CN1382220A - 编码细胞壁降解酶的核酸序列和在设计对镰孢和其他病原体的抗性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来源于镰孢真菌基因的、编码细胞壁降解酶葡聚糖酶、内切壳多糖酶和外切壳多糖酶的核酸序列;具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶和外切壳多糖酶活性的分离的多肽;包含该核酸序列的重组核酸分子、载体和宿主细胞,以及生产和使用该多肽的方法,包括在植物细胞中表达以赋予或提高某种植物对镰孢和其他病原体的抗性。

Description

编码细胞壁降解酶的核酸序列和 在设计对镰孢和其他病原体的抗性中的应用
发明背景
1.发明领域
本发明涉及来源于真菌基因的、编码具有细胞壁降解活性的多肽的核酸序列，以及分离的具有细胞壁降解活性的多肽。本发明也涉及含有该核酸序列的重组核酸分子、载体和宿主细胞，以及生产和使用该多肽的方法，包括在植物细胞中表达以赋予或提高植物对镰孢(Fusarium)和其他病原体的抗性。
2.本领域的描述
综述
对本国市场和出口市场来说，小麦都是最重要的粮食作物之一。美国每年大约生产24亿蒲式耳小麦，价值超过70亿美元。镰孢性穗枯萎(Fusarium head blight)或疮痂病(scab)是小麦、大麦、燕麦、黑麦和冰草的一个真菌性疾病，它影响谷粒的产量和质量。它在世界各处都可发生，特别是在抽穗期，当温度和湿度适合致病因子——禾谷镰孢(Fusarium graminearum)增殖的时候。在近十年内，穗枯萎病使美国和加拿大的种植者和加工者遭受了数十亿美元的损失。在明尼苏达州、北达科他州和南达科他州，由于镰孢性穗枯萎病所造成的小麦产量和谷物质量方面的损失在1993年接近10亿美元，其后几年又损失了2-4亿美元。在俄亥俄州、密西根州、印地安那州和伊利诺斯州，该病所造成损失在1995和1996年超过3亿美元。谷物的质量也大打折扣，因为受感染的谷物通常会被真菌产生的、对人和牲畜有害的真菌毒素、呕吐毒素或脱氧瓜蒌镰菌醇(DON)所污染。除此之外，该病害在上述中西部地区威胁大麦的生产，因为啤酒生产者根本不能容忍在谷物中存在呕吐毒素。
穗枯萎病
谷类作物，包括小麦、玉米、大麦、燕麦和黑麦，对许多类型的真菌和多种致病性镰孢属真菌是易感的。禾谷镰孢(Schwabe)和大刀镰孢(Fusarium culmorum)是小麦、大麦、燕麦和黑麦的被称作镰孢性穗枯萎病、穗枯萎病或疮痂病的主要致病因素(见Bai和Shaner 1994；Parry等1995的综述)。病原体的生命周期在两个宿主——小麦和玉米之间交替。禾谷镰孢的冬孢子体(teliomorph)(有性阶段)被称作玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)，可引起玉米的茎、穗腐烂和幼苗的穗枯萎。穗枯萎病是小麦和大麦的一个世界性问题，而且自1991以后在美国以流行比例发病。至今，在小麦、大麦或它们的有性兼容性亲缘植物中还没有鉴别出镰孢性穗枯萎病的有效的抗性基因。由于缺乏对该病害的抗性，加上免耕农业和不利的气候模式，结果造成12个州的小麦和大麦工业遭受了26亿美元的直接损失。由免耕农业导致的玉米和小麦留茬的不断积累有助于孢子和分生孢子在田间的增殖。而且，开花(花粉脱落)时降雨期和温暖的温度都有利于病原体的发芽和生长。禾谷镰孢引起含发育中的谷粒的花器官(小花)的死亡，使穗呈现漂白状或“痂状”  外观，并造成谷物从中等程度到严重程度的减产。除此之外，禾谷镰孢和其他种类的镰孢可产生单端孢菌素真菌毒素，例如脱氧瓜蒌镰菌醇(DON)，它会使疾病恶化，并对摄取了被污染的谷类产品的人和牲畜造成健康威胁。
早在1891年，小麦穗对镰孢的显著易感性就被Arthur注意到了(Parry等，1995)。Puge及其合作者(1933)报告说：用培养的玫瑰色镰孢(F.roseum)(大刀镰孢)分生孢子接种过的小麦穗在从开花到蜡熟初期的20天期间是最易感的，这取决于品种。裂开的花药和其他正在退化的组织似乎成为供菌丝增殖蔓延进韧皮部并遍及穗的其他部分的疫源地。在组织学研究中，Puge注意到菌丝通常在细胞间侵入，但是能穿透小花的内部薄壁。虽然禾谷镰孢能在花的不同部分上移植生长，但在实验室和田间研究都证明感染的迅速传播与突出的花药的存在有关(Andersen 1948，McKay和Loughnane，1945)。花药的水样提取物被发现可以在体外刺激菌丝的生长(Strange和Smith 1971)，然而大分生孢子的萌发似乎不受影响(Strange和Smith，1978)。菌丝的生长刺激作用几乎可以完全归功于两个季铵化合物：甜菜碱和它的前体胆碱(Strange等，1974)。这些化合物存在于小花的其他器官，但是在花粉中最为丰富(Pearce等，1976)。甜菜碱——一种渗透性杀虫剂，在干燥期间累积，越过了花粉发育的整个正常过程(见McCue和Hanson的综述，1990)。它同胆碱一起被假定为禾谷镰孢和其他的真菌病原体的碳和氮的一个偶然的来源。现在还不清楚是否真菌菌丝可以很容易地接近花粉表面的这些化合物，或者一定要侵入花粉细胞质才能接近它们。
如果要在明尼苏达州，北达科他州和其他州继续生产小麦和大麦，那么就必须鉴定出抗镰孢性穗枯萎病的基因。那怕只把镰孢感染降低10％，那么给粮食的生产者、加工者、以及最终给消费者节约下来的经济效益预计可达到数百万美元。研究人员已经在小麦和其他的谷类作物的种质中鉴别出抗疮痂病的多基因座，但是目前，通过传统育种方式在合适的作物品种中获得的对病害的耐受程度是不足以控制病原体的。既然免耕农业对水土保持有明显的好处，而镰孢在小麦产区又如此广泛地存在，故而宿主抗性需要可替代的来源。
对这种病害没有有效的控制措施。镰孢性穗枯萎病的抗性基因还没有从小麦、大麦或其他的有性兼容性植物品种中鉴别出来，这就限制了小麦育种专家发展抗性作物品种的努力。人们所需要是获得抗镰孢性穗枯萎病的作物品种的方法。真菌的葡聚糖酶和壳多糖酶的作用
在包括镰孢在内的许多真菌中，葡聚糖和壳多糖是细胞壁的基本成分。镰孢的外壁层是由β-1，3和β-1，6键连接的葡萄糖的聚合物(1，3/1，6-β-D-葡聚糖)组成的。最内基底层主要是由壳多糖微丝——β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖的线性聚合物组成的，它占了菌丝壁质量的三分之一(Barbosa和Kemmelmeier 1993)。镰孢细胞壁似乎更能抵御水解酶的活性，这可能是因为蛋白质和壳多糖的含量很高(Sivan和Chet，1989a)，以及乙酰化氨基葡萄糖残基的聚集(Fukamizo等，1992)。
壳多糖酶和葡聚糖酶是由自然存在的细菌、真菌和植物制造出来的。在真菌中，这些蛋白质分别在细胞壁的壳多糖和葡聚糖的自身水解中，以及其他微生物的细胞壁成分的水解中起作用(Srivastava等，1985；Sivan和Chet，1989b；Chérif和Benhamou，1990；V
Figure A0081362800111
zquez-Garcidue
Figure A0081362800112
as等，1998)。后者的特征被应用到发现抗微生物的生物防治剂方面。壳多糖也在昆虫的角皮和线虫类的卵壳中被发现。对于能利用壳多糖作为碳源的真菌，壳多糖酶可能在真菌的新陈代谢中起作用(Flach等，1992)。内切壳多糖酶在壳多糖聚合物里面随机裂解C1和C4之间的化学键(Flach等，1992；Graham和Sticklen，1994)，而外切壳多糖酶连续地裂解每个化学键，从壳多糖聚合物的末端释放出壳二糖。N-乙酰氨基葡萄糖糖苷酶也在末端裂解，释放N-乙酰葡糖胺(Flach等，1992)。同样，内切葡聚糖酶随机地在葡聚糖聚合物里面裂解β-键，产生短寡糖，而外切葡聚糖酶从聚合物的非还原端裂解单个葡萄糖残基(Vazquez-Garciduenas等1998)。真菌细胞壁葡聚糖层的水解应归功于内外切葡聚糖酶的联合作用。作为抗真菌蛋白质的葡聚糖酶和壳多糖酶。
真菌细胞壁与众不同的葡聚糖和壳多糖组成使得壳多糖酶和葡聚糖酶被广泛用作抗真菌蛋白。植物产生的壳多糖酶和葡聚糖酶已经被广泛表征成与防御病原体和有害昆虫有关的病理相关(Pr)蛋白质。植物中的病理相关蛋白质基因通过接触微生物病原体和有害昆虫而被诱生。人们根据细胞壁降解蛋白质的生物化学特性和结构特性将其分类。内切和外切壳多糖酶似乎都在真菌细胞壁壳多糖的水解中起作用。I类壳多糖酶对细菌细胞壁有壳多糖裂解活性，并且已经知道它是直接结合到壳多糖上的。相反地，II类壳多糖酶不对细菌细胞壁发生作用，也缺乏壳多糖结合活性；他们被假定在产生触发宿主防御反应的真菌诱生因子(elicitors)中起作用(Graham和Sticklen，1994；Fritig等，1998)。碱性壳多糖酶和葡聚糖酶(I类)通常蓄集在细胞内的液泡中，而酸性同工型(II类)则位于细胞外，当然也有一些例外(例如Wu等，1994；Graham和Sticklen，1994)。Cornelissen和同事(Sela-Buurlage等，1993)以及其他人(Graham和Sticklen，1994)观察到I类壳多糖酶和葡聚糖酶比活性高于II类酶的比活性。I类壳多糖酶在大多数植物和真菌中是由小基因家族所编码。各种不同的壳多糖酶的基因和蛋白质的结构已经被综述过了(Graham和Sticklen，1994)。
五类主要的β-葡聚糖酶中，只有β-1，3-葡聚糖酶显示出抗真菌活性(Simmons，1994)。β-1，3-葡聚糖酶在植物中是小的多基因家族的成员(Payne等，1990；Xu等，1992；Beffa和Meins，1996；Simmons，1994)，但是在拟分枝孢镰孢(Fusaium sporotrichioides)中是单拷贝基因(图27)。I类葡聚糖酶蓄积在液泡中，而II类和III类葡聚糖酶是酸性的并位于细胞外(见Beffa和Meins，1996)。I类葡聚糖酶在下列植物的病原体防御和应激反应中已经被广泛地研究过了，这些植物有烟草(Linthorst等，1990；Linthorst，1991；Payne等，1990)、大麦(Jutidamrongphan等，1991；Xu等，1992；Malehorn等，1993)、小麦(Jutidamrongphan等，1991；Cruz-Ortega等，1997)和其他种类(Krishnaveni等，1999a；见Simmons的综述，1994)。壳多糖酶和葡聚糖酶更偏爱作用在正在生长的真菌菌丝的尖端(例如，Broekaert等，1988；Collinge等1993)。壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶都在植物发育期间(Lotan等，1989)以及应对病原体攻击时差异表达。葡聚糖酶似乎在植物的细胞分裂和花发育(Beffa和Meins，1996)以及应激反应(Simmons，1994)中起作用。壳多糖酶在植物发育中的作用还没有被很好地描绘出来；然而它们都与胚胎发育和细胞分裂有关(参见Collinge等的综述，1993)。
一些由自然发生的细菌和真菌所产生的壳多糖酶和β-1，3葡聚糖酶具有抗镰孢特性(Mitchell和Alexander，1961；Michael和Nelson，1972；Cherif和Benhamou，1990)。植物来源的葡聚糖酶和壳多糖酶能降解分离的腐皮镰孢(Fusarium solani)的细胞壁(Mauch等，1988)。来自烟草的壳多糖酶对尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)(Yun等，1996)和腐皮镰孢(Sela-Buurlage等，1993)在培养中的生长有抑制作用。Krishnaveni等(1999b)描述了来自高粱种子的三种壳多糖酶抑制串珠镰孢(F.moniliforme)的生长。壳多糖酶和葡聚糖酶在对抗真菌病原体中的协同作用已经被广泛地报导(参见Graham和Sticklen，1994以及Van Loon，1997的综述)。例如，Mauch等(1988)观察到来自豌豆的一种壳多糖酶和一种β-1，3-葡聚糖酶对真菌的抗菌谱很广。Melchers等(1994)报告均来自烟草的一种V类内切壳多糖酶加上一种I类β-1，3-葡聚糖酶可协同抑制腐皮镰孢的生长。一种烟草酸性壳多糖酶和一种烟草β-1，3-葡聚糖酶在蕃茄中的表达赋予它对尖孢镰孢的抗性，然而单独表达时，每种蛋白质的效果就要差很多(Jongedijk等.1995)。同样地，当一种稻碱性壳多糖酶和一种紫花苜蓿酸性β-1，3-葡聚糖酶在烟草中共同表达时，烟草尾孢(Cercospora nicotiana)真菌病原体就受到限制(Zhu等，1994)。一种大麦II类壳多糖酶和一种大麦II类β-1，3-葡聚糖酶的协同作用使烟草具有了对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抗性(Jach等，1995)。这种壳多糖酶与一种大麦核糖体失活蛋白质合并使用也可以抑制腐皮丝核菌感染。葡聚糖酶和壳多糖酶的显著特异性
虽然真菌和许多种(如果不是全部)植物表达葡聚糖酶和壳多糖酶，不是所有的酶对所有类型的微生物都具有相等的作用(Graham和Sticklen，1994；以及该文所列参考文献)。举例来说，Broekaert和同事(1988)观察到来自曼陀罗、烟草和小麦的壳多糖酶具有抗Trichoderma harzianum和布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanue)的抗真菌活性，但是没有抗灰葡萄孢(Botrytis cinerea)活性。Mauch等(1988)报告了来自豌豆的一种壳多糖酶和一种葡聚糖酶对绿色木霉(T.viride)和腐皮镰孢的作用是有差别的。联合使用时，这两种酶对其他真菌的抗菌谱很广。有抗镰孢和木霉活性的一种烟草壳多糖酶没有抗黄曲霉(Aspergillus flavus)、Phytophthoraparasitica和其他病原体的活性(Yun等，1996)。壳多糖酶的差异活性可归因于酶的内在特性(Sela-Buurlage等，1993；Brunner等，1998)、真菌细胞壁结构的不同(Sivan和Chet，1989a；Van Loon，1997)、或其他因素。其他的抗镰孢蛋白质
在体外或在植物中有抗镰孢活性的其他蛋白质类型已经被发现。Boyapati等(1994)报告了来自珍珠粟的一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制了在培养条件下串珠镰孢的生长。来自凤仙花(Impatiensbalsamina)种子的一个富半胱氨酸的多肽具有抗大刀镰孢的活性(Tailor等，1997)。来自惜古比天蚕蛾的多肽杀菌肽A，是串珠镰孢和尖孢镰孢的有效抑制剂(deLucca等，1997；Cavallarin等，1998)。来自高粱种子的抗真菌蛋白质具有抗串珠镰孢的活性(Seetharaman等，1997)，病理相关蛋白质PR4家族的两种小麦种子蛋白质可以抑制大刀镰孢和禾谷镰孢菌丝的生长(Caruso等，1996)。Hu和Reddy(1997)从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)中分离出一个具有抗尖孢镰孢活性的奇异果甜蛋白样蛋白质。来自大麦和玉米叶的非特异性脂类转移蛋白质对腐皮镰孢具有抑制作用(Molina等，1993)。小麦嘌呤硫素与来自萝卜或菜籽油菜的一个2S白蛋白联合作用可以在体外有效抑制大刀镰孢的生长(Terras等，1993)。作为植物中抗真菌转基因的微生物基因
大多数在体外和在植物中研究过的抗真菌基因都是植物来源的。就我们所知道的而言，有两例来自真菌的基因表现出抗真菌活性。来自寄生菌类Trichoderma harzianum的内切壳多糖酶赋予转基因烟草抗链格孢(Alternaria alternata)和灰葡萄孢的活性，赋予转基因马铃薯抗A.solani和立枯丝核菌的活性(Lorito等，1998)。通过转入一个来自Rhizopus oligosporus的壳多糖酶基因，Terakawa等(1997)观察到了转基因烟草对核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)和灰葡萄孢的防护作用。当来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的一个壳多糖酶在烟草中表达时，显示出它具有抗真菌活性(Suslow等，1988)。
发明概述
本发明涉及来自镰孢真菌基因的编码具有细胞壁降解活性的多肽的核酸序列，以及具有细胞壁降解活性的分离的多肽。本发明也涉及含有该核酸序列的重组核酸分子、载体和宿主细胞，以及生产和使用该多肽的方法，包括在植物细胞中表达以赋予或提高植物对镰孢和其他病原体的抗性。
更具体的是，本发明提供编码具有细胞壁降解活性(包含葡聚糖酶、内切壳多糖酶和外切壳多糖酶活性)的多肽的分离的核酸分子。编码葡聚糖酶和外切壳多糖酶的基因组序列和编码葡聚糖酶、内切壳多糖酶和外切壳多糖酶的cDNA序列明确地示例于此。包括在本发明的范围内的有编码具有在下文示例的葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶多肽序列的多肽的核酸序列、以及编码具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的多肽的核酸分子。
包括在本发明范围之内的核酸序列还有那些能与一种酶编码序列或它的互补体在中度或高度严格条件下进行特异性杂交、并编码具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的多肽的核酸序列。
与下列详细描述的示例葡聚糖酶序列有至少70％序列同一性、并编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本发明中。编码与下列详细描述的示例葡聚糖酶多肽序列有至少80％序列同一性的多肽、并编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本发明中。
与下列详细描述的示例内切壳多糖酶或外切壳多糖酶序列有至少75％序列同一性、并编码具有内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本发明中。编码与下列详细描述的示例内切壳多糖酶或外切壳多糖酶多肽序列有至少85％序列同一性的多肽、并编码具有内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本发明中。
本发明也涉及具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的分离的多肽。本发明包括具有与下列详细描述的示例葡聚糖酶多肽序列有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽。本发明也包括具有与下列详细描述的示例内切壳多糖酶或外切壳多糖酶多肽序列有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽。由在中度或高度严格条件下能与下列详细描述的示例核酸序列进行杂交的核酸序列所编码的多肽也包含在本发明中。该多肽的变体以及具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的片段也包含在本发明中。
本发明也涉及生产和使用本发明的多肽的方法。
本发明进一步的一个方面是提供含有编码具真菌细胞壁降解活性(包含葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性)的多肽的序列的重组核酸分子。这些分子，举例来说包括重组载体：例如包含编码葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶DNA序列的克隆、表达或转化载体。
本发明的另外一个方面是提供被上述的载体或DNA序列转化的细胞。
本发明的一个具体用途是提供被一个或多个本发明的核酸序列转化的细胞。本发明更具体的一种用途是提供被一个或多个编码具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶编码活性的多肽的核酸序列转化的植物、植物种子或植物细胞，以提供具有对植物病原体，包括真菌，特别是镰孢属种的抗性的植物，或提供对植物病原体的抗性增强的植物。
本发明进一步的一个方面是提供能够在镰孢属真菌中检测葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶基因或其功能性等价物的寡核苷酸探针，以及该探针在分离编码葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶基因或其功能性等价物的核酸序列中的用途。能够与该探针进行特异性杂交并编码功能性葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶的核酸序列也包含在本发明中。
使用本发明的核酸序列将使得从真菌中分离同源基因，以获得能够保护包括真菌、细菌和植物在内的宿主细胞的基因以对抗相关的真菌病原体变得更加容易。
本发明也包括互相联合的转基因结构的应用，也就是说，葡聚糖酶和内切壳多糖酶；葡聚糖酶和外切壳多糖酶；内切壳多糖酶和外切壳多糖酶；以及葡聚糖酶、内切壳多糖酶和外切壳多糖酶的联合应用。携带了任何组合的转基因结构的转基因单子叶或双子叶植物系、植物细胞、以及通过有性或无性繁殖获得的后代都包含在本发明中。
根据这个发现，本发明的一个目的是提供编码从葡聚糖酶、外切壳多糖酶和内切壳多糖酶中选择的真菌细胞壁降解酶的核酸序列；具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的分离的多肽；包括编码具有细胞壁降解活性的多肽的表达载体在内的重组核酸分子；以及携带重组核酸分子或表达载体的细胞。
本发明的另一个目的是提供含有降解细胞壁的重组分子的转化载体，而这种载体是可以有效地将重组分子稳定导入植物体内的。
本发明的另一个目的是提供生产和使用具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的多肽的方法。
本发明的另一个目的是提供具有细菌或真菌抗性的转基因植物，其中抗性是本发明的重组核酸分子表达的结果。
本发明进一步的一个目的是提供产生细胞壁降解酶的真菌基因，这些细胞壁降解酶包括能够降解F.venenatum和其他镰孢属种(包括美国的穗枯萎病(疮痂病)的主要致病因子禾谷镰孢和大刀镰孢)细胞壁的葡聚糖和壳多糖成分的蛋白质。
本发明的另外一个目的是在转基因单子叶植物，包括小麦、大麦或燕麦中表达细胞壁降解酶，赋予小麦和其他的谷类作物对镰孢属种和/或其他真菌病原体的部份或者全部抗性。这样的转基因系将会是产生改良的农作物的有用的遗传原种。
本发明的更进一步的目的是提供表达被设计好了的基因的新小麦种质，该基因的设计目地是限制致病性镰孢类真菌的传播，并间接地减少脱氧瓜蒌镰菌醇在受感染的穗上的蓄积。
本发明的其他目的和优点将会在随后的描述中展示出来。
附图简述
图1是由F.venenatum cDNA(上)和拟分枝孢镰孢(F.sporotrichiorides)基因组DNA(下)编码的葡聚糖酶之间的一个比较(分别是SEQ ID NOS：5和4)。
图2显示的是F.venenatum内切壳多糖酶5’cDNA PCR产物和推导出的多肽序列(分别是SEQ ID NOS：6和7)。粗体字显示的是从5’PCR产物中获得的新序列。非粗体字显示的是与F.venenatum内切壳多糖酶部分cDNA序列匹配的F.venenatum内切壳多糖酶5’cDNA序列部分。
图3显示的是拟分枝孢镰孢外切壳多糖酶5’基因组PCR产物和推导出的多肽序列的一部分(分别是SEQ ID NOS：8和9)，下划线区段表示内含子。在ATG(第一个甲硫氨酸)之前的核苷酸区段是启动子和5’非翻译区。粗体字显示的是从5’PCR产物获得的新序列。非粗体字显示的是与F.Venenatum外切壳多糖酶cDNA序列匹配的拟分枝孢镰孢基因组序列部分。
图4显示的是由F.venenatum cDNA(上)和拟分枝孢镰孢基因组DNA(下)编码的外切壳多糖酶之间的比较(分别是SEQ ID NOS：14和15)。
图5举例说明对遍在蛋白-1启动子的修饰。
图6显示的是FvGluS质粒图；它是单子叶植物表达载体，在有义方向上含有被修饰过的全长葡聚糖酶cDNA。
图7显示的是FvGluAS质粒图；它是单子叶植物表达载体，在反义方向上含有被修饰过的全长葡聚糖酶cDNA。
图8显示的是FvEndoS质粒图；它是单子叶植物表达载体，在有义方向上含有被修饰过的全长内切壳多糖酶cDNA。
图9显示的是FvEndoAS质粒图；它是单子叶植物表达载体，在反义方向上含有被修饰过的全长内切壳多糖酶cDNA。
图10显示的是FvExoS质粒图；它是单子叶植物表达载体，在有义方向上含有被修饰过的全长外切壳多糖酶cDNA。
图11显示的是FvExoAS质粒图；它是单子叶植物表达载体，在反义方向上含有被修饰过的全长外切壳多糖酶cDNA。
图12显示的是对转基因系进行的稳定整合转基因DNA的PCR分析。UT表示未转化的植物；T1-T3表示被转化了的植物；C表示质粒(结构)对照；mw表示100bp的序列梯。
图13显示的是在普通小麦(Triticum aestivum)品系AB8-108中的FvEndo mRNA的Northern印迹。
图14显示的是使用RT-PCR方法在普通小麦的胚乳和颖片中检测葡聚糖酶转录本的5’部分。
图15显示的是使用RT-PCR方法在普通小麦的胚乳和颖片中检测内切壳多糖酶和外切壳多糖酶转录体的5’和3’部分。
图16显示的是使用限制性核酸内切酶鉴定内切壳多糖酶5’RT-PCR产物。
图17显示的是使用限制性核酸内切酶鉴定外切壳多糖酶5’RT-PCR产物。
图18表明FvEndo的5’和3’RT-PCR产物是cNDA依赖的。
图19表明FvExo的5’和3’RT-PCR产物是cDNA依赖的。
图20显示的是F.venenatum基因组DNA与FvGlu、FvEndo、FvExo cDNAs杂交的Southern印迹。序列简述
SEQ ID NO：1是F.venenatum葡聚糖酶未经修饰的全长cDNA序列。
SEQ ID NO：2是被SEQ ID NO：1编码的葡聚糖酶。
SEQ ID NO：3是含有拟分枝孢镰孢葡聚糖酶基因的基因组DNA片段。
SEQ ID NO：4是由SEQ ID NO：3编码的葡聚糖酶序列。
SEQ ID NO：5是由F.venenatum cDNA序列编码的葡聚糖酶。
SEQ ID NO：6是F.venenatum内切壳多糖酶5’cDNA的PCR产物。
SEQ ID NO：7是由SEQ ID NO：6编码的多肽。
SEQ ID NO：8是拟分枝孢镰孢外切壳多糖酶5’基因组PCR产物。
SEQ ID NO：9是SEQ ID NOS：8编码的多肽序列的一个部分。
SEQ ID NO：10是F.venenatum内切壳多糖酶未经修饰的全长cDNA序列。
SEQ ID NO：11是由SEQ ID NO：10编码的内切壳多糖酶。
SEQ ID NO：12是拟分枝孢镰孢-F.venenatum嵌合序列。
SEQ ID NO：13是由SEQ ID NO：12编码的外切壳多糖酶。
SEQ ID NO：14含有由F.venenatum cDNA编码的外切壳多糖酶的1到249位氨基酸。
SEQ ID NO：15含有拟分枝孢镰孢基因组DNA的1到249位氨基酸。
SEQ ID NO：16是F.venenatum葡聚糖酶修饰过的全长cDNA序列。
SEQ ID NO：17是由SEQ ID NO：16编码的葡聚糖酶。
SEQ ID NO：18是F.venenatum内切壳多糖酶修饰过的全长cDNA序列。
SEQ ID NO：19是由SEQ ID NO：18编码的内切壳多糖酶。
SEQ ID NO：20是F.venenatum外切壳多糖酶修饰过的全长cDNA序列。
SEQ ID NO：21是由SEQ ID NO：20编码的外切壳多糖酶。
SEQ ID NO：22-24是在图5中显示的(分别是上、中、下)、天然的遍在蛋白-1以及修饰过的遍在蛋白-1序列。
SEQ ID NO：25是一个前导序列。
SEQ ID NO：26是引物M13F。
SEQ ID NO：27是引物M13R。
SEQ ID NOS：28-74是在表2中显示的引物。
SEQ ID NOS：75-82是在表3中显示的PCR引物。
定义
除非另外下定义，否则在此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员所普遍理解的意义。下列参考文献给技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般性定义：Singleton等，微生物学及分子生物学辞典(Dictionary of Microbiology andMolecular Biology)(第二版，1994)；剑桥科技辞典(The CambridgeDictionary of Science and Technology)(Walker编辑，1988)；遗传学词汇(The Glossary of Genetics)，第五版，Rieger，R等(编辑)，Springer Verlag(1991)；和Hale & Marham，HARPER COLLINS生物学辞典(The Harper Collins Dictionary of Biology)(1991)。
为了使本发明更容易被理解，许多术语被定义如下：
“葡聚糖酶”指的是一种对葡聚糖，一种真菌细胞壁成分，具有水解活性的蛋白质或多肽。葡聚糖酶特别指的是一种具有降解葡聚糖的β-1，3键的酶活性的多肽。
术语“葡聚糖酶活性”在此被定义为催化葡聚糖的β-1，3键降解的水解活性。根据已经公开的方法，可以通过将一种合适的底物(例如葡聚糖，昆布多糖)加入细胞提取物如小麦胚乳组织、叶组织提取物中来测量葡聚糖酶活性。Keen和Yoshikawa(1983)以及Fontaine等(1997)的文章中描述了测定方法。
“壳多糖酶”指的是对壳多糖具有水解活性的蛋白质或多肽。壳多糖是一种主要由N-乙酰-氨基葡萄糖所组成的高分子，并在真菌的菌丝和孢子的细胞壁中被发现。
“内切壳多糖酶”指的是通过在壳多糖聚合物的C1和C4键之间随机裂解而酶促降解壳多糖的蛋白质或多肽。
术语“内切壳多糖酶活性”在此被定义为通过在壳多糖聚合物的C1和C4键之间随机裂解而降解壳多糖的能力。
“外切壳多糖酶”指的是通过从壳多糖聚合物的末端顺序地裂解每个C1和C4键而酶促降解壳多糖的蛋白质或多肽。
术语“外切壳多糖酶活性”在此被定义为通过从壳多糖聚合物的末端顺序地裂解每个C1和C4键而降解壳多糖的能力。
根据已经公开发表的方法，壳多糖酶(内切壳多糖酶或外切壳多糖酶)的活性可以通过将一种合适的底物加入到细胞提取物如小麦胚乳组织、叶组织提取物中而测量出来。测定方法在下列文献中有描述：Harman等(1993)、McCreath和Gooday(1992)、Tronsmo和Harman(1993)、Bolar等(2000)、以及美国专利5,378,821号。
用在细胞上的术语“转基因的”指的是包含了转基因的细胞，或者是其基因组已经被导入的转基因所改变的细胞。用在组织或植物上的术语“转基因的”分别指的是包含了一个或多个含有转基因的细胞，或者一个或多个其基因组已经被导入的转基因所改变的细胞的组织或植物。转基因细胞、组织和植物可以通过几种方法产生出来，包括将含有核酸(通常是DNA)的“转基因”导入靶细胞；或者通过人工干预方法——例如在此描述的方法，将“转基因”整合进靶细胞的染色体内。
在此使用的术语“转基因”指的是经由实验操作被导入细胞基因组中的任意核酸序列。转基因可能是“天然DNA序列”或“异源DNA序列”(也就是“外源DNA”)。术语“天然DNA序列”指的是被导入的细胞中天然存在的核苷酸序列，只要它与天然产生的序列相比，不包含某些修饰(例如点突变、存在选择性标记基因，等等)。
术语“异源DNA序列”指的是连接到、或被操纵连接到其天然不与之相连的、或其天然在不同的位置与之相连的核酸序列上的核苷酸序列。异源DNA对于其导入的细胞而言，不是内生的，而是从另外的细胞中获得的。异源DNA也包括含有一些修饰作用的天然DNA序列。一般来说，对那些表达异源DNA的细胞而言，异源DNA编码的RNA和蛋白质是它正常不能制造的，虽然这不是必然的情况。异源DNA的实例包括报道基因、转录和翻译调控序列、选择性标记蛋白(例如赋予药物抗性的蛋白质)，等等。
在此处使用的术语“转化”指的是将转基因导入细胞中。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。
术语“稳定转化”或“稳定转化的”指的是将一个或多个转基因导入和整合到细胞的基因组中。细胞的稳定转化可以通过将细胞基因组DNA与能结合一个或更多个转基因的核酸序列进行Southern印迹杂交而检测出来。植物的稳定转化也可以通过使用聚合酶链反应从此植物后代的细胞的基因组DNA中扩增转基因序列而检测出来。术语“稳定转化体”指的是已经将一个或更多个转基因整合进基因组DNA中的细胞。因此，稳定转化体与瞬时转化体是有区别的，稳定转化株的基因组DNA中含有一个或更多个转基因，而瞬时转化体的基因组DNA不包含转基因。
当术语“分离的”被关联到核酸分子，比如在“分离的核酸序列”中使用的时候，它指的是从其天然来源中与之相关的至少一种核酸污染物中鉴别和分开出来的核酸序列。分离的核酸以一种与其天然存在的不同形式或定位而存在。分离的核酸序列可能以单链或双链的形式存在。当一种分离的核酸序列将被用于表达蛋白质的时候，该核酸序列将会至少包括有义链或编码链的至少一部分(也就是说该核酸序列可以是单链)。或者它也可以同时包含有义链和反义链(也就是说该核酸序列可以是双链)。
用来分离和克隆编码多肽的核酸序列的技术，包括从基因组DNA中分离、自cDNA中制备、或其组合的技术，在本领域已经广为人知。从这样的基因组DNA中克隆本发明的核酸序列可以这样实施，举例来说，通过使用广为人知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库抗体筛选技术来检测具有相同结构特征的克隆化DNA片段。参见例如Innis等，1990，PCR：方法和应用指南(PCR：A Guide to Methods andApplication)，学术出版社，纽约。也可以使用其他核酸扩增程序，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和以核酸序列为基础的扩增反应(NASBA)。核酸序列可以是从镰孢属菌株，或另外的生物体或相关的生物体中扩增出来的，因此，举例来说，它可以是该核酸序列的多肽编码区的等位基因或种变异体。
在此使用的术语“纯化的”指的是分子，核酸序列或氨基酸序列，是从其自然环境中被迁移、分离或分开的。因此，“分离的核酸序列”是纯化的核酸序列。“大体上纯化的”分子的纯度至少约为20％，优选纯度至少约为40％，更优选纯度至少约为60％，甚至更优选纯度至少约为80％，最优选纯度至少约为90％或95％。纯度可以由琼脂糖电泳测定。举例来说，分离的核酸序列可以通过在遗传工程中使用的标准克隆程序而获得，以将该核酸序列从它的自然位置重新定位到一个不同的位点，它将会在那里被复制。克隆步骤可能包括剪切和分离含有编码多肽的核酸序列的所需要的核酸片段、将该片段插入载体分子中、和将该重组载体整合进宿主细胞，该核酸序列的多个拷贝或克隆将会在那里被复制。该核酸序列可能是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
正如在本领域已知的那样，术语“同一性”是指在两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间存在的关联，它是由序列之间的比较所确定的。在本领域，“同一性”也意味着多肽序列或多核苷酸序列之间的序列相关度，它是由这些序列的字符串之间的匹配所决定的。“同一性”可以用已知的方法很容易地计算出来，这些方法包括但并不限于在下列文献中描述过的方法：生物计算：信息学和基因组方案(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编辑，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑，Humana出版社，新泽西州，1994；以及分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987。确定同一性的优选方法是设计得出在被测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法已经被编成可公开获取的计算机程序。在两序列之间确定同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但并不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，核酸研究(Nucleic Acids Research)12：(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)。BLAST X程序可公开获取自NCBI和其他来源(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)和Altschul等，Gapped BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序。核酸研究(Nucleic Acid Res)25：3389-3402(1997))、ALIGN(http：//dot.imgen.bcm.tmc.edu：9331/seq-search/alignment.html)、和ClustalW(http：//dot.imgen.bcm.edu：9331/cgi-bin/multi-align/multi-align.pl)(Higgens，1989)
“序列同一性的百分率”可以通过将两种最佳比对的序列在比较窗口上进行比较而确定，其中对两种序列的最佳比对而言，与参考序列(不含添加或缺失)相比，多核苷酸序列或多肽序列部分在比较窗口上可能会含有添加或缺失(也就是裂隙)。百分率这样计算出来的：通过测定在两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，得出匹配位置的数目，将匹配位置数除以在比较窗口中的位置的总数，并将结果乘以100，就得出了序列同一性的百分率。优选比较窗口至少是编码序列的50％，优选60％，更优选75％或85％，甚至更优选95％到100％.
在此使用的术语“杂交”包括“核酸链通过碱基配对结合到互补链上的任何过程”[Coombs.J(1994)生物技术辞典(Dictionary ofBiotechnology)，Stockton出版社，纽约，纽约州]。杂交和杂交强度(也就是核酸之间结合的强度)是受这些因素影响的：比如核酸之间的互补程度，所涉及的条件的严格程度，所形成的杂交体的Tm值，和核酸里面的G∶C比值。
术语“严格条件下的杂交”指的是从两条单链核酸形成一条双链体。双链区可能包括一条或两条单链核酸全长，或一条单链核酸的全长和另一条单链核酸的子序列，或双链区可能包括每条单链核酸的子序列。
从不同的属或种的株系识别和克隆编码具有所需酶活性的多肽的DNA的核酸探针可以依照在本领域广为人知的方法来制备。这样的探针可以用于按标准Southern印迹程序与感兴趣的种或属的基因组或cDNA进行杂交，以识别和分离其中相应的基因。DNA和RNA探针都可以使用。典型地探针被标记以检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S，生物素或抗生物素蛋白质标记)。
对于长度至少为100个核苷酸的长探针，要使用高度或中度严格条件。当使用的探针长度为约100到大约1000个核苷酸时，所使用的与核酸杂交有关的高度严格条件包括与下列条件等同的条件：在由5×SSPE，1％SDS，5×Denhard’s试剂，100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中进行结合或杂交，杂交温度为68℃；继而在含有0.1×SSPE、0.1％ SDS的溶液中洗涤，洗涤温度为68℃，或者在前述条件中还含有50％甲酰胺时，可在42℃进行杂交和洗涤。高度严格洗涤条件可以包括0.1×SSC到0.2XSSC，1％ SDS，65℃，15-20分钟。这样的核酸Southern印迹的严格洗涤条件的一个实例是0.2×SSC，65℃洗涤15分钟(参见Sambrook等，分子克隆-实验室指南(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第二版)，1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港出版社，纽约，1989，关于SSC缓冲液的描述)。其他示例性高度严格杂交条件包括：例如，7％ SDS，0.25M磷酸钠缓冲液，PH值7.0-7.2，0.25M氯化钠，温度65℃-68℃，或在前述的条件中还含有50％甲酰胺时，可在42℃进行。示例性中度严格条件与上述高度严格条件基本一致，除了在42℃使用35％的甲酰胺，以及在55℃进行洗涤。
对于长度是大约15个核苷酸到大约70个核苷酸的短探针，严格条件被定义为按标准Southern印迹程序，预杂交、杂交和杂交后洗涤在含有0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl，pH 7.6，6mM EDTA，0.5％ NP-40，1×Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠(Sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP，和每毫升0.2克酵母RNA的溶液中进行，温度比依照Bolton和McCarthy(1962，美国国家科学院研究进展(Proceeding’s of the National Academy ofSciences USA)48：1390)的计算方法得出的Tm值低大约5℃到大约10℃。
对于长度是大约15个核苷酸到大约70个核苷酸的短探针，固定了DNA的实验材料要用6×SCC加0.1％ SDS的溶液洗涤一次，共15分钟，用6×SSC洗涤两次，每次15分钟，洗涤温度比计算出的Tm值低5℃到10℃。
从其他的生物体制备的基因组DNA或cDNA文库可以被用来从中筛选能与上述的探针杂交的、编码具有所需要的酶活性的多肽的DNA。来自这样的其他生物体的基因组DNA或其他的DNA可以被琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他的分离技术所分离。来自文库的DNA或被分离的DNA可以被转移到并固定在硝酸纤维素或其他的合适材料上。为了识别与所选择的序列或其子序列同源的克隆或DNA，固定了DNA的材料被用来作Southern印迹。就本发明而言，杂交是指核酸序列在中度到高度严格条件下与相应于所选核酸序列、它的互补链、或其子序列的标记核酸探针杂交。在这些条件下与核酸探针杂交的分子使用x光片检测。
术语“核酸结构”指的是单链或双链核酸分子，它是从自然产生的基因中分离的，或者它已经被修饰过而含有以自然界中并不存在的方式组合和并列的核酸区段。核酸结构可包括：例如本发明的编码序列、调控序列例如启动子序列，以及转录和翻译终止信号。当核酸结构包含本发明编码序列的表达所必需的所有调控序列的时候，术语核酸结构与术语表达盒是同义的。示例的结构包括质粒和载体，包括克隆载体、重组表达载体。“载体”是一种核酸构造，它能转导、转化、或者感染细胞并通常在细胞中复制，借此使得该细胞表达载体所编码的核酸和任选的蛋白质，其对细胞来说是非天然的、或在表达方式上并非天然的。载体包含待由细胞表达的核酸(通常是RNA或DNA)。载体可以任选包括协助核酸进入细胞的材料，例如逆转录病毒颗粒、脂质体、蛋白质包被物或类似物质。载体含有在细菌或其他的非植物生物体中允许其增殖和选择的核酸序列。关于载体和分子生物学技术的描述，参见：分子生物学当代方法(Current Protocolsof Molecular Biology)，Ausubel等，(编辑)，通用程序，Greene联合出版公司与John Wiley & Sons公司联合企业(包括1998年增刊的全部刊物)(Ausubel)。
术语“编码序列”在此被定义为直接规定它的蛋白质产物的氨基酸序列的核酸序列，例如被转录成mRNA并且翻译成多肽的一段序列。编码序列的分界线通常是由ATG起始密码子(真核生物)和翻译终止子(终止密码子)所决定。编码序列可包括但并不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“有义方向”指的是与结构中的启动子有关的cDNA序列或编码序列的方向，即cDNA序列或编码序列的5’端是与启动子毗连的。术语  “反义”(或反向)指的是与结构中的启动子有关的核酸序列例如cDNA或编码序列的方向，即序列的3’端是与启动子毗连的。
术语“调控序列”被定义为包括所有对多肽的表达是必需的或有利的成分。这样的调控序列包括但并不限于：前导序列，多肽序列，启动子，信号肽序列或靶向序列，增强子和转录终止子。调控序列最少包括启动子和转录终止子序列。基因或核酸结构中包含5’前导序列的部分，因为它能影响翻译的效力，也可以被视为调控序列，其中5’前导序列通常是紧接着ATG起始密码子上游的、长度为5到15个核苷酸的序列。调控序列可能提供有为了引进特有的限制性酶切位点而设置的接头，以便使调控序列与核酸序列编码多肽的编码序列的连接变得更加容易。术语“可操作地连接的”在此被定义为一种构型，其中的调控序列被置于与核酸序列的编码序列有关的位置，以便调控序列指导信使RNA和/或多肽的制造。
在此处使用的术语“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”指的是DNA序列，当它被连接到感兴趣的核苷酸序列上的时候，它能够调控感兴趣的核苷酸序列转录成mRNA。启动子典型地，虽然不是必然地，位于mRNA的转录受其调控的、感兴趣的核苷酸序列的5’端(也就是上游)，并且为启动转录的RNA聚合酶和其他的转录因子的特异性结合提供位点。当结合了启动子序列的RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后后者又翻译为被编码序列所编码的蛋白质的时候，这段DNA序列就与启动子在细胞中“有效联合”了。
调控序列也可能是合适的转录终止子序列，它是被宿主细胞所识别以终止转录的序列。终止子序列可操作地连接在编码多肽的核酸序列的3’端。
调控序列也可以是合适的前导序列，即mRNA上的一段非翻译区，它对宿主细胞的翻译有重要作用。前导序列可操作地连接在编码多肽的核酸序列的5’端。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，即一段可操作地连接在核酸序列的3’端的序列，当转录的时候，它被宿主细胞识别为在转录出的mRNA上加聚腺苷酸残基的信号。
调控序列也可以是编码连接到多肽的氨基末端的氨基酸序列、并指导被编码的多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。核酸序列的编码序列的5’端可能天然地包含在翻译读码框架中与编码分泌性多肽的编码区天然地连接的信号肽编码区。或者编码序列的5’端可能包含对编码序列而言是外源序列的信号肽编码区。当编码序列并没有天然地包含信号肽编码区的时候，就可能需要外源的信号肽编码区。或者外源的信号肽编码区可能简单地替换天然的信号肽编码区以便提高多肽的分泌。
调控序列也可能是编码连接到多肽羧基端的氨基酸序列并指导被编码的多肽在细胞中特异性定位的定位肽。
反义技术包含克隆区核酸片段并将它与启动子有效地连接，以使得反义的(或互补的)RNA链将被转录。这种结构然后被转化进宿主细胞并产生反义RNA链。
术语“表达载体”指的是含有核酸结构以及那些将其递送进微生物宿主细胞并在其中自主复制的序列的载体。上述的各种不同的核酸和调控序列可能被结合在一起而产生重组表达载体，该载体可能包括一个或更多个适当的限制性酶切位点，在这样的位点允许插入或替换编码多肽的核酸序列。或者，本发明的核酸序列可以通过将该核酸序列或包含该序列的核酸结构插入适当的表达载体内进行表达。在构建表达载体时，编码序列可以在载体上定位，以使得该编码序列能够可操作性地与适当的调控序列连接以便表达。
为了合成基本上类似于本发明多肽的多肽，对编码该多肽的核酸序列进行修饰可能是必须的。对多肽而言，术语“基本上类似于”指的是该多肽的非天然产生的形式。这些多肽可能以某种改造的方式与从其天然来源中分离的多肽有差别，例如：在比活性、温度稳定性、最适PH值、亚细胞定位或类似性质上有差别的变体。变体序列可能以表现为示例序列的多肽编码部分或其子序列的核酸序列为基础而构建；和/或通过引入核苷酸替代而构建，该核苷酸替代的引入并不导致产生由该核酸序列编码的多肽的另外一个氨基酸序列，但却符合用于该酶生产的宿主生物体的密码子选择；或通过导入可能导致另外一个氨基酸序列的核苷酸替代而构建。核苷酸替代的一般性描述，可参见：例如Ford等，1991，蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)2：95-107。
对于本领域技术人员来说，明了的是，这种替代可以在对分子功能有关键性影响的区域以外进行，并依然可以产生有活性的多肽。对由本发明的分离的核酸序列所编码的多肽的活性来说是必需的、因此优选不进行替代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的程序识别出来，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(举例来说，见Cunninghan和Well，1989，科学(Science)244：1081-1085)。在后者的技术中，突变被引进分子中每一个带正电荷的氨基酸残基处，得到的突变分子进行酶活性测试以识别对分子活性有关键作用的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过分析三维结构而确定，三维结构是通过例如核磁共振分析，结晶学或光亲和标记等技术而确定的(举例来说，见de Vos等，1992，科学255：306-312；Smith，1992，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)，224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letter 309：59-64)。
术语“宿主细胞”是已经被转化或转染或能够被外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。宿主细胞可能是单细胞微生物，例如原核生物细胞，或非单细胞微生物，例如真核细胞。真核细胞可以包括任何的细胞，例如来自昆虫、真菌或植物的细胞。宿主细胞的实例、将载体导入宿主细胞的方法以及克隆方法在美国专利5,374,540号中有描述，它也由此被列入为参考文献。
植物宿主细胞包括但并不限于：体细胞，配子或胚胎。“胚胎”指的是开始发芽前的孢子体植物。胚胎可以通过有性杂交或自花授粉引起配子受精而形成。“有性杂交”是一株植物被另外的植物授粉。“自花授粉”是通过自身授粉而产生种子，也就是说，花粉和胚珠来自同一植物。术语  “回交”指的是F1代杂交植物与它的亲本植物之一进行杂交。回交被典型地用来传递基因给近交系，这些基因赋予简单遗传的、具有高度可遗传性的性状。近交系被称为回归亲本。所需要的性状来源于供体亲本。当供体和回归亲本有性杂交之后，拥有来自供体亲本的所需要的性状的F1代杂交植物被选择出来并且重复地与回归亲本或近交系进行杂交(即：回交)。
胚胎也可以通过“胚胎体质发生”和“克隆”而形成。体细胞胚胎发生是从植物的细胞、组织和器官中直接地或间接地产生胚胎。间接的体细胞胚胎发生的特点是愈伤组织的生长和在愈伤组织表面形成胚胎。直接的体细胞胚胎发生是在外植体组织上从单一细胞或细胞团形成无性生殖胚胎，并不涉及愈伤组织阶段。因为从愈伤组织容易产生异常植物，所以直接的体细胞胚胎发生是优选的。
在此使用的术语“植物”指的是各种植物细胞，其在很大程度上分化成在植物发育任何阶段所存在的结构。这些结构包括但并不限于：整株植物、植物的部分或器官，例如：愈伤组织、根、果实、种子、芽、茎、块茎、叶、小花器官，包括颖片、外稃、内稃、绒毡层和花粉，以及上述结构的后代。植物后代包括植物、植物的部分和植物细胞的后代。可以在本发明的方法中使用的植物种类通常可以广泛到能够接受转化技术的高等植物种类，包括单子叶植物和双子叶植物。
术语“后代”指的是特定的植物或再生体(自交)的后裔，或一对植物(杂交或回交)的后裔。通过自花受粉产生的后代可以是T1代、T2代、或任何后续世代，而通过杂交产生的后代可以是F1代、F2代、或任何后续世代。典型地，亲本是花粉供体和胚珠供体，它们通过杂交产生本发明的后代植物。亲本也表示本发明的杂交植物(F2代植物)的F1代亲本。最后，亲本指的是回归亲本，它与本发明的杂交植物回交而产生本发明的另外的杂交植物。
术语“植物组织”包括已分化的和未分化的植物组织，包括但并不限于：根、芽、叶、花粉、种子、瘤组织和培养中的不同类型的细胞(例如：单个细胞、原生质体、胚胎、愈伤组织等)。植物组织可以存在于植物体、器官培养、组织培养、或细胞培养中。
植物的部分的例子有茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。同样，特定的植物组织，例如：叶绿体、质外体、线粒体、液泡，过氧化物酶体和细胞质，也被视为植物的一部分。此外，任何的植物细胞，无论来源于何种组织，也被视为植物的部分。
“转基因植物”是通过重组技术将核酸序列导入其体内的植物，这些重组技术有：包含核酸的载体、克隆、体细胞胚胎发生，或被技术人员用来产生植物的任何其他的技术。
“系”涉及植物或它的种质，转化而来的原代再生体，(T0)代植物或它的后代，其是由于遗传转化而产生的，其中所有或部分转基因已经被稳定整合。
术语  “单子叶植物”指的是具有单一子叶的植物种类，包括小麦、燕麦、大麦、稻、黑麦、黑小麦、玉米和其他的谷类作物，以及甘蔗、高粱、凤梨、山药、洋葱、香蕉、椰子、海枣、蛇麻草和草类，例如草地早熟禾、饲用牧草。
通贯全文所使用的谷类作物的俗名表示下列各属的各种植物：
俗名 属
小麦(软质，硬质和硬粒小麦品种) 小麦属(Triticum)
高粱 高粱属(Sorghum)
稻 稻属(Oryza)
大麦 大麦属(Hordeum)
玉米 玉蜀黍属(Zea)
黑麦 黑麦属(Secale)
黑小麦 Triticale
燕麦 燕麦属(Avena)
双子叶植物指的是一个植物种类，其特点是在发芽时出现一对胚胎子叶，它包括烟草、马铃薯、蕃茄、大豆、豌豆、菜豆、甜菜、番木瓜、南瓜属植物(Cucurbita)(南瓜、黄瓜、甜瓜、倭瓜、夏南瓜)、核果树、棉花、甘薯、十字花科植物(十字花科(Brassicaceae))，例如花椰菜、菜籽油菜以及近亲型生物(鼠耳芥)。
其他对真菌或细菌性疾病易感的植物也被包括在内，包括例如：葡萄、古柯豆和坚果类。
“EST”指的是已表达序列标志，它是完整或不完cDNA的核苷酸序列，代表在器官、组织或细胞类型中表达的转录本或信使RNA，通常长度为100个或更多个核苷酸。发明详述I.真菌细胞壁降解酶和编码该酶的核酸分子
本发明涉及编码具有细胞壁降解活性(包括葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性)的多肽、来自镰孢真菌基因的分离的核酸序列，以及分离的具有细胞壁降解活性的多肽。A1.编码葡聚糖酶活性的核酸分子
葡聚糖酶指的是具有降解葡聚糖β-1，3键能力的多肽。在第一个实施方案中，本发明针对编码具有葡聚糖酶活性的多肽的分离的核酸分子，其选自：
(a)与下列序列有至少70％核苷酸序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO：3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO：16的第18位到923位核苷酸；
(b)编码具有与SEQ ID NO：2，4，5或17的第1到301位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸序列；
(c)在中度或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸序列：(i)SEQ ID NO：l的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO：3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO：16的第18位到923位核苷酸；(ii)(i)的至少100个连续核苷酸的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(d) (a)、(b)或(c)的子序列，其中该子序列编码有葡聚糖酶活性的多肽片段。
编码具有葡聚糖酶活性的多肽的分离的核酸分子包括：编码葡聚糖酶并指导和调控葡聚糖酶编码序列的转录和翻译表达的基因组序列；以及编码有葡聚糖酶活性的多肽的cDNA序列。
编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列的具体实施方案在SEQ ID NO：1，3和16中给出。可作为范例的葡聚糖酶基因产物具有SEQ ID NO：2，4，5和17所给出的预测氨基酸序列。包含全长葡聚糖酶基因的基因组DNA序列呈现在SEQ ID NO：3中。此基因组DNA序列长度是3622bp，核苷酸序列分析显示有2个外显子和1个内含子。编码区包含第1801到2014位核苷酸和第2070到2761位核苷酸，编码一个长度为301个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：4)。F.venenatum葡聚糖酶未修饰的全长cDNA序列在SEQ ID NO：1中给出。此cDNA序列长度是1023bp。产生的可读框(编码部分)开始于第37位碱基，终止于第942位碱基，编码一个长度为301个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)。一个F.venenatum的编码葡聚糖酶的、经过修饰的全长cDNA序列在SEQ ID NO：16中给出。该cDNA长度是932bp。可读框开始于第18位碱基，终止于第923位碱基，编码一个长度为301个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：17)。对未经修饰的葡聚糖酶序列所做的一个修饰是CA丰富的5’前导序列GGATCCACCAACCAGCG(GLUC 5’引物中的#1-#17碱基，表2)的替代。经过修饰的5’前导序列直接存在于葡聚糖酶编码序列的ATG起始密码子的上游。该修饰作用使得前导序列富含C和A核苷酸，并将T核苷酸的量减到最少。这些特性据说在植物中可以提高基因的翻译效率。SEQ ID NO：5显示了有301个氨基酸的葡聚糖酶，是由F.venenatum cDNA所编码的。
在另外的一个实施方案中，所说的核酸分子是包含在质粒GLU2中的序列(SEQ ID NO：16，是F.venenatum的葡聚糖酶经过修饰的全长cDNA序列)，该质粒包含在大肠杆菌(Escherichia coli)NRRLB-30201中。
在另外的一个实施方案中，所说的核酸分子是包含在质粒FvGluS或FvGluAS中的序列，这两个质粒分别包含在大肠杆菌NRRLB-30204和NRRL B-30205中。
本发明也包含与SEQ ID：1，3或16的编码区、或SEQ ID NO：3的编码区加上内含子有如下程度的序列同一性的核酸序列，序列同一性至少是70％，优选至少约75％，优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选约为95％，且该序列编码可有效降解葡聚萄糖β-1，3-键的多肽。就本发明而言，两个核酸序列之间的同一性的程度由Clustal方法确定(Thompson等，1994)，使用ClustalW   1.7或1.8版(http：//dot.imgen.bcm.tmc.edu：9331/multi-align/multi-align.html)以及下列各项成对比对参数：K-tuple＝2；裂隙(gap)减分＝5；窗口大小＝4；对角线-4。多序列比对参数是：裂隙开始减分＝10；裂隙伸展减分＝5。
进一步说，那些在上面定义过的中度或高度严格条件下与SEQ IDNO：1，3或16 DNA序列的编码区或SEQ ID NO：3的编码区加上内含子杂交，并编码可有效降解葡聚糖β-1，3-键的多肽的核酸序列也包含在本发明中。
本发明也包含那些在上面定义过的中度或高度严格条件下与SEQ ID NO：1，3或16 DNA序列的编码区或SEQ ID NO：3的编码区加上内含子杂交的至少100个连续核苷酸、优选至少200个连续核苷酸的子序列。
本发明进一步包含那些在上面定义过的中度或高度严格条件下与SEQ ID NO：1，3或16 DNA序列的编码区或SEQ ID NO：3的编码区加上内含子杂交的核酸序列或核酸序列子序列的互补链。这些子序列为至少100个连续核苷酸，优选至少200个连续核苷酸的子序列。
本发明进一步指向上述核酸序列的子序列，其中该子序列编码具有葡聚糖酶活性的多肽片段。A2.具有葡聚糖酶活性的多肽
本发明也涉及分离的、由上述核酸分子编码的具有葡聚糖酶活性的多肽。分离的具有葡聚糖酶活性的多肽包括：
(a)具有与SEQ ID NO：2，4，5或17的第1到301位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由在中度或高度严格条件下可以与下列序列杂交的核酸序列所编码的多肽，这些序列是：(i)SEQ ID NO：1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO：3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO：16的第18位到923位核苷酸；(ii)至少100个核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(c)(a)或(b)的具有葡聚糖酶活性的片段。
图1是由F.venenatum cDNA(上)和拟分枝孢镰孢基因组DNA(下)(分别是SEQ ID NO：5和4)所编码的全长葡聚糖酶的比较。
由分离的核酸序列编码的如下多肽也包括在本发明中，这些多肽所含有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2，4，5或17的第1到301位氨基酸序列具有一定程度的同一性，这种序列同一性为至少约80％，优选至少为5％，更优选至少约90％，再更优选至少约95％，最优选至少约97％，而且这些多肽具有葡聚糖酶活性(同源多肽)。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度由Pearson(1990)的FASTA/FASTP方法所确定，使用ALIGN(http：//dot.imgen.bcm.tmc.edu：9331/seq-search/alignment.html)程序，以及BLOSUM50或PAM250评分矩阵和下列各项成对比对参数：在裂隙中的第一个残基的裂隙减分＝-12，其它残基的裂隙减分为-2；K-tuple＝2。多序列比对是由BLOSUM矩阵进行的，使用ClustalW 1.7算法(Thompson等，1994)。多序列比对参数是：裂隙开始减分＝10，裂隙伸展减分＝0.05；亲水性裂隙减分功能打开(亲水性残基GPSNDQERK)；并有残基特异性裂隙减分。
本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2，4，5或17的氨基酸序列或其具有葡聚糖酶活性的片段。在另外的优选实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2，4，5或17的第1到301位氨基酸或其具有葡聚糖酶活性的片段。
SEQ ID NO：2，4，5或17的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端删除了一个或更多个氨基酸的多肽。片段优选包含至少256个氨基酸残基，更优选至少包含271个氨基酸残基，最优选至少包含286个氨基酸残基。
本发明涉及分离的具有葡聚糖酶活性的多肽，其是由在上面详述过的中度严格条件或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸序列所编码的，这些序列是：(i)SEQ ID NO：1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO：3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO：16的第18位到923位核苷酸；(ii)至少100个连续核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链。
SEQ ID NO：1，3或16的子序列可以至少是100个连续核苷酸或优选至少200个连续核苷酸。而且，子序列可能编码具有葡聚糖酶活性的多肽片段。
遗传密码的简并性在本领域已经广为人知；因此，一个或更多个密码子被替代的同义编码序列可以很容易地被本领域的普通技术人员所确定。同义编码序列与示例的编码序列不同，但却编码与在此明确地提供的具有相同氨基酸序列的蛋白质。
保守替代的例子发生在下列各组中：碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。如上所述，通常不改变比活性的氨基酸替代在本领域已广为人知，举例来说，见H.Neurath和R.L Hill，1979，在：蛋白质(Theproteins)，学术出版社，纽约。最普遍发生的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly，以及那些相反的交换。
本发明多肽具有至少20％，优选至少40％，更优选至少60％，甚至更优选至少80％，甚至再更优选至少90％，和最优选至少100％的SEQ ID NO：2，4，5或17的多肽的葡聚糖酶活性。
本发明的多肽可以从任何属的微生物中获得。就本发明而言，在此使用的与给定的来源相关的术语“从…中获得”将意味着由该核酸序列编码的多肽是由该来源，或已经插入了来自该来源的该核酸序列的细胞所产生的。
本发明多肽可以是真菌多肽，例如曲霉属(Aspergillus)，镰孢属，Magnaporthe或疫霉(Phytophthora)。在一个优选实施方案中，多肽是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)，Fusariumcerealis，Fusarium crookwellense，大刀镰孢，禾谷镰孢，禾赤镰孢(Fusarium graminum)，异孢镰孢(Fusarium heterosporum)，合欢木镰孢(Fusarium negundi)，尖孢镰孢，多枝镰孢(Fusariumreticulatum)，玫瑰色镰孢，接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)，肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)，拟分枝孢镰孢，硫色镰孢Fusarium sulphureum)，Fusarium torulosum，Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum多肽。
在更优选的实施方案中，Fusarium venenatum细胞是Fusariumvenenatum A3/5，它本来被作为禾谷镰孢ATCC 20334而保藏，最近被重新归类为Fusarium venenatum(见：Yoder和Christianson 1998，真菌遗传学和生物学(Fungal Genetics and Biology)，23：62-80和O’Donnell等，1998，真菌遗传学和生物学，23：57-67)；以及Fusarium venenatum的分类学同等物而不管它们当前所称的种名。在另外的优选实施方案中，Fusarium venenatum细胞是在WO97/26330中Fusarium venenatum A3/5或Fusarium venenatum ATCC20334的形态学突变体。
很容易理解的是，就上述种而言，本发明包含其完全阶段和不完全阶段，以及其他的分类学同等物，例如无性型，而不管它们所称的种名。本领域技术人员将会很容易地识别适当的同等物的同一性。举例来说，镰孢的分类学同等物被D.L.Hawksworth，P.M.Kirk，B.C.Button，和D.N.Pegler(编辑)，1995，“Ainsworth & Bisby’s Dictionaryof the Fungi”，第八版，CAB International，大学出版社，剑桥，英国，第173-174页所定义。
公众可以很容易地在许多培养物保藏中心得到这些种的菌株，例如：美国典型培养物保藏中心(ATCC)，德意志微生物保藏中心(DSM)，真菌菌种保藏中心(CBS)，和农业研究机构保藏中心(NRRL)。
此外，这样的多肽可以是通过使用前述的探针，从包括微生物在内的其他来源中识别和获得的，而这些微生物是从自然界(举例来说，土壤，堆肥，水等)中分离的。从其自然的生活环境中分离微生物的技术在本领域是广为人知的。通过同样地筛选另外的微生物的基因组或cDNA文库，就可能获得核酸序列。一旦用探针检测出编码多肽的核酸序列，就可以使用那些本领域普通技术人员所熟知的技术(例如：见Sambrook等，1989，前已述及)分离或克隆该序列。
正如在此定义的那样，“分离的”多肽是基本上不含其他的非葡聚糖酶多肽的多肽，举例来说，由十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所确定的纯度至少是约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，甚至更最优选约95％纯。
由本发明的核酸序列所编码的多肽也包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中在所述多肽或其片段的N-端或C-端融合着另外一个多肽。融合多肽是通过将编码另外一个多肽的核酸序列(或它的一部分)与本发明的核酸序列(或它的一部分)融合而制备出来的。产生融合多肽的技术在本领域是已知的，包括将编码各多肽的编码序列进行连接，以便它们符合读框，并且融合多肽的表达是在相同的启动子和终止子的调控之下。B1.编码内切壳多糖酶活性的核酸分子
内切壳多糖酶指的是通过在壳多糖聚合物中随机裂解C1和C4键而降解壳多糖的多肽。在第一个实施方案中，本发明指向编码具有内部壳多糖活性的多肽的分离的核酸分子，其选自：
(a)与下列序列有至少75％核苷酸序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO：18的第18位到1217位核苷酸；
(b)编码具有内切壳多糖酶活性的多肽的核酸序列，所说的多肽具有与SEQ ID NO：11或19的第1到399位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列；
(c)在中度或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸序列：(i)SEQ ID NO：10的第186位到1385位核苷酸；SEQ ID NO：18的第18位到1217位核苷酸；(ii)(i)的至少100个连续核苷酸的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(d)  (a)、(b)或(c)的子序列，其中该子序列编码有内切壳多糖酶活性的多肽片段。
真菌内部壳多糖核酸分子包括：编码内切壳多糖酶及指导和调控内切壳多糖酶编码序列的转录和翻译表达的基因组序列；以及编码内切壳多糖酶的cDNA序列。
编码具有内切壳多糖酶活性的多肽的核苷酸序列的具体实施方案在SEQ ID NO：10和18中给出。可作为范例的内切壳多糖酶基因产物具有SEQ ID NO：11和19所给出的预测氨基酸序列。F.venenatum内切壳多糖酶未修饰的全长cDNA序列在SEQ ID NO：10中给出。该cDNA序列长度是1494bp。产生的可读框(编码部分)开始于第186位碱基，终止于第1385位碱基，编码一个长度为399个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：11)。一个编码具有内切壳多糖酶活性的多肽的经过修饰的全长cDNA序列在SEQ ID NO：18中给出。此cDNA长度是1227bp。可读框开始于第18位碱基，终止于第1217位碱基，编码一个长度为399个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：19)。对未经修饰的内切壳多糖酶序列所做的一个修饰是CA丰富的5’前导序列GGATCCACCAACCAGCG(ENDO 5’引物中的#1-#17碱基。表2)的替代。经过修饰的5’前导序列直接存在于内切壳多糖酶编码序列的ATG起始密码子的上游。该修饰使得前导序列富含C和A核苷酸，并将T核苷酸的量减到最少。这些特性据说在植物中可以提高基因的翻译效率。含有内切壳多糖酶cDNA 5’部分的DNA序列(图2)呈现在SEQ ID NO：6中，引物的其余部分就被设计于此，该部分cDNA长度是467bp。
在另外的一个实施方案中，所说的核酸分子是包含在质粒ENDO167中的序列(SEQ ID NO：18，是F.venenatum的内切壳多糖酶经过修饰的全长cDNA序列)，该质粒包含在大肠杆菌NRRL B-30202中。
在另外的一个实施方案中，所说的核酸分子是包含在质粒FvEndoS或FvEndoAS中的序列，这两个质粒分别包含在大肠杆菌NRRL B-30206和NRRL B-30207中。
本发明也包含与SEQ ID NO：10或18的编码区有一定程度的序列同一性的核酸序列，其中所述序列同一性是至少75％，优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选约95％，且该序列编码具有内切壳多糖酶活性的多肽，内切壳多糖酶活性就是通过裂解内部糖苷键而降解壳多糖的能力。就本发明而言，两个核酸序列之间的同一性的程度由Clustal方法确定(Thompson等，1994)，使用ClustalW 1.7或1.8版(http：//dot.imgen.bcm.tmc.edu：9331/multi-align/multi-align.html)以及下列各项成对比对参数：K-tuple＝2；裂隙减分＝5；窗口大小＝4；对角线-4。多序列比对参数是：裂隙开始减分＝10；裂隙伸展减分＝5。
进一步说，那些在上面定义过的中度或高度严格条件下能与SEQID NO：10或18的DNA序列编码区杂交并编码具有内切壳多糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本发明中。
本发明也包含那些在上面定义过的中度或高度严格条件下与SEQ ID NO：10或18的DNA序列编码区杂交的子序列，这些子序列是至少100个连续核苷酸，优选至少200个连续核苷酸的子序列。
本发明进一步包含那些在上面定义过的中度或高度严格条件下与SEQ ID NO：10或18的DNA序列编码区杂交的核酸序列或核酸序列子序列的互补链。这些子序列为至少100个连续核苷酸，优选至少200个连续核苷酸的子序列。
本发明进一步指向上述核酸序列的子序列，其中该子序列编码具有内切壳多糖酶活性的多肽片段。B2.具有内切壳多糖酶活性的多肽
本发明也指向分离的、由上述核酸分子编码的具有内切壳多糖酶活性的多肽。分离的具有内切壳多糖酶活性的多肽包含：
(a)具有与SEQ ID NO：11或19的第1到399位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由在中度或高度严格条件下可以与下列序列杂交的核酸序列所编码的多肽，这些序列是：(i)SEQ ID NO：10的第186位到1385位核苷酸或SEQ ID NO：18的第18位到1217位核苷酸；(ii)至少100个连续核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(c)(a)或(b)的具有内切壳多糖酶活性的片段。
由分离的核酸序列编码的如下多肽也包括在本发明中，这些多肽所含有的氨基酸序列与SEQ ID：11或19的氨基酸序列具有一定程度的同一性，这种序列同一性为至少约85％，优选至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约97％，而且这些多肽具有内切壳多糖酶活性(同源多肽)。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度由Pearson(1990)的FASTA/FASTP方法所确定，使用ALIGN程序(http：//dot.imgen.bcm.tmc.edu：9331/seq-search/alignment.html)，以及BLOSUM50或PAM250评分矩阵和下列各项成对比对参数：在裂隙中的第一个残基的裂隙减分＝-12，其它残基的裂隙减分为-2；K-tuple＝2。多序列比对是由BLOSUM矩阵进行的，使用ClustalW1.7算法(Thompson等，1994)。多序列比对参数是：裂隙开始减分＝10，裂隙伸展减分＝0.05；亲水性裂隙减分功能打开(亲水性残基GPSNDQERK)；并有残基特异性裂隙减分。
本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：11或19的氨基酸序列或其具有内切壳多糖酶活性的片段。在另外的优选实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：11或19的第1到399位氨基酸或其具有内切壳多糖活性的片段。
SEQ ID NO：11或19的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端删除了一个或更多个氨基酸的多肽。此片段优选包含至少339个氨基酸残基，更优选至少包含359个氨基酸残基，最优选至少包含379个氨基酸残基。
本发明涉及分离的具有内切壳多糖酶活性的多肽，其是由在上面详述过的中度严格条件或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸序列所编码的，这些序列是：(i)SEQ ID NO：10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO：18的第18位到1217位核苷酸；(ii)至少100个连续核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链。
SEQ ID NO：10或18的子序列可以是至少100个连续核苷酸或优选至少200个连续核苷酸。而且，该子序列可能编码具有内切壳多糖酶活性的多肽片段。
同义编码序列和保守氨基酸替代，正如上文详细描述的那样，在此通过参考而引入。
本发明多肽具有至少20％，优选至少40％，更优选至少60％，甚至更优选至少80％，甚至再更优选至少90％，最优选至少100％的SEQ ID NO：11或19的多肽的内切壳多糖酶活性。
本发明多肽可以是从上文详细描述过的任何属的微生物中获得的，这些微生物在此通过参考而引入。
正如在此定义的那样，“分离的”多肽是基本上不含其他的非内切壳多糖酶多肽的多肽，举例来说，由十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所确定的纯度是至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，甚至更最优选约95％纯。
由本发明的核酸序列所编码的多肽也包括如上文详细描述过的融合多肽或可裂解的融合多肽，在此通过参考而引入。C1.编码外切壳多糖酶活性的核酸分子
外切壳多糖酶指的是具有降解壳多糖能力的多肽，它从壳多糖聚合物的末端开始顺序裂解每个C1-C4键而降解壳多糖。在第一个实施方案中，本发明指向编码具有内部壳多糖活性的多肽的分离的核酸分子，其选自：
(a)与下列序列有至少75％核苷酸序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO：20的第18位到1763位核苷酸；
(b)编码具有内切壳多糖酶活性的多肽的核酸序列，所说的多肽具有与SEQ ID NO：13或21的第1到581位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列；
(c)在中度或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸序列：(i)SEQ ID NO：12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO：20的第18位到1763位核苷酸；(ii)(i)的至少100个连续核苷酸的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(d)  (a)、(b)或(c)的子序列，其中该子序列编码有内切壳多糖酶活性的多肽片段。
编码具有外切壳多糖酶活性的多肽的分离的核酸分子包括：编码外切壳多糖酶及指导和调控外切壳多糖酶编码序列的转录和翻译表达的基因组序列；以及编码外切壳多糖酶的cDNA序列。
编码外切壳多糖酶的核苷酸序列的具体实施方案在SEQ IDNOS：8，12和20中给出。可作为范例的外切壳多糖酶基因产物具有SEQ ID NO：13和21所给出的预测氨基酸序列。F.venenatum外切壳多糖酶未修饰的全长cDNA序列在SEQ ID NO：12中给出。此cDNA序列长度是1949bp。产生的可读框(编码部分)开始于第108位碱基，终止于第1853位碱基，编码一个长度为581个氨基酸的蛋白质。被编码的蛋白质被描述在SEQ ID NO：13中。F.venenatum的一个编码外切壳多糖酶的、经过修饰的全长cDNA序列在SEQ ID NO：20中给出。该cDNA长度是1781 bp。可读框开始于第18位碱基，终止于第1763位碱基，编码一个长度为581个氨基酸的蛋白质(SEQ IDNO：21)。对未经修饰的外切壳多糖酶序列所做的一个修饰是CA丰富的5’前导序列GGATCCACCAACCAGCG(EXO 5’引物中的#1-#17碱基。表2)的替代。经过修饰的5’前导序列直接存在于外切壳多糖酶编码序列的ATG起始密码子的上游。该修饰使得前导序列富含C和A核苷酸，并将T核苷酸的量减到最少。这些特性据说在植物中可以提高基因的翻译效率。
含有拟分枝孢镰孢外切壳多糖酶基因的5’部分的基因组DNA序列(图3)呈现在SEQ ID NO：8中。推导出的多肽序列在SEQ ID NOS：9中给出。基因组DNA序列长度是995bp，核苷酸序列分析显示它有2个外显子和一个内含子。
在另外的一个实施方案中，所说的核酸分子是包含在质粒EXO 9中的序列(SEQ ID NO：20，是F.venenatum的外切壳多糖酶经过修饰的全长cDNA序列)，该质粒包含在大肠杆菌NRRL B-30203中。
在另外的一个实施方案中，所说的核酸分子是包含在质粒FvExoS或FvExoAS中的序列，这两个质粒分别包含在大肠杆菌NRRLB-30208和NRRL B-30209中。
本发明也包含与SEQ ID：12或20的编码区有一定程度的序列同一性的核酸序列，其中所述序列同一性是至少75％，优选至少约80％，再优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选约95％，而且该序列编码具有外切壳多糖酶活性的多肽，外切壳多糖酶活性就是通过裂解末端糖苷键而降解壳多糖的能力。就本发明而言，两个核酸序列之间的同一性的程度由Clustal方法确定(Thompson等，1994)，使用ClustalW 1.7或1.8版(http：//dot.imgen.bcm.tmc.edu：9331/multi-align/multi-align.html)以及下列各项成对比对参数：K-tuple＝2；裂隙减分＝5；窗口大小＝4；对角线-4。多序列比对参数是：裂隙开始减分＝10；裂隙伸展减分＝5。
进一步而言，那些在上面定义过的中度或高度严格条件下与SEQID NO：12或20的DNA序列编码区杂交并编码具有外切壳多糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本发明中。
本发明也包含那些在上面定义过的中度或高度严格条件下与SEQ ID NO：10或18的DNA序列编码区杂交的子序列，这些子序列是至少100个连续核苷酸，优选至少200个连续核苷酸的子序列。
本发明进一步包含那些在上面定义过的中度或高度严格条件下与SEQ ID NO：12或20的DNA序列编码区杂交的核酸序列或核酸序列子序列的互补链，其中这些子序列是至少100个连续核苷酸，优选至少200个连续核苷酸的子序列。
本发明进一步指向上述核酸序列的子序列，其中子序列编码具有外切壳多糖酶活性的多肽片段。C2.具有外切壳多糖酶活性的多肽
本发明也指向分离的、由上述核酸分子编码的具有外切壳多糖酶活性的多肽。分离的具有外切壳多糖酶活性的多肽包括：
(a)具有与SEQ ID NO：13或21的第1到581位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由在中度或高度严格条件下可以与下列序列杂交的核酸序列所编码的多肽，这些序列是：(i)SEQ ID NO：12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO：20的第18位到1763位核苷酸；(ii)至少100个连续核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(c)(a)或(b)的具有外切壳多糖酶活性的片段。
图4显示了F.venenatum cDNA(上)和拟分枝孢镰孢基因组DNA(下)编码的外切壳多糖酶的比较(分别是SEQ ID NO：14和15)。
由分离的核酸序列编码的如下多肽也包括在本发明中，这些多肽所含有的氨基酸序列与SEQ ID NO：13或21的氨基酸序列具有一定程度的同一性，这种序列同一性为至少约85％，优选至少约90％，更优选至少约为95％，最优选至少约97％，而且这些多肽都具有外切壳多糖酶活性(同源多肽)。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度由Pearson(1990)的FASTA/FASTP方法所确定，使用ALIGN程序(http：//dot.imgen.bcm.tmc.edu：9331/seq-search/alignment.html)，以及BLOSUM50或PAM250评分矩阵和下列各项成对比对参数：在裂隙中的第一个残基的裂隙减分＝-12，其余残基的裂隙减分为-2；K-tuple＝2。多序列比对是由BLOSUM矩阵进行的，使用ClustalW 1.7算法(Thompson等，1994)。多序列比对参数是：裂隙开始减分＝10，裂隙伸展减分＝0.05；亲水性裂隙减分功能打开(亲水性残基GPSNDQERK)；并有残基特异性裂隙减分。
本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：13或21的氨基酸序列或其具有外切壳多糖酶活性的片段。在另外的优选实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：13或21的第1到581位氨基酸或其具有外切壳多糖酶活性的片段。
SEQ ID NO：13或21的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端删除了一个或更多个氨基酸的多肽。这个片段优选包含至少494个氨基酸残基，更优选至少包含523个氨基酸残基，最优选至少包含552个氨基酸残基。
本发明涉及分离的具有外切壳多糖酶活性的多肽，其是由在上面详述过的中度严格条件或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸序列所编码的，这些序列是：(i)SEQ ID NO：12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO：20的第18位到1763位核苷酸；(ii)至少100个连续核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链。
SEQ ID NO：12或20的子序列可以是至少100个连续核苷酸或优选至少200个连续核苷酸。而且，此子序列可以编码具有外切壳多糖酶活性的多肽片段。
同义编码序列和保守氨基酸替代，正如上文详细描述的那样，在此通过参考而引入。
本发明一个多肽可以是从上文详细描述过的任何属的微生物中获得的，在此通过参考而引入。
正如在此定义的那样，“分离的”多肽是基本上不含其他的非外切壳多糖酶多肽的多肽，举例来说，由SDS-PAGE所确定的纯度是至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，甚至最优选约95％纯。
由本发明的核酸序列所编码的多肽也包括如上文详细描述过的融合多肽或可裂解的融合多肽，在此通过参考而引入。D.编码细胞壁降解酶的核酸分子
任何编码具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的多肽的分离的细胞壁降解核酸分子都可以用于本发明。所使用的具体多核苷酸和氨基酸序列不是本发明的关键性特征，只要能实现所需要的细胞壁降解功能就行。E.与已知的真菌细胞壁水解酶的比较
对GenBank/EMBL序列数据库(Altschul等，1997)进行的计算机检索显示F.venenatum全长cDNA序列编码的多肽与已知的真菌细胞壁水解酶具有同一性。F.venenatum葡聚糖酶与来自酵母粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的葡聚糖1，3-β-葡萄糖苷酶(GenBank编号Z99126和AB000539)具有37％的氨基酸序列同一性；与来自酿酒酵母(SwissPro编号P15703；Klebl和Tanner，1989)和白色假丝酵母(SwissPro编号P43070)的葡聚糖1，3-β-葡萄糖苷酶具有34％的氨基酸序列同一性。F.venenatum内切壳多糖酶和外切壳多糖酶与来自其他真菌的壳多糖酶相类似。该内切壳多糖酶与一种来自构巢曲霉的壳多糖酶(GenBank编号D87063)的氨基酸序列具有56％的同一性，与来自粗球孢菌的壳多糖酶抗原具有53％的同一性(Yang等，1996；Zimmerman等，1996)，而且与来自Aphanocladium album的一个壳多糖酶具有48％的同一性(Blaiseau和Lafay，1992)。F.venenatum外切壳多糖酶与来自Trichoderma harzianum的两个外切壳多糖酶有66％和58％的氨基酸序列同一性(Draborg等，1995)，与来自T。harzianum的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶具有64％的同一性(Peterbauer等，1996)。II.使用探针识别和分离序列的同系物
其他镰孢属细胞壁降解基因或同系物基因，包括非功能的序列同系物的分离，可以使用许多技术来完成。例如，正如前面详细描述的那样，以公开的序列为基础的核酸探针可以用来从cDNA或基因组DNA文库分离所需要的基因。核酸探针可以是DNA或RNA。所需要的基因可以通过探针与目的序列的杂交而分离出来，这些目的序列包括基因组文库克隆、cDNA文库克隆或未克隆的分离的DNA或cDNA片段。杂交可以是在严格、高度严格、或低严格条件下在膜上或在溶液中进行的。核酸探针在真菌中可以被当做限制性片段长度多态性(RFLP)标记来使用，以进行基因座的遗传学作图，尤其在真菌中，或在真菌中识别同源基因或基因座。III.使用引物扩增核苷酸序列
以公开的序列为基础的引物可以用来分离来自cDNA或基因组文库的所需要的基因。感兴趣的核酸可以从核酸样品中使用扩增技术扩增出来。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可以用来直接从基因组DNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库中扩增镰孢属细胞壁降解酶和相关基因的序列。PCR和另外的体外扩增方法也可用于：举例来说，克隆编码被表达的蛋白质的核酸序列，制备核酸以作为检测在样品中所需要的DNA或mRNA的存在的探针；用于核酸测序；或其他的目的。对于PCR的一般综述参见：PCR程序：方法及应用指南(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)，Innis等，(编辑)，学术出版社，San Diego(1990)。IV.重组核酸分子(结构)的制备
在本发明的一个实施方案中，包含分离的细胞壁降解序列、并适合转化宿主细胞的重组核酸分子被制备出来。编码所需要的多肽的核酸序列，举例来说，编码全长蛋白质的cDNA或基因组序列，或编码同源多肽的核酸序列，适合用来构造重组表达盒，后者可以被导入所需要的宿主细胞内。表达盒典型地包含与一个或更多个调控序列可操作性地连接的镰孢属细胞壁降解核酸序列，所述调控序列在与之合适的条件下，指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达，表达盒还可能包括其他的转录和翻译起始调控序列，它们将会指导来自有义或反义基因的序列在被转化的宿主细胞的预期组织中的转录。表达将被理解为包括在多肽的产生中所涉及的任何步骤，包括但并不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
可以对编码本发明多肽的分离的核酸序列进行多种操作以便于多肽的表达。在该核酸序列被插入载体之前对它进行处理可能是所希望的或必须的，这取决于表达载体。利用重组DNA方法修饰核酸序列的技术在本领域广为人知。
调控序列包括对本发明的多肽的表达必须的或有利的所有成分。这样的调控序列包括但并不限于：前导序列，多聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列和转录终止子序列，这已经在上文详细描述过了。
在此使用的启动子序列指的是这样的DNA序列，当它连接到感兴趣的核苷酸序列上的时候，能够调控感兴趣的核苷酸序列转录成mRNA。这已经在上文详细描述过了。
启动子可能是组成型的。当术语“组成型的”关系到启动子的时候，就意味着该启动子能够在大多数缺乏刺激(例如：热休克，化学刺激，光刺激等)的环境和发育条件下和/或在几个或许多组织、细胞类型、或器官中，指导可操作地连接的核酸序列转录。
启动子可能是组织特异性或细胞特异性的。当术语“组织特异性”被应用于启动子时，它指的是启动子能够指导感兴趣的核苷酸序列在特异类型的组织(例如：花瓣)中的选择性表达，而同样的感兴趣的核苷酸序列在不同类型的组织(例如：根)中的表达则相对缺乏。启动子的组织特异性可以通过下列方法进行评估：举例来说，将启动子序列可操作性地连接报道基因，产生报道结构，将报道结构导入植物的基因组之内，以使得报道结构被整合进所产生的转基因植物的每个组织之内，并在转基因植物的不同组织中检测报道基因的表达(例如：检测mRNA，蛋白质，或被报道基因编码的蛋白质的活性)。
举例来说，组成型的植物启动子片段可能被用于指导镰孢细胞壁降解酶在几种到许多种植物组织中的表达。这样的启动子在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是有活性的。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区，来自于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1’-或2’-启动子，以及技术人员已知的、来自不同植物基因的其他转录起始区。
调控抗镰孢基因在谷类作物中的组成型表达的启动子和它们能够在其中显示活性的组织是：玉米遍在蛋白-1启动子，幼叶、根、花粉、种子(谷类作物)(Christensen和Quail，1996)；玉米Adh-1启动子，胚芽、根、花药、花粉、种子(稻)(Freeling和Bennett，1985)；稻ACT-1启动子，叶芽、根、花各部分，包括花粉(稻)(Zhang等，1991)；CaMV 35S启动子，叶、根(稻)(Battraw等)；ScBv启动子，茎、内稃、外稃、其他的小花器官，花药(燕麦)(Tzafrir等)，1998。
器官特异性启动子可以是：举例来说，来自贮藏池组织(Storagesink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自新陈代谢池组织例如分生组织(Ito等，1994，Plant.Mol.Biol.24：863-878)的启动子；或种子特异性启动子，例如来自稻的麦谷蛋白，谷醇溶蛋白，球蛋白或白蛋白启动子(Wu等，1998，植物和细胞生理学(Plant and CellPhysiology)39：885-889)；来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白质napA启动子，或在本领域已知的任何其他的种子特异性启动子。此外，启动子可以是叶特性启动子，例如来自稻或蕃茄的rbcS启动子(Kyozuka等，1993，植物生理学(PlantPhysiology)102：991-1000，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，分子遗传学和普通遗传学(Molecular and General Genetics)248：668-674)，或创伤诱导性启动子例如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)22：573-588)。
或者，植物启动子可以受环境或发育的调控。这样的启动子在此称作“诱导型”启动子。可能影响诱导型启动子转录的环境条件的例子包括：病原体攻击，无氧条件，或光的存在。
启动子增强子元件也可能用来在植物中实现基因的较高表达。例如，启动子增强子元件可能是被放置在启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等，1993，见上文，揭示了稻肌动蛋白基因的第一个内含子增强表达的用途。
在一个优选的实施方案中，使用特别适合在单子叶植物中表达基因的调节序列或启动子。举例来说，正如在下文实施所述的那样，我们选择了玉米的多聚遍在蛋白-1(Polyubiquitin-1)基因的启动子(Ubi-1，Christensen和Quail，1996)用来在小麦中调节葡聚糖酶和壳多糖酶基因的表达。Ubi-1启动子在许多谷物种类中是有活性的。因为它在许多不同的器官和组织中起作用，所以它被称“组成型的”启动子，这些器官或组织包括小麦的愈伤组织、幼叶、胚乳(A.Blechl，未发表)、成熟花粉、和小花器官(P.Okubara和A.Blechl，未发表)、稻的正在分裂的胚胎形成愈伤组织、叶、根和成熟花粉(Cornejo等，1993)，以及玉米苗的胚芽和基(Liu等，1995)。可以想象得到Ubi-1启动子的用途会被扩展到将该结构应用到对付那些攻击小麦其他器官的病原体和攻击其他谷类作物例如稻、玉米、燕麦和大麦的病原体。
启动子也能用来启始mRNA分子的转录而抑制基因的表达。使用重组DNA技术在宿主细胞中抑制基因表达的方法是广为人知的。例如，可以适当地使用反义技术。参见，例如：Sheehy等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：8805-8809(1988)和Hiatt等，美国专利4,801,340号。在有义方向导入核酸也已经显示出这是一个有效阻断目的基因的转录的方法。使用有义抑制方法调节内源性基因的表达一个实例可参见：Napoli等，植物细胞(The Plant cell)2：279-289(1990)，以及美国专利5,034,323号，5,231,020号，和5,283,184号。
调控序列也可能是合适的前导序列，它是对宿主细胞的翻译有重要作用的mRNA的一段非翻译区。前导序列可操作性地连接到编码多肽的核酸序列的5’端。在所选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列都可以在本发明中使用。
调控序列也可能是多聚腺苷酸化序列，它可操作性地连接到核酸序列的3’端，并且在转录的时候，被宿主细胞识别为在转录出的mRNA上加多聚腺苷酸残基的信号。在选择的宿主细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列都可以在本发明中使用。
调控序列也可以是信号肽编码区，它编码一段连接到多肽的氨基末端的氨基酸序列并且指导被编码的多肽进入细胞的分泌路径。核酸序列的编码序列的5’端可能天然地包含一个信号肽编码区，该编码区在翻译读码框架中天然地与编码被分泌的多肽的编码区片段连接。或者，编码序列的5’端可能包含这样的信号肽编码区，该编码区对编码序列而言是外源性的。当编码序列并没有天然地包含信号肽编码区的时候，就可能需要外源的信号肽编码区。或者，外源的信号肽编码区可能只是取代天然的信号肽编码区，以便提高多肽的分泌。然而，指导被表达的多肽进入被选择的宿主细胞的分泌路径的任何信号肽编码区都可能在本发明中使用。
含有来自细胞壁降解基因的序列的载体可能包含标记基因，它赋予植物细胞选择性表型。或者，而且对转化谷类作物更典型，标记基因可以是在单独的载体分子上被转化。举例来说，标记基因可能编码对杀虫剂的抗性，特别是对抗生素的抗性，例如对卡那霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素或除草剂的抗性；例如对chlorosulfuron或膦丝菌素(在bialaphos和Basta中的活性成分)的抗性。
正如在下面的实施例中所描述的那样，为了表达葡聚糖酶和壳多糖酶基因，我们构建了起源于pAHC20(Christensen和Quail 1996)的载体，其中bar选择性标记基因受玉米Ubi-1启动子(0.9kb，包括位于5’非翻译区的第一个外显子和第一个内含子)和NOS 3’终止子调节。赋予对除草剂bialaphos(de Block等，1987)的抗性的bar基因在我们的实验室中被成功地而且例行地当做转基因小麦植物的一个选择性标记。我们也使用了由Kent McCue博士(USDA-ARS，Albany，CA)设计的pUBK，设计pUBK的目的是避免使用氨苄青霉素抗性。为了构建pUBK，McCue博士用pBGS9(Spratt等，1986)的相应部分取代了pAHC20(Christensen和Quail 1996)的复制起点和氨苄青霉素抗性基因(bla)，pBGS9编码对卡那霉素的抗性(nptII)。pUBK可以从McCue博士那里公开得到。
制备重组转基因结构的另外一个因素是转基因mRNA的翻译效力。基因序列的计算机分析和体外实验表明：翻译开始的效率受位于ATG开始(起始)密码子前面并紧靠着该密码子的三个核苷酸(-3到-1)所调节。有报告称真核基因共有的起始密码子前-3到-1位核苷酸是ACC(Kozak 1987)；对植物基因的一项调查表明这三个核苷酸是共有序列ACA(Ftterer和Hohn，1996)；85个玉米基因优选GGC或AAG作为起始密码子前后序列(Luehrsen和Walbot 1994)。为了检查叶特异性mRNA的翻译起始的假设效力或花粉中的胚乳特异性mRNAs的翻译起始的假设效力，我们对一些来自GenBank和EMBL数据库的单子叶植物基因起始密码子前后的序列进行了一次有限的考察(普通小麦，大麦(H.vulgare)，稻(O.sativa)，燕麦(A.sativa)，玉蜀黍(Z.mays))。小麦叶mRNAs共有的起始密码子前后序列是GCC，单子叶植物花粉mRNAs共有的起始密码子前后序列是G/A，A/C，非T。
另外，ATG上游的15-20个核苷酸，包括-3到-1位核苷酸，在许多单子叶植物基因中是富含AC的。我们已经设计增强了外源基因例如在单子叶植物中的真菌基因的翻译效率。V.表达载体
本发明也涉及含有本发明的核酸序列、启动子以及转录和翻译的终止信号的重组表达载体。在上文描述过的各种核酸和调控序列可能被结合在一起构成重组表达载体，该载体可能包括一个或多个适当的限制性位点，在这样的位点将允许编码多肽的核酸序列的插入或替代。或者，本发明的核酸序列可以通过将该核酸序列或包含该序列的核酸结构插入一个适当的表达载体而表达。在构建表达载体时，编码序列被置于载体的适当位置以使得该编码序列可操作性地与适当的表达调控序列连接。
重组表达载体可能是任何载体(举例来说，质粒或病毒)，其能适宜地用于重组DNA操作并能实现核酸序列的表达。载体的选择典型地根据载体与将要导入该载体的宿主细胞之间的相容性来决定。载体可以是线性的或闭合的环形质粒。
载体可能是自主复制载体，也就是说，载体以一种独立于染色体外的实体形式存在，载体的复制并不依赖于染色体的复制，例如：质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可能含有保证自主复制的任何工具。或者，载体也可能是这样的：当它被导入宿主细胞以后，它被整合进基因组内并且与其整合的染色体一起复制。此外，也可以使用单一载体或质粒，或两个或更多个载体或质粒，它们共同包含将被导入宿主细胞基因组的全部DNA，或者也可以使用转座子。
载体也可能包含在宿主细胞中稳定核酸结构的整合和表达的序列。这些序列包括携带基质附着区(也被称为支架附着区)的DNA序列；举例来说，酵母或植物来源例如来自拟南芥属或小麦的序列。
载体也可能包含一个或多个选择性标记以便能够容易地选择被转化的细胞。
载体也可能包含一个或几个元件，该元件允许将载体整合进宿主细胞的基因组，或者允许在细胞中的载体不依赖于基因组而进行自主复制。
为了整合进宿主细胞的基因组内，载体可以依赖编码多肽的核酸序列或载体上的任何其他元件，以便通过同源或非同源重组的方式将载体整合进基因组内。
为了进行自主复制，载体可以进一步包含使得载体能够在所讨论的宿主细胞中进行自主复制的复制起点。
可将本发明核酸序列的一个以上的拷贝插入宿主细胞内，以便增加基因产物的产量。核酸序列拷贝数的增加可以通过将序列的至少一个附加拷贝整合进宿主细胞基因组内而获得，或通过包括可扩增的选择性标记基因与该核酸序列而获得。那些包含了选择性标记基因的扩增出来的拷贝，因而也就包含了该核酸序列的附加拷贝的细胞，可以通过在存在适当的选择性试剂的情况下培养这些细胞而选择出来。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的步骤对本领域技术人员来说已是众所周知的了(参见，例如：Sambrook等，1989，见上文)。VI.转基因宿主细胞的制备和多肽的生产
本发明也涉及包含本发明的核酸序列的重组宿主细胞，把它用在多肽的重组生产中是有利的。转化的宿主细胞的制备和克隆方法在美国专利5,374,540号中有描述，它也在此被列入作为参考文献。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物；或非单细胞的微生物，例如真核细胞。
真核细胞可以包括任何的细胞，例如来自昆虫，真菌类或植物的细胞。正如在上文中详细描述过的那样，术语“植物”包括全株植物，植物的部分或器官，植物组织。
本发明也涉及生产多肽的方法，包括在适合多肽生产的条件下培养宿主细胞并回收该多肽。细胞被培养在合适多肽生产的营养培养基中，使用的是在本领域中已知的方法。多肽可以使用本领域中已知的方法检测和回收。
本发明也涉及生产本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于多肽生产的条件下，培养含有编码有本发明酶活性的多肽的核酸序列的转基因植物或植物细胞；和(b)回收该多肽。
可以使用在本领域中已知道的对这种多肽特异性的方法检测多肽。这些检测方法可以包括使用特异抗体，酶产物的形成，或酶底物的消失。举例来说，正如在此描述的那样，可采用酶测定法确定多肽的活性。
产生的多肽可能通过本领域中已知的方法回收。例如，该多肽可以通过传统的步骤从营养培养基中回收，这些步骤包括但并不限于：离心，过滤，提取，喷雾干燥，蒸发或沉淀。
本发明多肽可以通过多种在本领域中已知的步骤进行纯化，包括但并不限于：色谱分析法(举例来说：离子交换，亲和层析，疏水层析，色谱凝焦法和分子筛法)；电泳步骤(举例来说，制备型等电聚焦)；差异溶解度(举例来说，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE或提取法(举例来说，见：蛋白质纯化(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden，编者，VCH出版社，纽约，1989)VIII.转基因植物的制备
表达本发明的RNA转录本或多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法构建。简而言之，植物或植物细胞是通过如下方式构建的：将编码本发明的多肽的一个或多个表达结构整合进植物宿主基因组内，并繁殖所产生的经过修饰的植物或植物细胞而获得转基因植物或植物细胞。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的转基因植物是谷类作物植物，包括但并不限于：小麦、黑麦、黑小麦、大麦、玉米、高粱和稻。在一个更优选的实施方案中，转基因植物是小麦、玉米、大麦、燕麦和黑麦。在一个备选的优选实施方案中，本发明的转基因植物是双子叶植物。
在上文描述过的DNA结构可以通过多种传统的技术被导入所需要的植物宿主基因组内。转化广泛多样的高等植物物种的技术是众所周知的，并被描述在技术和科学文献中。参见，例如：Weising等，Ann，Rev.Genet.22：421-477(1988)。
DNA结构可以通过使用下列技术直接导入植物细胞的基因组中，例如植物细胞原生质体或胚胎发生愈伤组织的生物轰击方法，电穿孔法，PEG穿孔法，和显微注射法。或者，DNA结构可能与合适的T-DNA侧翼区结合，使用根癌农杆菌或毛根农根菌(A.rhizogenes)载体导入细胞。
术语“撞击”、“轰击”和“生物轰击”指的是使粒子加速撞向靶生物学样品(例如：细胞，组织等)，以造成靶生物学样品细胞的细胞膜的损伤和/或使粒子进入靶生物学样品内的方法。生物轰击的方法在本领域广为人知(举例来说，美国专利5,584,807号，其内容在此被列入作为参考文献)，而且是商品化的(举例来说，氦气驱动的微粒加速器(PDS-1000/He)(BioRad)。
粒子轰击技术在Klein等，Nature 327：70-73(1987)中被描述。一个特别优选的转化小麦和其他的谷类作物的方法是轰击起源于未成熟胚胎的愈伤组织，如Week等，Plant Physiol，102：1077-1084(1993)描述的。
显微注射技术在本领域广为人知并在科学和专利文献中被很好地描述。使用聚乙二醇沉淀导入DNA结构的方法在Paszkowski等，EMBO J.3：2717-2722(1984)中有描述。电穿孔技术在Fromm等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 82：5824(1985)中有描述。
根癌农杆菌介导的转化技术也被很好地描述在科学文献中。参见：例如Horsch等，Science，233：496-498(1984)，和Fraley等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 80：4803(1983)。虽然农杆菌主要用于双子叶植物中，但某些单子叶植物也可以被农杆菌转化。例如：农杆菌转化稻就被Hiei等，Plant J.6：271-282(1994)；美国专利5,187,073号；美国专利5,591,616号；Li等，中国科学(Sciencein China)34：54(1991)；和Raineri等，Bio/Technilogy 8：33(1990)描述过。Xu等，Chinese J.Bot.2：81(1990)通过农杆菌感染转化了玉米、大麦、黑小麦和芦笋。
本发明特别用于小麦和其他的谷类作物。转化谷类作物的许多方法已经在文献中被描述过了。例如，小麦——包括高度再生品种例如硬质白色春小麦Bodwhite的稳定转化的可靠方法，就已经被描述过了(Vasil等，1992，1993；Week等，1993；Becker，1994；Nehra等，1994，Blechl和Anderson，1996)。Blechl等的美国专利5,650,558号和5,914,450号描述了小麦和非小麦谷类植物的转化，这些专利在此被列为参考文献。Chen等(1998)将一个受35S启动子调控的稻壳多糖酶基因导入小麦。它在第一代中被表达，但随后在后代植物中沉寂下来。Jensen等(1998)将一个受自身启动子调控的修饰过的热稳定1，3-1，4-葡聚糖酶基因导入大麦，并获得了在发芽的糊粉和子叶盘中表达该基因的植物。Bliffeld等(1998)将一个受玉米遍在蛋白-1启动子的调控的大麦种子II类壳多糖酶基因导入小麦，包含该结构的二个转基因植物系显示它们对由真菌禾白粉菌引起的感染的抗性增加了，该真菌可引起白粉病。
转基因玉米再生体已经由Fromm等，Bio/Technology8：833-839(1990)和Gordon-Kamm等，植物细胞(Plant cell)2：603-618(1990)描述过了。同样地，燕麦(Sommers等，Bio/Technology 10：1589-1594(1992))，高粱(Casas等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：11212-11216(1993))，稻(Li等，Plant Cell Rep.12：250-255(1993))，大麦(Yuechun & Lemaux，Plant Physiol.104：37-48(1994))，和黑麦(Castillo等，Bio/Technology  12：1366-1371(1994))已经通过轰击被转化。稻的转化被Toriyama等，Bio/Technology 6：1072-1074(1988)，Zhang等，Theor.Appl.Gen 76：835-840(1988)，和Shimamoto等，Nature 338：274-276(1989)所描述。
本发明进一步涉及瞬时表达所要求保护的序列的植物、种子、植物组织、植物器官和植物细胞。涉及表达指的是在植物中从所要求保护的DNA序列产生mRNA和/或蛋白质，而质粒并没有稳定整合进入宿主基因组。这样的表达可以在使用粒子枪轰击、土壤杆菌和其他的用于转化植物的方法导入DNA后1到14天被观察到。
通过上述的任何转化技术产生的转化植物细胞可以被培养以便产生全株植物，该植物拥有被转化的基因型和所需要的表现型。这样的再生技术依赖于在组织培养生长培养基中控制某些植物生长激素，典型地依赖与细胞壁降解多核苷酸序列一起被导入的杀虫剂和除草剂标记。从培养的原生质体中再生植物的方法在Evans等，原生质体分离与培养，植物细胞培养手册(Protoplasts Isolation andCulture，Handbook of Plant Cell Culture)，Macmillian出版公司，纽约，pp.124-176 1983；以及Binding，植物的再生，植物原生质体(Regeneration of Plant，Plant Protoplasts)，CRC出版社，Boca Raton，pp.21-73 1985中被描述。再生也可以从植物的愈伤组织、外殖体、器官、或其部分中获得。这样的再生技术在Klee等，Ann.Rev.of Plant.Phys 38：467-486(1987)中有一般性描述。
被转化的植物是通过所需要的性状的存在与否和/或所需要的性状的表达程度来进行评价的。最先的评价可以包括新导入的基因的表达水平，被转化的植物的真菌抗性水平，和所需要的性状的遗传稳定性。
技术人员应明了，在表达盒稳定地整合进转基因植物中而且确认这种整合是可操作性的以后，它可以通过有性杂交而导入其他的植物中。用来将所需要的表现型转移给植物繁殖种群的一种技术是通过回交。然而，许多的标准育种技术之中的任何一种都可以使用，这取决于所要杂交的物种。
遭受真菌攻击的任何植物物种或品种都可以被一种或多种本发明的遗传结构所转化，以便增强对镰孢或其他的病原体的抗性，举例来说，增强对镰孢性穗枯萎病和其他的真菌性疾病的抗性，包括通过(a)产生细胞壁降解酶，包括有能力降解F.venenatum和其他的镰孢属种(包括禾谷镰孢和大刀镰孢，这些真菌是美国的穗枯萎病(疮痂病)的主要致病因素)的细胞壁成分葡聚糖和壳多糖的蛋白质，(b)在转基因单子叶植物(包括小麦、大麦或燕麦)中表达细胞壁降解酶，以赋予部份或者完全的对镰孢属种和小麦和其他的谷类作物其他真菌病原体的抗性，(c)限制致病性镰孢的传播以及减少DON在受感染的穗上的蓄积，和(d)在双子叶植物中表达细胞壁降解酶以赋予对植物病原体的抗性。
下面的非限制的名单是真菌性疾病的举例说明：镰孢性穗枯萎病，由尖孢镰孢或腐皮镰孢引起的镰孢萎蔫，由串珠镰孢引起的茎干腐烂病，由疫霉引起的真菌性疾病。
为了进一步说明，下面的非限制性物种名单列举的是特别感兴趣的单子叶植物：小麦、稻、大麦、玉米、黑麦、燕麦、高粱、黑小麦。
转基因系的分析可以通过Northern印迹法、原位杂交法、RT-PCR法、S1核酸酶保护实验、RNase保护实验、Western印迹、酶测定或其他的方法来进行，以监测mRNA或蛋白质的表达。IX.用途
如上文所述，本发明的一种特别的用途是提供如下植物或植物细胞，这些植物或植物细胞是被编码葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶的编码序列的DNA序列转化过的，这种转化使植物具有了对植物病原体的抗性，特别是对镰孢属物种的抗性。
同样，本发明的另外一种用途是提供能够在镰孢属真菌中检测葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶基因或其功能性等价物的探针和引物，以及该探针在分离编码葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶基因或其功能同等物的DNA序列中的用途。
使用本发明的核酸序列将便于从宿主分离同源基因以获得保护包括真菌和植物在内的宿主细胞，对抗相关的真菌病原体的基因。
本发明序列的另外一种用途是以反义方向用作基因敲除。
另外的一种用途是为研究目的而产生镰孢细胞壁降解蛋白质。
另外的一种用途是产生细胞壁降解性壳多糖酶和葡聚糖酶以用于降解海产食物的废弃物，例如包含壳多糖的贝壳，或用于对壳多糖或葡聚糖进行化学修饰。概述：
在我们下面的实施例中，我们详细地描述了在抗击小麦和其他的农作物的镰孢性穗枯萎病(疮痂病)和其他镰孢介导疾病中所做的工作。我们分离出编码能够降解真菌细胞壁的葡聚糖和壳多糖成分的酶的cDNAs和基因，并从F.venenatum中识别出三个不同的cDNA克隆(编码葡聚糖酶，内切壳多糖酶，和外切壳多糖酶)，从拟分枝孢镰孢中识别出内切壳多糖酶和外切壳多糖酶的基因同系物。F.venenatum是穗枯萎病的致病因子禾谷镰孢的一个近亲。F.venenatum和拟分枝孢镰孢都产生与穗枯萎病病原体所产生的真菌毒素类似的毒素。来自镰孢属物种的细胞壁降解酶是真菌正常的生长和发育所需要的。
我们检查了来自F.venenatum的EST的两个葡聚糖酶cDNA克隆，一个内切壳多糖酶cDNA克隆，以及三个外切壳多糖酶cDNA克隆的核苷酸序列。两个葡聚糖酶cDNA克隆被确定为全长序列，而所有的壳多糖酶克隆都是缺少了5’端的不完全cDNA克隆，缺少成分包括ATG翻译起始密码子在内。为了恢复缺少的序列，我们对拟分枝孢镰孢的基因组文库进行了被称为5’锚式PCR的聚合酶链式反应(PCR)。产生的内切和外切壳多糖酶的5’基因组片段不能直接添加到不完全的cDNA克隆上，因为每个片段都携带了内含子。然而，这些5’片段的核苷酸序列为寡核苷酸PCR引物的设计提供了必须的数据，以便用该引物最终获得全长克隆。
为了获得内切和外切壳多糖酶的全长cDNA克隆，我们使用F.venenatum的cDNA文库进行了第二个聚合酶链反应程序。用来扩增cDNAs的引物去除了编码区侧翼的大部份非翻译序列。对基因的5’末端有特异性的PCR引物包括附加的核苷酸，其用A或C核苷酸替代了紧靠ATG起始密码子上游的15-16个碱基。AC丰富的起始密码子前后序列(以及5’侧翼核苷酸)预计会在多种小麦和其他的单子叶植物器官中使基因转录物的翻译变得更加容易。PCR引物把一个5’BamHI限制位点和一个3’BglII限制位点加入cDNAs的扩增部分的末端。这些位点对于将cDNAs克隆到我们的单子叶植物表达载体中是有用的。
内切和外切壳多糖酶PCR产物，以及葡聚糖酶cDNA，首先被克隆到细菌载体pCR2.1或pBKS+中。为接下来的克隆程序生产适当量的cDNA质粒可以在细菌宿主中很容易做到。同时，在所有三个cDNAs被克隆到细菌载体中之后，要对它们的核苷酸序列进行验证，以便核对PCR扩增在5’区引入了修饰以及除去了不必要的侧翼序列而不改变编码区。然后cDNAs被引入pUBKBgl II-载体之内，以便在单子叶植物中进行表达。该单子叶植物表达载体携带了来自玉米多聚遍在蛋白-1(Ubi-1)基因的启动子，赋予对除草剂bialaphos抗性的bar基因，一个来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(nos)基因的3’终止子片断，和赋予对抗生素卡那霉素抗性的npt II标记基因。一个位于Ubi-1启动子中的Bgl II限制性酶切位点被定点诱变所消除。这使我们能够用限制性酶Bgl II和BamHI从pUBKBglII中除去bar基因，并用F.venenatum cDNAs取而代之。我们获得了三个cDNAs的有义方向和反向序列(总共6个)，它们是根据启动子-转基因和转基因-终止子接合点的核苷酸序列而确定的。
普通小麦(Triticum aestivum)品种Bodwhite的胚胎被携带了有义方向cDNAs的质粒加上携带了bar基因的选择性标记质粒同时进行轰击。使用在实验室中发展的方法来培养愈伤组织和再生植物。根据在存在除草剂bialaphos的情况下(bar基因赋予抗性)的生长情况选择候选转基因植物。来自候选转化体的叶部分的DNA进一步用PCR方法进行分析，所用的第一个引物是根据玉米Ubi-l启动子序列设计的，第二个引物是分别对每个转基因(葡聚糖酶，内切壳多糖酶和外切壳多糖酶)有特异性的引物。那些携带转基因DNA的植物正在繁殖，为的是生产转基因纯合的种子。纯合系转基因的表达以及对禾谷镰孢和其他的真菌病原体的抗性都要进行检测。
实施例
下列实施例仅仅想要对本发明作进一步的阐述，而不是想要限制由权利要求书所定义的本发明的范围。实施例中使用了许多对下列领域的技术人员来说是众所周知而且也是容易理解的技术，这些领域包括分子生物学领域；植物组织中进行的重组DNA操作；以及转基因植物的培养和再生。酶都是从商业来源获得的，并且都是按照卖主推荐的方法或其他本领域熟知的变通方法来使用的。提供标准的分子生物学程序的参考文献包括：Sambrook等，分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉港实验室，Painview，纽约；R.Wu(编辑)(1993)，酶学方法(Methods in Enzymology)218；Wu等(编辑)，酶学方法100，101；Glover(编辑)(1985)；DNA克隆(DNA Cloning)，第一卷和第二卷，LRL出版社，牛津，英国；以及Hames和Higgins(编辑)(1985)，核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)，LRL出版社，牛津，英国。有关植物组织的处理和转化的参考文献有：Kung和Arntzen(编辑)(1993)，植物生物技术(Plant Biotechnology)，Butterworths，Stonehan，MA；R.A.Dixon(编辑)(1985)，植物细胞培养：实用方法(Plant CellCulture：A Practical Approach)，LRL出版社，牛津，英国；Schuler和Zielinski(1989)，植物分子生物学方法(Methods in PlantMolecular Biology)，学术出版社，San Diego，CA；Weissbach和Weissbach(编)(1988)Academic Press，San Diego，CA；I.Potrykus(1991)Ann.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.42：205；Weising等，(1988)Annu.Rev.Genet.22：421；van Wordragen等(1992)，Plant Mol.Biol.Rep.19：12；Davey等(1989)，Plant.Mol.Biol.13：273；Walden和Schell(1990)，Eur.J.Biochem.192：563；Joersbo和Brunstedt(1991)，Physiol.Plant.81：256以及在这些参考文献中引用的参考文献。所使用的缩写和专门用语被认为是本领域的标准用法并通常见于专业杂志，例如在此引用的杂志。所有在本申请中引用的参考文献在此被清楚地并入本文作为参考。实施例1F.venenatum菌丝的分离
F.venenatum CC1-3是镰孢属ATCC 20334株的一个形态突变株(Wiebe等，1991，Mycol.Research 95：1284-1288)。用批量进料发酵法在2升实验室规模的发酵罐中培养Fusarium venenatumCC1-3，使用作为碳源的NUTRIOSEJ(Roquette Freres，S.A.，Beinheim，法国)和酵母提取物进行培养。培养时供给磷酸铵。pH值维持在6-6.5，温度维持在30℃，伴有活性溶解氧。
分别在接种后的2，4，6，8天收集菌丝的样品并迅速地在液氮中冷冻。将样品保存在-80℃中，需提取RNA时取出使用。实施例2cDNA文库的构建
用Timberlake和Barnard的方法(1981，细胞(Cell)26：29-37)提取实施例1中所获得的菌丝样品的总细胞RNA。将RNA在含1％甲醛的凝胶上印迹后用Northern杂交的方法分析这些RNA(Davis等，1986，分子生物学的基础方法(Basic Methods in MolecularBiology)，Elsevier Science Publishing Co，Inc，纽约)。用mRNA分离试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)，按照使用说明从细胞的总RNA中分离多聚腺苷酸化的mRNA部分。根据Gubler和Hoffman的方法(1983，基因(gene)25：263-269)，用大约5μg的poly(A)+mRNA合成双链cDNA，以NotI-(dT)18引物(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)起始第一条链的合成。绿豆核酸酶(Boehringer Mannheim Corporation，Indianapolis，IN)处理cDNA后，用T4 DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)补平末端。
以NotI酶切cDNA，通过琼脂糖凝胶电泳选择合适大小的片段(约0.7-4.5Kb)，然后和pZErO-2.1(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)载体相连接。pZEro-2.1预先用NotI和EcoRV进行酶切，并用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim公司，Indianapolis，IN)进行去磷酸化处理。连接产物转化大肠杆菌TOP10的感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的2YT琼脂板上选择转化体(Miller，1992，细菌遗传学短期教程(A Short Course in Bacterial Genetics)。大肠杆菌及相关细菌的实验操作手册，冷港泉出版社，冷港泉，纽约)。
用克隆载体pZErO-2.1构建两个独立的定向的cDNA文库。文库A用接种后4天收获的菌丝的mRNA构建，文库B用接种后6天收获的菌丝的mRNA构建。为了检测基因在细胞中有代表性的表达“瞬志图(snapshot)”，两个文库都不进行扩增。而是对文库进行铺板，滴定，并对来自每个文库的独立的克隆进行DNA测序分析。
文库A(4天的细胞)含有7.5×104个独立的克隆。文库B(6天的细胞)大约有1.2×105个克隆。从每个文库的各40个克隆中小量制备DNA并检测cDNA是否插入及其插入片段的大小。在这项分析中，来自A文库的40个克隆中有39个(97.5％)克隆有大小在600bp至2200bp(平均＝1050bp)的片段插入。类似的，从B文库中挑选的40个克隆中39个克隆(97.5％)有片段插入，其大小在800bp至3600bp之间(平均＝1380bp)。实施例3模板的制备及核苷酸的测序
在实施例2中所描述的各cDNA文库中，直接从转化平板上各挑选1192个转化体克隆，转移到含有200μl 2YT肉汤培养基(Miller，1992，见上文)和50μg/ml卡那霉素的96孔微孔板中。将这些板放置在37℃中过夜培养，不需要摇晃。培养后，往每个孔中加入100μl 50％无菌的甘油。转化物复制到二级深盘的96孔微量培养板上(Advanced Genetic Technologies Corporation，Gaithersburg，MD)，每个孔中含有1ml的Magnificent BrothTM(MacConnellResearch，San Diego，CA)和50μg/ml的卡那霉素。最初的微量板保存在-80℃，二级深孔板在37℃摇床中剧烈震荡(300rpm)，过夜培养。为了防止液体洒出和相互污染以及供给充足的氧气，在每个二级培养板上盖上一个聚丙烯板(Advanced GeneticTechnologies Corporation，Gaithersburg，MD)和一个塑料微量碟盖。
用经Utterback等改进(1995，Genome Sci.Technol.1：1-8)的高级遗传技术公司(Advanced Genetic Technologies Co.)的96孔Miniprop试剂盒的方法从每个孔中分离DNA，用Peikin-Elmer应用生物系统377型测序仪XL(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，Foster City，Ca)进行单途径DNA测序，使用染料终止化学(Giesecke等，1992，病毒学方法杂志(Journal of Virolog Methods)38：47-60)和反向Lac测序引物(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MD)。实施例4DNA序列数据的分析
核苷酸序列资料经认真仔细的分析，如果样品间距错误或不确切程度超过2％，那么该样品要被舍弃或重测。在FACTURATM软件(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)的协助下将载体的序列移除。另外，如果序列的模糊碱基信号数增多则将每个样品的序列的末端截短。用AutoAssemblerTM软件(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)将所有的序列进行互相比较以确定重复度。最后，将所有序列按照三个读码框架进行翻译，并用GeneAssistTM软件(Perkin-ElmerApplied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)在非冗余数据库(NRDB)中进行搜索，所用的算法是改进的Smith-Waterman算法，采用阈值为70的BLOSUM 62矩阵。NRDB是由Genpept，Swiss-Prot，及PIR数据库所组成的。实施例5编码推定的壳多糖裂解酶的ESTs的确定
用应用生物系统377型XL自动DNA测序仪，根据使用手册的说明，对随机cDNA克隆作部分测序，识别出编码推定的壳多糖裂解酶的EST克隆，将每个EST的推定的氨基酸序列和NRDS中的氨基酸序列进行比较，NRDS是从公用的蛋白和核酸数据库构成的(如：GENBANK，EMBL，TREMBL，GENPEPT，SWISSPROT，PIR)。显示推定的氨基酸序列与Trichoderma harzianum的外切壳多糖酶(TREMBLP78739)，粗球孢菌(Coccidioides immitis)内切壳多糖酶1的前体(SWISSPROT P54196)，粗球孢菌壳多糖酶(PIR JC4565)，来源于酿酒酵母的外切-β-1，3-葡聚糖酶(SWISSPROT P15703)，来源于热纤维梭菌的多聚-β-氨基葡萄糖苷酶(TREMRL Q59326)，Emericella nidulans壳多糖酶(GENPEPT D87063)，及来源于家蚕蛾的壳寡糖裂解性(chitooligosaccharidolytic)β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(SWISSPROT P49010)有同一性的EST翻译用实施例4的方法鉴定。实施例6用带有葡聚糖酶全长cDNA，内切壳多糖酶及外切壳多糖酶部分cDNA的质粒转化大肠杆菌
从实施例5中选出2个F.venenatum葡聚糖酶克隆，1个内切壳多糖酶克隆和3个外切壳多糖酶克隆，这些克隆都是在pZErO-2载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。按实施例5所描述的方法，通过和GenBank数据库中已知的壳多糖酶和葡聚糖酶的序列进行配对比较以确定这些克隆的同一性。从cDNA 5’端的初步的核苷酸序列(ESTs)中选出1个全长的葡聚糖酶克隆，1个内切壳多糖酶cDNA克隆，3个外切壳多糖酶部分克隆中最长的一个用于进一步的研究。
用电穿孔方法将大约5到10ng带有上述3种cDNA的质粒分别导入大肠杆菌宿主NM522株中。对每份50μl细胞(3.5×107/μg)，用Bio-Rad Gene Pulser(Bio-Rad，Hercules，CA)在0.2cm间隙杯中用2500伏电压进行电穿孔。电穿孔后的细胞悬浮在1ml含有2％(w∶v)细菌培养用的蛋白胨，0.5％(w∶v)酵母提取物，0.05％(w∶v)氯化钠，20mM葡萄糖，10mM氯化镁及2.5mM氯化钾的培养液中。将细胞在37℃放置60分钟，以200-300rpm的速度摇动。取每份50到200μl的细胞涂布到含50μg/ml的硫酸卡那霉素的LB琼脂平板上。在37℃培养16-20小时后，将长势良好的细菌克隆转移到一个新鲜的LB-卡那霉素平板上。从这个储备平板上挑取单个克隆另外培养，用于质粒DNA的分离提取。实施例7质粒DNA的分离提取
30ml含上述cDNA克隆的大肠杆菌在37℃振荡培养16-18小时以进行质粒DNA的分离提取。所用的培养液是经过修改的LB，含1.5％(w∶v)细菌培养用的蛋白胨，0.75％(w∶v)酵母提取物，0.75％(w∶v)氯化钠，pH＝7.0，15mM Tris-Cl缓冲液，1.5mM氯化镁及50μg/ml的硫酸卡那霉素。在4℃，8000xg离心10分钟以收集细胞。根据Qiagen Plasmid Midi试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)的使用说明分离质粒DNA，用QIAprep 8试剂盒和QIAvacManifold-6S(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)从1.5ml的培养液中分离提取质粒DNA。实施例8用限制性内切酶处理鉴定cDNA克隆
用Lasergene软件程序EditSeq和MapDraw(DNASTAR，Inc，Madison，WI)分析初步核酸序列(ESTs)资料以确定限制性酶识别位点的存在。使用能够在一条或多条cDNA编码序列中或在pZErO-2的多接头区中进行裂解的限制性酶。按照酶制造商的使用说明，用ApaI，BamHI，EcoR I或Kpn I在总体积15μl溶液中酶切按实施例7所述方法制备的DNA(大约0.5-1μg)。酶切产物在含40mM TRIS乙酸、pH 8.2，1mM EDTA的1％的琼脂糖中分离，溴化乙锭溶液染色(约1μg/ml)。用紫外光源(UVT 400-M transilluminator，IBIKodak，Rochester，NY)照射以显色观察。结果如下表1所示：
                                  表1
  质粒/cDNA   限制性酶   获得的片段(kb)   理论片段(kb)
葡聚糖酶内切壳多糖酶外切壳多糖酶 Apa IBamHIEcoRIKpn IApa IBamHIEcoRIKpn IApa IBamHIEcoRIKpn I 3.7，0.64.44.4未消化3.7，0.94.64.54.5，0.34.74.74.73.8，0.9 3.6，0.7~4.3~4.3未消化3.7，1.04.5-4.74.5-4.74.4，0.24.5-4.74.5-4.74.5-4.73.3，1.4
实施例9葡聚糖酶全长cDNA克隆、内切壳多糖酶及外切壳多糖酶部分cDNA克隆的核苷酸序列确定及序列分析。
一个葡聚糖酶cDNA克隆，内切壳多糖酶cDNA克隆，以及最长的外切壳多糖酶cDNA克隆被挑选出来进行更严格的、双链核苷酸序列的测定。用改进的Sanger法(1977)，根据ABI Prism BigDyeTM终止物循环测序现成反应试剂盒(Perkin Elmer Applied Biosystems，Foster City CA)对每个cDNA进行测序，它的反应体系是：总体积为20μl，其中质粒DNA用量为2μl、250-600ng，BigDye Terminator混合物8μl，引物1μl(4μM)。PCR在PTC-100可编程热调节器(MJ research，Watertown，MA)中进行(25个循环：96℃ 30秒，50℃ 15秒，60℃ 4分钟)。使用通过含有50mg(干重)用水吸收的、DNA级sephadex G-50 Fine(Amersham Pharmacia，Biotech AB，Uppsala，瑞典)的柱子的方法，从未标记荧光的双脱氧核苷酸中富集有荧光标记的PCR产物。这些克隆和其他DNA模板序列资料都是用ABI Prism 310基因分析仪获得的。使用下面的条件可以得到最好的结果：注射时间是45秒，注射的电压是3kV，运转时间是90-120分钟，运转电压为15kV，温度是42℃，用Seq POP6(1ml)E模块。用ABI Prism 310基因分析仪的数据收集软件1.0.2版(PerkinElmer Applied Biosystems，Foster City CA)进行序列数据的组装和校对。
插入到pZErO质粒中的cDNA的5’和3’端的核苷酸序列通过使用引物M13F(5’GTAAAACGACGGCCAG)和M13R(5’AGCGAATAACAATTTCACACAGGA)而获得。另外的序列用是通过引物步行而获得的。为这个目的而合成的引物有：用于葡聚糖酶cDNA的902A和902B；用于内切壳多糖酶克隆的958A-D；用于外切壳多糖酶克隆的1082 A-D，如表2所示。葡聚糖酶cDNA有1023bp。未修饰的葡聚糖酶cDNA的全长见SEQ ID NO：1。琼脂糖凝胶电泳测定表明：内切壳多糖酶未修饰的部分cDNA是1290bp，外切壳多糖酶未修饰的部分cDNA是1390bp。
用BLASTN和BLASTX算法(Altschul等，1997)将序列和GenBank数据库的数据进行比较。F.venenatum葡聚糖酶部分cDNA序列显示它与来自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的1，3-β-葡糖苷酶的基因(Accession Number Z99126)有60％-70％的氨基酸序列同一性。葡聚糖酶cDNA是全长序列，它的ATG起始密码子的位置和观察到的粟酒裂殖酵母基因的ATG的位置基本相同。F.venenatum内切壳多糖酶部分cDNA片段和来自粗球孢菌的壳多糖酶抗原(编号U33265，Yang等，Infect.Immun.，64：1992-1997(1996))有70％-80％的氨基酸序列同一性。外切壳多糖酶部分cDNA序列的片段和来自Trichoderma harzianum的外切壳多糖酶基因(AccessionNumber S800069，Draborg等，Biochem.Mol.Biol.Int.36：781-791(1995))有80％的氨基酸序列同一性。根据与在数据库搜索中识别出的序列进行的比较以及根据内切和外切壳多糖酶cDNA序列缺乏候选的5’ATG起始密码子，证明它们都是部分序列。
                表2  用于聚合酶链式反应实验的引物名称             目的            靶DNA                   序列(5’至3’)128           外切壳多糖酶PCR    λgt11                 TCCTGGAGCCCGTCAGTATCGG
          产物5’端测序      克隆载体129           外切壳多糖酶5’           λgt11                  TGGCTGAATATCGACGGTTTCC
          部分PCR扩增        克隆载体410           内切壳多糖酶PCR    pZERO-2                ATTTAGGTGACACTATAG
          产物5’端测序      克隆载体720           内切壳多糖酶5’           pZero-2                CAGGACAGGAAACAGCTATGACC
          部分PCR扩增        克隆载体902A          葡聚糖酶cDNA       葡聚糖酶               CTATCAAGCAGCACGG
          测序，正向         cds902B          葡聚糖酶cDNA       葡聚糖酶               CTGGAAGGTCTTGAGGC
          测序，反向         cds958A          壳多糖酶cDNA       内切壳多糖酶           GATATCGATTGGGAGTACC
          测序，正向         cds958B          壳多糖酶cDNA       内切壳多糖酶           CATGGTACGTGACTGAGG
             测序，反向               cds958C             壳多糖酶cDNA             内切壳多糖酶       CAACCCTCAGTCACGTAC
             测序，正向               cds958D             壳多糖酶cDNA             内切壳多糖酶       CCTCGTTGGCATCCTG
             测序，反向               cds1003             外切壳多糖酶5’                       外切壳多糖酶       AGATCCTTATAGGCAAGCTCAACGACACCG
             部分PCR扩增              cds1009             外切壳多糖酶             外切壳多糖酶       CATAAATACCGGCAAGATCC
             PCR产物5’测序           基因5’部分1010             内切壳多糖酶             内切壳多糖酶       ATCGATATCTATACCGTCAAAACCG
             5’部分PCR扩增           cds1011             内切壳多糖酶             内切壳多糖酶       ATCGATATCTATACCGTCAAAACCG
             PCR产物5’测序           cDNA 5’部分1014             葡聚糖酶基因组           pFSC22-2           ATCTGCTGGGCGAGCTTC
             片段测序1015             葡聚糖酶基因组           pFSC22-2           CAGAAACCACTGGCATCC
             片段测序1016        葡聚糖酶基因组            pFSC22-2             AAGTTCGGCCTTACTTGC
        片段测序1017        葡聚糖酶基因组            pFSC22-2             CTTTGGGCTCGTATTCAC
        片段测序1018        葡聚糖酶基因组            pFSC22-2             CTTCAGCACTCTCAGCAC
        片段测序1021        葡聚糖酶基因组            pFSC22-2             GGACTGAGGGAGTGTTGGTTC
        片段测序1023        葡聚糖酶基因组            pFSC22-2             TCTACCCTACAACACTCATC
        片段测序1038        葡聚糖酶基因组            pFSC22-2             GTCGATCATGGTGGAAAG
        片段测序1040        葡聚糖酶基因组            pFSC22-2             TGTCCCTGTTACTAACGG
        片段测序1042        葡聚糖酶基因组            pFSC22-2             TAGTCGCCTTTCTAAGCC
        片段测序1047            外切壳多糖酶PCR        外切壳多糖酶           AAGAATGCCTCGATGAGGGTACTCG
            产物5’测序            基因5’部分1048            外切壳多糖酶PCR        外切壳多糖酶           ATCTCACTCACCTCACCTC
            产物5’测序            基因5’部分1082A           壳多糖酶cDNA           外切壳多糖酶           CCGGTATTTATGAGTATGG
            测序，正向             cds1082B           壳多糖酶cDNA           外切壳多糖酶           GATAGTCTCAGTCCATACGG
            测序，反向             cds1082C           壳多糖酶cDNA           外切壳多糖酶           GTACCTTGACTGTGGGC
            测序，正向             cds1082D           壳多糖酶cDNA           外切壳多糖酶           GGAAATGCGAGGGAAG
            测序，反向             cdsENDO 3’                   起始密码子前后序列     内切壳多糖酶           AGATCTCGCCTCAATTGTCCGGGAACC
            修饰                   基因ENDO 5’                   起始码子前后序列       内切壳多糖酶           GGATCCAACACCACGCGATGGGTGGTGGA
            修饰                   基因EXO 3’                     起始密码子前后序列     外切壳多糖酶           AGATCTGCGTCAAATTTATCATCCCTCG
                                   基因EXO 5’                       起始密码子前后序列        外切壳多糖酶    GGATCCACCAACCAGCGATGTGGTCCAAG
             修饰                      基因            GCTCTTCTGGCCGTTGFVEN B1          PCR扩增泛素-内部壳        内切壳多糖酶    GCTTCATGCAACCGTACAAGTTGG
             多糖酶基因融合物          cdsFVEX B1          PCR扩增泛素-外部壳        外切壳多糖酶    CGACTTCACCCACTGCTTCTTTTGC
             多糖酶基因融合物          cdsFVGLU B1         PCR扩增泛素-葡聚糖        葡聚糖酶        CCCAGACGCCAACAAGGATCTTC
             酶基因融合物              cdsGLUC 3’                     起始密码子前后序列        葡聚糖酶        AGATCTGGCTTAGCAAGTAAGGCTGAAC
             修饰                      基因GLUC 5’                     起始密码子前后序列        葡聚糖酶        GGATCCACCAACCAGCGATGAAGTTCTTCA
             修饰                      基因            GCACTCTTAGCGlucgene-1       葡聚糖酶基因组            pFSC22-2        GTACTGGGTTGGTGAGAC
             片段测序Glucgene-2       葡聚糖酶基因组            pFSC22-2        CCATTCCAAGACCAGGC
             片段测序NOS A            跨转基因-NOS融合          NOS 3’UT       CCCATCTCATAAATAACGTC
      边界测序UBI 1A    跨泛素-转基因融合    泛素启动子          CCTGCCTTCATACGCTAT
      边界测序UBI A2    PCR扩增泛素-转基因   泛素启动子          CCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGC
      融合物UBI 1B    启动子中突变BglII    泛素启动子          GACACCAACCAGCGAACCA
      位点测序UBI 1E    用定点突变去除       泛素启动子          CACACACAACCAGATTTCCCCCAAATCCACC
      启动子的BglII位点UBI 1F    用定点突变去除       泛素启动子          GGTGGATTTGGGGGAAATCTGGTTGTGTGTG
      启动子的BglII位点实施例10编码葡聚糖酶和内切壳多糖酶和外切壳多糖酶基因5’端的拟分枝孢镰孢基因组DNA片段的分离和测序。
葡聚糖酶。按照实施例9的方法，从pFSC22-2质粒克隆中获得编码葡聚糖酶的拟分枝孢镰孢基因组片段的核苷酸序列。用于测序的引物是：1014，1015，1016，1017，1018，1021，1023，1038，1040，1042，Glucgene-1和Glucgene-2(表2)。如实施例9所述对序列进行校对和组装。
内切壳多糖酶。从0.5μg拟分枝孢镰孢cDNA文库中用PCR方法扩增获取内切壳多糖酶cDNA的5’端(图2)，所用的引物是1010(来自内切壳多糖酶EST)和720(来自pZERO-2序列，作为M13反向引物)。1010/720反应的PCR条件是：94℃，30秒(第一个循环为1分钟)；52℃，25秒；72℃，60秒，25个循环。在用琼脂糖凝胶分离后，纯化该PCR产物。内切壳多糖酶的PCR产物的核酸序列资料是用410和1011引物获得的，其中410和克隆载体pZERO-2(Invitrogen)的SP6启动子相对应，1011和内切壳多糖酶cDNA相对应。1011/410循环测序反应的PCR条件是94℃，30秒(第一个循环为1分钟)；52℃，25秒；72℃，50秒，25个循环。注意：1011/410反应利用内部引物以减少PCR初始反应的非特异性扩增。
外切壳多糖酶。如Huynh等1984所述，在Lambda噬菌体λgt11中构建拟分枝孢镰孢的基因组文库。从拟分枝孢镰孢文库(20μl反应中有0.5μg的DNA)中扩增外切壳多糖酶基因的5’部分(图3)。所用的引物是与位于λgt11克隆载体EcoRI酶切位点上游的序列相对应的129引物(Huynh等1984)，以及和外切壳多糖酶cDNA相对应的1003引物。129/1003反应的PCR条件是：94℃，30秒(第一个循环为1分钟)；52℃，25秒；72℃，135秒，25个循环。通过琼脂糖凝胶纯化所得到的PCR产物。PCR产物的核苷酸序列资料(外切壳多糖酶基因的5’部分)是用128和1009引物获得的，128引物是和位于λgt11克隆载体EcoRI酶切位点上游的序列相对应的，1009引物是和外切壳多糖酶cDNA相对应的。128/1009循环测序反应的PCR条件是94℃，30秒(第一个循环为1分钟)；52℃，25秒；72℃，50秒，共25个循环。注意：第二个PCR反应(128/1009)利用内部引物以减少初始PCR反应的背景。实施例11全长内切壳多糖酶和外切壳多糖酶cDNA序列的组装
用视觉检测及用MapDraw软件(DNASTAR，Inc，Madison，WI)分析可读框的方法检测部分cDNA的核苷酸序列和对应的5’端PCR产物的重叠部分。直接从部分cDNA序列和5’端cDNA PCR产物的序列组合构建拟分枝孢镰孢外切壳多糖酶全长序列。这个全长外切壳多糖酶cDNA代表拟分枝孢镰孢5’基因组序列毗连到F.venenatum部分cDNA序列所形成的合成物。外切壳多糖酶信息转录的开始点被假定为紧接着推定的TATAA共有元件的第一个A核苷酸。实施例12含有经过修饰的起始密码子前后序列的全长cDNA的产生
用PCR扩增的方法获得了带有富含AC碱基的5’非翻译区的930bp全长葡聚糖酶cDNA。PRC扩增反应体系是：50ng经EcoRI酶切的葡聚糖酶质粒DNA，0.4uM GLUC 3’和GLUC 5’引物(表2)，0.2uM各种脱氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，TTP)，及1个单位的Elongase(Gibco BRL，Rockville，MD)，在总共50μl的缓冲液(60mM TRIS硫酸盐，PH 9.1，18mM的硫酸铵，1mM的硫酸镁)中进行反应。PCR反应在92℃ 30秒，57℃30秒，68℃ 60秒进行5个循环，然后是25个循环：92℃ 30秒，62℃ 30秒，68℃ 60秒。
用PCR方法对基因组DNA片段进行扩增，获得了内切壳多糖酶和外切壳多糖酶的全长cDNA，所用的引物分别是：ENDO3’加ENDO 5’引物，或EXO3’加EXO 5’引物(表2)。产生内切壳多糖酶全长cDNA的最后一步是在100μl反应体系中进行扩增，所用的引物是ENDO5’和ENDO3’，各32pmol。用Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)对F.venenatum cDNA文库“A”(大约0.5礸)进行的扩增是按照制造商使用说明在Pfu缓冲液中完成的。扩增的条件是：94℃ 30秒(第一个循环1分钟)；56℃ 25秒；72℃ 150秒，25个循环。所用的仪器是PE 2400热循环仪(Perkin Elmer)。所获得的片段分别按实施例6和17中所述的方法克隆到细菌和单子叶植物表达载体中。
PCR扩增外切壳多糖酶全长cDNA是在100μl反应体系中完成的，所用的引物是EXO5’和EXO3’，各32pmol。按制造商的使用说明，在Pfu缓冲液中用Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)完成F.venenatum cDNA文库“A”(约0.5μg)的扩增。所用的仪器是PE 2400热循环仪(Perkin Elmer)。PCR的条件是：94℃ 30秒(第一个循环1分钟)，56℃ 25秒，72℃ 150秒，25个循环。获得的PCR产物经凝胶电泳纯化后，分别按实施例6和18中所述的方法克隆到细菌和单子叶植物表达载体中。
用琼脂糖凝胶分离方法将cDNA片段从未整合的引物及其他的PCR产物中分离出来(实施例8)。具有所需要的片段大小的PCR产物(葡糖聚酶是930bp，内切壳多糖酶是1240bp，外切壳多糖酶是1780bp)用干净的剃刀片从胶中切下。然后按推荐的方法用硅珠(GENECLEAN Spin Kit，BIO 101，Inc，CA)吸附来从胶中回收片段。用水从硅基质中洗脱cDNA片段，保存在-80℃，用于下一步的克隆实验(实施例16-18)。实施例13单子叶植物表达载体pUBKBgl II-的构建
用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)和使用说明，将pUBK的Ubi-1启动子区的Bgl II限制性内切酶识别位点去除。将pUBK质粒DNA悬浮到下列反应混合物中：125ng引物UBI 1E(表2)，125ng引物UBI 1F(表2)，每种脱氧核苷酸各10mM，2.5单位Pfu聚合酶，在总共50μl 20mM的TRIS盐酸，pH 8.0，10mM氯化钾，6mM的硫酸铵，2mM的硫酸镁，0.1％ Triton X-100，10μg/ml的牛血清白蛋白中。PCR反应在DNA热循环仪(PerkinElmer Cetus，目前在Foster City，CA)中进行，扩增条件是：96℃ 30秒，55℃ 25秒，68℃ 13分钟，16个循环。得到的扩增产物用10个单位的Dpn I限制性内切酶在37℃酶切1小时。将1μl DpnI酶处理后的PCR混合物和大肠杆菌XL1-Blue宿主菌的感受态细胞在冰上孵育30分钟，立即转移到42℃的水浴中放置45秒，再到放置冰上2分钟。细胞悬浮到0.5ml含1％(w∶v)NZ胺，0.5％(w∶v)酵母提取物，0.5％(w∶v)氯化钠，20mM葡萄糖，12.5mM氯化镁，及12.5mM硫酸镁的液态培养基中。以225rpm的速度在37℃振荡孵育1小时。用1700xg的速度在4℃离心3分钟以浓缩细胞，然后将细胞涂布到含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB琼脂平板上。
显示能在LB-卡那霉素平板上生长的细菌菌落被培养在1.5ml含卡那霉素的LB液中，以便按实施例7所述的方法分离提取质粒DNA。将该质粒DNA用Bgl II限制性酶处理，并按实施例8所述在琼脂糖凝胶上观察酶切产物。观察到一个单一的片段，这表明在pUBK上的两个Bgl II位点中的一个已经在经过诱变处理的质粒中被除去了。跨径突变位点的Ubi-1启动子区部分的核苷酸序列资料是按实施例9所述的方法获得的，使用的是UBI 1B引物(表2)。除了将AGATCT(BglII位点)转变成AGATTT以外，还注意到Ubi-1启动子一部分的296p重复(见图5)。
经过诱变的质粒进一步被BamH I+Bgl II，Pst I和Pvu II限制性内切酶所处理，使用的是制造商推荐的方法，酶切产物按照实施例8所述的方法在琼脂糖凝胶上显色观察。经过诱变的质粒缺失了大约0.7kb的DNA，这段DNA存在于定点诱变前的pUBK上。为了修补这个缺失，用Hind III和BamH I限制性内切酶从经过诱变处理的质粒上切下一段2.0kb的部分，然后将其连接到已经切除了天然的Hind III-BamH I片段的pUBK质粒上。连接反应大约在10μl50mM Tris盐酸，pH 7.8，10mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇，2mM ATP，50μg/ml牛血清白蛋白中含有50ng 2.0kb片段，50ng pUBK载体，0.5单位T4连接酶。反应在15℃孵育17小时。电感受态(electrocompetent)大肠杆菌NM522细胞在存在1μl连接混合物的情况下接受电穿孔，并进一步被按照实施例6的方法进行处理。六个抗卡那霉素的细菌菌落被分别培养在1.5 ml LB-卡那霉素培养液中，以便按照实施例7所述的方法分离提取质粒。正如预期的那样，这些质粒在用Hind III+BamH I消化后给出4.5kb和2.0kb片段，用Bgl II处理后给出大约6.6kb的单一片段。一个被称作单子叶植物表达载体的质粒被选择出来以进行下面的克隆实验。实施例14小麦器官中修饰的Ubi-1启动子的活性
为了测定突变后的Ubi-1启动子的活性，用携带突变区的2.0kb的HindIII-BamHI片段(实施例13)替换携带有Ubi-1-β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因(uidA)融合物的质粒的复制起点区，使得GUS报告基因处于修饰后的Ubi-1启动子的调控之下。按照实施例19中描述的步骤，将该质粒导入普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)的胚中。测定uidA转基因系中小花器官的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)活性。
携带至少一个Ubi∷uidA转基因拷贝的转基因小麦全穗通过用70％的乙醇处理5分钟，20％(v/v)漂白剂处理15分钟进行表面消毒。全穗用灭菌水冲洗4到5次，灭菌水或者是被高压消毒过的，或者是通过0.2微米Millipore滤膜过滤的。在无菌工作台中解剖小花，这样将颖片、外稃、内稃、发育的种子和花药分开。小花器官立即浸入含有10mM磷酸钠缓冲液，pH7，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，0.5％(w∶v)Triton X-100，330μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的底物溶液中(Jersey Lab and Glove Supply，Livingston，NJ)。黑暗中孵育16-20小时，弃底物溶液。植物材料用pH 7的0.1M磷酸钠缓冲液漂洗两次。相继浸入70％，80％和90％乙醇溶液，每种溶液20-24小时，除去绿色组织中的叶绿素和其他色素。用90％乙醇重复处理直至组织变为半透明和近白为止。在小麦的发育中的种子和花粉中出现的深蓝色色素表明GUS基因的活性，证明修饰的Ubi-1启动子在这些器官有活性。在颖片、外稃和内稃的含四叶绿素的细胞或组织中也检测到GUS的活性。在冠毛或花药中没有看到GUS的活性。实施例15将修饰过的全长cDNAs导入细菌克隆载体
代表葡聚糖酶、内切壳多糖酶、外切壳多糖酶的全长cDNA片段并带有富含AC的5’非翻译区序列15到16个碱基的PCR产物连接进入pCR2.1载体(Invitrogen，Carlsbad，CA；用于葡聚糖酶)或Bluescript载体pBKS+(Stratagene，La Jolla，CA；用于内切壳多糖酶和外切壳多糖酶)中。如实施例13所描述进行连接，其中使用预先用Smal限制性酶切割的大约50-100ng细菌载体DNA和60ng的PCR产物。按照实施例6所述转化大肠杆菌NM522宿主细胞(对葡聚糖酶)或者DH5-α宿主细胞(对内切壳多糖酶和外切壳多糖酶)。在含有100μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板上筛选转化体。
为了利于鉴别含有内切壳多糖酶和外切壳多糖酶cDNAs的转化体，采用了菌落印迹杂交的方法(Sambrook等，1989)。羧苄青霉素抗性的菌落按有序陈列转移到新鲜琼脂板上和LB-羧苄青霉素琼脂上覆有一张Hybond N+尼龙膜(Amersham)的直径82厘米的圆盘上。转移的菌落在37℃生长16-18小时。沾有菌落的尼龙圆盘被置于一张用0.5N氢氧化钠、1.5M氯化钠浸泡的3MM(Whatman)滤纸上5分钟，在干净的纸上简单吸干，然后转移到用pH7.0，0.5M TRIS-Cl，3M氯化钠浸泡的纸上5分钟。菌落圆盘浸入2×SSC(0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，pH7.0)中10分钟，并以60-70转/分钟的速度振荡，使细菌碎片分散，再在新鲜的2× SSC中漂洗，空气中干燥。菌落圆盘置于Hybaid杂交炉(National Labnet，Woodbridge，NJ)内玻璃管的20ml杂交液中，杂交液组成为5×SSC，0.1％(w∶v)十二烷基肌胺酸钠，0.02％(w∶v)十二烷基硫酸钠和封闭试剂(BoehringerMannheim)，65℃孵育17到18小时。菌落圆盘转移到10ml含有20-25ng热变性的探针的新鲜杂交液中，在杂交炉中65℃孵育16到20小时。在终体积20μl体系中，用约100ng内切壳多糖酶和外切壳多糖酶PCR产物和4μl DIG HighPrime Mix，37℃孵育16到20小时，制备地高辛配基标记的杂交探针(Boehringer Mannheim)。在0.5M氯化锂和2.5倍体积95％或100％乙醇中，-80℃ 20分钟沉淀探针DNA，去除未整合的标记。探针DNA重悬于水中，以备杂交溶液中使用。在杂交管中按照下列程序洗杂交膜：50ml 2×SSC，0.1％ SDS室温洗5分钟两遍，50ml的0.5×SSC，0.1％ SDS，65℃洗25分钟两遍。膜转移到到1升的烧杯中，室温下以70到75转/分的速度与下列溶液孵育：100ml 0.1M顺丁烯二酸，0.15M氯化钠，pH7.5，0.3％(v∶v)Tween 20；100ml 0.1M顺丁烯二酸，0.15M氯化钠，pH7.5和0.1倍体积封闭液，30分钟；40ml 0.1M顺丁烯二酸，0.15M氯化钠，pH7.5，0.1倍体积封闭液和4μl抗-DIG-AP偶联物(Boehringer Mannheim)；100ml 0.1M顺丁烯二酸，0.15M氯化钠，pH7.5，0.3％(v∶v)Tween 20洗两遍，每次15分钟；40ml 0.1MTRIS-Cl，pH9.2，0.1M氯化钠，5分钟。膜上与地高辛杂交的菌落可以用CSPD试剂(Boehringer Mannheim)检测，随后在XAR 5型科学成象胶片上曝光(柯达，Rochester，NY)。
候选的葡聚糖酶cDNA克隆用BamHI+BglII，EcoRI或EcoRV处理；候选的内切壳多糖酶cDNA克隆用BamHI，BglII，和BamHI+BglII处理；候选的外切壳多糖酶cDNA克隆用BamHI，BglII，BamHI+BglII，Clal，和Xhol处理。限制性酶消化后的带型表明所有的三个cDNAs以两种方向克隆进细菌质粒载体中，而且每种cDNA都加上了BamHI和BglII位点。
为了要证实PCR反应和克隆的忠实性，按照实施例9所述，每种cDNA两条链的核苷酸序列通过自动荧光测序获得(见SEQ ID NOS.16，18，和20)。按第三部分所述的方法分析cDNA的双链序列以确定限制性位点的存在，并利用BLASTX分析与GenBank数据库中的序列的匹配。实施例16将修饰过的全长葡聚糖酶cDNA导入单子叶植物表达载体之中
核苷酸序列与原始的cDNAs具有同一性的经PCR修饰过的cDNAs被导入单子叶植物表达载体pUBKBglII-中，以用于小麦转化实验。该单子叶植物表达质粒载体用BamHI和BglII限制酶完全酶切。pUBKBglII-质粒载体DNA按照实施例8所述方法在琼脂糖上分离纯化。
选择葡聚糖酶编码序列的5’端插在pCR2.1上T7启动子和M13正向引物位点近端的葡聚糖酶克隆，以构建修饰过的葡聚糖酶cDNA。在pCR2.1上用BamHI限制酶部分酶切修饰过的葡聚糖酶cDNA，程序如下：在1.5ml锥形底管中，25μg葡聚糖酶质粒DNA重悬于125μl含有150mM氯化钠，10mM TRIS-Cl，pH7.9，1mM氯化镁，1mM二硫苏糖醇和100μg/ml牛血清白蛋白的溶液中。每份30μl混合液分到其他2管中。在留有混合液的第一管中，加入10个单位BamHI酶，彻底混合。然后，取30μl质粒-限制酶混合液加到30μl质粒混合液而不含BamHI酶的管中，并彻底混合。获得的溶液将BamHI酶稀释了2倍。用第2管质粒混合液(没有BamHI酶)相继稀释酶混合液，直至酶稀释为约1∶4。所有3管在37℃孵育85分钟。可以在1％琼脂糖凝胶上看到代表部分BamHI酶切产物的4个不同DNA片段。在含有1∶4稀释的BamHI酶的酶切混合物中，取约6到8μg质粒DNA在1％琼脂糖上分开。从琼脂糖凝胶切下约1kb带有修饰过的葡聚糖酶cDNA的片段，并按照实施例12所述的硅珠法纯化。
约36ng葡聚糖酶cDNA片段和220ng用BamHI和BglII消化的pUBKBglII-载体DNA在10μl体系中15℃连接22小时。2μl连接产物按照实施例6所述方法用来转化大肠杆菌DH5-α宿主菌。选择可以生长在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上的细菌菌落。按照实施例7所述，从1.5ml液体培养物中制备细胞。质粒DNA和pUBKBglII-DNA在1％琼脂糖上分离约1小时，电压69V。在琼脂糖凝胶中显示迁移较慢的质粒进一步用BamHI+BglII或BamHI限制酶处理。相对于Ubi-1启动子，修饰过的葡聚糖酶cDNA正向插入可以得到一个0.55kb大小的BamHI片段，不同于反向插入的cDNA所产生的0.39kb的BamHI片段。
选择数个代表不同方向的克隆，并通过核酸测序确认。用引物UBI 1A(见表2)测定Ubi-1启动子-葡聚糖酶基因融合物(Ubi∷Glu)接合区的序列；用引物NOS A(见表2)测定葡聚糖酶基因-NOS终止子融合物(Glu：NOS)序列。并给出代表正向和反向克隆的修饰过的葡聚糖酶cDNA序列。正向插入序列中，Ubi-1连接区的BamHI位点位于cDNA的5’末端(图6)。BglII位点和含有EcoRI位点的pCR2.1多接头区47个碱基DNA均位于3’端。在反义方向，位于Ubi-1-cDNA连接区的BamHI位点后面接着47bp的pCR2.1多接头区(含一个EcoRI位点)，然后是位于修饰过的葡聚糖酶cDNA 3’端的BglII位点。(图7)。反向版本还在cDNA-NOS终止子连接区包含一个无功能的嵌合BamHI-BglII位点。实施例17将修饰过的全长内切壳多糖酶cDNA导入单子叶植物表达载体
修饰过的全长内切壳多糖酶cDNA来自如下克隆，该克隆中编码区5’端接近pBKS+质粒的T7启动子位点。用30个单位BamHI和30单位BglII限制酶完全酶切约4μg质粒DNA，反应体系50μl，含150mM氯化钠，10mM TRIS-Cl，pH7.9，1mM氯化镁，1mM二硫苏糖醇和100μg/ml牛血清白蛋白。根据实施例12的方法，利用硅珠分离在琼脂糖凝胶中回收cDNA片段。按照实施例13的方法，连接90ng cDNA片段和440ng用BamHI和BglII消化的pUBKBglII-，连接体系15μl。用3μl连接混合物转化大肠杆菌DH5-α细胞(见实施例6)，在37℃，存在50μg/ml硫酸卡那霉素的条件下生长。从候选的卡那霉素抗性克隆中抽提质粒DNA。在琼脂糖凝胶中迁移比pUBKBglII-慢的质粒用BamHI和BglII限制酶切开。某些(正向)克隆中可以看到一个约1.2kb片段。反向克隆预期没有被BamHI+BglII切开的质粒。
用引物UBI 1A(见表2)测定部分克隆的Ubi-1启动子-内切壳多糖酶cDNA融合连接区的序列；用引物NOS A(见表2)测定内切壳多糖酶cDNA-NOS终止子融合物的序列。在pUBKBglII-中cDNA代表性有义和反义方向分别如图8和9所示。内切壳多糖酶的有义克隆包含有位于Ubi-1-编码序列连接区的BamHI限制位点和cDNA-NOS连接区的BglII限制位点。内切壳多糖酶反义克隆中不存在BamHI和BglII位点。实施例18将修饰过的全长外切壳多糖酶cDNA导入单子叶植物表达载体
为获得修饰过的外切壳多糖酶cDNA，选择外切壳多糖酶的如下克隆，其中外切壳多糖酶编码序列的5’端接近pBKS+的T3引物位点。用20个单位BamHI处理约3μg质粒DNA，终体积30μl，含有150mM氯化钠，10mM TRIS-Cl，pH7.9，1mM氯化镁，1mM二硫苏糖醇和100μg/ml牛血清白蛋白。在37℃消化90分钟。按照实施例8的方法，从琼脂糖凝胶中纯化约2.0kb的cDNA片段。连接混合物中含有约60ng cDNA片段和220ng pUBK Bgl II-DNA(见实施例16)。大肠杆菌DH5-α转化体的产生和生长如实施例15所述。用UBI 1A和NOS A引物分析迁移速率比pUBKBglII-载体慢的质粒DNA的核苷酸序列(实施例9)，确定编码序列在pUBKBglII-中的方向。其它的外切壳多糖酶克隆用菌落印迹程序鉴定(见实施例15)。pUBKBglII-中有义和反义插入的外切壳多糖酶cDNA的代表性序列分别如图10和11所示。外切壳多糖酶的有义克隆在Ubi-1-编码序列连接区有一个BamHI限制位点，在cDNA-NOS连接区有一个BglII限制位点。这些BamHI和BglII位点在外切壳多糖酶反义克隆中不存在。实施例19用真菌转基因转化小麦(普通小麦)
采用Week等(1993)的方法将修饰过的全长cDNA克隆(在单子叶植物表达载体pUBKBglII-中)导入小麦，但进行下述增改。在开花后约12到14天(dpa)，从普通小麦的Bobwhite品种的种子中切除胚，将胚盾片向上置于15mm×100mm碟子之上，碟子中含有30ml MMS培养基[4.3g/L Murashige & Skoog盐混合物(Gibco BRL，Rockville，MD)，0.5mg/L盐酸硫胺素，0.15g/L L-天冬酰胺，40g/L麦芽糖]，并用3.5g/L植物专用琼脂(Phytagel)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)使其固化和补充2mg/L 2，4-D。将胚在25℃黑暗条件下培养5天，允许愈伤组织发育，然后转移到15mm×60mm的碟子中，碟中含有20ml上述培养基并补充了0.35M甘露醇。在含有甘露醇的培养基上培养4个小时之后，每个碟子用0.7毫克、直径1-2微米(平均直径)的金颗粒(Bio-Rad，Hercules，CA)轰击胚，金颗粒包被17.4μg pUBKBglII-和19.5μg的FvEndoS，或15.5μgpUBKBglII-和16.2μg FvGluS，或12.5μg pUBK和22.6μg FvExoS。第二天，胚胎发生愈伤组织转移到″MMS2″培养基上(MMS培养基中补充2mg/L 2，4-D，并且用2.5g/L植物专用琼脂(Phytagel)固化)。每个碟子愈伤组织密度为20个(FvGluS)或者40个(FvEndoS和FvExoS)，在25℃避光培养二星期。然后在25℃黑暗中进行选择，持续两个2周的时间，选择在含MMS2并补充下列成分的碟子中进行：对于FvEndo，0或1mg/L bialaphos(Meiji Seika Kaisha Ltd，东京，日本)，然后2mg/L bialaphos；对于FvExoS，1或1.5mg/L，然后3mg/L bialaphos；对于FvGluS，1mg/L，然后2mg/L bialaphos。然后将存活的愈伤组织转移到MMS培养基上，培养基用2.5g/LPhytagel固化并含有0.2mg/L 2，4 D和3mg/L bialaphos，光照条件下26℃培养6周。在那时形成的绿芽转移到25mm×150mm试管中，试管中含有18ml生根培养基[2.15g/L Murashige & Skoog盐混合物，0.25mg/L盐酸硫胺素，0.075g/L L-天冬酰胺，20g/L麦芽糖，2.5g/L Phytagel]。试管在光照条件，26℃培养。形成芽的根转移到土壤中(Sunshine mix #1)，光照条件下，以22℃在丝龙膜包被下培养1周。在培养的第二星期在丝龙膜上戳孔以降低湿度，并逐渐增加孔数。然后将植株移植到温室中，保持23℃，补充光照为16/8小时的日/夜周期。在开花后约21天，从这些植物的种子上切下未成熟的胚，并在含有100ml用2.5g/L Phytagel固化的MMS培养基的品红色盒子中过早地萌发。实施例20小麦系的转基因稳定整合分析
从小麦候选系的叶片中提取基因组DNA或总DNA以分析修饰过的全长葡聚糖酶、内切壳多糖酶和外切壳多糖酶cDNA的稳定整合。未转化Bobwhite品种植物作为阴性对照。
基因组DNA的制备按照修改的d’Ovidio等的方法(1992)进行。从植株中切除湿重为3到5克的健康叶组织，立即置于冰上，然后转到液氮中，或者直接置于在液氮中。在抽提基因组DNA之前，叶片样品通常在-80℃储存。用冷的研钵和研棒将叶片组织在液氮中研碎。将研碎的粉末状组织转移到35-40ml的预冷的匀浆缓冲液中，缓冲液含有0.5M蔗糖，80mM氯化钾，10mM TRIS-Cl，10mM EDTA，4mM精胺，1mM亚精胺，pH9.5，180mg/L苯甲磺酰氟(临使用前加入)和0.1％(v∶v)β-巯基乙醇(使用前加入)。在冷的匀浆器中进一步用3到4次5秒脉冲将叶组织匀浆。匀浆液经过四层粗棉布过滤，随后通过一层Miracloth过滤材料(Calbiochem，La Jolla，CA)。澄清的抽提物在4℃ 1000xg离心20分钟。小心地弃去上清，含有核的沉淀用20到40毫升补加0.5％Triton X-100(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)的匀浆缓冲液洗两次。洗过的核沉淀重悬于1ml缓冲液中，缓冲液含有50mM TRIS-Cl，pH 8，100mM EDTA，100mM氯化钠和600μg蛋白酶K。另加入于65℃预热的4ml不含蛋白酶K的缓冲液，匀浆液在65℃孵育30分钟，而后室温(23°-25℃)孵育30分钟，随后加入2.5ml酚(用TRIS缓冲液平衡，pH7.9)，彻底混合。在DNA-酚混合物于4℃放置12-16小时后，另加入2.5ml的氯仿，彻底混合。抽提物以4000xg室温离心15分钟。水相(上层)再用氯仿抽提两次。室温用0.1倍体积2.5M醋酸钠，pH5.2和0.7倍体积异丙醇沉淀DNA。DNA用玻璃棒回收。然后在4℃重悬于水中1到3天。
采用修改的Dellaporta方法(1983)从1到1.5cm2大小的叶片中分离总DNA。用干净的剪刀切下部分健康叶片，置于1.5ml锥形微量离心管中，直接转移到液氮中。在抽提DNA前，叶片通常在-80℃储存。叶组织在液氮中用microfuge研杵(Kontes Glass Co.，Vineland，NJ)在微量离心管中匀浆。每管冰冻粉末加入0.5ml抽提缓冲液，缓冲液含有50mM TRIS-Cl，pH8，100mM氯化钠，10mMEDTA，pH8，1％十二烷基硫酸钠和10mM β-巯基乙醇(使用前加入)。在匀浆融化之前，管置于65℃水浴中。融化后，剧烈振摇离心管，在65℃至少放置10分钟但不超过25分钟。加入180μl 5M乙酸钾(Sambrook等，1989)后彻底混合抽提物，在冰上放置10分钟，然后在TOMY MTX-150高速微量冷冻离心机上4℃离心10分钟。含有DNA的上清转移到新的微量离心管中，用0.5ml异丙醇室温沉淀DNA 30分钟。DNA沉淀通过上述的离心方法得到，上清液倒出并弃掉。沉淀用250μl 70％乙醇(-20℃冷却)洗一次，4℃离心5分钟。残余的乙醇用移液器移去，洗过的沉淀在DNA 110 Speed Vac中干燥3分钟，而后溶解于50μl水中。新制备的抽提物可以获得最好的PCR扩增效果。
为了进行PCR扩增，200到400ng基因组DNA或者2μl总DNA用水于0.2ml薄壁管(MJ Research，Inc.，Watertown，MA)中补至10μl。每个样品加入40μl PCR混合液，它含25pmol UBI A2引物，25pmol转基因特异的引物(见表3)，50mM氯化钾，10mMTRIS-Cl，pH 9.0，0.1％ TritonX-100，3mM氯化镁，dATP，dCTP，dGTP和TTP每种均为1mM，以及2.5单位Taq DNA聚合酶(promega，Madison，WI)。PCR反应在PTC-100或PTC-200可编程的温控装置(MJ Research，Inc.，Watertown，MA)中进行，反应程序如下：96℃ 30秒；95℃ 1分钟，62℃ 1分钟，72℃为1分钟，35个循环；72℃ 15分钟；4℃保温。PCR产物(每个PCR反应混合物中10-13μl)在1％到1.6％琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色，紫外光下观察，如实施例中所描述的那样。阳性的PCR对照包括10到20ng包含有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶cDNAs的pUBKBglII-质粒DNA。
在我们的实验中，至少三个转基因小麦系扩增出预期的425bpUbi-外切壳多糖酶PCR产物，或预期的375bp Ubi-葡聚糖酶PCR产物，或预期的340bp Ubi-内切壳多糖酶PCR产物(图12)。
转基因系的繁殖如实施例19所述。采用PCR分析后代的bialaphos抗性和/或F.venenatum转基因的存在。在连续两代中每一个后代都有bialaphos抗性和/或在PCR转基因分析中呈现阳性的种群被认为是来自转基因纯合系。实施例21分析转基因小麦系的转基因mRNA
通过Northern印迹分析根据实施例20所述方法鉴定出来的纯合系和/或其后代的转基因信使RNA(mRNA)的表达。在开花后的15-20天，从穗上采集种子，然后在70％乙醇中浸泡5分钟表面灭菌，随后用20％(v∶v)次氯酸浸泡15分钟。用无菌水将种子冲洗4到5次。用解剖镊子将每个种子的胚移去，用金属药刀的平面将胚乳材料从从种皮中挤出。获得的胚乳在液氮中冻结，从15-30粒种子中收集胚乳材料，在RNA分离之前贮存在-80℃。采用修改的Altenbach方法分离总RNA(1998)。基本上，在液氮中用预冷的研钵和研杵将冷冻的胚乳研磨为细粉。冷冻的匀浆转移到50毫升锥形离心管中，管中包含5ml抽提缓冲液(10mM氯化钠，10mM TRIS-Cl，pH9.0，1mMEDTA)，2.5ml酚(TRIS缓冲液饱和，pH 4.3，Fisher #BP1751)和2.5ml氯仿。将管上下颠倒40次，然后在Sorvall HS-4转子上，4℃，6500转/分离心10分钟。水相转移到新管中，用等体积酚/氯仿(1∶1 v/v)抽提一次，再用等体积氯仿抽提一次。每次抽提之后混合物按照所描述的方法离心。在水相中加入8M LiCl至终浓度为2M，-20℃过夜孵育。在Sorvall SS-34转子中以4℃，12,500转/分离心30分钟，收集含有RNA的沉淀。用冰冷的2M LiCl洗RNA沉淀，空气中干燥，重悬于无菌水中。8M LiCl溶液和用于重悬RNA的水事先用0.05％(v∶v)焦碳酸二乙酯处理(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。根据制造商的建议，约100μg总RNA进一步经过RNeasy柱子(Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化。纯化的RNA储存在-80℃。
对于Northern印迹，将大约4-5μg纯化的RNA用样品缓冲液补充至10μl，样品缓冲液含有50％甲酰胺，6％甲醛(Fisher #BP531)，20mM MOPS，pH7.0，5mM醋酸钠，10mM EDTA和0.01％溴酚蓝。RNA样品加热到60℃，持续10到15分钟，在进行琼脂糖分离之前立即置于冰上。琼脂糖(0.3g)溶于30ml的20mM MOPS，5mM醋酸钠，10mM EDTA，pH7.0中，加入37％的甲醛至终浓度为6％，加入10μg/μl溴化乙锭至终浓度为166ng/ml。50-70V电泳至2个小时。分离的RNA转移到10xSSC(150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠，pH7.0)或50mM氢氧化钠中的Zeta-Probe GT尼龙膜上(Bio-Rad，Hercules，CA)3小时。含有RNA的尼龙膜(northern印迹)用2xSSC(30mM氯化钠，3mM柠檬酸钠，pH7.0)冲洗，之后用UV Stratalinker2400(Stratagene，La Jolla，CA)紫外线处理并于80℃真空烘烤(中性转移)，或者空气中干燥并直接使用(碱性转移)
根据Bio-Rad公司的建议，Northern印迹在Hybaid杂交炉(National Labnet，Woodbridge，NJ)，42℃，5到10ml溶液中进行孵育6到7小时，该溶液含50％(v∶v)甲酰胺，7％(w∶v)十二烷基硫酸钠(SDS)，0.25M磷酸钠缓冲液，pH 7.0，0.25M氯化钠和1mM EDTA，pH8.0。用于Northern印迹的探针由如下部分或全长cDNA组成：来自FvGluS的0.4kb BamHI GLU片段；来自FvEndoS的1.2kbBamHI+BglII Endo片段；或来自FvExoS的1.8kb BamHI+BglII Exo片段。按照实施例12所述，用琼脂糖凝分离后纯化探针片段。根据推荐意见，采用Multiprime DNA标记系统(Amersham PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway，NJ)用32P-α-dCTP(3000Ci/mmol)放射标记约25-50ng探针DNA，比活度为1-2×106cpm/ng。放射标记的片段直接用于Northern印迹，42℃杂交36-40小时。印迹膜用200到300ml的2×SSC，0.1％(w∶v)SDS室温洗15分钟；200到300ml0.5×SSC，0.1％(w∶v)SDS室温洗15分钟；200到300ml 0.1×SSC0.1％(w∶v)SDS，62℃洗15分钟。-80℃使用x光片胶片暗盒和Spectroline L-Plus增感屏(Spectronics Corp.，Westbury，NY)在预闪光XAR 5胶片(Kodak，Rochester，NY)上，或者室温下用Storm 820phosphoimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)在磷光质屏上进行放射自显影。Northern印迹分析在AB8-108系中检测到内切壳多糖酶转基因的mRNA转录本的存在(图13)。
我们也采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来分析根据实施例20所述方法鉴定的杂合和纯合系和/或其后代的转基因mRNA的聚积。RT-PCR是一个更敏感的探测不同组织和器官中mRNA积累的方法(Altenbach 1998；Wang等，1998)。从开花后2到3个星期的小麦颖片中获取总RNA的方法与从胚乳中分离RNA的程序是一样的(如上)。按照生产厂家的建议，使用GeneAmp PCR核心试剂盒(PerkinElmer，Foster City，CA)或者一步RT-PCR试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)，用600ng总RNA进行RT-PCR反应。转基因特异的转录本用引物RTUBI和RTGLU(内切壳多糖酶转录本5’末端)，RTEND(内切壳多糖酶转录本5’末端)，或RTEXO(外切壳多糖酶转录本5’末端)来扩增。表3为RT-PCR引物列表。转基因转录本的3’部分用RTNOS和RTGLU2(葡聚糖酶)，RTEND2(内切壳多糖酶)或RTEXO2(外切壳多糖酶)扩增，退火温度为58°-60℃。
来自AB9-59b系的胚乳和颖片的总RNA显示非常低，但是在可检测水平上的单一700bp RT-PCR产物(图14)，代表了转录本的5’末端，并且包括Ubi外显子。该产物的大小与预期的705bp非常接近，预期大小来自预测的转基因mRNA的核苷酸序列。葡聚糖酶转录本的3’部分扩增水平也非常低，但水平可以检测(数据未显示)，产生单一的330bp PCR产物(预期大小340bp)。
以AB8-108系连续的两个世代分离的胚乳和颖片总RNA中，代表内切壳多糖酶mRNA的5’末端、约700bp的单一RT-PCR产物(预期大小685bp)(图15A，左侧与右侧图)，和代表内切壳多糖酶mRNA的3’末端的320bp的单一RT-PCR产物(预期大小310bp)(图15B)强烈扩增。C9-25a系的胚乳总RNA中，代表外切壳多糖酶mRNA 5’末端的(预期大小795bp)(图15A，右图)约800bp的单一RT-PCR产物，和代表外切壳多糖酶mRNA(预期大小310bp)(图15B)3’末端的300bp单一RT-PCR产物也可以检测到。来自未转化的Bobwhite(bw)品系的总RNA没有任何RT-PCR产物。
为了鉴定的目的，根据制造商的建议，用Cla I或Ssp I限制性内切酶(New England BioLabs，Beverly，MA)彻底酶切内切壳多糖酶5’RT-PCR产物。产生的酶切产物用6％ TBE丙烯酰胺胶(Novex/Invitrogen，Carlsbad，CA)，100V分离约1小时，电泳缓冲液由89mM TRIS-Cl，pH 8.3，89mM硼酸，1.5mM EDTA组成。产生的内切壳多糖酶酶切产物如图16所示，与预期的内切壳多糖酶mRNA的核苷酸序列非常相配，并证实了RT-PCR产物的同一性。同样地，外切壳多糖酶5’RT-PCR产物用Bgl II，EcoRV或Nco I限制酶酶切(New England BioLabs，Beverly，MA)。最终的酶切产物按照实施例8所述在6％丙烯酰胺胶(图17A)或2％琼脂糖凝胶(图17B)上分离，与预测的内切壳多糖酶mRNA的核苷酸序列大小非常接近。由于在起始材料中存在较小的扩增产物，(标记为none的泳道，图17A)，在第一次实验中可以观察到额外的酶切片段。第二次实验中，在Bgl II泳道中，由于BglII的不完全酶切产生主要的约800bp的片段(图17B)。
FvEndo和FvExo RT-PCR产物是cDNA-依赖的，因而来自于RNA，而不是来自于RNA制备过程中的基因组DNA污染。只有首先合成cDNA(+)，才可以在3个独立系的胚乳中将FvEndo转录本的5’和3’端都扩增出RT-PCR产物(图18A)。缺乏cDNA合成(-)，则不能得到5’或3’RT-PCR产物。如同预期的一样，无论是否存在cDNA的合成，未转化的Bobwhite(Bw)系的胚乳中都检测不到FvEndo的转录本(图18B)。同样，只有在cDNA合成后，才能从转录本的5’和3’端都扩增到FvExo RT-PCR产物(图19)。在没有转化的Bobwhite样品中没有产物。
表3  RT-PCR实验用的PCR引物引物                 序列(5’到3’)                   扩增靶RTEND          CTGGAAGTTTGTCGCACCG                 FvEndo转录本5’末端RTEND2         GAGATAGAGGATGCTGTGCC                FvEndo转录本3’末端RTEXO          CAGTGATGTGAAGGTGAAGGC               FvExo转录本5’末端RTEXO2         CGTATGGACTGAGACTATCGAC              FvExo转录本3’末端RTGLU          GAGCATCCTTGATGGGAACAC               FvGlu转录本5’末端RTGLU2         GTCAACTCCAAGGCTGTCGTC               FvGlu转录本3’末端RTNOS          GCCAAATGTTTGAACGATCTGC              转录本3’末端RTUBI          CAACCTCGTGTTGTTCGGAG                转录本5’末端实施例22在F.venenatum基因组中确定葡聚糖酶和壳多糖酶基因的拷贝数
在本实施例中，我们采用A3/5(Wiebe等.1991)株的一个形态突变体F.venenatum CC1-3用于DNA印迹。用HindIII，BamHI或EcoRI限制内切酶彻底酶切基因组DNA(每个处理5μg)，按实施例8所述方法在琼脂糖凝胶上分离，然后转移到Nytran SuPerCharge膜上(Schleicher和Schuell，Keene，NH)。将DNA转移到膜上，进行放射性和非放射性标记的探针的杂交、洗涤的程序如Schleichler和Schuell的网站所述，网站的地址是http：//www.s-und-s.de/Pages-NEU-enYOscience/Lab％20Manual/southern.htm。杂交探针由下列成分组成：1)FvGlu cDNA(来自实施例15中所描述的质粒)的0.4kb 5’BamHI片段；2)FvEndoS(图15)的1.2kb BamHI/BglII的FvEndo cDNA片段；(3)1.8kb BamHI/BglII FvExo cDNA片段(来自实施例15中所描述的质粒)。使用Multiprime DNA标记系统(Amersham PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway，NJ)，用32P-α-dCTP[比活度3000Ci(111tBq)/mmol]放射性标记探针。
我们的Southern印迹结果表明在F.verzenatum基因组中三个基因的每一个都是单拷贝的(图20)。采用HindIII酶切的λ噬菌体DNA作为迁移标准，估计相应于FvGlu的杂交带的大小是12.5kb(HindIII)，1.6kb(BamHI)和11kb(EcoRI)(见图20的″kb″)。FvGlu编码区包含单一的BamHI位点，这样用全长的cDNA探针可以得到两个杂交的BamHI片段。然而，用于此次实验的FvGlu探针由BamHI位点5’端侧的cDNA序列组成，这样，预期并获得了一条BamHI杂交片段。杂交的FvEndo片段大小是9.3kb(HindIII)，8.9kb(BamHI)和6.6kb(EcoRI)。杂交的FvExo片段大小是4.3kb(HindIII)，11kb(BamHI)和4.7kb(EcoRI)。在FvEndo和Fvexo中都不含有这三个内切酶的限制性位点。保藏声明
下面所标识的质粒已导入大肠杆菌宿主，转化的大肠杆菌于如下日期根据布达佩斯条约的规定，保藏在农业研究机构保藏中心(NRRL)，农业研究服务部，美国农业部，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604 USA，并给予了下列的保藏编号：保藏物           保藏编号       图/序列编号       保藏日期GLU2           NRRL B-30201        SEQ16           8/26/99Endo167        NRRL B-30202        SEQ18           8/26/99Exo9           NRRL B-30203        SEQ20           8/26/99FvGluS         NRRL B-30204        图6             8/26/99FvGluAS        NRRL B-30205        图7             8/26/99FvEndoS        NRRL B-30206        图8             8/26/99FvEndoAS       NRRL B-30207        图9             8/26/99FvExoS         NRRL B-30208        图10            8/26/99FvExoAS        NRRL B-30209        图11            8/26/99
容易理解，前面所给出的详细描述仅仅是以举例说明的方式给出，在不偏离本发明的精神和范围的前提下，有可能在其中进行修改和变化。此处所引用的所有的出版物，专利和专利申请完整地列入作为参考文献。
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                  (PCT实施细则第13条之二)PCT/RO/134表保藏物                  保藏编号                     保藏日期GLU2                   NRRL B-30201                   8/26/99Endo167                NRRL B-30202                   8/26/99Exo9                   NRRL B-30203                   8/26/99FvGluS                 NRRL B-30204                   8/26/99FvGluAS                NRRL B-30205                   8/26/99FvEndoS                NRRL B-30206                   8/26/99FvEndoAS               NRRL B-30207                   8/26/99FvExoS                 NRRL B-30208                   8/26/99FvExoAS                NRRL B-30209                   8/26/99
                          序列表<110>Okubara，Patricia A.
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 Berka，Randy M.<120>编码细胞壁降解酶的核酸序列和在设计对镰孢和其它病原体的抗性中的应用<130>0079.99R<140><141><150>60/151,582<151>1999-08-30<150>60/224,946<151>2000-08-11<160>82<170>Patentin Ver.2.1<210>1<211>1023<212>DNA<213>Fusarium venenatum<220><221>CDS<222>(37)..(942)<400> 1cagttatctt tttttatcta ctatctttaa ttcact atg aag ttc ttc agc act             54
                                    Met Lys Phe Phe Ser Thr
                                      1               5ctt agc acc ctt gcg gtg gcc ctc atg atg agt ggc gag gct ctg gct             102Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Leu Met Met Ser Gly Glu Ala Leu Ala
        10                  15                  20ggt acc tac aag ggt ttc agc att ggc gcc aac agg gct gat ggt gcc             150Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ser Ile Gly Ala Asn Arg Ala Asp Gly Ala
     25                  30                  35tgt aag tgg gag gcc gac tgg aag aag gat ttc cag gcc atc aag agc             198Cys Lys Trp Glu Ala Asp Trp Lys Lys Asp Phe Gln Ala Ile Lys Ser
 40                  45                  50tgg aac aag ggt ttc aac gct gtt cgt ctg tac tct gcc tct gac tgt             246Trp Asn Lys Gly Phe Asn Ala Val Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asp Cys55                   60                  65                  70aac aca ctt gtc aag gct gtc ccc gct gcc aag gcc act ggc atg aag             294Asn Thr Leu Val Lys Ala Val Pro Ala Ala Lys Ala Thr Gly Met Lys
             75               80                     85atc ctt gtt ggc gtc tgg gcc acc gat gat gct cac ttc ggc cgc gac             342Ile Leu Val Gly Val Trp Ala Thr Asp Asp Ala His Phe Gly Arg Asp
         90                  95                 100aag gcc gcc ctc ctc aag gct atc aag cag cac ggc acc ggc tgg atc             390Lys Ala Ala Leu Leu Lys Ala Ile Lys Gln His Gly Thr Gly Trp Ile
    105                 110                 115gcc gcc atc agt gtc gga tcc gag gac ctc tac cgt gag gac atc tcc             438Ala Ala Ile Ser Val Gly Ser Glu Asp Leu Tyr Arg Glu Asp Ile Ser
120                 125                 130ccc cag aag ctc gca cag cag atc tac gac gtc cga ggc atg gtc cac             486Pro Gln Lys Leu Ala Gln Gln Ile Tyr Asp Val Arg Gly Met Val His135                 140                 145                 150caa tac aac aag aac ctc aag gtc gga cat acc gac acc tgg acc gct             534Gln Tyr Asn Lys Asn Leu Lys Val Gly His Thr Asp Thr Trp Thr Ala
            155                 160                 165tgg gtc gac ggc cgc aac gac gtc gtc acc aag gcc tgc gat atc gcc             582Trp Val Asp Gly Arg Asn Asp Val Val Thr Lys Ala Cys Asp Ile Ala
        170                 175                 180att aca aac ggt ttc ccc tac tgg cag ggt gtt ccc atc aag gat gct             630Ile Thr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gln Gly Val Pro Ile Lys Asp Ala
    185                 190                 195ctc cgc ctc aag acc ttc cag aac tcc ttc tgg aac gtc cag aag cac             678Leu Arg Leu Lys Thr Phe Gln Asn Ser Phe Trp Asn Val Gln Lys His
200                 205                 210gtc aag gct gtc aac tcc aag gct gct gtc tgg gtt ggc gag acc ggc             726Val Lys Ala Val Asn Ser Lys Ala Ala Val Trp Val Gly Glu Thr Gly215                 220                 225                 230tgg cct aca aag gga ccc aac tac cag aag gct gct gcc acg acc gcc             774Trp Pro Thr Lys Gly Pro Asn Tyr Gln Lys Ala Ala Ala Thr Thr Ala
            235                 240                 245agt ctc cag cag ttc tac aac aat gtc ggt tgc tgg ctc tgg cag cag             822Ser Leu Gln Gln Phe Tyr Asn Asn Val Gly Cys Trp Leu Trp Gln Gln
        250                 255                 260aag gag gcc agt ggt ttc tgg ttc act gct ttc gat aca cct gcg cac             870Lys Glu Ala Ser Gly Phe Trp Phe Thr Ala Phe Asp Thr Pro Ala His
    265                 270                 275agc acc gag gtt gag aag tac ttc ggt att gcc aac cag gac cgc aag              918Ser Thr Glu Val Glu Lys Tyr Phe Gly Ile Ala Asn Gln Asp Arg Lys
280                 285                 290ctc aag ttc agc ctt act tgc taa gcgttgtagc gggttttcga tgtataaatt             972Leu Lys Phe Ser Leu Thr Cys295                 300taatttacca tatactgtta gcgcttgtca acttgatagt atttccattc a                     1023<210> 2<211> 301<212> PRT<213> Fusarium venenatum<400> 2Met Lys Phe Phe Ser Thr Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Leu Met Met1               5                  10                  15Ser Gly Glu Ala Leu Ala Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ser Ile Gly Ala
         20                  25                  30Asn Arg Ala Asp Gly Ala Cys Lys Trp Glu Ala Asp Trp Lys Lys Asp
     35                  40                  45Phe Gln Ala Ile Lys Ser Trp Asn Lys Gly Phe Asn Ala Val Arg Leu
 50                  55                  60Tyr Ser Ala Ser Asp Cys Asn Thr Leu Val Lys Ala Val Pro Ala Ala65                  70                  75                  80Lys Ala Thr Gly Met Lys Ile Leu Val Gly Val Trp Ala Thr Asp Asp
             85                  90                  95Ala His Phe Gly Arg Asp Lys Ala Ala Leu Leu Lys Ala Ile Lys Gln
        100                 105                 110His Gly Thr Gly Trp Ile Ala Ala Ile Ser Val Gly Ser Glu Asp Leu
    115                 120                 125Tyr Arg Glu Asp Ile Ser Pro Gln Lys Leu Ala Gln Gln Ile Tyr Asp
130                 135                 140Val Arg Gly Met Val His Gln Tyr Asn Lys Asn Leu Lys Val Gly His145                 150                 155                 160Thr Asp Thr Trp Thr Ala Trp Val Asp Gly Arg Asn Asp Val Val Thr
            165                 170                 175Lys Ala Cys Asp Ile Ala Ile Thr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gln Gly
        180                 185                 190Val Pro Ile Lys Asp Ala Leu Arg Leu Lys Thr Phe Gln Asn Ser Phe
    195                 200                 205Trp Asn Val Gln Lys His Val Lys Ala Val Asn Ser Lys Ala Ala Val
210                 215                 220Trp Val Gly Glu Thr Gly Trp Pro Thr Lys Gly Pro Asn Tyr Gln Lys225                 230                 235                 240Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Leu Gln Gln Phe Tyr Asn Asn Val Gly
            245                 250                 255Cys Trp Leu Trp Gln Gln Lys Glu Ala Ser Gly Phe Trp Phe Thr Ala
        260                 265                 270Phe Asp Thr Pro Ala His Ser Thr Glu Val Glu Lys Tyr Phe Gly Ile
    275                 280                 285Ala Asn Gln Asp Arg Lys Leu Lys Phe Ser Leu Thr Cys
290                 295                 300<210>3<211>3622<212>DNA<213>拟分枝孢镰孢<220><221>CDS<222>(1801)..(2014)<220><221>CDS<222>(2070)..(2761)<400>3attgaatcgt aacgatagcc tcatgcttgg cattttgtgc cttgacatta tcgagcgcgg     60caccccacag gccttggtct ctgaaagaaa cggtggtggc gccgtttttt gcaaggttaa     120tcccacttcc aggcttcttg gtgacgttga gaagtgcatc gccccagcct ccgcccgtag       180caacagttga gtctcctgta aggatgaaaa agggcgattt cgcagcctga acaccaccaa       240agatgctcag ggcagcagaa gcaatggcca agaatctcat gctgagtaaa gatgattcag       300atatgattct cgaaaaaaat gacttcaatc gcgtcgctac ttgaaagtat catcttcttc       360tatatattga ccacggaccc caacatctgc cgaacactca taagtcgttt gcctcttcat       420gattgagaaa gtggaatatt tccaccaata aacatcatgc attgactttg ggggcataaa       480tgtcaaggtt tgcagggact gtattcatgt tcagaatccg aaccatctga ccttatgtta       540ctcccccatg ccatgcggag aatcactgat cgtcaggctt agaaaggcga ctaagtggtt       600gaactgtacc tcggctttca cattcggtct tgaatagccc gagtttctcg ctcgacctcg       660ccgttagtaa cagggacagg cagtgggttg gactacctac cagactacct actgtgtttc       720cccttgatct gatggcttta tcgataggca tatctaatct aatctcgatt tgtgctatct       780aatctcactt tatcgtttct tatctgagta ataaccttac tcctatttta tccagtattg       840aggtattaaa tgtcttgtgt aaatgaaaga ataaggggat aaaacgtagt atagagacct       900attcagtgtt tgtatgaatg cttataatcc tgaactgagt tgaggacagt agtgggttgg       960tttcttttga tcttttggtt gacttactca gctgaatttg cttaactcaa aacaacaacg       1020ctctacgcag gtgacctatt ttcagcacaa gatcattacc attgggataa tgttccatta       1080gcctgcagtt ctgatagact aataagctct catatgacca ggtttggcca tgttgaaggt       1140ctgattgatg aaattgatga gtgttgtagg gtagatcaag gtagactaat ggagaattga       1200gaaacctggc gaaggtgaaa agcggaggat ccggtgcttc cgaccaataa tcggacagca       1260tcgcgtggac aatcgatagc caaggaagat ctcttagcct ggttccatta ttctttgatc     1320ttgtggttgg ctaaccatct tgatttaacc aagatagcac agaacagagc agacatcgtt     1380ttgcatcatg gatccaactc aggccgacta acccgtagtg aggcgtttcg aatttctcca     1440gatacccaaa gatggattaa gcatgaaaac caatctgctt taattgcccg tagattgaat     1500ccattctggc gaagccgatg ttccgcgcaa caccgtcctt tctagcgcca ttccaagacc     1560aggccaagca taaaaatagc accacacacg gcaaaaaagg tctagaacag ctcacgctcc     1620agggtgaata cgagcccaaa ggggcaaaaa gcaacaagaa aaaaggggca taatttccat     1680catcccataa taaaaccaac tttccacccc aactttcttg cctttttgtc ctcttggctc     1740tttaactgtc actcgcttat taatcagtta ttttctttca tttactatcg ttaattcact     1800atg aag ttc ttc agc act ctc agc acc ctt gcg gtg gct ctc atg atg       1848Met Lys Phe Phe Ser Thr Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Leu Met Met1               5                  10                  15agt ggc gag gcc cta gcc ggt acc tac aag ggt ttc agc att ggc gcc       1896Ser Gly Glu Ala Leu Ala Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ser Ile Gly Ala
         20                  25                  30aac agg gct gat ggc gcc tgc aag tgg gag gcc gac tgg aag aag gat       1944Asn Arg Ala Asp Gly Ala Cys Lys Trp Glu Ala Asp Trp Lys Lys Asp
     35                  40                  45ttc cag gcc atc aag agc tgg aac aag ggt ttc aac gct gtt cgt ctg       1992Phe Gln Ala Ile Lys Ser Trp Asn Lys Gly Phe Asn Ala Val Arg Leu
 50                  55                  60tac tct gct agt gat tgc aac a gtaagcgttc cgcattctga acaacaataa         2044Tyr Ser Ala Ser Asp Cys Asn65                  70gctcttttac ttacgttctt cttag ca ctt gtc aag gcc gtc ccc gct gct         2095
                       Thr Leu Val Lys Ala Val Pro Ala Ala
                                    75                  80aag gcc act ggc atg aag atc ctt gtc ggc gtt tgg gcc acc gac gat        2143Lys Ala Thr Gly Met Lys Ile Leu Val Gly Val Trp Ala Thr Asp Asp
             85                  90                  95gct cac ttc ggc cgc gat aag gcc gct ctt ctc aag gct att aag cag        2191Ala His Phe Gly Arg Asp Lys Ala Ala Leu Leu Lys Ala Ile Lys Gln
        100                 105                 110cac ggc acg ggc tgg atc gcc gcc atc agc gtc gga tcc gaa gac ctc        2239His Gly Thr Gly Trp Ile Ala Ala Ile Ser Val Gly Ser Glu Asp Leu
    115                 120                 125tac cgt gag gat atc tcc ccc cag aag ctc gcc cag cag atc tac gat        2287Tyr Arg Glu Asp Ile Ser Pro Gln Lys Leu Ala Gln Gln Ile Tyr Asp
130                 135                 140gtc cga ggc atg gtc cac caa tac aac aag aat ctc aag gtc gga cac        2335Val Arg Gly Met Val His Gln Tyr Asn Lys Asn Leu Lys Val Gly His145                 150                 155                 160acc gac acc tgg acc gct tgg gtc gac ggc cgc aat gac gtc gtc acc        2383Thr Asp Thr Trp Thr Ala Trp Val Asp Gly Arg Asn Asp Val Val Thr
            165                 170                 175aag gcc tgc gac att gcc atc aca aac ggt ttc ccc tac tgg cag ggt        2431Lys Ala Cys Asp Ile Ala Ile Thr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gln Gly
        180                 185                 190gtc ccc atc aag gat gct ctc cgt ctc aag act ttc cag aac tcg tac        2479Val Pro Ile Lys Asp Ala Leu Arg Leu Lys Thr Phe Gln Asn Ser Tyr
    195                 200                 205tgg aac gtc aag aag cac gtc aat gct gtc aac tcc aag gct gct gtc        2527Trp Asn Val Lys Lys His Val Asn Ala Val Asn Ser Lys Ala Ala Val
210                 215                 220tgg gtt ggt gag acc ggc tgg cct acc aag gga ccc aac tac cag aag        2575Trp Val Gly Glu Thr Gly Trp Pro Thr Lys Gly Pro Asn Tyr Gln Lys225                 230                 235                 240gct gct gcc acg acc gcc agt ctg cag cag ttc tac aac aat gtc ggt        2623Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Leu Gln Gln Phe Tyr Asn Asn Val Gly
            245                 250                 255tgc tgg ctc tgg cag cag aag gat gcc agt ggt ttc tgg ttc act gct        2671Cys Trp Leu Trp Gln Gln Lys Asp Ala Ser Gly Phe Trp Phe Thr Ala
        260                 265                 270ttc gat act cct gcc cac agc act gaa gtt gag aag tac ttc ggt att        2719Phe Asp Thr Pro Ala His Ser Thr Glu Val Glu Lys Tyr Phe Gly Ile
    275                 280                 285gct aac cag gac cgc aag ctc aag ttc ggc ctt act tgc taa                2761Ala Asn Gln Asp Arg Lys Leu Lys Phe Gly Leu Thr Cys
290                 295                 300acgttgtagc ggggttgcca tgtataaatt taattgacca tatactgttg gcgtttatca      2821acttgatagt acttacattc attgcataaa aaagtctttc ttagatccaa tatataatat      2881caaagaccga tcacattcaa taatcttctt gtctatctat gcaaggccat tcatttcctt      2941aagccttggt gcttccagga ggacccaggt aactctcttg caccccaccg aagtcgacga      3001caaccttttc caacaagatg ttcgcatggt taagtcggag cttgaggtta tgcacaccag      3061tctttaacag ccccagctca tgcctccgta cccatacgtt gtccgacgca gcaaagaacc      3121acccgtcagc cgacgcccat cccttgtctg cggcgttctt ctcgctctgc ggagtccttc      3181tctgtaaatt gtacgtctga ctcgggcctt cgtcaatctg cacatcgtag gtcaggacat      3241cctcgggtga caagtcgaga gttgttccaa agtaaagcac cagctccgtc ttgtcagttt      3301cgctgtgcgt gaagagcggg tatttcatgt aaggaatctc gctattggtc cttgtcccgg      3361gagcgagagt cacacttccg gtctcgagtc tgcctgtatc aggaagcatc agatacggct      3421tctccatgtg acaatcagtt gctggtatcg agatataaca gtcttgctcc acaaagccac      3481ggaatgaatc ttggacatgt cgcccgtcaa tgagtaggtg gacttgttca aagtctcctt      3541cacgcgactg tacatcaata agaacctcct cttggaagtc ttgaggcact tgtgaccaat      3601tgatagaaac ttggactcgc a                                                3622<210>4<211>301<212>PRT<213>拟分枝孢镰孢<400>4Met Lys Phe Phe Ser Thr Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Leu Met Met1               5                  10                  15Ser Gly Glu Ala Leu Ala Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ser Ile Gly Ala
         20                  25                  30Asn Arg Ala Asp Gly Ala Cys Lys Trp Glu Ala Asp Trp Lys Lys Asp
     35                  40                  45Phe Gln Ala Ile Lys Ser Trp Asn Lys Gly Phe Asn Ala Val Arg Leu
 50                  55                  60Tyr Ser Ala Ser Asp Cys Asn Thr Leu Val Lys Ala Val Pro Ala Ala65                  70                  75                  80Lys Ala Thr Gly Met Lys Ile Leu Val Gly Val Trp Ala Thr Asp Asp
             85                  90                  95Ala His Phe Gly Arg Asp Lys Ala Ala Leu Leu Lys Ala Ile Lys Gln
        100                 105                 110His Gly Thr Gly Trp Ile Ala Ala Ile Ser Val Gly Ser Glu Asp Leu
    115                 120                 125Tyr Arg Glu Asp Ile Ser Pro Gln Lys Leu Ala Gln Gln Ile Tyr Asp
130                 135                 140Val Arg Gly Met Val His Gln Tyr Asn Lys Asn Leu Lys Val Gly His145                 150                 155                 160Thr Asp Thr Trp Thr Ala Trp Val Asp Gly Arg Asn Asp Val Val Thr
            165                 170                 175Lys Ala Cys Asp Ile Ala Ile Thr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gln Gly
        180                 185                 190Val Pro Ile Lys Asp Ala Leu Arg Leu Lys Thr Phe Gln Asn Ser Tyr
    195                 200                 205Trp Asn Val Lys Lys His Val Asn Ala Val Asn Ser Lys Ala Ala Val
210                 215                 220Trp Val Gly Glu Thr Gly Trp Pro Thr Lys Gly Pro Asn Tyr Gln Lys225                 230                 235                 240Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Leu Gln Gln Phe Tyr Asn Asn Val Gly
            245                 250                 255Cys Trp Leu Trp Gln Gln Lys Asp Ala Ser Gly Phe Trp Phe Thr Ala
        260                 265                 270Phe Asp Thr Pro Ala His Ser Thr Glu Val Glu Lys Tyr Phe Gly Ile
    275                 280                 285Ala Asn Gln Asp Arg Lys Leu Lys Phe Gly Leu Thr Cys
290                 295                 300<210>5<211>301<212>PRT<213>Fusarium venenatum<400>5Met Lys Phe Phe Ser Thr Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Leu Met Met1               5                  10                  15Ser Gly Glu Ala Leu Ala Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ser Ile Gly Ala
         20                  25                  30Asn Arg Ala Asp Gly Ala Cys Lys Trp Glu Ala Asp Trp Lys Lys Asp
     35                  40                  45Phe Gln Ala Ile Lys Ser Trp Asn Lys Gly Phe Asn Ala Val Arg Leu
 50                  55                  60Tyr Ser Ala Ser Asp Cys Asn Thr Leu Val Lys Ala Val Pro Ala Ala65                  70                  75                  80Lys Ala Thr Gly Met Lys Ile Leu Val Gly Val Trp Ala Thr Asp Asp
             85                  90                  95Ala His Phe Gly Arg Asp Lys Ala Ala Leu Leu Lys Ala Ile Lys Gln
        100                 105                 110His Gly Thr Gly Trp Ile Ala Ala Ile Ser Val Gly Ser Glu Asp Leu
    115                 120                 125Tyr Arg Glu Asp Ile Ser Pro Gln Lys Leu Ala Gln Gln Ile Tyr Asp
130                 135                 140Val Arg Gly Met Val His Gln Tyr Asn Lys Asn Leu Lys Val Gly His145                 150                 155                 160Thr Asp Thr Trp Thr Ala Trp Val Asp Gly Arg Asn Asp Val Val Thr
            165                 170                 175Lys Ala Cys Asp Ile Ala Ile Thr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Lys Gly
        180                 185                 190Val Pro Ile Lys Asp Ala Leu Arg Leu Lys Thr Phe Gln Asn Ser Phe
    195                 200                 205Trp Asn Val Gln Lys His Val Lys Ala Val Asn Ser Lys Ala Ala Val
210                 215                 220Trp Val Gly Glu Thr Gly Trp Pro Thr Lys Gly Pro Asn Tyr Gln Lys225                 230                 235                 240Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Leu Gln Gln Phe Tyr Asn Asn Val Gly
            245                 250                 255Cys Trp Leu Trp Gln Gln Lys Glu Ala Ser Gly Phe Trp Phe Thr Ala
        260                 265                 270Phe Asp Thr Pro Ala His Ser Thr Glu Val Glu Lys Tyr Phe Gly Ile
    275                 280                 285Ala Asn Gln Asp Arg Lys Leu Lys Phe Ser Leu Thr Cys
290                 295                 300<210>6<211>467<212>DNA<213>Fusarium venenatum<220><221>CDS<222>(186)..(467)<400>6gattcattcc ccacctaaaa ccctccaagt gccctccatc atcacgaatc tccacagaga          60cagccaagat acgccttgga aatcgtacca gggcgagcct tttacttata accgccgttt          120tcgctgcatt agttgcagta ttcctatcaa atacatcttt atctagtccc tttacttcaa          180tcaaa atg ggt ggt gga ccc gaa ggt ttc cgc acc gtt gcg tat ttc gtc              230
  Met Gly Gly Gly Pro Glu Gly Phe Arg Thr Val Ala Tyr Phe Val
    1               5                  10                  15aac tgg gct atc tat gca cga aag cat cgt cct cag gat ctt ccc gtg                278Asn Trp Ala Ile Tyr Ala Arg Lys His Arg Pro Gln Asp Leu Pro Val
             20                  25                  30gag aac ctg aca cat att ctt tac tcg ttc gct aat att cgt agc gac                326Glu Asn Leu Thr His Ile Leu Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Arg Ser Asp
         35                  40                  45tct ggc gaa gtc cat ctc acc gac tca tgg gcc gat acc gat att cat                374Ser Gly Glu Val His Leu Thr Asp Ser Trp Ala Asp Thr Asp Ile His
     50                  55                  60tgg gat gga gat tcc tgg aat gat gtc ggt acc aac ttg tac ggt tgc                422Trp Asp Gly Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn Leu Tyr Gly Cys
 65                  70                  75atg aag cag ctt aac ctg ttg aaa aga cgt aac cga aac ctc aag                    467Met Lys Gln Leu Asn Leu Leu Lys Arg Arg Asn Arg Asn Leu Lys80                  85                  90<210>7<211>94<212>PRT<213>Fusarium venenatum<400>7Met Gly Gly Gly Pro Glu Gly Phe Arg Thr Val Ala Tyr Phe Val Asn1               5                  10                  15Trp Ala Ile Tyr Ala Arg Lys His Arg Pro Gln Asp Leu Pro Val Glu
         20                  25                  30Asn Leu Thr His Ile Leu Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Arg Ser Asp Ser
     35                  40                  45Gly Glu Val His Leu Thr Asp Ser Trp Ala Asp Thr Asp Ile His Trp
 50                  55                  60Asp Gly Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn Leu Tyr Gly Cys Met65                  70                  75                  80Lys Gln Leu Asn Leu Leu Lys Arg Arg Asn Arg Asn Leu Lys
             85                  90<210>8<211>995<212>DNA<213>拟分枝孢镰孢<220><221>CDS<222>(160)..(303)<220><221>CDS<222>(392)..(469)<400>8gattcccaag ggggcggaac tggaagatca tcgccggtct tattaaacgg gnactggtac             60tttggacact tttgtctctt ccttaaagat tagcctccct cgctcagctt ctatctacca             120ttgttagcaa ttatctcact cacctcacct ctaggcgta atg tgg tcc aag gct                174
                                       Met Trp Ser Lys Ala
                                         1               5ctt ctg gcc gtt gcc gcc ttt gcc ttc aca ccc gcc aat gct ata tgg               222Leu Leu Ala Val Ala Ala Phe Ala Phe Thr Pro Ala Asn Ala Ile Trp
             10                  15                  20cca gtg cca aag aag atc tct act gga gac aag gcc ctc ttc atc gat               270Pro Val Pro Lys Lys Ile Ser Thr Gly Asp Lys Ala Leu Phe Ile Asp
         25                  30                  35caa acg att gac ntc acc tac aat gga gac ttt gtacgggact ctccccggtt             323Gln Thr Ile Asp Xaa Thr Tyr Asn Gly Asp Phe
     40                  45ctgattccga ttctggtgct tgtaaccata ccgcgcagct caatactgaa actttgcttc             383acaaacag atc ccc tac act tac aat tac caa ccc gat gct ggc tcc aag              433
     Ile Pro Tyr Thr Tyr Asn Tyr Gln Pro Asp Ala Gly Ser Lys
          50                  55                  60ttc agt agc aag caa atc atc caa gcc ggc gtc tct cgtgccctcc                    479Phe Ser Ser Lys Gln Ile Ile Gln Ala Gly Val Ser
     65                  70aaggcgtctt ccaggacaac tttgtcccat ggatgctccg cgaacgcgac tccgattttg             539agcctgacct gcaaaagaag cagtgggtga agtcgctaaa gattatccag accgaggagg             599atgacgagag caccttcaag cctctcaatg gtgaggttga cgagtcgtac tccctctcac             659tttctgagaa gggcgaggct tccatcaagg ccaagtcctc tacaggtgtc ctgcacggac             719ttgagacctt tgtccaactt ttcttcaagc acagctctgg cacttcctgg tacacgccgc             779acgcgcctgt ctcgatccag gacgagcccg agtaccctca tcgaggtatc cttctcgatg             839ttgcccgtag cttttttgaa gtcaagcaca tcaagcgcac aatcgatgcc atgtcgtgga             899gcaagttgaa tcgccttcac ctccacatca ctgactcgca gtcctggcct ctcgagatcc             959cagccctgcc caagctggcc gaaaagggcg cgtacc                            995<210>9<211>74<212>PRT<213>拟分枝孢镰孢<400>9Met Trp Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Ala Phe Ala Phe Thr Pro1               5                  10                      15Ala Asn Ala Ile Trp Pro Val Pro Lys Lys Ile Ser Thr Gly Asp Lys
         20                  25                      30Ala Leu Phe Ile Asp Gln Thr Ile Asp Xaa Thr Tyr Asn Gly Asp Phe
     35                  40                      45Ile Pro Tyr Thr Tyr Asn Tyr Gln Pro Asp Ala Gly Ser Lys Phe Ser
 50                  55                      60Ser Lys Gln Ile Ile Gln Ala Gly Val Ser65                  70<210>10<211>1494<212>DNA<213>Fusarium venenatum<220><221>CDS<222>(186)..(1385)<400>10gattcattcc ccacctaaaa ccctccaagt gccctccatc atcacgaatc tccacagaga          60cagccaagat acgccttgga aatcgtacca gggcgagcct tttacttata accgccgttt           120tcgctgcatt agttgcagta ttcctatcaa atacatcttt atctagtccc tttacttcaa           180tcaaa atg ggt ggt gga ccc gaa ggt ttc cgc acc gtt gcg tat ttc gtc           230
  Met Gly Gly Gly Pro Glu Gly Phe Arg Thr Val Ala Tyr Phe Val
    1               5                  10                  15aac tgg gct atc tat gca cga aag cat cgt cct cag gat ctt ccc gtg             278Asn Trp Ala Ile Tyr Ala Arg Lys His Arg Pro Gln Asp Leu Pro Val
             20                  25                  30gag aac ctg aca cat att ctt tac tcg ttc gct aat att cgt agc gac             326Glu Asn Leu Thr His Ile Leu Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Arg Ser Asp
         35                  40                  45tct ggc gaa gtc cat ctc acc gac tca tgg gcc gat acc gat att cat             374Ser Gly Glu Val His Leu Thr Asp Ser Trp Ala Asp Thr Asp Ile His
     50                  55                  60tgg gat gga gat tcc tgg aat gat gtc ggt acc aac ttg tac ggt tgc             422Trp Asp Gly Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn Leu Tyr Gly Cys
 65                  70                  75atg aag cag ctt aac ctg ttg aaa aga cgt aac cga aac ctc aag gtt             470Met Lys Gln Leu Asn Leu Leu Lys Arg Arg Asn Arg Asn Leu Lys Val80                  85                  90                  95ctt ctc agt att gga ggt tgg acc ttc agt agc aac ttc aag ggc ccc             518Leu Leu Ser Ile Gly Gly Trp Thr Phe Ser Ser Asn Phe Lys Gly Pro
            100                 105                 110gct agc aca ccc caa gga cgt gac aca ttc gcc aag agc tgt gtc gat             566Ala Ser Thr Pro Gln Gly Arg Asp Thr Phe Ala Lys Ser Cys Val Asp
        115                 120                 125ctg atc aag aac ctc ggt ttt gac ggt ata gat atc gat tgg gag tac               614Leu Ile Lys Asn Leu Gly Phe Asp Gly Ile Asp Ile Asp Trp Glu Tyr
    130                 135                 140ccc cag gat gcc aac gag gct aga aac tat gtc gaa ctt ctg ggc gcc               662Pro Gln Asp Ala Asn Glu Ala Arg Asn Tyr Val Glu Leu Leu Gly Ala
145                 150                 155gtg cgt cat gag atg gat gca tat gca cag aca ttg agc caa cct tat               710Val Arg His Glu Met Asp Ala Tyr Ala Gln Thr Leu Ser Gln Pro Tyr160                 165                 170                 175cac ttt gag ttg act gtg gcc tgt cca gcc ggt gcg aca aac ttc cag               758His Phe Glu Leu Thr Val Ala Cys Pro Ala Gly Ala Thr Asn Phe Gln
            180                 185                 190aag ctc gat atc cgt gga atg gat caa tac ctc gac ttc tgg aac ctc               806Lys Leu Asp Ile Arg Gly Met Asp Gln Tyr Leu Asp Phe Trp Asn Leu
        195                 200                 205atg gct tac gac tat gct ggt tct tgg gac caa act gcg ggt cat cag               854Met Ala Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Trp Asp Gln Thr Ala Gly His Gln
    210                 215                 220gcc aac ctg tac cca tct cac gac aac cca gta tca acc cca ttc tct               902Ala Asn Leu Tyr Pro Ser His Asp Asn Pro Val Ser Thr Pro Phe Ser
225                 230                 235acc tct gct gcc atc gac ttt tac gtc cgc agc ggt gtg aac cct tca               950Thr Ser Ala Ala Ile Asp Phe Tyr Val Arg Ser Gly Val Asn Pro Ser240                 245                 250                 255aag ata gtt ctc ggc atg cca ctc tac ggc cga gcc ttt gag aac acc               998Lys Ile Val Leu Gly Met Pro Leu Tyr Gly Arg Ala Phe Glu Asn Thr
            260                 265                 270gac ggt ccc ggc cgc ccc tac caa ggc gtt gga caa ggt tcc tgg gaa               1046Asp Gly Pro Gly Arg Pro Tyr Gln Gly Val Gly Gln Gly Ser Trp Glu
        275                 280                 285cag gga gtc tac gat tac aag gcg ctt ccc cta gag ggc gcg caa gag              1094Gln Gly Val Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Pro Leu Glu Gly Ala Gln Glu
    290                 295                 300tac gga gat aga gga tgc tgt gcc agc tac tgc tac aac cct cag tca              1142Tyr Gly Asp Arg Gly Cys Cys Ala Ser Tyr Cys Tyr Asn Pro Gln Ser
305                 310                 315cgt acc atg gtc acc tac gac acg ccg cgg gtc gcc tgg gat aag gcc              1190Arg Thr Met Val Thr Tyr Asp Thr Pro Arg Val Ala Trp Asp Lys Ala320                 325                 330                 335gag tat gtg aag agg tgg aag ctg gga ggc gct atg tgg tgg gag agc              1238Glu Tyr Val Lys Arg Trp Lys Leu Gly Gly Ala Met Trp Trp Glu Ser
            340                 345                 350agc gcg gat aag cag ggc gag cag agt ttg atc aca acg gtt gtg aac              1286Ser Ala Asp Lys Gln Gly Glu Gln Ser Leu Ile Thr Thr Val Val Asn
        355                 360                 365gga ttc gga ggt cag gga gcg ctc atg aga cag gac aac tgt att gag              1334Gly Phe Gly Gly Gln Gly Ala Leu Met Arg Gln Asp Asn Cys Ile Glu
    370                 375                 380tat ccc gcg acc aag tac gat aac ttg cga aat ggg ttc ccg gac aat              1382Tyr Pro Ala Thr Lys Tyr Asp Asn Leu Arg Asn Gly Phe Pro Asp Asn
385                 390                 395tga ggcgctaaag tggagttggt gggtcagagg aagcagaaac attgatgata                   1435400gtttgcaacg actcatagtg ataacatgaa taaatgaata gtaaaaatat ccattacga             1494<210>11<211>399<212>PRT<213>Fusarium venenatum<400>11Met Gly Gly Gly Pro Glu Gly Phe Arg Thr Val Ala Tyr Phe Val Asn1               5                  10                  15Trp Ala Ile Tyr Ala Arg Lys His Arg Pro Gln Asp Leu Pro Val Glu
         20                  25                  30Asn Leu Thr His Ile Leu Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Arg Ser Asp Ser
     35                  40                  45Gly Glu Val His Leu Thr Asp Ser Trp Ala Asp Thr Asp Ile His Trp
 50                  55                  60Asp Gly Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn Leu Tyr Gly Cys Met65                  70                  75                  80Lys Gln Leu Asn Leu Leu Lys Arg Arg Asn Arg Asn Leu Lys Val Leu
             85                  90                  95Leu Ser Ile Gly Gly Trp Thr Phe Ser Ser Asn Phe Lys Gly Pro Ala
        100                 105                 110Ser Thr Pro Gln Gly Arg Asp Thr Phe Ala Lys Ser Cys Val Asp Leu
    115                 120                 125Ile Lys Asn Leu Gly Phe Asp Gly Ile Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro
130                 135                 140Gln Asp Ala Asn Glu Ala Arg Asn Tyr Val Glu Leu Leu Gly Ala Val145                 150                 155                 160Arg His Glu Met Asp Ala Tyr Ala Gln Thr Leu Ser Gln Pro Tyr His
            165                 170                 175Phe Glu Leu Thr Val Ala Cys Pro Ala Gly Ala Thr Asn Phe Gln Lys
        180                 185                 190Leu Asp Ile Arg Gly Met Asp Gln Tyr Leu Asp Phe Trp Asn Leu Met
    195                 200                 205Ala Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Trp Asp Gln Thr Ala Gly His Gln Ala
210                 215                 220Asn Leu Tyr Pro Ser His Asp Asn Pro Val Ser Thr Pro Phe Ser Thr225                 230                 235                 240Ser Ala Ala Ile Asp Phe Tyr Val Arg Ser Gly Val Asn Pro Ser Lys
            245                 250                 255Ile Val Leu Gly Met Pro Leu Tyr Gly Arg Ala Phe Glu Asn Thr Asp
        260                 265                 270Gly Pro Gly Arg Pro Tyr Gln Gly Val Gly Gln Gly Ser Trp Glu Gln
    275                 280                 285Gly Val Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Pro Leu Glu Gly Ala Gln Glu Tyr
290                 295                 300Gly Asp Arg Gly Cys Cys Ala Ser Tyr Cys Tyr Asn Pro Gln Ser Arg305                 310                 315                 320Thr Met Val Thr Tyr Asp Thr Pro Arg Val Ala Trp Asp Lys Ala Glu
            325                 330                 335Tyr Val Lys Arg Trp Lys Leu Gly Gly Ala Met Trp Trp Glu Ser Ser
        340                 345                 350Ala Asp Lys Gln Gly Glu Gln Ser Leu Ile Thr Thr Val Val Asn Gly
    355                 360                 365Phe Gly Gly Gln Gly Ala Leu Met Arg Gln Asp Asn Cys Ile Glu Tyr
370                 375                 380Pro Ala Thr Lys Tyr Asp Asn Leu Arg Asn Gly Phe Pro Asp Asn385                 390                 395<210>12<211>1949<212>DNA<213>镰孢属<220><221>CDS<222>(108)..(1853)<400>12actggtactt tggacacttt tgtctcttcc ttaaagatta gcctccctcg ctcagcttct               60atctaccatt gttagcaatt atctcactca cctcacctct aggcgta atg tgg tcc                 116
                                                Met Trp Ser
                                                  1aag gct ctt ctg gcc gtt gcc gcc ttt gcc ttc aca ccc gcc aat gct               164Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Ala Phe Ala Phe Thr Pro Ala Asn Ala
  5                  10                  15ata tgg cca gtg cca aag aag atc tct act gga gac aag gcc ctc ttc               212Ile Trp Pro Val Pro Lys Lys Ile Ser Thr Gly Asp Lys Ala Leu Phe20                   25                  30                  35atc gat caa acg att gac ntc acc tac aat gga gac ttt atc ccc tac               260Ile Asp Gln Thr Ile Asp Xaa Thr Tyr Asn Gly Asp Phe Ile Pro Tyr
             40                  45                  50act tac aat tac caa ccc gat gct ggc tcc aag ttc agt agc aag caa               308Thr Tyr Asn Tyr Gln Pro Asp Ala Gly Ser Lys Phe Ser Ser Lys Gln
         55                  60                  65atc atc caa gcc ggc gtc tct cgt gcc ctc caa ggc gtc ttc cag gac               356Ile Ile Gln Ala Gly Val Ser Arg Ala Leu Gln Gly Val Phe Gln Asp
     70                  75                  80aac ttt gtc cca tgg atg ctc cgc gaa cgc gac tcc gat ttt gag cct               404Asn Phe Val Pro Trp Met Leu Arg Glu Arg Asp Ser Asp Phe Glu Pro
 85                  90                  95gac ctg caa aag aag cag tgg gtg aag tcg cta aag att atc cag acc               452Asp Leu Gln Lys Lys Gln Trp Val Lys Ser Leu Lys Ile Ile Gln Thr100                 105                 110                 115gag gag gat gac gag agc acc ttc aag cct ctc aat ggt gag gtt gac               500Glu Glu Asp Asp Glu Ser Thr Phe Lys Pro Leu Asn Gly Glu Val Asp
            120                 125                 130gag tcg tac tcc ctc tca ctt tct gag aag ggc gag gct tcc atc aag               548Glu Ser Tyr Ser Leu Ser Leu Ser Glu Lys Gly Glu Ala Ser Ile Lys
        135                 140                 145gcc aag tcc tct aca ggt gtc ctg cac gga ctt gag acc ttt gtc caa                596Ala Lys Ser Ser Thr Gly Val Leu His Gly Leu Glu Thr Phe Val Gln
    150                 155                 160ctt ttc ttc aag cac agc tct ggc act tcc tgg tac acg ccg cac gcg                644Leu Phe Phe Lys His Ser Ser Gly Thr Ser Trp Tyr Thr Pro His Ala
165                 170                 175cct gtc tcg atc cag gat gag ccc gag tac cct cat cga ggc att ctt                692Pro Val Ser Ile Gln Asp Glu Pro Glu Tyr Pro His Arg Gly Ile Leu180                 185                 190                 195ctc gat gtt gcc cgt agc ttt ttt gaa gtc aag cac atc aag cgc aca                740Leu Asp Val Ala Arg Ser Phe Phe Glu Val Lys His Ile Lys Arg Thr
            200                 205                 210atc gac gcc atg tcg tgg agc aag ctg aat cgc ctt cac ctt cac atc                788Ile Asp Ala Met Ser Trp Ser Lys Leu Asn Arg Leu His Leu His Ile
        215                 220                 225act gac tcg cag tcc tgg cct ctc gag atc cca gcc cta ccc aaa ctg                836Thr Asp Ser Gln Ser Trp Pro Leu Glu Ile Pro Ala Leu Pro Lys Leu
    230                 235                 240gcc gaa aag ggt gca tac cgc aaa ggc ctg acc tac tct cct gag gat                884Ala Glu Lys Gly Ala Tyr Arg Lys Gly Leu Thr Tyr Ser Pro Glu Asp
245                 250                 255ctt gcc ggt att tat gag tat ggt atc cac cgc gga gtc gag gtc atc                932Leu Ala Gly Ile Tyr Glu Tyr Gly Ile His Arg Gly Val Glu Val Ile260                 265                 270                 275atg gag att gac atg ccc ggc cat atc ggt gtc gtt gag ctt gcc tat                980Met Glu Ile Asp Met Pro Gly His Ile Gly Val Val Glu Leu Ala Tyr
            280                 285                 290aag gat ctc att gtc gcg tac aat gag aag cct tat caa tgg tgg tgt                 1028Lys Asp Leu Ile Val Ala Tyr Asn Glu Lys Pro Tyr Gln Trp Trp Cys
        295                 300                 305aag gag cca ccc tgt ggt gcg ttc cgc atg aac agc tct gat gtt tat                 1076Lys Glu Pro Pro Cys Gly Ala Phe Arg Met Asn Ser Ser Asp Val Tyr
    310                 315                 320gac ttt ctc gac act ctt ttt gat gac ctc ttc cct cgc att tcc aag                 1124Asp Phe Leu Asp Thr Leu Phe Asp Asp Leu Phe Pro Arg Ile Ser Lys
325                 330                 335tac agt cct tac ttc cac ctt ggt gga gac gag ctc aac cac aac gat                 1172Tyr Ser Pro Tyr Phe His Leu Gly Gly Asp Glu Leu Asn His Asn Asp340                 345                 350                 355tcc aga ctt gac cct gat gtg cgc tct aac gag acc gag gtt ctg gcg                 1220Ser Arg Leu Asp Pro Asp Val Arg Ser Asn Glu Thr Glu Val Leu Ala
            360                 365                 370cct ctt ttg caa aag ttc gtc gat tac act cac ggc aag gtt cga gat                 1268Pro Leu Leu Gln Lys Phe Val Asp Tyr Thr His Gly Lys Val Arg Asp
        375                 380                 385gcc ggc atg act ccg ttc gtc tgg gag gag atg att acc gaa tgg aac                 1316Ala Gly Met Thr Pro Phe Val Trp Glu Glu Met Ile Thr Glu Trp Asn
    390                 395                 400atg act ctg ggt aaa gac gtt gtg att cag tcc tgg ctc ggt ggc ggt                 1364Met Thr Leu Gly Lys Asp Val Val Ile Gln Ser Trp Leu Gly Gly Gly
405                 410                 415gct atc aag acc ctg gct gag gct ggt cac aag gta atc gat agt gat                 1412Ala Ile Lys Thr Leu Ala Glu Ala Gly His Lys Val Ile Asp Ser Asp420                 425                 430                 435tac aac ttc tgg tac ctt gac tgt ggg cgt gga cag tgg ctc aac ttt          1460Tyr Asn Phe Trp Tyr Leu Asp Cys Gly Arg Gly Gln Trp Leu Asn Phe
            440                 445                 450gac aac ggc gat gcc ttt caa aca tac tac ccc ttc aac gac tgg tgc          1508Asp Asn Gly Asp Ala Phe Gln Thr Tyr Tyr Pro Phe Asn Asp Trp Cys
        455                 460                 465ggt cct acc aag agc tgg cgg ctc atc tac tcc cac gat cct cgg gcc          1556Gly Pro Thr Lys Ser Trp Arg Leu Ile Tyr Ser His Asp Pro Arg Ala
    470                 475                 480ggt cta tcc gag gaa gca gcc aag cgc gtg ctt ggt ggt gag gcg gcc          1604Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Lys Arg Val Leu Gly Gly Glu Ala Ala
485                 490                 495gta tgg act gag act atc gac agt gtt aac ctc gat acc att gtg tgg          1652Val Trp Thr Glu Thr Ile Asp Ser Val Asn Leu Asp Thr Ile Val Trp500                 505                 510                 515ccc cgc gct gca gtg atg gga gaa gtt ctc tgg tca ggc cga act gac          1700Pro Arg Ala Ala Val Met Gly Glu Val Leu Trp Ser Gly Arg Thr Asp
            520                 525                 530gcc tca ggc cag aac aga tcg cag tat gat gct gca ccg cga ctg gct          1748Ala Ser Gly Gln Asn Arg Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Pro Arg Leu Ala
        535                 540                 545gag atg cgc gag cgt atg gtg gct cga gga gtg agt gct tca cca att          1796Glu Met Arg Glu Arg Met Val Ala Arg Gly Val Ser Ala Ser Pro Ile
    550                 555                 560cag atg ccc ttc tgt aca cag ggc aat gcc acc gag tgt gcg caa gtc          1844Gln Met Pro Phe Cys Thr Gln Gly Asn Ala Thr Glu Cys Ala Gln Val
565                 570                 575gag gga tga taaatttgac gcgtggtgca tctgtactta ttacgaatta                   1893Glu Gly580ctttgtacat agtttgttct cagcattttg aatagagaat tatttcccct ctttca             1949<210>13<211>581<212>PRT<213>镰孢属<400>13Met Trp Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Ala Phe Ala Phe Thr Pro1               5                  10                  15Ala Asn Ala Ile Trp Pro Val Pro Lys Lys Ile Ser Thr Gly Asp Lys
         20                  25                  30Ala Leu Phe Ile Asp Gln Thr Ile Asp Xaa Thr Tyr Asn Gly Asp Phe
     35                  40                  45Ile Pro Tyr Thr Tyr Asn Tyr Gln Pro Asp Ala Gly Ser Lys Phe Ser
 50                  55                  60Ser Lys Gln Ile Ile Gln Ala Gly Val Ser Arg Ala Leu Gln Gly Val65                  70                  75                  80Phe Gln Asp Asn Phe Val Pro Trp Met Leu Arg Glu Arg Asp Ser Asp
             85                  90                  95Phe Glu Pro Asp Leu Gln Lys Lys Gln Trp Val Lys Ser Leu Lys Ile
        100                 105                 110Ile Gln Thr Glu Glu Asp Asp Glu Ser Thr Phe Lys Pro Leu Asn Gly
    115                 120                 125Glu Val Asp Glu Ser Tyr Ser Leu Ser Leu Ser Glu Lys Gly Glu Ala
130                 135                 140Ser Ile Lys Ala Lys Ser Ser Thr Gly Val Leu His Gly Leu Glu Thr145                 150                 155                 160Phe Val Gln Leu Phe Phe Lys His Ser Ser Gly Thr Ser Trp Tyr Thr
            165                 170                 175Pro His Ala Pro Val Ser Ile Gln Asp Glu Pro Glu Tyr Pro His Arg
        180                 185                 190Gly Ile Leu Leu Asp Val Ala Arg Ser Phe Phe Glu Val Lys His Ile
    195                 200                 205Lys Arg Thr Ile Asp Ala Met Ser Trp Ser Lys Leu Asn Arg Leu His
210                 215                 220Leu His Ile Thr Asp Ser Gln Ser Trp Pro Leu Glu Ile Pro Ala Leu225                 230                 235                 240Pro Lys Leu Ala Glu Lys Gly Ala Tyr Arg Lys Gly Leu Thr Tyr Ser
            245                 250                 255Pro Glu Asp Leu Ala Gly Ile Tyr Glu Tyr Gly Ile His Arg Gly Val
        260                 265                 270Glu Val Ile Met Glu Ile Asp Met Pro Gly His Ile Gly Val Val Glu
    275                 280                 285Leu Ala Tyr Lys Asp Leu Ile Val Ala Tyr Asn Glu Lys Pro Tyr Gln
290                 295                 300Trp Trp Cys Lys Glu Pro Pro Cys Gly Ala Phe Arg Met Asn Ser Ser305                 310                 315                 320Asp Val Tyr Asp Phe Leu Asp Thr Leu Phe Asp Asp Leu Phe Pro Arg
            325                 330                 335Ile Ser Lys Tyr Ser Pro Tyr Phe His Leu Gly Gly Asp Glu Leu Asn
        340                 345                 350His Asn Asp Ser Arg Leu Asp Pro Asp Val Arg Ser Asn Glu Thr Glu
    355                 360                 365Val Leu Ala Pro Leu Leu Gln Lys Phe Val Asp Tyr Thr His Gly Lys
370                 375                 380Val Arg Asp Ala Gly Met Thr Pro Phe Val Trp Glu Glu Met Ile Thr385                 390                 395                 400Glu Trp Asn Met Thr Leu Gly Lys Asp Val Val Ile Gln Ser Trp Leu
            405                 410                 415Gly Gly Gly Ala Ile Lys Thr Leu Ala Glu Ala Gly His Lys Val Ile
        420                 425                 430Asp Ser Asp Tyr Asn Phe Trp Tyr Leu Asp Cys Gly Arg Gly Gln Trp
    435                 440                 445Leu Asn Phe Asp Asn Gly Asp Ala Phe Gln Thr Tyr Tyr Pro Phe Asn
450                 455                 460Asp Trp Cys Gly Pro Thr Lys Ser Trp Arg Leu Ile Tyr Ser His Asp465                 470                 475             480Pro Arg Ala Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Lys Arg Val Leu Gly Gly
            485                 490                 495Glu Ala Ala Val Trp Thr Glu Thr Ile Asp Ser Val Asn Leu Asp Thr
        500                 505                 510Ile Val Trp Pro Arg Ala Ala Val Met Gly Glu Val Leu Trp Ser Gly
    515                 520                 525Arg Thr Asp Ala Ser Gly Gln Asn Arg Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Pro
530                 535                 540Arg Leu Ala Glu Met Arg Glu Arg Met Val Ala Arg Gly Val Ser Ala545                 550                 555                 560Ser Pro Ile Gln Met Pro Phe Cys Thr Gln Gly Asn Ala Thr Glu Cys
            565                 570                 575Ala Gln Val Glu Gly
        580<210>14<211>249<212>PRT<213>Fusarium venenatum<400>14Met Trp Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Ala Phe Ala Phe Thr Pro1               5                  10                  15Ala Asn Ala Ile Trp Pro Val Pro Lys Lys Ile Ser Thr Gly Asp Lys
         20                  25                  30Ala Phe Phe Ile Asp Gln Thr Ile Asp Ile Thr Tyr Asn Gly Gly Phe
     35                  40                  45Ile Pro Tyr Thr Tyr Asn Tyr Gln Pro Asp Ala Gly Ser Lys Phe Ser
 50                  55                  60Ser Lys Gln Ile Val Gln Ala Gly Val Ser Arg Ala Leu Gln Gly Ile65                   70                  75                  80Phe Gln Asp Asn Phe Val Pro Trp Met Leu Arg Glu Arg Asp Ser Asp
             85                  90                  95Phe Glu Pro Asp Leu Gln Lys Lys Gln Trp Val Lys Ser Leu Lys Ile
        100                 105                 110Val Gln Thr Glu Glu Asp Asp Glu Ser Thr Phe Lys Pro Leu Asn Gly
    115                 120                 125Glu Val Asp Glu Ser Tyr Ser Leu Ser Leu Ser Glu Lys Gly Glu Ala
130                 135                 140Ser Ile Lys Ala Lys Ser Ser Thr Gly Val Leu His Gly Leu Glu Thr145                 150                 155                 160Phe Val Gln Leu Phe Phe Lys His Ser Ser Gly Thr Ser Trp Tyr Thr
            165                 170                 175Pro His Ala Pro Val Ser Ile Gln Asp Glu Pro Glu Tyr Pro His Arg
        180                 185                 190Gly Ile Leu Leu Asp Val Ala Arg Ser Phe Phe Glu Val Lys His Ile
    195                 200                 205Lys Arg Thr Ile Asp Ala Met Ser Trp Ser Lys Leu Asn Arg Leu His
210                 215                 220Leu His Ile Thr Asp Ser Gln Ser Trp Pro Leu Glu Ile Pro Ala Leu225                 230                 235                 240Pro Lys Leu Ala Glu Lys Gly Ala Tyr
            245<210>15<211>249<212>PRT<213>拟分枝孢镰孢<400>15Met Trp Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Ala Phe Ala Phe Thr Pro1               5                  10                  15Ala Asn Ala Ile Trp Pro Val Pro Lys Lys Ile Ser Thr Gly Asp Lys
         20                  25                  30Ala Leu Phe Ile Asp Gln Thr Ile Asp Xaa Thr Tyr Asn Gly Asp Phe
     35                  40                  45Ile Pro Tyr Thr Tyr Asn Tyr Gln Pro Asp Ala Gly Ser Lys Phe Ser
 50                  55                  60Ser Lys Gln Ile Ile Gln Ala Gly Val Ser Arg Ala Leu Gln Gly Val65                  70                  75                  80Phe Gln Asp Asn Phe Val Pro Trp Met Leu Arg Glu Arg Asp Ser Asp
             85                  90                  95Phe Glu Pro Asp Leu Gln Lys Lys Gln Trp Val Lys Ser Leu Lys Ile
        100                 105                 110Ile Gln Thr Glu Glu Asp Asp Glu Ser Thr Phe Lys Pro Leu Asn Gly
    115                 120                 125Glu Val Asp Glu Ser Tyr Ser Leu Ser Leu Ser Glu Lys Gly Glu Ala
130                 135                 140Ser Ile Lys Ala Lys Ser Ser Thr Gly Val Leu His Gly Leu Glu Thr145                 150                 155                 160Phe Val Gln Leu Phe Phe Lys His Ser Ser Gly Thr Ser Trp Tyr Thr
            165                 170                 175Pro His Ala Pro Val Ser Ile Gln Asp Glu Pro Glu Tyr Pro His Arg
        180                 185                 190Gly Ile Leu Leu Asp Val Ala Arg Ser Phe Phe Glu Val Lys His Ile
    195                 200                 205Lys Arg Thr Ile Asp Ala Met Ser Trp Ser Lys Leu Asn Arg Leu His
210                 215                 220Leu His Ile Thr Asp Ser Gln Ser Trp Pro Leu Glu Ile Pro Ala Leu225                 230                 235                 240Pro Lys Leu Ala Glu Lys Gly Ala Tyr
            245<210>16<211>932<212>DNA<213>Fusarium venenatum<220><221>CDS<222>(18)..(923)<400>16ggatccacca accagcg atg aag ttc ttc agc act ctt agc acc ctt gcg                50
               Met Lys Phe Phe Ser Thr Leu Ser Thr Leu Ala
                 1               5                  10gtg gcc ctc atg atg agt ggc gag gct ctg gct ggt acc tac aag ggt               98Val Ala Leu Met Met Ser Gly Glu Ala Leu Ala Gly Thr Tyr Lys Gly
         15                  20                  25ttc agc att ggc gcc aac agg gct gat ggt gcc tgt aag tgg gag gcc               146Phe Ser Ile Gly Ala Asn Arg Ala Asp Gly Ala Cys Lys Trp Glu Ala
     30                  35                  40gac tgg aag aag gat ttc cag gcc atc aag agc tgg aac aag ggt ttc              194Asp Trp Lys Lys Asp Phe Gln Ala Ile Lys Ser Trp Asn Lys Gly Phe
 45                  50                  55aac gct gtt cgt ctg tac tct gcc tct gac tgt aac aca ctt gtc aag              242Asn Ala Val Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asp Cys Asn Thr Leu Val Lys60                  65                  70                  75gct gtc ccc gct gcc aag gcc act ggc atg aag atc ctt gtt ggc gtc              290Ala Val Pro Ala Ala Lys Ala Thr Gly Met Lys Ile Leu Val Gly Val
             80                  85                  90tgg gcc acc gat gat gct cac ttc ggc cgc gac aag gcc gcc ctc ctc              338Trp Ala Thr Asp Asp Ala His Phe Gly Arg Asp Lys Ala Ala Leu Leu
         95                 100                 105aag gct atc aag cag cac ggc acc ggc tgg atc gcc gcc atc agt gtc              386Lys Ala Ile Lys Gln His Gly Thr Gly Trp Ile Ala Ala Ile Ser Val
    110                 115                 120gga tcc gag gac ctc tac cgt gag gac atc tcc ccc cag aag ctc gca              434Gly Ser Glu Asp Leu Tyr Arg Glu Asp Ile Ser Pro Gln Lys Leu Ala
125                 130                 135cag cag atc tac gac gtc cga ggc atg gtc cac caa tac aac aag aac              482Gln Gln Ile Tyr Asp Val Arg Gly Met Val His Gln Tyr Asn Lys Asn140                 145                 150                 155ctc aag gtc gga cat acc gac acc tgg acc gct tgg gtc gac ggc cgc              530Leu Lys Val Gly His Thr Asp Thr Trp Thr Ala Trp Val Asp Gly Arg
            160                 165                 170aac gac gtc gtc acc aag gcc tgc gat atc gcc att aca aac ggt ttc              578Asn Asp Val Val Thr Lys Ala Cys Asp Ile Ala Ile Thr Asn Gly Phe
        175                 180                 185ccc tac tgg aag ggt gtt ccc atc aag gat gct ctc cgc ctc aag acc               626Pro Tyr Trp Lys Gly Val Pro Ile Lys Asp Ala Leu Arg Leu Lys Thr
    190                 195                 200ttc cag aac tcc ttc tgg aac gtc cag aag cac gtc aag gct gtc aac               674Phe Gln Asn Ser Phe Trp Asn Val Gln Lys His Val Lys Ala Val Asn
205                 210                  215tcc aag gct gct gtc tgg gtt ggc gag acc ggc tgg cct aca aag gga               722Ser Lys Ala Ala Val Trp Val Gly Glu Thr Gly Trp Pro Thr Lys Gly220                 225                 230                 235ccc aac tac cag aag gct gct gcc acg acc gcc agt ctc cag cag ttc               770Pro Asn Tyr Gln Lys Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Leu Gln Gln Phe
            240                 245                 250tac aac aat gtc ggt tgc tgg ctc tgg cag cag aag gag gcc agt ggt               818Tyr Asn Asn Val Gly Cys Trp Leu Trp Gln Gln Lys Glu Ala Ser Gly
        255                 260                 265ttc tgg ttc act gct ttc gat aca cct gcg cac agc acc gag gtt gag               866Phe Trp Phe Thr Ala Phe Asp Thr Pro Ala His Ser Thr Glu Val Glu
    270                 275                 280aag tac ttc ggt att gcc aac cag gac cgc aag ctc aag ttc agc ctt               914Lys Tyr Phe Gly Ile Ala Asn Gln Asp Arg Lys Leu Lys Phe Ser Leu
285                 290                 295act tgc taa gccagatct                                                         932Thr Cys300<210>17<211>301<212>PRT<213>Fusarium venenatum<400>17Met Lys Phe Phe Ser Thr Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Leu Met Met1               5                  10                  15Ser Gly Glu Ala Leu Ala Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ser Ile Gly Ala
         20                  25                  30Asn Arg Ala Asp Gly Ala Cys Lys Trp Glu Ala Asp Trp Lys Lys Asp
     35                  40                  45Phe Gln Ala Ile Lys Ser Trp Asn Lys Gly Phe Asn Ala Val Arg Leu
 50                  55                  60Tyr Ser Ala Ser Asp Cys Asn Thr Leu Val Lys Ala Val Pro Ala Ala65                  70                  75                  80Lys Ala Thr Gly Met Lys Ile Leu Val Gly Val Trp Ala Thr Asp Asp
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    115                 120                 125Tyr Arg Glu Asp Ile Ser Pro Gln Lys Leu Ala Gln Gln Ile Tyr Asp
130                 135                 140Val Arg Gly Met Val His Gln Tyr Asn Lys Asn Leu Lys Val Gly His145                 150                 155                 160Thr Asp Thr Trp Thr Ala Trp Val Asp Gly Arg Asn Asp Val Val Thr
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    180                     185                 190Val Pro Ile Lys Asp Ala Leu Arg Leu Lys Thr Phe Gln Asn Ser Phe
195                     200                 205Trp Asn Val Gln Lys His Val Lys Ala Val Asn Ser Lys Ala Ala Val210                     215                 220Trp Val Gly Glu Thr Gly Trp Pro Thr Lys Gly Pro Asn Tyr Gln Lys225                 230                 235                 240Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Leu Gln Gln Phe Tyr Asn Asn Val Gly
            245                 250                 255Cys Trp Leu Trp Gln Gln Lys Glu Ala Ser Gly Phe Trp Phe Thr Ala
        260                 265                 270Phe Asp Thr Pro Ala His Ser Thr Glu Val Glu Lys Tyr Phe Gly lle
    275                 280                 285Ala Asn Gln Asp Arg Lys Leu Lys Phe Ser Leu Thr Cys
290                 295                 300<210>18<211>1227<212>DNA<213>Fusarium venenatum<220><221>CDS<222>(18)..(1217)<400>18ggatccaaca ccacgcg atg ggt ggt gga ccc gaa ggt ttc cgc acc gtt            50
               Met Gly Gly Gly Pro Glu Gly Phe Arg Thr Val
                 1               5                  10gcg tat ttc gtc aac tgg gct atc tat gca cga aag cat cgt cct cag           98Ala Tyr Phe Val Asn Trp Ala Ile Tyr Ala Arg Lys His Arg Pro Gln
         15                  20                  25gat ctt ccc gtg gag aac ctg aca cat att ctt tac tcg ttc gct aat           146Asp Leu Pro Val Glu Asn Leu Thr His Ile Leu Tyr Ser Phe Ala Asn
     30                  35                  40att cgt agc gac tct ggc gaa gtc cat ctc acc gac tca tgg gcc gat           194Ile Arg Ser Asp Ser Gly Glu Val His Leu Thr Asp Ser Trp Ala Asp
 45                  50                  55acc gat att cat tgg gat gga gat tcc tgg aat gat gtc ggt acc aac           242Thr Asp Ile His Trp Asp Gly Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn60                  65                  70                  75ttg tac ggt tgc atg aag cag ctt aac ctg ttg aaa aga cgt aac cga                290Leu Tyr Gly Cys Met Lys Gln Leu Asn Leu Leu Lys Arg Arg Asn Arg
             80                  85                  90aac ctc aag gtt ctt ctc agt att gga ggt tgg acc ttc agt agc aac                338Asn Leu Lys Val Leu Leu Ser Ile Gly Gly Trp Thr Phe Ser Ser Asn
         95                 100                 105ttc aag ggc ccc gct agc aca ccc caa gga cgt gac aca ttc gcc aag                386Phe Lys Gly Pro Ala Ser Thr Pro Gln Gly Arg Asp Thr Phe Ala Lys
    110                 115                 120agc tgt gtc gat ctg atc aag aac ctc ggt ttt gac ggt ata gat atc                434Ser Cys Val Asp Leu Ile Lys Asn Leu Gly Phe Asp Gly Ile Asp Ile
125                 130                 135gat tgg gag tac ccc cag gat gcc aac gag gct aga aac tat gtc gaa                482Asp Trp Glu Tyr Pro Gln Asp Ala Asn Glu Ala Arg Asn Tyr Val Glu140                 145                 150                 155ctt ctg ggc gcc gtg cgt cat gag atg gat gca tat gca cag aca ttg                530Leu Leu Gly Ala Val Arg His Glu Met Asp Ala Tyr Ala Gln Thr Leu
            160                 165                 170agc caa cct tat cac ttt gag ttg act gtg gcc tgt cca gcc ggt gcg                578Ser Gln Pro Tyr His Phe Glu Leu Thr Val Ala Cys Pro Ala Gly Ala
        175                 180                 185aca aac ttc cag aag ctc gat atc cgt gga atg gat caa tac ctc gac                626Thr Asn Phe Gln Lys Leu Asp Ile Arg Gly Met Asp Gln Tyr Leu Asp
    190                 195                 200ttc tgg aac ctc atg gct tac gac tat gct ggt tct tgg gac caa act                674Phe Trp Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Trp Asp Gln Thr
205                 210                 215gcg ggt cat cag gcc aac ctg tac cca tct cac gac aac cca gta tca             722Ala Gly His Gln Ala Asn Leu Tyr Pro Ser His Asp Asn Pro Val Ser220                 225                 230                 235acc cca ttc tct acc tct gct gcc atc gac ttt tac gtc cgc agc ggt             770Thr Pro Phe Ser Thr Ser Ala Ala Ile Asp Phe Tyr Val Arg Ser Gly
            240                 245                 250gtg aac cct tca aag ata gtt ctc ggc atg cca ctc tac ggc cga gcc             818Val Asn Pro Ser Lys Ile Val Leu Gly Met Pro Leu Tyr Gly Arg Ala
        255                 260                 265ttt gag aac acc gac ggt ccc ggc cgc ccc tac caa ggc gtt gga caa             866Phe Glu Asn Thr Asp Gly Pro Gly Arg Pro Tyr Gln Gly Val Gly Gln
    270                 275                 280ggt tcc tgg gaa cag gga gtc tac gat tac aag gcg ctt ccc cta gag             914Gly Ser Trp Glu Gln Gly Val Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Pro Leu Glu
285                 290                 295ggc gcg caa gag tac gga gat aga gga tgc tgt gcc agc tac tgc tac             962Gly Ala Gln Glu Tyr Gly Asp Arg Gly Cys Cys Ala Ser Tyr Cys Tyr300                 305                 310                 315aac cct cag tca cgt acc atg gtc acc tac gac acg ccg cgg gtc gcc            1010Asn Pro Gln Ser Arg Thr Met Val Thr Tyr Asp Thr Pro Arg Val Ala
            320                 325                 330tgg gat aag gcc gag tat gtg aag agg tgg aag ctg gga ggc gct atg            1058Trp Asp Lys Ala Glu Tyr Val Lys Arg Trp Lys Leu Gly Gly Ala Met
        335                 340                 345tgg tgg gag agc agc gcg gat aag cag ggc gag cag agt ttg atc aca            1106Trp Trp Glu Ser Ser Ala Asp Lys Gln Gly Glu Gln Ser Leu Ile Thr
    350                 355                 360acg gtt gtg aac gga ttc gga ggt cag gga gcg ctc atg aga cag gac               1154Thr Val Val Asn Gly Phe Gly Gly Gln Gly Ala Leu Met Arg Gln Asp
365                 370                 375aac tgt att gag tat ccc gcg acc aag tac gat aac ttg cga aat ggg               1202Asn Cys Ile Glu Tyr Pro Ala Thr Lys Tyr Asp Asn Leu Arg Asn Gly380                 385                 390                 395ttc ccg gac aat tga ggcgagatct                                                1227Phe Pro Asp Asn
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     35                  40                  45Gly Glu Val His Leu Thr Asp Ser Trp Ala Asp Thr Asp Ile His Trp
 50                  55                  60Asp Gly Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn Leu Tyr Gly Cys Met65                  70                  75                  80Lys Gln Leu Asn Leu Leu Lys Arg Arg Asn Arg Asn Leu Lys Val Leu
             85                  90                  95Leu Ser Ile Gly Gly Trp Thr Phe Ser Ser Asn Phe Lys Gly Pro Ala
        100                 105                 110Ser Thr Pro Gln Gly Arg Asp Thr Phe Ala Lys Ser Cys Val Asp Leu
    115                 120                 125Ile Lys Asn Leu Gly Phe Asp Gly Ile Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro
130                 135                 140Gln Asp Ala Asn Glu Ala Arg Asn Tyr Val Glu Leu Leu Gly Ala Val145                 150                 155                 160Arg His Glu Met Asp Ala Tyr Ala Gln Thr Leu Ser Gln Pro Tyr His
            165                 170                 175Phe Glu Leu Thr Val Ala Cys Pro Ala Gly Ala Thr Asn Phe Gln Lys
        180                 185                 190Leu Asp Ile Arg Gly Met Asp Gln Tyr Leu Asp Phe Trp Asn Leu Met
    195                 200                 205Ala Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Trp Asp Gln Thr Ala Gly His Gln Ala
210                 215                 220Asn Leu Tyr Pro Ser His Asp Asn Pro Val Ser Thr Pro Phe Ser Thr225                 230                 235                 240Ser Ala Ala Ile Asp Phe Tyr Val Arg Ser Gly Val Asn Pro Ser Lys
            245                 250                 255Ile Val Leu Gly Met Pro Leu Tyr Gly Arg Ala Phe Glu Asn Thr Asp
        260                 265                 270Gly Pro Gly Arg Pro Tyr Gln Gly Val Gly Gln Gly Ser Trp Glu Gln
    275                 280                 285Gly Val Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Pro Leu Glu Gly Ala Gln Glu Tyr
290                 295                 300Gly Asp Arg Gly Cys Cys Ala Ser Tyr Cys Tyr Asn Pro Gln Ser Arg305                 310                 315                 320Thr Met Val Thr Tyr Asp Thr Pro Arg Val Ala Trp Asp Lys Ala Glu
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               Met Trp Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Ala
                 1               5                  10ttc gcc ttt acc ccc gcc aat gcc ata tgg cca gtg cca aag aag atc                98Phe Ala Phe Thr Pro Ala Asn Ala Ile Trp Pro Val Pro Lys Lys Ile
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 45                  50                  55ggc tcc aag ttc agc agt aag caa atc gtc caa gcc ggc gtc tct cgt                242Gly Ser Lys Phe Ser Ser Lys Gln Ile Val Gln Ala Gly Val Ser Arg60                  65                  70                  75gcc ctc cag ggc atc ttc cag gac aac ttt gtc cca tgg atg ctt cgc                290Ala Leu Gln Gly Ile Phe Gln Asp Asn Phe Val Pro Trp Met Leu Arg
             80                  85                  90gaa cgc gat tcc gat ttc gag cct gac ctg caa aag aag cag tgg gtg                338Glu Arg Asp Ser Asp Phe Glu Pro Asp Leu Gln Lys Lys Gln Trp Val
         95                 100                 105aag tcg cta aag att gtc cag acc gag gag gat gac gag agt acc ttc              386Lys Ser Leu Lys Ile Val Gln Thr Glu Glu Asp Asp Glu Ser Thr Phe
    110                 115                 120aag cct ctc aat ggt gag gtt gac gag tcg tac tct ctc tca ctt tct              434Lys Pro Leu Asn Gly Glu Val Asp Glu Ser Tyr Ser Leu Ser Leu Ser
125                 130                 135gaa aag ggc gag gct tcc atc aag gcc aag tct tct aca ggc gtc ctg              482Glu Lys Gly Glu Ala Ser Ile Lys Ala Lys Ser Ser Thr Gly Val Leu140                 145                 150                 155cat gga ctt gag acc ttt gtc caa ctt ttc ttc aag cac agc tct ggc              530His Gly Leu Glu Thr Phe Val Gln Leu Phe Phe Lys His Ser Ser Gly
            160                 165                 170act tcc tgg tac acg ccg cac gcg cct gtc tcg atc cag gat gag ccc              578Thr Ser Trp Tyr Thr Pro His Ala Pro Val Ser Ile Gln Asp Glu Pro
        175                 180                 185gag tac cct cat cga ggc att ctt ctc gat gtt gcc cgt agc ttt ttt              626Glu Tyr Pro His Arg Gly Ile Leu Leu Asp Val Ala Arg Ser Phe Phe
    190                 195                 200gaa gtc aag cac atc aag cgc aca atc gac gcc atg tcg tgg agc aag              674Glu Val Lys His Ile Lys Arg Thr Ile Asp Ala Met Ser Trp Ser Lys
205                 210                 215ctg aat cgc ctt cac ctt cac atc act gac tcg cag tcc tgg cct ctc              722Leu Asn Arg Leu His Leu His Ile Thr Asp Ser Gln Ser Trp Pro Leu220                 225                 230                 235gag atc cca gcc cta ccc aaa ctg gcc gaa aag ggt gca tac cgc aaa              770Glu Ile Pro Ara Leu Pro Lys Leu Ala Glu Lys Gly Ala Tyr Arg Lys
            240                 245                 250ggc ctg acc tac tct cct gag gat ctt gcc ggt att tat gag tat ggt                  818Gly Leu Thr Tyr Ser Pro Glu Asp Leu Ala Gly Ile Tyr Glu Tyr Gly
        255                 260                 265atc cac cgc gga gtc gag gtc atc atg gag att gac atg ccc ggc cat                  866Ile His Arg Gly Val Glu Val Ile Met Glu Ile Asp Met Pro Gly His
    270                 275                 280atc ggt gtc gtt gag ctt gcc tat aag gat ctc att gtc gcg tac aat                  914Ile Gly Val Val Glu Leu Ala Tyr Lys Asp Leu Ile Val Ala Tyr Asn
285                 290                 295gag aag cct tat caa tgg tgg tgt aag gag cca ccc tgt ggt gcg ttc                  962Glu Lys Pro Tyr Gln Trp Trp Cys Lys Glu Pro Pro Cys Gly Ala Phe300                 305                 310                 315cgc atg aac agc tct gat gtt tat gac ttt ctc gac act ctt ttt gat                  1010Arg Met Asn Ser Ser Asp Val Tyr Asp Phe Leu Asp Thr Leu Phe Asp
            320                 325                 330gac ctc ttc cct cgc att tcc aag tac agt cct tac ttc cac ctt ggt                  1058Asp Leu Phe Pro Arg Ile Ser Lys Tyr Ser Pro Tyr Phe His Leu Gly
        335                 340                 345gga gac gag ctc aac cac aac gat tcc aga ctt gac cct gat gtg cgc                  1106Gly Asp Glu Leu Asn His Asn Asp Ser Arg Leu Asp Pro Asp Val Arg
    350                 355                 360tct aac gag acc gag gtt ctg gcg cct ctt ttg caa aag ttc gtc gat                  1154Ser Asn Glu Thr Glu Val Leu Ala Pro Leu Leu Gln Lys Phe Val Asp
365                 370                 375tac act cac ggc aag gtt cga gat gcc ggc atg act ccg ttc gtc tgg                  1202Tyr Thr His Gly Lys Val Arg Asp Ala Gly Met Thr Pro Phe Val Trp380                 385                 390                 395gag gag atg att acc gaa tgg aac atg act ctg ggt aaa gac gtt gtg               1250Glu Glu Met Ile Thr Glu Trp Asn Met Thr Leu Gly Lys Asp Val Val
            400                 405                 410att cag tcc tgg ctc ggt ggc ggt gct atc aag acc ctg gct gag gct               1298Ile Gln Ser Trp Leu Gly Gly Gly Ala Ile Lys Thr Leu Ala Glu Ala
        415                 420                 425ggt cac aag gta atc gat agt gat tac aac ttc tgg tac ctt gac tgt               1346Gly His Lys Val Ile Asp Ser Asp Tyr Asn Phe Trp Tyr Leu Asp Cys
    430                 435                 440ggg cgt gga cag tgg ctc aac ttt gac aac ggc gat gcc ttt caa aca               1394Gly Arg Gly Gln Trp Leu Asn Phe Asp Asn Gly Asp Ala Phe Gln Thr
445                 450                 455tac tac ccc ttc aac gac tgg tgc ggt cct acc aag agc tgg cgg ctc               1442Tyr Tyr Pro Phe Asn Asp Trp Cys Gly Pro Thr Lys Ser Trp Arg Leu460                 465                 470                 475atc tac tcc cac gat cct cgg gcc ggt cta tcc gag gaa gca gcc aag               1490Ile Tyr Ser His Asp Pro Arg Ala Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Lys
            480                 485                 490cgc gtg ctt ggt ggt gag gcg gcc gta tgg act gag act atc gac agt               1538Arg Val Leu Gly Gly Glu Ala Ala Val Trp Thr Glu Thr Ile Asp Ser
        495                 500                 505gtt aac ctc gat acc att gtg tgg ccc cgc gct gca gtg atg gga gaa               1586Val Asn Leu Asp Thr Ile Val Trp Pro Arg Ala Ala Val Met Gly Glu
    510                 515                 520gtt ctc tgg tca ggc cga act gac gcc tca ggc cag aac aga tcg cag               1634Val Leu Trp Ser Gly Arg Thr Asp Ala Ser Gly Gln Asn Arg Ser Gln
525                 530                 535tat gat gct gca ccg cga ctg gct gag atg cgc gag cgt atg gtg gct               1682Tyr Asp Ala Ala Pro Arg Leu Ala Glu Met Arg Glu Arg Met Val Ala540                 545                 550                 555cga gga gtg agt gct tca cca att cag atg ccc ttc tgt aca cag ggc               1730Arg Gly Val Ser Ala Ser Pro Ile Gln Met Pro Phe Cys Thr Gln Gly
            560                 565                 570aat gcc acc gag tgt gcg caa gtc gag gga tga taaatttgac gcagatct               1781Asn Ala Thr Glu Cys Ala Gln Val Glu Gly
        575                 580<210>21<211>581<212>PRT<213>Fusarium venenatum<400>21Met Trp Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Ala Phe Ala Phe Thr Pro1               5                  10                  15Ala Asn Ala Ile Trp Pro Val Pro Lys Lys Ile Ser Thr Gly Asp Lys
         20                  25                  30Ala Phe Phe Ile Asp Gln Thr Ile Asp Ile Thr Tyr Asn Gly Gly Phe
     35                  40                  45Ile Pro Tyr Thr Tyr Asn Tyr Gln Pro Asp Ala Gly Ser Lys Phe Ser
 50                  55                  60Ser Lys Gln Ile Val Gln Ala Gly Val Ser Arg Ala Leu Gln Gly Ile65                   70                  75                  80Phe Gln Asp Asn Phe Val Pro Trp Met Leu Arg Glu Arg Asp Ser Asp
             85                  90                  95Phe Glu Pro Asp Leu Gln Lys Lys Gln Trp Val Lys Ser Leu Lys Ile
        100                 105                 110Val Gln Thr Glu Glu Asp Asp Glu Ser Thr Phe Lys Pro Leu Asn Gly
    115                 120                 125Glu Val Asp Glu Ser Tyr Ser Leu Ser Leu Ser Glu Lys Gly Glu Ala
130                 135                 140Ser Ile Lys Ala Lys Ser Ser Thr Gly Val Leu His Gly Leu Glu Thr145                 150                 155                 160Phe Val Gln Leu Phe Phe Lys His Ser Ser Gly Thr Ser Trp Tyr Thr
            165                 170                 175Pro His Ala Pro Val Ser Ile Gln Asp Glu Pro Glu Tyr Pro His Arg
        180                 185                 190Gly Ile Leu Leu Asp Val Ala Arg Ser Phe Phe Glu Val Lys His Ile
    195                 200                 205Lys Arg Thr Ile Asp Ala Met Ser Trp Ser Lys Leu Asn Arg Leu His
210                 215                 220Leu His Ile Thr Asp Ser Gln Ser Trp Pro Leu Glu Ile Pro Ala Leu225                 230                 235                 240Pro Lys Leu Ala Glu Lys Gly Ala Tyr Arg Lys Gly Leu Thr Tyr Ser
            245                 250                 255Pro Glu Asp Leu Ala Gly Ile Tyr Glu Tyr Gly Ile His Arg Gly Val
        260                 265                 270Glu Val Ile Met Glu Ile Asp Met Pro Gly His Ile Gly Val Val Glu
    275                 280                 285Leu Ala Tyr Lys Asp Leu Ile Val Ala Tyr Asn Glu Lys Pro Tyr Gln
290                 295                 300Trp Trp Cys Lys Glu Pro Pro Cys Gly Ala Phe Arg Met Asn Ser Ser305                 310                 315                 320Asp Val Tyr Asp Phe Leu Asp Thr Leu Phe Asp Asp Leu Phe Pro Arg
            325                 330                 335Ile Ser Lys Tyr Ser Pro Tyr Phe His Leu Gly Gly Asp Glu Leu Asn
        340                 345                 350His Asn Asp Ser Arg Leu Asp Pro Asp Val Arg Ser Asn Glu Thr Glu
    355                 360                 365Val Leu Ala Pro Leu Leu Gln Lys Phe Val Asp Tyr Thr His Gly Lys
370                 375                 380Val Arg Asp Ala Gly Met Thr Pro Phe Val Trp Glu Glu Met Ile Thr385                 390                 395                 400Glu Trp Asn Met Thr Leu Gly Lys Asp Val Val Ile Gln Ser Trp Leu
            405                 410                 415Gly Gly Gly Ala Ile Lys Thr Leu Ala Glu Ala Gly His Lys Val Ile
        420                 425                 430Asp Ser Asp Tyr Asn Phe Trp Tyr Leu Asp Cys Gly Arg Gly Gln Trp
    435                 440                 445Leu Asn Phe Asp Asn Gly Asp Ala Phe Gln Thr Tyr Tyr Pro Phe Asn
450                 455                 460Asp Trp Cys Gly Pro Thr Lys Ser Trp Arg Leu Ile Tyr Ser His Asp465                 470                 475                 480Pro Arg Ala Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Lys Arg Val Leu Gly Gly
            485                 490                 495Glu Ala Ala Val Trp Thr Glu Thr Ile Asp Ser Val Asn Leu Asp Thr
        500                 505                 510Ile Val Trp Pro Arg Ala Ala Val Met Gly Glu Val Leu Trp Ser Gly
    515                 520                 525Arg Thr Asp Ala Ser Gly Gln Asn Arg Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Pro
530                 535                 540Arg Leu Ala Glu Met Arg Glu Arg Met Val Ala Arg Gly Val Ser Ala545                 550                 555                 560Ser Pro Ile Gln Met Pro Phe Cys Thr Gln Gly Asn Ala Thr Glu Cys
            565                 570                 575Ala Gln Val Glu Gly
        580<210>22<211>33<212>DNA<213>玉蜀黍<400>22cacacacaac agatctcccc caaatccacc cgt                                  33<210>23<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：修饰的UBI-I<400>23cacacacaac agatttcccc caaatccacc cgt                               33<210>24<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：修饰的UBI-1<400>24cagatttccc ccaaatccca cacacaacc                                    29<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：前导序列<400>25ggatccacca accagcg                                                17<210>26<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：M13F引物<400>26gtaaaacgac ggccag                                           16<210>27<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：M13R引物<400>27agcgaataac aatttcacac agga                                  24<210>28<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>28tcctggagcc cgtcagtatc gg                                    22<210>29<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>29tggctgaata tcgacggttt cc                                   22<210>30<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>30atttaggtga cactatag                                        18<210>31<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>31caggacagga aacagctatg acc                                  23<210>32<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>32ctatcaagca gcacgg                                          16<210>33<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>33ctggaaggtc ttgaggc                                         17<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>34gatatcgatt gggagtacc                                       19<210>35<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>35catggtacgt gactgagg                                        18<210>36<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>36caaccctcag tcacgtac                                        18<210>37<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>37cctcgttggc atcctg                                          16<210>38<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>38agatccttat aggcaagctc aacgacaccg                           30<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>39cataaatacc ggcaagatcc                                      20<210>40<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>40atcgatatct ataccgtcaa aaccg                                25<210>41<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>41atcgatatct ataccgtcaa aaccg                                25<210>42<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>42atctgctggg cgagcttc                                       18<210>43<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>43cagaaaccac tggcatcc                                       18<210>44<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>44aagttcggcc ttacttgc                                       18<210>45<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>45ctttgggctc gtattcac                                       18<210>46<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>46cttcagcact ctcagcac                                       18<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>47ggactgaggg agtgttggtt c                                   21<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>48tctaccctac aacactcatc                                     20<210>49<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>49gtcgatcatg gtggaaag                                       18<210>50<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>50tgtccctgtt actaacgg                                       18<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>51tagtcgcctt tctaagcc                                        18<210>52<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>52aagaatgcct cgatgagggt actcg                                25<210>53<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>53atctcactca cctcacctc                                       19<210>54<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>54ccggtattta tgagtatgg                                      19<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>55gatagtctca gtccatacgg                                     20<210>56<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>56gtaccttgac tgtgggc                                        17<210>57<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>57ggaaatgcga gggaag                                         16<210>58<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>58agatctcgcc tcaattgtcc gggaacc                             27<210>59<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>59ggatccaaca ccacgcgatg ggtggtggac ccgaagg                  37<210>60<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>60agatctgcgt caaatttatc atccctcg                                   28<210>61<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>61ggatccacca accagcgatg tggtccaagg ctcttctggc cgttg               45<210>62<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>62gcttcatgca accgtacaag ttgg                                      24<210>63<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>63cgacttcacc cactgcttct tttgc                           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Claims (39)

1.编码具有葡聚糖酶活性的多肽的分离的核酸分子，其选自：
(a)与下列序列有至少70％核苷酸序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO：3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO：16的第18位到923位核苷酸；
(b)编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸序列，所说的多肽具有与SEQ ID NO：2，4，5或17的第1到301位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列；
(c)在中度或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸序列：(i)SEQ ID NO：1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO：3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO：16的第18位到923位核苷酸；(ii)(i)的至少100个连续核苷酸的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(d)(a)、(b)或(c)的子序列，其中该子序列编码有葡聚糖酶活性的多肽片段。
2.权利要求1的核酸分子，其展示在SEQ ID NO：1，3或16中。
3.权利要求1的核酸分子，其包含在质粒Glu2，FvGluS或FvGluAS中。
4.包含权利要求1的核酸分子的核酸结构，该分子可操作地与一个或多个调控序列相连接，该调控序列可在表达宿主中指导具有葡聚糖酶活性的多肽的生产。
5.转化了权利要求1的分离的核酸分子的细胞。
6.转化了权利要求1的分离的核酸分子的植物。
7.权利要求6的植物的种子。
8.权利要求6的植物，其中该植物是单子叶植物。
9.权利要求8的植物，所说的单子叶植物是小麦。
10.权利要求6的植物的有性或无性来源的后代。
11.由权利要求1的核酸分子编码的葡聚糖酶多肽。
12.分离的具有葡聚糖酶活性的多肽，其选自：
(a)具有与SEQ ID NO：2，4，5或17的第1到301位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由在中度或高度严格条件下可以与下列序列杂交的核酸序列所编码的多肽，这些序列是：(i)SEQ ID NO：1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO：3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO：16的第18位到923位核苷酸；(ii)至少100个核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(c)(a)或(b)的具有葡聚糖酶活性的片段。
13.编码具有内切壳多糖酶活性的多肽的分离的核酸分子，其选自：
(a)与下列序列有至少75％核苷酸序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO：18的第18位到1217位核苷酸；
(b)编码具有内切壳多糖酶活性的多肽的核酸序列，所说的多肽具有与SEQ ID NO：11或19的第1到399位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列；
(c)在中度或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸序列：(i)SEQ ID NO：10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO：18的第18位到1217位核苷酸；(ii)至少100个连续核苷酸的(i)的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(d)(a)、(b)或(c)的子序列，其中该子序列编码有内切壳多糖酶活性的多肽片段。
14.权利要求13的核酸分子，其展示在SEQ ID NO：10或18中。
15.权利要求13的核酸分子，其包含在质粒Endo176，FvEndoS或FvEndoAS中。
16.包含权利要求13的核酸分子的核酸结构，该分子可操作地与一个或多个调控序列相连接，该调控序列可在表达宿主中指导具有内切壳多糖酶活性的多肽的生产。
17.转化了权利要求13的分离的核酸分子的细胞。
18.转化了权利要求13的分离的核酸分子的植物。
19.权利要求18的植物的种子。
20.权利要求18的植物，其中该植物是单子叶植物。
21.权利要求20的植物，其中所说的单子叶植物是小麦。
22.权利要求18的植物的有性或无性来源的后代。
23.由权利要求13的核酸分子编码的内切壳多糖酶多肽。
24.分离的具有内切壳多糖酶活性的多肽，其选自：
(a)具有与SEQ ID NO：11或19的第1到399位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由在中度或高度严格条件下可以与下列序列杂交的核酸序列所编码的多肽，这些序列是：(i)SEQ ID NO：10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO：18的第18位到1217位核苷酸；(ii)至少100个连续核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(c)(a)或(b)的具有内切壳多糖酶活性的片段。
25.编码具有外切壳多糖酶活性的多肽的分离的核酸分子，其选自：
(a)与下列序列有至少75％核苷酸序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO：20的第18位到1763位核苷酸；
(b)编码具有外切壳多糖酶活性的多肽的核酸序列，所说的多肽具有与SEQ ID NO：13或21的第1到581位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列；
(c)在中度或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸序列：(i)SEQ ID NO：12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO：20的第18位到1763位核苷酸；(ii)至少100个连续核苷酸的(i)的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(d)(a)、(b)或(c)的子序列，其中该子序列编码有外切壳多糖酶活性的多肽片段。
26.权利要求25的核酸分子，其展示在SEQ ID NO：8，12或20中。
27.权利要求25的核酸分子，其包含在质粒Exo9，FvExoS或FvExoAS中。
28.包含权利要求25的核酸分子的核酸结构，其中该分子可操作地与一个或多个调控序列相连接，该调控序列可在表达宿主中指导具有外切壳多糖酶活性的多肽的生产。
29.转化了权利要求25的分离的核酸分子的细胞。
30.转化了权利要求25的分离的核酸分子的植物。
31.权利要求30的植物的种子。
32.权利要求30的植物，其中该植物是单子叶植物。
33.权利要求30的植物，其中所说的单子叶植物是小麦。
34.权利要求30的植物的有性或无性来源的后代。
35.由权利要求25的核酸分子编码的外切壳多糖酶多肽。
36.分离的具有外切壳多糖酶活性的多肽，其选自：
(a)具有与SEQ ID NO：13或21的第1到581位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由在中度或高度严格条件下可以与下列序列杂交的核酸序列所编码的多肽，这些序列是：(i)SEQ ID NO：12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO：20的第18位到1763位核苷酸；(ii)至少100个连续核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(c)(a)或(b)的具有外切壳多糖酶活性的片段。
37.转化了一个或多个权利要求1、13或25的分离核酸分子的植物。
38.赋予或增强植物对真菌病原体的抗性的方法，包括用一个或多个编码具有葡聚糖酶活性的多肽、具有内切壳多糖酶活性的多肽或具有外切壳多糖酶活性的多肽的分离核酸分子转化所述植物。
39.生产具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的多肽的方法，该方法包括在适于生产该多肽的条件下培养包含被转化细胞的重组宿主细胞，所述被转化细胞具有编码有葡聚糖酶、内切壳多糖酶或外切壳多糖酶活性的多肽的核酸分子；并回收该多肽。
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