CN1265146A

CN1265146A - 细胞分裂素氧化酶

Info

Publication number: CN1265146A
Application number: CN98807668A
Authority: CN
Inventors: R·O·莫里斯
Original assignee: University of Missouri System
Current assignee: University of Missouri System
Priority date: 1997-07-30
Filing date: 1998-07-30
Publication date: 2000-08-30
Also published as: EP1002096A1; AU8603898A; BR9811592A; AU749221B2; CA2295859A1; PL338330A1; US6617497B1; CA2295859C; US6229066B1; WO1999006571A1

Abstract

一种分离的、具有细胞分裂素氧化活性的蛋白质,此蛋白质选自下组:SEQ ID NO.1;所具氨基酸序列包含SEQ ID N0.1氨基酸序列的一种蛋白质;所具氨基酸序列包含 SEQ ID NO.1氨基酸序列一部分的一种蛋白质,所包括部分至少约20个氨基酸残基长并赋予该蛋白质以细胞分裂素氧化活性;和所含氨基酸序列与 SEQ ID NO.1有至少约65%序列相同、其余的氨基酸残基被保守置换的一种蛋白质。编码有细胞分裂素氧化活性的蛋白质的核酸及相关产物和方法也在公开之列。

Description

细胞分裂素氧化酶

发明背景

本发明涉及来自玉米(Zea mays)、其完整氨基酸序列已阐明的纯化植物细胞分裂素氧化酶(ckx1)，还涉及对编码该酶的核苷酸序列的分离。本发明进一步涉及调节该酶和其它相似酶类在植物中的浓度从而影响植物细胞的生长和死亡的最新方法。本发明的应用包括通过调节ckx1在植物根部的产生而影响发病机制、通过调节而改变植物习性以及可用于植物生化分析的ckx1酶大规模生产。

植物细胞分裂素是一类植物激素，可与植物生长素共同控制细胞分裂、促进由愈伤组织发育出苗、解除休眠释放侧芽、并以各种不同方式调节植物的结构和生长。大多数高等植物的天然活性细胞分裂素均为玉米素(6-(4-羟基-3-甲基丁-反式-2-烯基氨基)嘌呤)游离碱(下文称之为Z)及其9-核糖核苷(下文称之为ZR)。因此植物组织通常包含Z、ZR和衍生自生物合成前体的N⁶-(Δ²-异戊烯)腺嘌呤(下文称之为iP)。细胞分裂素水平升高均与高等植物中种子发育有关，并已证实与玉米粒和其它谷物种子发育中胚乳内的最大有丝分裂活性一致。外源细胞分裂素的应用(通过茎注射)已显示与玉米粒的产量增加直接相关。此外，用根癌土壤杆菌ipt基因(编码能增加Z和ZR的胞内产量的二甲基丙烯焦磷酸酯：5’-ATP转移酶)转化的植物细胞显示有相应于内源细胞分裂素水平因酶诱导而增加的生长增加。因此，细胞分裂素对植物生长的生物重要性使得能够有商业价值和科研价值地控制高等植物细胞中细胞分裂素的水平。

细胞分裂素氧化酶的作用是植物细胞中细胞分裂素有效分解代谢的主要方式。使细胞分裂素失活是通过在分子氧存在的情况下自细胞分裂素游离碱(或它们的核糖核苷)氧化除去侧链而完成的。有iP参与的这一反应的一个实例已显示于图1a。尽管该反应的确切化学机制尚不明确，但有人推测该酶在iP去质子化为N⁶-(Δ²-异戊烯亚胺)嘌呤的过程中被还原。嘌呤然后经水解变成腺嘌呤和中间产物3-甲基-2-丁烯醛(图1b)。

植物细胞中负责还原酶重新氧化的电子受体尚不清楚，但分子氧可在体外担任此角色。或者，还原酶可在体外由中间产物如Cu⁺²/咪唑复合物或人工电子受体二氯靛酚(DCPIP)重新氧化。

已知细胞分裂素氧化酶可在细胞分裂后从植物细胞中除去细胞分裂素，并有人推测它参与衰老过程。细胞分裂素氧化酶活性已显示与玉米粒中胚乳细胞的有丝分裂正相关，也与天然细胞分裂素浓度的增加相关。氧化酶活性在内源性细胞分裂素水平上升后很快增强。已证实与人为增加转基因烟草中细胞分裂素水平有类似的相关性。因此认为细胞分裂素氧化酶的表达参与维持正在发育的植物细胞中激素体内平衡。因为细胞分裂素氧化酶看起来象是底物诱导型，它们以负调节方式将上升的细胞分裂素水平降至基础水平。这种细胞分裂素氧化酶活性的底物诱导作用是尝试通过在转基因植物中增加细胞分裂素的生产而控制细胞分裂素水平的有效商业应用的明显障碍。

已对以下多种植物物种中的细胞分裂素氧化酶进行了讨论，这些植物包括长春花、豆类(菜豆和棉豆)、小麦、烟草、麝香石竹、大豆、和玉米。所有这些植物的细胞分裂素氧化酶对iP和Z均有相似的底物偏好性，而对大分子的、还原的、或芳香族侧链细胞分裂素只有有限的活性或根本无活性。所有这些酶在有铜和咪唑存在时均表现出增强的活性。然而，这些酶显示在特异性活性和分子量上有实质性差异。这一点让人联想到与物种之间和物种内该蛋白的糖基化和未糖基化变体的存在有关。

在糖基化细胞分裂素氧化酶中，高度糖基化的蛋白质可呈现一种富含糖基的表面，它可阻止针对肽表位的抗体的形成。在这些情况下被针对而产生抗体的糖基表位是非特异性的，可妨碍经免疫层析或其它基于免疫学的方法对蛋白质或含其编码基因的克隆进行分离。此前报道的一项通过对玉米cDNA文库表达产物进行免疫筛选分离玉米细胞分裂素基因(ckx1)的尝试(Burch，1992)已告失败。

正如已证实的，细胞分裂素氧化酶的完整氨基酸序列和编码DNA是现代植物生理学的一项长期任务。

发明简述

因此本发明的目标之一是提供一种大量产生重组细胞分裂素氧化酶的方法以研究细胞分裂素氧化酶对植物生长和代谢的影响。本发明的另一目标是提供体内调节植物细胞中细胞分裂素氧化酶生产的方法，以便调节植物细胞中内源性细胞分裂素水平以达到改变病原体抗性和植物生长特点的效果。

因此本发明涉及一种分离的和基本纯化的新型植物细胞分裂素氧化酶(ckx1)，其分子量更优选约60KD，序列长度约505-565个氨基酸残基，优选525-545个氨基酸残基，更优选534个氨基酸残基，并具有细胞分裂素失活活性。本发明也涉及具有包含ckx1氨基酸序列(SEQID NO：1)的氨基酸序列的蛋白质。本发明还涉及具有细胞分裂素失活活性并包含ckx1氨基酸序列中至少长约20个氨基酸残基的一部分的蛋白质，所包含的ckx1序列部分赋予该蛋白质具有细胞分裂素失活活性。本发明涉及具有细胞分裂素失活活性并与ckx1有至少65％序列相同，更优选与ckx1有至少95％序列相同，而剩下的氨基酸被保守置换的蛋白质。

本发明更涉及编码ckx1或其细胞分裂素氧化同系物的基本分离的核酸聚合物。该核酸聚合物更优选具有SEQ ID NO：3的核酸序列或述于SEQ ID NO：10的其可预测变体。本发明也涉及含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：10描述的核酸聚合物长度至少为60bp的一部分的基本分离的核酸聚合物。此外，本发明涉及与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、或由SEQ ID NO：10描述的核酸聚合物，在0.5X-2XSSC缓冲液、0.1％SDS和55-65℃的条件下能杂交上的核酸聚合物。编码细胞分裂素氧化酶并符合上述要求的核酸聚合物可编码与ckx1有足够相似性、通常在生化领域的技术人员看来为ckx1等价体的蛋白质。

本发明也涉及掺入了含上述DNA的载体的宿主细胞和用此宿主细胞生产ckx1或其同系物的方法。此方法优选包括先将编码上述ckx1或其片段或其同系物的DNA与适当启动子(如RB7根特异性启动子，Conkling，M.A.等，美国专利第5,459,252号；或CaMV35S启动子，Odell，1985)或与启动子联合体(Hoffman，专利第5,106,739)连接至适当DNA载体(如根癌土壤杆菌中使用pBIN19)中。再将此载体构建体直接转化进宿主细胞，如巴斯德毕赤酵母(述于实施例2)。也可将它掺入一个次级载体以转化进宿主细胞，如根癌土壤杆菌，以及将它转化进植物细胞宿主(述于实施例4，以烟草为例)。

或者，为了生产大量酶，可按实施例2或Su等(1996)和Skory等(1996)的方法将编码ckx1的DNA或其部分转化进毕赤酵母。当转化进毕赤酵母时，由于在ckx1编码区的N-末端存在分泌信号肽而使ckx1分泌至培养基中。因此，无需裂解便可从大量毕赤酵母培养物中轻易纯化活性酶。以此方式生产的ckx1可按实施例3的方法用于生化分析中，以确定生物样品中细胞分裂素的未知浓度。

经上述方法产生的植物宿主细胞可再生成完整植物。根据载体构建体中所用启动子的不同，ckx1可组成型生产或经天然或人为环境因子而诱导型生产。含组织特异性或创伤特异性启动子及ckx1编码序列的载体所转化的植物可对某些细胞分裂素关联的植物病理学如某些线虫或真菌的感染表现出有所改变的抗性。

此处所述发现为以下方法的发展提供了重要的分析工具和关键的内在联系，借助于该方法，可以控制细胞分裂素氧化酶活性而以预期方式抑制或增强植物中各种细胞生长功能。可能的应用包括培育谷物产量增加、抗病性增强，或具有更理想的次级生长特点的商用植物。该酶及其编码核酸在植物细胞生长周期和衰老的研究中具有重要利用价值。此外，还可发现有关ckx1及其基因在其它制药学和农业上的很多应用。该酶、其表达方法、及其应用方法均在下文详述。

本发明的其它特点和目标有一部分对本领域技术人员而言是明显的，一部分将在后文指出。

附图简述、序列特征及定义

本发明由附图作进一步公开和举例说明。

图1a & b显示由细胞分裂素氧化酶催化的反应的一个实例(Browhlee，1975)，及其推测机制(如上述，基于Hare，1994之文献)。

图2显示RT-PCR DNA片段的琼脂糖凝胶电泳，证实ckx1基因的内含子已得到正确识别。

图3显示用ckx1分析溶液中细胞分裂素浓度时得到的标准分光光度吸收曲线(590nm)。

图4为DNA质粒pJL7的图解。

图5为DNA质粒pBI121的图解。

图6为DNA质粒pROM8的图解。

图7为DNA质粒pROM9的图解。

图8为DNA质粒pROM22的图解。

图9为DNA质粒pROM24的图解。

图10为DNA质粒pROM26的图解。

图11为DNA质粒pROM28的图解。

图12为DNA质粒pROM29的图解。

图13为DNA质粒pROM30的图解。

图14为DNA质粒pROM32的图解。

图15为DNA质粒pROM43的图解。

氨基酸和核苷酸的所有序列标志缩写均与USPTO和WIPO标准一致。

SEQ ID NO：1列出了衍生自玉米的天然ckx1的氨基酸序列。该序列是从基因组DNA衍生的编码ckx1的核苷酸序列预测而得。

SEQ ID NO：2列出了编码ckx1的基因组DNA序列，包括内含子。

SEQ ID NO：3列出了编码ckx1的DNA序列，排除了内含子。该序列已在实施例2中重建于pROM22中。

SEQ ID NO：4列出了ckx1的一个内部胰酶消化片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5列出了ckx1的一个内部胰酶消化片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6列出了用于分离编码ckx1的基因组DNA(如实施例1所述)的简并DNA探针的核酸序列。注意序列中命名为“n”的残基均为人工碱基次黄嘌呤核苷(I)。按常规约定指示序列简并性。

SEQ ID NO：7列出了用于分离编码ckx1的基因组DNA(如实施例1所述)的简并DNA探针的核酸序列。注意序列中命名为“n”的残基均为人工碱基次黄嘌呤核苷(I)。按常规方法指示序列简并性。

SEQ ID NO：8列出了用于分离编码ckx1的基因组DNA(如实施例1所述)的简并DNA探针的核酸序列。注意序列中命名为“n”的残基均为人工碱基次黄嘌呤核苷(I)。按常规方法指示序列简并性。

SEQ ID NO：9列出了用于分离编码ckx1的基因组DNA(如实施例1所述)的简并DNA探针的核酸序列。注意序列中命名为“n”的残基均为人工碱基次黄嘌呤核苷(I)。按常规方法指示序列简并性。

SEQ ID NO：10列出了编码ckx1的简并DNA序列。如本领域所熟知，多个这样的DNA分子编码具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的蛋白质，也称ckx1。这一组遵循遗传密码简并性的常规法则。在特定生物中表达所必需、但不遵循这些常规的特异性修饰可由领域内技术人员轻易完成。

SEQ ID NO：11列出了用于实施例2中经PCR除去内含子的合成引物的序列。

SEQ ID NO：12列出了用于实施例2中经PCR除去内含子的合成引物的序列。

SEQ ID NO：13列出了用于实施例2中经PCR除去内含子的合成引物的序列。

SEQ ID NO：14列出了用于实施例2中经PCR除去内含子的合成引物的序列。

SEQ ID NO：15列出了用于实施例2中经PCR除去内含子的合成引物的序列。

SEQ ID NO：16列出了用于实施例2中经PCR除去内含子的合成引物的序列。

SEQ ID NO：17列出了实施例2中所用合成性连接子构建体的序列。

SEQ ID NO：18列出了实施例2中所用合成性连接子构建体的序列。

SEQ ID NO：19列出了实施例4中为获得烟草RB7启动子所进行的PCR中所用合成性引物的序列。

SEQ ID NO：20列出了实施例4中为获得烟草RB7启动子所进行的PCR中所用合成性引物的序列。

这里的“基本纯化的蛋白质”指该蛋白质与通常与之相关的大部分宿主细胞蛋白质得到分离，或该蛋白质合成为基本纯化形式，这样的合成包括在宿主细胞中由经任意适当的基因治疗运送方式导入该细胞的外源核酸聚合物表达该蛋白质。

“基本分离的核酸聚合物”指包含目的核酸聚合物的混合物基本上不含通常与之相关的其它大部分核酸聚合物。“核酸聚合物”包括核苷酸或核苷酸衍生物或类似物(包括如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等)的聚合物。基因组DNA、cDNA和mRNA均为核酸聚合物的实例。

术语“调节转录”、“修饰转录”、“调节产生”和“修饰产生”意图包括促进和/抑制mRNA的转录或蛋白质的产生/翻译。

术语“表达调节序列”指连接至蛋白质编码序列的核酸聚合物序列，当将其导入宿主细胞中时，可诱导或阻止该蛋白质的表达。这些序列也可编码或不编码在它们的调节机制中应用的蛋白质。表达调节序列的实例包括CaMV启动子、ocs终止子及tet操纵子序列。

术语“基因”意图包括内源和外源基因，具体地包括例如在天然细胞中编码目标蛋白质的基因组DNA及编码目标蛋白质的cDNA，其中该cDNA是诸如已导入细胞的质粒载体或病毒等核酸构建体的一部分或是经RT-PCR产生的cDNA。

术语“载体”意图包括任意含目的核酸聚合物的物理或生化载体，借助于它可将这些核酸聚合物转移进宿主细胞，使该细胞被导入的核酸聚合物转化。载体实例包括DNA质粒、病毒、枪用小弹丸(particlegun pellets)及细菌如根癌土壤杆菌。术语“初级载体”意指系列转化中所用第一个载体，可以是一步转化中的载体(如用于转化酵母细胞的质粒)，或是伴有“次级载体”(如用于转化根癌土壤杆菌的质粒，此菌后用于转化植物细胞)。

术语“宿主细胞”意指载体所转化的靶细胞，转移进去的核酸聚合物将在其中复制和/或表达。

氨基酸序列范围中的术语“保守置换”指序列中一个氨基酸由另一个带相似大小和带电量之侧链的氨基酸置换。保守置换的一个实例是用天冬酰胺置换谷氨酰胺。蛋白质序列中预计对蛋白质结构或功能只有极小影响或根本无影响的保守置换可由生化领域中的一般技术人员轻易地进行设计。

术语“植物产物”指植物产生的任何细胞性物质，特别是那些可用于植物繁殖的物质。植物产物包括种子、根状茎、叶子、分生组织、根和芽。

术语“SSC缓冲液”指在1升水中含有8.765g NaCl和4.41g柠檬酸钠，pH经10 N NaOH溶液滴定调节至7.0的溶液。

本文引用的每篇参考文献的内容均全文引入作为参考。

发明详述

本发明涉及分离自玉米植株、命名为ckx1的最近已测序的细胞分裂素氧化酶，它表现出底物特异性的细胞分裂素氧化活性。此酶关系到玉米种子的发育和成熟，以及植物组织的衰老。对这些植物功能的控制看起来可通过降低内源和外源细胞分裂素浓度实现。因为ckx1能有效氧化无未饱和侧链的细胞分裂素以及它们的核糖核苷，如iP、Z和ZR(当将它们作外源或内源应用时也可诱导此酶的产生)，所以有人认为ckx1能作为植物生长调控的一个方面精确控制这些活性细胞分裂素的效力。

在发展这一要求保护之发明的过程中，申请人遇到了好几个难题，它们或许可以解释为什么有关细胞分裂素氧化酶基因的研究在此之前均未成功。该蛋白质表达水平很低，并且只在植物生长周期的特定阶段表达。因此，对大肠杆菌中的λ-cDNA玉米文库的筛选无法得到ckx1可能仅仅因为制备文库时该基因没有表达，或表达量太少，无法检测。此外，该蛋白质的分离对一些研究人员而言可能是个问题，因为其活性形式经过凝胶过滤后失活。申请人只有通过发展自己的筛选方法(述于实施例1)才能分离出具有足以进行胰酶消化及随后测序所需纯度的蛋白质。

甚至在蛋白质纯化后，要得到ckx1的基因序列也十分困难。很明显，ckx1的N-末端为封闭式，故不可能直接对其N-末端序列进行Edman降解法测定。该蛋白质经胰酶消化后，能测定的只有小分子的内部序列SEQ ID NO：4 & 5。由于这些片段在该蛋白氨基酸序列中的位置不清楚，不得不克服好几个难题以便成功地探查玉米基因组获得ckx1基因(详述于实施例1)。被测序的肽片段较小，不得不采用“明确分隔(bookended)”标准(在所复制DNA的任一末端有一个探针)以便从ckx1基因的每一侧排除非ckx1 DNA。能合理断定的是两个探针之间的DNA将是ckx1基因的一部分。杂交/扩增产物的大小也必须以300bp为标准以便区分二聚体化简并引物和PCR产物。简单的简并策略未必有效，因为胰酶消化肽提供的特定氨基酸序列本身具有高度简并性。最初，当采用标准的简并核苷酸策略时，应用编码内部氨基酸序列的所有可能的寡核苷酸，所得到的特异性结合引物浓度之低不足以起始PCR扩增。申请人只有通过应用具较大范围特异性的含次黄嘌呤核苷的简并探针才能克服该问题。此外，一些简并探针太接近以致于不能产生目标大小的产物，或在基因中的顺序不对因而不能产生“明确分隔”产物。经证实只有探针SEQ ID NO：6，7，8 & 9能用于分离ckx1基因。

所分离基因的特性用两种互不相干的方法检验。第一，经测试针对大肠杆菌中产生的SEQ ID NO：3翻译物的山羊抗血清对玉米粒提取物中的ckx1的亲和力而检验(如实施例1那样)。第二，经在巴斯德毕赤酵母中表达SEQ ID NO：3导致分泌活性细胞分裂素氧化酶而确证(如实施例2那样)。

SEQ ID NO：2列出了ckx1的完整基因组DNA序列，它在玉米中表达时产生糖基化形式的蛋白质。内含子在基因组序列中的预计位置用逆转录酶-聚合酶链式反应确认，以确定RNA的真实转录长度(如实施例1那样)。SEQ ID NO：3列出了ckx1的编码DNA序列，它产生SEQID NO：1所示的氨基酸序列。

目前分子生物学水平已非常进步，完全能在DNA序列中相对简便和精确地造成微小替换。技术较熟练的实验员可在某种市售定点诱变试剂盒(如Promega公司，Madison，Wisconsin提供的GeneEditor^TM)的指导下在一段DNA核苷酸序列中产生任意数目的变化。控制遗传密码的一般规律也已为人熟知，核苷酸三联密码根据这一规律经标准的生化方法翻译为氨基酸序列。故申请人认为SEQ ID NO：10共有序列(编码ckx1氨基酸序列SEQ ID NO：1)所指示的这组DNA序列将包括在本发明中。尽管一些生物门中存在遗传密码和GC％含量的不同，控制这些变异的规律也已有充分的文献可作依据，并且是分子遗传学领域的一般技术人员技术范围之内。故申请人还认为编码氨基酸序列SEQID NO：1的任何其它核酸序列也包括在本发明的范围内。

此外，尽管对蛋白质生物化学领域的理解不如对分子遗传学领域的理解那么全面，生化领域的一般技术人员还是能够预测蛋白质一级结构氨基酸序列的特定置换何时不会导致对蛋白质结构或功能的任何明显修饰。这类保守置换是通过用含有相似电荷、大小和其它特点之侧链的另一种氨基酸置换序列中氨基酸造成的。例如，具有小的非极性甲基侧链的丙氨酸通常可由具有小的非极性氢侧链的甘氨酸置换，并不产生任何可引人注意的影响。同样，有稍大些的极性乙酰胺侧链的天冬酰胺通常可由有稍大些的极性丙酰胺侧链的谷氨酰胺置换，并不产生任何可引人注意的影响。当这类保守置换使得与SEQ ID NO：1的同一性以及细胞分裂素氧化活性保持65％、优选80％或更高时，如此改变的蛋白质均包括在本发明的范围内。

已知细胞分裂素氧化酶在多种高等植物(包括玉米)中有非糖基化和糖基化的多种形式。有人认为这一修饰作用参与对在胞内和胞外有不同应用的细胞分裂素氧化酶的划分。此酶的糖基化程度还可说明为什么各物种之间细胞分裂素氧化酶的分子量有那么大的差异。但是，由于底物特异性，酶活性对分子氧的需求及铜浓度反应速率的体外影响在所有高等植物细胞分裂素氧化酶之间高度保守，人们确信存在共有结构域和活性结构位点负责所有酶的细胞分裂素氧化酶活性。因此，本发明还涉及具有细胞分裂素氧化活性并包含以下氨基酸序列的蛋白质：与SEQ ID NO：1的大小相似部分90％相同(或与保守性氨基酸置换相同)的至少长约20个氨基酸的氨基酸序列。

本发明的另一目标是ckx1在各种宿主细胞中的调控生产，以用于随后大量分离或受调控的胞内生产。例如，可在原核生物如大肠杆菌中生产非糖基化形式的ckx1，如实施例1所举例说明。更优选，该蛋白质可在真核生物中生产，如实施例2中毕赤酵母生产的举例说明。在毕赤酵母中生产该蛋白质的又一项好处是，该蛋白质将分泌在培养基中，从而很易纯化。或者，该蛋白质可在高等真核生物中生产，更优选植物中生产，如实施例4中在烟草内以糖基化或非糖基化形式生产。其它适于做宿主植物细胞的实例包括玉米、拟南芥、芸苔属各个种及稻。正如已举例，可在植物中以未调控形式产生ckx1(如此处所示受控于CaMV启动子)；也可经人为刺激调控生产(如此处所示受控于CaMV与tet操纵了组合体)；还可由环境刺激调控生产(如此处所示受控于RB7启动子，其对线虫感染产生反应而诱导蛋白质的根特异性生产)。

本发明的好几个方面，包括ckx1蛋白及编码它的核酸聚合物、酶类如ckx1酶等的细胞分裂素氧化活性和ckx1对植物细胞中细胞分裂素水平的调节等，综合起来可实施好几种应用，包括农业和科研应用。

申请人设计了有关大量细胞分裂素氧化酶的一项应用，大大促进了植物生理学研究。细胞分裂素氧化酶在氧化了细胞分裂素后可被合成性氧化剂二氯靛酚(DCPIP)重新氧化。经证实DCPIP在还原后于590nm处的光吸收值下降，这一点可经分光光度计定量。样品中细胞分裂素浓度可通过测定ckx1氧化样品中存在的细胞分裂素时氧化型DCPIP的减少而间接确定。还有更灵敏的氧化还原染料可提高试验的灵敏度。因此，本发明的另一个目标是提供一种简便、快速及有效的方法以分析样品中细胞分裂素浓度。

申请人还设计了一项对植物中ckx1的修饰生产的应用。细胞分裂素与好几类植物发病机制有关，这些机制包括线虫滋养细胞的形成及真菌对植物组织的入侵。故ckx1的病原体暴露性调节型生产可通过细胞分裂素利用机制[如根结线虫的利用机制(Bird等，1980)或真菌如玉米黑粉菌的利用机制]改变发病机制的功效。因此，本发明的一个目的是提供通过用ckx1生产型DNA构建体转化植物从而缓和细胞分裂素介导的发病机制的方法。

以下实施例举例说明了本发明的原理和优势。

实施例实施例1：ckx1的分离及其编码序列的鉴定

选择玉米种子作为纯化的原料，因为授粉大约一周时其中的细胞分裂素氧化酶浓度相对较高。经以下过程，每kg玉米可获得近1.66μg蛋白质。试验田中生长的玉米(先锋3180或3379)人工授粉，其后第5一第8天收获未成熟谷穗(Dietrich，1995)。迅速收获种子，冻存于-80℃直至提取时。种子在液氮中研成粉末后，将1kg种子粉与1700ml缓冲液A(50mM Tris，5mM EDTA，抗坏血酸0.4％w/v；10mM β-巯基乙醇，pH 8.5)混合。已酸洗的PVPP(200g湿重，用缓冲液A平衡)迅速搅拌。悬浮液经Miracloth过滤并于23,500×g离心15分钟除去残渣。向离心后的上清液中滴加聚乙烯亚胺溶液(5％v/v，pH8.5)至终浓度0.05％。于23,500×g再离心10分钟后，将上清液通过600g PVPP填料(如上制备)过滤。进行硫酸铵分级分离，离心收集40％-65％饱和度之间沉淀的蛋白质，将其溶于最小体积的缓冲液B(10mM Tris，1mM EDTA，1mM β-巯基乙醇，pH 8.5)中。不溶物经35,000×g离心20分钟除去。此时，可向上清液中加入甘油至10％(v/v)，使蛋白质能在-80℃无限期保存而不失活性。

将硫酸铵分级分离后的上清液对缓冲液B透析后，以10ml/分钟的流速上样至DEAE-纤维素层析柱(Whatman DE-52,500ml，由Whatman集团，Clifton，新泽西提供)中。用缓冲液B洗柱后，用所含KCl经600ml而浓度线性递增至200mM的缓冲液B对层析柱进行洗脱。蛋白质含量用Bradford染料结合试验(Bradford，1976)测定。按下述方法分析各级分的氧化酶活性。

用两个试验检查纯化步骤中的细胞分裂素氧化酶活性。第一个为如LiberosMinotta(1995)所述的希夫氏碱形成试验，可测定由iP产生的二甲基烯丙基醛(dimethylallylaldehyde)，，其中的iP经DEAE柱层析步骤后耗尽。第二个是由申请人开发的用于剩余几个纯化步骤的试验。在该试验中，经ckx1催化而将还原型等价体从异戊烯腺嘌呤转移至二氯酚靛酚(DCPIP)使得有可能通过测定590nm处光吸收值的变化而观察反应性。在终体积250μl中，试验包含：100mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0；1.0mM EDTA；0.05mM DCPIP；0.1mM iP；100μg/ml BSA；及待测样品。加入酶后，在590nm处读取光吸收值的变化共读10分钟。

经DEAE柱层析纯化后，将集中的主要活性物质对缓冲液C(20mMTris，0.5M NaCl，1.0mM CaCl₂，pH 7.4)透析，再上样于刀豆蛋白A琼脂糖层析柱(100ml，Sigma Aldrich，St.Louis，Missouri)中，并用缓冲液C(270ml)洗柱。糖基化蛋白质用含α-D-甲基甘露糖苷梯度经400ml递增至1M的缓冲液C进行洗脱。在这些条件下进行洗脱时相对较长的保留时间说明ckx1的糖基化形式已经分离。植物血凝素亲和层析所得活性级分接着对缓冲液D(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.5)透析，然后上样于高分辨率阴离子交换层析柱(FPLC MonoQ，1ml，Amersham Pharmacia Biotech公司，San Francisco，Califor-nia)中，用线性递增至0.12M的KCl梯度以1ml/分钟的流速洗脱超过24分钟。离子交换柱层析所得活性级分经浓缩，对缓冲液B透析，调至含1.5M硫酸铵，上样于已用含0.6硫酸铵的缓冲液B平衡的疏水相互作用层析柱(FPLC phenylsuperose，1ml，Pharmacia)。用0.6M硫酸铵洗25分钟后，硫酸铵浓度在15分钟的时间里递减至0.45M，然后在60分钟的时间里递减至0。

按Ornstein(1964)和Davis(1964)的说明进行非变性凝胶电泳。然后经上述DCPIP操作对凝胶染色分析其细胞分裂素氧化酶活性。酶活性以蓝色背景上的透明带显示。接着按Laemmli(1970)的说明进行变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。当检测级分的同质性时，凝胶按Moller(1995)所述染色。最后一步纯化时，酶用考马斯亮蓝R250染色。经胰酶消化、HPLC分离消化物及对胰酶消化多肽的Edman降解测序即完成对纯化蛋白的分析。经此分析获得好几个多肽序列，包括SEQ IDNO：4和5。根据这些序列设计了反向翻译引物探针SEQ ID NO：6，7，8和9，其中在高度简变性部位有次黄嘌呤核苷的置换。接着将引物SEQID NO：6和9与玉米基因组DNA组合，进行热启动的降落PCR(touchdownPCR)(Ault，1994)40个循环。PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，选出近400bp的一个片段作为杂交探针。由于它能用巢式内部引物SEQ ID NO：7和8进行PCR扩增，因而证实了该片段的性质。然后将引物SEQ ID NO：6和9扩增的片段与线性化pCRII DNA连接并转化进大肠杆菌(INVαF’，Invitrogen公司，Carlsbad，California)。克隆并再次分离DNA后，质粒插入物用Prism双脱氧终止物法(Applied Biosystems，FosterCity，CA)测序以检验所测序的胰酶消化多肽由该片段编码。

一旦证实了该大片段，就应用DNA聚合酶的Klenow片段及引物SEQID NO：6和9经引物延伸使之标记上³²P。将玉米基因组文库噬菌体(在λ-FIXII中，来自Stratagene，La Jolla，California)稀释于SM缓冲液中，取适当量加入新鲜制备的于10mM MgSO₄中的大肠杆菌(XL1-Blue MRA(P2)，Stratagene)中，于37℃温育15分钟。加入48℃的NZY顶层琼脂，将混合物铺板于NZY琼脂平板上。37℃温育近8小时后，将平板于4℃冷却2小时，并将噬菌体吸附在Hybond N膜(Amersham Pharmacia Biotech，San Francisco，California)上。将膜风干10分钟，再进行连续温育：0.5M NaOH加1.5M NaCl，500ml，5分钟；0.5Tris-Cl pH 8.0加1.5M NaCl，500ml，5分钟；及2×SSC，500ml，5分钟。干印记，80℃烤干(近15分钟)。将膜置于50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt’s溶液，0.2％ SDS，100-200μg/ml变性鲱鱼精子或小牛胸腺DNA中于45℃预杂交不到1小时(Maniatis，1990)。

然后于100℃变性标记的DNA片段5分钟，加入预杂交溶液中，于45℃杂交16小时。进行第一次筛选时，将噬菌体以500pfu/cm²的密度铺板而膜以强严谨条件洗涤。进行后续噬斑纯化时，将候选噬菌体以70pfu/cm²和2pfu/cm²的密度铺板而膜以中等严谨条件洗涤。经过三轮纯化后，经限制酶消化从阳性噬菌体DNA中取出插入物亚片段，亚克隆至pBluescript(Stratagene)中以便经限制酶消化及测序分析进行鉴定。重叠的两个质粒亚克隆pROM2(HindIII插入物)和pROM3(Xho-BamhI插入物)每个均包含ckx1基因的一部分。将这些重叠部分融合为质粒克隆pROM10。质粒pROM2，pROM3和pROM10均已存入保藏于美国典型培养物保藏中心，编号分别为ATCC第209573、209572和209571号。pROM2和pROM3中的克隆DNA序列提供了ckx1的基因组序列SEQ ID NO.2，由该序列包含编码上述胰酶消化片段的序列证实了这一点。

ckx1基因中内含子的位置及ckx1编码序列(SEQ ID NO.3)应用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)按以下操作进行验证。

授粉5天后(5DAP)收获种子的总RNA(2-4μg，经DNA酶I处理)，以包括内含子位点的寡核苷酸为引物引发RT-PCR。引物2031f(ckx1基因组序列第2031-2050位)和XBH1(ckx1基因组序列第2553-2570位的反向互补序列)覆盖了第一个内含子位点。引物3160f(ckx1基因组序列第3160-3179位)和3484r(ckx1基因组序列第3465-3484位的反向互补序列)覆盖了第二个内含子位点。于50℃逆转录50分钟，逆转录混合物为总体积20μl溶液中含有Superscript II(Gibco-BRL)200U，25mM Tris-Cl，pH 8.3，37.5mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.5mM四种dNTP，5mM二硫苏糖醇，RNAasin(Promega，Madison，Wisconsin)。以4-10％RT反应产物为模板、在含有1XPCR缓冲液(RocheDiagnostics，Basel，Switzerland)、1U Taq聚合酶、四种dNTP 200μM、及引物各0.5μM的溶液中进行PCR。反应条件为：于95℃初次变性4分钟，随后进行35个以下循环：95℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。最后在72℃延伸4分钟。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离。从凝胶中切出PCR产物并测序以确定剪切位点的连接。

用设计为跨越第一和第二个内含子位置的引物对玉米种子RNA(授粉5天后)进行RT-PCR，证实PCR产物的大小与成熟氧化酶mRNA中切出这些内含子一致。跨第一个内含子的引物在该内含子存在时应产生一段539bp的产物、该内含子被切出后应产生一段127bp的产物。同样，跨第二个内含子的引物在第二个内含子存在时应产生一段324bp的产物、该内含子被切出后应产生一段232bp的产物。如图2示，PCR产物分别为127bp和232bp，说明内含子都确实已经切出。片段的序列分析证实剪切已如预期一样发生。

ckx1蛋白和基因的性质经以下免疫学技术验证。

在山羊体内制备针对大肠杆菌内表达ckx1基因片段所生成肽的多克隆抗体。这样可在制备抗该基因产物的抗体时避免出现糖基化表面，并避免出现Burch等在制备抗天然ckx1抗体时遇到的问题。经硫酸钠沉淀法(Willams等，1967)部分纯化来自免疫和未免疫山羊的抗体。按厂家说明将这些纯化的抗体(2mg)偶联至pH 10的Aminolink Plus凝胶(1ml，Pierce)上，制备亲和柱。向每个柱加入0.2ml(27μg)刀豆蛋白A分级分离的玉米氧化酶制备物和0.8ml磷酸盐缓冲液(PBS)进行活性损耗试验。各柱加盖并于室温温育1小时。收集洗脱物，分析其细胞分裂素氧化酶活性。

针对ckx1的抗体可识别主要的玉米细胞分裂素氧化酶。包含固定化抗ckx1片段抗体的柱能够降低刀豆蛋白A分级分离的玉米提取物细胞分裂素氧化酶活性。作为对照的未免疫山羊抗体层析柱不能做到这点。实施例2：ckx1在巴斯德毕赤酵母中的表达

可用以下程序大量生产ckx1蛋白，以用于诸如实施例3的细胞分裂素分析等应用中，或应用于植物原料中。

ckx1在巴斯德毕赤酵母中的表达分四步：

第一步：除去ckx1中的内含子，

第二步：除去玉米启动子，并用无内含子的构建体构建适当的表达盒，

第三步：将最终构建体转化进毕赤酵母，及

第四步：在毕赤酵母中表达ckx1。

最右侧内含子的除去是通过重叠延伸法剪接(Horton等，1989)完成的，最左侧内含子的除去是通过连接适当限制性片段完成的。将所得无内含子的盒插入毕赤酵母表达载体pPICZ-A中，产生表达构建体pROM24(图9)。将此构建体导入必需的毕赤酵母宿主中并在有甲醇时进行培养以诱导ckx1表达。作为适当对照的毕赤酵母细胞系(只包含载体或包含表达人血清白蛋白的重组体)作平行培养。

在生长曲线的任何时间均未在含ckx1的毕赤酵母细胞裂解物或对照中发现细胞分裂素氧化酶活性。但携ckx1的毕赤酵母细胞系表达了高水平的细胞分裂素氧化酶活性，并将此酶分泌在培养基中。对照上清中未发现酶活性。这更证实ckx1确实编码细胞分裂素氧化酶。

第一步.除去内含子：为限制人为引发，用选择的ckx1限制性片段为模板，经重叠延伸法剪接除去第二个内含子(SEQ ID NO.2的第3219-3312位残基)。下表列出了所用引物和模板。

内含子	左侧引物	右侧引物	模板DNA
内含子	左侧引物	右侧引物	模板DNA	扩增#1	TGGGAATTCCATGGGGAGATGGTGACGTGCTC(SEQ.ID NO.11)	GCCGTCCCACATGGATTTGTTGAGGGGGTAGAC(SEQ.ID NO.12)	pROM2 Nco1/PinA1(700 bp)片段
扩增#2	CTCAACAAATCCATGTGGGACGACGGCATGTCGGCGG(SEQ.ID NO.13)	GCGGTCTAGATCTAACTAAAACATGCATGGGCTATCATC(SEQ.ID NO 14)	pROM2 390 bp PinA1+Vsp1	扩增#1	TGGGAATTCCATGGGGAGATGGTGACGTGCTC(SEQ.ID NO.11)	GCCGTCCCACATGGATTTGTTGAGGGGGTAGAC(SEQ.ID NO.12)	pROM2 Nco1/PinA1(700 bp)片段
扩增#2	CTCAACAAATCCATGTGGGACGACGGCATGTCGGCGG(SEQ.ID NO.13)	GCGGTCTAGATCTAACTAAAACATGCATGGGCTATCATC(SEQ.ID NO 14)	pROM2 390 bp PinA1+Vsp1	扩增#3	ATGGGAATTCCATGGGGAGATGGTGACGTGCTC(SEQ.ID NO.15)	GCGGTCTAGATCTAACTAAAACATGCATGGGCTATCATC(SEQ.ID NO.16)	扩增#1和#2的产物

反应#1和#2的PCR产物经凝胶纯化，用于最终PCR步骤中。对反应#3的终产物进行克隆和测序，并用一个PflM1/Xba1亚片段置换pROM7中带内含子的PflM1/Xba1亚片段。此构建体命名为pROM19。

然后从pROM19中除去第一个内含子(SEQ ID NO.2的第2113-2524位残基)，方法是用从寡核苷酸CCGGTTTTGGTACCGGT(SEQ ID NO.17)和CATGACCGGTACCAAAA(SEQ ID NO.18)构建的接头置换限制性位点PinA1和Nco1之间的DNA。该产物命名为pROM20。外源接头相关碱基经PinA1消化并重新连接而去除。此产物命名为pROM22(图8)，它包含三个融合的ckx1外显子及玉米ckx1启动子。第二步.毕赤酵母表达盒：用AatII对pROM22(图8)进行部分消化、用T4 DNA聚合酶填平粘端、用Bg1II重新消化便可除去玉米启动子。将外显子融合体(含ckx1并包括其假定信号肽)连接至pPICZ-A的Pml1/BsmB1限制位点(Easy-Select Pichia Expression Kit versionB，Invitrogen公司)。所得质粒命名为pROM24(图9)。第三步.如Invitrogen实验手册所述向毕赤酵母菌株X33转化：质粒pROM24(图9)(10μg)用Dra1消化，在2mm样品槽中以1.75KV电穿孔进入X33感受态细胞中(GenePulser，Bio-Rad Laboratories，Hercules，California)。在含100μg/ml zeocin的YPDS上经选择得到很多菌落。择其一(PPckx1)进行表达研究。第四步.氧化酶的表达：将转化体PPckx1接种于BMGY培养基(50ml)中培养过夜。沉淀细胞，重新悬浮于BMMY(含0.5％v/v甲醇)中，稀释至A₆₀₀＝1，于30℃猛烈振荡培养。另于接种后24、48、72小时加入甲醇使浓度维持0.5％v/v。收集样品分析细胞裂解物或培养物上清中细胞分裂素氧化酶活性。以毕赤酵母菌株X33(WT，无插入物)和GS115(分泌人血清白蛋白插入物)为对照。实施例3：重组细胞分裂素氧化酶在细胞分裂素快速分析法中的应用

将包含磷酸盐缓冲液(250mM，pH 7.0)、EDTA(2.5mM)和DCPIP(0.125mM)的缓冲液混合物100μl与过量的重组细胞分裂素氧化酶及各种浓度的玉米素溶液(150μl)混合以测量细胞分裂素。测量590nm处的光吸收值净变量。

图3示该分析法用于测定细胞分裂素玉米素时光吸收值的变化。此法能测量少至2nmol的玉米素，但此法相比于现有技术的主要优点是比较快速。分析可在不到5分钟内完成，大大快于放射免疫分析(MacDonald和Morris，1985)。而且，此法可通过将ckx1基因偶联至诸如ipt或tzs这样的细胞分裂素生产基因中而参与细胞分裂素生产系统，从而体外分析细胞分裂素的生产。实施例4：对烟草根部ckx1表达的不调节及组成型调节

下述方法可用于生产经修饰可在根部表达及组成型表达ckx1的烟草植物，该方法是对Draper等，1988所述的标准实验方法稍作修改。

烟草栽培品种Xanthi是标准的烟草品系。也用到无攻击能力的根癌土壤杆菌菌株如LBA4404等(Hoekema等，1985)。Murashige和Skoog盐、植物琼脂(phytagar)、蔗糖等为试剂或组织培养级别。

用ckx1编码序列(SEQ ID NO.3)分别构建三个不同构建体，以获得转化烟草中ckx1表达的三种模式。构建体是基于BIN19质粒初级载体(其包括土壤杆菌相容性复制起点和卡那霉素选择标记，Bevan等，1984)。制备以下构建体：

CaMV-ckx1-nos：pBI121(图5)中有带nos增强子的花椰菜花叶病毒启动子(美国专利第5,530,196)(由Clonetech，Palo Alto，California提供)。pBI121的β-葡糖醛酸酶基因经BamHI/EcoIcrI消化切出。ckx1编码序列(SEQ ID NO.3)得自BglII对pROM26(图10)(pROM24(图9)经定点诱变而包含另一个BglII和XhoI限制性位点)的消化。经BamHI消化改变的pBI121并连接至ckx1编码序列而产生诱导ckx1强组成型表达的最后构建体pROM30(图13。

CaMV-tet-ckx1-ocs：pROM26的ckx1编码区(图10)经BglII消化而分离，连接至pUCA7-TX的BamHI位点(Gatz等，1992)以形成pROM32(图14)。通过PvuII消化，从pUCA7-TX切出受四环素调节的操纵基因元件(美国专利第5,464,758号)，从pROM32(图14)切出插入的编码区。将片段连接于pJL7(图4)(一种BIN19型质粒)的SalI位点，得到最终构建体pROM29(图12)。将这一构建体导入已转化为可表达tet抑制蛋白的烟草中时，在加入四环素解除抑制之前没有ckx1活性的表达。这一构建体可能在因ckx1的强组成型表达而导致不正常生长的宿主生物体中具有特殊用途。

RB7-ckx1-nos：经以下方法获得烟草RB7根特异性启动子(美国专利第5,750,386号)。从烟草基因组DNA中用GACACCATTCCAAGCATACCCC(SEQ ID NO.19)和GTTCTCACTAGAAAAATGCCCC(SEQ ID NO.20)作引物，经PCR扩增得到含启动子的一个片段。将此1400bp产物连接于pCRII质粒(Invitrogen)中，以产生pROM8(图6)。然后将插入物中包含启动子的线虫特异性部分的HindIII-EcoRI区切出，连接于pBluescriptII KS+(Stratagene)的HindIII-EcoRI位点，产生pROM9(图7)。将pROM24(图9)中含ckx1编码序列的EcoRI-NdiI片段切出，连接于pROM9的EcoRI-PstI位点，产生pROM28(图11)。将pROM28中的HindIII-SacI片段连接至pBI121(图5)的HindIII-SacI位点，产生最终构建体pROM43(图15)，当转化植物的根受到线虫攻击时其可在根中诱导ckx1表达。培养基组成 MSS PC SI MSSKMS盐(g/l) 4.3 4.3 4.3 4.3蔗糖(g/l) 30.0 30.0 30.0 30.0Phytagar(g/l) 7.5 5.0 5.0 7.5NAA(mg/l) 0 1.0 1.0 0BAP(mg/l) 0 0.1 0.1 0Timetin(mg/l) 0 0 200 200卡那霉素(mg/l) 0 0 50.0 50.0pH 5.7 5.7 5.7 5.7

烟草在MSS上连续进行纯性茎尖培养，每隔4周传代。

将上述三个双元质粒构建体经电穿孔导入无攻击能力的根癌土壤杆菌宿主中，在适当选择下培养转化体(An等，1985)。取对数晚期培养物进行转化。

将幼龄纯性烟草叶(茎尖培养3至4周后)切成4-6段，除去最大的维管结构。将节段于PC上(远轴侧向上)培养48小时。然后将叶片于以水稀释(1∶1)的根癌土壤杆菌培养物中浸泡1小时。接着将叶片置于原来的PC培养基上培养48小时。叶片经水彻底清洗后置于SI培养基上，并每7-10天转移至新鲜的SI培养基上。尽管在烟草转化体中并未发现有不利于发育的影响，但培养某些宿主植物时必须应用非底物细胞分裂素如苄基氨基嘌呤、或四环素的抑制。当茎达到1cm长时将之移至MSSK培养基上。对茎尖培养连续进行2-3次转移，此后将转基因植物维持在MSS培养基上。

根据本发明上述详述和实施例，显然可以实现本发明的好几项目标。此处给出的解释和举例说明意在让本领域内的其他技术人员了解本发明、其原理、及其实践应用。本领域内的技术人员可以多种方式修改并应用本发明，这些方式可能是某些特殊用途所要求的最佳选择。相应地，在此所列本发明的特殊实施方案并不想穷尽或限制本发明。

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20 25 30Pro Trp Pro Ala Ser Leu Ala Ala Leu Ala Leu Asp Gly Lys Leu Arg

35 40 45Thr Asp Ser Asn Ala Thr Ala Ala Ala Ser Thr Asp Phe Gly Asn Ile

50 55 60Thr Ser Ala Leu Pro Ala Ala Val Leu Tyr Pro Ser Ser Thr Gly Asp65 70 75 80Leu Val Ala Leu Leu Ser Ala Ala Asn Ser Thr Pro Gly Trp Pro Tyr

85 90 95Thr Ile Ala Phe Arg Gly Arg Gly His Ser Leu Met Gly Gln Ala Phe

100 105 110Ala Pro Gly Gly Val Val Val Asn Met Ala Ser Leu Gly Asp Ala Ala

115 120 125Ala Pro Pro Gly Ile Asn Val Ser Ala Asp Gly Arg Tyr Val Asp Ala

130 135 140Gly Gly Glu Gln Val Trp Ile Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Ala Arg145 150 155 160Gly Val Ala Pro Arg Ser Trp Asn Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly

165 170 175Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe Arg His Gly

180 185 190Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr Gly His Gly

195 200 205Glu Met Val Thr Cys Ser Lys Gln Leu Asn Ala Asp Leu Phe Asp Ala

210 215 220Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile225 230 235 240Ala Val Glu Pro Ala Pro Ala Arg Ala Arg Trp Val Arg Phe Val Tyr

245 250 255Thr Asp Phe Ala Ala Phe Ser Ala Asp Gln Glu Arg Leu Thr Ala Pro

260 265 270Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ala Ser Phe Gly Pro Met Ser Tyr Val Glu

275 280 285Gly Ser Val Phe Val Asn Gln Ser Leu Ala Thr Asp Leu Ala Asn Thr

290 295 300Gly Phe Phe Thr Asp Ala Asp Val Ala Arg Ile Val Ala Leu Ala Gly305 310 315 320Glu Arg Asn Ala Thr Thr Val Tyr Ser Ile Glu Ala Thr Leu Asn Tyr

325 330 335Asp Asn Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Val Asp Gln Glu Leu Ala Ser

340 345 350Val Leu Gly Thr Leu Ser Tyr Val Glu Gly Phe Ala Phe Gln Arg Asp

355 360 365Val Ala Tyr Ala Ala Phe Leu Asp Arg Val His Gly Glu Glu Val Ala

370 375 380Leu Asn Lys Leu Gly Leu Trp Arg Val Pro His Pro Trp Leu Asn Met385 390 395 400Phe Val Pro Arg Ser Arg Ile Ala Asp Phe Asp Arg Gly Val Phe Lys

405 410 415Gly Ile Leu Gln Gly Thr Asp Ile Val Gly Pro Leu Ile Val Tyr Pro

420 425 430Leu Asn Lys Ser Met Trp Asp Asp Gly Met Ser Ala Ala Thr Pro Ser

435 440 445Glu Asp Val Phe Tyr Ala Val Ser Leu Leu Phe Ser Ser Val Ala Pro

450 455 460Asn Asp Leu Ala Arg Leu Gln Glu Gln Asn Arg Arg Ile Leu Arg Phe465 470 475 480Cys Asp Leu Ala Gly Ile Gln Tyr Lys Thr Tyr Leu Ala Arg His Thr

485 490 495Asp Arg Ser Asp Trp Val Arg His Phe Gly Ala Ala Lys Trp Asn Arg

500 505 510Phe Val Glu Met Lys Asn Lys Tyr Asp Pro Lys Arg Leu Leu Ser Pro

515 520 525Gly Gln Asp Ile Phe Asn

530<210>2<211>6733<212>DNA<213>玉米<220><221>基因<222>(1)..(6733)<223>玉米细胞分裂素氧化酶的基因组序列<220><221>CDS<222>(1497)..(2111)<220><221>CDS<222>(2524)..(3216)<220><221>CDS<222>(3311)..(3607)<220><221>不确定<222>(5697)<400>2ctcgagactc cgacgagagg aggctgcgca tgcttgagtc atatcttgga aaaaaaaact 60gtaacttaaa gtatgatcta tatatggatt atttggatgg gatgtcattt tcgtatcacc 120aaccaaaatt acagtttggt cgtgcgtaga aattctacct actagctgaa acaacggctg 180ctatgtataa ctactggtac tggaaagaat attagtcatt gactcaaaat tagaatgcat 240gtgtaagtca tgcgtgctaa tttgttctat cagcattcgg cgaattccga agtccgtacg 300tgttgttcgt ggaggagagg aaaacatcag aaatgacaaa actagacggt gtgtgcttct 360acactgaatt cctcaacatt tgttttactt ttactagaga atggcatcaa atggaaaacc 420gctggaaaaa aaacaacaaa acaattggac cccaaatatg tatacagacg ctagctatag 480ccagccacac tgaagttgac atgcggcagc tagctagcca ccttctctga aacactaaca 540tttgtacctt ggtcgtgtaa gtgtagtagt aacgtatgtt gacgcgactt accgaacaaa 600aatataattg tcccaatcaa gctagggacg attgtttgtt tccaaaatgt tgccatttgc 660ttaatcaatc ctatattaat tcatggctgt taaggtgaga taaagcgaca agaaatctat 720atatatgtat ataagatccc gaaggctagc gacatttttg atagcaaaat atgagaagtt 780tggcagattg ttctggtagc aaatcaaata atatggccag aataatcgtg gctagcttga 840ttaaaccttc atcagcttgg tgtattttgg aagtcgacca accagctggg ggtcgtcgta 900cgtagtacca aaattacagc ctgctttcct tcgtcctgta cgtaatgcag tacagctgtc 960tagtagagac cattttgagg aggcacacac acattaagtg ataacataaa agacggcctg 1020attttatttc ataaccaaac gatatggtca acacacacct atagctacca aatttgtaca 1080actatttagt gcgaaaacta tttcattctc aagaattgat cgcttatatt tattattaca 1140gctttttaaa tgtataaata cgctatattg catggcaaca gggggtaata attaggcagg 1200actatatata taatagtttt ttcttcttct gtaaattctt gggaggatgg taaagttggt 1260aactaggcac cttacttgcg cgcatatttt tctgtggtca aacagaataa aactagacgg 1320gatgcagaat atttttttcc ttggaaagca gctcatcttt gtgttcgagt aattgaagaa 1380gtatgtaatc gcactacacc tacacctata tatatacggg gtgcaatcac ctagttacca 1440aacactcaca cataacgtat agctctctct ctctcccgtg aacgacgacg tcgcta atg 1499

Met

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20 25 30tgg cca gcc tcc ctc gcc gcg ctg gcc ttg gac ggc aag ctc cgg acc 1643Trp Pro Ala Ser Leu Ala Ala Leu Ala Leu Asp Gly Lys Leu Arg Thr

35 40 45gac agc aac gcg acg gcg gcg gcc tcg acg gac ttc ggc aac atc acg 1691Asp Ser Asn Ala Thr Ala Ala Ala Ser Thr Asp Phe Gly Asn Ile Thr50 55 60 65tcg gcg ctc ccg gcg gcg gtc ctg tac ccg tcg tcc acg ggc gac ctg 1739Ser Ala Leu Pro Ala Ala Val Leu Tyr Pro Ser Ser Thr Gly Asp Leu

70 75 80gtg gcg ctg ctg agc gcg gcc aac tcc acc ccg ggg tgg ccc tac acc 1787Val Ala Leu Leu Ser Ala Ala Asn Ser Thr Pro Gly Trp Pro Tyr Thr

85 90 95atc gcg ttc cgc ggc cgc ggc cac tcc ctc atg ggc cag gcc ttc gcc 1835Ile Ala Phe Arg Gly Arg Gly His Ser Leu Met Gly Gln Ala Phe Ala

100 105 110ccc ggc ggc gtc gtc gtc aac atg gcg tcc ctg ggc gac gcc gcc gcg 1883Pro Gly Gly Val Val Val Asn Met Ala Ser Leu Gly Asp Ala Ala Ala

115 120 125ccg ccg cgc atc aac gtg tcc gcg gac ggc cgc tac gtg gac gcc ggc 1931Pro Pro Arg Ile Asn Val Ser Ala Asp Gly Arg Tyr Val Asp Ala Gly130 135 140 145ggc gag cag gtg tgg atc gac gtg ttg cgc gcg tcg ctg gcg cgc ggc 1979Gly Glu Gln Val Trp Ile Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Ala Arg Gly

150 155 160gtg gcg ccg cgc tcc tgg aac gac tac ctc tac ctc acc gtc ggc ggc 2027Val Ala Pro Arg Ser Trp Asn Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly

165 170 175acg ctg tcc aac gca ggc atc agc ggc cag gcg ttc cgc cac ggc cca 2075Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe Arg His Gly Pro

180 185 190cag ata tct aac gtg ctg gag atg gac gtt atc acc ggtacgtgtg 2121Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr

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Gly His Gly Gluatg gtg acg tgc tcc aag cag ctg aac gcg gac ctg ttc gac gcc gtc 2583Met Val Thr Cys Ser Lys Gln Leu Asn Ala Asp Leu Phe Asp Ala Val210 215 220 225ctg ggc ggg ctg ggg cag ttc gga gtg atc acc cgg gcc cgg atc gcg 2631Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ala

230 235 240gtg gag ccg gcg ccg gcg cgg gcg cgg tgg gtg cgg ttc gtg tac acc 2679Val Glu Pro Ala Pro Ala Arg Ala Arg Trp Val Arg Phe Val Tyr Thr

245 250 255gac ttc gcg gcg ttc agc gcc gac cag gag cgg ctg acc gcc ccg cgg 2727Asp Phe Ala Ala Phe Ser Ala Asp Gln Glu Arg Leu Thr Ala Pro Arg

260 265 270ccc ggc ggc ggc ggc gcg tcg ttc ggc ccg atg agc tac gtg gaa ggg 2775Pro Gly Gly Gly Gly Ala Ser Phe Gly Pro Met Ser Tyr Val Glu Gly

275 280 285tcg gtg ttc gtg aac cag agc ctg gcg acc gac ctg gcg aac acg ggg 2823Ser Val Phe Val Asn Gln Ser Leu Ala Thr Asp Leu Ala Asn Thr Gly290 295 300 305ttc ttc acc gac gcc gac gtc gcc cgg atc gtc gcg ctc gcc ggg gag 2871Phe Phe Thr Asp Ala Asp Val Ala Arg Ile Val Ala Leu Ala Gly Glu

310 315 320cgg aac gcc acc acc gtg tac agc atc gag gcc acg ctc aac tac gac 2919Arg Asn Ala Thr Thr Val Tyr Ser Ile Glu Ala Thr Leu Asn Tyr Asp

325 330 335aac gcc acg gcg gcg gcg gcg gcg gtg gac cag gag ctc gcg tcc gtg 2967Asn Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Val Asp Gln Glu Leu Ala Ser Val

340 345 350ctg ggc acg ctg agc tac gtg gag ggg ttc gcg ttc cag cgc gac gtg 3015Leu Gly Thr Leu Ser Tyr Val Glu Gly Phe Ala Phe Gln Arg Asp Val

355 360 365gcc tac gcg gcg ttc ctt gac cgg gtg cac ggc gag gag gtg gcg ctc 3063Ala Tyr Ala Ala Phe Leu Asp Arg Val His Gly Glu Glu Val Ala Leu370 375 380 385aac aag ctg ggg ctg tgg cgg gtg ccg cac ccg tgg ctc aac atg ttc 3111Asn Lys Leu Gly Leu Trp Arg Val Pro His Pro Trp Leu Asn Met Phe

390 395 400gtg ccg cgc tcg cgc atc gcc gac ttc gac cgc ggc gtg ttc aag ggc 3159Val Pro Arg Ser Arg Ile Ala Asp Phe Asp Arg Gly Val Phe Lys Gly

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50 55 60acg tcg gcg ctc ccg gcg gcg gtc ctg tac ccg tcg tcc acg ggc gac 240Thr Ser Ala Leu Pro Ala Ala Val Leu Tyr Pro Ser Ser Thr Gly Asp65 70 75 80ctg gtg gcg ctg ctg agc gcg gcc aac tcc acc ccg ggg tgg ccc tac 288Leu Val Ala Leu Leu Ser Ala Ala Asn Ser Thr Pro Gly Trp Pro Tyr

85 90 95acc atc gcg ttc cgc ggc cgc ggc cac tcc ctc atg ggc cag gcc ttc 336Thr Ile Ala Phe Arg Gly Arg Gly His Ser Leu Met Gly Gln Ala Phe

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210 215 220gtc ctg ggc ggg ctg ggg cag ttc gga gtg atc acc cgg gcc cgg atc 720Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile225 230 235 240gcg gtg gag ccg gcg ccg gcg cgg gcg cgg tgg gtg cgg ttc gtg tac 768Ala Val Glu Pro Ala Pro Ala Arg Ala Arg Trp Val Arg Phe Val Tyr

245 250 255acc gac ttc gcg gcg ttc agc gcc gac cag gag cgg ctg acc gcc ccg 816Thr Asp Phe Ala Ala Phe Ser Ala Asp Gln Glu Arg Leu Thr Ala Pro

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290 295 300ggg ttc ttc acc gac gcc gac gtc gcc cgg atc gtc gcg ctc gcc ggg 960Gly Phe Phe Thr Asp Ala Asp Val Ala Arg Ile Val Ala Leu Ala Gly305 310 315 320gag cgg aac gcc acc acc gtg tac agc atc gag gcc acg ctc aac tac 1008Glu Arg Asn Ala Thr Thr Val Tyr Ser Ile Glu Ala Thr Leu Asn Tyr

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340 345 350gtg ctg ggc acg ctg agc tac gtg gag ggg ttc gcg ttc cag cgc gac 1104Val Leu Gly Thr Leu Ser Tyr Val Glu Gly Phe Ala Phe Gln Arg Asp

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370 375 380ctc aac aag ctg ggg ctg tgg cgg gtg ccg cac ccg tgg ctc aac atg 1200Leu Asn Lys Leu Gly Leu Trp Arg Val Pro His Pro Trp Leu Asn Met385 390 395 400ttc gtg ccg cgc tcg cgc atc gcc gac ttc gac cgc ggc gtg ttc aag 1248Phe Val Pro Arg Ser Arg Ile Ala Asp Phe Asp Arg Gly Val Phe Lys

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485 490 495gac cgc agt gac tgg gtc cgc cac ttc ggc gcc gcc aag tgg aat cgc 1536Asp Arg Set Asp Trp Val Arg His Phe Gly Ala Ala Lys Trp Asn Arg

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530<210>4<211>21<212>PRT<213>玉米<220><221>变异体<222>(9)<400>4Tyr Val Glu Gly Ser Val Phe Val Xaa Gln Ser Leu Ala Thr Asp Leu1 5 10 15Ala Asn Thr Gly Phe

20<210>5<211>15<212>PRT<213>玉米<400>5Gly Ile Leu Gln Gly Thr Asp Ile Val Gly Pro Leu Ile Val Tyr1 5 10 15<210>6<211>23<212>DNA<213>玉米<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(12)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(15)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(18)<223>i<400>6tacgtngayg gnwsngtntt cgt 23<210>7<211>23<212>DNA<213>玉米<220><221>修饰的碱基<222>(3)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(9)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(12)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(18)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(21)<223>i<400>7acngayctng cnaacacngg ntt 23<210>8<211>23<212>DNA<213>玉米<220><221>修饰的碱基<222>(3)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(9)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(15)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(18)<223>i<400>8ccntargang tcccntgnct rta 23<210>9<211>23<212>DNA<213>玉米<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(9)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(12)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(15)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(21)<223>i<400>9tarcanccng gngantarca nat 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Claims

1.一种基本纯化的有细胞分裂素氧化活性的蛋白质，其选自下组：

(a)SEQ ID NO.1，

(b)所具氨基酸序列包含SEQ ID NO.1氨基酸序列的一种蛋白质，

(c)所具氨基酸序列包含SEQ ID NO.1氨基酸序列一部分的一种蛋白质，所包括部分至少约20个氨基酸残基长并赋予该蛋白质有细胞分裂素氧化活性，和

(d)所含的一段氨基酸序列与SEQ ID NO.1有至少约65％序列相同、其余的氨基酸残基被保守置换的一种蛋白质。

2.权利要求1的蛋白质，其中该蛋白质已纯化。

3.权利要求1的蛋白质，它是SEQ ID NO.1。

4.权利要求1的蛋白质，它是用包含编码权利要求1蛋白质之核酸聚合物的载体转化了的宿主细胞产生的。

5.编码权利要求1之蛋白质的基本分离的核酸聚合物。

6.权利要求5的基本分离的核酸聚合物，它编码SEQ ID NO.1。

7.编码有细胞分裂素氧化活性之蛋白质的基本分离的核酸聚合物，其中该核酸聚合物选自下组：

(a)SEQ ID NO.2，

(b)SEQ ID NO.3，

(c)具有SEQ ID NO.10所述序列的一段核酸聚合物，

(d)其序列包含选自下组的一段序列的核酸聚合物，所述组由SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或具有SEQ ID NO.10所述序列之核酸聚合物组成，

(e)包含选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或具有SEQ ID NO.10所述序列之核酸聚合物的核苷酸序列中至少一个60个碱基对部分的核酸聚合物，该部分编码的氨基酸序列赋予所编码蛋白质以细胞分裂素氧化活性，

(f)编码所含的一段氨基酸序列与SEQ ID NO.1有至少约65％序列相同、其余氨基酸残基被保守置换的蛋白质的核酸聚合物，

(g)可与选自下组的核苷酸序列在相当于0.5X-2X SSC缓冲液，0.1％ SDS，55-65℃的严谨洗涤条件下杂交的核酸聚合物，该组由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和具有SEQ ID NO.10所述序列之核酸聚合物组成，和

(h)具有互补于(a)-(g)中任一项之核酸序列的核苷酸序列的核酸聚合物。

8.权利要求7的基本分离的核酸聚合物，其中所述聚合物包含SEQID NO.10所述序列或互补于SEQ ID NO.10所述序列的序列。

9.权利要求7的基本分离的核酸聚合物，其中所述聚合物是SEQ IDNO.2或其互补序列。

10.权利要求7的基本分离的核酸聚合物，其中所述聚合物是SEQ IDNO.3或其互补序列。

11.被含编码权利要求1之蛋白质的脱氧核糖核酸聚合物的载体转化了的宿主细胞。

12.权利要求11的宿主细胞，其中该宿主细胞为植物细胞。

13.权利要求12的宿主细胞，其中该宿主植物细胞选自下组：

(a)烟草，

(b)拟南芥，

(c)玉米，

(d)芸苔属植物，

(e)稻。

14.权利要求11的宿主细胞，其中该宿主细胞选自下组：

(a)巴斯德毕赤酵母，

(b)大肠杆菌。

15.由权利要求12的宿主植物细胞再生的植物。

16.权利要求15的再生植物的植物产物。

17.权利要求16的植物产物，其中该植物产物选自下组：种子、叶、茎培养物、根茎和鳞茎。

18.在宿主细胞中产生权利要求1之蛋白质的方法，其基本包括：

(a)构建含有编码权利要求1之蛋白质的DNA及可在宿主细胞中操作的表达调节序列的载体。

(b)用该载体转染适于蛋白质生产的宿主细胞；和

(c)在该宿主细胞中表达该蛋白质。

19.权利要求18的方法，其中该载体选自下组：

(a)含DNA的质粒，

(b)根癌土壤杆菌。

20.权利要求18的方法，其中该宿主细胞选自下组：

(a)巴斯德毕赤酵母，

(b)大肠杆菌。

21.权利要求18的方法，其中该宿主细胞将该蛋白质分泌在培养基中，该方法进一步包括自培养基中纯化该蛋白质。

22.权利要求18的方法，其进一步包括将该宿主细胞重建成生物体的步骤。

23.权利要求18的方法，其中该宿主细胞为植物细胞。

24.权利要求23的方法，其中该宿主植物细胞选自下组：

(a)烟草，

(b)拟南芥，

(c)玉米，

(d)芸苔属植物，

(e)稻。

25.缓和植物中与细胞分裂素有关的发病机制的方法，包括用包含下列成分的核酸聚合物构建体转化植物细胞：

(a)编码权利要求1之蛋白质的核酸聚合物，和

(b)可在宿主植物中操作的表达调节序列；以及由转化的植物细胞再生植物。

26.权利要求25的方法，其中表达调节序列选自下组：组成型启动子、诱导型启动子、阻遏蛋白和增强子。

27.检测样品中细胞分裂素浓度的方法，其主要包括：

(a)向缓冲的样品中加入已知量的二氯靛酚和过量IU活性产生量的权利要求1之蛋白质；

(b)测量590nm处光吸收值的净变值；和

(c)将此净吸收值与由细胞分裂素已知浓度所得的标准曲线进行比较。