CN1434866A - 来自稻赤霉素3β－羟化酶的基因及其用途 - Google Patents

Abstract

从稻中分离编码GA 3β－羟化酶的基因组DNA和cDNA。当这些基因在稻植株中的表达受到抑制时，该植株与野生型植株相比矮化。

Description

来自稻赤霉素3β-羟化酶的基因及其用途

技术领域

本发明涉及关于赤霉素生物合成的来自于稻的基因以及该基因的用途。

发明背景

多细胞有机体由众多特化的组织和器官所构成，这些特化的组织和器官组装形成一个功能单元。有机体各部分的协作通过一类被称为激素的化学信使实现。植物激素是天然产生的物质，极小的量就可以有效发挥作用，刺激或抑制生长，或调节发育。现今，以下的植物生长物质通常被看作植物激素：生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、油菜素内酯和乙烯。

动物中，激素通常在特殊的腺体合成，通过血流在有机体内分布。因此，它们到达靶点和可以反应的应答组织。在那里，它们引发特异性的调节过程。现在这些最初在动物中产生的经典的激素概念被使用到高等植物中。许多情况下，植物激素在特定的靶组织中是活动的，该靶组织通常与产生激素的组织不同。然而，在多细胞植物的组织中也可发现所有的植物激素。这表明，植物激素的合成部位和作用部位间并无绝对的区别。如果需要，它们也可以作用于产生其自身的相同细胞(组织)。因此，理解植物激素合成的控制对于确定合成和作用之间的关系非常重要。

赤霉素(GA)由日本植物病理学家在20世纪20年代发现，最初认为是植物毒素。病原真菌Gibberella fujikuroi感染禾本科植物，并分泌一种引起病理性的纵向生长(Bakanae“恶苗病”)的化合物。1935到1938年间，这种活性物质被分离并纯化结晶。被称为“赤霉素”。后来的研究表明高等植物也合成赤霉素，并在生长调节和分化过程中非常重要。

至1992年被鉴定的约80种赤霉素的基本结构是内-赤霉素烷(ent-gibberellan)的四环结构(图1a)。赤霉素包含双萜碳酸，主要由甲羟戊酸通过·牛儿基·牛儿基焦磷酸环化产生的(图1b)。多数赤霉素对于促进植物发育是没有活性的。许多植物中，作为植物生长调节剂的生物活性赤霉素是GA₁和GA₄。它们可以控制许多发育过程，包括种子发芽，茎伸长，开花以及果实发育。因此，可通过改变GA的生物合成获得各种生产中有用的改良植物。

GA作为环境刺激介体的角色早已确立。物理因素，如光照和温度，通过改变GA代谢途径中的特定步骤可以改变其流量来修饰GA代谢。例如，光的性质(红光或红外线)和光强(高或低)可以影响GA的生物合成。在莴苣种子和豇豆上胚轴中，GA₂₀的3β-羟基化作用因远红外处理而增强(Toyumasu等，1992，Plant Cell Physiol.33，695-701)。此外，豌豆幼苗在低光照下生长(40μmol/m²s)，GA₂₀的含量增加到高光强下生长植物的7倍(386μmol/m²s)，而生长在黑暗中的植物，GA₂₀的含量与高光强下生长的植物相比较低(Gawronska等，(1995)Plant Cell Physiol.36，1361-1367)。

尽管许多人企图表明GA代谢有光敏色素介导的或光强介导的生长率的改变，支持的证据仍很少。GA生物合成的分子生物学的快速发展，将最终导致对于这些调节过程机理的理解。

尽管对此的大量努力，对于具有生物活性的赤霉素合成部位以及其在特定细胞和组织中的作用模式仍未得到阐明。基于给植物添加¹⁴C标记的赤霉素的实验，认为它们以一种非极性的方式在整个植物体转移。最近，矮化和野生型豌豆植物的嫁接实验显示，GA₁，一种具有生物活性的赤霉素，与其前体GA₂₀不同，在植物中不转移(Proebsting等，(1992)Plant Physiol.100，1354-1360；Reid等，(1983)J.Exp.Bot.34，349-364)。对矮化豌豆植物的GC-MS量化分析以及生物学分析显示，赤霉素主要存在于活性生长以及延伸的组织，如芽顶体，幼叶及花中(Jones & Phillips，(1966)Plant Physiol.41，1381-1386；Potts等，(1982)Physiol.Plant，55，323-328；Kobayashi等，(1988)Agric.Biol.Chem.52，1189-1194)。然而，由于多数赤霉素以很小的量存在，而且多数是不具有生物活性的，各赤霉素在特定组织中的特定量难以确定。因此需要一种新的方法以阐明具有生物活性的赤霉素的合成部位。

由于分子生物学和遗传工程的发展，目前从多种植物种属中克隆出了编码赤霉素生物合成酶的基因。对于这些激素的研究表明GA应答性矮化突变体缺乏相应的GA生物合成酶(图1b)。其表达模式表明该途径在发育中是受到严格调控的。这些基因中，来自拟南介的GA1编码在GA生物合成早期活性的酶—焦磷酸合成酶(CPS)，在快速生长的组织中高量表达，如苗端，根尖和花中(Silverstone等，(1997)Plant J.12，9-19)。GAC-20氧化酶，催化GA生物合成途径的最后一步，并包含一个小的基因家族，在拟南介、豌豆和蚕豆的茎干和发育中的种子中特异地表达，而这些时期GA对于发育是必须的。GA₃处理可对其产生负调节作用(Phillips等，(1995)Plant Physiol.108，1049-1057；Garcia-Martinez等，(1997)Plant Mol.Biol.33，1073-1084)。

这些观察使本发明的发明人设想GA在各种器官中的活性可能依赖于存在的内源GA量，而内源GA量反过来又依赖GA生物合成酶表达的调节，而非生物活性GA对于GA作用位点的转移。然而，由于生物活性赤霉素由3β-羟化酶催化的3β-羟化作用产生，CPS或GAC-20氧化酶表达的分析不能对生物活性GA的合成位点以及生物活性赤霉素量的调节提供直接的证据。

如上所述，3β-羟化酶在生物活性赤霉素合成的最后一步分别催化GA₂₀和GA₉转变为GA₁和GA₄(图1b)。对于3β-羟化酶的酶学机理并未完全阐明。然而，2-酮戊二酸结合区域对其活性是必要的，表明GA3β-羟化酶具有2-酮戊二酸依赖的双加氧酶的典型特征。某些GA3β-羟化酶可能具有多种功能；来自南瓜胚乳的该酶可催化2β和3β的羟化(Lange等，(1997)Plant Cell，9，1459-1467)。玉米矮化的1，3β-羟化酶也被认为是多功能的，其在玉米GA生物合成途径中催化三个羟化步骤(Spray等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93，10515-10518)。但对于这些GA3β-羟化酶的性质仍不完全清楚。

发明内容

本发明提供来自水稻的新的GA3β-羟化酶基因，以及这些基因的用途，特别是所述基因用于生产改变了株型的植物。

本发明的发明人首先基于双子叶植物GA3β-羟化酶的保守区设计简并引物，以稻基因组DNA作为模板进行PCR，从稻中分离GA3β-羟化酶基因。接着，用以上获得的编码GA的基因组DNA片段作为探针，本发明的发明人筛选了稻基因组文库，获得几个克隆。根据这些克隆的限制性酶切图将其分成两个组，各组的一个克隆被完整测序。结果，本发明的发明人发现这两个克隆都编码一种稻GA3β-羟化酶。

接着，为了获得基于各克隆核苷酸序列的cDNA片段，本发明的发明人用从稻幼苗(稻苗端)或蓓蕾中分离的总RNA进行RT-PCR，获得编码GA3β-羟化酶的全长DNA克隆(分别指定为“Os3β-1”和“Os3β-2”)。此外，基于以上获得的基因组DNA序列设计引物，本发明的发明人用从稻幼苗(稻苗端)或蓓蕾中分离的总RNA做模板，进行RT-PCR，成功地获得了编码完整稻GA3β-羟化酶的cDNA克隆。

由于稻d18被认为是GA应答性的矮化品种，本发明的发明人检测了此法分离的稻GA3β-羟化酶克隆是否相应于D18基因。对RFLP(限制性片段扩增长度多态性)分析和d18等位基因核苷酸序列的直接分析证明，两个分离的稻基因中，Os3β-2基因是引起d18突变的基因。此外，Os3β-1基因和Os3β-2基因表达的植物部分的差异表明，Os3β-1蛋白和Os3β-2蛋白参与生物活性GA的不同的生物合成途径。

此外，本发明的发明人通过用该基因的反义DNA抑制Os3β-2在稻植株中表达，成功地获得了与野生型植株相比矮化的稻植株。

如上所述，本发明的发明人成功地从稻中分离了一种新的GA3β-羟化酶基因，并发现可通过抑制该基因的表达获得比野生型植物矮化的植物。

更详细的，本发明将提供：

(1)一种DNA，该DNA编码有赤霉素3β-羟化酶活性的蛋白，并从下面(a)-(c)中任选：

(a)一种DNA，该DNA编码由SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(b)一种DNA，其包含SEQ ID NO：3或4所示核苷酸序列的编码区；和

(c)一种DNA，该DNA编码由SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列中的一个或更多个氨基酸残基被取代，缺失，添加，和/或插入的氨基酸序列形成的蛋白；

(2)一种编码反义RNA的DNA，该反义RNA与(1)中DNA或其转录产物互补；

(3)一种编码RNA的DNA，该RNA具有核酶活性，可特定剪切(1)中DNA的转录产物；

(4)一种编码RNA的DNA，该RNA通过共抑制，抑制内源的(1)中DNA在植物细胞中的表达；

(5)一种载体，其含有(1)到(4)中任何一种DNA；

(6)一种转化植物细胞，其含有(1)到(4)中所述任何一种的可表达的DNA；

(7)一种转基因植物体，其含有(6)中转化的植物细胞；

(8)一种(7)中所述转基因植物体的繁殖材料；

(9)一种编码(1)中所述DNA的蛋白；

(10)一种产生(9)中所述蛋白的方法，其中所述方法包括培养含有(1)中所述DNA的可表达的转化细胞，从所述细胞或其培养上清中获得表达的蛋白；

(11)一种改变植物生长的方法，其特征在于，控制(1)中所述DNA在植物中的表达水平；以及

(12)一种改变株型的方法，其特征在于，控制(1)中所述DNA在植物细胞中的表达水平。

本发明提供从稻植物中分离的新的GA3β-羟化酶，以及编码该酶的DNA。稻的GA3β-羟化酶基因的cDNA的核苷酸序列，Os3β-1和Os3β-2，由本发明的发明人分离，并包括在本发明的DNA中，其序列分别显示于SEQ ID NO：3和4，基因组DNA的核苷酸序列分别显示在SEQ ID NO：5和6。此外，Os3β-1蛋白和Os3β-2蛋白的氨基酸序列分别列表示在SEQ ID NO：1和2。

与先前将3β-羟化酶分类为2-酮戊二酸依赖的双加氧酶(2-ODD)一致，稻中的“Os3β-1”和“Os3β-2”蛋白都含有植物2-ODD特有的所有结构域(Prescott，A.G(1993)J.Exp.Bot.44，849-861；de Carolis &Luca(1994)Phytochemistry 36，1093-1107)。在所有发表过的序列中，这些克隆的编码区都和GA3β-羟化酶有最高的同源性。特别地，这些区域非常保守(Os3β-1中从240到247，302到307，Os3β-2中从222到229，285到290)，并可能是铁以及辅因子2-酮戊二酸的结合位点。这些蛋白也含有GA所独有的(Os3β-1中从144到150，Os3β-2中从127到133)保守基元(Met-Trp-X-Glu-Gly-X-Thr)。与双子叶植物GA3β-羟化酶以及其他双加氧酶的序列对比暗示，本发明的发明人分离的两个cDNA克隆都编码稻GA3β-羟化酶。

Os3β-2的基因谱和基因组Southern分析表明，Os3β-2相应于D18基因稻d18突变体是GA应答性的矮化品种，包括丰雪-矮化，秋晴-矮化，小丈-玉锦和矮稻-C(图2)。目前已识别了许多矮化等位基因。认为Os3β-2蛋白通过生物活性GA的合成，也参与植物的节间生长。

对于内源GA在不同生长时期、不同器官表达水平的分析显示，13-羟化赤霉素(GA₁₉，GA₂₀，GA₁)在营养性器官中占主导地位，而非13-羟化赤霉素(GA₂₄，GA₉，GA₄)尤其在繁殖性生长器官中累积，特别在花药中。这表明生物活性GA的生物合成途径是器官特异性的(Kurogouchi，S.等(1979)Planta 146，185-191；Kobayashi，M.等(1984)Agric.Biol.Chem.48，2725-2729；Kobayashi，M.等(1988)Agric.Biol.Chem.52，1189-1194)。Os3β-2(D18)和Os3β-1的表达方式符合这一推测。事实上，Os3β-2mRNA大量存在于茎干、幼叶及花序分生组织中，而Os3β-1mRNA特定地存在花中。这些一致性表明Os3β-2和Os3β-1的产物分别具有对GA₂₀和GA₉的底物特异性。

Os3β-2和Os3β-1的表达也与生物活性GA在稻中的分布一致。育种和量化分析表明，GA₁在赤霉素生物合成最活跃的幼叶组织中含量高(Choi，Y-H.等(1995)Plant Cell Physiol.36(6)，997-1001)，Os3β-2在幼叶中也有最高量的表达。有趣地是，Os3β-2在苗端的表达与稻其他器官相比处于中等水平，然而GA生物合成的许多基因，如拟南介的GA1和烟草的Nty基因，在分裂旺盛不断延伸的组织中(如苗端和根)是高量表达的(Silverstone等(1997)Plant J.12，9-19)。这种不一致性暗示，器官合成GA的活性可能在单子叶和双子叶植物中有差异。另一方面，内源GA₄在花期的花药中含量极高(Kobayashi，M.等(1988)Agric.Biol.Chem.52，1189-1194；Kobayashi，M.等(1990)Plant Cell Physiol.31(2)，289-293)。这一事实与Os3β-1的花特异性表达一致。这种一致性表明GA₄是通过Os3β-1蛋白的活化在花药中合成。因此，Os3β-2和Os3β-1蛋白可能参与生物活性GA的不同生物合成途径。

事实上，Os3β-1蛋白以GA₉为底物催化产生GA₄(3β-羟化)，GA₇(2，3-不饱和和3β-羟化)和GA₃₄(2β-羟化)(图9)，以GA₂₀为底物也得到了同样的结果。此外，以GA₅和GA₄₄为底物，该蛋白分别相应地产生3β羟化的赤霉素GA₃和GA₈₈。进一步的，Os3β-2蛋白分别以GA₅，GA₉，GA₂₀，GA₄₄为底物，催化产生3β-羟化赤霉素(GA₃，GA₄，GA₁，GA₃₈)。(图10)(实施例5)。

几个报道提及，生物活性GA不仅对于茎干的延长是必须的，对于植物的多种其他生长过程也是必须的。例如，对于花器官，有报道说，拟南介GA缺陷型gal-3表现雄性不育表型(Koornneef，M.& Van der Veen，J.H.(1980)Theor.Appl.Genet.58，257-263)，在番茄突变体，stamenless-2和gib-1导致花药生长在早期终止，不形成可育花粉粒(Sawhney(1974)J.Exp.Bot.25，1004-1009；Jacobsen & Olszewski(1996)Proc.Natl.Sci.U.S.A.93，9292-9296)。

由于本发明的蛋白被认为参与生物活性GA的生物合成，它们可被用于生产生物活性GA。此外，如上所述，植物的生长可以通过调节这些蛋白在植物中的表达而改变。例如，可以获得与野生型不同的植株型。

本发明的蛋白可通过本领域技术人员根据公知方法，利用基因重组技术以重组蛋白形式表达，也可表达为天然蛋白。重组蛋白的制备，如下所述，可通过将编码本发明蛋白的DNA(如SEQ ID NO：3和4)插入适当的表达载体，并从转化该载体的细胞中纯化该蛋白。天然蛋白的获得，例如，可用该制备的重组蛋白或其部分的肽免疫动物，将制备的抗体与亲和层析柱结合，将表达本发明蛋白的烟草和稻组织提取物过柱，纯化结合到柱上的蛋白。

本发明蛋白包括部分氨基酸被改变了的野生型蛋白(SEQ ID NO：1和2)，但其仍然保留野生型蛋白的功能。制备这种突变蛋白的方法是本领域技术人员所熟知的，包括定点突变(Kramer，W.& Fritz，H-J.Oligonucleotide-directed Construction of mutagenesis via gapped duplexDNA.Methods in Enzymology，154：350-367，1987)。氨基酸突变也可能天然产生。因此，本发明蛋白包括保留有天然型蛋白GA3β-羟化酶活性的蛋白，以及天然型蛋白的氨基酸序列经一个或多个氨基酸残基的替代、缺失、添加和/或插入所产生的蛋白。只要该突变蛋白仍保留GA3β-羟化酶活性，则对于该蛋白中氨基酸突变的位点和数量并无特别的限制。通常可被突变的氨基酸数量不超过50个氨基酸残基，优选不超过30个，更优选不超过10个，最优选不超过3个氨基酸残基。

此处，“GA3β-羟化酶活性”是指当GA₂₀或GA₉作为底物，铁离子和2-酮戊二酸作为辅因子时，合成反应产物GA₁或GA₄的活性。该活性可被检测，例如下法。通常，获得的cDNA插入表达载体，在大肠杆菌中作为融合蛋白过量表达。利用获得的细胞提取物(作为酶溶液)，反应在存在辅因子铁离子和2-酮戊二酸的条件下，以GA₂₀或G₉作为反应底物，在体外进行，最终得到的反应产物(GA₁或G₄)通过GC-MS证实。

本发明的发明人分离了编码以上蛋白的cDNA和基因组cDNA。因此，编码本发明蛋白的DNA包括cDNA和基因组cDNA，只要其编码这些蛋白。编码Os3β-2和Os3β-1蛋白的DNA如果是cDNA，这些DNA可通过RT-PCR制备，使用基于SEQ ID NO：3和4中确定的核苷酸序列信息设计的引物，以及从幼苗(稻苗端)或花的蓓蕾中分离的总RNA做模板。此外，基因组DNA可用根据SEQ ID NO：5和6中确定的核苷酸序列信息设计的引物，以及以稻基因组DNA为模板进行PCR获得。

编码本发明蛋白的DNA可用于，例如，生产重组蛋白。重组蛋白的产生可用以下方法。首先，利用包含限制性酶切位点的引物进行RT-PCR合成全长cDNA，亚克隆到表达载体pMAL-c2(NEB)的多克隆位点。通过标准方法将该构建体转化大肠杆菌Escherichia coli菌株BL21细胞(蛋白酶缺陷型)。使用获得的转化体诱导蛋白合成。E.coli在含有0.2％葡萄糖的2xYT培养基中，37℃震荡培养。OD₆₀₀达到0.6左右时，加入IGTP至终浓度为1mM，进一步在18℃继续培养24小时。酶溶液的抽提依照以下方法。培养完成后，收集细胞并在悬浮缓冲液(包含10％甘油，2mM DTT，1mg/ml溶菌酶的50mM Tris-Hcl(pH8.0)中裂解。细胞悬液在4℃放置30分钟，接着放置在-80℃直到完全冷冻。冷冻的细胞悬液融化后，超声波处理，最大强度处理两次，间隔5分钟，处理时间为30秒(Heat Systems-Ultrasonics，Inc.，Model W-225R)。将处理后的悬液离心(15000rpm，4℃20分钟)，该悬液被用做粗提的酶溶液。

进一步的，制备纯化蛋白，在E.coli中(或类似系统中)表达带有组氨酸标记，麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S转移酶(GST)的本发明蛋白，然后分别通过镍柱，淀粉酶柱或GST-谷胱甘肽柱。接着，纯化后，上述标记可用限制性的蛋白酶切除，如凝血酶和Xa因子。

如上所述，本发明的发明人所分离的基因被认为通过生物活性GA的表达参与植物的生长。因此，植物的生长可能通过调节这些基因的表达进行控制。由于Os3β-2特别被认为参与植物的节间生长，该基因可能被用于控制植物的高度。植物高度的控制有多种的工业用途。

例如，抑制本发明基因在植物中的表达从而控制植物高度，可以抗倒伏，因而增加果实重量。此外，植物的矮化使每棵植株更密集，因此单位面积上可种植的植株数量得以增加。这种密集种植对于特别是如稻，小麦，玉米等农作物的产量是非常重要的。另外，编码本发明蛋白的DNA可考虑如何应用于矮生花卉，矮生果树等。通过抑制Os3β-1基因在花中的表达可诱导产生雄性不育性状。

另一方面，通过本发明基因在植物中增强的表达，使植物更高，从而增加植物整体的产量也是可能的。这对于饲料作物的整体产量非常有用。

本发明中，有多种本领域技术人员所熟知的方法可用来抑制本发明基因的表达，控制植物的生长。此处，“基因表达的抑制”包括转录的抑制，蛋白翻译的抑制，不仅包括完全的抑制，还包括表达的降低。

植物中特定内源基因的表达可利用反义技术，用常规方法抑制。Ecker等利用瞬时的基因表达，最先表明在植物中通过电穿孔引入反义RNA的效果(Ecker，J.R.& Davis，R.W.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，5372)。之后，报道表明烟草和矮牵牛中靶基因的表达因反义RNA的引入而显著降低(van der Krol，A.R.等，(1988)Nature 333，866)。反义技术现在已确立为一种抑制植物中靶基因表达的方式。

多种因素可抑制反义核酸对靶基因表达的抑制。包括三链形成抑制转录的起始；在RNA聚合酶形成局部开环结构的位点形成杂交，抑制转录；合成的RNA与之形成杂交抑制转录；内含子和外显子连接位点形成杂交抑制剪切；在剪切体形成的位点有杂交形成，抑制剪切；与mRNA杂交抑制mRNA从细胞核到细胞质的转运；在加帽位点或多聚A尾的位点形成杂交抑制剪切；翻译起始因子的结合位点形成杂交抑制翻译的起始；启始密码子附近的核糖体结合位点形成杂交抑制翻译；mRNA的翻译区和多核糖体结合位点处形成杂交抑制肽链的延伸；核酸和蛋白相互作用位点形成杂交抑制基因的表达。这些因素通过抑制转录、剪切、或翻译，抑制靶基因的表达(Hirashima & Inoue，“Shin Seikagaku JikkenKoza(New Biochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan (NucleicAcids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication and Expression ofGenes)，”Nihon Seikagakukai Hen(The Japanese Biochemical Society Ed.)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。

本发明中使用的反义序列可通过上述任何方法抑制靶基因的表达，如果反义序列设计为与基因mRNA5’末端不翻译区互补，则其可有效地抑制该基因的翻译。此外，也可能使用与编码区或3’末端不翻译区互补的反义序列。因此，本发明中使用的反义序列包括含有与该基因翻译区和不翻译区互补的反义序列的DNA。反义DNA连接于适当启动子的下游，优选含有转录终止信号的序列连接在3’端。这样制备的DNA可通过已知方法转染需要的植物。反义DNA的序列优选是与转化植物的内源基因(或同源基因)或内源基因的部分互补的序列，但只要其能有效抑制该基因的表达，并不需要完全与之互补。转录的RNA优选的与靶基因的转录产物互补性不少于90％，更优选地不少于95％，为了有效抑制靶基因的表达，反义DNA至少应为15个核苷酸或更长，优选100个核苷酸或更长，更优选500个核苷酸或更长。使用的反义DNA通常小于5kb，优选地短于2.5kb。

也可使用编码核酶的DNA抑制内源基因的表达。核酶被定义为具有催化活性的RNA分子。目前已知多种核酶，其各有不同的催化活性。对作为RNA剪切酶的核酶的研究使能够设计位点特异性剪切RNA的核酶。第一组内含子类型或RNA酶P中所含M1 RNA的核酶由400或更多个核苷酸组成，其他属于榔头状和发夹型核酶的活性结构域约为40个核苷酸(Koizumi，Makoto & Ohtsuka，Eiko(1990)TranpakushitsuKakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)35，2191)。

榔头状核酶的自我剪切结构域剪切C15的3’末端序列G13U14C15。在第9位点U14和A之间形成的核苷酸对被认为对核酶的活性重要。此外，结果表明当15位点处的核苷酸是A或U而非C时，也发生剪切(Koizumi，M.等(1988).FEBS Lett.228，225)。如果核酶的底物结合位点设计为与靶点附近的RNA序列互补，则可获得一种类似限制性酶的RNA剪切核酶，其识别靶RNA内的UC，UU，或UA序列(Koizumi，M.等(1988).FEBS Lett.239，285；Koizumi，Makoto & Ohtsuka，Eiko(1990)Tranpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)35，2191；Koizumi，M.等(1989)Nucleic Acid Res.17，7059)。例如，在Nty基因，本发明的发明人分离的Os3β-1基因或Os3β-2基因(SEQ ID NO：3或4)的编码区有多个位点可用做核酶的靶点。

发夹类型的核酶也可用于本发明。例如，在烟草环斑病毒卫星RNA的负链中可发现发夹类型的核酶(Buzayan，J.M.(1986)Nature 323，349)。这种核酶被发现可以以靶特异性的方式剪切RNA(Kikuchi，Y.&Sasaki，N.(1992)Nuclei Acids Res.19，6751；Kikuchi，Yo(1992)KagakuTo Seibutsu(Chemistry and Biology)30，112)。

被设计用于剪切靶的核酶与一个启动子融合，如花椰菜花叶病毒35S启动子，并与一个转录终止序列相融合才能在植物细胞中转录。然而，如果在转录RNA5’末端或3’末端加入额外序列，核酶的活性有可能丧失。这种情况下，可以将顺式发挥剪切功能的其他的剪切核酶放置在核酶部分的5’或3’端，因而可以从含有该核酶的转录RNA精确地剪切出核酶部分(Taira，K.等(1990)Protein Eng.3，733；Dzaianott，A.M.& Bujarski，J.J.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 4823；Grosshands，C.A.& Cech，R.T.(1991)Nucleic Acids Res.19，3875；Taira，K.等(1991)Nucleic Acids Res.19，5125)。通过串联地将这些结构单元连接，靶基因中的多个位点都可以被剪切，获得最大的效果(Yuyama，N.等(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.186，1271)。使用这些核酶就可能特异地剪切本发明靶基因的转录产物，从而抑制该基因的表达。

内源基因的表达也可通过具有与靶基因序列相同或类似的序列的DNA的转化，被共抑制地抑制。此处所用“共抑制”指这种现象：具有与靶内源基因序列相同或类似的序列的基因通过转化进入植物中时，被引入的外源基因和靶内源基因的表达都受到抑制。尽管对于共抑制的详细机理还不清楚，这种现象在植物中是常见的(Curr.Biol.(1997)7，R793，Curr.Biol.(1996)6，810)。例如，如果希望获得一种本发明基因被共抑制的植物体，可能将表达本发明基因或具有相似序列的DNA制作形成的载体DNA转化该植物。用于共抑制的基因不需要与靶基因完全相同。但优选的，其具有70％或更高的序列相似性，更优选80％或更高的序列相似性，最优选具有90％或更高的序列相似性(如95％或更高)。

氨基酸序列或核苷酸序列之间的相同性可通过Karlin和Altschl等的BLAST算法确定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，5873-5877)。如BLASTN和BLASTX等程序是基于此算法(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215，403-410)发展而来。根据基于BLAST的BLASTN来分析核苷酸序列，例如参数的设定为score＝100，语句长度为12。另一方面，基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列时的参数包括，例如score＝50，语句长度为3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时一般用默认值。这些分析的特定技术是本领域所熟知的(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

利用抑制本发明基因表达的DNA改变植物的生长，可以通过将该DNA插入合适的载体，将载体转入植物细胞，转化植物细胞再生而获得。只要载体能在植物细胞中表达插入的基因，则对载体是没有限制的。

例如，可以使用本发明分离的基因的启动子。也可使用含有在植物细胞中组成型表达的启动子(如花椰菜花叶病毒的35S启动子)的载体。此外，植物的组织特异性启动子可特定地改变特化的植物组织，如叶，花，果实等。这些组织特异性启动子有如：种子特异性启动子，如菜豆蛋白启动子(Bustos等，(1991)EMBO J.10，1469-1479)，大豆的大豆球蛋白启动子(Lelievre等(1992)Plant Physiol 98，387-391)；叶特异性启动子如豌豆RbcS基因启动子(Lam & Chua(1990)Science 248，471-474)，以及小麦Cab1基因启动子(Gotorn等，(1993)Plant J.3，509-518)；根特异性的启动子如烟草TobRB7基因(Yamamoto等，(1991)Plant Cell 3，371-382)，以及发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的rolD基因(Elmayan&Tepfer(1995)Transgenic Res.4，388-396)。也可能使用包含外源刺激诱导活化性启动子的载体。

尽管对于载体插入何种植物细胞没有特别的限制，但优选本发明基因来源的是稻和烟草植物。此处所述“植物细胞”包括各种形式的植物细胞，如细胞的悬浮培养物，原生质体，叶的切片，愈伤组织等。载体可通过多种方式转移到细胞中，这些都是本领域技术人员所知的，包括聚丙烯酰胺凝胶法，电穿孔法，农杆菌介导的方法以及基因枪法等。从转化植物细胞中再生植物体的方法是本领域技术人员所知的标准方法。一旦转化的植物细胞再生，就可能从植物体获得繁殖性材料(如种子，块茎，枝等)，并大规模生产本发明的转化植物。

此外，本发明中也可能通过促进本发明的发明人分离的DNA的表达，增强植物的生长。这种情况，该DNA被插入合适的载体，产生的重组载体转入植物细胞，从而获得转化的植物细胞。在植物细胞中表达所用的载体，载体转入的植物细胞，以及植物再生的方法与以上所述使用反义DNA和其他同类情况是相似的。

附图说明

图1a显示了赤霉素(内赤霉素)的一般结构。

图1b显示了高等植物中一条主要的GA生物合成途径。斜体字是GA-应答性的矮化突变，其缺乏特定的GA生物合成途径：ga1，ga2，ga3，ga5和ga4来自拟南介；an1，d5，d3和d1来自玉米；1s和1e来自豌豆；d35(dx)和d18(dy)来自稻。

图2是几幅照片，表明d18矮化植物的各种表型。从左到右，台中(Taichuu)-65(wt：最终高度为1米)，古丈玉锦(Kotake-tamanishiki)矮化株(d18^k约65厘米)，矮稻(Waito)-C(约55厘米)，丰雪(Hosetsu)矮化株(d18^k约15厘米)以及秋晴(Akibare)矮化株(Bar＝10cm)。

图3表明GA3β-羟化酶(Os3β-1和Os3β-2)基因和各种RFLP标记基因在稻第一第五染色体上的基因座位。

图4a对D18和d18等位基因RFLP分析结果的电泳图谱。DNA分离自D18(Shiokari)和秋晴(Akibare)和d18等位基因(d18^h，1d18^k，d18-AD)植物的叶组织，DNA用ApaI消化，电泳分离，结合到尼龙膜，接着进行杂交。分子大小标记以kb表示于左边。

图4b是基因组Os3β-2克隆和其亚克隆的限制性酶切图谱。基因组克隆是通过PCR产物为探针，筛选基因组文库获得的。2.3kb片段BglII的亚克隆包含D18的完整编码区。

图5是GA3β-羟化酶在野生型Oryza sativa植物中表达模式的电泳图谱。该模式通过将3β-羟化酶cDNAD18和Os3β-1与从SA(苗端)，ST(茎干)，LB(叶片)，Ra(叶轴)，FL(花)YL(幼叶)，IFM(花序分生组织)以及Sh(2周的种苗)中提取的10μg总RNA进行northern杂交获得的。

图6是照片，在肌动蛋白启动子控制下反义组成型表达Os3β-2(D18)cDNA的转化植物。左边是野生型日本晴植物，中间为半矮化植物，右边为矮化植物。

图7表示插入全长Os3β-2 cDNA的质粒pBS-SK⁺。

图8显示插入反义Os3β-2(D18)基因的质粒pAct-NOS/Hm2。

图9表示以GA9为底物，经Os3β-1融合蛋白催化产生GA₄，GA₇和GA₃₄的途径。

图10表示以GA₅，GA₉，GA₂₀和GA₄₄为底物，在Os3β-2融合蛋白的催化下，分别产生3β-羟化赤霉素(GA₃，GA₄，GA₁，GA₃₈)的途径。

实施本发明的最佳模式

以下将以实施例详细地解释本发明，但并不应该认为是对本发明的限制。稻种子(Oryza sativa，Japonica-type品种：“日本晴”，“秋晴”，“Shiokari”和其他)在1％的NaClO中灭菌1小时，在无菌蒸馏水中充分润洗，种植于土壤中，温室生长。

实施例1分离编码GA3β-羟化酶的cDNA克隆

目前没有从单子叶植物中分离GA3β-羟化酶的报道。从双子叶植物中克隆出了几种GA3β-羟化酶(Chiang等，1995；Martin等，1997；Lester等，1997)。

为了分离编码GA3β-羟化酶的部分片段，以稻基因组DNA为模板，根据已知双子叶植物GA3β-羟化酶序列保守区设计简并引物(5’引物：5’-GTNGTNAARGTNGGNGARRT-3’/SEQ ID NO：7；3’引物：5’-AYYTARTCRTTGGANGTNAC-3’/SEQ ID NO：8)，进行PCR。获得了根据已知GA3β-羟化酶序列所预期的片段大小的210bp DNA片段。

为了分离全长克隆，本发明的发明人用该片段做探针，筛选稻基因组文库。分离了几个克隆，根据各基因组克隆的限性图谱将其分为两组。最终将各组的一个克隆完全测序，并命名为Os3β-1和Os3β-2(Os3β-1和Os3β-2；Oriza sativa GA3β-羟化酶-1，-2)。这些克隆的核苷酸序列为SEQ ID NO：5和6。Os3β-1与作为探针的片段序列相同，但Os3β-2与该片段在相应区域有不同的序列。

基于各克隆的序列，本发明的发明人用幼苗(稻苗端)或未开花的蓓蕾中分离总RNA，进行RT-PCR，以获得cDNA片段。结果获得了编码GA3β-羟化酶的全长cDNA克隆。Os3β-1或Os3β-2的cDNA包含一个开放阅读框，分别编码379或373个氨基酸的多肽。SEQ ID NO：3和4为这些克隆的核苷酸序列。Os3β-2基因组DNA包含一单独的短内含子(110bp)，该内含子的位置与先前报道的双子叶植物中GA3β-羟化酶的位置相同。另一个克隆Os3β-1的基因组DNA包含两个内含子。一个与Os3β-2的基因组DNA位置相同，大小也与Os3β-2的类似(110bp)。另一个位于辅因子2-酮戊二酸结合位点(400bp)的位置上(未显示数据)。这两个克隆推导出的氨基酸序列与其他GA3β-羟化酶非常相似，而且这二者之间的相似性也很高(56.6％相同，88.2％相似性)。

利用自动测序系统(ABI373A)，双脱氧核苷酸链终止法确定核苷酸序列。用GENETYX计算机软件(Software Kaihatsu Co.，Japan)进行序列分析。

实施例2  d18等位基因的识别及定性

先前对稻植物的量化分析和生物学分析表明D18基因编码GA3β-羟化酶。D18的基因位点确定在1号染色体，其处于位于该染色体底端的FS-2位点的侧翼。为了研究相应于D18基因的分离的GA3β-羟化酶克隆，本发明的发明人利用RFLP(限制性片段长度多态性)分析在稻基因组上标记了两个克隆。

Os3β-1或Os3β-2的RFLP分别存在与用EcoRI消化的Asominori(一种日本稻)和ApaI消化的IR24(一种印度稻)DNA中。对于Asominori和IR24杂交的F2子代的消化基因组DNA进行连锁性分析。Os3β-1和Os3β-2分别被标记于第5号染色体的顶端和第1号染色体的底端(图3)。该结果暗示Os3β-2的基因座位相应于D18的基因座位。

进行了进一步的分析，以证实Os3β-2定位在D18的基因座位上。D18基因功能丧失产生了四种独立的一般突变。这些突变可能是通过γ射线的诱发突变，导致D18基因的DNA重排和/或缺失而产生的。因此，如果Os3β-2是D18基因，则在野生型和这些突变型Os3β-2位置上的RFLP可被观察出来。

进行野生型DNA(Shiolari和Akibare)和d18等位基因(1d18^k，1d18^h，d18-AD)的DNA凝胶印记分析。1d18^k和1d18^h是Shiokari背景的同型基因系，d18-AD来自乙烯亚胺(EI)诱变产生的Akibare突变体。DNA凝胶印记分析，限制性酶消化稻基因组(每泳道1μg)，琼脂糖凝胶电泳分离，转移到Hybond N+nylon膜(Amersham)(Sambrook等，1989)，在65℃的0.25M Na₂HPO₄，1mM EDTA，7％SDS溶液中进行杂交。65℃的2XSSC，0.1％SDS冲洗滤膜两次，15分钟，再用65℃的0.1X SSC，0.1％SDS冲洗滤膜一次，15分钟。

使用8种酶(BamHI，BglII，ApaI，KpnI，DraI，EcoRV，EcoRI，HindIII)消化这些基因组DNA，以发现野生型和突变型之间的RFLP。用ApaI消化来自d18-AD和1d18^h的DNA时，观察到多形性，而1d18^k用任何酶消化都不表现多形性(图4)。

RFLP分析的结果强烈暗示，d18-AD在D18基因作为有一段长的缺失，而1d18^h有一段包含ApaI位点的短的缺失。为证实这一结果，本发明的发明人分析了所有d18等位基因的完整编码序列，并将其与野生型Os3β-2对比。

特别地使用源于D18 5’和3’末端非编码序列寡核苷酸引物，扩增包含来自D18，d18^h，d18^k和d18-w的完整编码区的1.6kb片段，接着对扩增片段进行测序。

正如预期，Os3β-2编码序列在所有d18等位基因的各个位置都改变(表1)，而d18-AD没有产生PCR产物。

                           表1等位基因         突变的性质a          在编码序列         突变结果

                                  中的位置d18-AD(秋晴矮    7-kb缺失                                不存在全长D18 ORF化)d18^h(丰雪矮化)  GGG单碱基缺失为      Gly²⁵¹            38个新氨基酸的移码，添加，

             GG                                      删减的多肽前端d18^k(古丈玉锦)  CGC突变为TGC         Arg¹⁴⁵            氨基酸替代，将Asp替代为Cys，

                                         产物改变d18-w(矮稻-C)    9个碱基缺失    Val⁵⁷突变为 由于阅读框内的缺失导致3个

                            Arg⁵⁹       氨基酸片段缺失，产物改变

a下划线表明在d18^K等位基因中的核苷酸替代。

这支持以上结果，即d18-AD几乎完全丧失编码序列(数据未显示)。来自1d18^K的序列中，从启始密码子计算的第433核苷酸处的C到T的替代，将168精氨酸转化为半胱氨酸。d18-w中，169到177处符合读框的9个核苷酸的缺失导致57处缬氨酸到59处精氨酸的3个氨基酸缺失。Ld18^h中核苷G的缺失导致阅读框移位。这些结果表明Os3β-2基因位于D18座位，并编码GA3β-羟化酶。

实施例3Os3β-2(D18)和Os3β-1基因在植物生长中的调节

为了研究D18和Os3β-1基因在植物生长中的表达，进行RNA凝胶印记分析。标准方法从各种器官或组织中制备总RNA(Sambrook等，1989)。凝胶电泳分离RNA(每样品10μg)，转移到Hybond N+nylon膜(Amersham)，在65℃的5XSSC，10％(w/v)硫酸葡聚糖，0.5％(w/v)SDS，0.1mg/ml变性鲑精DNA溶液中进行杂交。65℃的2XSSC，0.1％SDS冲洗滤膜两次，15分钟，再用65℃的0.1XSSC，0.1％SDS冲洗滤膜一次，15分钟。来自全长D18 cDNA的BssHII-PvuII(519bp)片段和来自Os3β-1的KpnI-PvuII(310bp)片段被用做探针。

在各检测的器官中表达D18基因(图5)。表达水平在茎干、幼叶和花序分生组织中高，在叶片和叶轴中低。作为对比，Os3β-1mRNA在花中高量表达，而在叶片和叶轴中表达量低。

由于D18和Os3β-1互相非常相似，本发明的发明人通过基因组southern分析检测了其相互杂交的程度。当基因组southern杂交使用各自特异性的探针时，没有出现交叉杂交(数据未显示)。

实施例4抑制Os3β-2(D18)基因表达产生矮化植物

克隆于质粒pBS-SK⁺的BamHI-HindIII位点的全长Os3β-2cDNA(图7)，经BamHI-HindIII消化从载体上剪切下来，以收集cDNA，接着将其两末端钝化。将这种钝化的全长cDNA插入质粒pAct-NOS/Hm2的SmaI位点，构建表达反义Os3β-2基因的载体(图8)。

电穿孔法将这种重组质粒转化农杆菌菌株的EHA101。稻发芽的种子与农杆菌菌株接触，在含有卡那霉素和潮霉素的选择培养基中培养3周，选择抗性细胞，将抗性细胞转移到再分化培养基以获得更多的转基因植物。结果表达反义Os3β-2基因的植物与野生型稻植物相比变得矮化(图6)。

实施例5重组GA3β-羟化酶的功能

Os3β-1和Os3β-2基因预测编码区的cDNA分别正向插入表达载体pMAL-c2(New England Biolabs，Beverly，MA)，以获得融合的翻译产物。获得的构建体，pMAL-Os3β-1和pMAL-Os3β-2，在E.coli菌株JM109中表达。细菌细胞在含有100mg/L氨苄青霉素的2×YT培养基中震荡，37℃过夜培养，接着培养物由含有100mg/L氨苄青霉素的2×YT培养基稀释100倍，进一步在30℃震荡培养。4小时后，在培养液中加入IPTG至终浓度为1mM，混合液17℃震荡培养18小时。培养结束后，收集细菌细胞，洗涤缓冲液(包含50mM Tris-HCl(pH8.0)，10％(w/v)甘油和2mM DTT)，用含有溶菌酶(1mg/ml)的洗涤缓冲液悬浮，冰上放置30分钟。

将获得的细胞裂解液超声处理，离心，上清进行SDS-PAGE以证实融合蛋白的表达。上清与各种赤霉素和辅因子(抗坏血酸，二价铁，和2-酮戊二酸)以检测Os3β-融合蛋白的酶活。对于Os3β-2融合蛋白的活性分析，根据手册中所述方法，上清在淀粉凝胶柱中纯化，获得的纯化蛋白同以上方法孵育。GC-MS可识别代谢的赤霉素。对于Os3β-1融合蛋白，当底物为GA₉(图9)，证实了GA₄(3β羟化)，GA₇(2，3-不饱和和3β羟化)，以及GA₃₄(2β羟化)的生成。GA₄和GA₇在反应产物中为主导。使用GA₂₀做底物也获得同样的结果。此外，GA₅和GA₄₄为底物时，仅获得相应的3β羟化的赤霉素(GA₃和GA₈₈)。另一方面，GA₅，GA₉，GA₂₀，GA₄₄作为底物时，Os3β-2融合蛋白产生相应的3β羟化的赤霉素(GA₃，GA₄，GA₁，和GA₃₈)(图10)。

这些结果表明Os3β-1基因编码催化2-，3-去饱和，2β-羟化以及3β-羟化核反应的酶。此外，显然Os3β-1基因编码催化3β-羟化的酶。

工业应用

本发明提供参与植物赤霉素活化的新的蛋白和基因，也提供通过控制这些基因的表达改变了赤霉素活性的植物。本发明使植物中的赤霉素活性能够被改变，从而人为地改变植株类型。对植物中赤霉素活性的抑制，抑制了植物的纵向生长，诱导植物矮化的表型。例如，当大量施肥促进植物过度生长时，其可以防止稻植物倒伏。由于叶片对光照的吸收效率增加，也将使作物产量有显著增加。还可能改善收获和育种管理的效率。本发明的另一个效果是，通过提高本发明基因在植物中的表达，促进赤霉素活性，从而增加植物的整体产量。这种策略对于饲料作物整体的产量尤其有用。

                            序列表<110>农林水产省农业生物资源研究所所长代表的日本国(JAPAN as represented byDirector General of Ministry of Agriculture，Forestry and Fisheries，National Institute of Agrobiological Resources)理化学研究所(RIKEN)<120>来自稻赤霉素3β-羟化酶的基因及其用途<130>MOA-103PCT<140><141><150>JP 1999-361608<151>1999-12-20<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>379<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>1Met Thr Ser Ser Ser Thr Ser Pro Thr Ser Pro Leu Ala Ala Ala Ala1               5                  10                  15His Asn Gly Val Thr Ala Ala Tyr Phe Asn Phe Arg Gly Ala Glu Arg

         20                  25                  30Val Pro Glu Ser His Val Trp Lys Gly Met His Glu Lys Asp Thr Ala

     35                  40                  45Pro Val Ala Ala Ala Asp Ala Asp Gly Gly Asp Ala Val Pro Val Val

 50                  55                  60Asp Met Ser Gly Gly Asp Asp Ala Ala Val Ala Ala Val Ala Arg Ala65                  70                  75                  80Ala Glu Glu Trp Gly Gly Phe Leu Leu Val Gly His Gly Val Thr Ala

             85                  90                  95Glu Ala Leu Ala Arg Val Glu Ala Gln Ala Ala Arg Leu Phe Ala Leu

        100                 105                 110Pro Ala Asp Asp Lys Ala Arg Gly Ala Arg Arg Pro Gly Gly Gly Asn

    115                 120                 125Thr Gly Tyr Gly Val Pro Pro Tyr Leu Leu Arg Tyr Pro Lys Gln Met

130                 135                 140Trp Ala Glu Gly Tyr Thr Phe Pro Pro Pro Ala Ile Arg Asp Glu Phe145                 150                 155                 160Arg Arg Val Trp Pro Asp Ala Gly Asp Asp Tyr His Arg Phe Cys Ser

            165                 170                 175Ala Met Glu Glu Tyr Asp Ser Ser Met Arg Ala Leu Gly Glu Arg Leu

        180                 185                 190Leu Ala Met Phe Phe Lys Ala Leu Gly Leu Ala Gly Asn Asp Ala Pro

    195                 200                 205Gly Gly Glu Thr Glu Arg Lys Ile Arg Glu Thr Leu Thr Ser Ser Thr

210                 215                 220Ile His Leu Asn Met Phe Pro Arg Cys Pro Asp Pro Asp Arg Val Val225                 230                 235                 240Gly Leu Ala Ala His Thr Asp Ser Gly Phe Phe Thr Phe Ile Leu Gln

            245                 250                 255Ser Pro Val Pro Gly Leu Gln Leu Leu Arg His Arg Pro Asp Arg Trp

        260                 265                 270Val Thr Val Pro Gly Thr Pro Gly Ala Leu Ile Val Val Val Gly Asp

    275                 280                 285Leu Phe His Val Leu Thr Asn Gly Arg Phe His Ser Val Phe His Arg

290                 295                 300Ala Val Val Asn Arg Glu Arg Asp Arg Ile Ser Met Pro Tyr Phe Leu305                 310                 315                 320Gly Pro Pro Ala Asp Met Lys Val Thr Pro Leu Val Ala Ala Gly Ser

            325                 330                 335Pro Glu Ser Lys Ala Val Tyr Gln Ala Val Thr Trp Pro Glu Tyr Met

        340                 345                 350Ala Val Arg Asp Lys Leu Phe Gly Thr Asn Ile Ser Ala Leu Ser Met

    355                 360                 365Ile Arg Val Ala Lys Glu Glu Asp Lys Glu Ser

370                 375<210>2<211>373<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>2Met Pro Thr Pro Ser His Leu Lys Asn Pro Leu Cys Phe Asp Phe Arg1               5                  10                  15Ala Ala Arg Arg Val Pro Glu Thr His Ala Trp Pro Gly Leu Asp Asp

         20                  25                  30His Pro Val Val Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Asp Ala Val Pro

     35                  40                  45Val Val Asp Val Arg Ala Gly Asp Ala Ala Ala Arg Val Ala Arg Ala

 50                  55                  60Ala Glu Gln Trp Gly Ala Phe Leu Leu Val Gly His Gly Val Pro Ala65                  70                  75                  80Ala Leu Leu Ser Arg Val Glu Glu Arg Val Ala Arg Val Phe Ser Leu

             85                  90                  95Pro Ala Ser Glu Lys Met Arg Ala Val Arg Gly Pro Gly Glu Pro Cys

        100                 105                 110Gly Tyr Gly Ser Pro Pro Ile Ser Ser Phe Phe Ser Lys Leu Met Trp

    115                 120                 125Ser Glu Gly Tyr Thr Phe Ser Pro Ser Ser Leu Arg Ser Glu Leu Arg

130                 135                 140Arg Leu Trp Pro Lys Ser Gly Asp Asp Tyr Leu Leu Phe Cys Asp Val145                 150                 155                 160Met Glu Glu Phe His Lys Glu Met Arg Arg Leu Ala Asp Glu Leu Leu

            165                 170                 175Arg Leu Phe Leu Arg Ala Leu Gly Leu Thr Gly Glu Glu Val Ala Gly

        180                 185                 190Val Glu Ala Glu Arg Arg Ile Gly Glu Arg Met Thr Ala Thr Val His

    195                 200                 205Leu Asn Trp Tyr Pro Arg Cys Pro Glu Pro Arg Arg Ala Leu Gly Leu

210                 215                 220Ile Ala His Thr Asp Ser Gly Phe Phe Thr Phe Val Leu Gln Ser Leu225                 230                 235                 240Val Pro Gly Leu Gln Leu Phe Arg Arg Gly Pro Asp Arg Trp Val Ala

            245                 250                 255Val Pro Ala Val Ala Gly Ala Phe Val Val Asn Val Gly Asp Leu Phe

        260                 265                 270His Ile Leu Thr Asn Gly Arg Phe His Ser Val Tyr His Arg Ala Val

    275                 280                 285Val Asn Arg Asp Arg Asp Arg Val Ser Leu Gly Tyr Phe Leu Gly Pro

290                 295                 300Pro Pro Asp Ala Glu Val Ala Pro Leu Pro Glu Ala Val Pro Ala Gly305                 310                 315                 320Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Ala Val Thr Trp Pro Glu Tyr Met Ala Val

            325                 330                 335Arg Lys Lys Ala Phe Ala Thr Gly Gly Ser Ala Leu Lys Met Val Ser

        340                 345                 350Thr Asp Ala Ala Ala Ala Ala Asp Glu His Asp Asp Val Ala Ala Ala

    355                 360                 365Ala Asp Val His Ala

 370<210>3<211>1187<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220><221>CDS<222>(1)..(1137)<400>3atg aca tcg tcg tcg acc tcg ccg acc tcg ccg ctg gcc gcc gcc gca  48Met Thr Ser Ser Ser Thr Ser Pro Thr Ser Pro Leu Ala Ala Ala Ala1               5                  10                  15cac aat ggc gtc acc gcc gcc tac ttc aac ttc cgc ggg gcg gag cgc  96His Asn Gly Val Thr Ala Ala Tyr Phe Asn Phe Arg Gly Ala Glu Arg

         20                  25                  30gtg ccg gag tcg cac gtg tgg aag ggg atg cac gag aag gac acc gcg  144Val Pro Glu Ser His Val Trp Lys Gly Met His Glu Lys Asp Thr Ala

     35                  40                  45ccg gtg gcg gcg gcg gac gcg gac ggc ggc gac gcg gtg ccg gtg gtg  192Pro Val Ala Ala Ala Asp Ala Asp Gly Gly Asp Ala Val Pro Val Val

 50                  55                  60gac atg agc ggc ggc gac gac gcc gcg gtg gcg gcg gtg gcg cgc gcg  240Asp Met Ser Gly Gly Asp Asp Ala Ala Val Ala Ala Val Ala Arg Ala65                  70                  75                  80gcg gag gag tgg ggc ggg ttc ctg crc gtc ggg cac ggc gtg acc gcg  288Ala Glu Glu Trp Gly Gly Phe Leu Leu Val Gly His Gly Val Thr Ala

             85                  90                  95gag gcc ctg gcg cgc gtc gag gcg cag gcg gcg cgg ctg ttc gcg ctg  336Glu Ala Leu Ala Arg Val Glu Ala Gln Ala Ala Arg Leu Phe Ala Leu

        100                 105                 110ccg gcg gac gac aag gcg cgc ggg gcg cgg cgg ccc ggc ggc ggg aac  384Pro Ala Asp Asp Lys Ala Arg Gly Ala Arg Arg Pro Gly Gly Gly Asn

    115                 120                 125acc ggc tac ggc gtg ccg ccg tac ctc ctc cgg tac ccg aag cag atg    432Thr Gly Tyr Gly Val Pro Pro Tyr Leu Leu Arg Tyr Pro Lys Gln Met

130                 135                 140tgg gcc gag ggc tac acc ttc cct ccc cct gcc atc cgc gac gag ttc    480Trp Ala Glu Gly Tyr Thr Phe Pro Pro Pro Ala Ile Arg Asp Glu Phe145                 150                 155                 160cgc cgc gtc tgg ccc gac gcc ggc gac gac tac cac cgc ttc tgc tcc    528Arg Arg Val Trp Pro Asp Ala Gly Asp Asp Tyr His Arg Phe Cys Ser

            165                 170                 175gcc atg gag gag tac gac tcg tcg atg aga gct ctg ggc gag agg ctc    576Ala Met Glu Glu Tyr Asp Ser Ser Met Arg Ala Leu Gly Glu Arg Leu

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    195                 200                 205ggc ggc gag acc gag cgg aag atc cgc gaa acg ttg acg tcg tcg acg    672Gly Gly Glu Thr Glu Arg Lys Ile Arg Glu Thr Leu Thr Ser Ser Thr

210                 215                 220att cac ctc aac atg ttc cct agg tgt cca gat cca gac cgg gtg gtc    720Ile His Leu Asn Met Phe Pro Arg Cys Pro Asp Pro Asp Arg Val Val225                 230                 235                 240ggg ctg gcg gcg cac acg gac tca ggc ttc ttc acc ttc atc ctg cag    768Gly Leu Ala Ala His Thr Asp Ser Gly Phe Phe Thr Phe Ile Leu Gln

            245                 250                 255agc ccc gtg ccg ggg ttg cag ctg ctc cgc cac cgg ccg gac cgg tgg    816Ser Pro Val Pro Gly Leu Gln Leu Leu Arg His Arg Pro Asp Arg Trp

        260                 265                 270gtg acg gtt ccg ggg acg ccg ggg gcg ctc atc gtc gtc gtc ggc gat    864Val Thr Val Pro Gly Thr Pro Gly Ala Leu Ile Val Val Val Gly Asp

    275                 280                 285ctc ttc cat gtg ctc acc aac ggg cgc ttc cac agc gtg ttc cac cgc    912Leu Phe His Val Leu Thr Asn Gly Arg Phe His Ser Val Phe His Arg

290                 295                 300gcc gtc gtg aac cgg gag aga gac cgg atc tcc atg ccc tac ttc ctc  960Ala Val Val Asn Arg Glu Arg Asp Arg Ile Ser Met Pro Tyr Phe Leu305                 310                 315                 320ggt ccg ccg gcc gac atg aag gtg aca cct ctc gtg gcg gcg ggg tcg  1008Gly Pro Pro Ala Asp Met Lys Val Thr Pro Leu Val Ala Ala Gly Ser

            325                 330                 335ccg gag agc aag gcc gtg tat cag gcc gtg aca tgg ccg gag tac atg  1056Pro Glu Ser Lys Ala Val Tyr Gln Ala Val Thr Trp Pro Glu Tyr Met

        340                 345                 350gct gta agg gat aag ttg ttc ggg aca aat ata tcg gcg ttg agc atg  1104Ala Val Arg Asp Lys Leu Phe Gly Thr Asn Ile Ser Ala Leu Ser Met

    355                 360                 365att cga gta gcg aag gaa gag gac aag gag agt tagaactatg gtatgattgc1157Iie Arg Val Ala Lys Glu Glu Asp Lys Glu Ser

370                 375aattatccat gccagaaaaa aaaaaaaaaa                                 1187<210>4<211>1122<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220><221>CDS<222>(1)..(1119)<400>4atg ccg acg ccg tcg cac ttg aag aac ccg ctc tgc ttc gac ttc cgg 48Met Pro Thr Pro Ser His Leu Lys Asn Pro Leu Cys Phe Asp Phe Arg1               5                  10                  15gcg gcg agg cgg gtg ccg gag acg cac gcg tgg ccg ggg ctg gac gac 96Ala Ala Arg Arg Val Pro Glu Thr His Ala Trp Pro Gly Leu Asp Asp

         20                  25                  30cac ccg gtg gtg gac ggc ggc ggc ggc ggc ggc gag gac gcg gtg ccg 144His Pro Val Val Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Asp Ala Val Pro

     35                  40                  45gtg gtg gac gtc agg gcg ggc gac gcg gcg gcg cgg gtg gcg cgg gcg    192Val Val Asp Val Arg Ala Gly Asp Ala Ala Ala Arg Val Ala Arg Ala

 50                  55                  60gcg gag cag tgg ggc gcg ttc ctt  ctg gtc ggg cac ggc gtg ccg gcg   240Ala Glu Gln Trp Gly Ala Phe Leu Leu Val Gly His Gly Val Pro Ala65                  70                  75                  80gcg ctg ctg tcg cgc gtc gag gag cgc gtc gcc cgc gtg ttc tcc ctg    288Ala Leu Leu Ser Arg Val Glu Glu Arg Val Ala Arg Val Phe Ser Leu

             85                  90                  95ccg gcg tcg gag aag atg cgc gcc gtc cgc ggc ccc ggc gag ccc tgc    336Pro Ala Ser Glu Lys Met Arg Ala Val Arg Gly Pro Gly Glu Pro Cys

        100                 105                 110ggc tac ggc tcg ccg ccc atc tcc tcc ttc ttc tcc aag ctc atg tgg    384Gly Tyr Gly Ser Pro Pro Ile Ser Ser Phe Phe Ser Lys Leu Met Trp

    115                 120                 125tcc gag ggc tac acc ttc tcc cct tcc tcc ctc cgc tcc gag ctc cgc    432Ser Glu Gly Tyr Thr Phe Ser Pro Ser Ser Leu Arg Ser Glu Leu Arg

130                 135                 140cgc ctc tgg ccc aag tcc ggc gac gac tac ctc ctc ttc tgt gac gtg    480Arg Leu Trp Pro Lys Ser Gly Asp Asp Tyr Leu Leu Phe Cys Asp Val145                 150                 155                 160atg gag gag ttt cac aag gag atg cgg cgg cta gcc gac gag ttg ctg    528Met Glu Glu Phe His Lys Glu Met Arg Arg Leu Ala Asp Glu Leu Leu

            165                 170                 175agg ttg ttc ttg agg gcg ctg ggg ctc acc ggc gag gag gtc gcc gga    576Arg Leu Phe Leu Arg Ala Leu Gly Leu Thr Gly Glu Glu Val Ala Gly

        180                 185                 190gtc gag gcg gag agg agg atc ggc gag agg atg acg gcg acg gtg cac    624Val Glu Ala Glu Arg Arg Ile Gly Glu Arg Met Thr Ala Thr Val His

    195                 200                 205ctc aac tgg tac ccg agg tgc ccg gag ccg cgg cga gcg ctg ggg ctc    672Leu Asn Trp Tyr Pro Arg Cys Pro Glu Pro Arg Arg Ala Leu Gly Leu

210                 215                 220atc gcg cac acg gac tcg ggc ttc ttc acc ttc gtg ctc cag agc ctc    720Ile Ala His Thr Asp Ser Gly Phe Phe Thr Phe Val Leu Gln Ser Leu225                 230                 235                 240gtc ccg ggg ctg cag ctg ttc cgt cga ggg ccc gac cgg tgg gtg gcg    768Val Pro Gly Leu Gln Leu Phe Arg Arg Gly Pro Asp Arg Trp Val Ala

            245                 250                 255gtg ccg gcg gtg gcg ggg gcc ttc gtc gtc aac gtc ggc gac ctc ttc    816Val Pro Ala Val Ala Gly Ala Phe Val Val Asn Val Gly Asp Leu Phe

        260                 265                 270cac atc ctc acc aac ggc cgc ttc cac agc gtc tac cac cgc gcc gtc    864His Ile Leu Thr Asn Gly Arg Phe His Ser Val Tyr His Arg Ala Val

    275                 280                 285gtg aac cgc gac cgc gac cgg gtc tcg ctc ggc tac ttc ctc ggc ccg    912Val Asn Arg Asp Arg Asp Arg Val Ser Leu Gly Tyr Phe Leu Gly Pro

290                 295                 300ccg ccg gac gcc gag gtg gcg ccg ctg ccg gag gcc gtg ccg gcc ggc    960Pro Pro Asp Ala Glu Val Ala Pro Leu Pro Glu Ala Val Pro Ala Gly305                 310                 315                 320cgg agc ccc gcc tac cgc gct gtc acg tgg ccg gag tac atg gcc gtc    1008Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Ala Val Thr Trp Pro Glu Tyr Met Ala Val

            325                 330                 335cgc aag aag gcc ttc gcc acc ggc ggc tcc gcc ctc aag atg gtc tcc    1056Arg Lys Lys Ala Phe Ala Thr Gly Gly Ser Ala Leu Lys Met Val Ser

        340                 345                 350acc gac gcc gcc gcc gcc gcc gac gaa cac gac gac gtc gcc gcc gcc    1104Thr Asp Ala Ala Ala Ala Ala Asp Glu His Asp Asp Val Ala Ala Ala

    355                 360                 365gcc gac gtc cac gca taa                                            1122Ala Asp Val His Ala

370<210>5<211>1948<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220><223>基因组DNA序列<220><221>内含子<222>(811)..(909)<220><221>内含子<222>(1072)..(1461)<400>5ctcgaggatc gaaaccaaaa ttaagggagc acaaaaaact atgacaaatg tttagttctg 60acaatgaact aaattagaac aaagcttgat ccgatcctat ccatttctga ttttgtgccg 120aacgatgcgg agagaagtta gttttttgta gataatgcaa gcccaaattt agccatgcta 180tctcgttatt aatcacgcga aagaaatggt catgccaaca aattaattta tcgtacatca 240ctagtcacag gcttttgtgc gttagccaac gagttcatgc agatcatgac atcgtcgtcg 300acctcgccga cctcgaccgc tggccgccgc cgcacacaat ggcgtcaccg ccgcctactt 360caacttccgc ggggcggagc gcgtgccgga gtcgcacgtg tggaagggga tgcacgagaa 420ggacaccgcg ccggtggcgg cggcggacgc ggacggcggc gacgcggtgc cggtggtgga 480catgagcggc ggcgacgacg ccgcggtggc ggcggtggcg cgcgcggcgg aggagtgggg 540cgggttcctg ctcgtcgggc acggcgtgac cgcggaggcc ctggcgcgcg tcgaggcgca 600ggcggcgcgg ctgttcgcgc tgccggcgga cgacaaggcg cgcggggcgc ggcggcccgg 660cggcgggaac accggctacg gcgtgccgcc gtacctcctc cggtacccga agcagatgtg 720ggccgagggc tacaccttcc ctccccctgc catccgcgac gagttccgcc gcgtctggcc 780cgacgccggc gacgactacc accgcttctg gtacgcgttt accgccgatc gatcgatcga 840tccgccattg cttgcatgca actaacctag ctagcttccg cgcgtgttcg tccgatccgg 900cccggccagc tccgccatgg aggagtacga ctcgtcgatg agagctctgg gcgagaggct 960cctcgccatg ttcttcaagg cgctcgggct cgccggcaac gatgcccccg gcggcgagac 1020cgagcggaag atccgcgaaa cgttgacgtc gtcgacgatt cacctcaaca tgtatgtaaa 1080ctcatatgga tgtggatttt ctatgcatag atgccatagc actgcaccca tcatttacat 1140acgattttga gaaaatataa gtttataaac aagctatatt taatctacaa ctaaaaaaac 1200aaaaataata aaatcaggca ataaatacta gtaaaatttg ttatttttac ttcgtgtgta 1260ggtcgaattt aattttacat atttatatag tgttttatac tattattgta atctatctta 1320tcaaattcta tgatttttta taactattta aactacatgt atgatacaca attagaaaat 1380acttttccat acaaatatat cttcacatgc aatggtgttt ggagctgatc gacacgtgtc 1440actctgacat ggccacacgc aggttcccta ggtgtccaga tccagaccgg gtggtcgggc 1500tggcggcgca cacggactca ggcttcttca ccttcatcct gcagagcccc gtgccggggt 1560tgcagctgct ccgccaccgg ccggaccggt gggtgacggt tccggggacg ccgggggcgc 1620tcatcgtcgt cgtcggcgat ctcttccatg tgctcaccaa cgggcgcttc cacagcgtgt 1680tccaccgcgc cgtcgtgaac cgggagagag accggatctc catgccctac ttcctcggtc 1740cgccggccga catgaaggtg acacctctcg tggcggcggg gtcgccggag agcaaggccg 1800tgtatcaggc cgtgacatgg ccggagtaca tggctgtaag ggataagttg ttcgggacaa 1860atatatcggc gttgagcatg attcgagtag cgaaggaaga ggacaaggag agttagaact 1920atggtatgat tgcaattatc catgccag                                    1948<210>6<211>2112<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220><223>基因组DNA序列<220><221>内含子<222>(789)..(899)<400>6ttttttcctc tccaaatcta ttaattaatg atccatttca attcttcatc actgatttat 60tcaccaatta attctctctt ttttttttct tccactacgc tccaaaactt ctctccctat 120atatacctct cccttgtact tgtccagttc ttacactcgt ctcactttac tactcattcc 180actattgtaa agtcatagaa aaaatttata tagagagaaa aaattagtgt ttgttattgt 240tactggcttt ctgccagacg agacgagcga gcgcgcgagt gtgttcctct ctgagtcatc 300tcgtcgtcgt cggcgatgcc gacgccgtcg cgcttgaaga acccgctctg cttcgacttc 360cgggcggcga ggcgggtgcc ggagacgcac gcgtggccgg ggctggacga ccacccggtg 420gtggacggcg gcggcggcgg cggcgaggac gcggtgccgg tggtggacgt cagggcgggc 480gacgcggcgg cgcgggtggc gcgggcggcg gagcagtggg gcgcgttcct tctggtcggg 540cacggcgtgc cggcggcgct gctgtcgcgc gtcgaggagc gcgtcgcccg cgtgttctcc 600ctgccggcgt cggagaagat gcgcgccgtc cgcggccccg gcgagccctg cggctacggc 660tcgccgccca tctcctcctt cttctccaag ctcatgtggt ccgagggcta caccttctcc 720ccttcctccc tccgctccga gctccgccgc ctctggccca agtccggcga cgactacctc 780ctcttctggt atatatacat atatatatac tctcccatgc attccatgca catacactct 840acgtatatat ctacctctac gtatatatct acgtattgat ctacgtataa tatacgcagt 900gacgtgatgg aggagtttca caaggagatg cggcggctag ccgacgagtt gctgaggttg 960ttcttgaggg cgctggggct caccggcgag gaggtcgccg gagtcgaggc ggagaggagg 1020atcggcgaga ggatgacggc gacggtgcac ctcaactggt acccgaggtg cccggagccg 1080cggcgagcgc tggggctcat cgcgcacacg gactcgggct tcttcacctt cgtgctccag 1140agcctcgtcc cggggctgca gctgttccgt cgagggcccg accggtgggt ggcggtgccg 1200gcggtggcgg gggccttcgt cgtcaacgtc ggcgacctct tccacatcct caccaacggc 1260cgcttccaca gcgtctacca ccgcgccgtc gtgaaccgcg accgcgaccg ggtctcgctc 1320ggctacttcc tcggcccgcc gccggacgcc gaggtggcgc cgctgccgga ggccgtgccg 1380gccggccgga gccccgccta ccgcgctgtc acgtggccgg agtacatggc cgtccgcaag 1440aaggccttcg ccaccggcgg ctccgccctc aagatggtct ccaccgacgc cgccgccgcc 1500gccgacgaac acgacgacgt cgccgccgcc gccgacgtcc acgcataagc tatagctact 1560agctacctcg atctcacgca aaaaaaaaaa gaaacaatta atagagcaaa aaaaaaaaga 1620aacaattaat agagcaaaaa aaaaaagaag agaaaatggt ggtacttgtg tttaaggttt 1680cctccatgca aaatggtttg catgcatgca tgcaaagcta gcatctgcag ctgcaagaat 1740tacaagagca gagaagcaga cagctagatg gagataatta attaattaat taatctaatt 1800aagcatgcaa taattaagat tattattctg atttcagaac tgaaaaaaaa agtgtggtta 1860attaattatt ggttaggctt aattttatct agatgtagaa aaagaatcaa gatcttcaag 1920caagagagaa gaggatcgaa gaagaaggaa aagaaaacga aaaggacatg ctgtgttgtc 1980tcttctagtt gtaccctggc tgctgattaa gtgctttgtt ttgttgctgc aagcttgtcg 2040ttactgatta ttagttagtt atgcatctaa ttgattaaac taatctgttt ggcattttgg 2100ctcgaggtcg ac                                                     2112<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工序列的引物序列<400>7gtngtnaarg tnggngarrt                            20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工序列的引物序列<400>8ayytartcrt tggangtnac                            20

Claims (12)

1、一种DNA，该DNA编码有赤霉素3β-羟化酶活性的蛋白，并从下面(a)-(c)中任选：

(a)一种DNA，该DNA编码由SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列组成的蛋白；

(b)一种DNA，其包含SEQ ID NO：3或4所示核苷酸序列的编码区；和

(c)一种DNA，该DNA编码由SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列中的一个或更多个氨基酸残基被取代，缺失，添加，和/或插入形成的氨基酸序列组成的蛋白。

2、一种编码反义RNA的DNA，该反义RNA与权利要求1中的DNA或其转录产物互补。

3、一种编码RNA的DNA，该RNA具有能特异性剪切权利要求1中DNA的转录产物的核酶活性。

4、一种编码RNA的DNA，该RNA通过共抑制，抑制内源的权利要求1所述的DNA在植物细胞中的表达。

5、一种载体，其中包含权利要求1-4中任一项所述的DNA。

6、一种转化植物细胞，其中包含权利要求1-4中任一所述的可表达的DNA。

7、一种转基因植物体，其中包含权利要求6所述的转化植物细胞。

8、一种权利要求7所述转基因植物体的繁殖材料。

9、一种由权利要求1所述DNA编码的蛋白。

10、一种产生权利要求9所述蛋白的方法，其中所述方法包括培养权利要求1所述DNA的可表达的转化植物细胞，从所述细胞或其培养物上清中回收表达的蛋白。

11、一种改变植物生长的方法，其特征在于，控制植物细胞内权利要求1所述DNA的表达水平。

12、一种改变植物株型的方法，其特征在于，控制植物细胞内权利要求1所述DNA的表达水平。

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