WO2001046434A1 - GENES TIRES DU RIZ CODANT LA GIBBERELLINE 3β-HYDROXYLASE, ET LEUR UTILISATION - Google Patents

GENES TIRES DU RIZ CODANT LA GIBBERELLINE 3β-HYDROXYLASE, ET LEUR UTILISATION Download PDF

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WO2001046434A1
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dna
protein
gene
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Hiroshi Tanaka
Toshiaki Kayano
Masahiro Yano
Makoto Matsuoka
Masatomo Kobayashi
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National Institute Of Agrobiological Sciences
Riken
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    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8297—Gibberellins; GA3

Definitions

  • the present invention relates to a rice-derived gene involved in gibberellin biosynthesis and use of the gene.
  • Multicellular organisms are composed of a number of specialized organs and tissues that assemble into functional units. The coordination of various parts of living organisms is through chemical mediators, for which the term hormone is used. Plant hormones are naturally occurring substances that stimulate or inhibit growth or act as signals to control some growth program, and are very effective in small amounts. Today, substances commonly recognized as plant hormones include auxins, gibberellins, cytokines, abscisic acid, brassinolide, and ethylene.
  • hormones are usually synthesized in special glands and sent throughout the body through the bloodstream. In this way, hormones reach targets and responding tissues that are ready to respond, triggering specific regulatory processes.
  • plant hormones are active in specific target tissues, but they are often different from the tissues where the hormones are produced.
  • all plant hormones can be detected at many sites in multicellular nuclei. This indicates that there is often no absolute separation between the site of synthesis and the site of plant hormone action. If necessary, hormones can act on the same cells (tissues) as the cells on which the hormone is formed. It is possible. Thus, understanding the regulation of plant hormone synthesis is important in determining the relationship between synthesis and effect.
  • Gibberellin was first discovered as a phytotoxic by Japanese plant pathologists in the 1920s.
  • the phytopathogenic fungus Gibberella Wibberella fujikuroi) infects grasses and secretes compounds that cause pathological longitudinal growth ("mad seedling disease").
  • mad seedling disease pathological longitudinal growth
  • the compound was isolated and the active substance crystallized and was called “gibberellin”. Subsequent studies have shown that GA is also produced by higher plants and is very important in growth control and differentiation processes.
  • GA The basic structure of about 80 GAs identified by 1992 is a four-ring system of ent-gibberellan (Fig. La).
  • GA contains diterpenoid carboxylic acids, which are mainly produced from mevalonic acid through the cyclization of geranylgeranyl pyrophosphate ( Figure lb), but most are inactive in promoting plant growth.
  • the biologically active GA which act as plant growth regulators, it is our and GA 4. They can regulate various growth processes such as seed germination, stem elongation, flowering and fruiting. Therefore, by modifying the biosynthesis of GA, it is possible to produce various industrially useful modified plants.
  • the role of GA as a mediator of environmental stimuli is well established.
  • GA1 of Arabidopsis which encodes coparyl diphosphate synthase (CPS), an enzyme active early in GA biosynthesis, For example, it is highly expressed in rapidly growing tissues such as stem tips, root tips and flowers (Silverstone et al. (1997) Plant J. 12, 9-19).
  • GA C-20 oxidase which catalyzes the late stages of the GA biosynthetic pathway and constitutes a small gene family, is used in Arabidopsis, endo, and kidney bean stems and growing seeds, which require GA for growth. specifically expressed, they undergo a control negative control by GA 3 treatment (Phillips et al (1995) Plant Physiol 108, Yuzuru -.... 1057, Garcia -Martinez et al (1997) Plant Mol.Biol 33 , 1073-1084).
  • the present inventors conclude that the action of GA in various organs depends on the amount of endogenous GA present, and that the amount of endogenous GA is They speculated that it might depend on the regulation of GA biosynthetic enzyme expression.
  • bioactive GA is synthesized by 35 hydroxylation catalyzed by GA3-?-Hydroxylase, so analyzing the expression of CPS or GA C-20 oxidase, We did not believe that there was direct evidence for controlling the amount of GA.
  • the maize dwarf 1,3-hydroxylase is also thought to be multifunctional and catalyzes three hydroxylation steps in the corn GA biosynthetic pathway (Spray et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 10515-10518). However, the nature of these GA35 hydroxylases has not yet been fully elucidated. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a novel GA 3 -hydroxylase gene derived from rice and its use, in particular, the use of the gene for producing a plant with a modified plant type.
  • the present inventors In order to isolate a rice-derived hydroxylase gene, the present inventors first used a degenerate primer designed based on the conserved region of dicotyledonous GA3 hydroxylase to obtain a rice genome. PCR was performed using MA as type II. Next, a rice genomic library was screened using the genomic DNA fragment encoding GA3-hydroxylase thus obtained as a probe, and several clones were obtained. These genomic clones were classified into two groups based on the restriction map, and one of each group was completely sequenced. As a result, the present inventors found that these clones each encode rice GA3-hydroxylase.
  • RT-PCR was performed using total RNA isolated from seedlings (rice-tips) or unopened flowers to obtain cDNA fragments. This resulted in full-sized cDNA clones encoding GA3? -Hydroxylase (these clones were named "0s3? -1" and "0s3? -2"). Furthermore, the present inventors reverse-transcribed total RNA isolated from rice seedlings (stem tips) or unopened flowers into type III using a primer designed based on the obtained genomic MA sequence. PCR (RT-PCR) was performed to obtain a complete cDNA clone encoding rice GA3-hydroxylase.
  • a dl8 mutant is known as a GA-responsive dwarf species.
  • the present inventors investigated whether or not the isolated rice GA3-hydroxylase clone corresponds to the D18 gene. Done.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • the 0s33-2 gene caused the dl8 mutation. Turned out to be.
  • Ma the difference in the expression site from the 0s3 -2 gene suggested that the 0s3 -l protein is involved in different pathways of 0s3 -2 protein and bioactive GA.
  • the present inventors used antisense DNA against the 0s35-2 gene to suppress the expression of the Os35-2 gene in rice plants, thereby obtaining dwarfed plants compared to wild-type plants. Was successfully created.
  • the present inventors succeeded in isolating a novel GA3-hydroxylase gene from rice, and by suppressing the expression of the gene, the plant type was modified as compared with a wild-type plant. It was found that a plant could be produced.
  • the present invention more particularly,
  • a transformed plant comprising the transformed plant cell according to (6),
  • a method for modifying plant growth which comprises regulating the expression level of the DNA according to (1) in a plant cell,
  • a method for modifying a plant type of a plant which comprises regulating the expression level of MA described in (1) in a plant cell.
  • the present invention provides a novel GA3-hydroxylase isolated from rice and a DNA encoding the enzyme.
  • the nucleotide sequences of the rice GA35-hydroxylase genes 0s3-?-1 and 0s35-2 contained in the DNA of the present invention and isolated by the present inventors are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • the nucleotide sequences of the genomic DNA are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.
  • the amino acid sequences of the "0s3-1" protein and the "0s3? -2" protein are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the “0s35-1” and “0s3-2” proteins from rice are consistent with the previous classification of 3-hydroxyxylase as 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase (2-ODD). And contained all the domains characteristic of plant 2-ODD (Prescott, (1993) J. Exp. Bot. 44, 849-861; de Carolis and Luca, (1994) Photochemistry, 36, 1093 -1107). Of all the published sequences, the coding regions of both clones show the highest homology with GA3-hydroxylase. In particular, the region that may act as a bond between iron and the cofactor 2-oxoglutarate is highly conserved (positions 240-247 and 302-307 in 0s35-1, and 302-307 in 0s3-2).
  • 0s3 -2 corresponds to the D18 gene.
  • the rice dl8 mutant is a GA-responsive dwarf species and has a number of alleles, namely, Hosetsu-waisei, Akibare-waise i, and Kotake-tamanish. tamanishiki) and dwarf-C (Waito-C) have been identified so far (Fig. 2).
  • the 0s35-2 protein is also thought to be involved in plant internode elongation via bioactive GA synthesis.
  • 0s3? -2 mRNA is high in stems, young leaves, and inflorescence meristems, while 0s35-1 mRNA is . in particular it observed in flowers these match, 0S3 -2 and 0s3 -?? 1 products respectively, allowed with substrate specificity for GA 20 and GA 9 Shows the sex.
  • GA biosynthetic genes such as GA1 in Arabidopsis and Nty in tobacco, are , Live It is strongly expressed in developing and evolving tissues, such as stem tips and roots (Silverston e et al. (1997) Plant J. 12, 9-19). This difference suggests that the activity of GA-synthesizing organs may be different between monocots and dicots.
  • endogenous GA 4 levels are extremely high in anthers at the flowering stage (Kobayashi et al. (198 8) Agric. Biol. Chem. 52, 1189-1194, Kobayashi et al. (1990) Plant Cell Ph ysiol.
  • 0s3? -1 protein uses GA 9 as a substrate to produce GA 4 (3-hydroxylated), GA 7 (unsaturated and 3-hydroxylated at positions 2 and 3), and GA 34 (dihydroxylated).
  • Figure 9 GA 2. Similar results were obtained when was used as a substrate. When GA 5 and GA were used as substrates, they produced corresponding 3-hydroxy gibberellins (GA 3 and GA 88 ).
  • the 0s 3 -2 protein produced the corresponding 3 -hydroxy gibberellin (GA 3 , GA 4 , GA ⁇ GA 38 ) using GA 5 , GA 9 , GA 2Q , and GA ⁇ as substrates (GA 3 , GA 4 , GA ⁇ GA 38 ) ( ( Figure 10) (Example
  • the protein of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art as a recombinant protein prepared by using a genetic recombination technique or as a natural protein.
  • a recombinant protein is prepared by inserting a DNA encoding the protein of the present invention (for example, SEQ ID NO: 3 or 4) into an appropriate expression vector, and introducing the vector into an appropriate cell. It can be prepared by purifying from the transformed cells.
  • Natural proteins can be expressed, for example, by expressing the protein of the present invention on an affinity column bound with an antibody prepared by immunizing a suitable immunized animal with the prepared recombinant protein or a partial peptide thereof.
  • the extract can be prepared by contacting an extract prepared from a tobacco or rice tissue or the like and purifying the protein bound to the column.
  • the proteins of the present invention include proteins in which some amino acids have been modified while retaining the function of the wild-type protein (SEQ ID NOs: 1, 2).
  • Methods well known to those skilled in the art for preparing such proteins include, for example, the s: ite-directed mutagenesis method (Kramer, W. & Fritz, H.-J. Oiigonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA. Methods in Enzymology, 154: 350-367, 1987). Amino acid mutations can also occur in nature.
  • the protein of the present invention has a protein in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added and / or inserted in its amino acid sequence while retaining the GA3-hydroxylase activity of the native protein as described above. Is also included. There are no particular restrictions on the amino acid modification site and modification number in the protein, as long as the modified protein has GA35-hydroxylase activity. Amino acid modification is generally within 50 amino acids, preferably 30 amino acids. It is within an acid, more preferably within 10 amino acids, and further preferably within 3 amino acids.
  • the term "GA3 ⁇ -hydroxylase activity” means that when GA20 or GA9 as a reaction substrate is given, GA1 or GA4 is synthesized as a reaction product in the presence of a cofactor iron ion and 2-oxoglutarate. Activity.
  • the activity can be detected, for example, as follows.
  • the obtained cDNA is inserted into an expression vector and overexpressed as a fusion protein in E. coli.
  • the obtained cell extract is used as an enzyme solution, and the reaction is performed in vitro in the presence of GA20 or GA9, which is a reaction substrate, iron ion, which is a cofactor, and 2-oxoglutaric acid.
  • DNA encoding the protein of the present invention includes both cDNA and genomic DNA as long as it can encode these proteins.
  • DNA encoding 0s3?-2 protein or 0s3? -L protein, if it is cDNA may be used as a seedling (rice) using primers designed based on the base sequence information described in SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • Genomic MA can be prepared by performing PCR on rice genomic DNA using a primer designed based on the nucleotide sequence information described in SEQ ID NOS: 5 and 6, respectively.
  • DNAs encoding these proteins of the present invention can be used, for example, for producing recombinant proteins.
  • the production of the recombinant protein can be performed, for example, as follows. First, the full-length cDNA synthesized from RT-PCI is subcloned to the multicloning site of the pMAL-c2 expression vector (NEB) using primers provided with restriction enzyme sites in advance. This construct is transformed into BL21 (protease deficient strain) by a standard method. Protein induction is performed using the transformant thus obtained. E. coli, 2xYT, 0.2% glucose medium Incubate at 37 ° C with shaking.
  • Preparation of the purified protein is performed, for example, by expressing the protein of the present invention in Escherichia coli or the like in a form fused with histidine, maltose-binding protein, and glutathione-S-transferase (GST). It can be carried out by purifying with a Nigel column, an amine column, or a GST-gluthione column. Furthermore, after purification, the above-mentioned evening can be separated using a restriction protease such as thrombin or factor-1Xa, if necessary.
  • GST glutathione-S-transferase
  • the genes isolated by the present inventors are considered to be involved in the growth of plants through the production of biologically active GA. Therefore, by regulating the expression of these genes, the growth of plants can be improved. Can be controlled.
  • Os35-2 is considered to be involved in internode growth of plants, and can be used to control plant height. Controlling plant height has a variety of industrial advantages. ⁇
  • the plant by suppressing the expression of the gene of the present invention in a plant body and reducing the plant height, the plant can be made harder to fall, and as a result, the grain weight can be increased. Also, by reducing the plant height and making the shape of plants per plant more compact, the number of plants that can be planted per unit area can be increased. This has great significance especially in the production of agricultural products such as rice, wheat, and corn.
  • the protein of the present invention The applied MA can be applied to dwarf flowers, dwarf orchards, etc. For 0s3? -L, male sterility may be induced by suppressing the expression in flowers.
  • various methods known to those skilled in the art can be used as a method for suppressing the expression of the gene of the present invention in order to control plant growth.
  • “suppression of gene expression” includes suppression of gene transcription and suppression of protein translation. It also includes a reduction in expression as well as a complete cessation of gene expression.
  • a method for suppressing the expression of a specific endogenous gene in a plant a method using antisense technology is most often used by those skilled in the art.
  • the antisense effect in plant cells was first demonstrated by Ecker et al. Using a transient gene expression method, in which antisense RNA introduced by electroporation exerted an antisense effect in plants (J.R. Ecker and ⁇ W.
  • the action of the antisense nucleic acid to suppress the expression of the target gene has several factors as follows. In other words, inhibition of transcription initiation by triplex formation, suppression of transcription by formation of a hybrid with a site where an open loop structure was locally formed by RNA polymerase, inhibition of transcription by formation of a hybrid with RM that is undergoing synthesis, and inhibition of intron.
  • the antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the above actions.
  • designing an antisense sequence that is complementary to the untranslated region near the 5 'end of the gene mRNA would be effective in inhibiting translation of the gene.
  • sequences complementary to the coding region or the 3 'untranslated region may also be used.
  • the DNA containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the gene is also included in the antisense DNA used in the present invention.
  • the antisense DNA to be used is ligated downstream of a suitable promoter, preferably a sequence containing a transcription termination signal is ligated on the 3 'side.
  • the DNA thus prepared can be transformed into a desired plant by a known method.
  • the sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous gene (or a homologous gene thereof) of the transformed plant or a part thereof, as long as the gene expression can be effectively inhibited. It need not be completely complementary.
  • the transcribed A has preferably 90% or more, and most preferably 95% or more complementarity to the transcript of the target gene.
  • the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, and more preferably 500 bases or more. It is. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
  • Ribozymes include those with a size of 400 nucleotides or more, such as the group I intron type and M1 RNA contained in RNaseP, but have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead-hairpin type. (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 35: 2191, 1990).
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves the 3 'side of C15 of G13U14C15, but it is important for activity that U14 forms a base pair with A at position 9 and base 15 at position 15.
  • Has been shown to be cleaved by A or U in addition to C (M. Koizumi et al., FEBS Lett. 228: 225, 1988).
  • the ribozyme substrate binding region complements the RNA sequence near the target site. If designed, it is possible to create a restriction-enzymatic RNA-cleaving ribozyme that recognizes the sequence UC, UU or UA in the target RNA (M.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purpose of the present invention. Hairpin ribozymes are found, for example, in the negative strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (J. M. Buzayan Nature 323: 349, 1986). It has been shown that this ribozyme can also be designed to cause target-specific A cleavage (Y. Kikuchi and N. Sasaki Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology 30: 112, 1992).
  • Ribozymes designed to cleave the target contain a promoter, such as the 35S promoter of the forceful mosaic virus, to be transcribed in plant cells. Linked to a transcription termination sequence. However, at this time, if an extra sequence is added to the 5 'end or 3' end of the transcribed RNA, ribozyme activity may be lost. In such a case, in order to an additional trimming Ribozaimu portion from the RNA containing the transferred Ribozaimu, 5 Ribozaimu portion, on the side and 3 3 side, another trimming ribonucleic The I acting on cis for performing small rimming (K. Taira et al., Protein Eng. 3: 733, 1990, AMDzianott and J.
  • Co-suppression refers to the phenomenon that when a gene having the same or similar sequence as a target endogenous gene is introduced into a plant by transformation, the expression of both the foreign gene to be introduced and the target endogenous gene is suppressed. Say. Is not a mechanism details clarify the co-suppression, is frequently observed in plants (Curr Biol .7:..
  • the gene of the present invention In order to obtain a co-suppressed plant, the vector of the present invention or a vector DNA prepared so as to express a DNA having a sequence similar thereto may be transformed into a target plant.
  • the gene used for co-suppression need not be completely identical to the target gene, but preferably has a sequence of 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more (eg, 95% or more). Have identity.
  • the DNA is inserted into an appropriate vector, and this is introduced into a plant cell. What is necessary is just to regenerate the obtained transformed plant cell.
  • the vector used is not particularly limited as long as it can express the inserted gene in plant cells.
  • tissue-specific promoters include seed-specific promoters such as kidney bean /?-Phaseolin (Bustos et al. (1991) EMB0 J. 10: 1 469-1479) and soybean glycinin (Lelievre et al. (1992) Plant Physiol.
  • leaf-specific promoters include the Endo RbcS gene (Lam and Chua (1990) Science 248: 471-474) and the wheat Cabl gene (Gotorn et al. (1993) Plant J. 3: 509- 518), as a root-specific promoter, the TobRB7 gene of tobacco (Yamamoto et al. (1991) Plant Cell 3: 371-382)
  • the rolD gene of D. agrobacterium rhizogenes Elmayan and Tepfer (1995) Transgenic Res 4: 388-396) I can do it. It is also possible to use a vector having a promoter which is inducibly activated by an external stimulus.
  • the plant cell into which the vector is inserted is not particularly limited, but rice and tobacco from which the gene isolated according to the present invention is derived are particularly preferable.
  • plant cells used herein includes various forms of plant cells, for example, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and calli.
  • Various methods known to those skilled in the art such as a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation), a method involving agrobacterium, and a particle gun method, can be used to introduce the vector into a plant cell.
  • Regeneration of the plant from the transformed plant cell can be performed by a known method. If a transformed plant is thereby produced, a propagation medium (eg, seeds, tubers, cuttings, etc.) is obtained from the plant, and the transformed plant of the present invention is mass-produced based on the medium. Can be.
  • a propagation medium eg, seeds, tubers, cuttings, etc.
  • the DNA may be inserted into an appropriate vector, introduced into a plant cell, and the resulting transformed plant cell may be regenerated.
  • the vector used for expression in a plant cell, the plant cell into which the vector is introduced, the method of regeneration of a plant, and the like are the same as in the case of using the above-described antisense.
  • GA-responsive dwarf mutants that lack specific GA biosynthetic pathways c, Arabidopsis gal, ga2 s ga3, ga5, and ga4; corn anl, d5, d3, and dl, Endo Is and le, Rice d35 (dx) and dl8 (dy).
  • FIG. 3 is a diagram showing the location of each GA 3 ⁇ -hydroxylase (0s3y5-1 and 0s33-2) gene and various RFLP markers for chromosomes 1 and 5 of rice.
  • FIG. 4 is an electrophoresis photograph showing the results of RFLP analysis of a: D18 and dl8 alleles.
  • DNA is D18 (Shio force Li and autumn weather) and d18 alleles (dl8 h, ldl8 k and d 18 - AD) was isolated from leaf tissue of a plant. The DNA was digested with Apal, separated by electrophoresis, ligated to Nylon Fil, and hybridized. Molecular length markers are shown on the left in kilobases.
  • Genomic clones were derived from screening a genomic library using the PCR product as a probe.
  • the 2.3 kb BglII fragment subclone contains the entire coding region of D18.
  • FIG. 5 is an electrophoretic photograph showing the expression pattern of GA35-hydroxylase in a wild-type ⁇ sa ⁇ 7a plant. 3? -Hydroxylase cDNA D18 and 0s3? -L, SA (stem tip), ST (stem), LB (leaf blade), Ra (leaf axis), FL (flower), YL (young leaf), IFM (inflorescence) This is the result of hybridization with a Northern plot containing 10 ⁇ g of total RNA extracted from meristems) and Sh (2 week old seedlings).
  • FIG. 6 is a photograph showing a transformed plant in which 0s3? -2 (D18) cDNA was constantly expressed in the antisense direction under the control of actin promoter.
  • the photograph on the left is a wild type Nipponbare, the center is a semi-dwarf plant, and the right is a dwarf plant.
  • Figure 7 is a diagram showing pBS-SK +, a plasmid into which full-length cDNA of 0s3? -2 has been inserted.o
  • FIG. 8 is a diagram showing pAct-N0S / Hm2, a plasmid into which the antisense of the 0s3 / 5-2 (D18) gene has been inserted.
  • FIG. 9 is a diagram showing that the fusion protein of Os 3-1 generates GA 4 , GA 7 , and GA 34 when GA 9 is used as a substrate.
  • rice seeds (Oryza sativa ⁇ Japonica type cultivars: “Futatsubare”, “Akibare”, “Shiokari”, and others) are disinfected with l% NaC10 for 1 hour, rinsed with sterile distilled water sufficiently, Germinated in soil and grown in a greenhouse.
  • Example 1 Isolation of cDNA Clone Encoding GA35-Hydroxylase There has been no report of isolation of GA3-?-Hydroxylase from monocotyledonous plants. Some GA3 ⁇ -hydroxylases have been cloned from dicotyledonous plants (Chiang et al., 1995; Martin et al., 1997; Lester et al., 1997).
  • a degenerate primer designed from the conserved region of the reported dicotyledon GA35-hydroxylase sequence using rice genomic MA as type III 5 5 - primer one: 5 5 - GTNGTN AARGTNGGNGMRT-3 '/ SEQ ID NO: 7, 3, primer one: 5, -AYYTMTCRTTGGANGTNAC - 3' / SEQ ID NO: 8) PCR was performed using. As a result, a 210 bp DNA fragment corresponding to the size expected from the reported GA35-hydroxylase sequence was obtained. Next, to isolate a full-length clone, a rice genomic library was screened using this fragment as a probe.
  • RT-PCR was performed using total RNA isolated from seedlings (rice shoot tips) or unopened flowers to obtain cDNA fragments. This resulted in a full-sized cDNA clone encoding GA3? -Hydroxylase.
  • the 0s3? -LcDNA and the 0s3? -2 cDNA each contained an open reading frame encoding a polypeptide of 379 and 373 residues, respectively.
  • the nucleotide sequences of the respective clones are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • the 0s3? -2 genomic DNA contained a single short intron (110 bp), which was located in dicots at the same position as previously reported GA3?
  • 0s3? -L genomic DNA contained two introns. One was located at the same position as the 0s3? -2 genomic DNA, which was approximately the same size (110 bp). The other was at the binding site of the cofactor 2-oxoglutarate (400 bp) (data not shown).
  • the deduced amino acid sequences of both clones showed a high degree of similarity to other GA33-hydroxylases, but they also showed a high degree of similarity to each other (56.6% identity and 88.2% similarity). ).
  • nucleotide sequence was determined by the dideoxynucleotide 'chain' method using an automatic sequencing system (ABI373A). The sequence analysis was performed using GENETYX computer software (Software Kaihatu Co., Japan). [Example 2] Identification and characterization of dl8 allele
  • Quantitative analysis and bioassay on dwarf rice plants indicate that the D18 gene encodes GA35-hydroxylase.
  • the D18 locus has been identified on chromosome 1 and is adjacent to the FS-2 locus at the lower end of this chromosome.
  • To determine that the isolated GA33-hydroxylase clone corresponds to the D18 gene two clones were mapped on the rice genome using RFLP (restriction fragment length polymorphism) analysis.
  • RFLPs of 0s3? -L or 0s33-2 were present between Asaminoli (Japonica rice) and IR24 (Indy rice) DNA digested with EcoRI or Apal, respectively. Linkage analysis was performed on digested genomic DNA from F2 progeny of the cross between Asaminori and IR24. 0s3? -1 and 0s3? -2 map to the upper end of chromosome 5 and the lower end of chromosome 1, respectively ( Figure 3). This result suggests that Os35-2 corresponds to the D18 locus.
  • 0s3-2 is at the D18 locus.
  • dl8 allele AD ldl8 k, ldl8 h and d 18).
  • ldl8 k and ldl 8 h is an isogenic strain of Shiokari system
  • dl8- AD were isolated from Aki Barre mutagenesis by Echirenimin (EI).
  • EI Echirenimin
  • MA gel plot analysis rice genomic DNA (1 ⁇ g per lane) was first digested with restriction enzymes, separated by agarose gel electrophoresis, and transferred to Hybond N + nylon membrane (Amersham) (Sambrook et al. 1989). Hybrida I See Chillon was carried out in 0.25 M Na 2 HP0 4, lm M EDTA and 7% SDS in at 65 ° C. Phil Yuichi 2xSS 0.1% SDS Two 15-minute washes at 65 ° C in water and one 15-min wash at 65 ° C in 0.1 X SS 0.1% SDS.
  • oligonucleotide plug timer one derived from the 5 'and 3' noncoding sequences of D18, amplify 1.6 kb fragment containing the entire coding region from D18, d18 h, d18 k and Dl8- w Then, the amplified fragment was sequenced.
  • the product was modified by the substitution d18-W
  • RNA gel blot analysis was performed to examine the expression of the D18 and 0s3? -1 genes during the growth of plants. did.
  • RNA gel blot analysis use standard methods (Samb Total RNA was prepared from various organs or tissues according to Rook et al., 1989). RNA (10 jug per sample) was separated by gel electrophoresis and transferred to Hybond N + nylon membrane (Amersham). Hybridization was performed at 65 ° C.
  • the D18 gene was expressed in all examined organs (Fig. 5). Expression levels were high in stems, young leaves, and inflorescence meristems, and low in leaf blades and stems. In contrast, 0s3? -L mRNA expression was particularly high in flowers and low in leaf blades and stems.
  • the full-length cDNA of 0s3? -2 has been cloned into the BamHI-HindiII site in PBS-SK + (Fig. 7), and the cDNA was extracted by digestion of the plasmid with BamHI-Hindlll treatment. Later, it was blunt-ended.
  • a vector expressing the antisense of the 0s3? -2 gene was constructed by inserting the blunt-ended full-length cDNA into the Smal site of pAct-NOS / Hm2 (Fig. 8).
  • cDNAs that are predicted to encode proteins were translated into pMAL-c2 expression vectors (New England Biolabs, Beverly, MA) Inserted in the sense orientation as a fusion.
  • the resulting constructs pMAL-Os 3? -1 and pMAL-0s 3? -2 were expressed in E. coli strain JM109.
  • Bacterial cells were shake cultured overnight at 37 ° C. in 2 ⁇ YT medium containing 100 mg / L ampicillin. After the culture, the culture was diluted 100-fold with a fresh 2xYT medium containing 100fflg / L ampicillin, and cultured with shaking at 30 ° C.
  • IPTG was added to a final concentration of ImM, and cultured with shaking at 17 ° C for an additional 18 hours.
  • the bacterial cells are collected, washed with a washing buffer (50 mM Tris-HC1, pH 8.0, 10% [w / v] glycerol, 2 mM DTT), and suspended in a washing buffer containing lysozyme (lmg / ml). It became cloudy and was left still on ice for 30 minutes. The lysate thus obtained was sonicated and centrifuged, and the supernatant was subjected to SDS-PAGE to confirm the expression of the fusion protein.
  • the supernatant was used to incubate with a wide range of gibberellins and cofactors (ascorbic acid, ferrous iron, 2-ketoglutaric acid).
  • this supernatant was purified by a column using amylose resin according to the method described in the catalog, and the same incubation was carried out using this purified protein solution.
  • the metabolized gibberellins were identified using GC-MS.
  • novel proteins and genes involved in the activation of gibberellin in plants and plants in which gibberellin activity in plants is modified by regulating the expression of the genes.
  • the efficiency of the amount of light received from the leaves increases, a significant increase in yield can be expected. It is also possible to improve the efficiency of harvesting and growth management work.
  • the expression of the gene of the present invention in the plant is increased to promote the activation of diperelin in the plant, thereby increasing the yield of the whole plant. This is particularly significant in improving the overall yield of feed crops.

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Description

明細書 ィネ由来のジべレリン 3 水酸化酵素遺伝子およびその利用 技術分野
本発明は、 ジべレリンの生合成に関与するイネ由来の遺伝子および該遺伝子の 利用に関する。 背景技術
多細胞生物は、 集合して機能的単位を形成する多数の専門器官や組織で構成さ れる。 生物の様々な部分の協調は化学伝達物質を通じて行なわれており、 これら 物質に対してホルモンという語が用いられている。 植物ホルモンは、 生長を刺激 したり阻害したりする、 または何らかの生長プログラムを制御するシグナルとし て作用する天然に存在する物質であり、 少量でも非常に有効である。 今日、 一般 に植物ホルモンとして認識されている物質としては、 オーキシン類、 ジベレリン 類、 サイ トカイ二ン類、 ァブシジン酸、 ブラシノライ ド、 およびエチレンが挙げ られる。
動物ではホルモンは、 通常、 特殊な腺で合成され、 血流を通じて生体全体に送 られる。 このようにして、 ホルモンは反応する準備ができている標的や反応組織 に到達し、 特異的な制御プロセスを誘発する。 当初、 動物について展開されたホ ルモンに対するこのような古典的な考え方は、 高等植物に応用された。 多くの場 合、 植物ホルモンは特異的標的組織において活性を示すが、 それらはホルモンが 産生される組織とは異なることが多い。 しかし、 植物ホルモンは全て、 多細胞核 物の多くの部位で検出することができる。 これは、 合成部位と植物ホルモン作用 部位との間にしばしば絶対的な分離がないことを示している。 必要であれば、 ホ ルモンは、 ホルモンが形成される細胞と同じ細胞 （組織） に作用を及ぼすことが 可能である。 このように、 植物ホルモン合成の調節を理解することは、 合成と作 用との関係を決定する上で重要である。
ジベレリン （GA) は、 当初、 1920年代に日本人植物病理学者によって植物毒 素として発見された。 植物病原性真菌であるジペレラ Wibberella fujikuroi) は、 イネ科植物に感染し、 病理的な縦方向の生長を引き起こす化合物を分泌する (馬鹿苗病 ("mad seedling disease") ) 。 1935〜1938年の間にこの化合物は 単離され、 活性物質が結晶化されて、 これを 「ジベレリン」 と呼んだ。 後の研究 によって、 GAが高等植物によっても生成され、 生長の制御と分化プロセスにお いて非常に重要であることが示された。
1992年までに同定された約 80個の GAの基本構造は、 ェント ·ジべレラン （e nt-gibberellan) の 4環式系である （図 l a) 。 GAは、 主にメバロン酸からゲラ ニルゲラニルピロ燐酸の環状化を通じて生成されるジテルぺノィ ドカルボン酸を 含むが （図 l b) 、 そのほとんどは植物の生長促進には不活性である。 多くの植 物において、 植物生長制御物質として作用する生物学的に活性な GAは、 お よび GA4である。 それらは、 種子の発芽、 茎の伸長、 開花そして結実などの様々 な生長プロセスを調節することができる。 このため、 GAの生合成を改変するこ とで、 産業上有用な様々な改変植物を作出することが可能であると考えられる。 環境刺激のメデイエ一夕としての GAの役割は、 十分に確立されている。 光や 温度のような物理的要因は、 代謝経路の特定の段階を通じて、 その流量を変化さ せることにより GA代謝を修飾することができる。 例えば、 光の性質 （赤色また は赤外線） と強度 （強いまたは弱い） は、 GA生合成に影響を及ぼす。 レタスの 種子やササゲの上胚軸では、 GA2。の 3 5ヒドロキシル化は、 遠赤色線による処 置によって増強される (Toyumasu et al. (1992) Plant Cell Physiol. 33, 695- 701) 。 さらに、 エンドゥの実生を低放射度 （40 imol/m2 · s) で生長させると、 GA2 0含量は、 高放射度 （386 mol/m2 · s) で生長する植物と比較して 7倍増加 するが、 暗所で生長させた植物の GA2 0含量は高放射度の場合の含量へと減少す る (Gawronska et al . (1995) Plant Cell Physiol.36, 1361-1367) 。
フィ トクロムや光の強度による生長速度の変化と GA代謝との閧係を解明しよ うとした試みは数多く為されてきたが、 それを支持する証拠はいまだ乏しい。 こ れらの制御プロセスの基礎となるメ力ニズムは、 GA生合成の分子生物学におけ る現在の進歩の結果として理解されるであろう。
また、 少なからぬ努力にも関わらず生物活性 GAの合成部位と特定の細胞や組 織におけるそれらの作用様式は明らかにされていない。 植物に1 4 C-標識 GAを加 えた実験から、 それらは植物の中を非極性的に移動すると考えられている。 最近、 矮性のェンドウ植物と野生型のェンドウ植物の接木実験から、 生物活性 GAであ る が、 その前駆体である GA2 0とは異なり輸送されないことが示された （Pro ebsting et al . ( 1992) Plant Physiol.100, 1354-1360、 Reid et al. ( 1983) J. Exp. Bot.34, 349-364) 。 矮性エンドゥ植物について GC- MSとバイオアツセィを用 いた定量的分析から、 GAが主に茎端、 若葉そして花のような活発に生長伸長し つつある組織に存在することが明らかになった （Jones and Phillips ( 1996 ) PI ant Physiol. 1, 1381-1386, Potts et al . (1982) Physiol. Plant, 55, 323-328, Kobayashi et al. ( 1988) Agric. Biol . Chem.52, 1189-1194) 。 しかし、 ほとんど の GAはごく少量しか存在せず、 ほとんどが生物活性でないため、 特定の組織に 存在する各 GAの正確な量は測定することが難しい。 したがって、 生物活性 GAの 合成部位を明らかにするためには、 新しいアプローチが必要である。
分子生物学と遺伝子戦略の進歩に伴って、 現在では、 GA生合成酵素をコード する遺伝子のほとんどが様々な植物種からクローニングされている。 これらの試 験から、 それそれの GA反応性矮性変異体が GA生合成酵素を欠損することが示さ れた （図 lb) 。 その発現プロフィールは、 経路が生長時に厳密に制御されてい ることを示している。 これらの遺伝子のうち、 GA生合成の初期に活性な酵素で あるコパリル 2燐酸シン夕一ゼ （CPS) をコードするシロイヌナズナの GA1は、 例えば、 茎端、 根端そして花などの急速に生長しつつある組織において高度に発 現されている (Silverstone et al. (1997) Plant J. 12, 9-19) 。 GA生合成経 路の後期段階を触媒し、 小さい遺伝子ファミリーを構成する GA C-20ォキシダ一 ゼは、 生長のために GAが必要であるシロイヌナズナ、 エンドゥそしてインゲン の茎や生長しつつある種子に特異的に発現し、 それらは GA3処理によって負の制 御を受ける (Phillips et al. ( 1995) Plant Physiol. 108, 譲- 1057、 Garcia -Martinez et al. (1997) Plant Mol.Biol. 33, 1073-1084) 。
これらの観察により、 本発明者らは、 様々な器官における GAの作用は存在す る内因性 GAの量に依存し、 内因性 GA量は、 生物活性 GAの GA作用部位への移動 ではなくて、 GA生合成酵素の発現の制御に依存するのではないかと推測するに 至った。 しかし、 生物活性 GAは、 GA3 ?-ヒドロキシラーゼによって触媒される 3 5ヒドロキシル化によって合成されるため、 CPSまたは GA C- 20ォキシダーゼ の発現を分析しても、 生物活性 GAの合成部位や生物活性 GA量の制御に関する直 接的な証拠は得られないと考えた。
上記のように、 3 ?-ヒドロキシラーゼは、 生物活性 GA生成の最終段階でそれ それ、 GA2 0と GA9の と GA4への変換を触媒する （図 lb) 。 3 ?-ヒドロキシラ —ゼの酵素学はまだ完全には解明されていないが、 2-ォキソグルタル酸結合領域 がその活性に必須であり、 このことは ヒドロキシラーゼが 2-ォキソグル タル酸依存的ジォキシゲナーゼの典型的な特性を有することを示している。 特定 の GA3 ^ヒドロキシラーゼは多機能性である可能性があり、 カボチヤの胚乳は、 2 /5と 3 ?の双方のヒドロキシル化を触媒する （Lange et al. ( 1997) Plant Ce 11, 9, 1459-1467) 。 トウモロコシ矮性体の 1 , 3 ?ヒドロキシラーゼもまた、 多機能性であると考えられており、 トウモロコシ GA生合成経路における 3つの ヒドロキシル化段階を触媒する (Spray et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 10515-10518) 。 しかし、 これらの GA 3 5ヒドロキシラーゼの本質はまだ十分 に解明されていない。 発明の開示
本発明は、 イネ由来の新規な GA 3 ? -ヒドロキシラーゼ遺伝子およびその利用、 特に草型が改変された植物体の作出のための該遺伝子の利用を提供する。
本発明者等は、 イネ由来の ヒドロキシラーゼ遺伝子を単離するために、 まず、 双子葉植物の GA3 ヒドロキシラ一ゼの保存領域を基に設計した縮重プ ライマ一を用いて、 イネのゲノム MAを錶型に PCRを行なった。 次いで、 これに より得られた GA3 ? -ヒドロキシラーゼをコ一ドするゲノム DNA断片をプロ一ブ としてイネのゲノムライブラリのスクリーニングを行ない、 いくつかのクロ一ン を得た。 これらのゲノムクローンを制限マップに基づいて 2群に分類し、 各群の 中の 1つにつき完全に塩基配列の決定を行なった。 その結果、 本発明者等は、 こ れらクローンが、 それそれイネの GA3 ?-ヒドロキシラーゼをコ一ドしているこ とを見出した。
次ぎに、 各クローンの配列に基づき、 cDNA断片を得るために、 実生 （イネの 茎端） または未開の花から単離した総 RNAを用いて RT-PCRを実施した。 これに より、 GA3 ?-ヒドロキシラーゼをコードする完全な大きさの cDNAクローンを得 た （それそれのクローンを 「0s3 ?- 1」 と 「0s3 ?- 2」 と名付けた） 。 さらに、 本 発明者等は、 得られたゲノム MAの配列を基に設計したプライマ一を用いて、 ィ ネの実生 （茎端） または未開の花から単離した総 RNAを錶型に逆転写 PCR (RT-P CR) を行ない、 完全なイネ GA3 ?-ヒドロキシラーゼをコードする cDNAクローン を取得することに成功した。
ィネにおいては GA反応性の矮性種として dl8変異体が知られているため、 本 発明者等は、 単離されたイネ GA3 ?-ヒドロキシラーゼクローンが D18遺伝子に 対応するか否かの検討を行なった。 RFLP (制限断片長多型） 分析および dl8対立 遺伝子の塩基配列の直接的な分析を行なった結果、 単離した 2つのィネ遺伝子の うち、 0s3 3- 2遺伝子が dl8変異の原因となる遺伝子であることが判明した。 ま た、 0s3 ?-2遺伝子との発現部位の相違から、 0s3 ?-lタンパク質が 0s3 ?-2夕 ンパク質と生物活性 GAの異なる経路に関与していることが示唆された。
さらに、 本発明者等は、 0s35-2遺伝子に対するアンチセンス DNAを利用して、 イネ植物体における Os35 -2遺伝子の発現を抑制することにより、 野生型植物体 と比較して矮性化した植物体を作出することに成功した。
即ち、 本発明者等は、 イネから新規な GA3 ?-ヒドロキシラーゼ遺伝子を単離 することに成功し、 さらに該遺伝子の発現を抑制することで野生型植物体と比較 して草型が改変された植物体を作出し得ることを見出した。
本発明は、 より詳しくは、
( 1) ジベレリン 3 5水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする、 下記 (a) から （c) のいずれかに記載の DNA、
(a) 配列番号： 1または 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコ一 ドする DNA、
(b) 配列番号： 3または 4に記載の塩基配列のコ一ド領域を含む DNA、
(c) 配列番号： 1または 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数の アミノ酸が置換、 欠失、 付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなる夕 ンパク質をコードする DNA、
(2) ( 1) に記載の DNAまたはその転写産物と相補的なアンチセンス RNAを コードする DNA、
(3) (1) に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有 する RNAをコードする DNA、
(4) 植物細胞における発現時に、 共抑制効果により、 内因性の （ 1) に記載 の MAの発現を抑制する RNAをコ一ドする MA、
(5) (1) から （4) のいずれかに記載の DNAを含むベクター、
(6) (1) から （4) のいずれかに記載の DNAを発現可能に保持する形質転 換植物細胞、 (7) (6) に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
(8) (7) に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
(9) (1) に記載の DNAによりコードされるタンパク質、
(10) ( 1 ) に記載の DNAを発現可能に保持する形質転換細胞を培養し、 該 細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、
(9) に記載のタンパク質の製造方法、
( 1 1) 植物細胞内において （ 1) に記載の DNAの発現量を調節することを特 徴とする、 植物の生長を改変する方法、
( 12) 植物細胞内において （1) に記載の MAの発現量を調節することを特 徴とする、 植物の草型を改変する方法、 を提供するものである。
本発明は、 イネから単離された、 新規な GA3 ?-ヒドロキシラーゼおよび該酵 素をコードする DNAを提供する。 本発明の DNAに含まれる、 本発明者らにより単 離されたイネ由来の GA 3 5 -ヒドロキシラーゼ遺伝子 0s3 ? -1および 0s35 - 2の cDNAの塩基配列をそれそれ配列番号： 3および 4に、 ゲノム DNAの塩基配列を それそれ配列番号： 5および 6に示す。 また、 「0s3 - 1」 タンパク質および 「0 s3 ?- 2」 タンパク質のアミノ酸配列をそれそれ配列番号： 1および 2に示す。 イネ由来の 「0s35- 1」 タンパク質および「0s3 ?-2」 タンパク質は、 3 ?ヒド 口キシラ一ゼの 2-ォキソグルタル酸依存的ジォキシゲナ一ゼ （2- ODD) としての これまでの分類と一致して、 植物の 2- ODDに特徴的な全てのドメインを含んでい た (Prescott, (1993) J.Exp.Bot. 44， 849-861； de Carolis and Luca, (1994) Photochemistry， 36, 1093-1107) 。 公表された全ての配列の中で、 双方のクロ ーンのコード領域は GA3 ?-ヒドロキシラーゼと最も高い相同性を示す。 特に、 鉄と共因子である 2-ォキソグルタル酸の結合として作用する可能性がある領域 は、 高度に保存されている （0s35- 1では 240~247位と 302〜307位、 0s3 ?-2 では 222〜229位と 285〜290位） 。 それらはまた、 GA3 ?-ヒドロキシラ一ゼ （0 s33- 1では 144~150位、 0s3 ?- 2では 127〜133位） に独自の保存モチーフ （Me t-Trp-X-Glu-Gly-X-Thr) を有する。 双子葉植物の GA3 ?-ヒドロキシラーゼやそ の他のジォキシゲナーゼとの配列の比較から、 本発明者等により単離されたクロ —ンは、 イネの GA3 ?-ヒドロキシラーゼをコードしていると考えられる。
0s3 ?-2のマッピングとゲノムサザン分析から、 0s3 ?-2が D18遺伝子に対応 することが示された。 イネの dl8変異体は GA反応性の矮性種であり、 多数の対 立遺伝子、 すなわち豊雪-矮性 （Hosetu- waisei) 、 秋晴-矮性 (Akibare-waise i) 、 小丈-玉錦 （Kotake- tamanishiki) 、 そして矮稲- C (Waito-C) 、 がこれま でに確認されている （図 2) 。 0s35-2タンパク質もまた、 生物活性 GA合成を 介して、 植物の節間伸長に関与していると考えられる。
様々な生長段階で異なる器官における内因性 GA量に関する分析から、 13-ヒド ロキシジベレリン （GAig、 GA20、 GA は栄養生長器官では優性であるが、 非 1 3-ヒドロキシル化ジベレリン （GA24、 GAg、 GA4) は再生生長器官、 特に葯に蓄 積することが明らかになつている。 このことは、 生物活性 GAの生合成経路が器 官特異的であることを示している (Kurogouchi et al. (1979) Planta, 146, 18 5-191、 Kobayashi et al. (1984) Agric.Biol.Chem. 48, 2725-2729、 Kobayashi et al. (1988) Agric.Biol.Chem. 52, 1189-1194) 。 0s3 ?-2 (D18) と 0s33- 1の発現パターンはこの推測と一致する。 実際、 0s3 ?-2 mRNAは茎、 若葉、 そし て花序分裂組織において高く、 0s35- 1 mRNAは花において特に認められた。 こ れらの一致は、 0s3 ?-2と 0s3 ?- 1の産物がそれぞれ、 GA20と GA9に対する基質 特異性を有する可能性を示している。
0s3^-2と 0s3 ?- 1の発現はまた、 イネにおける生物活性 GAの分布とも一致 する。 育種分析と定量的分析により、 は、 ジベレリン生合成の最も活発な部 位である若葉組織では高く (Choi et al. (1995) Physiol. 36(6), 997-1001)、 0s35 -2の最も高い発現も若葉において認めた。 興味深いことに、 茎端における 0s3 ?-2の発現は他の器官と比較して中等度のレベルであるが、 それにも関わら ず、 シロイヌナズナの GA1やタバコの Ntyなどの多くの GA生合成遺伝子は、 活 発に分裂伸長しつつある組織、 例えば茎端と根に強く発現している （Silverston e et al. (1997) Plant J. 12, 9-19) 。 この相違は、 GAを合成する器官活性が 単子葉植物と双子葉植物では異なる可能性があることを示唆している。 一方、 内 因性の GA4量は、 開花段階での葯において非常に高く （Kobayashi et al. (198 8) Agric.Biol.Chem. 52, 1189-1194、 Kobayashi et al. (1990) Plant Cell Ph ysiol. 31(2), 289-293) 、 この事実は花における 0s3 ?- 1の特異的発現とよく 一致する。 この一致は (^4が 0s3^-l夕ンパク質の作用により葯において合成さ れることを示しているのかも知れない。 従って、 0s3y5- 2タンパク質と 0s33-l 夕ンパク質は、 生物活性 GAの異なる経路に関係している可能性がある。
実際、 0s3 ?- 1タンパク質は GA9を基質として、 GA4 (3 ?水酸化） 、 GA7 (2, 3位の不飽和化および 3 水酸化） 、 GA34 (2 水酸化） を生成し （図 9) 、 GA2。 を基質とした場合にも同様な結果が得られた。 また GA5、 GA を基質とした時に はそれそれに対応する 3 ?水酸化ジベレリン （GA3、 GA88) を生成した。 また、 0s 3 ?- 2タンパク質は、 GA5、 GA9、 GA2Q、 GA^を基質として、 それぞれに対応する 3 ?水酸化ジベレリン （GA3、 GA4、 GA^ GA38) を生成した （図 1 0) (実施例
5) o
生物活性 GAが、 茎の伸長のみならず、 他の様々な植物生長過程に必要である ことに関しては、 その他いくつかの報告例がある。 例えば、 花の器官に関しては、 シロイヌナズナの GA欠損変異体である gal- 3が雄性不稔表現型を示すという報 告 (Koornneef and Van der Veen, (1980) Theor.Appl. Genet. 58, 257-263) や トマトの stamenless- 2や gib-1が、 初期段階で葯の生長を停止し、 生存花粉粒 を形成しないという報告 (Sawhney, (1974) J.Exp.Bot. 25， 1004-1009、 Jacobs en and Olszewski, (1996) Proc. atl. Acad. Sci. 93， 9292-9296) がなされてい る。
本発明のこれらタンパク質は、 いずれも生物活性 GAの生成に関与していると 考えられるため、 生物活性 GAの製造に用いることが可能である。 また、 後述す るように、 植物体内においてこれらタンパク質の発現量を調節することにより、 植物の生長を改変させ、 例えば、 野生型とは異なる草型の植物体を製造すること も可能である。
本発明のタンパク質は、 当業者に公知の方法により、 遺伝子組み換え技術を利 用して調製した組み換えタンパク質として、 また天然の夕ンパク質として調製す ることができる。 組み換えタンパク質は、 後述するが、 例えば、 本発明のタンパ ク質をコードする DNA (例えば、 配列番号： 3、 4 ) を適当な発現ベクターに揷 入し、 該ベクターを適当な細胞に導入し、 該形質転換細胞から精製することによ り調製することが可能である。 また、 天然のタンパク質は、 例えば、 調製した組 み換えタンパク質若しくはその部分ペプチドを適当な免疫動物に免疫することに より調製した抗体を結合したァフィ二ティ一カラムに、 本発明のタンパク質を発 現しているタバコやイネの組織などから調製した抽出液を接触させて、 該カラム に結合するタンパク質を精製することにより調製することができる。
本発明のタンパク質には、 野生型タンパク質 （配列番号： 1、 2 ) の機能を保 持したまま、 その一部のアミノ酸を改変したタンパク質が含まれる。 このような タンパク質を調製するための当業者によく知られた方法としては、 例えば、 s:ite - directed mutagenesis法 (Kramer, W.& Fritz,H. - J. Oiigonucleotide-direct ed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA. Methods in Enzymolo gy, 154: 350-367, 1987) が挙げられる。 また、 アミノ酸の変異は自然界におい て生じることもある。 本発明のタンパク質には、 このように天然型のタンパク質 の GA3 ?-ヒドロキシラーゼ活性を保持したまま、 そのアミノ酸配列において 1 もしくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 付加および/または挿入されたタンパク 質も含まれる。 タンパク質におけるアミノ酸の改変部位および改変個数は、 改変 後のタンパク質が GA3 5 -ヒドロキシラーゼ活性を有する限り、 特に制限はない。 アミノ酸の改変は、 一般的には、 50アミノ酸以内であり、 好ましくは 30ァミノ 酸以内であり、 さらに好ましくは 10アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 3 アミノ酸以内である。
本発明において 「GA3 ^ -ヒドロキシラーゼ活性」 とは、 反応基質である GA20 または GA9を与えた際に、 補因子である鉄イオン、 2ォキソグルタル酸の存在下 で GA1または GA4を反応生成物として合成する活性を指す。 該活性は、 例えば、 次ぎにようにして検出することができる。 一般的には、 発現べクタ一に得られた cDNAを挿入し、 融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させる。 その結果、 得られる細胞抽出液を酵素液として、 反応基質である GA20または GA9、 および 補因子である鉄イオン、 2ォキソグルタル酸の存在下で反応を in vitroで行な わせ、 最終的に反応生成物 （GA1または GA4) を GC- MSによって確認する。
本発明においては、 これらタンパク質をコードする cDNAおよびゲノム DNAが 単離された。 従って、 本発明のタンパク質をコードする DNAには、 これらタンパ ク質をコードしうる限り、 cDNAおよびゲノム DNAの双方が含まれる。 0s3 ?- 2夕 ンパク質や 0s3 ?-lタンパク質をコードする DNAは、 cDNAであれば、 それそれ 配列番号： 3および 4に記載の塩基配列情報を基に設計したプライマーを用い、 実生 （イネの茎端） または未開の花から単離した総 RNAを錶型とした逆転写 PCR を行なうことにより調製することができる。 また、 ゲノム MAは、 それぞれ配列 番号： 5および 6に記載の塩基配列情報を基に設計したプライマ一を用い、 イネ のゲノム DNAを錶型に PCRを行なうことにより調製することができる。
これら本発明のタンパク質をコードする DNAは、 例えば、 組換えタンパク質の 製造に用いることができる。 組換えタンパク質の製造は、 例えば、 下記のように して行なうことができる。 まず、 pMAL- c2発現べクタ一 （NEB社） のマルチクロ —ニングサイ トに対し、 予め制限酵素サイ トを設けたプライマーを用いて RT - PC I こより合成した全長 cDNAをサブクロ一ニングする。 この構築物を、 定法によ り、 BL21 (プロテア一ゼ欠失株） に形質転換する。 これにより得られる形質転換 体を用いてタンパク質の誘導を行う。 大腸菌は、 2xYT、 0.2%グルコースの培地 で 37°C振とう培養する。 0D6TOが 0.6前後になったところで、 IPTGを最終濃度 lm Mとなるように加え、 更に 18°Cで 24時間培養する。 酵素液の抽出に関しては、 培養後、 集菌し、 これを suspend buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0, 10%グリセ口 —ル， 2IDM DTT， lmg/ffll リゾチーム〉に溶かす。 懸濁液を 4 °Cにて 30分放置後、 - 80°Cにて、 凍結するまでインキュベートする。 凍結した懸濁液を解凍し、 SONIC AT0R(HEAT SYSTEMS-ULTRASONICS, INC. MODEL W- 225R)を用いて、 AXレベルにて、 30秒間、 5分のイン夕一バルをおき、 2回超音波処理を行う。 処理した懸濁液を 遠心 a5，000rpm, 4°C, 20分） し、 その上清を粗酵素液とすることができる。 また、 精製タンパク質の調製は、 例えば、 本発明のタンパク質をヒスチジン夕 グ、 マルト一ス結合タンパク質、 グル夕チオン- S-トランスフェラーゼ （GST) と 融合した形態で大腸菌などで発現させ、 これをそれそれニヅケルカラム、 アミ口 —スカラム、 GST-グル夕チオンカラムにて精製することにより行なうことができ る。 さらに、 精製後は、 必要に応じて、 スロンビンやファクタ一 Xaなどの制限 プロテア一ゼを利用して上記夕グを切り離すこともできる。
上記したように、 本発明者等により単離された遺伝子は、 生物活性 GAの生産 を通じて植物の生長に関係していると考えられ、 従って、 これら遺伝子の発現を 調節することにより、 植物の成長を制御することができると言える。 特に Os3 5 - 2は、 植物の節間の生長に関与していると考えられるため、 植物の草丈の制御 などに利用することができる。 植物の草丈を制御することには、 産業上の種々の 利点が存在する。 ·
例えば、 植物体内における本発明の遺伝子の発現を抑制して、 草丈を減少させ ることにより、 植物を倒れにくくすることができ、 その結果、 子実重量を増加さ せることが可能となる。 また、 草丈を減少させ、 1株あたりの植物体の形をより コンパクトにすることにより、 単位面積あたりに作付できる植物体の個体数を増 加させることができる。 このことは、 特に、 イネをはじめ、 ムギ、 トウモロコシ などの農作物の生産において大きな意義を有する。 また本発明のタンパク質をコ ードする MAは、 矮性花卉などへの応用、 矮性果樹などへの応用も考えられる。 0s3 ?-lに関しては、 花における発現を抑制することにより、 雄性不稔形質を誘 導できる可能性がある。
一方、 植物体内における本発明の遺伝子の発現を増加させて、 草丈を増加させ ることにより、 植物体全体の収量を増加させることも考えられる。 このことは、 特に、 飼料用作物全体の収穫量を向上させる上で有意義である。
本発明において、 植物の生長を制御するために、 本発明の遺伝子の発現を抑制 する方法としては、 当業者に公知の種 °々の方法を用いることができる。 ここで 「遺伝子の発現の抑制」 には、 遺伝子の転写の抑制、 タンパク質への翻訳の抑制 が含まれる。 また、 遺伝子発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。 植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、 アンチセン ス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。 植物細胞におけるァ ンチセンス効果は、 エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、 電気穿孔法で導 入したアンチセンス RNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初め て実証した（ J . R . Eckerおよび ϋ . W . Davi s , Proc . Nat 1. Acad . USA .83： 5372， 1986 )。 その後、 タバコやペチュニアにおいても、 アンチセンス RNAの発現によって標的 遺伝子の発現を低下させる例が報告されており（A.R.van der Krolら Nature 33 3:866， 1988)、 現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立し ている。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、 以下のような 複数の要因が存在する。 すなわち、 三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメ ラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイプリヅド形成 による転写抑制、 合成の進みつつある RMとのハイプリヅド形成による転写阻害、 ィントロンとェキソンとの接合点でのハイプリヅド形成によるスプライシング抑 制、 スプライソゾーム形成部位とのハイブリツド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイプリヅド形成による核から細胞質への移行抑制、 キヤヅピング部 位やポリ（A)付加部位とのハイブリツド形成によるスプライシング抑制、 翻訳開 始因子結合部位とのハイプリッド形成による翻訳開始抑制、 開始コドン近傍のリ ポソ一ム結合部位とのハイブリヅド形成による翻訳抑制、 mRNAの翻訳領域ゃポ リソーム結合部位とのハイプリッド形成によるべプチド鎖の伸長阻止、 および核 酸とタンパク質との相互作用部位とのハイプリッド形成による遺伝子発現抑制な どである。 これらは、 転写、 スプライシング、 または翻訳の過程を阻害して、 標 的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上 「新生化学実験講座 2核酸 IV遺伝 子の複製と発現」 ，日本生化学会編,東京化学同人 , pp.319- 347, 1993)。
本発明で用いられるアンチセンス配列は、 上記のいずれの作用で標的遺伝子の 発現を抑制してもよい。 一つの態様としては、 遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻 訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻訳阻害に効果的で あろう。 しかし、 コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用 し得る。 このように、 遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセ ンス配列を含む DNAも、 本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。 使用 されるアンチセンス DNAは、 適当なプロモ一夕一の下流に連結され、 好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 このようにして調製された D NAは、 公知の方法で、 所望の植物へ形質転換できる。 アンチセンス DNAの配列 は、 形質転換する植物が持つ内在性遺伝子 （若しくはその相同遺伝子） またはそ の一部と相補的な配列であることが好ましいが、 遺伝子の発現を有効に阻害でき る限り、 完全に相補的でなくてもよい。 転写された Aは、 標的とする遺伝子の 転写産物に対して好ましくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以上の相補性を有 する。 アンチセンス配列を用いて、 効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、 アンチセンス DNAの長さは、 少なくとも 15塩基以上であり、 好ましくは 100塩 基以上であり、 さらに好ましくは 500塩基以上である。 通常、 用いられるアンチ センス DNAの長さは 5kbよりも短く、 好ましくは 2.5kbよりも短い。 内在性遺伝子の発現の抑制は、 また、 リボザィムをコードする DNAを利用して 行うことも可能である。 リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいう c リボザィムには種々の活性を有するものがあるが、 中でも RNAを切断する酵素と してのリボザィムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザィ ムの設計が可能となった。 リボザィムには、 グループ Iイントロン型や、 RNaseP に含まれる M1RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、 ハン マ—へッド型ゃヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有 するものもある（小泉誠および大塚栄子，蛋白質核酸酵素， 35 :2191，1990)。
例えば、 ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C1 5の 3'側を切断するが、 活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要 とされ、 15位の塩基は Cの他に Aまたは Uでも切断されることが示されている (M.Koizumiら， FEBS Lett.228 :225, 1988) 0 リボザィムの基質結合部を標的部位 近傍の RNA配列と相補的になるように設計すれば、 標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することが可 能である（M.Koizumi ら， FEBS Lett. 239 :285, 1988, 小泉誠および大塚栄子，蛋白 質核酸酵素， 35 :2191， 1990， M.Koizumiら， ucleic Acids Res. 17: 7059, 1989)。 本発明者等により単離された Nty遺伝子、 0s3^- 1遺伝子、 0s3;5- 2遺伝子 （配 列番号： 3、 4 ) 中にはリボザィムの標的となりうる部位が多数存在する。
また、 ヘアピン型リボザィムも、 本発明の目的のために有用である。 ヘアピン 型リボザィムは、 例えばタバコリングスポットウィルスのサテライ ト RNAのマイ ナス鎖に見出される（J.M.Buzayan Nature 323: 349, 1986)。 このリボザィムも、 標的特異的な A切断を起こすように設計できることが示されている（Y.Kikuchi および N. Sasaki Nucleic Acids Res. 19:6751, 1992, 菊池洋,化学と生物 30 : 1 12，1992)。
標的を切断できるよう設計されたリボザィムは、 植物細胞中で転写されるよう に力リフラヮ一モザイクウィルスの 35Sプロモーターなどのプロモーターおよび 転写終結配列に連結される。 しかし、 その際、 転写された RNAの 5'末端や 3'末 端に余分な配列が付加されているとリボザィムの活性が失われてしまうことがあ る。 このようなとき、 転写されたリボザィムを含む RNAからリボザィム部分だけ を正確に切り出すために、 リボザィム部分の 5，側や 33側に、 小リミングを行う ためのシスに働く別のトリミングリボザィムを配置させることも可能である（K. T airaら， Protein Eng. 3:733, 1990, A.M.Dzianottおよび J.Bujarski Proc.N atl. Acad. Sci . USA. 86 :4823, 1989, A. Grosshansおよび R. T. Cech Nucleic Aci ds Res. 19:3875, 1991, K.Tairaら Nucleic Acids Res. 19 :5125, 1991 )。 ま た、 このような構成単位をタンデムに並べ、 標的遺伝子内の複数の部位を切断で きるようにして、 より効果を高めることもできる（N.Yuyamaら Biochem. Biophys. Res . Commun.186： 1271， 1992 )。 このようなリボザィムを用いて本発明で標的とな る遺伝子の転写産物を特異的に切断し、 該遺伝子の発現を抑制することができる 内在性遺伝子の発現の抑制は、 さらに、 標的遺伝子配列と同一もしくは類似し た配列を有する DNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成され うる。 「共抑制」 とは、 植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を 有する遺伝子を形質転換により導入すると、 導入する外来遺伝子および標的内在 性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。 共抑制の機構の詳細は明 らかではないが、 植物においてはしばしば観察される（Curr. Biol .7:R793， 1997， Curr. Biol.6 :81031996 ) o 例えば、 本発明の遺伝子が共抑制された植物体を得る ためには、 本発明の遺伝子若しくはこれと類似した配列を有する DNAを発現でき るように作製したべクタ一 DNAを目的の植物へ形質転換すればよい。 共抑制に用 いる遺伝子は、 標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、 好ましくは 70% 以上、 さらに好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上 （例えば、 95% 以上） の配列の同一性を有する。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるァルゴリズ ム BLAST(Proc. Natl . Acad. Sei. USA 90: 5873-5877, 1993)によって決定する ことができる。 このアルゴリズムに基づいて、 BLASTNや BLASTXと呼ばれるプロ グラムが開発されている（Altschul et al. J. Mol. Biol.215 :403-410, 1990)。 BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、 パラメ一夕一 はたとえば score二 100、 wordlength = 12とする。 また、 BLASTに基づいて BLA STXによってアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメ一夕一はたとえば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合 には、 各プログラムのデフォルトパラメ一夕一を用いる。 これらの解析方法の具 体的な手法は公知である（http： //www.ncbi . nlm. nih. gov. )。
本発明の遺伝子の発現を抑制する機能を有する DNAを利用して、 植物の生長を 改変するためには、 該 DNAを適当なベクターに挿入して、 これを植物細胞に導入 し、 これにより得られた形質転換植物細胞を再生させればよい。 用いられるべク 夕一としては、 植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば 特に制限はない。
例えば、 本発明者等により単離された遺伝子のプロモーターを用いることが可 能である。 また、 植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター (例えば、 カリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーター） を有するベクタ 一を用いることが可能である。 また、 植物の組織特異的なプロモー夕一を用いれ ば、 植物の特定の組織、 例えば、 葉や花、 実などを特異的に改変させることが可 能であるかもしれない。 組織特異的プロモー夕一としては、 種子特異的プロモー 夕一としてインゲンマメの/?ーファセォリン （Bustosら （1991) EMB0 J. 10:1 469-1479) やダイズのグリシニン (Lelievreら (1992) Plant Physiol. 98:387 -391) 、 葉特異的プロモーターとしてはエンドゥの RbcS遺伝子 （Lam and Chua (1990) Science 248:471-474) やコムギの Cabl遺伝子 （Gotornら (1993) Plan t J. 3:509-518) 、 根特異的なプロモ一夕一としてはタバコの TobRB7遺伝子 （Y amamotoら （1991) Plant Cell 3 :371-382) ゃァグロバクテリゥム · リゾゲネス の rolD遺伝子 （Elmayan and Tepfer (1995) Transgenic Res 4:388-396) が挙 げられる。 また、 外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモータ一を有する ベクターを用いることも可能である。
ベクタ一を挿入する植物細胞としては、 特に制限はないが、 本発明等により単 離された遺伝子が由来するイネやタバコが特に好ましい。 なお、 ここでいう 「植 物細胞」 には、 種々の形態の植物細胞、 例えば、 懸濁培養細胞、 プロトプラスト、 葉の切片、 カルスなどが含まれる。 植物細胞へのベクタ一の導入は、 ポリエチレ ングリコール法、 電気穿孔法 （エレクト口ポーレーシヨン） 、 ァグロバクテリウ ムを介する方法、 パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いるこ とができる。 形質転換植物細胞からの植物体の再生は公知の方法により行なうこ とが可能である。 これにより形質転換植物体が作出されれば、 該植物体からその 繁殖媒体 （例えば、 種子、 塊茎、 切穂など） を得て、 これを基に本発明の形質転 換植物体を量産することができる。
また、 本発明においては、 本発明者らにより単離された DNAの発現を促進する ことで、 植物の生長を増大させることも可能であるかもしれない。 この場合、 該 DNAを適当なベクターに挿入して、 これを植物細胞に導入し、 これにより得られ た形質転換植物細胞を再生させればよい。 植物細胞内で発現させるために利用さ れるベクター、 ベクタ一の導入される植物細胞、 植物体の再生などの方法は、 上 記アンチセンスなどを用いる場合と同様である。 図面の簡単な説明
図 1は、
a：ジべレリン （ェント ·ジべレリン） の一般構造を示す図である。
b：高等植物における主要な GA生合成経路を示す図である。
ィタリック体は、 特異的 GA生合成経路を欠損する GA反応性矮性変異体を示す c それぞれ、 シロイヌナズナの gal、 ga2s ga3、 ga5、 そして ga4 ; トウモロコシの anl、 d5、 d3、 そして dl、 エンドゥの Isおよび le、 イネの d35 (dx) および dl8 (dy) 。
図 2は、 dl8矮性植物の様々な表現型を示す写真である。 左から右へ、 台中- 6 5 (WT：最終段階で約 l m) 、 古丈玉錦矮性体 （dl8k：約 65 cm) 、 矮稲- C (約 5 5 cm) 、 そして豊雪矮性矮性体 (dl8h：約 15 cm) 、 秋晴矮性矮性体 （バ一 = 10 cm) である。
図 3は、 各 GA 3 ^ -ヒドロキシラーゼ （0s3y5 - 1と 0s3 3 -2) 遺伝子の位置と 様々な RFLPマーカーをイネの第 1染色体と第 5染色体について示す図である。 図 4は、 a： D18と dl8対立遺伝子の RFLP分析の結果を示す電気泳動写真であ る。 DNAは D18 (シォ力リとアキバレ) と dl8対立遺伝子 （dl8h、 ldl8kそして d 18 - AD) 植物の葉組織から単離した。 DNAを Apalで消化し、 電気泳動で分離して、 ナイロンフィル夕一に結合させ、 ハイプリダイズさせた。 分子の長さのマーカー を左側にキロベースで示す。
b：ゲノム 0s3y5 - 2クローンとそのサブクローンの制限マップを示す図である。 ゲノムクローンは PCR産物をプロ一ブとして用いたゲノムライブラリのスクリー ニングに由来した。 2. 3 kbの Bgl l l断片のサブクローンは D18 の全コード領域 を含む。
図 5は、 野生型 ί sa^7a植物における GA 3 5 -ヒドロキシラーゼの発現パ夕 —ンを示す電気泳動写真である。 3 ? -ヒドロキシラーゼ cDNA D18と 0s3 ? -lの、 SA (茎端） 、 ST (茎） 、 LB (葉身） 、 Ra (葉軸） 、 FL (花） 、 YL (若葉） 、 IFM (花序分裂組織） 、 そして Sh ( 2週齢の実生） から抽出した総 RNA 10 〃gを含 むノザンプロットとのハイブリダィゼーシヨンの結果である。
図 6は、 0s3 ? - 2 (D18) cDNAをアンチセンス向きにァクチンプロモー夕一の 制御下で恒常的に発現させた形質転換植物体を示す写真である。 写真左は野生型 の日本晴、 写真中央は半矮性植物体、 写真右は矮性植物体を示す。 図 7は、 0s3 ?- 2の全長 cDNAが揷入されたプラスミ ド、 pBS- SK+を示す図であ る o
図 8は、 0s3/5-2 (D18) 遺伝子のアンチセンスが挿入されたプラスミ ド、 pAct -N0S/Hm2を示す図である。
図 9は、 Os 3 -1の融合蛋白質が GA9を基質としたとき GA4、 GA7、 GA34を生成 することを示した図である。
図 10は、 Os 3/5-2の融合蛋白質が、 GA5、 GA9、 GA20, GA^を基質としたとき にそれそれに対応する 3 ?水酸化ジベレリン （GA3、 GA^ GA1 GA38) を生成する ことを示した図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。 なお、 イネの種子 (Oryza sativa^ ジャポニカ型栽 培品種： 「二ツボンバレ」 、 「アキバレ」 、 「シォカリ」 、 そしてその他） を l%NaC10で 1時間消毒して、 滅菌蒸留水で十分にすすぎ、 土壌で発芽させて、 温室で生育させた。
[実施例 1] GA35-ヒドロキシラ一ゼをコードする cDNAクローンの単離 単子葉植物の GA3 ?-ヒドロキシラーゼを単離したという報告例はない。 いく つかの GA3 ^-ヒドロキシラーゼは双子葉植物からクローニングされている （Chi angら、 1995； Martinら、 1997； Lesterら、 1997) 。
GA3 ?-ヒドロキシラーゼをコードする部分的断片を単離するために、 イネのゲ ノム MAを铸型として、 報告された双子葉植物の GA35-ヒドロキシラーゼ配列 における保存領域からデザインした縮重プライマー （55-プライマ一： 55- GTNGTN AARGTNGGNGMRT-3' /配列番号： 7、 3，プライマ一： 5， -AYYTMTCRTTGGANGTNAC - 3 '/配列番号： 8) を用いて PCRを行なった。 その結果、 報告された GA35-ヒド ロキシラーゼ配列から予想されるサイズに対応する 210 bpの DNA断片を得た。 次ぎに、 全長のクローンを単離するため、 この断片をプローブとしてイネのゲ ノムライブラリをスクリーニングした。 その結果、 いくつかのクロ一ンを単離し、 各ゲノムクローンの制限マップに基づいて 2群に分類した。 最後に各群の 1つを 完全にシークェンシングして、 それそれのクローンを Os 3/5-1と 0s3 ? -2 (0s3 β-\と 0s3 ?- 2； Oriza sativa GA35-ヒドロキシラーゼ -1、 -2) と名付けた。 ' それそれのクローンの塩基配列を配列番号： 5および 6に示す。 0s3 ?- 1はプロ ーブとして用いた断片と共通する配列を有したが、 0s3 ?- 2は断片からの対応す る領域で異なる配列を含んでいた。
次ぎに、 各クローンの配列に基づき、 cDNA断片を得るために、 実生 （イネの 茎端） または未開の花から単離した総 RNAを用いて RT- PCRを実施した。 これに より、 GA3 ?-ヒドロキシラーゼをコ一ドする完全な大きさの cDNAクロ一ンを得 た。 0s3 ?-lcDNAおよび 0s3 ?-2 cDNAはそれそれ 379残基および 373残基のポ リペプチドをコードするォープンリーディングフレームを含んでいた。 それぞれ のクローンの塩基配列を配列番号： 3および 4に示す。 0s3 ?- 2ゲノム DNAは、 短いサイズ （110 bp) の単一のイントロンを含み、 イントロンは双子葉植物にお いてこれまでに報告された GA3 ?-ヒドロキシラーゼと同じ位置に存在していた。 0s3 ?-lゲノム DNAは 2つのィントロンを含んでいた。 1つは 0s3 ?- 2ゲノム DN Aと同じ位置に存在し、 これはほぼ同程度の大きさであった （110 bp) 。 もう一 つは、 共因子である 2-ォキソグルタル酸 （400 bp) の結合部位に存在した （デ 一夕は示していない） 。 両クローンの推定アミノ酸配列は、 他の GA3 3-ヒドロ キシラーゼと高度の類似性を示したが、 それらは互いに対しても高度の類似性を 示した （56.6%の同一性と 88.2%の類似性） 。
なお、 塩基配列は、 自動シークェンシングシステム （ABI373A) を用いたジデ ォキシヌクレオチド 'チェーン '夕一ミネ一シヨン法により決定した。 また、 配 列の解析は、 GENETYXコンピュータ一ソフトウエア （Software Kaihatu Co.、 日 本） を用いて実施した。 [実施例 2] dl8対立遺伝子の同定と特徴付け
矮性イネ植物に関する定量的分析とバイオアツセィから、 D18遺伝子が GA3 5 -ヒドロキシラ一ゼをコードすることが示されている。 D18座は第 1染色体上で 同定され、 この染色体の下端で FS-2座に隣接する。 単離された GA3 3-ヒドロ キシラーゼクローンが D18遺伝子に対応することを調べるために、 RFLP (制限断 片長多型） 分析を用いてイネのゲノム上に 2つのクローンをマッピングした。
0s3 ?-lまたは 0s33- 2の RFLPは、 EcoRIまたは Apalでそれそれ消化したァ ソミノリ （ジャポニカ種のイネ） と IR 24 (インディ力種のイネ） DNAの間に存 在した。 ァソミノリと IR24の交配の F2子孫の消化したゲノム DNAについて連鎖 分析を行った。 0s3 ?- 1と 0s3 ?-2はそれぞれ、 第 5染色体の上端と第 1染色体 の下端にマッピングされる （図 3) 。 この結果は、 Os3 5- 2が D18座に対応する ことを示唆している。
0s3 - 2が D18座であることを確認するためにさらなる分析を行った。 D18遺 伝子の機能喪失によって生じた 4つの独立した通常変異体が存在する。 これらの 変異は、 ァ線照射を用いた変異誘発による D18遺伝子の DNA転位および/または 欠失によって生じる可能性がある。 従って、 野生型とこれらの変異体の間の 0s3 ?-2位での RFLPは、 0s3y5- 2が D18遺伝子であれば認められる可能性がある。 野生型 （シォカリまたはアキバレ） と dl8対立遺伝子 （ldl8k、 ldl8hそして d 18 - AD) からのゲノム DNAについて DNAゲルプロット分析を行った。 ldl8kと ldl 8hは、 シォカリ系の同種同系株で、 dl8- ADはエチレンィミン （EI) によるアキ バレの変異誘発から単離した。 MAゲルプロット分析においては、 まず、 イネの ゲノム DNA (レーンあたり l〃g) を制限酵素で消化させ、 ァガロースゲル電気 泳動によって分離して、 ハイボンド N+ナイロンメンブレン （Amersham社） に移 した （Sambrookら、 1989) 。 ハイブリダィゼーシヨンは、 0.25 M Na2HP04、 lm M EDTAそして 7%SDS中で 65°Cで実施した。 フィル夕一は、 2xSS 0.1%SDS 中で 65°Cで 15分の洗浄を 2回、 そして 0.1 X SS 0.1%SDS中で 65°Cで 15分の 洗浄を 1回行った。
8個の酵素 (BamHIヽ Bg/I Apal、 Kpn l、 Dral、 EcoRV、 EcoRI、 そして Hindi II) を用いてこれらのゲノム DNAを消化して、 野生型植物と変異体の間の RFLP を探索した結果、 dl8-ADと Idl8hからの DNAを Apalで消化した際に多型性が認 められた。 一方、 ldl8kは試した如何なる酵素でも多型性を示さなかった （図 4 ) 。
RFLP分析の結果は、 dl8- ADが D18座に長い欠失を有することを示唆しており、 ldl8hは Apal部位を含む短い欠失を有する。 この検討を確認するため、 全ての d 18対立遺伝子の全コ一ド配列を直接分析して、 これらを野生型の 0s3 ?- 2の配 列と比較した。
具体的には、 D18の 5'と 3'非コード配列に由来するオリゴヌクレオチドプラ イマ一を用いて、 D18、 dl8h、 dl8kそして dl8- wからの全コード領域を含む 1.6 kb断片を増幅し、 次に増幅された断片をシークェンシングした。
その結果、 予想通り、 全ての dl8対立遺伝子は、 様々な位置でその 0s3 ?- 2コ —ド配列を変化させていたが （表 1 ) 、 dl8- ADは PCII産物を生成しなかった。
対立遺伝子 ¾r 変異の結果
Figure imgf000026_0001
d18-AD D18オープンリーディング
kb欠失 フレームの全長が欠失 (秋晴矮性） フレームシフ卜により d18h GGG to GG, 38の新規なアミノ酸が 付加し、 ポリペプチドの
(豊雪矮性） 1塩基欠失 Gly 251
先端が切除された d18k Aspから Cysにアミノ酸が
45
(古丈玉錦） GGC to IGC Arg 1
置換することにより、 産物が改変された インフレーム欠失により d18-W
(矮稲- c) 9塩基欠失 Val57 to Arg59
a Z部M分的^残基lか^欠失 ,し、 産物が改変された ― 3下線を施した ½分は d18K—対立遗伝子におけるヌクレオチドの置換を示している このことはこの対立遺伝子がほぼ完全にそのコード配列を失っているという上 記推測を支持するものである （データは示していない） 。 ldl8kからの配列では、 開始コドンから 433位の塩基での Cから Tへの置換によって、 アルギニン- 168 がシスチンに変化した。 dl8- wでは、 169〜177位での 9個の塩基のインフレーム 欠失により、 バリン 57からアルギニン 59までのアミノ酸 3個が欠失した。 ldl8 hでは、 塩基 Gの欠失によって読みとり枠がシフトしている。 これらの結果は、 0s3 β -2遺伝子が D18座であり、 GA3 ? -ヒドロキシラーゼをコードすることを証 明する。
[実施例 3 ] 0s3 3-2 (D18) そして 0s3 5-l遺伝子の生長過程での制御 植物の生長過程での D18と 0s3 ?- 1遺伝子の発現を調べるために、 RNAゲルブ ロット分析を実施した。 RNAゲルブロヅト分析においては、 標準的な方法 （Samb rookら、 1989) にしたがって、 総 RNAを様々な器官または組織から調製した。 R NA (試料あたり 10 jug) をゲル電気泳動で分離して、 ハイボンド N+ナイロンメ ンプレン （Amersham社） に移した。 ハイブリダィゼーシヨンは、 5xSS 10% ( /v) 硫酸デキストラン、 0.5% (w/v) SDS、 0.1 mg/ml変性サケ精子 MAを含 む溶液中で 65°Cで実施した。 フィル夕一は、 2xSSC、 0.1%SDS中で 65°Cで 15 分洗浄を 2回、 そして 0.1XSSC、 0.1%SDS中で 65°Cで 15分洗浄を 1回行った。 プローブとしては、 D18全長の cDNAからの BssHII- PvuII (519 bp) 断片、 およ び 0s3 ?- 1からの Kpnl-PvuII断片 (310 bp) を用いた。
その結果、 D18遺伝子は調べたあらゆる器官に発現していた （図 5) 。 発現レ ベルは茎、 若葉、 そして花序分裂組織で高く、 葉身と葉軸で低かった。 対照的に、 0s3 ?-l mRNA発現は花では特に高く、 葉身と葉軸では低かった。
また、 D18と 0s3^- 1は高度の配列類似性を共有するため、 ゲノムサザン分析 によるクロス-ハイブリダイゼ一ションの程度を調べた。 それそれの特定のプロ ーブをゲノムサザンハイプリダイゼ一シヨンにプローブとして用いた結果、 クロ ス-ハイプリダイゼーシヨンは検出されなかった （データは示していない） 。
[実施例 4] 0s33-2 (D18) 遺伝子の発現抑制による矮性化植物体の作出
0s3 ?-2の全長 cDNAは、 PBS-SK+に BamHI -Hindi II部位にクロ一ニングされて おり （図 7) 、 BamHI- Hindlll処理による該ぺク夕一の切断により該 cDNAを取 り出した後、 平滑末端化した。 0s3 ?- 2遺伝子のアンチセンスを発現するべクタ —は、 この平滑末端化した全長 cDNAを、 pAct- N0S/Hm2の Smal部位に挿入する ことにより構築した （図 8) 。
これをエレクトロポレーシヨン法によりァグロバクテリア EHA101株にトラン スフオームした。 イネ発芽種子に該ァグロバクテリアを共存させた後、 カナマイ シン及びハイグロマイシンを含む選抜培地で 3週間培養して細胞を選抜後、 再分 化培地に移植して、 数十個体の形質転換植物体を得た。 その結果、 0s3^- 2遺伝 子のアンチセンスを発現する植物体は、 野生型植物体と比較して矮性化していた (図 6 ) 。
[実施例 5 ] 組み替え GA 3 ?ヒドロキシラーゼの機能
Os 3 /5-1遺伝子および Os 3 /3 -2遺伝子について、 蛋白をコードすることが予 想される部分の cDNAを、 pMAL-c2発現ベクター （New England Biolabs, Beverl y， MA) へと翻訳融合体としてセンス方向で挿入した。 得られた構築物 pMAL-Os 3 ?- 1および pMAL-0s 3 ?-2を、 大腸菌株 JM109内で発現させた。 細菌細胞を、 100mg/Lアンピシリンを含有する 2xYT培地で一晩 37°Cで振盪培養した。 一晚培 養したあと、 培養物を 100fflg/Lアンピシリンを含有する新鮮な 2xYT培地で 100 倍希釈し、 30°Cで振盪培養した。 4時間後、 IPTGを最終濃度 ImMとなるように添 加し、 17°Cで更に 18時間振盪培養した。 培養終了後細菌細胞を集め、 洗浄バッ ファー （50mM Tris- HC1、 pH8.0、 10% [w/v]グリセロール、 2mM DTT) で洗浄し、 リゾチーム （lmg/ml) を含む洗浄バッファ一に懸濁して氷上で 30分間静置した。 これにより得られた溶菌液を超音波処理して遠心し、 その上清を SDS- PAGEに かけて融合蛋白の発現を確認した。 0s 3 1の融合蛋白質の活性を検定するた めに、 この上清を用いて広範なジベレリン類およびコファクタ一類 （ァスコルビ ン酸、 2価鉄、 2-ケトグルタル酸） とともにインキュベーションを行った。 0s 3 β - 2の融合蛋白質の活性検定のためには、 この上清をアミロースレジンを用い たカラムでカタログに記載された方法により精製し、 この精製蛋白液を用いて同 様のインキュベーションを行った。 代謝されたジベレリン類は、 GC- MSを用いて 同定した。 その結果、 0s 3 ? -lの融合蛋白質は GA9を基質としたとき GA4 ( 3 /3 水酸化） 、 GA7 (2, 3位の不飽和化および 3 ?水酸化） 、 GA34 (2/5水酸化） の生 成が確認された （図 9 ) 。 生成物の中では GA4と GA7が主要な産物であった。 GA2。 を基質とした場合にも同様な結果が得られた。 また GA5、 GA を基質とした時に はそれそれに対応する 3 /5水酸化ジベレリン （GA3、 GAg8) のみを得た。 一方、 0s 3 /5 - 2の融合蛋白質は、 GA5、 GA9 GA2fl、 GA^を基質としたときにそれそれに対 応する 3 水酸化ジベレリン （GA3、 GA4、 GA1 GA38) を生成した （図 1 0 )。 この結果、 Os 3 /3 -1遺伝子は 3 ?水酸化のほかに 2，3位の不飽和化、 2 ^水 酸化の核反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であることが明らかとなった。 また Os 3 5 -2遺伝子は、 3 ?水酸化反応を触媒する酵素をコードする遺伝子で あることが明らかとなった。 産業上の利用の可能性
本発明により、 植物のジべレリンの活性化に関与する新規なタンパク質および 遺伝子、 並びに該遺伝子の発現を調節することにより植物体内におけるジべレリ ン活性が改変された植物が提供された。 本発明により、 植物体内のジベレリン活 性化を改変させ、 植物の草型を人為的に改変することが可能となった。 植物体内 のジべレリン活性化を抑制することにより、 特に伸長生長の抑制によって引き起 こされる植物の矮性を誘起できる。 このため、 例えば、 イネにおいては多肥料に よつて生育を促しても背丈が伸びすぎて倒伏してしまうこともなくなる。 また、 葉の受光量の効率が上昇するため収量の大幅な増加が期待できる。 さらに収穫や 生育管理の作業の効率化も図ることが可能である。 また、 植物体内における本発 明の遺伝子の発現を増加させて、 植物体内のジペレリン活性化を促進することに より、 植物体全体の収量を増加させることも考えられる。 このことは、 特に、 飼 料用作物全体の収穫量を向上させる上で有意義である。

Claims

請求の範囲
1 . ジベレリン 3 5水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする、 下記 ( a ) から （c ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 1または 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコ一 ドする DNA。 '
( b ) 配列番号： 3または 4に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 1または 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数の アミノ酸が置換、 欠失、 付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなる夕 ンパク質をコードする DNA。
2 . 請求項 1に記載の DNAまたはその転写産物と相補的なアンチセンス RNAを コ一ドする DNA。
3 . 請求項 1に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有 する RNAをコードする DNA。
4 . 植物細胞における発現時に、 共抑制効果により、 内因性の請求項 1に記載 の DNAの発現を抑制する RNAをコードする MA。
5 . 請求項 1から 4のいずれかに記載の DNAを含むベクタ一。
6 . 請求項 1から 4のいずれかに記載の DNAを発現可能に保持する形質転換植 物細胞。
7 . 請求項 6に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
8 . 請求項 7に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
9 . 請求項 1に記載の MAによりコードされる夕ンパク質。
1 0 . 請求項 1に記載の DNAを発現可能に保持する形質転換細胞を培養し、 該 細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 請求 項 9に記載の夕ンパク質の製造方法。
1 1 . 植物細胞内において請求項 1に記載の DNAの発現量を調節することを特 徴とする、 植物の生長を改変する方法。
1 2 . 植物細胞内におい "t請求項 1に記載の DNAの発現量を調節することを特 徴とする、 植物の草型を改変する方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1375668A1 (en) * 2001-03-27 2004-01-02 National Institute of Agrobiological Sciences Vegetative growth-specific promoter and genetically modified plants obtained thereby
US7057088B2 (en) 1999-12-24 2006-06-06 Riken Gibberellin 2β-hydroxylase genes of rice and uses thereof

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323256B2 (en) 2011-12-09 2019-06-18 Ceres, Inc. Transgenic plants having altered biomass composition
CN118546979A (zh) 2016-08-17 2024-08-27 孟山都技术公司 通过操纵赤霉素代谢增加可收获产量的用于矮株型植物的方法和组合物
CN106967734B (zh) * 2017-04-24 2020-12-01 浙江师范大学 水稻矮化小穗基因dsp1及其应用
CN107227303B (zh) * 2017-07-03 2021-10-08 江西省超级水稻研究发展中心 一种OsGA3ox1基因在水稻雄性不育株系创制中的应用
CN111787786A (zh) * 2018-02-15 2020-10-16 孟山都技术公司 通过性状堆叠提高作物产量的组合物和方法
WO2019161151A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
CN109006470B (zh) * 2018-07-23 2021-11-02 西南科技大学 一种运用保护剂于60Co-γ辐射诱变培育郁金香新品种的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998059057A1 (en) * 1997-06-24 1998-12-30 The General Hospital Corporation Ga4 homologue dna, protein and methods of use

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9311147D0 (en) * 1993-05-28 1993-07-14 Long Ashton Research Station Regulation of plant growth
JPH10508186A (ja) * 1994-08-16 1998-08-18 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション Ｇａ４ ｄｎａ、タンパク質および使用方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998059057A1 (en) * 1997-06-24 1998-12-30 The General Hospital Corporation Ga4 homologue dna, protein and methods of use

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIANG H.H. ET AL.: "Isolation of the arabidopsis GA4 locus", THE PLANT CELL, vol. 7, no. 2, February 1995 (1995-02-01), pages 195 - 201, XP002936720 *
HEDDEN P.: "Recent advances in gibberellin biosynthesis", JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY, vol. 50, no. 334, May 1999 (1999-05-01), pages 553 - 563, XP002936716 *
LANGE T. ET AL.: "Cloning and expression of a gibberellin 2beta, 3beta-hydroxylase cDNA from pumpkin endsperm", THE PLANT CELL, vol. 9, no. 8, August 1997 (1997-08-01), pages 1459 - 1467, XP002936717 *
LANGE T. ET AL.: "Expression cloning of a gibberellin 20-oxidase, a multifunctional enzyme involved in gibberellin biosynthesis", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 91, no. 18, August 1994 (1994-08-01), pages 8552 - 8556, XP002936721 *
MARTIN D. ET AL.: "Mendel's dwarfing gene: cDNAs from the Le alleles and function of the expressed proteins", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 94, no. 16, August 1997 (1997-08-01), pages 8907 - 8911, XP002936719 *
See also references of EP1254958A4 *
SHINJIRO YAMAGUCHI: "Gibberellin no seigousei kenkyu; saishin no shinpo(1)", KAGAKU TO SEIBUTSU, vol. 34, no. 6, June 1996 (1996-06-01), pages 402 - 410, XP002936718 *
TOMOAKI SAKAMOTO ET AL.: "Geberellin seigousei kouso idenshi no hatsugen chousetsu ni yoru ine kasagata no jiniteki seigyo", KAGAKU TO SEIBUTSU, vol. 38, no. 2, February 2000 (2000-02-01), pages 131 - 139, XP002936715 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7057088B2 (en) 1999-12-24 2006-06-06 Riken Gibberellin 2β-hydroxylase genes of rice and uses thereof
EP1375668A1 (en) * 2001-03-27 2004-01-02 National Institute of Agrobiological Sciences Vegetative growth-specific promoter and genetically modified plants obtained thereby
EP1375668A4 (en) * 2001-03-27 2005-01-26 Nat Inst Of Agrobio Sciences VEGETATIVE GROWTH PROMOTER AND GENETICALLY MODIFIED PLANTS OBTAINED USING THE PROMOTER
US7176347B2 (en) 2001-03-27 2007-02-13 National Institute Of Agrobiological Sciences Vegetative growth specific promoter and transgenic plant obtained with the same

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