KR20020064352A

KR20020064352A - 벼 유래의 지베렐린 3β수산화효소 유전자 및 그 이용

Info

Publication number: KR20020064352A
Application number: KR1020027007921A
Authority: KR
Inventors: 히로시 다나카; 토시아키 카야노; 마사히로 야노; 마코토 마쯔오카; 마사토모 고바야시
Original assignee: 독립행정법인농업생물자원연구소; 리가가쿠 겐큐쇼
Priority date: 1999-12-20
Filing date: 2000-12-20
Publication date: 2002-08-07
Also published as: CA2394759A1; EP1254958A1; US20030172405A1; WO2001046434A1; AU778179B2; EP1254958A4; AU2398401A; US7049490B2; CN1434866A

Abstract

벼에서 GA 3β-히드록실라제를 코드하는 게놈 DNA 및 cDNA를 단리하였다. 벼 식물체에 있어서 상기 유전자의 발현을 억제한 결과, 야생형 식물체와 비교하여 왜성화되었다.

Description

벼 유래의 지베렐린 3β수산화효소 유전자 및 그 이용{Rice-Origin Gibberellin 3β-HydroxylaseGenes and Utilization Thereof}

다세포생물은 집합되어 기능적 단위를 형성하는 다수의 전문 기관이나 조직에서 구성된다. 생물의 다양한 부분의 협조는 화학 전달물질을 통하여 행해지고 있고, 이들 물질에 대해 호르몬이라고 하는 단어가 사용되고 있다. 식물 호르몬은 생장을 자극하거나 저해하거나 하며 또는 어떠한 생장 프로그램을 조절하는 시그널로서 작용하는 천연에 존재하는 물질이고, 소량이라도 상당히 유효하다. 요즈음, 일반적으로 식물 호르몬으로서 인식되고 있는 물질으로서는, 옥신류(auxins), 지베렐린류(gibberellins), 사이토카이닌류(cytokinins), 아브시진산(abscisic acid), 부라시놀라이드(brassinolide) 및 에틸렌(ethylene)을 들 수 있다.

동물에서는, 호르몬은 통상 특수한 선에서 합성되고, 혈류를 통하여 생체 전체에 보내진다. 이렇게 하여 호르몬은 반응할 준비가 되어 있는 표적이나 반응 조직에 도달하여 특이적인 조절 프로세스(process)를 유발한다. 당초, 동물에 관하여 전개된 호르몬에 대한 이러한 고전적인 사고 방식은 고등식물에 응용되었다. 많은 경우, 식물 호르몬은 특이적 표적조직에서 활성을 나타내지만, 그들은 호르몬이 생산되는 조직과는 다른 것이 많다. 그러나 식물 호르몬은 모두 다세포 식물의 많은 부위에서 검출할 수 있다. 이것은 식물 호르몬의 합성부위와 작용부위와의 사이에 종종 절대적인 분리가 없다는 것을 나타내고 있다. 필요하다면 호르몬은 호르몬이 형성되는 세포와 동일한 세포(조직)에 작용을 미칠 수 있다. 이렇게 식물 호르몬 합성의 조절을 이해하는 것은 활성과 작용과의 관계를 결정하는 데에 중요하다.

지베렐린(GA)은 당초, 1920년대에 일본인 식물 병리학자에 의해 식물독소로서 발견되었다. 식물 병원성 진균인 지베렐라(Gibberella fujikuroi)는 벼과식물에 감염되어 병리적인 길이 방향의 생장을 일으키는 화학물을 분비한다(Bakanae "mad seedling disease"). 1935~1938년의 사이에 이 화합물은 단리되고, 활성 물질이 결정화되어 이것을 「지베렐린」이라고 불렀다. 이후 연구에 의해 GA가 고등식물에 의해서도 생성되고, 생장의 조절와 분화 프로세스에서 상당히 중요한 것이 알려졌다.

1992년까지 동정된 약 80개의 GA의 기본 구조는 엔트·지베렐란(ent-gibberellan)의 4환식계이다(도1a). GA는 주로 메바론산(mevalonic acid)으로부터 게라닐게라닐피로 인산(geranyl geranyl pyrophosphate)의 환상화를 통하여 생성되는 디테르페노이드 카르본산(diterpenoid carboxylic acid)을 포함하지만(도1b),그 대부분은 식물의 생장 촉진에는 불활성이다. 많은 식물에 있어서, 식물 생장 조절 물질으로서 작용하는 생물학적으로 활성인 GA는 GA₁및 GA₄이다. 그들은 종자의 발아, 줄기의 신장, 개화 그리고 결실 등의 다양한 생장 프로세스를 조절할 수 있다. 따라서, GA의 생합성을 변형시킴으로써 산업상 유용한 다양한 변형식물을 생산할 수 있다고 생각된다.

환경 자극의 메디에이터(mediator)로서의 GA의 역할은 충분히 확립되고 있다. 빛이나 온도와 같은 물리적 요인은 대사 경로의 특정한 단계를 통하여 그 유량을 변화시킴으로써 GA 대사를 변경시킬 수 있다. 예를들어, 빛의 성질(적색 또는 적외선)과 강도(강하거나 약함)는 GA 생합성에 영향을 미친다. 상추(lettuce)의 종자나 광저기(cowpea)의 상배축(epicotyls)에서는, GA₂₀의 3β히드록실화가 적외선에 의한 처리에 의해 증강된다(Toyumasu et al. (1992) Plant Cell Physiol. 33, 695-701). 또한, 완두콩의 실생(묘목)을 저방사도(4Oμmol/m²·s)에서 생장시키면 GA₂₀의 함량은 고방사도 (386μmol/m²·s)에서 생장하는 식물과 비교하여 7배 증가하지만, 어두운 곳에서 생장시켰던 식물의 GA₂₀함량은 고방사도의 경우의 함량으로 감소한다(Gawronska et al. (1995) Plant Cell Physiol. 36, 1361-1367).

피토크롬(phytochrome)이나 빛의 강도에 의한 생장속도의 변화와 GA 대사와의 관계를 해명하려고 하는 시도는 수없이 행해져 왔지만 그것을 지지하는 증거는 아직도 부족하다. 이러한 조절 프로세스의 기초가 되는 메커니즘은, GA 생합성의분자생물학에 있어서 현재의 진보의 결과로서 이해되는 것이다.

또, 적지 않은 노력에도 불구하고 생물활성 GA의 합성부위와 특정한 세포나 조직에서 그러한 작용 양식은 분명하지 않다. 식물에¹⁴C-표식 GA를 가한 실험에서 그들은 식물의 도처를 비극성적으로 이동한다고 생각되고 있다. 최근, 왜성의 완두콩 식물과 야생형의 완두콩 식물의 접목실험에서 생물활성 GA인 GA₁이 그 전구체인 GA₂₀과는 달리 수송되지 않는 것이 나타났다(Proebsting et al. (1992) Plant Physiol. 1OO, 1354-1360; Reid et al. (1983) J.Exp.Bot.34, 349-364). 왜성 완두콩 식물에 관하여 GC-MS와 바이오 에세이(bioassay)를 이용한 정량적 분석으로부터 GA가 주로 생장점, 어린 잎 그리고 꽃과 같이 활발하게 생장 및 신장하고 있는 조직에 존재한 것이 밝혀졌다(Jones and Phillips (1996) Plant Physiol. 41, 1381-1386; Potts et al (1982) Physiol. Plant, 55, 323-328; Kobayashi et al. (1988) Agric.Biol.Chem.52, 1189-1194). 그러나, 대부분의 GA는 극히 소량밖에 존재하지 않고, 대부분이 생물활성이 아니기 때문에 특정의 조직에 존재하는 각 GA의 정확한 양은 측정하는 것이 어렵다. 따라서, 생물활성 GA의 합성부위를 분명하게 하기 위해서는 새로운 어프로치(approach)가 필요하다.

분자생물학과 유전자 전략의 진보에 따라 현재는 GA 생합성 효소를 코드하는 유전자의 대부분이 다양한 식물종으로부터 클로닝되어 있다. 이러한 시험으로부터, 각각의 GA 반응성 왜성 변이체가 GA 생합성 효소를 결손하는 것이 나타났다(도1b). 그 발현 프로필은, 경로가 생장시에 엄밀히 조절되고 있는 것을나타내고 있다. 이러한 유전자 가운데, GA 생합성의 초기에 활성인 효소인 코팔릴 2인산 신타제(copalyl diphosphate synthase, CPS)를 코드하는 아라비돕시스의 GA1은 예를들어, 생장점, 근단(root tip) 그리고 꽃 등의 급속하게 생장하고 있는 조직에서 고도로 발현되고 있다(Silverstone et al. (1997) Plant J. 12, 9-19). GA 생합성 경로의 후기 단계를 촉매하며 작은 유전자 패밀리를 구성하는 GA C-2O 옥시다제는 생장을 위해 GA가 필요한 아라비돕시스, 완두콩 그리고 강낭콩의 줄기나 생장하고 있는 종자에 특이적으로 발현하고 그것들은 GA₃처리에 의해 부정적으로 조절를 받는다(Phillips et al. (1995) Plant Physiol. 108, 1049-1057; Garcia-Martinez et al. (1997) Plant Mol.Biol. 33, 1073-1084).

이러한 관찰에 의해 본 발명자들은, 여러가지 기관에서 GA의 작용은 존재하는 내인성 GA의 양에 의존하고, 내인성 GA 양은 생물활성 GA의 GA 작용부위로의 이동이 아니라, GA 생합성 효소의 발현의 조절에 의존하는 것은 아닐까 하고 추측하게 되었다. 그러나, 생물활성 GA는 GA 3β-히드록실라제에 의해 촉매되는 3β히드록실화에 의해 합성되기 때문에 CPS 또는 GA C-2O 옥시다아제의 발현을 분석하여도 생물활성 GA의 합성부위나 생물활성 GA 양의 조절에 관한 직접적인 증거는 얻어지지 않는다고 생각했다.

상기와 같이 3β-히드록실라제는 생물활성 GA 생성의 최종단계에서 각각 GA₂₀과 GA₉의 GA₁와 GA₄로의 변환을 촉매한다(도1b). 3β-히드록실라제의 효소학은 아직 완전하게는 해명되지 않았지만, 2-옥소글루타르산(2-oxoglutarate) 결합 영역이 그 활성에 필수이고, 이것은 GA 3β-히드록실라제가 2-옥소글루타르산 의존적 디옥시게나제(dioxygenase)의 전형적인 특성을 지니는 것을 나타내고 있다. 특정한 GA 3β히드록실라제는 다기능성인 가능성이 있고, 호박의 배젖 유래 효소는 2β와 3β 둘다의 히드록실화를 촉매한다(Lange et al. (1997) Plant Cell, 9, 1459-1467). 옥수수 왜성체의 1,3 β히드록실라제도 또한 다기능성이라고 생각되고 있고, 옥수수 GA 생합성 경로에서 3개의 히드록실화 단계를 촉매한다(Spray et al. (1996) Proc.Natl.Acad.Sci. 93,10515-10518). 그러나, 이들의 GA 3β히드록실라제의 본질은 아직 충분히 규명되지 않았다.

본 발명은 지베렐린의 생합성에 관여하는 벼 유래의 유전자 및 상기 유전자의 이용에 관한 것이다.

도1은

a: 지베렐린(엔트-지베렐란)의 일반구조를 나타내며,

b: 고등식물에서 주요한 GA 생합성 경로를 나타내고

이탤릭체는 특이적 GA 생합성 경로를 결손시키는 GA 반응성 왜성 변이체를 나타내고, 각각 아라비돕시스의 ga1, ga2, ga3, ga5, 그리고 ga4; 옥수수의 an1, d5, d3, 그리고 d1, 완두콩의 ls 및 le, 벼의 d35(dx) 및 d18(dy).

도2는 d18 왜성 식물의 다양한 표현형을 나타내며, 왼쪽에서 오른쪽으로, 태추-65(WT: 최종 단계에서 약1m), 코타케 타마니시키 왜성체 (d18^k; 약65cm) , 와토-C(약55cm), 그리고 호세추-와세이 왜성 왜성체(d18^h: 약15cm), 아키바레-와세이 왜성 왜성체(바=1Ocm)이다.

도3은 각 GA 3β-히드록실라제(Os3β-1과 Os3β-2) 유전자의 위치와 다양한 RFLP 마커를 벼의 제l염색체와 제5염색체에 관하여 나타낸다

도4는

a: D18과 d18 대립유전자의 RFLP 분석의 결과를 나타내는 전기영동 사진이며, DNA는 D18(시오카리와 아키바레)과 d18 대립유전자(d18^h, ld18^k그리고 d18-AD) 식물의 잎조직으로부터 단리되었다. DNA를 ApaI으로 소화시키고, 전기영동으로 분리하여 나일론 필터에 결합시켜 하이브리다이즈시켰다. 분자의 길이의 마커를 좌측에 킬로 베이스(kilobase)로 나타내며,

b: 게놈 Os3β-2 클론과 그 서브클론의 제한맵을 나타내는 그림이다. 게놈 클론은 PCR 산물을 프로브로서 이용한 게놈 라이브러리의 스크리닝에서 유래되었다. 2.3kb의 BglII 단편의 서브클론은 D18의 전 코드영역을 포함한다.

도5는 야생형0. sativa식물에서 GA 3β-히드록실라제의 발현 패턴을 나타내는 전기영동 사진이다. 3β-히드록실라제 cDNA D18과 Os3β-1의 SA(생장점), ST(줄기), LB(엽신), Ra(엽축), FL(꽃), YL(어린잎), lFM(화서분열조직), 그리고 Sh(2주령의 실생)에서 추출한 총 RNA 1Oμg를 포함하는 노던 블롯(northern blot)와의 하이브리다이제이션의 결과이다.

도6은 Os3β-2(D18) cDNA를 안티센스 쪽으로 액틴 프로모터의 조절하에서 구조적으로 발현시킨 형질전환 식물체를 나타내는 사진이다. 사진 왼쪽은 야생형의 일본청, 사진 중앙은 반왜성 식물체, 사진 오른쪽은 왜성 식물체를 나타낸다.

도7은 Os3β-2의 전체 길이 cDNA가 삽입된 플라스미드, pBS-SK⁺를 나타내는 그림이다.

도8은 Os3β-2(D18) 유전자의 안티센스가 삽입된 플라스미드, pAct-NOS/Hm2를 나타내는 그림이다.

도9는 Os3β-1의 융합 단백질이 GA₉를 기질로 했을 때, GA₄, GA₇, GA₃₄를 생성한 것을 나타내는 그림이다.

도10은 Os3β-2의 융합 단백질이 GA₅, GA₉, GA₂₀, GA₄₄를 기질로 했을 때, 각각에 대응하는 3β수산화 지베렐린(GA₃, GA₄, GA₁, GA₃₈)을 생성하는 것을 나타내는 그림이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 실시예를 통해 더 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 또한, 벼의 종자(Oryza sativa, 자포니카형 재배품종: 「닛폰바레(Nipponbare)」, 「아키바레(Akibare)」, 「시오카리(Shiokari)」, 그리고 기타)를 1% NaClO로 1시간 소독하고 멸균 증류수로 충분히 헹구어, 토양에서 발아시키고 온실에서 생육시켰다.

발명의 개시

본 발명은 벼 유래의 신규 GA 3β-히드록실라제 유전자 및 그 이용, 특히 식물형이 변형된 식물체의 생산을 위한 상기 유전자의 이용을 제공한다.

본 발명자들은 벼 유래의 GA 3β-히드록실라제 유전자를 단리하기 위해 먼저, 쌍자엽식물의 GA 3β-히드록실라제의 보존 영역을 기초로 설계한 축중 프라이머를 이용하여 벼의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 행하였다. 이어서, 이에 의해 얻어진 GA 3β-히드록실라제를 코드하는 게놈 DNA 단편을 프로브(probe)로 하여 벼의 게놈 라이브러리의 스크리닝을 행하고, 몇개의 클론을 얻었다. 이러한 게놈 클론을 제한맵(restriction map)에 근거하여 2군으로 분류하고, 각 군 가운데 1개씩 완전히 염기서열의 결정을 행하였다. 그 결과, 본 발명자 등은 이러한 클론이 각각벼의 GA 3β-히드록실라제를 코드하고 있다는 것을 발견하였다.

다음으로, 각 클론의 서열에 근거하여, cDNA 단편을 얻기 위해 실생(벼의 생장점) 또는 피지않은 꽃으로부터 단리한 총 RNA를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 이에 의해, GA 3β-히드록실라제를 코드하는 완전한 크기의 cDNA 클론을 얻었다(각각의 클론을 「Os3β-1」 라고 「Os3β-2」 라고 명칭하였다). 또한, 본 발명자 등은 얻어진 게놈 DNA의 서열을 기초로 설계한 프라이머를 이용하여 벼의 실생(생장점) 또는 피지않은 꽃으로부터 단리한 총 RNA를 주형에 역전사 PCR(RT-PCR)을 행하여 완전한 벼 GA 3β-히드록실라제를 코드하는 cDNA 클론을 얻는데 성공하였다.

벼에서는 GA 반응성의 왜성종으로서 d18 변이체가 알려져 있기 때문에, 본 발명자 등은 단리된 벼 GA 3β-히드록실라제가 D18 유전자에 대응하는지 아닌지의 검토를 행하였다. RFLP(제한단편장다형) 분석 및 d18 대립유전자의 염기서열의 직접적인 분석을 행한 결과, 단리한 2개의 벼 유전자 가운데, Os3β-2 유전자가 d18 변이의 원인이 된 유전자라는 것이 판명되었다. 또한, Os3β-2 유전자와의 발현 부위의 차이로부터 Os3β-1 단백질이 Os3β-2 단백질과 생물활성 GA의 다른 경로에 관여하고 있는 것이 시사되었다.

또한, 본 발명자 등은 Os3β-2 유전자에 대한 안티센스 DNA를 이용하여 벼 식물체에서 Os3β-2 유전자의 발현을 억제함으로써 야생형 식물체와 비교하여 왜성화된 식물체를 생산하는 것에 성공하였다.

즉, 본 발명자 등은 벼로부터 신규 GA 3β-히드록실라제 유전자를 단리하는 것에 성공하였고, 또한 상기 유전자의 발현을 억제하는 것으로 야생형 식물체와 비교하여 식물형이 변형된 식물체를 생산할 수 있는 것을 발견했다.

본 발명은 보다 자세하게는,

(1) 지베렐린 3β 수산화효소 활성을 지니는 단백질을 코드하는 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA,

(a) 서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 DNA,

(b) 서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA,

(c) 서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 DNA,

(2) (1)의 DNA 또는 그 전사산물과 상보적인 안티센스 RNA를 코드하는 DNA,

(3) (1)의 DNA의 전사산물을 특이적으로 개열한 리보자임 활성을 지니는 RNA를 코드하는 DNA,

(4) 식물세포에서 발현시에 공억제 효과에 의해 내인성의 (1)의 DNA의 발현을 억제하는 RNA를 코드하는 DNA,

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 벡터,

(6) (1) 내지 (4) 중 어느 한 항의 DNA를 발현가능하게 보유하는 형질전환 식물세포,

(7) (6)의 형질전환 식물세포를 포함하는 형질전환 식물체,

(8) (7)의 형질전환 식물체의 번식재료,

(9) (1)의 DNA에 의해 코드되는 단백질,

(10) (1)의 DNA를 발현가능하게 보유하는 형질전환세포를 배양하고, 상기 세포 또는 그 배양상청으로부터 발현시킨 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 (9)의 단백질의 제조방법,

(11) 식물세포내에서 (1)의 DNA의 발현양을 조절하는 것을 특징으로 하는 식물의 생장을 변형시키는 방법,

(12) 식물세포내에서 (1)의 DNA의 발현양을 조절하는 것을 특징으로 하는 식물의 식물형을 변형시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 벼에서 단리된 신규 GA 3β-히드록실라제 및 상기 효소를 코드하는 DNA를 제공한다. 본 발명의 DNA에 포함되는 본 발명자들에 의해 단리된 벼 유래의 GA 3β-히드록실라제 유전자인 Os3β-1 및 Os3β-2의 cDNA의 염기서열을 각각 서열번호 3 및 4에, 게놈 DNA의 염기서열을 각각 서열번호 5 및 6에 나타낸다. 또, 「Os3β-1」 단백질 및 「Os3β-2」 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호 1 및 2에 나타낸다.

벼 유래의 「Os3β-1」 단백질 및 「Os3β-2」 단백질은 3β-히드록실라제의 2-옥소글루타르산 의존적 디옥시게나제(2-ODD)로서의 지금까지의 분류와 일치하고, 식물의 2-ODD에 특징적인 모든 도메인을 포함하고 있었다(Prescott, (1993) J.Exp.Bot. 44, 849-861; de Carolis and Luca, (1994) Phytochemistry, 36, 1093-11O7). 공표된 모든 서열 중에서 둘다의 클론의 코드영역은 GA 3β-히드록실라제와 가장 높은 상동성을 나타낸다. 특히, 철과 보조인자(cofactor)인 2-옥소글루타르산의 결합으로서 작용할 가능성이 있는 영역은 고도로 보존되고 있다(Os3β-1에서는 240~247 위치와 302~307 위치, Os3β-2에서는 222~229 위치와 285~290 위치). 그것들은 또한, GA 3β-히드록실라제(Os3β-1에서는 144~15O 위치, Os3β-2에서는 127~133 위치)에 독자적인 보존 모티프(Met-Trp-X-Glu-Gly-X-Thr)를 지닌다. 쌍자엽식물의 GA 3β-히드록실라제나 그 이외의 디옥시게나제와의 서열의 비교로부터 본 발명자 등에 의해 단리된 클론은 벼의 GA 3β-히드록실라제를 코드하고 있다고 생각된다.

Os3β-2의 맵핑(mapping)과 게놈 서던분석(genomic Sothern analysis)에서 Os3β-2가 D18 유전자에 대응한다는 것이 나타났다. 벼의 d18 변이체는 GA 반응성의 왜성종이고, 다수의 대립유전자, 즉 호세츠-와세이(Hosetu-waisei), 아키바레-와세이(Akibare-waisei), 코타케-타마니시키(Kotake-tamanishiki), 그리고 와토-C(Waito-C)가 지금까지 확인되고 있다(도2). Os3β-2 단백질도 또한, 생물활성 GA 합성을 매개로 하여 식물의 마디 사이의 신장에 관여하고 있다고 생각된다.

여러가지 생장 단계에서 다른 기관에 있어서 내인성 GA 양에 관한 분석으로부터 13-히드록시 지베렐린(GA₁₉, GA₂₀, GA₁)은 영양 생장기관(vegetative organ)으로는 우성이지만, 비 13-히드록실화 지베렐린(GA₂₄, GA₉, GA₄)은 재생 생장기관(reproductive growth organ), 특히 꽃밥에 축적하는 것이 분명해 지고 있다. 이것은 생물활성 GA의 생합성 경로가 기관특이적인 것을 나타내고 있다(Kurogouchi et al (1979) Planta, 146, 185-191; Kobayashi et al. (1984)Agric.Biol.Chem. 48, 2725-2729; Kobayashi et al. (1988) Agric.Biol.Chem. 52, 1189-1194). Os3β-2(D18)와 Os3β-1의 발현 패턴은 이 추측과 일치한다. 실제, Os3β-2 mRNA는 줄기, 어린 잎, 그리고 화서분열조직(inflorescence meristem)에서 높고, Os3β-1 mRNA는 꽃에서 특히 확인되었다. 이들의 일치는 Os3β-2와 Os3β-1의 산물이 각각 GA₂₀과 GA₉에 대한 기질특이성을 지닐 가능성을 나타내고 있다.

Os3β-2와 Os3β-1의 발현은 또한, 벼에서 생물활성 GA의 분포와도 일치한다. 육종 분석과 정량적 분석에 의해 GA₁은 지베렐린 생합성의 가장 활발한 부위인 어린 잎 조직에서 높고(Choi et al. (1995) Physiol. 36(6), 997-1OO1), Os3β-2의 가장 높은 발현도 어린 잎에서 확인되었다. 흥미롭게, 생장점에서 Os3β-2의 발현은 다른 기관과 비교하여 중등도의 레벨이지만, 그럼에도 불구하고 아라비돕시스의 GA1이나 담배의 Nty 등의 많은 GA 생합성 유전자는 활발하게 분열신장하고 있는 조직, 예를들어, 생장점과 뿌리에서 강하게 발현하고 있다(Silverstone et al (1997) Plant J. 12, 9-19). 이런 차이는 GA를 합성하는 기관활성이 단자엽식물과 쌍자엽식물에서는 다를 가능성이 있다는 것을 시사하고 있다. 한편, 내인성의 GA₄양은 개화단계에서의 꽃밥에서 상당히 높고(Kobayashi et al. (1988) Agric.Biol.Chem. 52, 1189-1194; Kobayashi et al. (1990) Plant Cell Physiol. 31(2), 289-293) 이런 사실은 꽃에서 Os3β-1의 특이적 발현과 잘 일치한다. 이런 일치는 GA₄가 Os3β-1 단백질의 작용에 의해 꽃밥에서 합성될 수 있는 것을 나타내고 있는 것일지도 모른다. 따라서, Os3β-2 단백질과 Os3β-1 단백질은 생물활성 GA의 다른 경로에 관계되고 있을 가능성이 있다.

실제, Os3β-1 단백질은 GA₉를 기질로 하여 GA₄(3β수산화) , GA₇(2,3 위치의 불포화화 및 3β수산화), GA₃₄(2β수산화)를 생성하고(도9), GA_2O을 기질로 한 경우에도 동일한 결과가 얻어졌다. 또, GA₅, GA₄₄를 기질로 하였을 때에는 각각에 대응한 3β수산화 지베렐린(GA_3,GA₈₈)를 생성하였다. 또, Os3β-2 단백질은 GA₅, GA₉, GA₂₀, GA₄₄을 기질로 하여 각각에 대응하는 3β수산화 지베렐린(GA₃, GA₄, GA₁, GA₃₈)를 생성하였다(도10)(실시예5).

생물활성 GA가 줄기의 신장뿐만 아니라, 다른 여러가지 식물 생장과정에 필요한 것에 관해서는 그 이외에 몇가지의 보고예가 있다. 예를들어, 꽃의 기관에 관해서는 아라비돕시스의 GA 결손 변이체인 ga1-3이 웅성 불임 표현형(male-sterile phenotype)을 나타낸다고 하는 보고(Koornneef and Van der Veen, (1980) Theor.Appl.Genet 58, 257-263)나 토마토의 stamenless-2나 gib-1이 초기단계에서 꽃밥의 생장을 정지하여 생존 화분입(viable pollen grain)을 형성하지 않는다고 하는 보고(Sawhney, (1974) J.Exp.Bot. 25, 1OO4-1OO9, Jacobsen and Olszewski, (1996) Proc.Natl.Acad.Sci. 93, 9292-9296)가 되어져 있다.

본 발명의 이러한 단백질은 어느 것이든 생물활성 GA의 생성에 관여하고 있다고 생각되기 때문에, 생물활성 GA의 제조에 이용하는 것이 가능한다. 또, 후술하는 바와 같이, 식물체내에서 이러한 단백질의 발현양을 조절함으로써 식물의 생장을 변형시키고 예를들어, 야생형과는 다른 식물형의 식물체를 제조하는 것도 가능하다.

본 발명의 단백질은 당업자에게 공지된 방법에 의한 유전자 재조합 기술을 이용하여 조제한 재조합 단백질으로서 또는 천연의 단백질으로서 조제할 수 있다. 재조합 단백질은 후술하지만, 예를들어 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA(예를들어, 서열번호 3, 4)를 적당한 발현벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 적당한 세포로 도입하여 상기 형질전환 세포로부터 정제함으로써 조제할 수 있다. 또, 천연의 단백질은 예를들어, 조제한 재조합 단백질 또는 그의 부분 펩티드를 적당한 면역동물에게 면역시킴으로써 조제한 항체를 결합한 친화성정제(affinity chromatography)용 컬럼에 본 발명의 단백질을 발현하고 있는 담배나 벼의 조직 등으로부터 조제한 추출액을 접촉시켜 상기 컬럼에 결합하는 단백질을 정제함으로써 조제할 수 있다.

본 발명의 단백질에는 야생형 단백질(서열번호 1, 2)의 기능을 보유한 체로 그 일부의 아미노산을 변형시킨 단백질이 포함된다. 이러한 단백질을 조제하기 위해 당업자에게 잘 알려진 방법으로는 예를들어, site-directed mutagenesis법 (Kramer,W.& Fritz,H.-J. 0ligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA. Methods in Enzymology, 154: 350-367, 1987)을 들 수 있다. 또, 아미노산의 변이는 자연계에서 생기는 것도 있다. 본 발명의 단백질에는 이러한 천연형의 단백질의 GA 3β-히드록실라제 활성을 보유한 채, 그 아미노산 서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 단백질도 포함된다. 단백질에서 아미노산의 변형 부위 및 변형 개수는 변화후의 단백질이GA 3β-히드록실라제 활성을 지니는 한, 특별히 제한은 없다. 아미노산의 변형는 일반적으로는, 5O 아미노산 이내이고, 바람직하게는 3O 아미노산 이내이고, 보다 바람직하게는 1O 아미노산 이내이고, 가장 바람직하게는 3 아미노산 이내이다.

본 발명에서 「GA 3β-히드록실라제 활성」이란 반응기질인 GA_2O또는 GA₉를 이용하였을 때에 보조인자인 철 이온, 2-옥소글루타르산의 존재하에서 GA₁또는 GA₄를 반응생성물로서 합성하는 활성을 가리킨다. 상기 활성은 예를들어, 다음과 같이 하여 검출할 수 있다. 일반적으로는, 발현벡터에 얻어진 cDNA를 삽입하고, 융합 단백질로서 대장균내에서 과잉발현시킨다. 그 결과, 얻어진 세포 추출액을 효소액으로 하여 반응기질인 GA_2O또는 GA₉및 보조인자인 철 이온, 2-옥소글루타르산의 존재하에서 반응을 생체외(in vitro)에서 행하게 하여 최종적으로 반응생성물(GA₁또는 GA₄)을 GC-MS에 의해 확인한다.

본 발명에서는 이러한 단백질을 코드하는 cDNA 및 게놈 DNA가 단리되었다. 따라서, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA에는 이러한 단백질을 코드할 수 있는 한, cDNA 및 게놈 DNA의 둘다 포함된다. Os3β-2 단백질이나 Os3β-1 단백질을 코드하는 DNA는 cDNA라면 각각 서열번호 3 및 4에 기재된 염기서열 정보를 기초로 설계한 프라이머를 이용하여 실생(벼의 생장점) 또는 피지않은 꽃으로부터 단리한 총 RNA를 주형으로 역전사 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. 또, 게놈 DNA는 각각 서열번호 5 및 6에 기재된 염기서열 정보를 기초로 설계한 프라이머를 이용하여 벼의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다

이러한 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA는 예를들어, 재조합 단백질의 제조에 이용할 수 있다. 재조합 단백질의 제조는 예를들어, 하기와 같이 하여 행할 수 있다. 먼저, pMAL-c2 발현벡터(NEB사)의 멀티 클로닝 사이트(multi-cloning site)에서 미리 제한효소 사이트를 설치한 프라이머를 이용하여 RT-PCR에 의해 합성한 전체 길이 cDNA를 서브 클로닝한다. 이 구축물을 정법에 의해 BL21(프로테아제 결실주)에 형질 전환한다. 이렇게 얻어지는 형질전환체를 이용하여 단백질의 유도를 행한다. 대장균은 2x YT, 0.2% 글루코스의 배지에서 37℃ 진탕 배양한다. OD_6OO이 0.6 전후가 된 점에서 IPTG를 최종농도 1mM가 되도록 가하고 다시 18℃에서 24시간 배양한다. 효소액의 추출에 관해서는 배양후, 집균하고 이것을 현탁버퍼(5OmM Tris-HCl, pH8.0, 10% 글리세롤, 2mM DTT, 1mg/ml 리소자임)에 녹인다. 현탁액을 4℃에서 30분 방치 후, -80℃에서 동결할 때까지 인큐베이트한다. 동결한 현탁액을 해동하고 SONlCATOR(HEAT SYSTEMS-ULTRASONICS,lNC.MODEL W-225R)를 이용하여 MAX레벨에서 30초간, 5분의 간격을 두고 2회 초음파 처리를 행한다. 처리한 현탁액을 원심(15,OOO rpm,4℃, 20분)하여 그 상청을 조효소액으로 할 수 있다.

또한, 정제 단백질의 조제는 예를들어, 본 발명의 단백질을 히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질, 글루타치온-S-트랜스페라제(GST)와 융합한 형태로 대장균 등으로 발현시키고 이것을 각각 니켈 컬럼, 아밀로오스 컬럼, GST-글루타치온 컬럼에서 정제함으로써 행할 수 있다. 또한, 정제후에는 필요에 따라, 트롬빈이나 인자 Xa 등의 제한 프로테아제를 이용하여 상기 태그를 분리할 수도 있다.

상기와 같이, 본 발명자 등에 의해 단리된 유전자는 생물활성 GA의 생산을 통해 식물의 생장에 관계하고 있다고 생각되고, 따라서 이들 유전자의 발현을 조절함으로써 식물의 성장을 조절할 수 있다고 말할 수 있다. 특히 Os3β-2는 식물의 마디 사이의 생장에 관여하고 있다고 생각되기 때문에, 식물의 키의 조절 등에 이용할 수 있다. 식물의 키를 조절하는 데에는 산업상의 여러가지 이점이 존재한다.

예를들어, 식물체내에서 본 발명의 유전자의 발현을 억제하여 키를 감소시킴으로써 식물을 굽어지기 어렵게 할 수 있고 그 결과, 자실 중량을 증가시키는 것이 가능하게 된다. 또, 키를 감소시켜 1그루당 식물체의 형을 보다 콤팩트하게 함으로써 단위 면적당 작물을 심을 수 있는 식물체의 개체수를 증가시킬 수 있다. 이것은 특히, 벼를 시작으로 보리, 옥수수 등의 농작물의 생산에서 큰 의의를 갖는다. 또한, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA는 왜성화초 등으로의 응용, 왜성과수 등으로의 응용도 생각할 수 있다. Os3β-1에 관해서는 꽃에서 발현을 억제함으로써 웅성 불임 형질을 유도할 수 있는 가능성이 있다.

한편, 식물체내에서 본 발명의 유전자의 발현을 증가시켜 키를 증가시킴으로써 식물체 전체의 수확량을 증가시키는 것도 생각할 수 있다. 이것은 특히, 사료용 작물 전체 수확량을 향상시키는 데에 의의가 있다.

본 발명에서 식물의 생장을 조절하기 위해 본 발명의 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는, 당업자에게 공지된 여러가지의 방법을 이용할 수 있다. 여기에서 「유전자 발현의 억제」에는 유전자 전사의 억제, 단백질로의 번역 억제가 포함된다. 또, 유전자 발현의 완전한 억제뿐만 아니라 발현의 감소도 포함된다.

식물에서 특정의 내재성 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는, 안티센스 기술을 이용한 방법이 당업자에게 가장 자주 이용되고 있다. 식물세포에서 안티센스 효과는 에커들이 일시적 유전자 발현법을 이용하여 전기천공법으로 도입한 안티센스 RNA가 식물에서 안티센스 효과를 발휘하는 것에서 최초로 증명되었다(Ecker J.R. and Davis, R.W. Proc.Natl.Acad.USA. 83: 5372, 1986). 그후, 담배나 페추니아에 있어도 안티센스 RNA의 발현에 의해 표적 유전자의 발현을 저하시키는 예가 보고되고 있고(van der Krol, A.R. et al, Nature, 333: 866, 1988). 현재에는 식물에서 유전자 발현을 억제시키는 수단으로서 확립되고 있다.

안티센스 핵산이 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용으로는 이하와 같은 복수의 요인이 존재한다. 즉, 삼중쇄 형성에 의한 전사개시 저해, RNA 폴리머라제에 의해 국부적인 개상루프 구조가 만들어진 부위에서 하이브리드 형성에 의한 전사억제, 합성의 진행중 RNA와의 하이브리드 형성에 의한 전사저해, 인트론과 엑손과의 접합점에서의 하이브리드 형성에 의한 스프라이싱 억제, 스프라이좀 형성부위에서 하이브리드 형성에 의한 스프라이싱 억제, mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵에서 세포질로의 이행억제, 캡핑 부위나 폴리(A) 부가부위에서 하이브리드 형성에 의한 스프라이싱 억제, 번역개시 인자 결합부위에서 하이브리드 형성에 의한 번역개시 억제, 개시코돈 근방의 리보솜 결합부위에서 하이브리드 형성에 의한 번역억제, mRNA의 번역영역이나 폴리솜 결합부위에서 하이브리드 형성에 의한 펩티드 사슬의 신장저지 및 핵산과 단백질과의 상호작용 부위에서 하이브리드 형성에 의한 유전자발현 억제 등이다. 이들은 전사, 스프라이싱 또는 번역의 과정을 저해하여 표적유전자의 발현을 억제한다(Hirashima and Inoue, "Shin Seikagaku Jikken Koza (New Biochemistry Experimentation Lectures) 2, Kakusan (Nucleic Acids) IV, Idenshi No Fukusei To Hatsugen (Replication and Expression of Genes), "Nihon Seikagakukai Hen (The Japanese Biochemical Society Ed.), Tokyo Kagaku Dozin, 319-347, 1993).

본 발명에 사용된 안티센스 서열은 상기의 어느 작용으로 표적 유전자의 발현을 억제해도 좋다. 하나의 형태로서는 유전자의 mRNA의 5'말단 근방의 비번역영역에 상보적인 안티센스 서열을 설계하면 유전자의 번역저해에 효과적일 것이다. 그러나, 코드영역 또는 3'측의 비번역영역에 상보적인 서열도 사용할 수 있다. 이렇게, 유전자의 번역영역 뿐만 아니라 비번역영역의 서열의 안티센스 서열을 포함하는 DNA도 본 발명에서 이용되는 안티센스 DNA에 포함된다. 사용된 안티센스 DNA는 적당한 프로모터의 하류에 연결되며 바람직하게는 3'측에 전사종결 시그널을 포함하는 서열이 연결된다. 이렇게 조제된 DNA는 공지의 방법으로 원하는 식물에 형질전환할 수 있다. 안티센스 DNA의 서열은 형질전환되는 식물이 가지는 내재성 유전자(또는 그 상동유전자) 또는 그 일부와 상보적인 서열인 것이 바람직하지만, 유전자의 발현을 유효하게 저해할 수 있는 한, 완전히 상보적이지 않아도 좋다. 전사된 RNA는 표적으로 하는 유전자의 전사산물에 대하여 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상보성을 지닌다. 안티센스 서열을 이용하여 효과적인 표적 유전자의 발현을 저해하는 데에는 안티센스 DNA의 길이가 적어도 15 염기 이상이고, 바람직하게는 1OO 염기 이상이고, 가장 바람직하게는 500 염기 이상이다. 통상, 사용되는 안티센스 DNA의 길이는 5kb보다도 짧고, 바람직하게는 2.5kb보다도 짧다.

내재성 유전자의 발현의 억제는 또 리보자임(ribozyme)을 코드하는 DNA를 이용하여 행할 수도 있다. 리보자임이란 촉매활성을 지니는 RNA 분자에 관한 것을 말한다. 리보자임에는 여러가지의 활성을 지니는 것이 있지만, 그 중에서도 RNA를 절단하는 효소로서의 리보자임 연구에 의해 RNA의 부위특이적인 절단을 목적으로 하는 리보자임의 설계가 가능해졌다. 리보자임에는 그룹Ⅰ의 인트론형이나 RNaseP에 포함되는 M1RNA와 같이 400 뉴클레오티드 이상의 크기인 것도 있지만, 해머헤드형(hammerhead type)이나 헤어핀형(hairpin type)이라고 불리는 4O 뉴클레오티드 정도의 활성 도메인을 가지는 것도 있다(Koizumi, Makoto and Ohtsuka, Eiko (1990) Tanpakushitsu Kakusan Kohso (Protein, Nucleic acid, and Ezyme) 35, 2191).

예를들어, 해머헤드형 리보자임의 자기절단 도메인은 G13U14C15의 C15의 3’측을 절단하지만, 활성에는 U14가 9 위치의 A와 염기쌍을 형성하는 것이 중요시되어 15 위치의 염기는 C 이외에 A 또는 U라도 절단되는 것이 나타나고 있다(Koizumi M. et al. FEBS Lett. 228: 225, 1988). 리보자임의 기질 결합부를 표적 부위 근방의 RNA 서열과 상보적으로 되도록 설계하면 표적 RNA 중의 UC, UU 또는 UA라고 하는 서열을 인식하는 제한효소적인 RNA 절단 리보자임을 생산하는 것이 가능하다(Koizumi M. et al, FEBS Lett. 239: 285, 1988; Koizumi, Makoto and Ohtsuka, Eiko. Tanpakushitsu Kakusan Kohso (Protein, Nucleic acid, andEnzyme), 35: 2191, 1990; Koizumi M. et al, Nucleic Acids Res. 17: 7059, 1989). 본 발명자 등에 의해 단리된 Nty 유전자, Os3β-1 유전자, Os3β-2 유전자(서열번호 3, 4) 중에는 리보자임의 표적이 될 수 있는 부위가 다수 존재한다.

또한, 헤어핀형 리보자임도 본 발명의 목적을 위해 유용하다. 헤어핀형 리보자임은 예를들어, 담배 링 스팟 바이러스(tabacco ringspot virus)의 새테라이트(satellite) RNA의 마이너스 사슬에서 발견된다(Buzayan, J.M., Nature 323: 349, 1986). 이런 리보자임도 표적특이적인 RNA 절단을 일으키도록 설계할 수 있는 것이 나타나 있다(Kikuchi, Y. and Sasaki, N. Nucleic Acids Res. 19: 6751,1992; Kikuchi, Yo. Kagaku To Seibutsu (Chemistry and Biology) 30: 112, 1992).

표적을 절단할 수 있도록 설계된 리보자임은 식물세포 중에서 전사되도록 컬리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)의 35S 프로모터 등의 프로모터 및 전사종결 서열에 연결된다. 그러나, 그 때 전사된 RNA의 5' 말단이나 3' 말단에 여분의 서열이 부가되어 있으면 리보자임의 활성을 잃어 버리는 경우가 있다. 이러한 경우, 전사된 리보자임을 포함하는 RNA로부터 리보자임 부분만을 정확하게 절개하기 위하여 리보자임 부분의 5'측이나 3'측에 트리밍(trimming)을 행하기 위해 시스에 움직이는 다른 트리밍 리보자임을 배치시키는 것도 가능한다(Taira K. et al. Protein Eng. 3: 733, 1990; Dzianott A.M. and Bujarski J.J. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86: 4823, 1989; Grosshans C.A. and Cech R.T. NucleicAcids Res. 19: 3875, 1991; Taira K. et al. Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991). 또, 이러한 구성단위를 세로로 정렬함으로써 표적 유전자내의 복수의 부위를 절단할 수 있도록 하여 보다 효과를 높힐 수도 있다(Yuyama N. et al. Biochem.Biophys.Res.Commun. 186: 1271, 1992). 이렇게 리보자임을 이용하여 본 발명에서 표적으로 된 유전자의 전사산물을 특이적에 절단하여 상기 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

내재성 유전자의 발현의 억제는 또한, 표적 유전자 서열과 동일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA의 형질전환에 의해 초래된 공억제(co-suppression)에 의해서도 달성된다. 「공억제」란 식물에 표적 내재성 유전자와 동일 또는 유사한 서열을 가지는 유전자를 형질전환에 의해 도입하면 도입한 외래 유전자 및 표적 내재성 유전자의 양쪽의 발현이 억제되는 현상을 말한다. 공억제의 기전의 상세한 것은 분명하지는 않지만, 식물에서는 종종 관찰된다(Curr.Biol. 7: R793, 1997; Curr.Biol. 6: 810, 1996). 예를들어, 본 발명의 유전자가 공억제된 식물체를 얻기 위해서는 본 발명의 유전자 또는 이것과 유사한 서열을 가지는 DNA를 발현할 수 있도록 제작한 벡터 DNA로 목적의 식물을 형질전환하면 좋다. 공억제에 이용되는 유전자는 표적 유전자와 완전히 동일할 필요는 없지만, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상(예를들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 지닌다.

아미노산 서열이나 염기서열의 동일성은 Karlin and Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 5873-5877, 1993)에 의해 결정할 수 있다.이 알고리즘에 근거하여 BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되고 있다(Altschul et al. J.Mol.Biol. 215: 403-410, 1990). BLAST에 근거하고 BLASTN에 의한 염기서열을 분석하는 경우에는 파라미터는 예를들어, score=1OO, wordlength=12로 한다. 또한, BLAST에 근거하고 BLASTX에 의한 아미노산 서열을 분석할 경우에는 파라미터는 예를들어, score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우에는 각 프로그램의 디폴트 파라미터(Default parameter)를 이용한다. 이러한 분석방법의 구체적인 방법은 공지된 것이다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

본 발명의 유전자의 발현을 억제하는 기능을 지니는 DNA를 이용하여 식물의 생장을 변형시키기 위해서는, 상기 DNA를 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 식물세포로 도입하며 이렇게 얻어진 형질전환 식물세포를 재생시키면 좋다. 사용되는 벡터로는 식물세포내에서 삽입 유전자를 발현시키는 것이 가능한 것이라면 특별히 제한은 없다.

예를들어, 본 발명자 등에 의해 단리된 유전자의 프로모터를 이용할 수 있다. 또한, 식물세포내에서의 구조적인 유전자 발현을 행하기 위한 프로모터(예를들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터)를 가지는 벡터를 이용할 수 있다. 또, 식물의 조직특이적인 프로모터를 이용하면 식물의 특정한 조직, 예를들어, 잎이나 꽃, 과실 등을 특이적으로 변형시킬 수 있을지도 모른다. 조직특이적 프로모터로는, 종자특이적 프로모터로서 강낭콩의 β-파세오린(phaseoline)(Bustos et al. (1991) EMBO J. 10: 1469-1479)이나 대두의 글리시닌(glycinin)(Lelievreet al. (1992) Plant Physiol. 98: 387-391), 잎 특이적 프로모터로서 완두콩의 RbcS 유전자(Lam and Chua (1990) Science 248: 471-474)나 밀의 Cab1 유전자(Gotorn el al. (1993) Plant J. 3: 509-518), 뿌리 특이적인 프로모터로서 담배의 TobRB7 유전자(Yamamoto et al. (1991) Plant Cell 3: 371-382)나 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)의 rolD 유전자(Elmayan and Tepfer (1995) Transgenic Res 4: 388-396)를 들 수 있다. 또, 외적인 자극에 의해 유도적으로 활성화되는 프로모터를 가지는 벡터를 이용할 수도 있다.

벡터를 삽입하는 식물세포로서는, 특별히 제한은 없지만, 본 발명 등에 의해 단리된 유전자가 유래하는 벼나 담배가 특히 바람직하다. 즉, 여기에서 말하는 「식물세포」에는 여러가지의 형태의 식물세포, 예를들어, 현탁 배양 세포, 프로토프라스트(protoplast), 잎의 절편, 컬스(cali) 등이 포함된다. 식물세포로의 벡터의 도입은 폴리에틸렌글리콜법, 전기천공법(electroporation), 아그로박테리움을 매개시키는 방법, 파티클간법(particle gun method) 등 당업자에게 공지된 여러가지의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환 식물세포에서의 식물체의 재생은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 이렇게 형질전환 식물체가 생산되면 상기 식물체로부터 그 번식매체(예를들어 종자, 덩이줄기, 절수 등)를 얻고, 이것을 기초로 본 발명의 형질전환 식물체를 양산할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서는 본 발명자들에 의해 단리된 DNA의 발현을 촉진하는 것으로, 식물의 생장을 증대시킬 수 있을지도 모른다. 이 경우, 상기 DNA를 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 식물세포로 도입하여 이렇게 얻어진 형질전환 식물세포를 재생시키면 좋다. 식물세포내에서 발현시키기 위하여 이용되는 벡터, 벡터가 도입되는 식물세포, 식물체의 재생 등의 방법은 상기 안티센스 등을 이용하는 경우와 마찬가지이다.

<실시예1. GA 3β-히드록실라제를 코드하는 cDNA 클론의 단리>

단자엽 식물의 GA 3β-히드록실라제를 단리하였다고 하는 보고예는 없다. 몇개인가의 GA 3β-히드록실라제는 쌍자엽 식물로부터 클로닝되어 있다(Chiang et al. 1995; Martin et al. 1997; Lester et al. 1997).

GA 3β-히드록실라제를 코드하는 부분적 단편을 단리하기 위하여 벼의 게놈DNA를 주형으로 하여 보고된 쌍자엽 식물의 GA 3β-히드록실라제 서열에서 보존영역으로부터 디자인한 축중 프라이머(5'-프라이머:5'-GTNGTNAARGTNGGNGARRT-3’/ 서열번호: 7, 3'프라이머: 5'-AYYTARTCRTTGGANGTNAC-3'/서열번호: 8)를 이용하여 PCR을 행하였다. 그 결과, 보고된 GA 3β-히드록실라제 서열에서 예상되는 사이즈에 대응한 210bp의 DNA단편을 얻었다.

다음으로, 전체 길이의 클론을 단리하기 위하여 이 단편을 프로브로 하여 벼의 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 그 결과, 몇개의 클론을 단리하고, 각 게놈 클론의 제한맵에 근거하여 2군으로 분류하였다. 마지막으로 각 군의 하나를 완전하게 시퀀싱하여 각각의 클론을 Os3β-1과 Os3β-2(Os3β-1과 Os3β-2;Oriza sativaGA 3β-히드록실라제-1, -2)라고 명명하였다. 각각의 클론의 염기서열을 서열번호 5 및 6에 나타낸다. Os3β-1은 프로브로서 이용한 단편과 공통된 서열을 지니지만, Os3β-2는 단편으로부터 대응하는 영역과 다른 서열을 포함하고 있었다.

다음으로, 각 클론의 서열에 근거하여 cDNA 단편을 얻기 위하여 실생(벼의 생장점) 또는 피지않은 꽃으로부터 단리한 총 RNA를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 이에 의해, GA 3β-히드록실라제를 코드하는 완전한 크기의 cDNA 클론을 얻었다. Os3β-1 cDNA 및 Os3β-2 cDNA는 각각 379 잔기 및 373 잔기의 폴리펩티드를 코드하는 한 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하고 있었다. 각각의 클론의 염기서열을 서열번호 3 및 4에 나타낸다. Os3β-2 게놈 DNA는 짧은 사이즈(110 bp)의 단일의 인트론을 포함하고, 인트론은 쌍자엽 식물에서 지금까지 보고된 GA 3β-히드록실라제와 동일한 위치에 존재하고 있었다. Os3β-1 게놈 DNA는 2개의 인트론을 포함하고 있었다. 하나는 Os3β-2 게놈 DNA와 동일한 위치에 존재하고, 이것은 거의 같은 정도의 크기였다(11Obp). 다른 하나는 보조인자(cofactor)인 2-옥소글루타르산(400bp)의 결합부위에 존재하였다(데이터는 나타내지 않음). 양 클론의 추정 아미노산 서열은 다른 GA 3β-히드록실라제와 고도의 유사성을 나타내지만, 그것들은 서로간에도 고도의 유사성을 나타내었다(56.6%의 동일성과 88.2%의 유사성).

즉, 염기서열은 자동 시퀀싱 시스템(ABI373A)을 이용한 디데옥시뉴클레오티드 체인-터미네이션법(dideoxynucleotide chain-termination)에 의해 결정하였다. 또, 서열의 분석은 GENETYX 컴퓨터 소프트웨어(Software Kaihatsu Co., 일본)를 이용하여 실시하였다.

<실시예2. d18 대립유전자의 동정과 특징>

왜성 벼 식물에 관한 정량적 분석과 바이오 에세이로부터 D18 유전자가 GA 3β-히드록실라제를 코드하는 것이 나타났다. D18좌는 제1염색체상에서 동정되며 이 염색체의 하단에서 FS-2좌에 인접한다. 단리된 GA 3β-히드록실라제가 D18 유전자에 대응하는 것을 조사하기 위하여 RFLP(제한단편장다형)분석을 이용하여 벼의 게놈 상에 2개의 클론을 맵핑하였다.

Os3β-1 또는 Os3β-2의 RFLP는 EcoRI 또는 ApaI로 각각 소화한 아소미노리(Asominori, 자포니카종의 벼)와 IR 24(인디카종의 벼) DNA의 사이에 존재하였다. 아소미노리와 IR 24의 교배의 F2 자손의 소화된 게놈 DNA에 대하여 연쇄분석을 행하였다. Os3β-1과 Os3β-2는 각각 제5염색체의 상단과 제1염색체의 하단에 맵핑된다(도3). 이 결과는 Os3β-2가 D18좌에 대응하는 것을 시사하고 있다.

Os3β-2가 D18좌인 것을 확인하기 위하여 새로운 분석을 행하였다. D18 유전자의 기능 상실에 의하여 생긴 4개의 독립된 통상 변이체가 존재한다. 이러한 변이는 γ선조사를 이용한 변이유발에 의한 D18 유전자의 DNA 전위 및/또는 결실에 의해 생길 가능성이 있다. 따라서, 야생형과 이러한 변이체의 사이의 Os3β-2 위치에서의 RFLP는 Os3β-2가 D18 유전자라면 관찰될 가능성이 있다.

야생형(시오카리 또는 아키바레)과 d18 대립유전자(ld18^k, ld18^h그리고 d18-AD)에서의 게놈 DNA에 관하여 DNA 겔 플롯 분석을 행하였다. ld18^k와 ld18^h는 시오카리계의 동종 동계통주로, d18-AD는 에틸렌이민(EI)에 의한 아키바레의 변이유발로부터 단리하였다. DNA 겔 플롯 분석에 있어서는, 우선 벼의 게놈 DNA(레인당 1μg)을 제한효소로 소화시키고, 아가로스겔 전기 영동에 의해 분리하여 하이본드 N+나일론 멤브레인(Hybond N+ nylon membrane, Amersham사)에 전이시켰다(Sambrook et al. 1989). 하이브리다이제이션은 0.25M Na₂HPO₄, 1mM EDTA 그리고 7% SDS 중에서 65℃로 실시하였다. 필터는 2×SSC, 0.1% SDS 중에서 65℃로 15분의 세정을 2회, 그리고 0.1×SSC, 0.1% SDS 중에서 65℃로 15분의 세척을 1회 행하였다.

8개의 효소(BamHI, BglII, ApaI, KpnI, DraI, EcoRV, EcoRI, 그리고HindIII)를 이용하여 이들 게놈 DNA를 소화시키고, 야생형 식물과 변이체의 간의 RFLP로 탐색한 결과, d18-AD와 ld18^h로부터의 DNA를 ApaI로 소화시킨 때에 다형성이 확인되었다. 한편, ld18^k는 시험한 어떠한 효소로 소화시킨 때라도 다형성을 나타내지 않았다(도4).

RFLP 분석의 결과는 d18-AD가 D18좌에 긴 결실을 지니는 것을 시사하고 있고, ld18^h는 ApaI 부위를 포함하는 짧은 결실을 지닌다. 이 검토를 확인하기 위해, 모든 d18 대립유전자의 전 코드서열을 직접 분석하고, 이들을 야생형의 Os3β-2의 서열과 비교하였다.

구체적으로는 D18의 5'와 3' 비코드서열에서 유래하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, D18, d18^h, d18^k그리고, d18-w로부터의 전 코드영역를 포함하는 1.6kb 단편을 증폭하고, 이어서 증폭된 단편을 시퀀싱하였다.

그 결과, 예상한 바와 같이 모든 d18 대립유전자는 다양한 위치에서 그 Os3β-2 코드서열을 변형시키고 있지만(표1), d18-AD는 PCR산물을 생성하지 않았다.

<표1>

대립유전자	변이체의 특성	코드서열에서위치	변이의 결과
d18-AD(아키바레-와세이)	7kb-결실		D-18 ORF의 전길이 결실
d18^h(호세츠-와세이)	GGG에서 GG으로1 염기결실	Gly²⁵¹	프레임시프트에 의해 38의 신규 아미노산이 부가, 폴리펩타이드의 선단이 절제됨
d18^k(코타케-타마니시키)	CGC에서TGC으로	Arg¹⁴⁵	Asp에서 Cys로 아미노산이 치환됨으로써 산물이 변형됨
d18-w(와토-c)	9 염기결실	Val⁵⁷에서Arg⁵⁹으로	인프레임 결실에 의해 아미노산 3개의 부분적 잔기가 결실되어 산물이 변형됨

^a아래선을 친 부분은 18^k대립유전자에서 뉴클레오타이드의 치환을 나타내고 있다.

이것은 이 대립유전자가 거의 완전하게 그 코드서열을 잃어버리고 있다고 하는 상기 추측을 지지하는 것이다(데이터는 안 나타냄). ld18^k의 서열에서는 개시코돈으로부터 433 위치의 염기에서의 C에서 T로의 치환에 의해 아르기닌-168이 시스틴으로 변형하였다. d18-w에서는 169~177 위치에서의 9개의 염기의 인플레임(in-flame) 손실에 의해 발린 57에서 아르기닌 59까지의 아미노산 3개가 결핍되었다. ld18^h에는 염기 G의 결실에 의해 리딩 플레임이 시프트(shift)하고 있다. 이러한 결과는 Os3β-2 유전자가 D18h좌이고 GA 3β-히드록실라제를 코드하는 것을 증명한다.

<실시예3. Os3β-2(D18) 그리고 Os3β-1 유전자의 생장과정에서의 조절>

식물의 생장과정에서의 D18과 Os3β-1 유전자의 발현을 조사하기 위하여 RNA겔 플롯 분석을 실시하였다. RNA 겔 플롯 분석에 있어서는 표준적인 방법(Sambrook et al. 1989)에 따라 총 RNA를 다양한 기관 또는 조직으로부터 조제하였다. RNA(시료당 10μg)를 겔 전기영동으로 분리하여 하이본드 N+나일론 멤브레인(Amersham사)에 옮겼다. 하이브리다이제이션은 5×SSC, 10%(w/v) 황산 덱스트란, 0.5%(w/v) SDS, 0.1mg/ml 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 65℃로 실시하였다. 필터는 2×SSC, 0.1% SDS 중에서 65℃로 15분 세정을 2회, 그리고 0.1×SSC, 0.1% SDS 중에서 65℃로 15분 세정을 1회 행하였다. 프로브로는 D18 전체 길이의 cDNA로부터의 BssHII-PvuII(519bp) 단편 및 Os3β-1로부터의 KpnI-PvuII 단편(31Obp)을 이용하였다.

그 결과, D18 유전자는 조사한 모든 기관에 발현되고 있다(도5). 발현 레벨은 줄기, 어린 잎, 그리고 화서분열조직에서 높고 엽신과 엽축에서 낮았다. 대조적으로 Os3β-1 mRNA 발현은 꽃에서는 특히 높고, 엽신과 엽축에서는 낮았다.

또, D18과 Os3β-1은 고도의 서열 유사성을 공유하기 때문에 게놈 서던 분석에 의한 크로스-하이브리다이제이션의 정도를 조사하였다. 각각의 특정의 프로브를 게놈 서던 하이브리다이제이션에 프로브로서 이용한 결과, 크로스-하이브리다이제이션은 검출되지 않았다(데이터는 안 나타냄).

<실시예4. Os3β-2(D18) 유전자의 발현 억제에 의한 왜성화 식물체의 생산>

Os3β-2의 전체 길이 cDNA는 pBS-SK⁺에서 BamHI-HindIII 부위로 클로닝되었고(도7), BamHI-HindIII 처리에 의한 상기 벡터의 절단에 의해 상기 cDNA를 모아낸 후, 평활 말단화(blunt end)하였다. Os3β-2 유전자의 안티센스를 발현한 벡터는 이 평활 말단화된 전체 길이 cDNA를 pAct-NOS/Hm2의 SmaI 부위로 삽입함으로써 구축하였다(도8).

이것을 일렉트로포레이션법(electroporation method)에 의해 아그로박테리아 EHA101주에 형질전환시켰다. 벼 발아 종자에 그 아그로박테리아를 공존시킨 후, 카나마이신(kanamycin) 및 하이그로마이신(hygromycin)을 포함하는 선별배지에서 3주간 배양하여 세포를 선별한 후, 재분화 배지로 이식하여 수십 개체의 형질전환 식물체를 얻었다. 그 결과, Os3β-2 유전자의 안티센스를 발현하는 식물체는 야생형 식물체와 비교하여 왜성화되었다(도6).

<실시예5. 재조합 GA 3β-히드록실라제의 기능>

Os3β-1 유전자 및 Os3β-2 유전자에 관하여 단백을 코드하는 것이 예상되는 부분의 cDNA를 pMAL-c2 발현벡터(New England Biolabs, Beverly, MA)로 번역 융합체를 얻기 위해 센스방향으로 삽입하였다. 얻어진 구축물 pMAL-Os3β-1 및 pMAL-Os3β-2를 대장균주 JM109 내에서 발현시켰다. 세균세포를 1OOmg/L 암피실린을 함유하는 2x YT 배지에서 하룻밤 37℃로 진탕배양하였다. 하룻밤 배양한 후, 배양물을 1OOmg/L 암피실린을 함유하는 신선한 2x YT 배지에서 1OO배 희석하여 30℃로 진탕 배양하였다. 4시간 후, IPTG를 최종농도 1mM이 되도록 첨가하여 17℃로 다시 18시간 진탕배양하였다. 배양 종료후 세균세포를 모아 세정버퍼(5OmM Tris-HCl,pH8.0, 10%[w/v] 글리세롤, 2mM DTT)로 세정하고, 리소자임(1mg/ml)을 포함하는 세정버퍼에 현탁하여 빙상에서 30분간 정치하였다.

이렇게 얻어진 용균액을 초음파 처리하고 원심하여 그 상청을 SDS-PAGE에 걸어 융합단백의 발현을 확인하였다. Os3β-1의 융합단백질의 활성을 검정하기 위하여 이 상청을 이용하여 광범위한 지베렐린류 및 보조인자류(아스코르빈산, 2가철, 2-케토글루타르산)와 함께 인큐베이션을 행하였다. Os3β-2의 융합단백질의 활성 검정을 위해서는 이 상청을 아밀로오스 수지를 이용한 컬럼에서 카탈로그에 기재된 방법에 의해 정제하고 이 정제 단백액을 이용하여 동일한 인큐베이션을 행하였다. 대사된 지베렐린류는 GC-MS를 이용하여 동정하였다. 그 결과, Os3β-1의 융합단백질은 GA₉를 기질로 하였을 때, GA₄(3β수산화), GA7(2,3 위치의 불포화화 및 3β수산화), GA₃₄(2β수산화)의 생성이 확인되었다(도9). 생성물 중에는 GA₄와 GA₇이 주요한 산물이었다. GA_2O를 기질로 한 경우에도 동일한 결과가 얻어졌다. 또, GA₅, GA₄₄를 기질로 했을 때에는 각각에 대응하는 3β수산화 지베렐린(GA₃, GA₈₈)만을 얻었다. 한편, Os3β-2의 융합단백질은 GA₅, GA₉, GA₂₀, GA₄₄를 기질로 했을 때에 각각에 대응하는 3β수산화 지베렐린(GA₃, GA₄, GA₁, GA₃₈)을 생성하였다(도10).

이 결과, Os3β-1 유전자는 3β수산화 외에 2,3 위치의 불포화화, 2β수산화의 핵반응을 촉매하는 효소를 코드하는 유전자인 것이 분명해졌다. 또, Os3β-2 유전자는 3β수산화 반응을 촉매하는 효소를 코드하는 유전자인 것이 분명해졌다.

본 발명에 의해 식물의 지베렐린의 활성화에 관여하는 신규 단백질 및 유전자뿐 아니라 상기 유전자의 발현을 조절함으로써 식물체내에서 지베렐린 활성이 변형된 식물이 제공되었다. 본 발명에 의해 식물체내의 지베렐린 활성화를 변화시키고, 식물의 식물형을 인위적으로 변형시키는 것이 가능해졌다. 식물체내의 지베렐린 활성화를 억제함으로써 특히, 신장 생장의 억제에 의해 일어나게 되는 식물의 왜성을 야기할 수 있다. 이 때문에 예를들어, 벼에서는 많은 비료에 의해 생육을 촉진해도 신장이 지나치게 자라 굽어버리는 것도 없어진다. 또한, 잎의 수광량의 효율이 상승하기 때문에 수확량의 대폭적인 증가가 기대될 수 있다. 또한, 수확이나 생육관리의 작업의 효율화도 꾀할 수 있다. 또, 식물체내에서 본 발명의 유전자의 발현을 증가시키고, 식물체내의 지베렐린 활성화를 촉진함으로써 식물체 전체의 수확량을 증가시키는 것도 고려될 수 있다. 이것은 특히, 사료용 작물 전체의 수확량을 향상시키는 데에 있어서 의의가 있다.

Claims

지베렐린 3β 수산화효소 활성을 지니는 단백질을 코드하는 하기 (a) 내지 (c) 중의 어느 하나의 DNA:

(a) 서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 DNA;

(b) 서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA;

(c) 서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 DNA;
제1항의 DNA 또는 그 전사산물과 상보적인 안티센스 RNA를 코드하는 DNA.
제1항의 DNA의 전사산물을 특이적으로 개열하는 리보자임 활성을 지니는 RNA를 코드하는 DNA.
식물 세포에 있어서 발현시에, 공억제 효과에 의해 내인성의 제1항의 DNA의발현을 억제하는 RNA를 코드하는 DNA.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 DNA를 발현가능하게 보유하는 형질전환 식물세포.
제6항의 형질전환 식물세포를 포함하는 형질전환 식물체.
제7항의 형질전환 식물체의 번식재료.
제1항의 DNA에 의해 코드되는 단백질.
제1항의 DNA를 발현가능하게 보유하는 형질전환세포를 배양하고, 상기 세포또는 그 배양상청으로부터 발현시킨 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 제9항의 단백질의 제조방법.
식물세포내에서 제1항의 DNA의 발현양을 조절하는 것을 특징으로 하는 식물의 생장을 변화시키는 방법.
식물세포내에서 제1항의 DNA의 발현양을 조절하는 것을 특징으로 하는 식물의 식물형을 변화시키는 방법.