JP2004275048A - プラスチッドの数又は大きさを制御するｄｎａ及びタンパク質 - Google Patents
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Abstract
【課題】植物細胞内のプラスチッドの数及び大きさを変化させる遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質の提供。
【解決手段】本発明の、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するために用いるＤＮＡは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来の、特定の配列で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＡＲＣ３タンパク質をコードするＤＮＡである。本発明は該遺伝子を利用して、光合成能や花卉の色調の上昇した植物を提供する。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明の、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するために用いるＤＮＡは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来の、特定の配列で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＡＲＣ３タンパク質をコードするＤＮＡである。本発明は該遺伝子を利用して、光合成能や花卉の色調の上昇した植物を提供する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞内のプラスチッドの数及び大きさを変化させる遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、上記遺伝子を利用して、光合成能や花卉の色調が上昇した植物を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
植物細胞内に存在する葉緑体は、光合成細菌と真核生物との共生によって発生した器官であると言われている。この葉緑体は植物細胞内で光合成等を行う細胞内小器官であるが、組織によっては光合成を行わず、エチオプラストやアミロプラスト等の器官に変化する。これらを全てまとめてプラスチッドと称している。
【０００３】
従来、植物の光合成能を上昇させようとする研究が行われているが、光合成を担うタンパク質等を改変することが主流であった。しかしながら、光合成を担うタンパク質を個々に改変しても、複雑な光合成反応を効率よく上昇することは困難であった。また、光合成が行われる場としての葉緑体の植物細胞における数は厳密に制御されているため、タンパク質の改変による方法では光合成能を上昇させる方法として限界があると考えられていた。
【０００４】
一方、花卉の色調を上昇させ、花卉の商品価値を高めようとするために、色素合成遺伝子を花の細胞内で発現させることも行われている。しかし、この方法によっても、色素の蓄積の場としての植物細胞内におけるプラスチッドの数は制御されているため、色素の蓄積量が制限されていた。
【０００５】
従って、植物細胞内の葉緑体等のプラスチッドの数を増加することができれば、植物の光合成能を上昇させたり、花卉の色調を上昇させることが可能である。
従来、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさの変化した植物が知られている。例えば、Ｐｙｋｅ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｌｅｅｃｈ Ｒ．Ｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （１９９２） ９９， １００５−１００８には、シロイヌナズナの変異体が開示されている。この文献に開示されたシロイヌナズナの変異体は、葉肉細胞内の葉緑体の大きさが通常のものより大きく、その数は通常のものよりも少なくなっている。上記文献に開示されたシロイヌナズナの変異体の変異に関する遺伝子の解析はまだ行われていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｐｙｋｅ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｌｅｅｃｈ Ｒ．Ｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （１９９２） ９９， １００５−１００８
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、植物細胞内のプラスチッドの数及び大きさを変化させる遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質を提供することを目的とする。また、本発明は、上記遺伝子を利用して、光合成能や花卉の色調が上昇した植物を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ポジショナルクローニングの手法を用いることにより、植物細胞内においてプラスチッドの数及び大きさを制御する遺伝子を同定し、その遺伝子を用いて植物の光合成能や花卉の色調を改良することが可能であるという知見を得た。
【０００９】
すなわち、本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するために用いる、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡを提供するものである。
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１０】
また、本発明は、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するために用いる、上記ＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを提供するものである。
また、本発明は、上記ＤＮＡを有する組換えベクターを提供するものである。また、本発明は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供するものである。
また、本発明は、上記ＤＮＡによりコードされるタンパク質を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、上記形質転換体を培養し、該形質転換体又はその培養上清から、発現させたタンパク質を回収する工程を含む、上記タンパク質の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、上記ＤＮＡ、又は上記組換えベクターを保持する形質転換植物細胞を提供するものである。
また、本発明は、上記形質転換植物細胞を含む形質転換植物体を提供するものである。
また、本発明は、上記タンパク質と結合する抗体を提供するものである。
また、本発明は、上記ＤＮＡ、上記タンパク質、又は上記抗体を含む、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するための組成物を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について説明する。
本発明は、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御に関与する「ＡＲＣ（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）３」タンパク質を提供する。シロイヌナズナ葉緑体変異体はａｒｃシリーズは、肉眼観察では野生型との相違は検出されないが、葉緑体の数と大きさとが変化した変異体であることが報告されている。この変異体の原因遺伝子として、ポジショナルクローニングの手法を用いて、本発明者らが単離したＡＲＣ３遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に、この遺伝子がコードするＡＲＣ３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。
【００１３】
シロイヌナズナにおいて、葉緑体の数及び大きさを変化させる表現型をもたらすことが知られているａｒｃ変異が、野生型の産生するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、Ａｔｌｇ７５０１０の２００１番目のグアニンがアデニンに変換され、Ａｔｌｇ７５０１０タンパク質の６６７番目のトリプトファンが停止コドンになっていることが見出された。この事実は、本発明者らが単離したＡＲＣ３遺伝子が、植物細胞内における葉緑体の数及び大きさの制御に関与していることを証明するものである。このようなＡＲＣ３遺伝子と植物細胞内の葉緑体の数及び大きさの制御との密接な関係は、植物においてＡＲＣ３遺伝子の発現を調節することにより、植物細胞内の葉緑体等のプラスチッドの数及び大きさを制御し得ることを意味する。従って、「ＡＲＣ３」タンパク質及び「ＡＲＣ３」遺伝子は、植物のプラスチッドの数や大きさを制御するために、もしくは制御するための標的として利用することが可能である。
【００１４】
また、本発明は、「ＡＲＣ３」タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、機能的に同等なタンパク質を提供する。ここで「機能的に同等」とは、タンパク質がプラスチッドの数及び大きさを制御する機能を有することを意味する。
【００１５】
本明細書において、「実質的に同一」及び「機能的に同等」とは、タンパク質の活性、すなわち植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御する活性が実質的に同一であることを意味する。一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加された場合、活性が同一であれば、その欠失、置換又は付加がなされたタンパク質は欠失、置換又は付加されていないものと実質的に同一、又は機能的に同等である。このような、実質的に同一、又は機能的に同等なタンパク質を単離する方法の一つの態様としては、タンパク質中のアミノ酸に変異を導入する方法が行われる。
【００１６】
一般的に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列との相同性の程度が、全体の約８０％以上、好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜５０個、更に好ましくは１〜３０個程度、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質も実質的に同一である。なお、配列の相同性は、例えば遺伝子配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発株式会社）やＢｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？Ｊｆｏｒｍ＝１）等による相同性検索により決定することができる。
【００１７】
すなわち、当業者であれば、公知の方法によって、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質中のアミノ酸を適宜置換などして、これと同等の機能を有する改変タンパク質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じる。本発明のタンパク質には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有し、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御する機能を有するタンパク質も含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の改変は、通常は、全アミノ酸の５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。アミノ酸の改変は、例えば、変異や置換であれば「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」、「ＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いて行うことが可能である。欠失であれば「Ｑｕａｎｔｕｍ ｌｅａｐ Ｎｅｓｔｅｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いて行うことが可能である。
【００１８】
また、実質的に同一、又は機能に同等なタンパク質を単離する方法の他の態様としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ １９７５ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８：５０３、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ＰＣＲ技術（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ （ｅｄ．） １９８９． ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）等が挙げられる。すなわち、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又はその一部をプローブとして、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡの一部にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、これと高い相同性を有するＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡから、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることができる。上述したように、ハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術によって単離されたＤＮＡによりコードされる「ＡＲＣ３」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。
【００１９】
ＡＲＣタンパク質をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＲＣタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明に含まれる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、６５℃の温度でハイブリダイゼーションさせた後、０．１％濃度のＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸ナトリウム）もしくは２ＸＳＳＰＥ（３．６Ｍ ＮａＣｌ， ０．２Ｍ リン酸ナトリウム液（ｐＨ７．７），０．０２Ｍ Ｎａ２−ＥＤＴＡ）中で、６５℃の温度で１０分間の洗浄を合計３回行うという条件で行なうことができる。よりストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいては、６５℃の温度でハイブリダイゼーションさせた後、０．１％濃度の ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣもしくは２ＸＳＳＰＥ液中で、６５℃の温度で１０分間洗浄し、次に０．１％濃度の ＳＤＳを含む１ＸＳＳＣもしくは１ＸＳＳＰＥ液中で、６５℃の温度で１０分間の洗浄を２回行えばよい。よりストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいては、６５℃の温度でハイブリダイゼーションさせた後、０．１％ ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣもしくは２ＸＳＳＰＥ液中で、６５℃で１０分間洗浄し、次に０．１％ ＳＤＳを含む１ＸＳＳＣもしくは１ＸＳＳＰＥ液中で６５℃で１０分間洗浄し、さらに０．１％ ＳＤＳを含む０．１ＸＳＳＣもしくは０．１ＸＳＳＰＥ液中で６５℃で１０分間洗浄すればよい。ハイブリダイゼーション液は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」に記載されているもの等を用いればよい。
【００２０】
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、天然のタンパク質として調製することができる。また、遺伝子組み換え技術を利用して調製した組み換えタンパク質として調製することもできる。天然のタンパク質は、例えば、下記の方法により調製された組み換えタンパク質をウサギなどの小動物に免疫して得た抗体を適当な吸着体（ＣＮＢｒ活性化アガロースやトシル活性化アガロース）に結合させてカラムを作製し、得られたカラムを利用し、上述した、Ｐｙｋｅ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｌｅｅｃｈ Ｒ．Ｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （１９９２） ９９， １００５−１００８に記載のシロイヌナズナの葉肉細胞からのタンパク質抽出液を精製することにより調製することが可能である。一方、組み換えタンパク質は、常法により、例えば、配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な細胞に導入して形質転換細胞を得、該形質転換細胞から精製することにより調製することが可能である。
なお、一旦、本発明タンパク質の遺伝子の塩基配列が決定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明のタンパク質の遺伝子を得ることができる。更に、部位特異的突然変異誘発法等によって、本発明のタンパク質の遺伝子の変異型を合成することも可能である。
【００２１】
なお、遺伝子に変異を導入する方法としては、例えばＫｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、変異の導入を行うことができる。
【００２２】
本発明のタンパク質コードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、適当なベクターに、本発明のタンパク質の遺伝子（例えば、配列番号：２で表わされるを塩基配列からなるＤＮＡ）を連結（挿入）することにより得ることができる。ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより実施される。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５又はｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ＹＥｐ１３又はＹＣｐ５０等）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス又はバキュロウイルス等の動物ウイルス等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーター等が好ましい。
【００２３】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。
【００２４】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、ＤＨ５α及びＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕及びバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞及びＨＥＫ２９３細胞等が用いられる。
【００２５】
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）； Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及び Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００２６】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子を植物に形質転換し、トランスジェニック植物を得る場合は、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等によって植物中に遺伝子を導入することができる。例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧５００〜６００Ｖ、１００μＦ、２０ｍｓｅｃの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。
【００２７】
アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等の適当なアグロバクテリウムに導入し、この株をバキュームインフィルトレーション法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃ． Ｒ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｓｅｒ． ＩＩＩ Ｓｃｉ． Ｖｉｅ， ３１６， １１９４−１１９９に記載の方法）等に従って宿主の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物細胞を得ることができる。
【００２８】
パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）自体をそのまま使用するか、切片を調製した後に使用するか、又はプロトプラストを調製して使用する。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＢＩＯＬＩＳＴＩＣ ＰＯＳ １０００／Ｈｅ； ＢｉｏＲａｄ等）を用いて処理する。処理の条件は植物又は試料により異なるが、通常は１０００〜１１００ｐｓｉ程度の圧力、５〜１０ｃｍ程度の距離で行う。
【００２９】
また、形質転換に用いられる植物としては、例えば、アブラナ科のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ナス科のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、イネ科のトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、マメ科のダイズ（Ｃｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、その他の農作物や樹木等に対しても有用である。植物は針葉樹、広葉樹、双子葉植物、単子葉植物等いずれであってもよい。
【００３０】
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネであればＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ． ２：７４ （１９９５））の方法が挙げられ、トウモロコシであればＳｈｉｌｌｉｔｏら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：５８１ （１９８９））の方法やＧｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍら（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３（１９９０））が挙げられ、ジャガイモであればＶｉｓｓｅｒら（Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ ７８：５９４ （１９８９））の方法が挙げられ、タバコであればＮａｇａｔａとＴａｋｅｂｅ（Ｐｌａｎｔａ ９９：１２（１９７１））の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればＡｋａｍａら（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ１２：７−１１ （１９９２））の方法が挙げられ、ユーカリであれば土肥ら（特開平８−８９１１３号公報）の方法が挙げられる。
【００３１】
一旦、ゲノム内に本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫又はクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得、それらから植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、該植物体、その子孫及びクローンの繁殖材料も含まれる。このようにして得られた形質転換植物体は、細胞内のプラスチッドの数又は大きさが制御されている。
【００３２】
上述の形質転換法により得られる、腫瘍組織やシュート、毛状根等は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることができ、また従来より知られている植物組織培養法により、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与等により植物体に再生させることができる。
【００３３】
大腸菌等の細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００３４】
動物細胞を宿主とする場合は、動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３５】
昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３６】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法としては、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために用いた条件と同様の条件にて行われる。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、次いで増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出してもよい。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させた後、蛍光又は酵素反応を用いて増幅産物を確認する方法を用いることもできる。
【００３７】
本発明のタンパク質は、前記形質転換体を培養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積し、該タンパク質を採取することにより製造することができる。本発明のタンパク質が蓄積されるのは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明において形質転換体を培養する方法は、特に制限はなく、宿主の培養において用いられる通常の方法でよい。
【００３８】
例えば、宿主が大腸菌や酵母等の微生物の場合、形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鐵、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、浸透培養又は通気攪拌培養等の好気的条件の下で行う。培養温度、培養時間は、宿主が大腸菌の場合、約１５〜４３℃の温度で約１２〜４８時間行う。宿主がバチルス属菌の場合、約３０〜４０℃の温度で約１２〜１００時間行う。宿主が酵母の場合は、約２０〜３５℃の温度で約２４〜１００時間行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることができる。ｐＨの調製を行う必要がある場合、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
【００３９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して培養を行う。例えば、Ｔ７プロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＰＴＧ等を培地に添加して培養を行ってもよい。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＡＡ等を培地に添加してもよい。
【００４０】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する場合、用いられる培地としては、一般に用いられているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が挙げられる。培養は、通常、５％程度の二酸化炭素の存在下で約３７℃の温度で１〜３０日間行う。
【００４１】
培養後、タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標）等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。すなわち、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質を生成することができる。
【００４２】
こうして得られた本発明のタンパク質は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に断片化することもできる。また、キナーゼ等のタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることもできる。本発明のタンパク質の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００４３】
また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等が含まれる。ゲノムＤＮＡは、例えば、文献（Ｒｏｇｅｒｓ ａｎｄ Ｂｅｎｄｉｃｈ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５：６９ （１９８５））記載の方法に従って調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡの塩基配列（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてＰＣＲ法により調製することができる。また、ｃＤＮＡでは、常法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により上述した、Ｐｙｋｅ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｌｅｅｃｈ Ｒ．Ｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （１９９２） ９９， １００５−１００８に記載のシロイヌナズナの葉肉細胞らｍＲＮＡを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてＰＣＲを実施して調製することができる。また、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡは、常法によりゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば本発明のＤＮＡの塩基配列（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列）を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することができる。
【００４４】
得られたＤＮＡの塩基配列は、例えば「シークエンサーＭｏｄｅｌ３７３」（ＡＢＩ社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。本発明のＤＮＡは、例えば、上述したように組み換えタンパク質の調製に用いることができる。さらに、本発明のＤＮＡを植物体内で発現させることにより、その植物細胞中の葉緑体の大きさが小さくなり数は多くなる。また、その植物の花卉の色調を上昇させることができるとともに、植物細胞内に蓄積されるでんぷん量を増加させることができる。
【００４５】
また、本発明は、植物細胞内で本発明のＤＮＡの発現を抑制し得る分子を提供する。本発明のＤＮＡの発現の抑制し得るとは、遺伝子の転写の抑制及びタンパク質への翻訳の抑制も含むものである。また、ＤＮＡの発現を完全に停止すること、及び発現の減少のいずれをも含むものである。
【００４６】
植物細胞内における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が挙げられる。すなわち、配列番号：２で表わされるＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡを設計する方法である。アンチセンスＲＮＡとしては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であると考えられる。また、コード領域又は３‘側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明におけるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法で、所望の植物細胞へ形質転換される。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換される植物細胞が有する内在性遺伝子又はその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相補性を有する。本発明における、配列番号：２で表わされるＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの一例を配列番号：３に示す。
【００４７】
アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは１．５ｋｂよりも短い。
アンチセンス配列を植物体内で発現させることにより、葉緑体の大きさが大きくなり数は少なくなる。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。なお、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等の一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」）に基本的に従った。また、シロイヌナズナの寒天培地や土壌を用いた育成、交配、ゲノムＤＮＡの調製は実験書（例えば「モデル植物の実験プロトコール（秀潤社）」）に基本的に従った。
【００４９】
実施例１
ＡＲＣ３遺伝子の染色体上の位置を決定するために、分子マーカーを用いてマッピングを行った。ＡＲＣ３変異体はシロイヌナズナのランズバーグ・エレクタにおいて見出されているので、この変異体に、別のエコタイプであるコロンビアタイプ種を交配し、次世代の種子を採取し、それを生育させ、自殖させてＦ２世代の種子を得た。このＦ２世代の種子を発芽させ、育成した植物からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを、マーカーとしてＦ１Ｍ２０−３、Ｆ２５Ａ４．６、Ｆ２５Ａ４．４、Ｆ１０Ａ及びＦ９Ｅ．Ｃｌａを用いて、上記ゲノムＤＮＡに対して、ＰＣＲ法により組換価を算出した。
【００５０】
具体的には、Ｆ１Ｍ２０−３を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：４及び配列番号：５）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は１８１ｂｐに、コロンビア種は１９６ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には１９３４染色体間で８染色体で組換えが認められた。
【００５１】
次いで、Ｆ２５Ａ４．６を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：６及び配列番号：７）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は９４ｂｐに、コロンビア種は８７ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には２０００染色体間で２染色体で組換えが認められた。
【００５２】
次いで、Ｆ２５Ａ４．４を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：８及び配列番号：９）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は８７ｂｐに、コロンビア種は９６ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には２０００染色体間で組換えは認められなかった。
【００５３】
次いで、Ｆ１０Ａ５を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：１０及び配列番号：１１）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は１８４ｂｐに、コロンビア種は２００ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には１８５２染色体間で２２染色体で組換えが認められた。
【００５４】
次いで、Ｆ９Ｅ．Ｃｌａ を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：１２及び配列番号：１３）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、制限酵素ＣｌａＩで処理した後、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は１９９ｂｐに、コロンビア種は２８ｂｐ及び１７１ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には２０００染色体間で１染色体で組換えが認められた。
【００５５】
以上のようにして、ＡＲＣ３遺伝子を含む染色体上の領域が、Ｆ２５Ａ４．４、Ｆ９Ｅ．Ｃｌａの２つの分子マーカーによって挟まれていることが確認された。そこで、Ｆ２５Ａ４．４、Ｆ９Ｅ．Ｃｌａマーカーをそれぞれ含むゲノムＤＮＡ断片を単離して、相補テストを行い遺伝子を同定した。ＡＲＣ３遺伝子は７４２アミノ酸をコードしており、塩基配列の決定を行ったところ、Ｎ末領域がバクテリアの分裂制御因子であるＦｔｓＺとの相同性があり、Ｃ末領域は真核生物でよく知られているシグナル伝達因子のホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート５−キナーゼの一部と相同性があった。配列決定された遺伝子の塩基配列は、配列番号：１で表わされる。
【００５６】
実施例２
ＡＲＣ３遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号：２）を用いて、アンチセンス遺伝子の構築を行った（配列番号：３）。配列番号：２で表わされるＤＮＡ、及び配列番号：３で表わされるＤＮＡを、バイナリーベクターｐＢＩ１２１の３５Ｓプロもーなー顆粒に連結し、それぞれセンス遺伝子及びアンチセンス遺伝子とした。次いで、センス遺伝子又はアンチセンス遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナをアグロバクテリウム・チュメファシエンス菌を介した遺伝子導入法によって作成した。
【００５７】
まず、上記センス遺伝子又はアンチセンス遺伝子発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌にエレクトロポレーション法を用いて移行させた。上記発現ベクターは、マーカーとして、カナマイシン耐性遺伝子を有している。センス遺伝子又はアンチセンス遺伝子発現ベクターＤＮＡを１０％グリセロール溶液に懸濁したアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌体と混合し、１ｍｍ幅のキュベット電極中で、２５μＦ・６００Ω・１．８ｋＶ設定にて電気パルスを印可した後、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと５０μｇ／ｍｌのリファンピシンを添加したＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン，０．５％酵母抽出物，０．５％塩化ナトリウム，１．２％バクトアガー）上で、２８℃，２日間培養して、カナマイシン耐性の付与されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌のコロニーを選抜した。
【００５８】
次いで、このセンス遺伝子又はアンチセンス遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を５０μｇ／ｍｌのリファンピシンと２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＬＢ液体培地（１％バクトトリプトン，０．５％酵母抽出物，０．５％塩化ナトリウム）で、２８℃，１６時間培養した培養液を用意した。シロイヌナズナは、種子を１％アンチホルミンで滅菌した後、１％ショ糖と０．４％ゲランガムを添加したＭＳ寒天培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ， ｖｏｌ．１５：ｐ４７３−）に播種して、２５℃の温度で１４日間生育させた。生育させたシロイヌナズナは、胚軸部を切り出して、ＣＩＭ培地（０．５ｍｇ／ｌ ２，４Ｄ、０．０５ｍｇ／ｌ カイネチン、２％グルコース、０．４％ゲランガムを添加したＢ５寒天培地（Ｇａｍｂｏｒｇら（１９６８）， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ．５０：ｐ１５１−））に置床し、２５℃の温度で６日間暗所で培養した。この胚軸を、上記のセンス遺伝子又はアンチセンス遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌培養液と混和した後、再度ＣＩＭ培地に置いて、２５℃の温度で２日間暗所で共培養して感染を行わせた。除菌のために胚軸は、１５０ｍｇ／ｌのクラフォランと２％グルコースを含むＢ５液体培地中で５時間振とう洗浄した。洗浄後の胚軸は、形質転換植物を分化させ、選抜するために、ＳＩＭ培地（２ｍｇ／ｌ ゼラチン、０．２ｍｇ／ｌ ＩＢＡ、１５０ｍｇ／ｌ クラフォラン、５０μｇ／ｍｌ カナマイシン、２％グルコース、０．４％ゲランガムを含むＢ５寒天培地）に１週間ごとに植え継いだ。上記センス遺伝子又はアンチセンス遺伝子を発現させている３５Ｓプロモーターは、恒常的発現プロモーターとして知られている。その結果として、継代培養４週目には、胚軸から直接に雌蕊を分化させることができた。
【００５９】
得られた植物体の葉肉細胞内の葉緑体の数及び大きさを以下のようにして観察した。
葉肉細胞を光学顕微鏡で観察し、デジタルデータをとり、葉緑体の数をカウントした。大きさは肉眼で観察した。
【００６０】得られた結果を図１に示す。図１において、（ａ）は未処理のシロイヌナズナの葉肉細胞の葉緑体の電子顕微鏡写真であり、（ｂ）はアンチセンス遺伝子を発現するシロイヌナズナの葉肉細胞の葉緑体の電子顕微鏡写真である。
【００６１】
図１から明らかなように、アンチセンス遺伝子を発現するシロイヌナズナの葉肉細胞中の葉緑体は、未処理のものに比べ、その大きさが大きくなり、数は少なくなっていた。また、このシロイヌナズナは、植物の生育速度が未処理のものよりも遅く、種子の収量も低下していた。
【００６２】
また、図には示さないが、センス遺伝子を発現するシロイヌナズナの葉肉細胞中の葉緑体は、未処理のものに比べ、その大きさが小さくなり、数は多くなっていた。このシロイヌナズナは、植物体の光合成能が上昇しており、植物の生育速度は未処理のものよりも上昇していた。更に、このシロイヌナズナは、未処理のものに比べ、種子の収量も上昇していた。
【００６３】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明によれば、植物細胞内のプラスチッドの数及び大きさを変化させる遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質を提供することができる。また、本発明によれば、上記遺伝子を利用して、光合成能や花卉の色調が上昇した植物を提供することができる。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】シロイヌナズナの葉肉細胞の葉緑体の電子顕微鏡写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞内のプラスチッドの数及び大きさを変化させる遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、上記遺伝子を利用して、光合成能や花卉の色調が上昇した植物を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
植物細胞内に存在する葉緑体は、光合成細菌と真核生物との共生によって発生した器官であると言われている。この葉緑体は植物細胞内で光合成等を行う細胞内小器官であるが、組織によっては光合成を行わず、エチオプラストやアミロプラスト等の器官に変化する。これらを全てまとめてプラスチッドと称している。
【０００３】
従来、植物の光合成能を上昇させようとする研究が行われているが、光合成を担うタンパク質等を改変することが主流であった。しかしながら、光合成を担うタンパク質を個々に改変しても、複雑な光合成反応を効率よく上昇することは困難であった。また、光合成が行われる場としての葉緑体の植物細胞における数は厳密に制御されているため、タンパク質の改変による方法では光合成能を上昇させる方法として限界があると考えられていた。
【０００４】
一方、花卉の色調を上昇させ、花卉の商品価値を高めようとするために、色素合成遺伝子を花の細胞内で発現させることも行われている。しかし、この方法によっても、色素の蓄積の場としての植物細胞内におけるプラスチッドの数は制御されているため、色素の蓄積量が制限されていた。
【０００５】
従って、植物細胞内の葉緑体等のプラスチッドの数を増加することができれば、植物の光合成能を上昇させたり、花卉の色調を上昇させることが可能である。
従来、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさの変化した植物が知られている。例えば、Ｐｙｋｅ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｌｅｅｃｈ Ｒ．Ｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （１９９２） ９９， １００５−１００８には、シロイヌナズナの変異体が開示されている。この文献に開示されたシロイヌナズナの変異体は、葉肉細胞内の葉緑体の大きさが通常のものより大きく、その数は通常のものよりも少なくなっている。上記文献に開示されたシロイヌナズナの変異体の変異に関する遺伝子の解析はまだ行われていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｐｙｋｅ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｌｅｅｃｈ Ｒ．Ｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （１９９２） ９９， １００５−１００８
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、植物細胞内のプラスチッドの数及び大きさを変化させる遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質を提供することを目的とする。また、本発明は、上記遺伝子を利用して、光合成能や花卉の色調が上昇した植物を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ポジショナルクローニングの手法を用いることにより、植物細胞内においてプラスチッドの数及び大きさを制御する遺伝子を同定し、その遺伝子を用いて植物の光合成能や花卉の色調を改良することが可能であるという知見を得た。
【０００９】
すなわち、本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するために用いる、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡを提供するものである。
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１０】
また、本発明は、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するために用いる、上記ＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを提供するものである。
また、本発明は、上記ＤＮＡを有する組換えベクターを提供するものである。また、本発明は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供するものである。
また、本発明は、上記ＤＮＡによりコードされるタンパク質を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、上記形質転換体を培養し、該形質転換体又はその培養上清から、発現させたタンパク質を回収する工程を含む、上記タンパク質の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、上記ＤＮＡ、又は上記組換えベクターを保持する形質転換植物細胞を提供するものである。
また、本発明は、上記形質転換植物細胞を含む形質転換植物体を提供するものである。
また、本発明は、上記タンパク質と結合する抗体を提供するものである。
また、本発明は、上記ＤＮＡ、上記タンパク質、又は上記抗体を含む、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するための組成物を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について説明する。
本発明は、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御に関与する「ＡＲＣ（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）３」タンパク質を提供する。シロイヌナズナ葉緑体変異体はａｒｃシリーズは、肉眼観察では野生型との相違は検出されないが、葉緑体の数と大きさとが変化した変異体であることが報告されている。この変異体の原因遺伝子として、ポジショナルクローニングの手法を用いて、本発明者らが単離したＡＲＣ３遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に、この遺伝子がコードするＡＲＣ３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。
【００１３】
シロイヌナズナにおいて、葉緑体の数及び大きさを変化させる表現型をもたらすことが知られているａｒｃ変異が、野生型の産生するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、Ａｔｌｇ７５０１０の２００１番目のグアニンがアデニンに変換され、Ａｔｌｇ７５０１０タンパク質の６６７番目のトリプトファンが停止コドンになっていることが見出された。この事実は、本発明者らが単離したＡＲＣ３遺伝子が、植物細胞内における葉緑体の数及び大きさの制御に関与していることを証明するものである。このようなＡＲＣ３遺伝子と植物細胞内の葉緑体の数及び大きさの制御との密接な関係は、植物においてＡＲＣ３遺伝子の発現を調節することにより、植物細胞内の葉緑体等のプラスチッドの数及び大きさを制御し得ることを意味する。従って、「ＡＲＣ３」タンパク質及び「ＡＲＣ３」遺伝子は、植物のプラスチッドの数や大きさを制御するために、もしくは制御するための標的として利用することが可能である。
【００１４】
また、本発明は、「ＡＲＣ３」タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、機能的に同等なタンパク質を提供する。ここで「機能的に同等」とは、タンパク質がプラスチッドの数及び大きさを制御する機能を有することを意味する。
【００１５】
本明細書において、「実質的に同一」及び「機能的に同等」とは、タンパク質の活性、すなわち植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御する活性が実質的に同一であることを意味する。一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加された場合、活性が同一であれば、その欠失、置換又は付加がなされたタンパク質は欠失、置換又は付加されていないものと実質的に同一、又は機能的に同等である。このような、実質的に同一、又は機能的に同等なタンパク質を単離する方法の一つの態様としては、タンパク質中のアミノ酸に変異を導入する方法が行われる。
【００１６】
一般的に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列との相同性の程度が、全体の約８０％以上、好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜５０個、更に好ましくは１〜３０個程度、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質も実質的に同一である。なお、配列の相同性は、例えば遺伝子配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発株式会社）やＢｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？Ｊｆｏｒｍ＝１）等による相同性検索により決定することができる。
【００１７】
すなわち、当業者であれば、公知の方法によって、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質中のアミノ酸を適宜置換などして、これと同等の機能を有する改変タンパク質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じる。本発明のタンパク質には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有し、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御する機能を有するタンパク質も含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の改変は、通常は、全アミノ酸の５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。アミノ酸の改変は、例えば、変異や置換であれば「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」、「ＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いて行うことが可能である。欠失であれば「Ｑｕａｎｔｕｍ ｌｅａｐ Ｎｅｓｔｅｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いて行うことが可能である。
【００１８】
また、実質的に同一、又は機能に同等なタンパク質を単離する方法の他の態様としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ １９７５ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８：５０３、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ＰＣＲ技術（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ （ｅｄ．） １９８９． ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）等が挙げられる。すなわち、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又はその一部をプローブとして、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡの一部にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、これと高い相同性を有するＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡから、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることができる。上述したように、ハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術によって単離されたＤＮＡによりコードされる「ＡＲＣ３」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。
【００１９】
ＡＲＣタンパク質をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＲＣタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明に含まれる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、６５℃の温度でハイブリダイゼーションさせた後、０．１％濃度のＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸ナトリウム）もしくは２ＸＳＳＰＥ（３．６Ｍ ＮａＣｌ， ０．２Ｍ リン酸ナトリウム液（ｐＨ７．７），０．０２Ｍ Ｎａ２−ＥＤＴＡ）中で、６５℃の温度で１０分間の洗浄を合計３回行うという条件で行なうことができる。よりストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいては、６５℃の温度でハイブリダイゼーションさせた後、０．１％濃度の ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣもしくは２ＸＳＳＰＥ液中で、６５℃の温度で１０分間洗浄し、次に０．１％濃度の ＳＤＳを含む１ＸＳＳＣもしくは１ＸＳＳＰＥ液中で、６５℃の温度で１０分間の洗浄を２回行えばよい。よりストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいては、６５℃の温度でハイブリダイゼーションさせた後、０．１％ ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣもしくは２ＸＳＳＰＥ液中で、６５℃で１０分間洗浄し、次に０．１％ ＳＤＳを含む１ＸＳＳＣもしくは１ＸＳＳＰＥ液中で６５℃で１０分間洗浄し、さらに０．１％ ＳＤＳを含む０．１ＸＳＳＣもしくは０．１ＸＳＳＰＥ液中で６５℃で１０分間洗浄すればよい。ハイブリダイゼーション液は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」に記載されているもの等を用いればよい。
【００２０】
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、天然のタンパク質として調製することができる。また、遺伝子組み換え技術を利用して調製した組み換えタンパク質として調製することもできる。天然のタンパク質は、例えば、下記の方法により調製された組み換えタンパク質をウサギなどの小動物に免疫して得た抗体を適当な吸着体（ＣＮＢｒ活性化アガロースやトシル活性化アガロース）に結合させてカラムを作製し、得られたカラムを利用し、上述した、Ｐｙｋｅ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｌｅｅｃｈ Ｒ．Ｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （１９９２） ９９， １００５−１００８に記載のシロイヌナズナの葉肉細胞からのタンパク質抽出液を精製することにより調製することが可能である。一方、組み換えタンパク質は、常法により、例えば、配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な細胞に導入して形質転換細胞を得、該形質転換細胞から精製することにより調製することが可能である。
なお、一旦、本発明タンパク質の遺伝子の塩基配列が決定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明のタンパク質の遺伝子を得ることができる。更に、部位特異的突然変異誘発法等によって、本発明のタンパク質の遺伝子の変異型を合成することも可能である。
【００２１】
なお、遺伝子に変異を導入する方法としては、例えばＫｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、変異の導入を行うことができる。
【００２２】
本発明のタンパク質コードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、適当なベクターに、本発明のタンパク質の遺伝子（例えば、配列番号：２で表わされるを塩基配列からなるＤＮＡ）を連結（挿入）することにより得ることができる。ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより実施される。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５又はｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ＹＥｐ１３又はＹＣｐ５０等）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス又はバキュロウイルス等の動物ウイルス等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーター等が好ましい。
【００２３】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。
【００２４】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、ＤＨ５α及びＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕及びバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞及びＨＥＫ２９３細胞等が用いられる。
【００２５】
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）； Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及び Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００２６】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子を植物に形質転換し、トランスジェニック植物を得る場合は、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等によって植物中に遺伝子を導入することができる。例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧５００〜６００Ｖ、１００μＦ、２０ｍｓｅｃの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。
【００２７】
アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等の適当なアグロバクテリウムに導入し、この株をバキュームインフィルトレーション法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃ． Ｒ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｓｅｒ． ＩＩＩ Ｓｃｉ． Ｖｉｅ， ３１６， １１９４−１１９９に記載の方法）等に従って宿主の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物細胞を得ることができる。
【００２８】
パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）自体をそのまま使用するか、切片を調製した後に使用するか、又はプロトプラストを調製して使用する。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＢＩＯＬＩＳＴＩＣ ＰＯＳ １０００／Ｈｅ； ＢｉｏＲａｄ等）を用いて処理する。処理の条件は植物又は試料により異なるが、通常は１０００〜１１００ｐｓｉ程度の圧力、５〜１０ｃｍ程度の距離で行う。
【００２９】
また、形質転換に用いられる植物としては、例えば、アブラナ科のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ナス科のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、イネ科のトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、マメ科のダイズ（Ｃｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、その他の農作物や樹木等に対しても有用である。植物は針葉樹、広葉樹、双子葉植物、単子葉植物等いずれであってもよい。
【００３０】
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネであればＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ． ２：７４ （１９９５））の方法が挙げられ、トウモロコシであればＳｈｉｌｌｉｔｏら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：５８１ （１９８９））の方法やＧｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍら（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３（１９９０））が挙げられ、ジャガイモであればＶｉｓｓｅｒら（Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ ７８：５９４ （１９８９））の方法が挙げられ、タバコであればＮａｇａｔａとＴａｋｅｂｅ（Ｐｌａｎｔａ ９９：１２（１９７１））の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればＡｋａｍａら（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ１２：７−１１ （１９９２））の方法が挙げられ、ユーカリであれば土肥ら（特開平８−８９１１３号公報）の方法が挙げられる。
【００３１】
一旦、ゲノム内に本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫又はクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得、それらから植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、該植物体、その子孫及びクローンの繁殖材料も含まれる。このようにして得られた形質転換植物体は、細胞内のプラスチッドの数又は大きさが制御されている。
【００３２】
上述の形質転換法により得られる、腫瘍組織やシュート、毛状根等は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることができ、また従来より知られている植物組織培養法により、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与等により植物体に再生させることができる。
【００３３】
大腸菌等の細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００３４】
動物細胞を宿主とする場合は、動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３５】
昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３６】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法としては、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために用いた条件と同様の条件にて行われる。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、次いで増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出してもよい。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させた後、蛍光又は酵素反応を用いて増幅産物を確認する方法を用いることもできる。
【００３７】
本発明のタンパク質は、前記形質転換体を培養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積し、該タンパク質を採取することにより製造することができる。本発明のタンパク質が蓄積されるのは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明において形質転換体を培養する方法は、特に制限はなく、宿主の培養において用いられる通常の方法でよい。
【００３８】
例えば、宿主が大腸菌や酵母等の微生物の場合、形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鐵、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、浸透培養又は通気攪拌培養等の好気的条件の下で行う。培養温度、培養時間は、宿主が大腸菌の場合、約１５〜４３℃の温度で約１２〜４８時間行う。宿主がバチルス属菌の場合、約３０〜４０℃の温度で約１２〜１００時間行う。宿主が酵母の場合は、約２０〜３５℃の温度で約２４〜１００時間行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることができる。ｐＨの調製を行う必要がある場合、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
【００３９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して培養を行う。例えば、Ｔ７プロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＰＴＧ等を培地に添加して培養を行ってもよい。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＡＡ等を培地に添加してもよい。
【００４０】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する場合、用いられる培地としては、一般に用いられているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が挙げられる。培養は、通常、５％程度の二酸化炭素の存在下で約３７℃の温度で１〜３０日間行う。
【００４１】
培養後、タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標）等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。すなわち、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質を生成することができる。
【００４２】
こうして得られた本発明のタンパク質は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に断片化することもできる。また、キナーゼ等のタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることもできる。本発明のタンパク質の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００４３】
また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等が含まれる。ゲノムＤＮＡは、例えば、文献（Ｒｏｇｅｒｓ ａｎｄ Ｂｅｎｄｉｃｈ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５：６９ （１９８５））記載の方法に従って調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡの塩基配列（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてＰＣＲ法により調製することができる。また、ｃＤＮＡでは、常法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により上述した、Ｐｙｋｅ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｌｅｅｃｈ Ｒ．Ｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （１９９２） ９９， １００５−１００８に記載のシロイヌナズナの葉肉細胞らｍＲＮＡを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてＰＣＲを実施して調製することができる。また、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡは、常法によりゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば本発明のＤＮＡの塩基配列（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列）を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することができる。
【００４４】
得られたＤＮＡの塩基配列は、例えば「シークエンサーＭｏｄｅｌ３７３」（ＡＢＩ社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。本発明のＤＮＡは、例えば、上述したように組み換えタンパク質の調製に用いることができる。さらに、本発明のＤＮＡを植物体内で発現させることにより、その植物細胞中の葉緑体の大きさが小さくなり数は多くなる。また、その植物の花卉の色調を上昇させることができるとともに、植物細胞内に蓄積されるでんぷん量を増加させることができる。
【００４５】
また、本発明は、植物細胞内で本発明のＤＮＡの発現を抑制し得る分子を提供する。本発明のＤＮＡの発現の抑制し得るとは、遺伝子の転写の抑制及びタンパク質への翻訳の抑制も含むものである。また、ＤＮＡの発現を完全に停止すること、及び発現の減少のいずれをも含むものである。
【００４６】
植物細胞内における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が挙げられる。すなわち、配列番号：２で表わされるＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡを設計する方法である。アンチセンスＲＮＡとしては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であると考えられる。また、コード領域又は３‘側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明におけるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法で、所望の植物細胞へ形質転換される。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換される植物細胞が有する内在性遺伝子又はその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相補性を有する。本発明における、配列番号：２で表わされるＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの一例を配列番号：３に示す。
【００４７】
アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは１．５ｋｂよりも短い。
アンチセンス配列を植物体内で発現させることにより、葉緑体の大きさが大きくなり数は少なくなる。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。なお、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等の一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」）に基本的に従った。また、シロイヌナズナの寒天培地や土壌を用いた育成、交配、ゲノムＤＮＡの調製は実験書（例えば「モデル植物の実験プロトコール（秀潤社）」）に基本的に従った。
【００４９】
実施例１
ＡＲＣ３遺伝子の染色体上の位置を決定するために、分子マーカーを用いてマッピングを行った。ＡＲＣ３変異体はシロイヌナズナのランズバーグ・エレクタにおいて見出されているので、この変異体に、別のエコタイプであるコロンビアタイプ種を交配し、次世代の種子を採取し、それを生育させ、自殖させてＦ２世代の種子を得た。このＦ２世代の種子を発芽させ、育成した植物からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを、マーカーとしてＦ１Ｍ２０−３、Ｆ２５Ａ４．６、Ｆ２５Ａ４．４、Ｆ１０Ａ及びＦ９Ｅ．Ｃｌａを用いて、上記ゲノムＤＮＡに対して、ＰＣＲ法により組換価を算出した。
【００５０】
具体的には、Ｆ１Ｍ２０−３を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：４及び配列番号：５）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は１８１ｂｐに、コロンビア種は１９６ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には１９３４染色体間で８染色体で組換えが認められた。
【００５１】
次いで、Ｆ２５Ａ４．６を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：６及び配列番号：７）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は９４ｂｐに、コロンビア種は８７ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には２０００染色体間で２染色体で組換えが認められた。
【００５２】
次いで、Ｆ２５Ａ４．４を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：８及び配列番号：９）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は８７ｂｐに、コロンビア種は９６ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には２０００染色体間で組換えは認められなかった。
【００５３】
次いで、Ｆ１０Ａ５を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：１０及び配列番号：１１）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は１８４ｂｐに、コロンビア種は２００ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には１８５２染色体間で２２染色体で組換えが認められた。
【００５４】
次いで、Ｆ９Ｅ．Ｃｌａ を増幅することができる２種類のＰＣＲプライマー（配列番号：１２及び配列番号：１３）を用いてＦ２世代のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、制限酵素ＣｌａＩで処理した後、アガロース電気泳動で調べた。この分子マーカーでは、ランズバーグ種は１９９ｂｐに、コロンビア種は２８ｂｐ及び１７１ｂｐにバンドを示すことが知られているため、これに基づいて計算したところ、ＡＲＣ３遺伝子と同マーカーとの間には２０００染色体間で１染色体で組換えが認められた。
【００５５】
以上のようにして、ＡＲＣ３遺伝子を含む染色体上の領域が、Ｆ２５Ａ４．４、Ｆ９Ｅ．Ｃｌａの２つの分子マーカーによって挟まれていることが確認された。そこで、Ｆ２５Ａ４．４、Ｆ９Ｅ．Ｃｌａマーカーをそれぞれ含むゲノムＤＮＡ断片を単離して、相補テストを行い遺伝子を同定した。ＡＲＣ３遺伝子は７４２アミノ酸をコードしており、塩基配列の決定を行ったところ、Ｎ末領域がバクテリアの分裂制御因子であるＦｔｓＺとの相同性があり、Ｃ末領域は真核生物でよく知られているシグナル伝達因子のホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート５−キナーゼの一部と相同性があった。配列決定された遺伝子の塩基配列は、配列番号：１で表わされる。
【００５６】
実施例２
ＡＲＣ３遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号：２）を用いて、アンチセンス遺伝子の構築を行った（配列番号：３）。配列番号：２で表わされるＤＮＡ、及び配列番号：３で表わされるＤＮＡを、バイナリーベクターｐＢＩ１２１の３５Ｓプロもーなー顆粒に連結し、それぞれセンス遺伝子及びアンチセンス遺伝子とした。次いで、センス遺伝子又はアンチセンス遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナをアグロバクテリウム・チュメファシエンス菌を介した遺伝子導入法によって作成した。
【００５７】
まず、上記センス遺伝子又はアンチセンス遺伝子発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌にエレクトロポレーション法を用いて移行させた。上記発現ベクターは、マーカーとして、カナマイシン耐性遺伝子を有している。センス遺伝子又はアンチセンス遺伝子発現ベクターＤＮＡを１０％グリセロール溶液に懸濁したアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌体と混合し、１ｍｍ幅のキュベット電極中で、２５μＦ・６００Ω・１．８ｋＶ設定にて電気パルスを印可した後、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと５０μｇ／ｍｌのリファンピシンを添加したＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン，０．５％酵母抽出物，０．５％塩化ナトリウム，１．２％バクトアガー）上で、２８℃，２日間培養して、カナマイシン耐性の付与されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌のコロニーを選抜した。
【００５８】
次いで、このセンス遺伝子又はアンチセンス遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を５０μｇ／ｍｌのリファンピシンと２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＬＢ液体培地（１％バクトトリプトン，０．５％酵母抽出物，０．５％塩化ナトリウム）で、２８℃，１６時間培養した培養液を用意した。シロイヌナズナは、種子を１％アンチホルミンで滅菌した後、１％ショ糖と０．４％ゲランガムを添加したＭＳ寒天培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ， ｖｏｌ．１５：ｐ４７３−）に播種して、２５℃の温度で１４日間生育させた。生育させたシロイヌナズナは、胚軸部を切り出して、ＣＩＭ培地（０．５ｍｇ／ｌ ２，４Ｄ、０．０５ｍｇ／ｌ カイネチン、２％グルコース、０．４％ゲランガムを添加したＢ５寒天培地（Ｇａｍｂｏｒｇら（１９６８）， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ．５０：ｐ１５１−））に置床し、２５℃の温度で６日間暗所で培養した。この胚軸を、上記のセンス遺伝子又はアンチセンス遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌培養液と混和した後、再度ＣＩＭ培地に置いて、２５℃の温度で２日間暗所で共培養して感染を行わせた。除菌のために胚軸は、１５０ｍｇ／ｌのクラフォランと２％グルコースを含むＢ５液体培地中で５時間振とう洗浄した。洗浄後の胚軸は、形質転換植物を分化させ、選抜するために、ＳＩＭ培地（２ｍｇ／ｌ ゼラチン、０．２ｍｇ／ｌ ＩＢＡ、１５０ｍｇ／ｌ クラフォラン、５０μｇ／ｍｌ カナマイシン、２％グルコース、０．４％ゲランガムを含むＢ５寒天培地）に１週間ごとに植え継いだ。上記センス遺伝子又はアンチセンス遺伝子を発現させている３５Ｓプロモーターは、恒常的発現プロモーターとして知られている。その結果として、継代培養４週目には、胚軸から直接に雌蕊を分化させることができた。
【００５９】
得られた植物体の葉肉細胞内の葉緑体の数及び大きさを以下のようにして観察した。
葉肉細胞を光学顕微鏡で観察し、デジタルデータをとり、葉緑体の数をカウントした。大きさは肉眼で観察した。
【００６０】得られた結果を図１に示す。図１において、（ａ）は未処理のシロイヌナズナの葉肉細胞の葉緑体の電子顕微鏡写真であり、（ｂ）はアンチセンス遺伝子を発現するシロイヌナズナの葉肉細胞の葉緑体の電子顕微鏡写真である。
【００６１】
図１から明らかなように、アンチセンス遺伝子を発現するシロイヌナズナの葉肉細胞中の葉緑体は、未処理のものに比べ、その大きさが大きくなり、数は少なくなっていた。また、このシロイヌナズナは、植物の生育速度が未処理のものよりも遅く、種子の収量も低下していた。
【００６２】
また、図には示さないが、センス遺伝子を発現するシロイヌナズナの葉肉細胞中の葉緑体は、未処理のものに比べ、その大きさが小さくなり、数は多くなっていた。このシロイヌナズナは、植物体の光合成能が上昇しており、植物の生育速度は未処理のものよりも上昇していた。更に、このシロイヌナズナは、未処理のものに比べ、種子の収量も上昇していた。
【００６３】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明によれば、植物細胞内のプラスチッドの数及び大きさを変化させる遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質を提供することができる。また、本発明によれば、上記遺伝子を利用して、光合成能や花卉の色調が上昇した植物を提供することができる。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】シロイヌナズナの葉肉細胞の葉緑体の電子顕微鏡写真である。
Claims (12)
- 植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するために用いる、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するために用いる、請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
- 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
- 請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項１に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
- 請求項１に記載のＤＮＡ、又は請求項３に記載の組換えベクターを保持する形質転換体を培養し、該形質転換体又はその培養上清から、発現させたタンパク質を回収する工程を含む、得請求項５に記載のタンパク質の製造方法。
- 請求項１又は２に記載のＤＮＡ、又は請求項３に記載の組換えベクターを保持する形質転換植物細胞。
- 請求項７に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
- 請求項８に記載の形質転換植物体の子孫又はクローンである、形質転換植物体。
- 細胞内のプラスチッドの数又は大きさが制御されている、請求項８又は９に記載の形質転換植物体。
- 請求項５に記載のタンパク質と結合する抗体。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ、請求項５に記載のタンパク質、又は請求項１１に記載の抗体を含む、植物細胞内のプラスチッドの数又は大きさを制御するための組成物。
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-
2003
- 2003-03-14 JP JP2003069670A patent/JP2004275048A/ja active Pending
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