JP5083792B2 - 植物体の脱分化方法及びこれを用いて得られるカルス、並びにその利用 - Google Patents
植物体の脱分化方法及びこれを用いて得られるカルス、並びにその利用 Download PDFInfo
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
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Description
Banno H,Ikeda Y, Niu QW, Chua, NH(2001) Overexpression of Arabidopsis ESR1 induces initiation of shoot regeneration. Plant Cell.13:2609-2618 Sakai H, Honma T, Aoyama T, Sato S, Kato T, Tabata S, Oka A(2001) ARR1, a transcription factor for genes immediately responsive to Cytokinins. Science. 294: 1519-1521 Kosugi S, Ohashi Y(2003) Constitutive E2F expression in tobacco plants exhibits altered cell cycle control and morphological change in a cell type-specific manner. Plant Physiol. 132: 2012-2022 Okamuro JK, Caster B, Villarroel R, Van Montagu M, Jofuku KD(2001) The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 94: 7076-7081
(a)脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子、
(b)配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、
(c)配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子、
(d)配列番号2、4または6に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
(e)配列番号2、4または6に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有し、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
上述したように、本発明にかかる植物体の生産方法は、脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入する。以下、(I−1)脱分化に関与する転写因子、(I−2)本発明にかかる植物体の生産方法の一例の順に説明する。
本発明で用いられる転写因子は、脱分化に関与する転写因子であれば特に限定されるものではない。かかる転写因子は、植物界で広く保存されている。したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様の機能を有する転写因子が含まれる。
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記(I−1)で説明した転写因子を植物体で過剰に生産させる過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記(I−1)で説明した転写因子をコードする遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
本発明において行われる形質転換工程は、上記(I−2−1)で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記(I−1)で説明した転写因子を生産させるようになっていればよい。
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記転写因子を植物体で過剰に生産させることによる。これにより、当該転写因子が標的とする標的遺伝子の転写が促進されると考えられる。その結果、得られる植物体の脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。
ここで、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、かかる脱分化の誘導によりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。双子葉植物としては、離弁花亜綱であってもよいし、合弁花亜綱であってもよい。合弁花亜綱としては、例えば、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、キク目を挙げることができる。また、離弁花亜綱としては、例えば、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、サガリバナ目、ウツボカズラ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目等を挙げることができる。
本発明では、植物体を脱分化が誘導されるように改変することができるが、本発明の有用性は特に限定されるものではなく、そのような脱分化の誘導により効果がある分野であればよい。かかる分野としては、例えば、脱分化が誘導されるように改変されることによるカルス化が困難な植物のカルス化、カルスを用いた有用物質生産、カルスからの再分化系を利用した育種分野等を挙げることができる。
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、上述したように、本発明にかかる植物体の生産方法により脱分化が誘導されるように改変された植物体は、有用物質の生産に好適に用いることができる。それゆえ、本発明には、本発明の植物体を、植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させる有用物質の生産方法も含まれる。
以下の実施例1においては、シロイヌナズナ由来のRAP2.4遺伝子(At1g78080)をカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(以下の説明では、便宜上、CaMV35Sと称する)の下流につないで組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換し、RAP2.4遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。
形質転換用ベクター構築用ベクターであるp35SGを、図1に示すように、以下の工程(1)〜(4)のとおりに構築した。
5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3'(配列番号11)
5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3'(配列番号12)
(4)このp35S−Nosプラスミドを制限酵素HindIIIで消化し、上記attL1断片を挿入した。さらにこれをEcoRIで消化し、attL2断片を挿入して、ベクターp35SGを完成させた。
構築用ベクターのatt部位で挟まれたDNA断片と組換えるための、2つのatt部位を有する植物形質転換用ベクターであるpBIGCKHを、図2に示すように、以下の工程(1)から(3)のとおりに構築した。
上記構築用ベクターp35SGにシロイヌナズナ由来の転写因子RAP2.4タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程(1)〜(3)のとおりに組み込み、p35SRAP2.4Gを得た。
プライマー1(RAP2.4−F)5'-ATGGCAGCTGCTATGAATTTGTAC-3'(配列番号13)
プライマー2(RAP2.4−R)5'-CTAAGCTAGAATCGAATCCCAATC-3'(配列番号14)
RAP2.4遺伝子の塩基配列及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号2及び1に示す。
上記構築用ベクター上にあるCaMV35Sプロモーター、RAP2.4遺伝子、Nos−ter等を含むDNA断片を、植物形質転換用ベクターpBIGCKHに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のGateway(登録商標)LR clonase(登録商標)を用いて以下の工程(1)〜(3)のとおりに行った。
次に、以下の工程(1)〜(3)に示すように、上記RAP2.4遺伝子を含むDNA断片をpBIGCKHに組み込んだプラスミドであるpBIG−RAP2.4(35S::RAP2.4)で、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
得られた形質転換植物体の芽生えを、植物ホルモン(オーキシン及びサイトカイニン)非存在のハイグロマイシンを含むCIM培地で生育させた。下表3にCIM培地の組成を、下表4にB5培地の組成を示す。なお、本実施例において用いた植物ホルモン非存在のCIM培地は、表3中、オーキシン(「2,4−D」と表示。)とサイトカイニンの一種であるカイネチンとを加えていない培地である。また、CIM培地に加えたハイグロマイシンの量は、CIM培地1lに対し30 mgであった。
シロイヌナズナ由来のRAP2.4遺伝子(At1g78080)の代わりにシロイヌナズナ由来の遺伝子(At1g22190)を用いた以外は実施例1と同様にして、シロイヌナズナを形質転換し、At1g22190遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。
プライマー1(At1g22190−F)5'-ATGACAACTTCTATGGATTTTTACAG-3'(配列番号15)
プライマー2(At1g22190−R)5'-CTAATTTACAAGACTCGAACACTG-3'(配列番号16)
また、At1g22190遺伝子の塩基配列及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号4及び3に示す。
シロイヌナズナ由来のRAP2.4遺伝子(At1g78080)の代わりにシロイヌナズナ由来の遺伝子(At1g36060)を用いた以外は実施例1と同様にして、シロイヌナズナを形質転換し、At1g36060遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。
プライマー1(At1g36060−F)5'-ATGGCGGATCTCTTCGGTGG-3'(配列番号17)
プライマー2(At1g36060−R)5'-TCACGATAAAATTGAAGCCCAATC-3'(配列番号18)
また、At1g36060遺伝子の塩基配列及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号6及び5に示す。
にならず脱分化(カルス化)した。なお、図6中スケールバーは3mmを示す。
以下の実施例4においては、本発明の植物体のカルス化が内因性のオーキシンの過剰生産に起因するものであるのか否かを、DR5::GUS植物体でRAP2.4遺伝子を過剰発現させることにより調べた。
次にRAP2.4カルスの内因性オーキシン(IAA)濃度の測定を試みた。方法はGas Chromatography-Mass Spectrometry(GC−MS)を用いたNakamuraらの方法 (Nakamura, A. et al. Plant Physiology, 133, 1843-1853, 2003) に基づいた。方法の手順を以下に示す。
以下の実施例6においては、RAP2.4カルスの培養において、形質転換体の選択マーカーの試薬であるハイグロマイシン(Hm)を培地から除き、カルスの変化を観察した。
以下の実施例7においては、実施例6で得られた、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖するRAP2.4カルスを用いて、本発明にかかる植物体が有用物質を安定して生産する(二次代謝を安定に発現させる)ことを検証した。なお、二次代謝産物としては、シロイヌナズナで計測可能なモデル二次代謝産物とてアントシアニンを選び、シロイヌナズナの植物体、培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するRAP2.4カルスにおける二次代謝産物生産能の比較を行った。
アントシアニン含有量(Abs530 / g D.C.W)
= [Abs530−(0.25×Abs657)]×extraction volume(mL) / dry cell weight
なお、上記式中、「D.C.W」は「dry cell weight 」すなわち細胞乾燥重量を表す。
Claims (10)
- 以下の(b)〜(d)のいずれかに記載の遺伝子が発現するように、該遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程と、
上記形質転換工程によって得られた形質転換体を植物ホルモンを含有していない培養培地を用いて培養する培養工程と、
を含んでいることを特徴とする植物体の脱分化方法:
(b)配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、
(c)配列番号1、3または5に示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、脱分化を誘導する活性を有しているタンパク質をコードする遺伝子、
(d)配列番号2、4または6に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。 - さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項1に記載の植物体の脱分化方法。
- 上記培養工程において、選択マーカーの試薬である抗生物質を上記培養培地に添加して上記形質転換体を培養することを特徴とする請求項1または2に記載の植物体の脱分化方法。
- 上記培養工程において、選択マーカーの試薬である抗生物質を上記培養培地に添加せずに上記形質転換体を培養することを特徴とする請求項1または2に記載の植物体の脱分化方法。
- 請求項4に記載の植物体の脱分化方法により生産され、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖させることができるカルス。
- カルス内の内因性のオーキシンの濃度が、脱分化が誘導される前と比較して、有意に増加していないことを特徴とする請求項5に記載のカルス。
- 請求項1から4の何れか1項に記載の植物体の脱分化方法を行うためのキットであって、
上記(b)〜(d)のいずれかに記載の遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物体の脱分化誘導キット。 - さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項7に記載の植物体の脱分化誘導キット。
- 請求項3に記載の植物体の脱分化方法により生産されたカルスを、植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させることを特徴とする有用物質の生産方法。
- 請求項4に記載の植物体の脱分化方法により生産されたカルス、または請求項5若しくは6に記載のカルスを、上記選択マーカーの試薬である抗生物質および植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させることを特徴とする有用物質の生産方法。
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