CN101031649A - 水稻凝集素样受体激酶1(OsLRK1)，一个参与植物发育的基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新基因Oslrk1，其参与植物发育，包括根系扩张。本发明还描述了影响该发育的方法，及包含所描述的序列的转化的细胞及转基因植物。

Description

水稻凝集素样受体激酶1(OsLRK1)，一个参与植物发育的基因

[0001]本发明要求申请日为2004年10月1日的美国临时专利申请号60/614,549的优先权，该申请通过引用以其全文并入本文作参考。

发明领域

[0002]本发明一般性地涉及植物基因工程，特别涉及在转化的植物和植物细胞中调节根系扩张(root expansion)。

发明背景

[0003]在本文全文中，各种公开出版物均在括号中引用。这些出版物公开内容通过引用以其全文并入本文作参考，以更加全面地描述涉及本发明的技术领域的现状。所述参考的详细信息列于所附权利要求书之前。

[0004]已经有提示植物丝氨酸/苏氨酸受体样激酶(receptor-like kinase，RLK)在细胞表面的信号传导事件中起到关键作用(Hardie et al.，1998；Morris，et al.，2003；Shiu，et al.，2004)。细胞对各种外部因素进行应答的分子基础是当前的一个研究热点(Morris and Walker，2003)。RLK是一类跨膜蛋白，其包含一个单一跨膜结构域、一个胞外配体结合结构域以及一个胞质内的催化激酶结构域(Shiu and Bleecker，2001)。在已经被阐明的拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中，RLK有超过600个代表基因，而在水稻中已经确定了至少1132个成员(Shiu et al.，2004)。植物RLK的激酶结构域具有单谱系起源(monophyletic origin)并与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Pelle和哺乳动物白细胞介素受体相关性激酶属于相同的基因家族(Becraft，2002)。有两种方法可以对RLK进行分类，第一种是基于被认为是配体结合位点的胞外结构域的结构特征进行分类(McCarty and Chory，2000)，第二种是基于RLK在控制植物生长和发育或植物-微生物相互作用及防御应答中的生物学功能和作用进行分类(Shiu et al.，2004)。鼠耳芥属(Arabidopsis)RLK胞外结构域有超过21个不同类别(Becraft，2002)。一类已被描述并被部分研究的RLK是凝集素样受体激酶(lectin-like receptorkinases，LRK)(Herve et al.，1996；1999；Nishiguchi，et al.，2002，Navarro-Gochicoa，2003；Riou et al.，2002；He et al.，2004；Shiu et al.，2004)。

[0005]LRK具有与豆科样凝集素(legume-like lectins)具有显著同源性的凝集素样胞外结构域。凝集素已知为碳水化合物结合蛋白，但是对于被识别的糖不具有酶活性(Loris，2002)。这是一组在结构上和进化上多样性的蛋白质。凝集素可以在所有生物界发现(Van Damme，1998)。豆科凝集素(legume lectins)是指特别在豆科植物中发现的植物凝集素。这些迄今为止分离的凝集素中的大部分是从成熟种子中被鉴别的(Van Damme et al.，1998)，并且其浓度在其他植物器官中非常低。豆科凝集素在它们的一级、二级和三级结构中令人惊讶地相似，但是尽管有这些相似性，其在四级关联和单体组织模式方面显示很大的不同(Rudiger and Gabius，2001)。有趣的是，一级序列中的改变导致的三级结构中的微小改变会导致四级结构中的显著不同(Vijayan and Chandra，1999)。典型地，已经证明了针对葡萄糖、N-乙酰-D-葡糖胺、甘露糖、半乳糖或N-乙酰-D-半乳糖胺、L-岩藻糖及复合物类型的寡糖的特异性(Rudiger and Gabius，2001)。豆科凝集素的生理学作用仍不清楚，尽管其已经被猜想是参与植物防御的储备蛋白质。

[0006]凝集素样受体激酶(LRK)是RLK的亚类，首先在拟南芥中被描述(Herve et al.，1996)。目前，在水稻基因组中已经阐明了103个成员(Shiu etal.，2004)，在鼠耳芥属中鉴别了42个LRK(Barre et al.，2002)，在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中鉴别了9个成员(Navarro-Gochicoa et al，2003)，以及在钻天杨(Lombardy poplar)中鉴别了一些成员(Nishiguchi et al，2002)。在酵母和人类的完整基因组序列中未发现具有豆科样凝集素结构域的RLK(Navarro-Gochicoa et al.，2003)。其可能是植物特异性的。已经表面LRK在不同器官中表达，包括根、成熟叶、茎、花和长角果。这些蛋白质的生理学作用仍在研究中。在LRK中存在豆科样凝集素作为受体提示其在感知寡糖介导的信号中具有一定作用，但是目前仍没有证据表明LRK具有活性受体结构域并且糖分子可能与其结合，但是发现激酶结构域能够进行自身磷酸化(Nishiguchi et al.，2002；He et al.，2004)。

[0007]本领域现在需要进一步了解植物发育包括根系扩张的机制，以用于调节所述发育的方法及用于在其中可以调节这种发育的植物和植物细胞。

发明概述

[0008]本发明涉及新的凝集素样受体激酶基因，称为水稻(Oryza sativa)凝集素样受体激酶1(Oslrk1)，其在植物发育中起作用。试验结果提示Oslrk1对于来自糖和/或植物激素的信号产生应答，并且其是包括根系扩张在内的植物发育某些方面的负调节物。

[0009]特别地，本发明提供了一种分离的核酸，其包含(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，(b)编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列，或(c)相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列。本发明还提供了载体，其包含与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的上述核酸。本发明还提供了用于在植物中负调节发育的方法，包括用本文所述的核酸转化植物细胞并将所述细胞培养为植物。

[0010]在一方面，本发明提供了一种用于促进在植物中增强的根生长的方法，所述方法包括用至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列是(a)相应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的反义核苷酸序列，或(b)相应于编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的反义核苷酸序列，并将所述细胞培养为植物。

[0011]另外，本发明提供了一种Oslrk1 Ds插入突变体，其在根和地上部分具有独特表型。另外，本发明提供了一种转基因植物，其基因组包含具有一个破坏(disruption)的Oslrk1基因，其中所述破坏包含Ds插入，并且其中所述破坏引起所述转基因植物与野生型植物相比显示增强的根生长。

[0012]本发明进一步提供了具有掺入到其基因组中的本发明的核酸的转化的植物细胞和转基因植物。以及所述转基因植物的种子。本发明另外提供了与本文所述序列同源的核苷酸序列，并且所述序列保留本发明描述的序列的生物学活性，本发明还提供了使用或涉及这些同源序列的方法、转化的细胞、转基因植物和种子。

附图说明

[0013]图1.Oslrk1突变体显示的表型。A.在MS培养基上生长五天的WT(左)和突变体(右)秧苗。B.和C.在MS培养基上分别生长两周的WT和突变体幼苗的根。在土壤中分别生长两月的WT植株(D)和突变体植株(E)的根。F.生长两月的WT植株(左)和突变体植株(右)的叶形态。生长45天的WT植株(G)和突变体植株(H)的形态，其中突变体显示开花推迟(I)。生长三个月的突变体植株(右)与WT相比，其地上部分显示整体较强壮的表型。成熟WT植株(J)和突变体植株(K)的圆锥花序在突变体中显示更多分枝。

[0014]图2：Oslrk1基因的表达水平。图中显示Oslrk1在WT和纯合Oslrk1突变体中的基因表达的Northern杂交分析。从生长两周的wt或突变体幼苗的根组织提取总RNA(10μg)。膜与相应于Oslrk1基因的3’UTR的DIG标记的探针杂交。在WT植株中检测到大小为2.7Kb的转录物，其在突变体根组织中不存在(上组)。下组显示上样的总RNA的量(通过与用相应于水稻肌动蛋白基因(RAct1)的探针进行条带印迹(stripped blot)的杂交获得条带)。

[0015]图3：Oslrk1的cDNA序列(SEQ ID NO：1)。

[0016]图4：OsLRK1蛋白质(SEQ ID NO：2)的结构域和基序组织。豆科样凝集素结构域处于框中并示于图5以进行凝集素结构域氨基酸序列的排列对比。凝集素结构域的β链和α链在所述框中分别以粗体示出。可能的N-糖基化位点以下划线示出。信号肽和跨膜结构域以斜体示出。丝氨酸/苏氨酸激酶结构域以阴影示出，12个亚结构域的最保守氨基酸以黑粗体示出。可能参与亮氨酸拉链结构的亚结构域X中的亮氨酸残基(L⁵⁹⁹-L⁶⁰⁵-L⁶¹⁹-L⁶²⁶)被框出。激酶结构域中的ATP结合区(Leu³⁸⁷-Lys⁴¹³)以下划线示出。

[0017]图5.OsLRK1相关序列的凝集素样结构域的排列的氨基酸序列的对比。排列使用TCoffee程序(Notredame，C.et al.，2000)进行。相同氨基酸用阴影表示并且同源序列被框出。星号表示Ca²⁺结合氨基酸，十字表示Mn²⁺结合氨基酸。β链和α链之间的可能的切割位点(NDT)被框出并以阴影表示。OsLRK2是OsLRK1的最接近的同系物；P.nigra，来自黑杨(Populusnigra)(DDBJ中的AB030083)的凝集素受体激酶；MtLeRK1，来自蒺藜苜蓿(Medicago trunculata)(AY358030)的表达在根部的凝集素受体激酶；F.bean，来自蚕豆(Field bean)(P38662)的甘露糖/葡萄糖特异性凝集素；B.purpurea，来自羊蹄甲(Bauhinia purpurea)(P16030)的N-乙酰-D-半乳糖特异性凝集素；L.sphaericus，来自Lathyrus sphaericus(P16349)的凝集素；P.sativum，来自豌豆(Pisum sativum)(P02867)的种子的甘露糖特异性凝集素；M.hemaglutinin和M.hemaglutinin，来自怀槐(Maackia amurensis)(1DBN_B(PDB)和210523A)的凝集素；P.angolensis，来自安哥拉紫檀(Pterocarpus angolensis)(PDB中的Q8Q-A)的凝集素；R.pseudoacacia，来自刺槐(Robiniapseudoacacia)(BBA04604)的树皮凝集素；AthLecRK1，来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)(AAB58725)的凝集素样受体激酶。NCBI GeneBank登录号和PBD ID示于括号内。

[0018]图6.通过RT-PCR(A)和Northern印迹杂交(B)进行的Oslrk1基因的表达研究。对于RT-PCR，大约2μg总RNA加入到PCR混和物中，并加入相应于Oslrk1特异的5’UTR和3’UTR序列的引物。Oslrk1的扩增的转录物的预期长度(2.7kb)用箭头示出(左侧)。同时扩增水稻Actin 1基因的500bp转录物作为内部对照。对于Northern印迹，使用分离自不同组织(在上面示出)的总RNA(10μg)作为模板并使用DIG标记的Oslrk1的3’UTR作为探针。2.7kb转录物相应于Oslrk1基因(如在左侧示出的)。18SrRNA用作总RNA的定量对照。

[0019]图7.携带具有GusA或Eyfp基因的Oslrk1启动子的转基因植物的表达分析。A-D.Oslrk1启动子::gusA在转基因植物中的表达；E，G.EYFP在Oslrk1启动子::eyfp转基因植物中的表达；(A).GUS在生长四天的转基因幼苗的不定根中的表达以及在生长两周的幼苗的不定根和侧根中的表达。(B)；GUS染色的根的横切片显示在远端伸长区的表达(C)和在示出发生中的侧根的芽体的成熟区的表达(D)。在(C)中，Ep-表皮；Cx-皮质；En-内皮层；Pc-Pericuycle细胞。(E，G)EYFP在转基因植物的根中的表达的显微图像；(E，G).EYFP在根维管细胞中的表达的共焦成像；(F).根的可见光成像；(G).E和F的融合图像。

[0020]图8.用不同激素SA(A)和糖(B)对Oslrk1转录物的调节。在全部实验中，在Northern印迹杂交中均使用DIG标记的相应于Oslrk1基因的3’UTR的探针。作为上样的总RNA的定量对照，清洗使用Oslrk1探针进行Northern杂交的滤膜并用相应于水稻Actin 1基因的DIG标记的探针进行再杂交。在Northern印迹的顶端的比值示出Oslrk1在样品中的实际表达水平，其根据用Oslrk1特异性探针获得的杂交信号的强度与用Act1探针获得的信号强度的比值计算得出。

[0021]图9.用MeJA处理WT和突变体幼苗。WT和突变体的种子在含有各种浓度的MeJa(1μM，5μM和10μM)或对照的MS(含有1％Suc)中发芽并生长(A)。条形图显示不定根的长度和数目以及侧根的数目(B)。每一个数据点测量大约30-50株幼苗。p-Value针对不定根的数目(0.005)、不定根的长度(0.00)和侧根的数目(0.19)计算。

[0022]图10.Oslrk1突变体对Man(A和B)以及Gal(C和D)的不同应答。WT和突变体植物的种子在MS培养基中在不同浓度的Gal/Man中发芽一周。A和C分别显示在Man和Gal中发芽的幼苗的应答。条形图示出苗长度、不定根的长度和数目以及WT和Oslrk1突变体幼苗对施用Man(B)和Gal(D)的发芽率。B和D显示三次独立实验的平均值。对于每一次实验，使至少50株幼苗在合适的单糖中发芽，并测量数据点。p-Value针对用甘露糖处理(C)的苗长度(0.453)、不定根的数目(0.509)和长度(0.527)测量。对于半乳糖处理(D)，p-Value对于不定根的数目及长度和苗长度分别为0.00、0.01和0.00。

[0023]图11.OsLRK1作为水稻根生长的负调节物的作用的假设的模型。

[0024]图12.Oslrk的表达研究-Northern印迹。YL-幼叶；ML-成熟叶。显示使用不同lrk作为探针的Northern印迹得到的mRNA表达结果。

[0025]图13.糖处理下的Oslrk的表达分析。

[0026]图14.激素处理下的Oslrk的表达分析。

[0027]图15.非生物胁迫处理下的Oslrk的表达研究。

发明详述

[0028]本发明描述了一个新的参与植物发育的基因：Oslrk1。克隆的cDNA长度为2701bp(图3)(SEQ ID NO：1)。推断的OSLRK1蛋白质(SEQID NO：2)示于图4。

[0029]另外，从对几百个Ds插入品系的可见表型筛选中分离得到一个水稻凝集素样受体激酶1(Oslrk1)突变体并进行了研究。突变体植株显示扩张的根系，所述根系具有更多的不定根和更长的侧根。所述植株与野生型相比，其地上部分显示更大的叶、开花推迟、以及更高的种子产量。所述突变体将表型与Basta抗性及bar基因型分离提示该表型与Ds插入相关。所述Oslrk1 Ds插入品系是无效突变，因为在纯合突变体中没有检测到转录物。

[0030]Ac/Ds转座子系统的一个优点是能够通过将存在于转座酶来源中的Ds元件进行再移动(remobilization)而获得由于Ds插入而导致的突变体表型的回复体(Ramachandran and Sundaresan，2001)。获得了Oslrk1突变体的纯合回复体，其将所述突变体表型拯救为野生型。回复体的产生证明了观察到的突变体表型是由于通过Ds插入而敲除Oslrk1基因导致的。

[0031]所述Ds插入位于第一个外显子中的ATG密码子下游117bp处，其导致Oslrk1转录物的缺失，这已由Northern分析确认。所述Oslrk1基因属于一个多基因家族，该家族包括已阐明的水稻基因组的至少64个成员。通过将纯合突变品系与携带Ac转座酶的植株杂交获得回复体。分别携带Oslrk1启动子::gusA和eyfp构建体的转基因植物的Northern印迹杂交、组织化学和荧光分析显示Oslrk1基因主要在不定根和侧根的维管结构中表达，而不是在根冠中。在对甲基茉莉酸(MeJA)的应答中，Oslrk1的转录物被诱导，但是其被赤霉酸(GA)和水杨酸(SA)抑制。除此之外，Oslrk1基因被测试的一些糖所负调节。另外，所述突变体植物显示对半乳糖的超敏感性和对MeJA处理的降低的敏感性。这些结果提示OsLRK1在植物发育尤其是根系扩张的某些方面中起到负调节物的作用，并且对来自糖和植物激素的信号产生应答。

[0032]因此本发明的一个实施方案提供了一种分离的核酸，其包含(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，(b)编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列，和/或(c)相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列。所述核酸可以是DNA或RNA，并且可以是cDNA、基因组DNA、或mRNA。在一个实施方案中，所述核酸是融合基因，如Oslrk1-GUS融合基因或Oslrk1-EYFP融合基因。所述核酸可以是可转录的融合体如Oslrk1启动子::gusA或Oslrk1启动子::eyfp。本发明还提供了一种包含与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的上述核酸的载体。所述载体可以是植物表达载体或用于植物转化的载体。本领域技术人员熟知的任何合适的载体均可应用。所述启动子可以是用于在植物中表达基因的任何启动子。合适的载体是本领域技术人员所熟知的。优选的启动子包括玉米遍在蛋白(ubiquitin)启动子和CaMV 35S启动子。如本领域所已知的，启动子可以包括可诱导的和/或可阻遏的启动子以及增强子，由此核酸和被编码的多肽的表达可以基于各种生理学条件和信号被调节。本发明的核酸可以使用本领域已知的各种技术在体内和体外表达所描述的多肽，所述技术例如包括将所述核酸或载体转导、转染或转化进细胞，以及体外转录和翻译。

[0033]本发明还提供了一种用于在植物中负调节发育的方法，所述方法包括用至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列是(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸，或(b)包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸，并将所述细胞培养为植物。将所述细胞培养为植物可涉及任何用于将植物细胞生长为或继续生长为成熟植物的技术，包括本文所描述的技术和本领域已知的其他技术。所述启动子可以是任何合适的启动子，所述植物可以是任何植物物种，优选单子叶植物，如本文所述。优选的启动子例如包括玉米遍在蛋白启动子和CaMV 35S启动子。植物物种例如包括玉米、小麦、大麦、黑麦等等。

[0034]在本文所述的方法中，植物发育包括形态发生的发育控制的所有方面，包括细胞生长、细胞分裂和细胞分化的协调，以及这种协调的反映，如观察到的器官生长和/或产生的整体植物生长。本发明的序列可以通过使用本领域技术人员熟知的技术而导入到任何植物中，并且可通过使用本领域技术人员熟知的技术而用于转化任何植物物种。所述被导入的序列可被包含在用于在特定的感兴趣的植物中表达的表达盒中。

[0035]在优选的实施方案中，所述发育是根系扩张。所述调节可包括传递来自糖和/或植物激素的信号。本发明进一步提供了一种用于在植物中促进增强的根生长的方法，所述方法包括用至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列是(a)相应于SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的反义核苷酸序列，或(b)相应于编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的反义核苷酸序列，并将所述细胞培养为植物。所述启动子可以是任何合适的植物启动子，优选玉米遍在蛋白或CaMV35S启动子。所述植物可以是任何物种，优选单子叶植物。合适的植物物种例如包括玉米、小麦、大麦、黑麦等等。

[0036]在一个优选的实施方案中，所述增强的根生长包括扩张的根系。在优选的实施方案中，所述扩张的根系包括更多的不定根和/或更长的侧根。

[0037]本发明还提供了一种转化的植物细胞，所述细胞具有稳定整合进其基因组的至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸，(b)包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸，或(c)包含相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列的核酸。所述启动子可以是任何合适的启动子。所述细胞可以是任何植物类型和任何物种的，并且优选来自单子叶植物。

[0038]本发明还提供了一种转基因植物，所述植物具有稳定整合进其基因组的至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是(a)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸，(b)具有编码SEQID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸，或(c)具有相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列的核酸。所述启动子可以是任何合适的启动子。所述植物可以是任何植物物种，并且优选是单子叶植物。本发明还提供了本文描述的转基因植物的种子。

[0039]本发明还提供了一种用于在植物中调节发育的方法，所述方法包括用至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列是(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸，(b)包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸，或(c)包含相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列的核酸，并将所述细胞培养为植物。所述启动子可以是任何合适的启动子。所述植物可以是任何植物物种，并且优选是单子叶植物。在一个优选的实施方案中，所述发育包括根生长。在另一个优选的实施方案中，所述调节包括在所述植物的一个地上部分导入修饰。

[0040]本发明还提供了一种核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1所示的全长核苷酸序列具有大于50％的同源性，其中所述同源核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽，所述生物学活性即本文描述的调节发育活性。

[0041]所述核苷酸序列的同源性优选地是大约80％，更优选地是大约95％。

[0042]本发明还提供了一种用于在植物中负调节根系扩张的方法，所述方法包括用至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列是(a)与SEQ ID NO：1所示的全长核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽，或(b)与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽，并将所述细胞培养为植物。所述核苷酸序列的同源性优选地是大约80％，更优选地是大约95％。

[0043]本发明还提供了一种用于在植物中促进根系扩张的方法，所述方法包括用至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列是(a)相应于与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列的反义核苷酸序列，或(b)相应于与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列的反义核苷酸序列，并将所述细胞培养为植物。所述核苷酸序列的同源性优选地是大约80％，更优选地是大约95％。

[0044]本发明还提供了一种转化的植物细胞，所述细胞具有稳定整合进其基因组的至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是(a)与SEQ ID NO：1所示的全长核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽，(b)与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽，或(c)相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列。所述核苷酸序列的同源性优选地是大约80％，更优选地是大约95％。

[0045]本发明还提供了一种转基因植物，所述植物具有稳定整合进其基因组的至少一种与启动子可操纵地连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是(a)与SEQ ID NO：1所示的全长核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽，(b)与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽，或(c)相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列。所述核苷酸序列的同源性优选地是大约80％，更优选地是大约95％。本发明还提供了这种植物的种子。

[0046]本发明还提供了一种转基因植物，其基因组包含水稻(Oryzasativa)凝集素样受体激酶1(Oslrk1)基因的一个破坏，其中所述破坏包括一个Ds插入，并且所述破坏导致该转基因植物与野生型植物相比显示增强的根生长。在一个优选的实施方案中，所述破坏是纯合破坏。在一个优选的实施方案中，所述破坏是Oslrk1基因的完全敲除。在另一个优选的实施方案中，所述Ds插入位于Oslrk1基因第一个外显子中的ATG密码子下游117bp处。在另一个优选的实施方案中，所述增强的根生长是扩张的根系。在另一个优选的实施方案中，所述扩张的根系包括更多的不定根或更长的侧根。

[0047]在一个实施方案中，所述转基因植物在其地上部分显示修饰，所述修饰可以是与野生型植物相比更大的叶、开花推迟、或更高的种子产量。在一个实施方案中，所述更高的种子产量是比野生型植物产量高大约20％。

[0048]在另一个实施方案中，所述转基因植物与野生型植物相比显示对D-半乳糖的超敏感性。在另一个实施方案中，所述开花与野生型植物相比推迟大约五天至大约七天。本发明的转基因植物当成熟时可以比在相似条件下生长的野生型植物高大约30％。所述转基因植物当成熟时可以比在相似条件下生长的野生型植物在圆锥花序中显示大约多70％的分枝。所述转基因植物在幼苗期可以比在相似条件下生长的野生型植物显示大约2倍的苗长度(shoot length)。在另一个实施方案中，所述转基因植物在幼苗期可以比在相似条件下生长的野生型植物显示大约多56％的不定侧根。在另一个实施方案中，所述转基因植物在幼苗期可以比在相似条件下生长的野生型植物显示大约长74％的侧根。所述转基因植物可以是任何植物物种，优选单子叶植物。优选的物种包括包括玉米、小麦、大麦、黑麦等等。本发明进一步提供所述转基因植物的种子。

[0049]本发明还提供了包含Oslrk1基因的分离的核酸，其中所述基因包含位于第一个外显子中的ATG密码子下游大约117bp处的Ds插入。

[0050]本发明还提供了一种在植物中增强根生长的方法，所述方法包括使所述植物细胞的基因组包含Oslrk1基因的一个破坏，其中所述破坏包含Ds插入，并将所述细胞培养为植物。在一个优选的实施方案中，所述破坏是Oslrk1基因的完全敲除。在一个优选的实施方案中，所述破坏是纯合破坏。在一个实施方案中，所述增强的根生长包括扩张的根系。在一个实施方案中，所述扩张的根系包括更多的不定根和/或更长的侧根。在一个优选的实施方案中，所述Ds插入位于Oslrk1基因第一个外显子中的ATG密码子下游117bp处。

[0051]本发明还提供了一种修饰植物地上部分的方法，所述方法包括使所述植物细胞的基因组包含Oslrk1基因的一个破坏，其中所述破坏包含Ds插入，并将所述细胞培养为植物。在一个优选的实施方案中，所述破坏是Oslrk1基因的完全敲除。在一个优选的实施方案中，所述破坏是纯合破坏。在一个实施方案中，所述植物地上部分的修饰是与野生型植物相比更大的叶、开花推迟、或更高的种子产量。所述更高的种子产量可以是与野生型植物相比大约高21％。

[0052]本发明还提供了一种增加植物对D-半乳糖的敏感性的方法，所述方法包括使所述植物细胞的基因组包含Oslrk1基因的一个破坏，其中所述破坏包含Ds插入，并将所述细胞培养为植物。在一个优选的实施方案中，所述Ds插入位于Oslrk1基因第一个外显子中的ATG密码子下游117bp处，。在另一个优选的实施方案中，所述破坏是Oslrk1基因的完全敲除。在一个优选的实施方案中，所述破坏是纯合破坏。

[0053]本发明还提供了一种分离的Oslrk1基因的Ds插入突变体，其中所述Ds插入位于Oslrk1基因第一个外显子中的ATG密码子下游117 bp处。

[0054]如本文所用，分离的或纯化的核酸或蛋白质，或其生物学活性部分，当通过重组技术产生时基本上不含有其他细胞物质或培养基，或当化学合成时基本上不含有化学前体或其他化学物质。优选地，分离的核酸不含有在衍生该核酸的生物体的基因组DNA中天然处于所述核酸侧翼的序列(优选地蛋白编码序列)(即位于所述核酸的5′和3′末端的序列)。

[0055]本发明的多核苷酸或核酸组合物包括有义链和反义链的RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式、以及混和的多聚体，并可以是化学或生物化学修饰的或可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，这是本领域技术人员容易得知的。这些修饰例如包括标记、甲基化、一或多个天然发生的核苷酸用类似物的取代、核苷酸间的修饰例如不带电荷的键(例如甲基膦酸酯(methyl phosphonate)、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等等)、带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)、侧基成分(pendentmoieties)(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等等)、螯和剂、烷化剂、以及修饰的键(例如α异头核酸(anomeric nucleic acid)等等)。还包括模拟多核苷酸与指定的序列通过氢键和其他化学相互作用结合的能力的合成分子。这些分子是本领域所熟知的，包括例如其中在分子骨架中肽键置换磷酸键的分子。本发明的多核苷酸可以是分离的或基本纯的。

[0056]包含OsLRK1基因或其Ds插入突变体的重组构建体可以能够在宿主细胞中自主复制。或者，所述重组构建体可以整合进所述宿主细胞的染色体DNA中。这种重组多核苷酸包含基因组来源的多核苷酸、cDNA来源的多核苷酸、半合成来源的多核苷酸、或合成来源的多核苷酸，其中根据其来源或操作，所述多核苷酸1)不与其在天然状态下相联系的全部多核苷酸或其一部分相联系；2)与其在天然状态下相联系的多核苷酸之外的其他多核苷酸相联系；或3)天然不发生。

[0057]因此，本发明还提供了包含不是天然发生的序列的重组核酸。尽管所描述的序列可以应用，但是它们通常被例如通过缺失、置换或插入而改变。

[0058]本发明提供了野生型和突变的OsLRK1多肽或其片段的蛋白质修饰或片段，其与一级结构序列基本同源，但包括例如体内或体外化学和生物化学修饰，或掺入了不常见的氨基酸。这些修饰包括例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、遍在蛋白化(ubiquitination)、标记例如用放射性核素标记、以及各种酶修饰，这些均可很容易地为本领域普通技术人员所知。为此目的的标记多肽的各种方法以及各种取代基或标记为本领域普通技术人员所知，包括放射性同位素如³²P、与标记的抗配体(例如抗体)结合的配体、荧光团、化学发光剂、酶、以及对于标记的配体可作为特异结合对的成员的抗配体。标记的选择依赖于需要的灵敏度、与引物缀合的容易程度、稳定性需求、以及可得到的仪器。

[0059]如本文所描述的，除了基本全长的蛋白质外，本发明还提供了所述多肽的生物学活性片段和同系物。如本文所用，术语“多肽”是指全长蛋白和作为多肽片段的所述蛋白的一部分。

[0060]本发明还提供了融合多肽，其包括OsLRK1多肽及其片段，以及本领域已知的其他多肽或蛋白的片段。同源多肽可以是两或多个多肽序列的融合体或OsLRK1和一个相关蛋白的序列的融合体。类似的，异源融合体可以构建为显示衍生蛋白的性质或活性的组合的融合体。例如，配体结合结构域或其他结构域可以在不同的新融合多肽或片段之间“交换(swapped)”。这些同源或异源融合多肽可例如显示改变的结合强度或结合特异性，并可包括例如配偶体如免疫球蛋白、细菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-内酰胺酶、α淀粉酶、醇脱氢酶和酵母α交配因子。

[0061]融合蛋白可以典型地通过重组核酸方法(如下面所介绍的)制备或通过化学合成制备。合成多肽的技术是本领域普通技术人员所熟知的。

[0062]其他蛋白质修饰包括氨基酸取代。取代的变体典型地包含在蛋白质内部的一或多个位点将一个氨基酸交换为另一个，并且可被设计为调节所述多肽的一或多种性质(例如针对蛋白酶剪切的稳定性)而不丧失其他功能或性质。氨基酸取代可以基于所涉及的残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、和/或两亲性性质的相似性产生。优选的取代是保守取代，即一个氨基酸被另一个相似形状和电荷的氨基酸取代。保守取代是本领域普通技术人员所熟知的，典型地包括但不限于在下列组中列出的取代：甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬氨酸/谷氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；丝氨酸/苏氨酸；赖氨酸/精氨酸；酪氨酸/苯丙氨酸。

[0063]蛋白质结构中的某些氨基酸可以被其他氨基酸取代而不显著丧失与一些结构的相互作用的结合能力，所述结构例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点或与多肽相互作用的蛋白质上的结合位点。由于定义蛋白质的生物学功能活性的是蛋白质的相互作用能力和性质，因此可以在蛋白质序列及其DNA编码序列中产生某些氨基酸取代，并且获得具有相似性质的蛋白质。在产生这些改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。本领域一般明白疏水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能中的重要性。或者，相似氨基酸的取代可以基于亲水性而有效的进行。本领域一般明白亲水性在赋予蛋白质相互作用的生物学功能中的重要性(参见例如美国专利4,554,101)。美国专利5,691,198中进一步讨论了疏水指数或亲水性在设计多肽中的应用。这些专利通过引用以其全文并入本文。

[0064]重组核酸是非天然发生的核酸，或是通过人工组合两个分离的序列片段而产生的核酸。这种人工组合通常通过化学合成手段或通过对分离的核酸片段进行人工操作例如通过进行遗传工程技术而实现。这个短语还包括被从其正常的调节表达限制中移走的基因，所述情形例如一种基因产物由于存在该基因的多个拷贝或存在被增量调节的启动子或增强子信号、增加的mRNA或蛋白质半衰期等等而被过表达。

[0065]“调节序列”是指影响基因表达的序列，所述基因表达包括所述基因的转录以及信使RNA的翻译、剪接、稳定性等等。

[0066]大量的本发明的多核苷酸可以由用本文所描述的核苷酸序列转化的合适的宿主细胞产生。编码多肽或所希望的片段的天然或合成的多核苷酸片段可以掺入重组多核苷酸构建体(载体)中，所述构建体通常是DNA构建体，能够导入至原核或真核细胞中并在其中复制。典型地，所述载体要适于在单细胞宿主如酵母或细菌中复制，但也可适于导入培养的哺乳动物或植物或其他真核细胞系中(整合或不整合进基因组中)。最常用的原核宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，尽管也可以使用其他原核生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或假单胞菌(Pseudomonas)。哺乳动物细胞或其他真核宿主细胞(例如酵母细胞、丝状真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、或两栖动物或禽类物种的细胞)也可用于产生本发明的蛋白质。如本领域所熟知的，调节多核苷酸表达可导致由所述多核苷酸编码的多肽的调节。

[0067]表达和克隆载体优选地包含可选择的标记基因。典型的标记基因编码a)赋予抗生素抗性或其他有毒物质例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤等等抗性的蛋白质；b)互补营养缺陷型缺陷的蛋白质；或c)提供不能得自复合培养基的关键营养物质的蛋白质(例如编码用于芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因)。选择合适的可选择的标记依赖于宿主细胞，本领域普通技术人员熟知用于不同宿主的合适的标记。

[0068]包含感兴趣的核酸的载体可以在体外转录，得到的RNA通过已知的方法例如注射被导入宿主细胞中，或者所述载体可以通过本领域普通技术人员所熟知的方法被直接导入宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而改变，包括电穿孔、利用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、或其他物质的转染、基因枪法(microprojectile bombardment)、脂转染法、感染(如果所述载体是感染剂例如逆转录病毒基因组)、以及其他方法。在本文中将所述多核苷酸通过本领域已知的任何方法例如包括上述方法导入宿主细胞称为“转化”。上述已经被导入核酸的细胞也包括这些细胞的后代。

[0069]根据载体构建的模式，克隆通过使用标记而选择。所述标记可以位于相同的或不同的DNA分子，优选相同的DNA分子。在原核宿主中，转化子可以例如通过对氨苄青霉素、四环素或其他抗生素的抗性而选择。基于温度敏感性产生特定产物也可以作为一种合适的标记。

[0070]用本发明的多核苷酸转化的原核或真核细胞不仅可用于产生本发明的核酸和多肽，还可以例如用于研究OsLRK多肽的特征。用本发明的多核苷酸转化的植物细胞也可用于生长表达本发明的多核苷酸和多肽的植物。本发明的核苷酸也可转化进已经进行了一些生长的植物中。

[0071]本发明的多核苷酸可以根据需要以有义或反义方向表达。应理解控制基因以有义或反义方向表达可以直接影响可观察的植物特征。本领域已知的反义技术可以方便地用于植物中的基因表达。为了实现所述反义表达，克隆得自所希望的基因的核酸片段并将其与启动子可操纵地连接，从而可以转录RNA的反义链。接下来将所述构建体转化进植物中并产生RNA的反义链。在植物细胞中，已经示出反义RNA通过阻止编码感兴趣的酶的mRNA积聚而抑制基因表达。

[0072]用T-DNA和转座子(例如AC/Ds，Spm/En)进行的插入诱变(insertional mutagenesis)在功能性基因组学中是一种有力的工具，其介导基因敲除并可导致突变体表型(Ramachandran，S.，and Sundaresan，V.(2001))。除了使用T-DNA诱变的简便性之外，可转座元件还有一些其他优点，例如在基因组中的单一插入和通过所述可转座元件的再移动拯救失活基因的可能性。

[0073]本领域已知的其他技术例如miRNA、RNAi和sRNA通过降解其转录物而引起基因失活(Mallory，A.，and Vaucheret，H.(2004)；Dawnward，J.(2004)；Finnegan，E.and Matzke，M.(2003))。本领域普通技术人员可以从本文的教导中容易地认识到这些技术适于抑制本发明的Oslrk1基因产物的表达。因此本发明进一步提供了各种失活、破坏、或其他阻断Oslrk1基因或其产物的活性或表达以得到本文描述的转基因植物和转化的细胞的特征的方法。

[0074]基于前面的描述，本领域普通技术人员可以最大限度地实现本发明。因此下面的实施例仅仅是示例性的，不应将其理解为以任何方式限定如后面所附的权利要求书所阐述的本发明。

                          实施例1

[0075]突变体分离及表型鉴定。对我们课题组之前生产的几百个F3/F4基因陷阱(gene trap)水稻Ds插入品系(Kolesnik T.et.al.，2004)进行可见表型筛选。在这些转座株(transposant)中，选择一个具有明显表型的Basta抗性(Bar^R)品系进行进一步分析。该突变体植物与野生型(WT)植物相比显示更长和更宽的叶、更多的圆锥花序分枝、以及由此产生的更高的种子产量(图1，表1)。所述突变体表型在连续后代中是稳定的。在MS培养基上生长6天(图1A)和14天(表1)的突变体幼苗与在相似条件下生长的WT幼苗相比显示长两倍的苗长度(图1，表1)。在幼苗期，突变体植物具有多56％的不定根和长74％的侧根(图1B，表1)。

表1.Oslrk1突变体的表型鉴定

	WT	Oslrk1突变体	p-Value
				苗长度(cm)叶长度(cm)叶宽度(cm)圆锥花序分枝数目种子数目不定根数目侧根长度(cm)	16.2(±2.51)36.5(±4.51)1.25(±0.09)7.0(±0.51)1056(±200.1)6.3(±1.61)0.78(±0.17)	27.4(±4.45)46.6±(3.95)1.65(±0.12)12.0(±0.71)1275(±206.5)9.8(±1.95)1.36(±0.31)	0.0000.0000.0000.0000.0080.0000.244

叶宽度和长度测量自成熟的生长2个月的植物。苗长度、不定根数目、以及侧根长度由在生长室中的MS琼脂培养基中在25℃生长两周的幼苗确定。每一时间点使用大约50株植物。标准偏差值(SDV)在括号中给出。上述全部参数用t-test处理并给出p-Value。所有均为p＜0.05，因此是显著不同的。

[0076]突变体植物在其全部发育阶段持续显示相似的差异。生长两个月的WT植物的旗叶平均长度为37cm，而突变体旗叶显示平均值为47cm(长27％)。在突变体植物的旗叶宽度中也观察到相似的差异(比WT旗叶宽30％)(图1C和表1)。除了这些特征之外，Ds插入品系与WT植物相比显示推迟5至7天开花的表型(图1D)。成熟突变体植物比在相似条件下生长的WT植物高大约30％(数据未显示)(图1E)。在成熟阶段，突变体植物显示在圆锥花序中大约多70％的分枝(图1F，表1)，导致高21％的种子产量(表1)。突变体植物的高度、圆锥花序分枝、以及种子产量与WT特征相比是统计学显著的。在成熟阶段，突变体植物比WT具有更多的不定根和更长的侧根，这与在幼苗期观察到的差异相似(图1B)。

[0077]为了将Ds插入引起的突变和突变体表型联系起来，进行了选择标记bar基因(赋予Basta除草剂抗性)的分离分析。向衍生自杂合F₂植株的大约200株F₃幼苗喷洒Basta除草剂。在F₃后代中获得3∶1比例的Basta抗性(Bar^R)与敏感(Bar^S)幼苗，这提示突变体可能具有单一Ds插入。为了确认这些Basta抗性植株确实含有所述bar基因，分离得自这些植株的叶的基因组DNA，并用作PCR分析的模板与针对bar基因设计的引物组合使用。

[0078]在将表型和由Ds插入引起的突变联系起来的分析中，分析分离比是重要的(但并非是充分的)一步。表型可能是由于初级Ds转座导致的在相同的基因座中其他基因的足迹产生的(Chin et al.，1999)。为了显示Ds与突变体表型共分离，在另一系列实验中不喷洒Basta除草剂，对提取自衍生自杂合F₃植株的200株F₄幼苗的基因组DNA进行PCR分析以检查是否存在bar基因。PCR分析中bar阴性的植株显示WT特征，而具有基因的植株表现突变体的生长参数，这确认了表型和由Ds插入引起的突变之间的联系。

突变体的分子特征研究：

                       实施例2

[0079]Ds插入标记的基因编码凝集素受体激酶(OsLRK1)。为了确定Ds插入侧翼的序列，对分离自突变体植物的叶的基因组DNA进行TAIL-PCR(Liu and Whittier，1995)，之后进行测序。获得5’和3’Ds侧翼序列以及基于整合通过Ds元件引入的8个核苷酸的靶复制位点(5’TTCACCAG 3’)。对所述侧翼序列在TIGR(The Institute for GenomeResearch)、RGP(Rice Genome Research Program)和NCBI(National Centerfor Biotechnology Information)公共数据库中使用BLASTN和BLASTX排列对比算法进行序列相似性检索。结果显示Ds标记的基因编码与凝集素受体蛋白激酶同源的蛋白质，并且该基因被命名为水稻凝集素受体激酶1，或“Oslrk1”。

                        实施例3

[0080]Oslrk1突变体具有Ds元件的单一拷贝。分离比(Bar^R∶Bar^S)3∶1提示在基因组中存在单一拷贝的Ds元件或在同一基因座内存在多拷贝。存在两或多个Ds元件会使突变体表型及其特征鉴定复杂化。为了确定Ds元件的拷贝数，使用提取自突变体植物的叶的基因组DNA用bar或gusA基因作为探针进行Southern印迹杂交(方法)。在两种情况中，用每一种限制酶均获得单一条带，这些结果确认了在突变体品系中存在单一Ds元件(数据未示出)。

                      实施例4

[0081]通过Ds插入进行的Oslrk1的完全敲除。Oslrk1基因位于2号染色体，BAC克隆OJ1038 A06(在遗传图谱125.6cM处)。Oslrk1的基因区预测为3,257bp长，具有一个内含子(1kb)，其中开放读框(ORF)为2,224bp。5’和3’非翻译区(UTR)分别为至少107bp和392bp，如我们使用基于推测的5’UTR和3’UTR序列设计的不同引物组合通过RT-PCR所示出的那样。

[0082]为了研究Ds插入在Oslrk1基因内部的精确位置，使用分离自突变体叶的基因组DNA和针对Oslrk1基因的5’UTR和gusA基因的5’端设计的特异性引物进行PCR。对PCR产物进行测序，该测序分析揭示了Ds插入位于第一个外显子内ATG密码子下游117bp处。通过使用纯化自WT和纯合突变体植物的总RNA进行的Northern印迹杂交进行的进一步分析使用Oslrk1基因的3’UTR作为探针进行。Oslrk1基因转录物仅在WT中而不再纯合突变体植物中检测到，这提示该基因可能的敲除。

                     实施例5

[0083]Ds元件从Oslrk1基因的再移动拯救突变体表型。为了拯救Ds插入导致的突变体表型，将25株纯合Oslrkl突变体植物与携带Ac转座酶(Acl或Ac5；Kolesnik et al.，2004)的纯合植物杂交以使所述Ds元件再移动。R1和大部分R2植物显示突变体的生长特征。提取得自转基因植物和WT(作为对照)的基因组DNA并用作PCR模板，针对Ds元件侧翼的5′和3′序列设计引物。对扩增的片段进行测序并使用CLUSTALW程序(Thompson et al.，1994)进行排列对比，之后分析由于Ds切除而存在的足迹。对于22株R₂植物，我们已经获得了含有不同足迹的PCR产物，这显示Ds元件的再移动。足迹的长度(空的供体位点)从8个核苷酸(提示完美的Ds元件切除)至2个核苷酸(删除几个中心核苷酸的结果；Schiefelbein et al.，1988)不等。由于Ds元件插入在第一个外显子中的ATG密码子下游117bp(编码39氨基酸)处，因此3bp(或3的倍数)足迹会产生Ds元件切除后获得的mRNA的适当的翻译。仅获得了一株具有3bp足迹的植物，其显示WT植物的生长参数。然而，具有不同于3bp的足迹的植物不能拯救突变体表型。

                         实施例6

[0084]水稻中的凝集素样激酶由一个多基因家族编码。已经示出凝集素样激酶在鼠耳芥(Herve et al.，1996，1999；Barre et al.，2002)、黑杨，(Poplusnigera)(Nishiguchi et.al.，2002)和蒺藜苜蓿(Navarro-Gochcoa et al.，2003)中由多基因家族编码。在水稻基因组中(O.sativa，indica)已阐明有103个推断的LRK(Shiu et al.，2004)。我们已经获得了99个非冗余的氨基酸序列(Shiu，personal communication)并使用了组合方法对它们进行分析，所述组合方法是使用ClustalW程序(Thompson et al.，1994)的多序列排列对比和BLASTP程序(NCBI)的预测模式。一些推断的LRK由于长度上的显著差异(从171到1311aa)、α和β链的位置或在豆科凝集素结构域中缺乏一条链而不能仅使用ClustalW进行排列对比。我们发现35个推断的LRK仅具有Ser/Thr激酶结构域，它们中的4个具有两个激酶结构域，而没有确定任何豆科样结构域。剩余的64个LRK包含至少一个豆科样结构域(α，β，或两条链)、Ser/Thr激酶结构域、以及在一些情况中其他结构域(例如Chase或DUF26结构域)。蛋白质长度从349aa至1055aa不等。LRK之间的同源性在21％至75％之间变化。得自水稻O.sativa，japonica的OsLRK1和OsLRK2的相同序列在indica基因组中具有其对应序列。Oslrk1的最接近的同系物Oslrk2在蛋白质水平具有75％的相同性，在cDNA水平具有85％相似性，并且与Oslrkl位于同一个BAC克隆，在Oslrk1的polyA信号的下游1kb处。另一个同系物Oslrk3具有59％序列相似性，在cDNA水平是70％，并且其位于6号染色体，PAC P0019A05。

[0085]我们进行了Southern印迹杂交分析以选择Oslrk1基因特异性探针。分离自WT植物的叶的基因组DNA用合适的酶消化、印迹、并与相应于Oslrk1基因的凝集素结构域或3′UTR的探针杂交。当凝集素结构域被用作探针时，在低严格条件下暴露时间为2至3小时获得了几条条带(数据未示出)。当所述印迹暴露过夜时，出现了较强的模糊(smear)。另一方面，当使用相应于Oslrk1基因的3′UTR的探针时，在相似杂交和检测条件下进行的Southern印迹检测到单一条带(数据未示出)。由于Oslrk1基因特异性条带用3′UTR探针在Southern印迹杂交中获得，这个探针被用于在Northern印迹杂交中分析Oslrk1基因表达模式。

[0086]我们分析了15个选择的Oslrk，包括Oslrk1，其被详细分析并在本文中被详细描述。特别地，分析了Oslrk在水稻基因组中的位置、PAC和BAC克隆信息、基因大小和其他特征，详细情况适于表2。另外，图12示出了通过使用不同lrk作为探针进行的northern印迹的mRNA表达结果。在被测试的组织(根、幼叶和成熟叶、圆锥花序)中，只有Oslrk1，7，8，11和14是表达的。所述表达模式如图所示。

[0087]对于分离自生长两周的幼苗的RNA样品进行RT-PCR，所述幼苗用各种糖(图13)、激素(图14)和非生物胁迫(图15)处理，所述RT-PCR使用针对表2中列出的15个Oslrk的3’或5’非翻译区(UTR)设计的引物进行。对于每一个Oslrk在胶中设置两条泳道，第一条泳道是对照，第二条是处理的样品。这些结果总结于表3。

[0088]表3提供了有关Oslrk的所有上述提到的数据的概述，显示各种处理的RT-PCR结果，所述处理包括糖、激素和非生物胁迫，以及在正常条件下生长的水稻植物的各种组织的northern印迹结果，以及EST或cDNA在数据库中是否可得到。在表中，“I”表示诱导的表达，“R”表示抑制的表达。

表2.在已知的水稻基因组中凝集素受体激酶家族成员

OslrkN°	Chr.N°	BAC/PAC	BAC/PAC中的ORF	位置(cM)	基因长度(bp)	内含子N°	cDNA长度(bp)	cDNA/EST(Accession N0)
									1	2	OJ1038_A06	136676	125.6	3265	1	2211	AY663848
2	2	OJ1038_A06	132251	125.6	2752	1	2205	AK107391
									3	6	P0019A05	75385	65.2	2375	1	2289	AK121604
4	1	P0010B10	56334	134.7	2091	无	2091	NA
									5	3	OSJNBb0081B07	91055	154.8	2105	无	2106	BE040631
6	3	OSJNBb0094O03	29760	144.5	2033	1	1926	CA765300
									7	3	OSJNBb0094O03	36553	144.5	2034	2	1767	NA
8	7	OJ1019_E02	74985	80.8	3768	5	2049	AK108637
									9	7	OJ1019_E02	66599	80.8	4166	6	2661	NA
10	8	P0711H09	117579	103.2	2930	2	2220	NA
									11	8	P0711H09	122350	103.1	3541	1	2202	AK109868
12	4	OSJNBa0081C01	85249	81.7	2001	无	2022	NA
									13	4	OSJNBa0081C01	86790	81.7	8482	8	2040	NA

14	4	OSJNBa0088A01	156052	96.0	2034	无	2034	NA
									15	12	OSJNBb0036A19	2352	91.9	2061	无	2061	NA

表3.Oslrk的RT-PCR、Northern和数据库分析概述
	胁迫								激素和SA										糖								Northern	cDNA/EST
																													LRKs	盐		寒冷		干旱		Submergency		IAA		MeJA		GA3		ABA		SA		GAL		MAN		SUC		GLU
	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh	Rt	Sh
																													1	I					I										R											Rt
2	R		I	I	I	R	I								I	I			I	R			I	R				AK107391
																													3																												AK121604
4				I					I		I	R	I		I	I	I			I	I				I	R
																													5									I		I	R	I		I	I	I		I	I	I	R	I	I				BE040631
6	I															R												CA765300
																													7																												NM_184891
8								I	I				I			I				I	I				I	R	Rt，Sh，P	AK108637
																													9																				I
10									I						R		I			I

11				R				R					I	R		I	I		I	R	I		I				Rt
																													12																I
13
																													14																I				I							Rt
15									I																			XM_483328.1

LAA-吲哚乙酸；MeJA-甲基茉莉酸；GA3-赤霉酸；ABA-脱落酸；SA-水杨酸；GAL-半乳糖；MAN-甘露糖；SUC-蔗糖；GLU-葡萄糖

                         实施例7

[0089]OsLRK1结构域组织及其在其他物种中的同源序列。推断的OsLRK1蛋白包含与在其他凝集素受体激酶中发现的结构域相似的两个截然不同的结构域(Herve C.，et al.，1996，1999；Nishiguch M.，et al，2002；He X.-J.etal，2004，Navarro-Gochicoa M.-T.et al，2003)：N末端豆科样凝集素受体结构域和C末端信号转导丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(图4)。在N²⁵⁶D²⁵⁷T²⁵⁸位置有一个糖基化位点(共有序列Asn-X-Ser/Thr)(图4)(Rudiger H.，and Gabius H.J.，2001)。在凝集素结构域中发现11个推断的糖基化位点。四个残基E¹⁴⁷、-D¹⁴⁹、-D¹⁵⁶和-H¹⁶¹与Mn²⁺结合氨基酸相同，其中两个D¹⁴⁹和D¹⁵⁶还结合Ca²⁺。需要这些阳离子以保持凝集素的三级结构，使得所述单糖结合位点被暴露。一个信号肽(20个氨基酸长度)和一个跨膜结构域(23个氨基酸长度)分别位于凝集素结构域的N末端和凝集素与激酶结构域之间。丝氨酸/苏氨酸激酶结构域长度为282氨基酸并且由12个典型蛋白激酶亚结构域组成，如图4所示。

[0090]OsLRK1的豆科样凝集素结构域的氨基酸序列揭示了与其他凝集素样蛋白激酶的凝集素结构域和来自不同物种的豆科凝集素很强的同源性(图5)。对于氨基酸序列排列对比(Notredame，et al.，2000)，选择非推断的和已经研究清楚(通过解析的3D结构或已确立的功能/作用确定)的蛋白序列。初始我们基于相应于LRK的凝集素或凝集素结构域的原始长度进行排列对比，然后将选择的序列的长度进行优化以得到更好的排列对比。在这些蛋白质中，OsLRK1凝集素样结构域的最接近的同系物是黑杨(Populus nigra)的LRK中的凝集素(PnLRK)，其具有51％相同性和68％相似性，这在其他凝集素中是最高的分值。拟南芥凝集素受体蛋白激酶的凝集素结构域与OsLRK1凝集素结构域具有37％相同性和55％同源性，而得自蒺藜苜蓿(Medicago tranculata)的凝集素样蛋白激酶的凝集素结构域仅具有27％相同性和39％同源性。豆科凝集素的氨基酸序列与OsLRK1具有在24％和27％之间的低相同性和大约40％的同源性。在凝集素样蛋白激酶(除了MtLECRK1)的凝集素的推断的序列中的天冬氨酸残基(D⁸⁸，图5或D¹³⁵，图4)被谷氨酸残基(如在OsLRK1，2和PnLRK中)或组氨酸残基(如在AthlecRK1中)取代。这个残基显示在凝集素与碳水化合物的结合中是必需的，其取代在得自刺槐(Robinia pseudoacacia)的树皮凝集素(RBL)中导致丧失血细胞凝集活性(Nishiguchi et.al.，1997)。

                           实施例8

[0091]Oslrk1基因主要在根中表达。为了确定Oslrk1基因的表达模式，使用了几种方法。最初进行两组实验：使用从胼胝体、生长24天的整株幼苗及其根、幼叶和成熟叶提取的总RNA进行的RT-PCR(图6A)，和使用从根、幼苗和圆锥花序构建的cDNA文库作为模板进行的PCR(材料和方法)。RT-PCR结果显示该基因主要在幼苗的根中表达；然而，在圆锥花序和胼胝体中也观察到了Oslrk1转录物的低表达水平(图6A)。在使用cDNA的PCR中，扩增产物在根、幼苗和圆锥花序文库中均检测到(数据未示出)；这些结果与RT-PCR数据一致。除了cDNA文库PCR，还用用于RT-PCR的总RNA样品进行了Northern印迹分析。使用相应于Oslrk1的3′UTR和凝集素结构域的探针进行杂交。用3′UTR探查的Northern印迹显示Oslrk1基因在根和幼苗中的强表达、在圆锥花序中的低表达和在胼胝体中仅痕量表达，这确认了RT-PCR结果(图6B)。当使用凝集素结构域探针时，Oslrk1转录物在与用3′UTR探针在Northern分析中检测到的器官相同的器官中被检测到(图6B)。

                           实施例9

[0092]Oslrk1基因在根的维管结构和中柱鞘细胞中表达。为了确定Oslrk1基因表达的组织特异性，设计了两个构建体：Oslrk1基因的启动子与gus或eyfp基因融合(材料和方法)。这些构建体被导入到水稻中，产生转基因品系。对T0和T1转基因植物进行组织化学染色和荧光研究。对生长四天的转基因幼苗在GUS染色溶液中温育20分钟，在不定根的远端伸长区中观察到了GUS表达(图7A)。在温育1至2小时后，根的近端伸长区和成熟区也被染色(数据未示出)。生长七天的幼苗在不定根和侧根的伸长区和成熟区显示GUS染色(图7B)。在根的成熟区，维管结构被强烈染色。然而，在根冠未检测到表达。为了研究表达Oslrk1启动子::gus融合转录物的根细胞类型，进行GUS染色的根的横切片分析。特别是根的维管束和中柱鞘细胞显示GUS染色，提示在这些细胞中Oslrk1基因的内源性表达(图7C和D)。当转基因植物的根携带Oslrk1启动子::eyfp基因构建体时观察到了相似的表达模式(图7E和G)。当对这些转基因植物进行共焦显微观察时，在根的维管结构(中心部分)中观察到了EYFP荧光(图7E和G)。在成熟阶段的根中也检测到了EYFP荧光的相似模式。将GUS表达和EYFP荧光数据综合到一起，证明Oslrk1基因主要在水稻不定根和侧根的维管结构和中柱鞘细胞中表达，然而，不能排除在皮层和表皮细胞中的非常低的表达。

                 Oslrk1基因的生理学研究：

                        实施例10

[0093]激素对Oslrk1基因表达的差异调节。受体样激酶被假定参与信号传导事件，因为它们通过配体结合胞外结构域感知一个信号并将其通过丝氨酸/苏氨酸激酶结构域传递进入胞浆(Shiu and Bleecker，2001)。为了得知可能的影响Oslrk1基因调节的因子，我们使用PlantCARE程序分析了Oslrk1的启动子(1.5kb)中存在的顺式作用元件(Lescot et al.，2002)。在Oslrkl的启动子中位置-186、-657和-1190发现了在MeJA可诱导的基因中观察到的三个TGAGC基序。除此之外，三个GA3可诱导的基序(P-box-CCTTxt)位于Oslrk1 ORF的上游-101、-206和-740bp处。另外，在位置-321、-601、-604、-855和-1135检测到五个水杨酸可诱导的基序(TCA-elementcAGAAa/ga)。在Oslrk1启动子中存在MeJA、GA和SA应答顺式元件提示这些因子可能的调节作用。所述启动子分析使得我们研究不同激素和化合物对Oslrk1转录的作用。将WT种子发芽七天，之后将幼苗转入含有浓度为100μM的NAA、MeJA、GA₃或ABA之一和SA(5mM)的培养基中培养24小时(材料和方法)。在用Oslrk1基因3′UTR作为探针的Northern印迹杂交中使用分离自未处理的和处理的幼苗的总RNA。用GA₃和SA处理分别抑制Oslrk1基因表达2.5和3.3倍(图8A)。另一方面，MeJA诱导Oslrk1转录物；当与对照对比时，杂交信号的强度增加3.2倍，而当幼苗用IAA和ABA处理时，未观察到对转录的显著作用。为了确认Oslrk1基因被MeJA随时间诱导的水平，在另一系列实验中，在激素处理后研究一个时程。生长七天的幼苗上喷洒100μM的MeJA溶液，并在1、2、4、6、8和12小时收获。在整个时程中，Oslrk1表达被逐渐诱导，在8小时达到最大值，这是未处理的样品的大约3倍，并在处理后稳定长达12小时(数据未示出)。

                      实施例11

[0094]在对糖的应答中Oslrk1基因转录物显示差异表达。已知凝集素为特异性识别各种糖结构的碳水化合物结合蛋白(Vijayan and Chandra，1999)。由于OsLRK1具有一个豆科样凝集素结构域，我们希望测试Oslrk1表达对不同糖的应答。在此研究中使用五种不同的糖：葡萄糖(Glu)、蔗糖(Suc)、果糖(Fm)、Gal和Man，同时使用甘露醇作为渗透性对照(方法)。在分离自处理后的幼苗的总RNA上进行Northern印迹杂交。图8C显示在对这些单糖和Suc的应答中Oslrk1表达，其中所有测试的糖除Man之外均抑制该基因表达。Oslrk1的转录物水平在应答甘露醇中未改变提示这个基因不是通过渗透性调节的。

                        实施例12

[0095]Oslrk1突变体显示对植物激素改变的应答。为了研究植物激素对Oslrk1突变体的作用，使种子在含有不同浓度的MeJA(1，5，and 1011m)(图9A)或GA3(0.5，1，5 and 10μm)的培养基中生长(数据未示出)，WT作为对照。测量不定根的数目和长度、侧根的数目和苗长度。基于MeJA处理，在WT和突变体中苗长度均下降，但是在增加的浓度它们之间没有显著差异。然而，在WT幼苗和突变体中不定根的数目逐渐增加至5μM，而在10μM，MeJA的作用与在5μM时观察到的作用相反(图9B)。相反，在WT中不定根的长度基于增加的MeJA浓度(高至10μM)逐渐下降，在10μM长度减少大约75％，然而，Oslrk1突变体的不定根的长度不显著降低。在WT幼苗中，侧根的数目在5μM增加，在10μM减少。相反，在突变体中没有观察到侧根数目显著改变(图9A和B)。这些结果提示Oslrk1突变体对于MeJA的应用较不敏感。

[0096]另一方面，当幼苗在含有GA3的MS琼脂中生长两周时，与WT相比在突变体的行为方面除了不定根的长度之外没有观察到显著差异。WT的不定根长度在浓度为10μM的GA3时增加50％，但是在突变体中没有改变。

                         实施例13

[0097]Oslrk1突变体证明对半乳糖的超敏感性。上述不同的糖引起Oslrk1改变的表达使我们希望研究突变体对于这些单糖和蔗糖的应答。在含有不同浓度(从0.1％至1％)的Gal、Man、Glu、Fm与Suc的培养基中使WT和突变体种子发芽并生长，只含有Suc的培养基作为对照。在观察中考虑下列参数：苗长度、不定根的数目和长度、以及发芽率。用各种浓度的Glu、Fm和Man处理幼苗后在突变体和WT的行为方面没有显示显著差异，但是当种子在含有Gal的培养基中发芽并生长时观察到差异应答。除了这三种测试的糖之外，选择Man作为一个示例，因为其抑制作用在WT和突变体的种子和幼苗中是相似的，如图10A和B中所示。种子发芽受到Man的严重影响。在甘露糖浓度为0.5％时，WT和突变体植物的种子均不发芽。在甘露糖浓度为0.1％时，没有观察到任何测试的参数的明显作用，但是在浓度为0.2％时，种子发芽率在WT和突变体中均降低至35％。

[0098]另一方面，当在含有Gal的培养基上生长时，WT和突变体幼苗显示统计学显著的差异应答(图10C和D)。与WT相比，不定根数目，以及特别是长度，在突变体中被Gal强烈抑制(图10B和C)。在1.0％的Gal，在突变体中苗长度降低一半，而在WT幼苗中仅降低15％。在WT中不定根的数目或多或少是一样的，但是在突变体中，它们急剧降低85％。除此之外，在WT和突变体中，不定根长度在1.0％Gal中均下降，而在突变体中有严重下降。另外，WT种子的发芽率降低至85％，而在突变体中其降低至30％。基于获得的结果，我们的结论是突变体显示对Gal的超敏感性。

方法

[0099]基因组DNA分离和Southern印迹杂交。从叶中分离5μg基因组DNA(Dellaporta et al.，1983)，用合适的限制酶(EcoRI，Pstl，PvuII)消化，在0.8％琼脂糖凝胶上进行分级分离并转移到Hybond-N⁺膜(Amersham Biosciences，Little Chalfont，Bucks，UK)上。用地高辛(DIG)标记的探针在DIG easy Hyb溶液(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)中于42℃杂交DNA印迹。杂交后，将膜用2X SSC和0.1％SDS清洗两次15min，然后用0.5X SSC和0.1％SDS在68℃清洗两次15min。根据生产商说明用DIG Wash and block Buffer组以及化学发光底物CDP-Star(Roche)进行检测。DIG标记的探针使用PCRDIG Probe Synthesis Kit(Roche)和下列引物进行合成：

[00100]GUS探针：GusF：5’-CATTTGAAGCCGATGTACC-3’和GusR：TATCGGTGTGA GCG TCGCAG-3’；

BAR探针：BarF：5’-CATCAGATCTCGGTGACG’-3和BarR：

5’-TCGTCAACCACTACATCG-3’；

OsLRk1 的 3UTR：LRPK1F2：5’-GTCGCTGTTCG-TACTACG-3’和3UTRR5：5’-AGGATCGAACGCAAAGAG-3’；

凝集素探针：FRT15’-CAACCCCCACCCTTTTCTCCA-3’和RRT2：

5’-GGCCCGCCGAAGAGGTG-3’

[00101]RNA分离和Northern印迹分析。RNA从处于不同发育阶段的水稻植株的不同器官(10-14天的幼苗和生长2个月的植物的根、10-14天的幼苗、幼叶及成熟的叶、在开花阶段和胼胝体的圆锥花序)中使用RNeasy Plant minikit(Qiagen，)分离。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分级分离RNA(10 μg)并转移至Hybond-N⁺膜(Amersham)上。用地高辛(DIG)标记的探针在DIG Easy Hyb溶液(Roche)中于50℃杂交膜。杂交后，将膜用2X SSC和0.1％SDS清洗两次15min，然后用0.5X SSC和0.1％SDS在68℃清洗两次15min。根据生产商说明用DIG Wash and Block Buffer组以及化学发光底物CDP Star^TM(Roche)进行检测。使用DIG标记的相应于Oslrk1的3’UTR和凝集素结构域的探针。为了控制RNA的量，相应于水稻Actin1基因的DIG探针使用下列引物进行合成：

414F：5’-CTCTCAACCCCAAGGCCAATC-3’和1113R：

5’-AGGGCAGCGGAAACGCTCAG-3’

[00102]重复RT-PCR和Northern印迹至少三次，获得相似的结果。使用Quantity ONE 4.5.0软件在Gel doc XR文件管理系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.，USA)中对杂交信号强度进行定量。将实际表达水平计算为特异信号(Oslrk13′UTR探针)的强度与阳性对照信号(水稻Actl)强度的比值。

RT-PCR分析

[00103]通过使用提取自生长14天的幼苗的根的总RNA用One stepRT-PCR试剂盒(Qiagen)进行的RT-PCR扩增长度为2701bp的Oslrk1 cDNA(GenBank登录号AY663848)。所述PCR反应在PTC-100HB-96热循环仪(MJResearch Inc.，Watertown，MA，USA)上在以下条件下进行：50℃ 30min，95℃ 15min，之后：94℃ 40sec、58℃ 40sec、72℃ 3min，共35个循环，使用下列引物：5UTR-F7：5’-TTTCGTGGCCAACTCCT-3’，5UTR-F6：5’-CCCCTTGCTACATCACC-3’和 3UTR-R5：5’-AGGATCGAACGCAAAGAG-3’。对于表达研究，使用Northern杂交中使用的总RNA进行RT-PCR。使用上述相应于水稻Actin1的引物(414F和113R)作为内部对照。对于使用cDNA文库的PCR，使用特异于Oslrk1的3’UTR的引物以获得长度为500bp的扩增产物。

Oslrk1突变体的生理学研究

[00104]植物生长条件。在细胞培养容器(Phytatray II Sigma cell culture，USA)中，表面消毒的水稻种子在含有1％Suc的0.8％琼脂MS培养基(Murashige and Skoog medium，Sigma.，St.Louis MO，USA)上发芽并生长2周，光照周期为16/8小时。用于各种处理的所有化学物质均购于Sigma。

[00105]用激素和糖处理WT幼苗。将生长两周的WT幼苗转移至含有100μM不同激素和5mM水杨酸的MS培养基上，所述激素如吲哚3-乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)、或赤霉酸(GA3)，在正常日/光条件下生长24小时。从幼苗的根和完整幼苗提取总RNA。

[00106]用生长两周的幼苗在喷洒100μM MeJA后进行对MeJA作用的时程表达研究，并纯化得自在不同时间间隔(0h、1h、2hrs、4hrs、6hrs、8hrs和12hrs)收获的幼苗的总RNA。

[00107]为了研究不同糖对Oslrk1转录物的作用，将表面消毒的WT种子在含有0.8％琼脂但不含有蔗糖的MS培养基上在黑暗条件下发芽1周。之后，将幼苗转移至含有175mM不同糖(包括蔗糖、D(+)葡萄糖、β-D(-)果糖、D(+/-异构体混和物)甘露糖、D(+)半乳糖)的MS培养基并在正常日/光条件下温育48小时。

[00108]WT和突变体种子在含有半乳糖/甘露糖的培养基中的萌发。WT和突变体种子分别在含有0.8％琼脂和1％蔗糖的MS培养基上发芽。另外，以不同浓度(0.1、0.2、0.5、和1.0％)加入D(+)半乳糖/D(+/-)甘露糖和对照(含有1％蔗糖的MS)。在发芽后14天，记录观察到的不定根数目和长度(cm)、苗长度(cm)和发芽率(％)。

[00109]WT和突变体幼苗在含有MeJA的培养基中的生长WT和突变体幼苗在含有不同浓度的MeJA(1μM、5μM、和10μM)的MS培养基(1％Suc)中发芽并生长两周。对照中不加入MeJA。测量不定根的数目和长度(cm)以及侧根数目。

[00110]启动子Oslrk1::gusA和启动子Oslrk1::eyfp构建体。产生含有与gusA或eyfp基因融合的Oslrk1启动子(1.5Kb)的两个构建体。首先基于在Oslrk1的ATG上游大约2kb处发现的另一个基因的终止密码子而选择一段1.5kb长的上游区域。其次，我们使用PlantCARE程序(Lescot，et al.，2002)和用于检索顺式调节元件的数据库在Oslrk1的ATG密码子上游的不同区域检索了顺式调节元件，并且发现在1.5kb和2kb的序列长度上存在相同一组元件，但是元件的数目是不同的。由于所述1.5kb区域包含至少在数据库中是可用的全部调节元件，我们扩增了这个区域并将其用于启动子-报道基因融合构建体。

[00111]相应于Oslrk1启动子的一个片段(1kb)在PCR中使用提取和纯化自WT幼苗的叶的基因组DNA(100ng)和下列引物扩增：相应于Oslrk1基因的启动子序列的PromOslrk1F(CATTGCTTGGTCATTGG)和PromOslrk1R(AGGTCTGCGAGGAGTT)。PCR在50μl含有1X PCR缓冲液、1.5 mM MgCl、200μM每一种dNTP和1.5 U HotStar Taq-聚合酶(5U/μl)(Qiagen，)的体系中进行。循环程序包括：95℃ 15min，94℃ 40sec.，58℃ 40sec.，72℃ 1min，30个循环。扩增的片段从1％琼脂糖凝胶中纯化并使用pGEM-T Easy Vector System I(Promega，Madison，WI，USA，Cat.NA 1360)亚克隆进pGEM-T Easy载体中。pGEM-T Easy载体中的启动子Oslrk1用NcoI和SalI限制酶切割，然后，相应于Oslrk1启动子的1.4kb片段从凝胶中纯化并直接用于使用同样的限制酶消化而克隆进pCAMBIA 1301载体(CAMBIA)中(启动子Oslrk1::gusA)。连接使用Rapid DNA Ligation Kit(Roche)在4℃过夜进行。

[00112]pCAMBIA 1301中的PromOslrk1::gusA构建体用XbaI和NcoI限制酶消化，相应于1.4kb的片段用相同的限制酶切割而克隆进含有eyfp的构建体pSSZ32(Kolesnik et.al.，2004)中(Oslrk1启动子::eyfp)。

[00113]两个构建体均通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化而转化进水稻胼胝体中(Hiei et al.，1994)；选择并再生转基因胼胝体。

[00114]GUS染色分析和共焦显微术。对于GUS表达研究，将在不同发育阶段的水稻植株的不同器官收集于GUS染色液中并在37℃温育。然后用70％乙醇置换染色液以除去叶绿素成分，之后在LEICA MZ12显微镜(LiecaMicrosystems，NuBloch GmbH，Heidelberger)下对染色的组织进行显微观察。为了了解解剖学细节，将染色的根浸润、包埋、并用LEICA HISTORESINEmbedding Kit，(Leica Microsystems)根据生产商手册进行封片。封片的样品使用三角玻璃刀(后角4°-7°)在可收缩的机动切片机LEICA RM 2165(Leicamicrosystems)上进行切片，并在Nikon Eclipse 80i显微镜下观察。

[00115]使用LSM Ziess共焦显微镜(Model 510 META)在488nm波长分析携带启动子Oslrk1::eYFP构建体的转基因植物中的EYFP表达。用Zeiss LSMImage Browser 3，2，0，70版本成像。

统计学分析

[00116]对列于表2的参数进行t-检验并计算概率值(pValue)。通过双向方差分析(two-way Analysis of Variance，ANOVA)进行WT和突变体行为特征对于升高的MeJA(图9)和甘露糖和半乳糖(图10)的浓度产生的应答的统计学测试。这个测试用于研究对于两种处理(突变体和野生型)，模式的改变中的差异，其中我们分析并计算了相互作用效应的pValue。我们还进行了General LinearModel ANOVA以研究对于两种处理，模式改变的类型。

讨论

[00117]一些报道已经显示了凝集素样受体激酶由多基因家族编码。在拟南芥中已经描述了10个凝集素样激酶(Herve et al.，1999)并预测了42个基因(Barre et al.，2002；Navarro-Gochicoa et al.，2003)；在蒺藜苜蓿中报道了至少9个LRK(Navarro-Gochicoa et al.，2003)；在黑杨中通过Southern杂交证实了在基因组中存在几个LRK同系物(Nishiguchi et al，2002)。我们还通过在NCBI数据库中进行的ClustalW和BLASTNP同源性检索显示了Oslrk1基因属于一个包括至少64个成员的多基因家族。它们分布于不同的染色体上，形成两至三个基因的簇(cluster)。RLK的成簇事件在水稻中被描述，其中超过42％的基因被发现于串联重复中(Shiu et al.，2004)。鼠耳芥属中公开了相似的RLK的串联组织(34％；Shiu et al.，2001)，但是特别地在水稻中，RLK串联重复的程度高于在鼠耳芥属中。水稻LRK在蛋白质水平具有23-75％之间的同源性。

[00118]我们鉴别了一个在Oslrk1最接近的同系物Oslrk2中具有Ds插入的突变体品系。仔细观察Oslrk2突变体表型没有显示与WT相比在根和地上部分的特征中有任何变化，尽管其是一个无效突变(因为所述插入位于该基因的第一个外显子内)。我们没有能够证实存在Oslrk2的表达，尽管在KOME数据库中发现得自未成熟的种子的相应cDNA在序列中99％匹配。在纯合突变体中详细分析了种子产量，但是与WT相比没有观察到差异(数据未示出)。在Oslrk2突变体中缺少明显表型可能提示这个基因在正常条件下是功能上冗余的。

[00119]凝集素样受体激酶属于具有N末端配体结合凝集素样胞外结构域、跨膜结构域和胞质激酶结构域的一类受体激酶。这一类受体激酶在拟南芥、蒺藜苜蓿和黑杨中被报道(Herve et al.，1996，1999；Nishiguchi et al.，2002；Navarro-Gochicoa et al.，2003)。在RLK中，通过被识别的配体的特异性确定了胞外结构域。OsLRK1具有豆科样凝集素作为识别结构域，如在其他豆科植物中所示出的那样(Van Damme et al.，1998)。豆科凝集素是凝集素中独特的一组，因为其含有二价阳离子结合位点。OsLRK1具有用于在其凝集素结构域内结合Mn²⁺和Ca²⁺的保守残基(图5)。这些阳离子对于凝集素的碳水化合物结合活性是必需的(Sharon and Lis，2002)。

[00120]在所有豆科凝集素中均发现参与单糖结合的天冬氨酸。这个残基在OsLRK1中被谷氨酸取代，其在完整氨基酸序列中相应于Glu¹³⁵(图4)，在排列对比的氨基酸序列中相应于Glu⁸⁸(图5)。除了蒺藜苜蓿凝集素激酶(MtLecRK1；1)外，在所有凝集素样激酶中均观察到相似的由谷氨酸(OsLRK1，PnLRK)或组氨酸(AthLecRK1)残基进行的取代。在OsLRK1蛋白中也发现了相应于凝集素结构域的推断的序列中的Gly¹¹²、Asn¹²⁴、Gly²²⁷、Ala²³⁰、参与糖识别的其他保守残基。除了凝集素结构域之外，OsLRK1还在OsLRK1的C末端具有很保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。钻天杨(PnLRK；Nishiguchi et al.，2002)和鼠耳芥属(AtLecRK2；He et.al.，2004)的凝集素受体激酶示出能够在激酶结构域的保守丝氨酸/苏氨酸残基处进行自身磷酸化。在OsLRK1的激酶结构域中也发现了相似的磷酸化基序(DIKPS和GTLGYIAPE)。

[00121]通过RT-PCR、cDNA文库筛选和Northern印迹进行的Oslrk1的表达分析证明Oslrk1主要在根中表达，与得自蒺藜苜蓿的MtLecl；l、MtLec7；2和MtLec 7；3(Navarro-Gochicoa et al.，2003)、得自钻天杨的PnLRK1(Nishiguchi etal.，2002)以及得自鼠耳芥属的AtlecRK2(He et al.，2004)相似。我们已经通过RT-PCR和Northern印迹杂交证明了Oslrk1主要在幼苗和成熟植物的根中表达。在NCBI EST数据库中进行的BLASTN同源性检索揭示了衍生自生长一周的幼苗的水稻根(Accession N BE039888)和衍生自面包麦的根(AccessionNCD87254)的EST序列和Oslrk1的5′相同，这提供了这个基因在根中表达的另外的证据。另外，对携带Oslrk1启动子::gusA或eyfp的转基因植物的分析证实了Oslrk1主要在根的维管结构中表达。OsLRK1在维管结构中表达可能提示这个基因参与维管结构发育或参与碳或养料从源器官向根的运输。WT和突变体的根的横切未显示维管组织结构中的差异，这提示OsLRK1可能不是在维管结构发育中具有作用。另一方面，突变体植物显示扩张的根系，这提示碳(养料)从源器官向根细胞的积累可能通过敲除OsLRK1而增加，这导致根系扩张。

[00122]作为一个推定的跨膜蛋白，OsLRK1可能感受来自质外体的信号并将其传送至细胞质中。RLK由各种生物因子和生物胁迫因子调节，其可能参与信号转导途径(McCarthy and Chory，2000)。鼠耳芥属AtlecRK-al和钻天杨PnLRK被受伤所诱导(Riou et al.，2002；Nishiguchi et al.，2002)，而AtlecRK2被盐诱导(He et al.，2004)。然而，用不同激素如ABA和JA和SA处理黑杨的叶对于PnLRK基因的表达没有影响(Nishiguchi et al.，2002)。这些报道和在Oslrk1启动子中存在的几种MeJA、GA3和SA应答性顺式作用元件使我们想要研究不同激素(IAA、GA3、MeJA和ABA)和SA对Oslrk1基因的调节。Oslrk1基因差异调节在对激素和SA的应答中得到证明。在对MeJA的应答中表达水平升高，在对GA3和SA的应答中被抑制。

[00123]尽管在根中MeJA的水平相对较低(Berger et al.，1996)，但是在鼠耳芥属中显示MeJA强烈抑制根生长(Staswick et al.，1992，Berger et al.，1996，Ueda et al.，1995)。相似地，在水稻中，不定根的发育也被MeJA在高于3μM的浓度所抑制(Moons et al.，1997)；然而，所述根抑制的分子基础仍不清楚。Oslrk1转录物被MeJA诱导和突变体对于MeJA处理较不敏感的事实提示在调节根生长中OsLRK1应答或介导MeJA信号传导。

[00124]与MeJA相反，GA3抑制Oslrk1转录物。GA3已知为根生长促进因子，其通过抑制RGA和GAI的转录而介导植物生长素在促进根生长中的作用(Fu and Harberd，2003)。Oslrk1转录物被MeJA上调(根生长抑制剂)而被GA3抑制(根生长促进剂)的事实与设想的Oslrk1作为根生长抑制剂的功能相一致。另外，GA3处理时，与WT相比突变体中的不定根的长度改变较小，这可能提示OsLRK1在调节根长度时在介导来自GA3的信号中的作用。

[00125]植物中激素和胁迫信号之间的联系(cross talk)是当前了解植物对非生物刺激的应答和了解发育过程中的调节的一个问题。在鼠耳芥中，盐诱导的AtlecRK2示出被乙烯正调节(He et al.，2004)，而在水稻根中盐诱导性SalT基因在对JA的应答中累积(Moons et al.，1997)。LRK的生理学作用仍不清楚。LRK中的豆科样凝集素结构域可能参与碳水化合物结合的假设仍未得到证明，另外，大多数LRK中的参与糖结合的关键氨基酸的取代引起这样的假设：凝集素结构域几乎不能识别单糖(Herve et al.，1996，1999)。在Oslrk1中，在其他豆科凝集素中参与糖结合的关键氨基酸中的大多数是保守的，除了Asp⁸⁸之外。在鼠耳芥属中报道了寡聚糖对Athlecrk-al转录物的激活(Riou et al.，2002)。我们也已经示出Oslrk1转录物被各种糖除Man之外所抑制。甘露醇不能提高Oslrk1的转录物水平的事实提示这个基因不是渗透调节的。尽管Oslrk1表达被不同的碳水化合物差异调节，但是突变体仅在对Gal的应答中显示改变的应答。

[00126]在植物特别是单子叶植物中，Gal是半乳糖脂、细胞壁聚糖和糖蛋白的一种重要组分(Dormannn et al.，1998)。Gal在鼠耳芥属(Dormann andBenning，1998)、大麦(Farrar et al.，1994)、燕麦(Cheung and Cleland，1991)、番茄(Huges et al.，1974)、小麦(Knudson，1917)、玉米和其他物种(Yamamoto et al.，1988)中显示是根系扩张的一种非常强的抑制剂。在大麦中，证实了Gal对根细胞扩展的抑制作用是由于碳进入生长中的器官的输入降低(Thorpe et al.，1999)。与WT相比，Oslrk1突变体在对Gal的应答中显示超敏感性(图10)，这提示OsLRK1在Gal信号传导中具有一定作用以使其在根生长抑制中的作用最小化。

[00127]基于我们在Oslrk1表达分析和突变体生理学研究上的结果，我们提出了OsLRK1在水稻中的一个模型，如图11所示。Oslrk1作用为根生长的一种负调节物，因为这个基因功能的丧失导致扩张的根系。GA3已经被示出促进根生长，并且另一方面，MeJA、盐胁迫和Gal已经被示出抑制根生长。GA3抑制Oslrk1基因表达提示这个基因可能参与根生长抑制。在WT中Oslrk1转录物的诱导和突变体对MeJA的降低的敏感性显示OsLRK1直接或间接感知来自MeJA的信号并抑制根生长。如表达研究示出的Gal对Oslrk1转录物的抑制和突变体对Gal的超敏感性提示OsLRK1参与对半乳糖的应答并抑制根系扩张。简而言之，基于我们的结果，我们设想了OsLRK1在根生长的调节中作为根系扩张的负调节物和植物激素与糖信号传导的介导物的功能。

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Claims (64)

1.选自如下一组的分离的核酸：

(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸；和

(c)包含相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列的核酸。

2.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸是DNA。

3.权利要求2的分离的核酸，其中所述核酸是cDNA。

4.权利要求2的分离的核酸，其中所述核酸是基因组DNA。

5.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸是RNA。

6.权利要求5的分离的核酸，其中所述核酸是mRNA。

7.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸是融合基因。

8.一种载体，其包含与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的权利要求1的核酸。

9.一种用于在植物中负调节发育的方法，所述方法包括：

用至少一种与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列选自如下一组：

(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸；和

(b)包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸；以及

将所述细胞培养为植物。

10.权利要求9的方法，其中所述植物是单子叶植物。

11.权利要求9的方法，其中所述发育是根系扩张。

12.权利要求11的方法，其中所述调节包括传递来自糖或植物激素的信号。

13.一种用于促进在植物中增强的根生长的方法，所述方法包括：

用至少一种与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列选自如下一组：

(a)相应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的反义核苷酸序列；和

(b)相应于编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的反义核苷酸序列；以及

将所述细胞培养为植物。

14.权利要求13的方法，其中所述植物是单子叶植物。

15.权利要求13的方法，其中所述增强的根生长包括扩张的根系。

16.权利要求15的方法，其中所述扩张的根系包括更多的不定根和/或更长的侧根。

17.一种转化的植物细胞，所述细胞具有稳定整合进其基因组的至少一种与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自如下一组：

(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸；和

(c)包含相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列的核酸。

18.一种转基因植物，所述植物具有稳定整合进其基因组的至少一种与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自如下一组：

(a)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸；

(b)具有编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸；和

(c)具有相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列的核酸。

19.权利要求18的植物，其中所述植物是单子叶植物。

20.权利要求19的植物的种子。

21.一种用于在植物中调节发育的方法，所述方法包括：

用至少一种与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列选自如下一组：

(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸；和

(c)包含相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列的核酸；以及

将所述细胞培养为植物。

22.权利要求21的方法，其中所述植物是单子叶植物。

23.权利要求21的方法，其中所述发育包括根生长。

24.权利要求21的方法，其中所述调节包括在所述植物的一个地上部分导入修饰。

25.一种核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1所示的全长核苷酸序列具有大于50％的同源性，其中所述同源核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽。

26.一种用于在植物中负调节根系扩张的方法，所述方法包括：

用至少一种与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列选自如下一组：

(a)与SEQ ID NO：1所示的全长核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽；和

(b)与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽；以及

将所述细胞培养为植物。

27.一种用于在植物中促进根系扩张的方法，所述方法包括：

用至少一种与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的核苷酸序列转化植物细胞，其中所述核苷酸序列选自如下一组：

(a)相应于与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列的反义核苷酸序列；和

(b)相应于与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列的反义核苷酸序列；以及

将所述细胞培养为植物。

28.一种转化的植物细胞，所述细胞具有稳定整合进其基因组的至少一种与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自如下一组：

(a)与SEQ ID NO：1所示的全长核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽；

(b)与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽；和

(c)相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列。

29.一种转基因植物，所述植物具有稳定整合进其基因组的至少一种与在植物细胞中控制表达的启动子可操纵地连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自如下一组：

(a)与SEQ ID NO：1所示的全长核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽；

(b)与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列具有大于50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码保留该全长序列的生物学活性的多肽；和

(c)相应于(a)或(b)的核苷酸序列的反义核苷酸序列。

30.权利要求29的植物的种子。

31.一种转基因植物，其基因组包含水稻(Oryza sativa)凝集素样受体激酶1(Oslrk1)基因的一个破坏，其中所述破坏包括一个Ds插入，并且所述破坏导致该转基因植物与野生型植物相比显示增强的根生长。

32.权利要求31的转基因植物，其中所述破坏是Oslrk1基因的完全敲除。

33.权利要求31的转基因植物，其中所述增强的根生长包括扩张的根系。

34.权利要求33的转基因植物，其中所述扩张的根系包括更多的不定根或更长的侧根。

35.权利要求31的转基因植物，其中所述转基因植物在其地上部分显示修饰，所述修饰选自由与野生型植物相比更大的叶、开花推迟、和更高的种子产量组成的一组。

36.权利要求35的转基因植物，其中所述更高的种子产量是与野生型植物相比大约高21％。

37.权利要求31的转基因植物，其中所述转基因植物与野生型植物相比显示对D-半乳糖的超敏感性。

38.权利要求31的转基因植物，其中所述Ds插入位于Oslrk1基因第一个外显子中的ATG密码子下游117bp处。

39.权利要求35的转基因植物，其中所述开花与野生型植物相比推迟大约五天至大约七天。

40.权利要求31的转基因植物，其中所述转基因植物当成熟时比在相似条件下生长的野生型植物高大约30％。

41.权利要求31的转基因植物，其中所述转基因植物当成熟时比在相似条件下生长的野生型植物在圆锥花序中显示大约多70％的分枝。

42.权利要求31的转基因植物，其中所述转基因植物在幼苗期比在相似条件下生长的野生型植物显示大约2倍的苗长度。

43.权利要求31的转基因植物，其中所述植物在幼苗期比在相似条件下生长的野生型植物显示大约多56％的不定侧根。

44.权利要求31的转基因植物，其中所述植物在幼苗期比在相似条件下生长的野生型植物显示大约长74％的侧根。

45.包含水稻(Oryza sativa)凝集素样受体激酶1(Oslrk1)基因的分离的核酸，其中所述基因包含位于第一个外显子中的ATG密码子下游大约117bp处的Ds插入。

46.权利要求31的植物的种子。

47.一种在植物中增强根生长的方法，所述方法包括：

操作所述植物细胞的基因组使之包含水稻(Oryza sativa)凝集素样受体激酶1(Oslrk1)基因的一个破坏，其中所述破坏包含Ds插入；以及

将所述细胞培养为植物。

48.权利要求47的方法，其中所述破坏是Oslrk1基因的完全敲除。

49.权利要求47的方法，其中所述增强的根生长包括扩张的根系。

50.权利要求49的方法，其中所述扩张的根系包括更多的不定根或更长的侧根。

51.权利要求47的方法，其中所述Ds插入位于Oslrk1基因第一个外显子中的ATG密码子下游117bp处。

52.一种修饰植物地上部分的方法，所述方法包括：

操作所述植物细胞的基因组使之包含水稻(Oryza sativa)凝集素样受体激酶1(Oslrk1)基因的一个破坏，其中所述破坏包含Ds插入；以及

将所述细胞培养为植物。

53.权利要求52的方法，其中所述破坏是Oslrk1基因的完全敲除。

54.权利要求52的方法，其中所述植物地上部分的修饰选自由与野生型植物相比更大的叶、开花推迟和更高的种子产量组成的一组。

55.权利要求54的方法，其中所述更高的种子产量是与野生型植物相比大约高21％。

56.一种增加植物对D-半乳糖的敏感性的方法，所述方法包括：

操作所述植物细胞的基因组使之包含水稻(Oryza sativa)凝集素样受体激酶1(Oslrk1)基因的一个破坏，其中所述破坏包含Ds插入；以及

将所述细胞培养为植物。

57.权利要求56的方法，其中所述Ds插入位于Oslrk1基因第一个外显子中的ATG密码子下游117bp处。

58.权利要求56的方法，其中所述破坏是Oslrk1基因的完全敲除。

59.权利要求31的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。

60.水稻(Oryza sativa)凝集素样受体激酶1(Oslrk1)基因的分离的Ds插入突变体。

61.权利要求60的Ds插入突变体，其中所述Ds插入位于Oslrk1基因第一个外显子中的ATG密码子下游117bp处。

62.一种在植物中增强根生长的方法，所述方法包括：

操作所述植物细胞的基因组使之包含水稻(Oryza sativa)凝集素样受体激酶1(Oslrk1)基因的一个破坏，其中所述破坏包括Oslrk1基因的失活；以及

将所述细胞培养为植物。

63.权利要求62的方法，其中失活是由于基因转录物的降解所致。

64.权利要求63的方法，其中所述降解通过miRNA、RNAi、或sRNA技术实现。

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