CN101296613B - 显性失活突变体krp蛋白保护活性细胞周期蛋白-cdk复合物不受野生型krp抑制 - Google Patents

显性失活突变体krp蛋白保护活性细胞周期蛋白-cdk复合物不受野生型krp抑制 Download PDF

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Abstract

公开了具有针对野生型CKI蛋白的显性失活拮抗活性的突变体CDK抑制剂(CKI)多肽，以及相关组合物，包括编码突变体CKI多肽的核酸和载体，以及包含此类核酸和载体的转化的宿主细胞和转基因植物。还公开了关于使用所述突变蛋白质来调节细胞特别是植物细胞中的细胞分裂的相关方法。

Description

显性失活突变体KRP蛋白保护活性细胞周期蛋白-CDK复合物不受野生型KRP抑制
相关申请
本申请要求于2005年7月29日提交的美国申请号60/703,999的优先权，所述专利整体引入本文作为参考。
发明背景
植物具有与真核生物相同的基本细胞周期。并不令人意外地，它们还共同具有被称为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的真核生物激酶，所述细胞周期蛋白依赖性激酶调节细胞周期不同时期之间的过渡。拟南芥这一用于研究细胞周期的模型植物系统具有几个CDK亚群。CDKA最类似于哺乳动物的cdc2(CDK1)，并且在介导与其细胞周期蛋白配偶体的相互作用的区域中包含高度保守的ProSerThrAlaIleArgGlu(PSTAIRE)氨基酸序列(SEQIDNO：1)。拟南芥还具有被称为CDKB的植物特异性CDK群体，所述CDKB在高等动物中不是保守的。然而，植物缺乏关于G1CDKs-CDK4和CDK6的哺乳动物对应物。CDKA被提议为G1CDK(它由植物D型细胞周期蛋白激活)，而CDKB显示在S期中和以后是占优势表达的，因此可能被鉴定为G2/M特异性CDK。
这些CDKs的激活/失活驱动细胞通过细胞周期，并且还指示细胞何时退出细胞周期。拟南芥包含分成10个亚类的高达49种细胞周期蛋白(参见，Wang等人，PlantPhysiol.135：1084-1099，2004)。只有A、B和D类似乎在细胞周期中起作用并且激活CDKs(Wang等人，PlantPhysiol.135：1084-1099，2004)。CDKA由D型细胞周期蛋白激活，而CDKB由A和B型细胞周期蛋白激活。
在动物中，CDKs由2个CDK抑制剂(CKIs)家族负调节。被称为CDK4的抑制剂(INK4)的一类由4个成员(p15、p16、p18和p19)组成，所述4个成员与G1CDKs即CDK4和CDK6结合且抑制G1CDKs结合细胞周期蛋白。另一组抑制剂被称为激酶抑制剂蛋白(KIPs)或CIP(CDK相互作用蛋白)蛋白质，并且它们在所有动物中是高度保守的。CIP/KIP家族主要抑制细胞周期蛋白A-和E-CDK2激酶活性。在植物中，推定的CKIs已被鉴定(Wang等人，Nature386：451-452，1997；Wang等人，PlantJ.15：501-510，1998；DeVeylder等人，PlantCell13：1653-1667，2001；Jasinski等人，PlantPhysiol.130：1871-1882，2002)，并且显示出在体外抑制纯化的细胞周期蛋白/CDK激酶活性(Wang等人，1997，同上；Wang等人，PlantJ.24：613-623，2000；Lui等人，PlantJ.21：379-385，2000)。使用包含较大细胞的较小器官，植物CKIs的表达显示出生长减少(参见Wang等人，2000，同上；Jasinski等人，J.CellSci.115：973-982，2001；DeVeylder等人，同上；Zhou等人，PlantCellRep.20：967-975，2002；Zhou等人，PlantJ.35：476-489，2003；Schnittger等人，PlantCell15：303-315，2003)。在拟南芥中，这些CKIs被称为CDK的抑制剂(ICKs)或KIP相关蛋白(KRPs)。已鉴定了七个ICK家族成员，其最接近地类似CKIs的CIP/KIP家族。这些ICK/KRP家族成员中的每一个与p27KIP1具有高度的氨基酸序列同一性，但该同一性限于最C-末端的30个氨基酸。迄今为止，没有在任何植物中鉴定出INK相关CKIs。
细胞周期蛋白的过表达或CKI的敲除表明，良好平衡的细胞周期引擎在哺乳动物中可以容易地被扰乱。这种不平衡可以最终导致细胞周期加速、动物大小增加和/或肿瘤形成。降低或完全消除CKI“活性”导致细胞周期蛋白/CDK激酶活性增加。这种增加的活性导致细胞周期进展所需的下游靶的磷酸化，并且动物最终产生细胞过度增殖(Coats等人，Science272：877-880，1996)。由于导致过量细胞增殖的过量的细胞周期蛋白/cdk活性，小鼠中p27KIP1基因的缺失导致较大的小鼠(Fero等人，Cell85：733-744，1996；Kiyokawa等人，Cell85：721-732，1996；Nakayama等人，Cell85：707-720，1996)。
存在抑制KRP家族中的各个成员的表达的机制。植物中的转录后基因沉默(PTGS)是类似于动物中的RNA干扰(RNAi)的RNA降解机制。RNAi导致双链RNA(dsRNA)特异性降解成短的21-23bpdsRNA片段，所述dsRNA片段最终在同源RNAs群体的降解中起作用。在植物中，PTGS使用反向重复(IR)策略以抑制许多植物种类中的基因表达，所述植物种类包括作物植物，仅举几个例子例如玉米、大豆和卡诺拉油菜(canola)。然而，IR技术具有几个缺点，例如IR序列的效率、脱靶基因调节(Jackson等人，NatureBiotech.21：635-637，2003)、瞬时沉默、总体IR稳定性等。这些缺点由对于同时沉默超过一种基因的需要而在目前情况下复合。
常规植物育种在过去的75年里已成为用于增加作物产量的主要驱动力(J.Fernandez-Cornejo，AgricultureInformationBulletinNo.(AIB786)第81页，2004年2月)。最近，例如对昆虫害虫和除草剂具有抗性的转基因作物已变得可获得。然而，这些转基因作物确伴随产量损失发生(Elmore等人，Agron.J.93：408-412，2001；Elmore等人，Agron.J.93：404-407，2001)。迄今为止，还没有这样的已知转基因作物是商购可得的，所述转基因作物具有种子大小的增加或作物产量的增加。
本领域需要用于修饰某些在商业上有价值的作物的特性的改进方法，所述对于特性的修饰包括例如但不限于，增加作物产量、增加种子大小、增加萌芽率、增加根群(rootmass)等。如本文所述，本发明满足这些和其他需要。
发明概述
本发明提供了相对于野生型CKI多肽具有至少一个修饰的变体植物细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)多肽。在某些实施方案中，所述修饰在CDK结合区域内，以便相对于野生型CKI蛋白质，赋予对于CDK蛋白的经修饰的结合亲和力，同时基本上维持对于细胞周期蛋白的结合亲和力。本发明的变体CKI多肽具有针对野生型CKI功能的显性失活拮抗活性。当所述变体在下述细胞内表达时，野生型CKI的生物活性被抑制，导致通过细胞周期的进展加速和细胞增殖增加：表达相应野生型CKI蛋白的细胞，或表达与相应野生型蛋白质异源但尤其在细胞周期蛋白和CDK结合方面具有基本上等价的野生型功能的野生型CKI的细胞。
在其他方面，本发明提供了编码变体CKI多肽的重组核酸，或包含所述重组核酸的载体。可以将变体CKI编码核酸或载体引入宿主细胞中以用于扩增或表达所述核酸。宿主细胞可以例如在本发明的方法中用于产生变体CKI多肽。此外，变体CKI多肽在细胞中的表达可以在本发明的方法中用于调节细胞分裂。例如，变体CKI多肽在细胞中的表达可以导致通过细胞周期的进展加速和细胞增殖增加。
在另外其他的方面，提供了包含编码变体CKI多肽的转基因的转基因植物。所述变体CKI多肽在转基因植物中的表达可以在本发明的方法中用于例如，增加植物活力、增加根群、增加植物大小、或增加早期萌芽等。
定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似的任何方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用，但只描述了示例性方法和材料。为了本发明的目的，下述术语如下定义。
如本文使用的，术语“a”、“an”和“the”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指出。
如本文使用的，术语“细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂”(在本文中也称为“CDK抑制剂”或“CKI”)指负调节细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的一类蛋白质。顺应于本发明的CKIs是具有能够独立地结合细胞周期蛋白和CDK的分开的多肽区域的那些CKIs。此类CKIs包括例如，经鉴定的植物CKIs家族(7个鉴定的拟南芥CKIs)，所述植物CKIs与动物中的激酶抑制蛋白(KIPs)具有同源性，称为KIP相关蛋白(KRPs)(也称为“CDKs”的抑制剂或“ICKs”)。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。
术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单或双链形式的聚合物。除非具体限制，该术语包含含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸类似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，特定核酸序列还含蓄地包括其保守修饰变体(例如，简并密码子置换)。具体而言，简并密码子置换可以通过产生这样的序列来达到，在所述序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第3个位置用混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换(参见，例如，Batzer等人，NucleicAcidRes.19：5081，1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608，1985；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8：91-98，1994)。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。
在CKI多肽和核酸的情况下，术语“天然存在的”意指具有在自然界中发现的氨基酸或核苷酸序列(即可以从自然界中的来源(生物)分离且仍未通过人为干预有意修饰的氨基酸或核苷酸序列)的多肽或核酸。如本文使用的，可能已根据常规遗传学进行选择性育种的植物实验室株系被视为天然存在的植物。
如本文使用的，“野生型CKI基因”或“野生型CKI核酸”指相应于生物基因组中的CKI基因座的核酸序列，所述核酸序列编码的基因产物执行由相应于该基因座的天然存在核苷酸序列所编码的CKI蛋白质的正常功能。基因座可以在个体群体中具有超过一种序列或等位基因，和术语“野生型”包括编码执行正常功能的基因产物的所有此类天然存在的等位基因。“野生型”还包括不一定天然存在但仍编码具有正常功能的基因产物的基因序列(例如，具有沉默突变或编码具有保守置换的蛋白质的基因)。
术语“野生型CKI多肽”或“野生型CKI蛋白”指由野生型基因编码的CKI多肽。基因座可以在个体群体中具有超过一种序列或等位基因，和术语“野生型”包括编码执行正常功能的基因产物的所有此类天然存在的等位基因。
在本发明的CKI多肽和核酸的情况下，术语“突变体”或“变体”意指相对于相应野生型多肽或核酸为经修饰的多肽或核酸。
术语“参考CKI多肽”是为了定义突变体或变体CKI多肽的目的而在本文中使用的术语：该术语指为了定义氨基酸序列中的修饰的目的，将突变体CKI多肽与之进行比较的CKI多肽。因此，“相对于参考CKI多肽包含具有至少一个修饰的CKI氨基酸序列”的突变体CKI多肽意指，除了一个或多个氨基酸修饰外，突变体CKI多肽在其他方面包含参考多肽的氨基酸序列。在如本文所述执行本发明的过程中，参考CKI多肽是预先确定的。参考CKI多肽可以是例如野生型和/或天然存在的CKI多肽，或已进行有意修饰的CKI多肽。
术语“经修饰的结合”或“经改变的结合”指由野生型基因编码的突变体CKI多肽，所述野生型基因的参考CKI多肽结合细胞周期蛋白/CDK复合物。术语“经修饰的结合”或“经改变的结合”在本文中指突变体CKI与细胞周期蛋白/CDK激酶复合物的结合。术语“经修饰的结合”或“经改变的结合”指与参考CKI多肽相比较，突变体CKI多肽的相对结合。“经修饰的结合”或“经改变的结合”可以指这样的突变体CKI多肽，其与参考CKI多肽相比较，具有与细胞周期蛋白/CDK复合物的相同的结合、减少的结合、或等价的结合。
如本文使用的，“重组体”指已通过重组方法进行有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“重组核酸”在本文中意指一般而言通过核酸内切酶处理核酸，以自然界中通常未发现的形式，最初在体外形成的核酸。因此，线性形式的分离的突变体或变体CKI核酸，或通过使通常不连接的DNA分子连接在一起而在体外形成的表达载体，为了本发明的目的都被视为重组体。应当理解，一旦制备了重组核酸并将其再引入宿主细胞或生物内后，它将非重组地，即使用宿主细胞的体内细胞机构而不是体外操作进行复制；然而，此类核酸一旦重组产生后，尽管随后非重组地进行复制，但为了本发明的目的仍被视为重组体。“重组蛋白质”是使用重组技术，即通过如上文所述的重组核酸表达来制备的蛋白质。重组蛋白质通过至少一个或多个特征与天然存在的蛋白质区分开。
关于氨基酸，“非保守的”修饰意指其中野生型残基和突变体残基在一个或多个物理性质方面显著不同的修饰，所述物理性质包括疏水性、电荷、大小和形状。例如，从极性残基到非极性残基的修饰或反之亦然，从带正电荷残基到带负电荷残基的修饰或反之亦然，和从大残基到小残基的修饰或反之亦然是非保守的修饰。例如，可以进行更显著影响下述性质的置换：改变区域中的多肽主链的结构，例如α螺旋或β折叠结构；靶位点上的分子的电荷或疏水性；或侧链的松密度。一般被预期在多肽性质中产生最大变化的置换是下述那些：其中(a)亲水残基例如丝氨酰或苏氨酰被置换成疏水残基例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰(或反之亦然)；(b)半胱氨酸或脯氨酸被置换成任何其他残基(或反之亦然)；(c)具有电正性侧链的残基例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰被置换成电负性残基例如谷氨酰或天冬氨酰(或反之亦然)；或(d)具有大体积侧链的残基例如苯丙氨酸被置换成无侧链的氨基酸例如甘氨酸(或反之亦然)。
保守修饰一般是下文显示的那些，然而，如本领域已知的，其他置换也可以被视为是保守的。
Ala：Ser
Arg：Lys
Asn：Gln，His
Asp：Glu
Cys：Ser
Gln：Asn
Glu：Asp
Gly：Pro
His：Asn，Gln
Ile：Leu，Val
Leu：Ile，Val
Lys：Arg，Gln，Glu
Met：Leu，Ile
Phe：Met，Leu，Tyr
Ser：Thr
Thr：Ser
Trp：Tyr
Tyr：Trp，Phe
Val：Ile，Leu。
在蛋白质作用机理或基因表型的情况下，术语“显性失活的”指基本上阻止具有野生型功能的相应蛋白质执行野生型功能的突变体或变体蛋白质、或者编码所述突变体或变体蛋白质的基因。
如本文使用的，短语“野生型CKI的拮抗剂”意指，与在不存在该拮抗剂的情况下经由野生型CKI多肽的激酶活性抑制相比较，突变体CKI多肽显著减少(抑制)野生型CKI多肽抑制CDK/细胞周期蛋白复合物的激酶活性的能力。
当将核酸置于与另一种核酸序列处于功能性关系的状况时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它与该序列是可操作地连接的；或如果核糖体结合位点如此放置以便促进翻译，那么它与该编码序列是可操作地连接的。
术语“植物”包括完整植物、植物器官(例如，叶、茎、花、根等)、种子、和植物细胞(包括组织培养细胞)及其后代。可以在本发明的方法中使用的植物种类一般与适合于转化技术的高等植物种类一样广泛，包括裸子植物和被子植物，单子叶和双子叶植物，以及某些低等植物例如藻类。它包括各种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体。单子叶被子植物的例子包括，例如天门冬、野生甜玉米、大麦、小麦、稻、高粱、甘蔗、洋葱、粟、黑麦和燕麦及其他谷类作物。双子叶被子植物的例子包括但不限于，西红柿、烟草、棉花、油菜(卡诺拉油菜)、亚麻荠、蚕豆、大豆、胡椒、莴苣等。木本种类的例子包括杨树、松树、雪松、橡树、冷杉等。
“异源序列”是来源于不同物种的序列，或如果来自相同物种，那么与其最初形式而言是实质上经过修饰的。例如，与结构基因可操作地连接的异源启动子来自与结构基因所来源的物种不同的物种，或如果来自相同物种，那么与其最初形式而言是实质上经过修饰的。
术语“载体”指通常为双链的DNA片，在所述DNA片中可以已插入了外源DNA片。载体或复制子可以例如具有质粒或病毒来源。载体包含促进载体在宿主细胞内自主复制的“复制子”多核苷酸序列。在本公开内容的情况下，术语“复制子”还包括，使载体序列靶向重组到宿主染色体内或者促进载体序列重组到宿主染色体内的多核苷酸序列区域。此外，尽管外源DNA最初可以例如插入DNA病毒载体内，但病毒载体DNA转化到宿主细胞内可以导致病毒DNA转变成病毒RNA载体分子。外源DNA被定义为异源DNA，所述异源DNA是在宿主细胞中未天然发现的DNA，其例如复制载体分子、编码可选择的或可筛选的标记或转基因。载体用于将外源或异源DNA运输到合适的宿主细胞内。一旦进入宿主细胞内后，载体可以与宿主染色体DNA独立地或同时复制，且可以产生载体及其插入DNA的几个拷贝。备选地，载体可以使外源或异源DNA的靶向插入宿主染色体内。此外，载体还可以包含允许插入DNA转录成mRNA分子，或者引起插入DNA复制成多个拷贝的RNA的必需元件。某些表达载体另外还包含邻近于插入DNA的序列元件，所述序列元件允许mRNA翻译成蛋白质分子。因此，可以快速合成由插入DNA编码的mRNA和多肽的许多分子。
术语“转基因载体”指包含DNA插入区段(“转基因”)的载体，所述DNA插入区段在宿主细胞内被转录成mRNA或复制为RNA。术语“转基因”不仅指转变成RNA的插入DNA的部分，还指转录或复制所述RNA所需的载体的那些部分。此外，转基因不一定必需包含含有能够产生蛋白质的开放读码框的多核苷酸序列。
术语“转化的宿主细胞”、“转化的”和“转化”指将DNA引入细胞内。该细胞被称为“宿主细胞”，并且它可以是原核或真核细胞。通常的原核宿主细胞包括各种大肠杆菌(E.coli)的菌株。通常的真核宿主细胞是植物细胞(例如，卡诺拉油菜、大豆、稻或玉米细胞等)、酵母细胞、昆虫细胞、或动物细胞。引入的DNA通常为包含插入的DNA片的载体形式。引入的DNA序列可以来自与宿主细胞相同的物种或来自与宿主细胞不同的物种，或者它可以是杂合DNA序列，包含某些外源DNA和某些来源于宿主物种的DNA。
在CKI多肽和核酸的情况下，与另一个序列(例如，区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“相应性”基于这样的惯例，即根据核苷酸或氨基酸位置数目进行编号，随后以使匹配每个位置的核苷酸或氨基酸数目最大化的方式，即以使序列同一性百分比最大化的方式比对所述序列。因为并非所有具有给定“相应区域”的位置都必需是相同的，所以相应区域内的非匹配位置可以被视为“相应位置”。因此，如本文使用的，当提及“相应于特定CKI多肽的氨基酸位置X的氨基酸位置”时表示提及在其他所认可的CKI多肽以及结构同系物和家族中的等价位置的集合。
在涉及CKI多肽和核酸的KRP超家族的典型的本发明实施方案中，氨基酸或核苷酸位置的“相应性”通常相关于CDK结合区域内的氨基酸、或编码CDK结合区域的核苷酸而言进行确定。一般地，与KRP多肽的其他区域相比较，KRPCKIs的CDK结合区域共享基本的序列同一性或相似性。因此，用于确定KRPCKI多肽的CDK结合区域的一种合适技术是，鉴定与第二种KRPCKI的已知CDK结合区域(例如，来自欧洲油菜(Brassicanapus)Krp1(BnKrp1)的大约氨基酸位置145-168)共享基本的序列同一性或相似性的氨基酸区域。(参见，例如，图1，显示了几个CKI家族成员与BnKrp1的氨基酸序列比对)。一旦已通过序列比对确定了相应于CDK结合区域的序列后，那么因而就可以确定相应的氨基酸或核苷酸位置。
如本文使用的，“序列同一性百分比”通过在比较窗上比较2个经最佳比对的序列来测定，其中对于所述2个序列的最佳比对，与参考序列(它不包含添加或缺失)相比较，比较窗中的序列部分可以包含添加或缺失(即，缺口)。百分比通过下述方式来计算：测定2个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的位置的总数目，并将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。
在2个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“同一的”或“同一性”百分比涉及，如使用下述序列比较算法之一或通过手工比对和目测检查所测量的，当在比较窗或指定区域上就最大相应性进行比较和比对时，相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(例如，在指定区域上60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性)的2个或更多个序列或子序列。如果序列至少约25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、或至少55％同一，那么它们是彼此“基本上同一的”。这些定义还涉及测试序列的互补序列。任选地，同一性存在于长度为至少约6个氨基酸残基、长度为至少约15个氨基酸残基、长度为至少约25个氨基酸残基、长度为至少约35个氨基酸残基、长度为至少约50个氨基酸残基、或长度为至少约100个或更多氨基酸的多肽区域上，或存在于编码此类多肽区域的核酸区域上。在本发明的某些优选方面，用于比较的指定区域是CKI多肽的CDK结合区域、包含此类CDK结合区域的部分的多肽区域、或包含此类CDK结合区域的多肽区域。
在2个或更多个多肽序列的情况下，术语“相似性”或“相似性百分比”涉及，如使用下述序列比较算法之一或通过手工比对和目测检查所测量的，当在比较窗或指定区域上就最大相应性进行比较和比对时，具有指定百分比的由保守氨基酸置换限定为相同或相似的氨基酸残基(例如，在指定区域上60％相似性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相似的)的2个或更多个序列或子序列。如果序列彼此至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、或至少55％相似，那么它们是彼此“基本上相似的”。任选地，这种相似性存在于长度为至少约6个氨基酸残基、长度为至少约15个氨基酸残基、长度为至少约25个氨基酸残基、长度为至少约35个氨基酸残基、长度为至少约50个氨基酸残基、或长度为至少约100个或更多氨基酸残基的区域上。
在本发明的某些方面，为了测定序列同一性或相似性，用于比较的指定区域是CKI多肽的CDK结合区域、包含此类CDK结合区域的部分的多肽区域、或包含此类CDK结合区域的多肽区域。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机内，指定子序列坐标(coordinates)，必要时还指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定其他参数。序列比较算法随后根据程序参数来计算相对于参考序列而言的测试序列的序列同一性或相似性百分比。
如本文使用的，“比较窗”包括涉及邻接氨基酸或核苷酸位置的区段，其中在2个序列最佳比对后，序列可以与相同邻接位置数目的参考序列进行比较。就根据本发明进行CKI多肽的比较而言，比较窗通常为约6个-约200个或更多个邻接氨基酸，通常为约6个-约50个，约6个-约25个，约15个-约100个，约15个-约50个，约15个-约30个，约20个-约50个，或约25个-约50个邻接氨基酸。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1970)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)的同源性比对算法；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444，1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(例如，WisconsinGeneticsSoftwarePackage，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(1995增刊))。
一个有用算法的例子是PILEUP。PILEUP使用渐进的成对比对而由一组相关序列产生多重序列比对，以显示相互关系和序列同一性百分比。它还绘制显示出用于产生比对的聚类关系的树或树状图。PILEUP使用简化的Feng&Doolittle，(J.Mol.Evol.35：351-360，1987)的渐进比对方法。所使用的方法类似于由Higgins&Sharp，(CABIOS5：151-153，1989)描述的方法。该程序可以比对高达300个序列，每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多重比对操作从2个最相似序列的成对比对开始，产生2个经比对的序列的聚簇(cluster)。这个聚簇随后可以与下一个最相关序列或经比对的序列的聚簇进行比对。2个序列聚簇可以通过2个独个序列的成对比对的简单延伸来进行比对。最终比对通过一系列渐进的成对比对来完成。该程序通过指定序列比较区域的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐标和通过指定程序参数来运行。使用PILEUP，将参考序列与其他测试序列进行比较以测定序列同一性百分比关系，使用下述参数：缺省缺口权重(3.00)、缺省缺口长度权重(0.10)、和加权末端缺口。PILEUP可以从GCG序列分析软件包(例如，版本7.0(Devereaux等人，Nucl.AcidsRes.12：387-395，1984))中获得。
适合于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另一个例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分别在Altschul等人(Nucl.AcidsRes.25：3389-3402，1977)和Altschul等人(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)中描述。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开获得。这种算法包括，首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字(word)来鉴定高得分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，所述HSPs匹配或满足某一正值阈值得分T。T称为邻近字得分阈值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul等人，同上)。这些最初邻近字的命中用作起始搜索的种子，以找到包含它们的更长HSPs。在累积比对得分可以增加的情况下，字命中(wordhits)沿着每个序列在2个方向上进行延伸。对于核苷酸序列，累积得分使用参数M(关于一对匹配残基的奖励得分；总是＞0)和N(关于错配残基的罚分；总是＜0)进行计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积得分。在下列情况时，停止字命中在每个方向上的延伸：累积比对得分比其达到的最大值减少X量；由于一个或多个负得分残基比对的积聚，累积得分变成零或零以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用下列作为缺省值：字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用下列作为缺省值：字长为3、和期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919，1992)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787，1993)。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小加和概率(P(N))，它提供了对两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率指示。例如，如果测试核酸与参考核酸比较中的最小加和概率小于约0.2，通常小于约0.01，和更通常小于约0.001，那么该核酸被视为类似于参考序列。
还可以使用国家生物技术信息中心(NCBI)的HomoloGene资源来鉴定基因同系物和直向同源物。第一种基因的同系物或直向同源物可以编码具有与由第一种基因编码的基因产物相同或相似功能的基因产物。2个核酸序列或多肽是直向同源物的另一个指示是，该异源基因可以在真核细胞表达系统中补足(例如，援救)内源基因的无效等位基因。
附图简述
图1显示了拟南芥属植物KRP家族成员与芸苔属植物Krp家族成员的氨基酸序列比对。拟南芥属植物KRPs的序列从公共数据库获得：AtKrp1(Genbank#U94772)(SEQIDNO：2)；AtKrp2(Genbank#CAB76424)(SEQIDNO：3)；AtKrp3(Genbank#CAC41617)(SEQIDNO：4)；AtKrp4(Genbank#CAC41618)(SEQIDNO：5)；AtKrp5(Genbank#CAC41619)(SEQIDNO：6)；AtKrp6(Genbank#CAC41620)(SEQIDNO：7)；和AtKrp7(Genbank#CAC41621)(SEQIDNO：8)。芸苔属植物KRPs的序列(BnKrp1(SEQIDNO：68)、BnKrp3(SEQIDNO：69)、BnKrp4(SEQIDNO：70)、BnKrp5(SEQIDNO：71)和BnKrp6(SEQIDNO：72))如下文实施例1中所述获得。还显示了p27的氨基酸序列(SEQIDNO：73)。
图2显示了玉米(SEQIDNO：9)、卡诺拉油菜、大豆(SEQIDNO：11)、杨树(SEQIDNO：12)、烟草(SEQIDNO：13)、小麦、稻(SEQIDNO：15)、和马铃薯(SEQIDNO：16)细胞周期蛋白和CDK结合结构域的氨基酸序列比对，其图解说明了CDK结合结构域内的高度序列同一性。
图3显示了编码BnKrp1F151A；153A(SEQIDNO：74)或BnKrp1Y149A；F151A；F153A(SEQIDNO：75)中任一个的突变体BnKrp1核酸序列，其已就在玉米中的表达进行了密码子优化。
发明详述
本发明包括用于调节植物细胞分裂的组合物和方法。特别地，提供了经由显性失活机制来拮抗野生型CKI蛋白功能的多肽，以及相关的多核苷酸、宿主细胞、转基因植物、及其使用方法。包含编码显性失活的变体CKI多肽的多核苷酸的广泛多样的转基因载体，可以用于实践本发明。当本发明的CKI转基因被引入植物内并表达时，调节了植物细胞分裂。取决于与变体CKI转基因可操作地连接的启动子序列的类型，细胞分裂的调节可以在植物体各处发生，或以组织或器官特异性方式发生。特别地，本文提供的组合物和方法可以用于加速植物细胞通过细胞周期的进展，伴随着细胞增殖增加。以这种方式使用组合物和方法允许例如在广泛多样植物中的任何植物之中产生作物产量和/或种子大小增加。作物产量的增加可以包括，例如，叶组织增加、果实增加、花的产生增加、根群增加等。
在本发明的具体实施方案中，变体CKI多肽是KRP家族成员。本发明的这个方面至少部分基于下述发现：KRP家族成员的CDK结合区域主要负责抑制细胞周期蛋白-CDK复合物。因此，瞄准KRP家族成员中的CDK结合区域(与细胞周期蛋白结合区域相对)允许产生突变体蛋白，所述突变体蛋白是野生型CKI功能的特别有效的显性失活拮抗剂。
突变体CKI多肽、核酸和载体
本发明的CKI多肽是可与天然存在的或野生型的CKIs区分的突变体或变体蛋白质。相对于参考CKI多肽(例如，野生型CKI蛋白)，变体CKI多肽在蛋白质的CDK或细胞周期蛋白结合区域中包含至少一个修饰。与相应的野生型序列相比较，通常的修饰包括氨基酸置换、插入和/或缺失。特别合适的修饰是氨基酸置换。在某些实施方案中，变体CKI多肽包含至少一个非保守修饰(例如，置换)。
本发明的突变体CKI多肽是显性失活蛋白质。显性失活方法特别顺应于具有分别参与CDK和细胞周期蛋白结合的2个多肽区域的CKI多肽。用于形成本发明的显性失活突变体的一般方法包括修饰独个CDK和细胞周期蛋白结合区域之一，以便修饰“野生型”CDK或细胞周期蛋白结合。这种经修饰的CDK或细胞周期蛋白结合区域可以导致与野生型多肽相比较，与细胞周期蛋白或CDK的结合相等、减少或消除。在任一情况下，突变可以减少或消除CKIs激酶抑制活性。为了设计可以干扰野生型功能的显性失活CKI多肽，突变体多肽必须(1)基本上与细胞周期蛋白/CDK复合物结合；(2)即使在高浓度下也基本上不抑制细胞周期蛋白CDK复合物；和(3)与野生型CKI多肽竞争结合细胞周期蛋白/CDK复合物。在体内，符合所有这些要求的突变体CKI多肽导致细胞中的细胞周期蛋白/CDK激酶活性升高，这依次导致细胞增殖增加和更高的有丝分裂指数，这最终导致植物具有增加的产量、更大的种子、和/或与植物的一个或多个区域中的细胞周期蛋白/CDK激酶活性升高相关的某些其他特征。
在KRP多肽的具体情况下，瞄准CDK结合区域用于修饰，所述CDK结合区域主要负责这个CKI多肽家族中的细胞周期蛋白/CDK激酶抑制。
特别合适的修饰包括氨基酸置换、插入或缺失。例如，氨基酸置换可以作为减少或消除结合的在CDK或细胞周期蛋白结合区域中的修饰而产生。类似地，氨基酸置换可以作为减少或消除CKI抑制活性的在CDK或细胞周期蛋白结合区域中的修饰而产生。在典型实施方案中，在CDK或细胞周期蛋白结合区域中进行至少一个非保守氨基酸置换、插入或缺失，以破坏或修饰CKI多肽与CDK或细胞周期蛋白的结合。
置换型CKI多肽突变体是在参考CKI蛋白序列中已去除至少一个氨基酸残基且在相同位置上插入不同氨基酸以替代之的那些突变体。置换可以是单个的，其中在分子中只有一个氨基酸被置换，或者置换可以是多个的，其中同一分子中的2个或更多个氨基酸被置换。本发明的CKI蛋白分子活性的实质改变可以通过用下列氨基酸置换一个氨基酸来获得：侧链在电荷和/或结构方面显著不同于天然氨基酸的另一个氨基酸，具有与天然氨基酸相反的电荷的氨基酸，或具有与天然氨基酸相反的亲水性的氨基酸等。这些类型的置换预期将影响置换区域中多肽主链的结构和/或分子的电荷或疏水性。在本发明的某些示例性实施方案中，置换型CKI突变体包括用丙氨酸置换非丙氨酸残基。在其他变化形式中，置换型CKI包括用下述氨基酸置换氨基酸残基：例如，带相反电荷的氨基酸，具有更大侧链的氨基酸残基，具有相反亲水性的氨基酸，小的非极性氨基酸(例如，Cys、Thr、Ser、Ala或Gly)，或极性氨基酸(例如，Pro、Glu、Asp、Asn或Gln)。
插入型CKI多肽突变体是具有与在参考CKI蛋白分子中特定位置处的氨基酸紧邻地插入的一个或多个氨基酸的突变体。与氨基酸紧邻意指与所述氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。插入可以是一个或多个氨基酸。插入可以例如由1个或2个保守氨基酸组成。在电荷和/或结构方面与邻近插入位点的氨基酸类似的氨基酸被定义为保守的。备选地，突变体CKI包括插入这样的氨基酸，所述氨基酸具有与邻近插入位点的氨基酸基本上不同的电荷和/或结构。
缺失型CKI多肽突变体是其中已去除了参考CKI蛋白分子中的一个或多个氨基酸的突变体。在某些实施方案中，缺失型突变体在CKI蛋白分子的特定区域中将具有缺失的1个、2个或更多个氨基酸。缺失型突变体可以包括例如，具有氨基或羧基末端截短的突变体。
本发明的方法可以应用于其中独个区域参与结合CDK和细胞周期蛋白以抑制CDK功能的蛋白质的CKI家族中的任何公认的成员。在一个实施方案中，突变体CKI蛋白质是属于CKIs的KRP家族的蛋白质的突变或变体。如上所述，KRP家族成员的CDK结合区域主要负责激酶抑制。因此，在变体KRPCKI多肽的设计中优选瞄准CDK结合区域以用于修饰。KRP蛋白的CDK结合区域一般相应于欧洲油菜Krp1(BnKrp1)(SEQIDNO：17)的氨基酸145-168。在某些实施方案中，KRP家族成员的CDK结合区域的修饰包括在相应于BnKrp1位置145-168的区域内的至少1个氨基酸位置、2个氨基酸位置、或更多个氨基酸位置上的修饰。(拟南芥Krp1中的相应区域包括氨基酸167-190)。用于修饰的特别合适的氨基酸位置包括相应于欧洲油菜Krp1(BnKrp1)的氨基酸145、148、149、151、153、155、163、164、165和/或167的那些位置。通过使用已知方法和如本文进一步描述的进行序列比对，可容易地确定其他CKI多肽中的相应氨基酸残基。
在每种情况下，上述氨基酸在哺乳动物p27中是保守的，且在与细胞周期蛋白A和CDK2复合的p27的晶体结构中全都接触CDK。在一个实施方案中，KRPCDK结合区域的修饰包括相应于BnKrp1的氨基酸位置151和153的氨基酸的修饰(例如，在这些位点中每一个上的氨基酸置换，例如，至丙氨酸或带相反电荷的氨基酸)。在其他示例性变化形式中，除了相应于BnKrp1位置151和153的氨基酸修饰外，KRPCDK结合区域的修饰进一步包括在相应于BnKrp1的氨基酸149、164和/或165的位置上的修饰(例如，在相应于BnKrp1的氨基酸149的位置上的另外氨基酸置换；或在相应于BnKrp1的氨基酸164和氨基酸165的位置上的2个另外氨基酸置换)。对于KRPCKI多肽的此类修饰改变对于CDK蛋白的结合亲和力，而基本上保留变体蛋白质结合细胞周期蛋白的能力。
特别感兴趣的KrpCDK结合区域的修饰包括但不限于，相应于任何下述氨基酸置换的修饰：
BnKrp1F145A；Y149A
BnKrp1F145A；Y149A；F151A
BnKrp1F145A；Y149A；F151A；F153A
BnKrp1Y149A；F151A
BnKrp1Y149A；F153A
BnKrp1F151A；F153A
BnKrp1F151A；F153A；Y149A
BnKrp1F151A；F153A；E164A
BnKrp1F151A；F153A；W165A
BnKrp1F151A；F153A；E164A；W165A
BnKrp1F151A；F153A；Y149A；E164A
BnKrp1F151A；F153A；Y149A；W165A
BnKrp1F151A；F153A；Y149A；E164A；W165A
BnKrp1E164A；W165A。
在某些实施方案中，如上进行修饰的CKI多肽是BnKrp1。在其他变化形式中，如上进行修饰的CKI不是具有相应于上述那些的经置换的氨基酸的BnKrp1(例如，拟南芥)。
影响CDK或细胞周期蛋白结合的其他修饰(例如，置换、插入、缺失)包括KRP家族成员中的另外修饰，其可以使用各种技术包括结构比对法、序列比对法等来鉴定。突变体或变体蛋白质可以通过下述方法来产生：例如，使用先前在美国专利号6,188,965、6,296,312和6,403,312中描述的PDATM系统，丙氨酸扫描(参见美国专利号5,506,107)，基因改组(WO01/25277)，位点饱和诱变，平均场(meanfield)，序列同源性，或本领域技术人员已知的指导选择点突变位点和类型的其他方法，如下文进一步描述的。
本发明的CKI多肽变体可以通过使编码相应的野生型CKI或由其衍生出该变体的其他相应CKI的DNA序列突变来构建，例如通过使用通常被称为定点诱变的技术。编码CKI蛋白的核酸分子可以通过各种本领域普通技术人员众所周知的聚合酶链式反应(PCR)技术来突变。(参见，例如，PCRStrategies(M.A.Innis，D.H.Gelfand和J.J.Sninskyeds.，1995，AcademicPress，SanDiego，CA)第14章；PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky和T.J.Whiteeds.，AcademicPress，NY，1990)。此外，众所周知的化学和/或辐射诱变方法也是本领域众所周知的，其可以用于诱导KRP家族成员蛋白质的编码区中的突变。可以进行筛选以找出可能包含所需核苷酸序列的那些植物，所述核苷酸序列编码本发明的突变体或变体Krp。可以就CKI氨基酸序列的变化、激酶活性的变化或表型的预期变化来筛选植物，随后为序列分析。
作为非限制性例子，在来自Clontech的TransformerSite-DirectedMutagenesis试剂盒中使用的2个引物系统，可以用于将定点突变引入编码CKI蛋白的基因内。靶质粒在这个系统中变性后，2个引物同时与该质粒退火；这些引物之一包含所需的定点突变，另一个包含在该质粒中另一个点上的突变，从而导致限制位点消除。随后进行紧密连接这两个突变的第二条链合成，并将所得到的质粒转化到大肠杆菌的mutS菌株内。从转化的细菌中分离质粒DNA，用相关限制酶进行限制性消化(从而使未突变的质粒线性化)，然后再转化到大肠杆菌内。这个系统允许直接在表达质粒中产生突变，无需亚克隆或产生单链噬菌粒。这两个突变的紧密连接和未突变质粒的随后线性化导致高突变效率且允许最低限度的筛选。在合成最初限制位点引物后，这种方法对于每个突变位点只需要使用一个新引物类型。不是分别制备每个位置突变体，而是可以合成一组“设计简并”寡核苷酸引物，以便在给定位点上同时引入所有所需突变。转化体可以通过如此来进行筛选：经过诱变区域对质粒DNA进行测序，以鉴定和分选突变体克隆。然后，每个突变体DNA可以进行限制性消化，并通过例如在MutationDetectionEnhancement凝胶(J.T.Baker)上的电泳来进行分析，以证实在序列中没有发生其他改变(通过与未诱变对照的带移比较)。备选地，可以对整个DNA区域进行测序，以证实在靶区域外没有发生另外的突变事件。
pET(或其他)过表达载体中的经验证的突变体双链体可以用于转化大肠杆菌，例如菌株大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，用于高水平产生突变蛋白，和通过标准方案的纯化。FAB-MS作图法可以用于快速检查突变体表达的保真度。这种技术为测序完整蛋白质各处的区段作准备，并提供序列分配中的必需置信度。在这种类型的作图实验中，蛋白质用蛋白酶进行消化(选择将取决于待修饰的具体区域，因为这个区段具有主要意义，和剩余的图应等同于未诱变蛋白质的图)。该组切割片段通过例如微孔HPLC(反相或离子交换，再次取决于待修饰的具体区域)来分级以在每个级分中提供几种肽，和肽分子量通过标准方法例如FAB-MS来测定。随后将每个片段的测定质量与从预测序列的消化中预期的肽分子量进行比较，并快速确定序列的正确性。因为这种对于蛋白质修饰的诱变方法是定向的，所以当MS数据与预测一致时，对于改变的肽进行测序将不是必需的。如果必需验证改变的残基，那么可以使用CAD-串联MS/MS来测序所述混合物的肽，或者取决于修饰的部位，靶肽可以进行纯化以用于消减式Edman降解或羧肽酶Y消化。
在具体的定点诱变的设计中，一般希望首先制备非保守置换，和确定(a)所靶向的CDK或细胞周期蛋白结合活性是否受损和(b)任何未靶向的活性(例如，如果靶向CDK结合区域，那么细胞周期蛋白结合)是否因此极大受损。如果残基通过这种方法被证明对于未靶向的生物活性是重要的，那么可以进行保守置换。
对于CKI核苷酸序列也可以使用其他定点诱变技术。例如，如一般在Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual(第2版，1989ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，NY)的第15.3节中所述，限制性核酸内切酶消化DNA并随后连接可以用于产生CKIs的缺失变体。如Sambrook等人(同上)的第15.3节中所述，类似策略可以用于构建插入变体。最近，Zhu等人(Proc.Natl.Acad.SciUSA96：8768-8773，1999)已设计出了使用嵌合RNA/DNA寡核苷酸在体内将突变靶向至植物基因的方法。
具有超过一个氨基酸置换的突变体多肽可以以几种方法之一来产生。如果所述氨基酸在多肽链中紧密地在一起，那么它们可以使用编码所有所需氨基酸置换的一个寡核苷酸同时进行突变。然而，如果所述氨基酸彼此定位相隔一定距离(例如，由超过10个氨基酸隔开)，那么较难产生编码所有所需变化的单个寡核苷酸。作为替代，可以使用两种备选方法之一。在第一种方法中，对于每个待置换的氨基酸产生分开的寡核苷酸。随后，将所述寡核苷酸同时对单链模板DNA进行退火，和从该模板合成的DNA的第二条链将编码所有所需的氨基酸置换。另一种备选方法包括2轮或更多轮诱变以产生所需突变体。如所述的，第一轮关于单突变体：野生型CKIDNA用于模板，将编码第一个所需氨基酸置换的寡核苷酸与这个模板进行退火，随后产生异双链体DNA分子。第二轮诱变使用在第一轮诱变中产生的突变DNA作为模板。因此，这个模板已包含一个或多个突变。然后，将编码另外所需氨基酸置换的寡核苷酸与这个模板进行退火，且所得到的DNA链现在编码来自第一和第二轮诱变的突变。这种所得到的DNA可以用作第三轮诱变中的模板，等等。
用于指导鉴定合适修饰的一种特别合适的技术包括通过序列比对来比对CKI蛋白。存在许多可以使用的上文讨论的序列比对方法。基于序列的比对程序包括例如Smith-Waterman搜索、Needleman-Wunsch、DoubleAffineSmith-Waterman、框搜索、Gribskov/GCG轮廓(profile)搜索、Gribskov/GCG轮廓扫描、轮廓框搜索、Bucher一般化轮廓、HiddenMarkov模型、Hframe、DoubleFrame、Blast、Psi-Blast、Clustal和GeneWise。(参见，例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1990；Altschul等人，NucleicAcidsRes.25：3389-3402，1997，所述两个参考文献引入作为参考)。
相关CKI多肽的氨基酸序列可以例如在多重序列比对(MSA)中进行比对。(参见，例如，图1)。MSA也可以用于将关于一种或多种CKI多肽已知的结构信息扩展至可能仍未被鉴定的另外CKI多肽(通常扩展至共享基本序列同一性的CKI多肽)。由于不同CKI多肽之间的高度结构同源性，所以MSA可以用作在该比对内在各个位置上的修饰效应的可靠预报器。因此，在KRP家族成员的情况下，例如，图1中所示的CKI序列和编号可以用作关于任何其他KRP家族成员蛋白质序列的MSA参考点。如上所述，用于修饰的特别合适的氨基酸位置包括相应于欧洲油菜KRP1(BnKrp1)的氨基酸位置145、148、149、151、153、155、163、164、165和/或167的那些。使用图1中所示的比对，和/或使用本领域已知的比对程序，例如本文描述的那些，可以使用比对程序的编号系统作为参考点，且可以使该CKI多肽的相关位置与CKIs的其他公认成员或结构同系物和家族中的等价位置相关联。类似方法可以用于比对仍未被测序的CKI多肽的氨基酸序列。
在某些情况下，CKI多肽中与CDK或细胞周期蛋白相互作用的氨基酸可以直接从CKI/CDK或CKI/细胞周期蛋白复合物的三维结构中鉴定。等价的信息可以通过分析相关CKI多肽的CKI/CDK或CKI/细胞周期蛋白复合物来获得。因此，结构比对可以用于产生本发明的变体CKI多肽。存在广泛多样的本领域已知的结构比对程序。参见，例如，来自NCBI网站的VAST；SSAP(Orengo和Taylor，MethodsEnzymol.266：617-635，1996)；SARF2(Alexandrov，ProteinEng.9：727-732，1996)；CE(Shinydyalov和Bourne，ProteinEng.11：739-747，1998)；(Orengo等人，Structure5：1093-108，1997)；Dali(Holm等人，Nucl.AcidRes.26：316-9，1998，所有这些参考文献引入作为参考)。
因此，有用的在CKI/CDK或CKI/细胞周期蛋白界面处的修饰可以使用蛋白质设计或建模算法例如PDATM技术(参见美国专利号6,188,965；6,269,312；和6,403,312，所述专利在此引入作为参考)来进行选择。这类算法一般使用原子水平或氨基酸水平评分函数，以评估氨基酸序列与蛋白质整体三级和四级结构的兼容性。因此，这类算法可以用于选择CDK或细胞周期蛋白结合的修饰和/或破坏，所述修饰和/或破坏基本上不干扰变体CKI蛋白正确折叠并与天然存在的靶相互作用的能力，所述天然存在的靶相应于该蛋白质的非修饰区域。这些技术通常使用靶蛋白的高分辨率结构信息作为输入。在一个实施方案中，经实验测定的合适CKI蛋白的结构用作输入。在备选实施方案中，基于其三维结构已使用结晶法或相关方法测定的家族亚群，MSA可以用于指导关于CKI成员的原子水平同源性模型的构建。在另外一个实施方案中，哺乳动物p27/细胞周期蛋白界面的结构模型可以用于预测关于植物CKI的接触氨基酸残基。
具有经修饰的例如减少的与CDK或细胞周期蛋白的结合的突变体CKI多肽也可以通过大量各种其他方法来进行鉴定，所述方法包括例如，定向进化(例如，易错PCR，DNA改组等)、单位点饱和诱变、和丙氨酸扫描诱变。在KRPCKIs的情况下，例如，使用这些和/或其他方法可以允许鉴定另外的修饰，所述另外的修饰减少CDK结合活性且位于本文所述的CDK结合区域外。
此外，分子动力学计算可以用于通过独个地计算突变体序列得分并汇编成列表来经计算机筛选序列。此外，在计算机筛选期间残基对可能性(residuepairpotentials)可以用于给序列评分(Miyazawa等人，Macromolecules18：534-552，1985，引入本文作为参考)。
备选地，可以制备变体CKI蛋白文库以用于测试。例如，可以使用变体CKI氨基酸序列文库来设计编码变体CKI序列的核酸，并且所述核酸随后可以克隆到宿主细胞内、表达和测定。密码子、合适的表达载体、和合适的宿主细胞的选择通常将依众多因素而变，且可以根据需要容易地进行优化。
在用于筛选突变体文库的一种特别合适的方法中，就显性失活拮抗剂活性和/或如本文所述的其他所需活性进行测试，进行使用合并的寡核苷酸的多重PCR反应。合成相应于全长基因的重叠寡核苷酸。这些寡核苷酸可以代表在每个变体位置或亚群处的所有不同氨基酸。这些寡核苷酸可以以相等比例合并，并且进行多重PCR反应，以形成包含由该文库限定的突变组合的全长序列。此外，这可以使用易错PCR方法来完成。
通常，每个重叠寡核苷酸只包含一个待改变的位置。备选地，变体位置太靠近在一起而不允许使用每寡核苷酸这个和多个变体来允许完全组合所有可能性(即，每个oligo可以包含被突变的单个位置，或超过一个被突变的位置的密码子)。被突变的多个位置在序列中优选是接近的，以阻止oligo核苷酸长度不切实际。为了使寡核苷酸上的多个位置突变，通过包括或排除编码那个组合的寡核苷酸可以在文库中包括或排除特定的突变组合。例如，如本文讨论的，在可变区之间可能存在关联；即，当位置X是某一残基时，位置Y一定(或不一定)是特定残基。这些可变位置组在本文中有时称为“聚类(cluster)”。当聚类由靠近在一起的残基组成，并因此可以位于一个寡核苷酸引物上时，聚类可以被设定为“良好”关联，且消除了可能减少文库效率的不利组合。然而，如果聚类的残基在序列中相隔很远，并因此将位于用于合成的不同寡核苷酸上，那么可能希望将残基设定为“良好”关联，或将它们作为可变残基完全消除。备选地，文库可以在几个步骤中产生，从而使得聚类突变只能一起出现。这个操作程序，即，鉴定突变聚类以及将它们置于同一寡核苷酸上或在保存聚类的几个步骤中将它们从文库或文库产生中清除的操作程序，可以相当大地富集具有经适当折叠的蛋白质的文库。聚类的鉴定可以通过许多方法来进行，例如，使用已知的模式识别方法，突变出现频率的比较，或使用待经实验产生的序列的能量分析(例如，如果相互作用能量很高，那么位置是相关联的)。这些关联可以是位置关联(例如，可变位置1和2总是一起改变或从不一起改变)或序列关联(例如，如果残基A在位置1，那么在位置2上总是残基B)。(参见PatternDiscoveryinBiomolecularData：Tools，Techniques，andApplications；(JasonT.L.Wang，BruceA.Shapiro，DennisShashaeds.，NewYork，OxfordUniversity，1999)；Andrews，IntroductiontoMathematicalTechniquesinPatternRecognition(NewYork，Wiley-lnterscience，1972)；ApplicationsofPatternRecognition(K.S.Fued.，BocaRaton，FL，CRCPress，1982)；GeneticAlgorithmsforPatternRecognition(SankarK.Pal和PaulP.Wangeds.，BocaRaton，FL，CRCPress，1996)；Pandya，PatternRecognitionwithNeuralNetworksinC++(BocaRaton，FL，CRCPress，1996)；HandbookofPatternRecognition&ComputerVision(C.H.Chen，L.F.Pau和P.S.P.Wang，eds.，第2版，Singapore；RiverEdge，N.J.，WorldScientific，c1999)；Friedman，IntroductiontoPatternRecognition：Statistical，Structural，Neural，andFuzzyLogicApproaches(RiverEdge，NJ.，WorldScientific，1999，Seriestitle：Seriesinmachineperceptionandartificialintelligence；第32卷)；所有这些参考文献特别引入作为参考。此外，用于搜索共有基序的程序也可以使用。
具有密码子插入或缺失的寡核苷酸可以用于形成表达不同长度蛋白质的文库。特别地，筛选插入或缺失的计算机序列可以导致产生限定不同长度蛋白质的次级文库，所述文库可以由合并的具有不同长度的寡核苷酸的文库来表达。
在另一个实施方案中，本发明的突变体CKI多肽通过改组家族(例如，突变体组)来形成；即，某些顶部序列组(如果使用按等级分级的列表)可以使用或不使用易错PCR来进行改组。在这种情况下的“改组”意指一般以随机方式进行的相关序列重组。它可以包括如美国专利号5,830,721；5,811,238；5,605,793；5,837,458和PCTUS/19256中定义和示例的“改组”，所有这些专利引入本文作为参考。这组序列也可以是人造组；例如，来自概率表(例如使用SCMF产生的)或MonteCarlo组。类似地，“家族”可以是顶部10个和底部10个序列，顶部100个序列等。这也可以使用易错PCR来完成。
因此，可以使用本文所述的计算机方法来进行在计算机上的改组(例如，从2个文库或2个序列开始，可以产生并评估序列的随机重组)。
可以进行易错PCR以产生变体CKI多肽的文库。参见美国专利号5,605,793，5,811,238和5,830,721，所述专利在此引入作为参考。这可以对文库或某些其他人造组或家族的最佳序列或顶部成员来进行。在这种方法中，可以合成在初级文库的计算机筛选中发现的最佳序列的基因。随后在编码在文库的变体位置上的突变的寡核苷酸(偏向寡核苷酸)存在下对最佳序列基因进行易错PCR。寡核苷酸的添加将形成支持突变掺入文库中的偏向。备选地，只有关于某些突变的寡核苷酸可以用于使文库产生偏向。
在偏向寡核苷酸的存在下，可以用易错PCR对最佳序列的基因来进行基因改组，以形成反映在CKI文库中发现的突变比例的DNA序列文库。偏向寡核苷酸的选择可以以各种方法来完成；它们可以基于其频率来选择，例如，可以使用编码高突变频率位置的寡核苷酸；备选地，可以使用包含最可变位置的寡核苷酸，从而使得多样性增加；如果次级文库进行排序，那么可以使用一定数目的顶部评分位置来产生偏向寡核苷酸；可以选择随机位置；可以选择少数顶部评分和少数低评分位置；等等。重要的是基于优选的可变位置和序列来产生新序列。
在另一种变化形式中，可以采用使用野生型基因或其他基因的PCR。在这个实施方案中，使用起始基因(例如，野生型基因，编码总体优化序列或例如由比对来自不同生物的同源序列而获得的共有序列的基因)。在这个实施方案中，使用相应于变体位置且包含文库的不同氨基酸的寡核苷酸。PCR使用在末端的PCR引物来完成。这提供了两个益处。首先，这一般需要较少的寡核苷酸且可以导致较少的误差。其次，它具有实验优点，因为如果使用野生型基因，那么它不需要被合成。
突变体CKI多肽可以来自任何数目的生物，其中来自植物的CKI多肽是特别优选的。合适的植物包括，例如顺应于转化技术的高等植物种类，包括单子叶和双子叶植物，以及某些低等植物例如藻类。它包括各种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体。在具体实施方案中，植物是欧洲油菜、拟南芥、大豆(Glycinemax)、玉米、稻、小麦、苜蓿、棉花、杨树等。
如上所述，本发明的突变体CKI多肽是野生型CKI多肽的显性失活拮抗剂。在某些实施方案中，突变体CKI多肽只与其相应的细胞周期蛋白或CDK蛋白(即，来自CKI突变体所源自的物种的内源性的、天然存在的CDK或细胞周期蛋白)之一或两者物理地相互作用，从而使得包含突变体CKI的CDK/细胞周期蛋白复合物被保护而不遭受经由野生型CKI蛋白引起的CDK/细胞周期蛋白激酶抑制。
在备选的、非互相排斥的实施方案中，突变体CKI多肽只与异源CDK或细胞周期蛋白(即，来自与CKI突变体所源自的物种不同的物种的天然存在的CDK或细胞周期蛋白)之一或两者物理地相互作用，从而使得包含突变体CKI的异源CDK/细胞周期蛋白复合物被保护而不遭受经由野生型CKI蛋白引起的CDK/细胞周期蛋白激酶抑制，所述野生型CKI蛋白相应于在该复合物内的CDK和细胞周期蛋白(即，通过对于所述CDK和细胞周期蛋白而言内源的野生型CKI蛋白)。
在某些实施方案中，本发明的突变体CKI多肽是对于相应野生型CKI蛋白的高特异性拮抗剂。在备选实施方案中，本发明的突变体CKI多肽是对于超过一种野生型CKI多肽的特异性拮抗剂。例如，突变体拟南芥属植物CKI多肽可以只是野生型拟南芥属植物CKI多肽的特异性拮抗剂，或对于野生型拟南芥属植物、欧洲油菜、大豆、玉米、稻、棉花和/或杨树CKI多肽是特异的。同样地，突变体芸苔属植物CKI多肽可以只是野生型芸苔属植物CKI多肽的特异性拮抗剂，或是野生型拟南芥属植物、欧洲油菜、大豆、玉米、稻、小麦、苜蓿、棉花和/或杨树的特异性拮抗剂。
与野生型CKI多肽相比较，突变体CKI多肽显示出实质上减少的生物活性，包括，例如，修饰的与CDK或细胞周期蛋白之一的结合以及减少的CDK/细胞周期蛋白激酶复合物的抑制。此类减少的生物活性可以使用体内和/或体外测定法进行测试和验证。合适的测定法包括但不限于，CDK/细胞周期蛋白激酶活性测定法；CDK或细胞周期蛋白结合测定法；和细胞增殖测定法。与野生型CKI多肽相比较生物活性的实质减少意指，变体CKI多肽的生物活性为相应野生型CKI多肽的80％或70％，通常60％或50％，更通常40％或30％，且优选20％或10％。
在某些实施方案中，与野生型CKI多肽相比较，突变体CKI多肽包括修饰，除了本文所述的那些(即，与除了用于产生显性失活蛋白质的那些之外，与相应野生型CKI蛋白相比较，突变体CKI蛋白可以包含另外的修饰)。例子包括但不限于，被引入以使得能够在大肠杆菌中进行可溶性表达的氨基酸置换，和被引入以优化溶解行为的氨基酸置换。此外，如本文所述，本文所述的任何突变可以以各种方法组合以形成另外的变体CKI多肽。此外，可以制备比相应的野生型蛋白质更长的突变体CKI多肽，例如，通过添加表位或纯化标记，添加其他融合序列等，或者它们可以更短。
突变体CKI多肽也可以鉴定为由突变体CKI核酸来编码。在核酸的情况下，核酸序列的总体序列同一性与氨基酸序列同一性相称，但要考虑不同生物的遗传密码的简并性和密码子偏爱。因此，核酸序列同一性可以比蛋白质序列同一性更低或更高，其中更低的序列同一性是通常的。
如本领域技术人员将会意识到的，由于遗传密码的简并性，可以制备非常大量的核酸，所有这些核酸都编码本发明的突变体CKI多肽。因此，如果已鉴定了特定氨基酸序列，任何数目的编码突变体蛋白的不同核酸可以通过以不改变突变体CKI多肽的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的顺序来制备。
本发明的突变体CKI多肽和核酸优选是重组的(除非合成制备)。如上所述，突变体通常通过在编码相应CKI蛋白的DNA中的核苷酸的定点诱变来制备，使用盒或PCR诱变或另一种本领域众所周知的技术，以产生编码突变体的DNA，并且此后在重组细胞培养中表达该DNA。氨基酸序列突变体通过预定的突变性质来表征，即将它们远离该突变体CKI蛋白氨基酸序列的天然存在的等位基因或种间变异的特征。如上所述，变体通常显示出相似的CDK或细胞周期蛋白结合(因此，与相应的野生型CKI蛋白相比较，突变体显示出其抑制活性的实质减少；尽管也可以选择具有另外变体特征的变体)。
尽管用于引入氨基酸序列变异的位点或区域是预定的，但突变本身无需是预定的。例如，为了使给定位点上的突变表现进行优化，随机诱变可以在靶密码子或区域上进行，并就所需活性的最佳组合来筛选表达的变体CKI蛋白。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点处制备置换突变的技术是众所周知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。突变体的筛选使用对于最佳特征的突变体CKI蛋白活性测定法来完成。
在某些实施方案中，氨基酸置换是单个残基。在其他实施方案中，多个氨基酸残基被置换(例如，2、3、4或更多个氨基酸可以被置换)。插入片段通常为约1-约20个氨基酸的级别，尽管可以耐受相当更大的插入片段。缺失为约1-约20个残基，或约1-约30个残基，尽管在某些情况下缺失可以大得多。在某些实施方案中，突变体CKI多肽是来源于两个或更多个野生型CKI蛋白的嵌合体，其中具有至少一个如本文所述的在CDK或细胞周期蛋白结合区域中的修饰。
置换、缺失、插入或其任何组合用于达到最终突变体。一般地，修饰就相对少数的氨基酸而言来进行，以使分子改变最小化。然而，在某些情况下，可以耐受较大的变化。
使用编码突变体CKI多肽的本发明核酸，可以制备各种载体。包含复制子和控制序列(来源于与宿主细胞相容的物种)的任何载体可以在本发明的实践中使用。载体可以是自主复制的染色体外载体或整合到宿主基因组内的载体。一般地，表达载体包括与编码突变体CKI多肽的核酸可操作地连接的转录和翻译调节核酸区域。术语“控制序列”指对于在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列而言所需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。转录和翻译调节核酸区域一般将会适合于用于表达该多肽的宿主细胞。
在某些实施方案中，CKI核酸通过使用密码子优化来进行修饰以用于增强在宿主细胞中的基因表达，所述密码子优化涉及用在待表达所述DNA分子的细胞种类中高度使用的翻译密码子(相应于同一氨基酸)替换密码子序列。已就在玉米中表达进行优化的BnKrp1突变体编码序列(BnKrp1F151A；F153A和Y149A；F151A；F153A)的例子显示于图3中。密码子优化操作一般是本领域众所周知的，且可以由本领域技术人员使用来获得依照本发明的其他经密码子优化的突变体Krp1序列。
对于各种宿主细胞，本领域中已知众多类型的合适的表达载体和合适的调节序列。一般而言，转录和翻译调节序列可以包括，例如，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、和增强子或激活子序列。在典型的实施方案中，调节序列包括启动子以及转录起始和终止序列。载体通常还包括包含用于插入外源DNA的几个限制位点的多位点接头区域。使用标准重组DNA操作程序来进行合适载体的构建，所述合适载体包含编码复制序列的DNA、调节序列、表型选择基因、和目的变体CKIDNA。如本领域众所周知的(参见，例如，Maniatis，同上；和Sambrook等人，同上)，分离的质粒、病毒载体和DNA片段被切割、剪切并以特定次序连接在一起，以产生所需载体。
启动子序列编码组成型或诱导型启动子。所述启动子可以是天然存在的启动子或杂合启动子。组合了超过一种启动子的元件的杂合启动子也是本领域已知的，并且在本发明中是有用的。在典型的实施方案中，所述启动子是强启动子，其允许在细胞特别是植物细胞中高表达。特别适合于依照本发明使用的启动子在下文进一步描述。
此外，表达载体可以包含另外元件。例如，表达载体可以具有2个复制系统，从而允许它在2种生物中维持，例如在植物或昆虫细胞中用于表达和在原核宿主中用于克隆和扩增。进一步地，为了整合表达载体，表达载体包含至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，并且优选包含位于该表达构建体侧翼的2个同源序列。通过选择用于包含在载体中的合适同源序列，可以将整合型载体导向宿主细胞中的特定基因座。关于整合型载体的构建是本领域众所周知的。
在某些实施方案中，表达载体包含选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域众所周知的，并且将依所使用的宿主细胞而变。合适的选择基因可以包括，例如编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，这使得用这些载体转化的细胞能够在这些抗生素的存在下生长。
在本发明的一个方面，将突变体CKI核酸引入细胞之内，单独地或与载体一起。“引入......之内”或语法上的等价形式意指，核酸以适合于核酸的后续整合、扩增和/或表达的方式进入细胞。引入方法在很大程度上由所靶向的细胞类型指定。示例性方法包括CaPO4沉淀、脂质体融合、lipofectin、电穿孔、病毒感染等。特别适合于引入植物细胞内的方法是本领域已知的，并且也在下文描述(参见，部分II，“转基因植物”)。此类方法包括例如，用装载有DNA的微粒轰击细胞。突变体CKI核酸可以稳定地整合到宿主细胞的基因组内，或可以瞬时或稳定地存在于细胞质中(例如，通过使用传统质粒，使用标准调节序列、选择标记等)。
原核生物可以用作宿主细胞以用于本发明的起始克隆步骤。它们特别可用于大量DNA的快速生产，用于产生在定点诱变中使用的单链DNA模板，用于同时筛选许多突变体，和用于所产生的突变体的DNA测序。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌K12菌株94(ATCCNo.31，446)、大肠杆菌菌株W3110(ATCCNo.27，325)、大肠杆菌X1776(ATCCNo.31，537)和大肠杆菌B；然而，许多其他大肠杆菌菌株，例如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539，以及原核生物的许多其他种和属，包括杆菌例如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)，其他肠杆菌科例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesans)，和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种都可以用作宿主。具有坚硬细胞壁的原核宿主细胞或其他宿主细胞通常使用如在Sambrook等人(同上)的第1.82节中描述的氯化钙方法进行转化。备选地，电穿孔可以用于转化这些细胞。原核细胞转化技术在下述参考文献中描述，例如，Dower，GeneticEngineering，PrinciplesandMethods12：275-296(PlenumPublishingCorp.，1990)；Hanahan等人，Meth.Enymol.，204：63，1991。通常用于转化大肠杆菌的质粒包括pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCI18、pUC119和BluescriptM13，所有这些质粒在Sambrook等人(同上)的第1.12-1.20节中描述。然而，许多其他合适载体也是可用的。
本发明的突变体CKI多肽通常通过下述来产生：在合适条件下培养用包含编码突变体CKI多肽的核酸的表达载体转化的宿主细胞，以诱导或引起突变体CKI多肽表达。为了调节细胞分裂，CKI蛋白以其正常的细胞内形式表达。对于包括收获或分离突变体CKI多肽的本发明应用，可以将CKI突变体表达为细胞内蛋白质，或备选地，以从宿主细胞中分泌的形式。通常从细胞中分泌的许多真核蛋白质包含内源分泌信号序列作为氨基酸序列的一部分。因此，通过将信号序列与蛋白质连接可以将通常在细胞质中发现的蛋白质靶向至分泌。这通过下述容易地完成：使编码信号序列的DNA与编码蛋白质的DNA的5′末端连接，并随后在合适的宿主细胞中表达这种融合蛋白。编码信号序列的DNA可以作为任何编码具有信号序列的蛋白质的基因的限制性片段而获得。因此，取决于用于实践本发明的宿主细胞类型，可以在本文中使用原核、酵母和真核信号序列。编码几种真核基因的信号序列部分的DNA和氨基酸序列是已知的，所述几种真核基因包括例如人生长激素、胰岛素原和白蛋白原(参见Stryer，Biochemistry(W.H.FreemanandCompany，NewYork，NY，1988，第769页))，并且所述序列可以在合适的真核宿主细胞中用作信号序列。酵母信号序列例如酸性磷酸酶(Arima等人，Nuc.AcidsRes.11：1657，1983)、α-因子、碱性磷酸酶和转化酶可以用于指导从酵母宿主细胞中的分泌。来自编码例如LamB或OmpF(Wong等人，Gene68：193，1988)、MalE、PhoA或β-内酰胺酶的基因以及其他基因的原核信号序列，可以用于将在原核细胞中表达的蛋白质靶向进入培养基内。
对于突变体CKI多肽表达来说适当的条件将依所选表达载体和宿主细胞而变，并且将由本领域技术人员通过常规试验容易地确定。例如，表达载体中组成型启动子的使用将需要优化宿主细胞的生长和增殖，而诱导型启动子的使用需要合适的生长条件以用于诱导。此外，在某些实施方案中，收获的时间选择是重要的。例如，在昆虫细胞表达中使用的杆状病毒系统是裂解性病毒，因此收获时间的选择对于产物得率可以是重要的。
原核载体中最常使用的启动子包括p-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等人，Nature375：615，1978；Itakura等人，Science198：1056，1977；Goeddel等人，Nature281：544，1979)和色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，Nucl.AcidsRes.8：4057，1980；EPO申请公开号36,776)，和碱性磷酸酶系统。尽管这些是最常使用的，但也已利用了其他微生物启动子，并且关于其核苷酸序列的细节已被公开，这使得技术人员能够将它们功能性地连接到质粒载体内(参见，Siebenlist等人，Cell20：269，1980)。
可以在本发明实践中使用的响应性启动子系统的举例说明性例子是玉米中的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)系统。GSTs是可以使许多疏水性亲电子化合物解毒的酶的家族，所述化合物通常用作萌前除草剂(Weigand等人，PlantMolecularBiology7：235-243，1986)。研究已显示，GSTs直接参与引起这种增强的除草剂耐受性。这种作用主要通过特异性1.1kbmRNA转录产物来介导。简言之，玉米具有已存在的天然出现的静止基因，其可以响应外部刺激且可以被诱导以产生基因产物。这种基因先前已进行了鉴定和克隆。因此，在本发明的一个实施方案中，从GST响应型基因中取出该启动子并与突变体CKI编码序列连接。如果突变体CKI基因来源于基因组DNA来源，那么必需在嵌合基因构建期间移去该天然启动子。这种经改造的基因是对外部化学刺激作出响应的启动子和负责成功生产突变体CKI蛋白的基因的组合。
诱导型启动子是能够响应于诱导物而直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因的转录的启动子。在不存在诱导物的情况下，DNA序列或基因将不被转录。通常，与诱导型启动子特异性结合以激活转录的蛋白质因子以无活性形式存在，所述无活性形式随后通过诱导物而直接或间接转变成活性形式。诱导物可以是化学试剂例如蛋白质、代谢产物、生长调节剂、除草剂或酚化合物，或者通过热、冷、盐或有毒元素而直接施加或通过病原体或疾病因子例如病毒的作用而间接施加的生理应激。通过将诱导物外部应用于细胞或植物，例如通过喷雾、浇水、加热或类似方法，可以使包含诱导型启动子的植物细胞暴露于诱导物。如果希望在植物发育期间于特定时间激活靶基因表达，那么可以在那时这样施用诱导物。
此类诱导型启动子的例子包括热休克启动子，例如黑腹果蝇(Drosphiliamelanogaster)的诱导型70KD热休克启动子(Freeling等人，Ann.Rev.ofGenetics19：297-323)；冷诱导型启动子，例如来自欧洲油菜的冷诱导型启动子(White等人，PlantPhysiol.106，1994)；和通过乙醇诱导的乙醇脱氢酶启动子(Nagao等人，SurveysofPlantMolecularandCellBiology第3卷，第384-438页(BJ.Miflined.，OxfordUniversityPress，Oxford，1986)。
组成型启动子是能够直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因在转基因植物所有组织中的转录的启动子。通常，使用组成型启动子例如CaMC的35S启动子(Odell，Nature313：810-812，1985)。在植物中有用的组成型启动子的其他例子包括稻肌动蛋白启动子(Elroy等人，PlantCell2：163-171，1990)、玉米HE组蛋白(Lepetit等人，MolGen.Genet.231：276-285，1992)等。
本发明的CKI转基因可以使用启动子例如BCEA(芸苔油菜(B.campestris)胚)启动子进行表达，所述BCEA启动子已显示在非常早期种子发育中指导高水平表达(即，在油菜籽蛋白启动子之前被转录)。这是在芸苔属植物种子中于贮藏产物积聚之前但具有快速色素生物合成的时期(来源于Johnson-Flanagan等人，J.PlantPhysiol.136：180，1989；Johnson-Flanagan等人，Physiol.Plant81：301，1991)。种子贮藏蛋白启动子也已显示出以种子特异性方式指导高水平表达(Voelker等人，PlantCell1：95，1989；Altenbach等人，PlantMol.Biol.13：513，1989；Lee等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA99：6181，1991；Russell等人，TransgenicRes.6：157-68，1997)。油菜籽蛋白启动子已显示出在转基因芸苔属植物中指导油质蛋白基因表达，从而使得油质蛋白积聚至种子总蛋白的大约1％(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：6181，1991)。在启动子选择中，可能希望使用组织特异性的或受发育调节的启动子，其允许在某些组织中受抑制或过表达而不影响在其他组织中的表达。“组织特异性启动子”指指导主要在特定组织中的基因表达的编码区，所述特定组织例如为根、叶、茎、雌蕊、花药、花瓣、种皮、种子珠心、或表皮层。转录刺激物、增强子或激活物可以整合到组织特异性启动子中，以形成保留了组织特异性并具有高水平活性的启动子。例如，在过表达中使用的启动子将优选是组织特异性的。当尝试在种子贮藏区中过表达时，在错误组织例如叶中的过表达可能是有害的。特别合适的启动子是允许例如种子特异性、根特异性、叶特异性、果实特异性表达等的那些。这可以是特别有用的，因为种子、根、叶和果实是特别感兴趣的。对于不同组织类型特异的某些启动子已经是可用的，或可以通过良好建立的技术(参见，例如，美国专利号：5,792,925；5,783,393；5,859,336；5,866,793；5,898,096；和5,929,302)和如下文进一步描述的进行分离。表1列出了可以用于实践本发明的其他胚特异性启动子。
表1.胚特异型启动子
启动子 胚胎 胚乳 时机 参考文献
来自拟南芥属植 物的油质蛋白 强，均匀 无 在中心痕量，在早 期至晚期子叶阶 段较高 Al等人，Plant Mol. Biol.25： 193-205，1994。
来自蚕豆(Vicia faba)的USP 强，均匀 无 早期未知，晚期子 叶阶段强 Baumlein等人，Mol. Gen.Genet.225： 459-467，1991。
来自蚕豆的豆球 蛋白 在子叶中 强，优先 糊粉层(晚 期) 早期未知，晚期子 叶阶段强 Baumlein等人，同上 1991。
来自芸苔属植物 的油菜籽蛋白 ？ 晚期 Kohno-Murase，Plant Mol.Biol.26： 1115-1124，1994
来自拟南芥属植 物的白蛋白S1 只在胚轴中 无 早期至晚期子叶 阶段 Guerche等人，Plant Cell2：469-478，1990
白蛋白S2 在胚轴和子 叶中 无 早期至晚期子叶 阶段 Guerche等人，同上 1990。
在本发明的具体实施方案中，在未成熟种子的胚植物体的发育期间特别活跃的种子特异性启动子是感兴趣的。在种子发育早期本发明的显性失活突变体的表达可能是希望的，以便增加种子发育早期的细胞分裂。这个阶段时更多的细胞分裂可以导致更大的胚。胚的组成为约33％的油，因此更大的胚将导致油含量增加。适合于在胚中进行本发明表达和在其他植物组织中较低或无表达的启动子是感兴趣的，以增加种子油含量。特别感兴趣的是在早期特异性胚胎发育中起始表达的那些启动子序列。早期特异性启动子是在拟南芥属植物中进行授粉(手杖(walkingstick))后第7天之前或在另一种植物种类中的等价阶段起始蛋白质表达的启动子。特别感兴趣的启动子序列的例子包括氨基酸通透酶基因(AAP1)的启动子(例如，来自拟南芥的AAP1启动子)，油酸12-羟化酶：去饱和酶基因的启动子(例如，来自Lesquerellafendleri的命名为LFAH12的启动子)，2S2白蛋白基因的启动子(例如，来自拟南芥的2S2启动子)，脂肪酸延伸酶基因启动子(FAE1)(例如，来自拟南芥的FAE1启动子)，和叶状子叶基因启动子(leafycotyledongenepromoter，LEC2)(例如，来自拟南芥的LEC2启动子)。AAP1、LFAH12、2S2和FAE1启动子在胚胎发育的最早阶段是无活性的。它们在发育过程中的逐渐后期阶段时变成具有转录活性，从AAP1开始，随后为LFAH12、2S2，最后为FAE。所有4种启动子随后在后期胚胎发育阶段自始至终保持活性。LEC2启动子具有相反的表达特性谱。它在非常早期的胚胎发育中是有活性的，随后它的活性在后期阶段期间逐渐降低。其他感兴趣的胚特异性启动子包括来自下述基因的启动子：Seedstick(Pinvopich等人，Nature424：85-88，2003)、Fbp7和Fbp11(矮牵牛Seedstick)(Colombo等人，PlantCell.9：703-715，1997)、Banyuls(Devic，PlantJ.，19：387-398，1999)、ABI3(Ng等人，Plant.Mol.Biol.54：25-38，2004)、agl-15、Agl18(Lehti-Shiu等人，PlantMol.Biol.58：89-107，2005)、Phel(Kohler，GenesDevelop.17：1540-1553，2003)、emb175(Cushing等人，Planta.221：424-436，2005)、L11(Kwong等人，PlantCell15：5-18，2003)、Lecl(Lotan，Cell93：1195-1205，1998)、Fusca3(Kroj等人，Development130：6065-6073，2003)，TT12(Debeaujon等人，PlantCell13：853-871，2001)、TT16(Nesi等人，PlantCell14：2463-2479，2002)、A-RZf(Zou和Taylor，Gene196：291-295，1997)、TTG1(Walker等人，PlantCell11：1337-1350，1999)、TT1(Sagasser等人，GenesDev.16：138-149，2002)、TT8(Nesi等人，PlantCell12：1863-1878，2000)和Gea-8(胡萝卜)(Lin等人，J.Exp.Botany50：1139-1147，1999)启动子。来自单子叶植物的胚特异性启动子包括球蛋白、Knox(稻)(Postma-Haarsma，PlantMol.Biol.39：257-271，1999)、油质蛋白(Plant，PlantMol.Biol.25：193-205，1994)、Keddie(PlantMol.Biol.24：327-340，1994)、过氧化物氧还酶(Perl)(Haslekas等人，PlantMol.Biol.36：833-845，1998；Haslekas等人，PlantMol.Biol.53：313-326，2003)、来自大麦的HvGAMYB(Diaz等人，PlantJ.29：453-464，2002)和SAD1(Isabel-LaMoneda等人，PlantJ.33：329-340，1999)、和玉米杂合富含脯氨酸的蛋白质启动子(Jose-Estanyol等人，PlantCell4：413-423，1992；Jose-Estanyol等人，Gene356：146-152，2005)。
种子贮藏蛋白的启动子也是特别感兴趣的，因为种子贮藏蛋白可以代表许多植物中高达90％的种子总蛋白。种子贮藏蛋白是受严格调节的，以高度组织特异性和阶段特异性方式几乎专有地在种子中表达(Higgins等人，Ann.Rev.PlantPhysiol.35：191-221，1984；Goldberg等人，Cell56：149-160，1989)。此外，不同种子贮藏蛋白可以在种子发育的不同阶段时进行表达。种子特异性基因的表达已被非常详细地研究(参见Goldberg等人(同上)和Higgins等人(同上)的综述)。种子特异性启动子的例子包括拟南芥属植物和其他植物的LFAH12，以及如在Thomas等人的美国专利5,977,436(整体引入作为参考)中所述的拟南芥属植物油质蛋白基因的5′调节区，当可操作地连接至异源基因的编码序列或者与天然植物基因互补的序列时，所述5′调节区指导所述异源基因或互补序列在植物种子中的表达。
关于双子叶植物的合适的种子贮藏蛋白启动子包括例如，豆β-菜豆蛋白、凝集素和植物凝血素启动子(Sengupta-Gopalan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324，1985；Hoffinan等人，PlantMol.Biol.11：717-729，1988；Voelker等人，EMBOJ.6：3571-3577，1987)；油菜(卡诺拉油菜)油菜籽蛋白启动子(Radke等人，Theor.Appl.Genet.75：685-694，1988)；大豆的大豆球蛋白和伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子(Chen等人，EMBOJ.7：297-302，1988；Nielson等人，PlantCell1：313-328，1989；Harada等人，PlantCell1：415-425，1989；Beachy等人，EMBOJ.4：3047-3053，1985)；大豆凝集素启动子(Okamuro等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：8240-8244，1986)；大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂启动子(Perez-Grau等人，PlantCell1：1095-1109，1989；Jofuku等人，PlantCell1：1079-1093，1989)；马铃薯patatin启动子(Rocha-Sosa等人，EMBOJ.8：23-29，1989)；豌豆的伴豌豆球蛋白、豌豆球蛋白和豆球蛋白启动子(Rerie等人，Mol.Gen.Genet.259：148-157，1991；Newbigin等人，Planta180：461-470，1990；Higgins等人，PlantMol.Biol.11：683-695，1988；Shirsat等人，Mol.Gen.Genetics215：326-331，1989)；和甘薯sporamin启动子(Hattori等人，PlantMol.Biol.14：595-604，1990)。
对于单子叶植物，在本发明实践中有用的种子贮藏蛋白启动子包括例如玉米的玉米醇溶蛋白启动子(Schernthaner等人，EMBOJ.7：1249-1255，1988；Hoffman等人，EMBOJ.6：3213-3221，1987(玉米15kD玉米醇溶蛋白))；玉米18kD油质蛋白启动子(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888：6181-6185，1991)；waxy启动子；shrunken-1启动子；球蛋白1启动子；shrunken-2启动子；稻的谷蛋白启动子；大麦的大麦醇溶蛋白启动子(Marris等人，PlantMol.Biol.10：359-366，1988)；RP5(Su等人，J.PlantPhysiol.158：247-254，2001)；EBE1和2玉米启动子(Magnard等人，PlantMol.Biol.53：821-836，2003)以及小麦的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白启动子(美国专利号5,650,558；Colot等人，EMBOJ.6：3559-3564，1987)。
同样适合于实践本发明的是关于欧洲油菜异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶的基因的启动子(Comai等人，PlantCell1：293-300，1989)；来自红花(Thompson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：2578-2582，1991)和蓖麻(Shanklin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：2510-2514，1991)的δ-9去饱和酶；来自拟南芥属植物(Post-Beittenmiller等人，Nucl.AcidsRes.17：1777，1989)、欧洲油菜(Safford等人，Eur.J.Biochem.174：287-295，1988)和芸苔油菜(Rose等人，Nucl.AcidsRes.15：7197，1987)的酰基载体蛋白(ACP)；来自大麦的β-酮脂酰-ACP合成酶(Siggaard-Andersen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：4114-4118，1991)；和来自玉米(Zeamays)(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：6181-6185，1991)、大豆(Genbank登录号X60773)和欧洲油菜(Lee等人，PlantPhysiol.96：1395-1397，1991)的油质蛋白。
在本发明实践中有用的其他启动子是本领域技术人员已知的。此外，已知方法可以用于分离适合于依照本发明进行使用的另外启动子。例如，差异筛选技术可以用于分离在特定(发育)时刻，例如在果实发育期间表达的启动子。
在嵌合基因构建体中与异源编码序列可操作地连接的种子特异性基因的启动子还在转基因植物中维持其时间和空间的表达模式。此类例子包括使用拟南芥2S种子贮藏蛋白基因启动子以在拟南芥属植物和欧洲油菜种子中表达脑啡肽(Vandekerckhove等人，Bio/Technology7：929-932，1989)，使用豆的凝集素和豆的β-菜豆蛋白启动子以表达萤光素酶(Riggs等人，PlantSci.63：47-57，1989)，和使用小麦的麦谷蛋白启动子以表达氯霉素乙酰转移酶(Colot等人，同上)。
获得本发明核酸片段的合适表达水平可能需要利用不同启动子的不同嵌合基因的使用。此类嵌合基因可以在单个表达载体中一起或使用超过一种载体顺次转移到宿主植物中。
此外，增强子通常是需要的或有帮助的以增加本发明基因的表达。必需的是，这些元件与编码所需蛋白质的序列可操作地连接，并且调节元件是可操作的。增强子或增强子样元件可以是天然或嵌合的核酸片段。这将包括病毒增强子，例如在35S启动子中发现的那种(Odell等人，PlantMol.Biol.10：263-272，1988)，来自冠瘿碱基因的增强子(Fromm等人，PlantCell1：977-984，1989)，或当置于与本发明核酸片段可操作地连接的启动子内时导致转录增加的来自任何其他来源的增强子。例如，构建体可以包括与烟草蚀纹病毒(TEV)5′非翻译前导序列连接的、具有双重转录增强子的CaMV35S启动子。TEV前导序列充当翻译增强子以增加制备的蛋白质的量。
合适的启动子元件例如本文所述的那些，可以根据良好建立的操作程序与突变体CKI核酸序列和合适的终止子(多腺苷酸化区域)融合。
转基因植物
在本发明的另一个方面，提供了包含突变体CKI转基因的转基因植物。表达突变体CKI多肽的转基因植物可以例如通过将编码突变体多肽的转基因载体(例如，质粒或病毒载体)转移到植物中来获得。通常，当载体是质粒时，载体还包括选择标记基因例如，编码针对卡那霉素的抗性的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因。最常用的植物转化方法通过如下来进行：将靶转基因克隆到植物转化载体内，随后将所述植物转化载体转化到包含辅助Ti质粒的根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumifaciens)中，如Hoeckema等人(Nature303：179-181，1983)中所述。如An等人(PlantPhysiology81：301-305，1986)所述，将包含转基因载体的土壤杆菌细胞与待转化植物的叶切片一起温育。(还参见Hooykaas，PlantMol.Biol.13：327-336，1989)。如上所述，培养的植物宿主细胞的转化通常通过根瘤土壤杆菌来完成。无坚硬细胞膜屏障的宿主细胞的培养物通常使用磷酸钙法来转化，所述磷酸钙法由Graham等人(Virology52：546，1978)最初描述并如Sambrook等人(同上)的第16.32-16.37节中所述进行修饰。然而，也可以使用用于将DNA引入细胞内的其他方法，例如Polybrene(Kawai等人，Mol.Cell.Biol4：1172，1984)、原生质体融合(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：2163，1980)、电穿孔(Neumann等人，1982EMBOJ.1：841，1982)、和直接显微注射到核内(Capecchi，Cell22：479，1980)。转化的植物愈伤组织可以通过使细胞在培养基上生长而经由选择标记进行选择，所述培养基包含例如卡那霉素和合适量的植物激素例如萘乙酸和苄基腺嘌呤以用于愈伤组织和芽诱导。然后，可以使用本领域技术人员众所周知的技术来使植物细胞再生并将所得到的植物转移至土壤。
除了上述方法，本领域已知大量用于将克隆的DNA转移到广泛多样的植物种类中的方法，所述植物种类包括裸子植物、被子植物、单子叶植物和双子叶植物(参见，例如，MethodsinPlantMolecularBiology(Glick和Thompsoneds.，CRCPress，BocaRaton，FL，1993)；Vasil，PlantMol.Biol.25：925-937，1994；和Komari等人，CurrentOpinionsPlantBiol.1：161-165，1998(一般综述)；Loopstra等人，PlantMol.Biol.15：1-9，1990；和Brasileiro等人，PlantMol.Biol.17：441-452，1991(树的转化)；Eimert等人，PlantMol.Biol.19：485-490，1992(芸苔属植物的转化)；Hiei等人，PlantJ.6：271-282，1994；Hiei等人，PlantMol.Biol.35：205-218，1997；Chan等人，PlantMol.Biol.22：491-506，1993；美国专利号5,516,668和5,824,857(稻的转化)；和美国专利号5,955,362(小麦的转化)；5,969,213(单子叶植物的转化)；5,780,798(玉米的转化)；5,959,179和5,914,451(大豆的转化)。代表性例子包括电穿孔促进的经由原生质体的DNA摄取(Rhodes等人，Science240：204-207，1988；Bates，MethodsMol.Biol.111：359-366，1999；D′Halluin等人，MethodsMol.Biol.111：367-373，1999；美国专利号5,914,451)；用聚乙二醇处理原生质体(Lyznik等人，PlantMolecularBiology13：151-161，1989；Datta等人，MethodsMol.Biol.，111：335-334，1999)；和用装载有DNA的微粒轰击细胞(Klein等人，PlantPhysiol.91：440-444，1989；Boynton等人，Science240：1534-1538，1988；Register等人，PlantMol.Biol.25：951-961，1994；Barcelo等人，PlantJ.5：583-592，1994；Vasil等人，MethodsMol.Biol.111：349-358，1999；Christou，PlantMol.Miol.35：197-203，1997；Finer等人，Curr.Top.MicrobiolImmunol.240：59-80，1999)。此外，植物转化策略和技术在Birch，AnnRevPlantPhysPlantMolBiol48：297，1997；Forester等人，Exp.Agric.33：15-33，1997中进行了综述。较少变化就可以使得这些技术可应用于广泛的植物种类。
在单子叶植物转化的情况下，粒子轰击通常是所选择的方法。然而，单子叶植物例如玉米也可以通过使用如在Hiei等人的美国专利5,591,616中所述的土壤杆菌转化方法来转化。实施单子叶植物例如玉米的转化的另一种方法将来自胚胎发生悬浮培养的细胞与纤维(5％w/v，SilarSC-9须晶)和质粒DNA(1μg/ul)悬浮液混合，所述混合物随后垂直放置在VortexGenieII涡旋混合器(ScientificIndustries，Inc.，Bohemia，NY，USA)上的多样品头中或水平放置在Mixomat牙科汞齐混合器(DegussaCanadaLtd.，Burlington，Ontario，Canada)的支架中。随后通过以全速混合60秒(例如用VortexGenieII)或以固定速度摇动1秒(Mixomat)来进行转化。这个过程导致产生可以从中选择出稳定转化体的细胞群体。植物由经稳定转化的愈伤组织中再生，并且这些植物及其后代可以通过Southern杂交分析而显示为转基因的。该方法的主要优点是其简单性和低成本。与粒子轰击不同，不需要昂贵设备和物资。须晶用于转化植物细胞特别是玉米的用途在例如Coffee等人的美国专利5,464,765中描述。
Dan等人的美国专利5,968,830描述了转化和再生大豆的方法。Hall等人的美国专利5,969,215描述了用于产生转化的甜菜(Betavulgaris)植物例如糖用甜菜的转化技术。
上述转化技术中的每一种都具有优点和缺点。在每种技术中，来自质粒的DNA是经遗传改造的，从而使得它不仅包含目的基因，而且还包含可选择和可筛选的标记基因。可选择的标记基因用于只选择出具有质粒的整合拷贝的那些细胞(构建是这样的，即使得目的基因以及可选择和可筛选的基因作为一个单元进行转移)。可筛选的基因提供了关于只成功培养携带目的基因的那些细胞的另一种检查。
使用抗生素抗性选择标记的传统土壤杆菌转化是有问题的，因为此类植物具有对动物和人散布抗生素耐受性的过度危险而遭到公众反对。此类抗生素标记可以通过使用类似于Komari等人的美国专利5,731,179中描述的那些的土壤杆菌技术转化植物来从植物中消除。通过使用bar或pat编码序列也可以有效避免抗生素抗性问题，例如如美国专利号5,712,135中所描述的。这些优选的标记DNAs编码第二种蛋白质或多肽，其抑制或中和谷氨酰胺合成酶抑制剂除草剂膦丝菌素(草铵膦)和草铵膦铵盐(Basta，Ignite)的作用。
通过任何前述技术将包含这些基因中的一种或多种的质粒引入植物原生质体或愈伤组织细胞内。如果标记基因是可选择的基因，那么只有已掺入了DNA包装的那些细胞才能在用合适的植物毒性试剂进行的选择下存活。一旦鉴定并繁殖合适的细胞，就再生出植物。来自转化的植物的后代必须进行测试，以确保DNA包装已成功整合到植物基因组内。
存在许多影响成功转化的因素。外源基因构建体及其调节元件的设计和构建影响外源序列整合到植物细胞核的染色体DNA内、和转基因被细胞表达的能力。用于以非致死方式将外源基因构建体引入植物细胞核内的合适方法是必需的。重要的是，如果将回收整个植物，那么构建体所引入其内的细胞类型必须是顺应于再生的类型，考虑到合适的再生方案。
使用方法
依照本发明的另一个方面，植物细胞中的细胞分裂被调节例如增加。顺应于使用本文所述方法来调节例如增加细胞分裂的植物细胞，是表达野生型CKI多肽的植物细胞，所述野生型CKI多肽具有分开的细胞周期蛋白和CDK结合区域。一般地，所述方法包括在植物细胞内表达如本文所述的突变体CKI多肽，并允许所述突变体CKI多肽抑制植物细胞内的野生型CKI生物活性。突变体CKI多肽从编码突变体蛋白的重组核酸中表达。进一步地，在某些实施方案中，该方法进一步包括将编码突变体CKI多肽的重组核酸引入植物细胞内。编码突变体CKI多肽的重组核酸，包括此类重组分子的构建及其引入植物细胞内，一般同前所述，且在下文实施例中进一步例示说明。细胞分裂的调节可以在体内于植物细胞中进行，例如上文就转基因植物方面所述的。备选地，该方法可以在体外于植物细胞中进行。
如上所述，相对于参考CKI多肽，突变体CKI多肽包括具有至少一个修饰的CKI氨基酸序列。关于用于调节细胞分裂的方法，参考CKI多肽可以是在植物细胞内表达的野生型植物CKI多肽(通常为内源性野生型CKI)，在所述植物细胞中将进行细胞分裂的调节。备选地，因为使用如本文所述的突变体CKI蛋白可以允许获得针对突变体所衍生自的野生型CKI的结构同系物或家族成员的显性失活拮抗剂活性，所以参考CKI多肽可以是与在所述植物细胞中表达的野生型CKI多肽异源且能够提供基本上等价的野生型功能的野生型CKI多肽。因此，在某些情况下，不从内源性CKI蛋白衍生的突变体CKI蛋白在植物细胞内表达，以抑制内源性野生型CKI功能(例如，来源于拟南芥野生型KRP蛋白的突变体CKI多肽可以用于抑制非异源植物细胞例如欧洲油菜、大豆、玉米细胞等中的野生型KRP功能)。还可以使用来源于其他植物例如欧洲油菜等的其他异源突变体CKI多肽。
进一步地，在该方法的某些实施方案中，使用本发明的突变体CKI在植物细胞内同时抑制多个相关CKIs。例如，在某些实施方案中，同时抑制家族(例如，KRP家族成员)内的所有内源性CKIs。如上所述，如本文所述的突变体CKI蛋白允许在突变体所衍生自的野生型CKI的结构同系物或家族成员的范围内获得显性失活拮抗剂活性，从而允许多个同系物或家族成员的此类同时抑制。因此，在典型的实施方案中，在所靶向的CDK或细胞周期蛋白结合区域内具有基本序列同一性或相似性的多个(和优选地所有)CKIs在植物细胞内被抑制。例如，在某些实施方案中，因为KRP家族成员在主要负责抑制细胞周期蛋白-CDK激酶活性的CDK结合区域内共享基本序列同一性，所以植物细胞内的多个且优选地所有内源性KRP家族成员经由突变体KRPCKI的表达而被抑制，以便调节细胞分裂。
如上所述，通过有效阻断内源性CKI蛋白抑制细胞周期蛋白/CDK活性，植物细胞内的细胞分裂得到调节。此类调节包括加速通过细胞周期的进展，和最终增加细胞增殖。因此，在体内(例如，转基因植物，参见前文)使用本文所述方法，可以达到作物产量和/或种子大小增加、植物活力增加、根群增加、果实大小增加等。
作物产量增加其本身可以以各种形式表现，这取决于特定植物组织和植物种类，其中植物细胞周期已通过阻断内源性CKI蛋白质抑制细胞周期蛋白/CDK活性而被调节。
在种子作物例如玉米、稻、小麦、大麦、大豆、卡诺拉油菜中，产量增加可以采取种子总数目增加、种子大小增加、或种子数目和种子大小均增加的形式。在一个实施方案中，通过如此来在任何种子作物的转基因变种中获得产量增加：表达编码突变体CKI蛋白的转基因，导致细胞分裂增加和种子总数目增加、种子变大、或种子数目和种子大小均增加。在一个实施方案中，突变体CKI蛋白转基因的表达受组成型启动子的控制。在另一个示例性实施方案中，突变体CKI蛋白转基因的表达受种子特异性启动子的控制，所述种子特异性启动子使突变体CKI蛋白的效应靶向种子，所述种子是种子作物的农艺学上重要的组分。
对于其中所需产物是油的油料种子作物，例如大豆、卡诺拉油菜、亚麻荠、亚麻、玉米、红花或向日葵等，产量增加采取更大的油产量/植物的形式。油来源于种子中的胚。在一个实施方案中，通过如此来在任何油料种子作物的转基因变种中获得油产量增加：表达编码突变体CKI蛋白的转基因，引起细胞分裂增加，导致种子总数目增加、胚胎大小增加、或种子数目和胚胎大小均增加。种子总数目/植物增加导致油总产量/植物增加。胚胎大小增加导致更多的油含量/种子和增加的油总产量/植物。在一个优选实施方案中，突变体CKI蛋白转基因的表达受胚特异性启动子的控制，所述胚特异性启动子在早期胚胎发育中产生细胞分裂增加，导致更大的胚、增加的油量/种子、和油总产量/植物的相应增加。
非种子生物量生产是作物例如苜蓿、莴苣、烟草、桉树和杨树的主要产量组分。此类作物中的产量增加将在总体植物生长增加中看到，导致生物量积聚增加。在一个实施方案中，通过如此来在任何生物量作物的转基因变种中获得生物量增加：表达编码突变体CKI蛋白的转基因，引起细胞分裂增加，导致生长和生物量增加。在一个实施方案中，突变体CKI蛋白转基因的表达受启动子的控制，所述启动子产生编码突变体CKI蛋白的转基因在植物的大多数或所有组织中的组成型表达。在一个优选实施方案中，突变体CKI蛋白转基因的表达受组织特异性启动子的控制，所述组织特异性启动子使转基因的表达靶向植物的农艺学上重要的组分，例如莴苣或烟草中的叶或者桉树或杨树中的树干，以增加靶组织中的生物量积聚。
糖或纤维素是生长用于乙醇生产的作物的主要产量组分，包括甘蔗、糖用甜菜、玉米和柳枝稷。在一个实施方案中，通过如此来在任何产糖作物例如甘蔗和糖用甜菜的转基因变种中获得糖增加：表达编码突变体CKI蛋白的转基因，引起细胞分裂增加、植物的糖积聚组织的生长增加、和糖总含量/植物增加。在一个实施方案中，产糖作物中突变体CKI蛋白转基因的表达受启动子的控制，所述启动子产生编码突变体CKI蛋白的转基因在植物的大多数或所有组织中的组成型表达。在一个优选实施方案中，突变体CKI蛋白转基因的表达受组织特异性启动子的控制，所述组织特异性启动子使转基因的表达靶向植物的糖积聚组织，例如甘蔗中的茎或糖用甜菜中的根，从而增加细胞增殖以及植物的糖贮藏和积聚组织的生长，导致总糖含量增加。在另一个实施方案中，通过如此来在任何产纤维素作物例如玉米或柳枝稷的转基因变种中获得纤维素增加：表达编码突变体CKI蛋白的转基因，引起细胞分裂和细胞壁合成增加，从而增加作为细胞壁组分的纤维素的含量。在一个实施方案中，突变体CKI蛋白转基因的表达受启动子的控制，所述启动子产生编码突变体CKI蛋白的转基因在植物的大多数或所有组织中的组成型表达。随之发生的细胞增殖的总体增加导致细胞壁沉积增加，并因此导致植物的纤维素总含量增加。
实施例
提供下述实施例以举例说明而不是限制所要求保护的发明。
实施例1.活性细胞周期蛋白：CDK复合物的产生/纯化以及Krp分子的产生/纯化。
昆虫细胞和培养基
杆状病毒表达系统是用于异源基因表达的通用真核系统。这个系统提供正确的蛋白质折叠、二硫键形成和其他重要的翻译后修饰。所有方法来自Baculovirusexpressionvectorsystem：Proceduresandmethodsmanual.(BDBiosciences，Pharmingen，SanDiego，CA.第6版)。Sf9昆虫细胞在TNM-FH昆虫细胞培养基(BDBiosciences)中于27℃生长以用于所报道的研究。应当指出，备选培养基是技术人员众所周知并且也是有用的。类似地，备选昆虫细胞系例如Sf21和HighFiveTM细胞也用于病毒生产和蛋白质生产。
Western印迹和免疫沉淀
昆虫细胞中表达的重组蛋白质通过Western印迹来监控。将蛋白质提取物(35μg)在Laemmli缓冲液存在下煮沸，在10％或12％SDS-PAGE凝胶上走样，并使用浸没的转移装置(BioRad)转移至PVDF膜。转移后，将膜在包含5％脱脂奶粉的TBS-T(25mMTrispH7.5；75mMNaCl；0.05％Tween)中封闭。一抗在TBS-T封闭缓冲液中以1∶1000的稀释度过夜使用。印迹于室温洗涤3次，15分钟。与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的合适的二抗在TBS-T封闭缓冲液中以1∶10,000的稀释度使用。印迹在二抗中温育1小时，随后在TBS-T中洗涤3次，各15分钟。然后，印迹如ECL系统方案(AmershamBiosciences)中所述进行处理。常用的抗体是：抗-flagM2单克隆抗体(Sigma)、抗HA单克隆或多克隆抗体(Babco)、抗PSTAIR抗体(Sigma-Aldrich)、抗myc单克隆或多克隆(A-14)(SantaCruzBiotechnology)。使用的二抗是抗小鼠IG-HRP和抗兔IG-HRP(GEHealthcare)。
常规地进行免疫沉淀以监控AtCyclinD2；1、AtCDKA和Krp分子之间的复合物形成。蛋白质提取物(14μg)在0.5ml结合缓冲液(100mM磷酸钠缓冲液pH7.0，150mMNaCl，1％Triton100加蛋白酶抑制剂)中进行稀释。蛋白质/抗体混合物于4℃轻轻摇动约2小时，随后加入合适的抗体。(2μg抗flagM2抗体；5μl抗HA抗体；5μl抗myc多克隆)。加入A蛋白sepharose至得到10μl柱床体积。将免疫沉淀物于4℃轻轻混合1小时，随后用1ml结合缓冲液洗涤3次。然后，将与A蛋白sepharose结合的蛋白质复合物在Laemmli缓冲液存在下煮沸。将蛋白复合物在10％或12％SDS-PAGE凝胶上进行解析，并转移至PVDF膜。膜如上所述进行印迹法。
杆状病毒载体构建
拟南芥属植物细胞周期蛋白D2；1(AtcyclinD2；1)和拟南芥属植物CDKA(AtCDKA)cDNA序列经用表位加上标签，并克隆到杆状病毒转移载体(BDBiosciences)内。也可以使用技术人员已知的其他转移载体系统。AtCyclinD2；1通过PCR添加MetAspTyrLysAlaPheAspAsnLeu(MDYKAFDNL)氨基酸序列(SEQIDNo.：18)而在N-末端上用FLAG表位(Sigma-Aldrich)加上标签，随后克隆到pAcHLT转移载体(BDBiosciences)内。其他杆状病毒转移载体系统例如Baculodirect(Invitrogen)也可以用于这个目的。血凝素(HA)表位氨基酸序列TyrProTyrAspValProAspTyrAla(YPYDVPDYA；SEQIDNO：19)通过PCR相对于AtCDKA的5′末端按阅读框放置，随后克隆到pVL1393转移载体(ABVector，CA)内。细胞周期蛋白和CDK经用表位加上标签以使得能够通过Western印迹进行鉴定和用于免疫沉淀实验。也可以使用缺乏标签的细胞周期蛋白或CDK。也可以使用其他相容的转移载体系统。
重组病毒产生
使用的杆状病毒基因组是BaculogoldBrightBaculovirus(BDBiosciences)。也可以使用备选的杆状病毒基因组。使用同源重组将具有Flag标签的形式的AtcyclinD2；1引入杆状病毒病毒基因组的非必需区内。当包含细胞周期蛋白D2；1的转移载体与线性化BDBaculogoldBrightBaculovirusDNA一起共转染到Sf9昆虫细胞内时，发生同源重组。Sf9细胞以2×106细胞接种在60mm皿上，且使用Fugene6转染试剂根据制造商的方案(RocheDiagnostics)，与2μg细胞周期蛋白D2；1转移载体(pAcHLT-cyclinD2；1)加0.5g线性化BDBaculogoldBrightBaculovirusDNA一起瞬时共转染。转染4小时后，去除Fugene/DNA溶液并用3mlTNM-FH培养基替换。4天后，收集上清液，随后用于感染更多细胞以用于病毒扩增。重复这种扩增直至病毒滴度为至少109病毒颗粒/ml。病毒通过以＜1的感染复数(moi)感染Sf9细胞来进行扩增。病毒滴度使用光和荧光显微术进行监控。
使用同源重组将具有HA标签的形式的AtCDKA1引入杆状病毒病毒基因组的非必需区内。当包含细胞周期蛋白D2；1的转移载体与线性化BDBaculogoldBrightBaculovirusDNA一起共转染到Sf9昆虫细胞内时，发生同源重组。Sf9细胞以2×106细胞接种在60mm皿上，且使用Fugene6转染试剂根据制造商的方案(RocheDiagnostics)，与2μgAtCDKA转移载体(pVL1393-AtCDKA)加0.5μg线性化BDBaculogoldBrightBaculovirusDNA一起瞬时共转染。转染4小时后，去除Fugene/DNA溶液并用3mlTNM-FH培养基替换。4天后，收集上清液，随后用于感染更多细胞以用于病毒扩增。重复这种扩增直至病毒滴度为至少109病毒颗粒/ml。病毒通过以＜1的感染复数(MOI)感染Sf9细胞来进行扩增。病毒滴度使用光和荧光显微术进行监控。
在昆虫细胞中的重组蛋白质生产
具有Flag标签的AtcyclinD2；1蛋白的产生：具有标签的AtcyclinD2；1通过用AtcyclinD2；1杆状病毒感染草地夜蛾(S.frugiperda)Sf9细胞来获得。为此，将以2×106/ml在悬浮液中生长的Sf9细胞用重组杆状病毒MOI＞5(但其他更高或略微更低的MOIs也将起作用)感染约4-5天，随后收获。收集细胞并于4℃在3000rpm下离心。细胞粒状沉淀用新鲜培养基洗涤，随后于4℃在3000rpm下离心。将粒状沉淀冷冻于-80℃或立即裂解。裂解缓冲液由下述组成：20mMHepespH7.5、20mMNaCl、1mMEDTA、20％甘油、20mMMgCl2加蛋白酶抑制剂(CompleteMini，无EDTA，BoehringerMannheim)，1片/10ml裂解缓冲液。细胞裂解物在冰上超声处理2次，15秒。蛋白质裂解物随后在BeckmanTLA100.2旋转器中在40,000rpm下离心2小时。包含具有标签的AtCyclinD2；1的上清液进行等分且冷冻于-20℃。使用抗FlagM2单克隆抗体(Sigma-Aldrich)通过Western印迹来监控表达。
具有标签的AtCDKA的产生通过用AtCDKA杆状病毒感染草地夜蛾Sf9细胞来完成，且以与上文所述相同的方式进行处理。使用抗HA单克隆或多克隆抗体(Babco)通过Western印迹来监控表达。还可以使用抗PSTAIR抗体(Sigma-Aldrich)通过Western印迹来监控表达。
AtcyclinD2；1/AtCDKA的活性激酶复合物通过用AtcyclinD2；1(MOI＞5)加AtCDKA(MOI＞5)杆状病毒共感染草地夜蛾Sf9细胞来制备。活性复合物如上所述进行纯化。蛋白质表达通过使用抗FlagM2抗体或抗HA抗体进行昆虫细胞提取物的Western印迹来监控。AtcyclinD2；1和AtCDKA的相互作用如下所述通过共免疫沉淀来进行监控。
激酶测定法
开发了体外测定法以测试各种KRP/ICK分子抑制细胞周期蛋白/CDK复合物的能力。
来自昆虫细胞的蛋白质提取物中的激酶活性用标准激酶测定法进行监控，所述昆虫细胞用单一杆状病毒感染或用2种杆状病毒共感染。组蛋白HI(HHI)是使用的主要底物，但重组烟草成视网膜细胞瘤蛋白(NtRb)也可以用作底物(参见Koroleva等人，PlantCell16，2346-79，2004)。激酶测定法如下进行：将7μg昆虫细胞蛋白质提取物加入激酶缓冲液混合物(KAB：50mMTrispH8.0、10mMMgCl2、10μMATP加0.5μCi/ml32PγATP和2μgHHI)中至30μl终体积。反应体系于27℃温育30分钟。激酶反应用相等体积(30μl)的2×Laemmli缓冲液来终止。通过在12％凝胶上的SDS-PAGE后进行放射自显影术和/或MolecularDynamicsPhosphorlmager来监控[32P]磷酸盐掺入。用于执行CDK激酶测定法的备选缓冲条件也可以使用。(参见，例如，Wang和Fowke，Nature386：451-452，1997；Azzi等人，Eur.J.Biochem.203：353-360，1992；Firpo等人，Mol.Cell.Biol.14：4889-4901，1994)。
结果：使用HHI作为底物，来自用AtcyclinD2；1单独地或用AtCDKA单独地感染的昆虫细胞的蛋白质提取物没有显示出激酶活性。用AtcyclinD2；1病毒和AtCDKA病毒共感染的昆虫细胞包含强激酶活性。也可以通过使用p13sucl琼脂糖珠从植物蛋白质组织提取物，或从植物组织培养细胞提取物中纯化出活性CDK样(cdc2样)激酶(参见Wang和Fowke，Nature386：451-452，1997；Azzi等人，Eur.J.Biochem.203：353-360，1992)，且在上文所述类似的测定法以及下文实施例2至实施例8中所述的竞争实验中使用。
将KrpcDNAs克隆到细菌表达载体中
AtKrp1克隆
使用下述寡核苷酸通过PCR从拟南芥属植物cDNA中克隆AtKrp1cDNA：
(开始)5′-ATGGTGAGAAAATATAGAAAAGCT-3′(SEQIDNO：20)；
(结束)5′-TCACTCTAACTTTACCCATTCGTA-3′(SEQIDNO：21)
将所得到的PCR片段亚克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)内。对所得到的载体AtKrp1#359进行测序以验证对于GenBank#U94772的正确序列。
欧洲油菜Krp1克隆的5′RACE
在国家生物技术信息中心网站上使用Blastn，以找到与AtKRP1cds同源的芸苔属植物序列。搜索产生2个EST候选物，CD820320和CD829052，它们被证实是相同的序列。CD820320通过Jorja’sblastx获取，以验证经翻译的EST核苷酸序列明显匹配AtKRP1蛋白质序列。
CD829052是646bp，且包括甘蓝(Brassicaoleracea)KRP1序列的最后106个氨基酸和3′UTR的321bp。设计5′RACE引物(GSP1brasskrp1-5′RACE：5′-CTCTGATAATTTAACCCACTCGTAGCGTCCTTCTAATGGCTTCTC-3′；SEQIDNO：22)以寻找全长BnKRP1。该RACE引物包含CD820320编码序列的最后45个核苷酸。
使用SMARTRACEcDNAAmplifictionKit(Clontech)从欧洲油菜DH12075叶中制备5′RACE-现成cDNA。根据试剂盒说明书对该cDNA进行5′RACE，除了使用pfu酶和缓冲液(Stratagene)代替Klentaq。PCR条件是：于94℃最初变性5分钟，随后为94℃5秒、68℃10秒、72℃3分钟的35个循环。所得到的PCR产物是约600bp非常黯淡的条带。然后，将2.5μl这种PCR产物使用上述PCR条件再次扩增。将所得到的PCR产物克隆到TOPOBlunt载体(Invitrogen)中，并转化到α金细胞(alphagoldcells)(Bioline)中。从2个转化体中回收质粒DNA，并用M13正向和反向引物对插入片段进行测序。一种候选插入片段的序列等同于CD820320，并命名为BnKRP1-II(无来自RACE的另外的新序列)。命名为BnKRP1-I的另一种候选插入片段的序列在核苷酸水平上在编码区中与BnKRP1-II具有94％同一性，和在氨基酸水平上对于最后106个残基具有86％同一性。RACE寻找到了BnKRP1-I的完全编码序列，具有另外的在TOPOBlunt载体(pTG313)中5′UTR的108bp。下文显示了BnKrp1编码序列(SEQIDNO：23)：
1atggtgagaaaatgcagaaaaactaaagggacggtgggagcttcgtctacgtatatgcagcttcgcagccggagaatcgt80
81ttacagatcggaaaaagctagctcgtcgtcgtcgtcttgttgcgcgagtaacaacaatggagttatagatcttgaggagg160
161aaagagatggtgagactgaaacgtcgtcgtgtcgacggagtagtaagaggaagctatttgaaaaccttagagaaaaagaa240
241tctatggagaattcacagcaaatcgtagctggttttgattccgccgtgaaagaatcatcggattgttgttgcagccggag320
321aacatctttgtcaacgacggaggagaaggggaaatcagcgacggagcaaccaccaacggcagtggagattgaagattttt400
401tcgtggaagctgagaaacagctccatgataatttcaagaagaagtataactttgatttcgaaaaggagaagccattagaa480
481ggacgctacgagtgggttaaattatcagagtaa513
pET16b细菌表达载体包含编码连续6个组氨酸(6×His，或(His)6或hexaHis)的序列，以使得能够通过固定化的金属亲和层析(Novagen)来进行蛋白质纯化。这种载体以这样的方式进行修饰，即使得还在6×His编码序列紧下游和按阅读框包括poly-Myc表位(pET16b-5MYC)。使用在完整编码序列侧翼的2种寡核苷酸从pTG#359TopoIIAtKrp1cds中扩增出全长AtKrp1cDNA。这些寡核苷酸包含促进克隆到pET16B-5MYC载体中的限制酶位点(5′AtKrp1BamHI/NdeI：ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATATAG(SEQIDNO：24)和3′AtKrp1XhoI：ATCGCTCGAGTCACTCTAACTTTAC(SEQIDNO：25)。将所得到的PCR片段亚克隆到pET16b-5myc的BamHI和XhoI位点内。所得到的载体AtKrp#385以与6×His和myc标签按阅读框的方式包含AtKrp1野生型cDNA。
下述2种寡核苷酸用于扩增在BnKrp1的3′末端上添加5′BamHI/NdeI位点和XhoI限制位点的BnKrp1cDNA(5′BnKrp1BamHI/NdeI：ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATGC(SEQIDNO：26)和3′BnKrp1XhoI；ATCGCTCGAGTCACTCTGATAATTTAAC(SEQIDNO：27)。从pTG#313(TopoIIBnKrp1)中扩增出PCR片段，并且亚克隆到pET16b-5myc的BamHI和XhoI位点内并测序。所得到的载体BnKrp#461以与6×His和myc标签按阅读框的方式包含BnKrp1野生型cDNA。
重组Krp蛋白质在细菌中的表达和纯化
将携带插入片段的所有细菌表达质粒pET16b和pET16b-5MYC转化到BL21Star(DE3)(Invitrogen)内。来自这种新鲜转化的细菌菌落用于接种包含100μg/ml氨苄青霉素的400mlLB，并于37℃生长。当培养物达到OD6000.6-0.8时，用0.5mM异丙基-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)来诱导重组蛋白质表达。细胞随后于30℃生长3小时。通过在JLA10.500Beckman旋转器中离心来收集细胞。将细菌细胞粒状沉淀贮藏于-80℃或立即裂解。细菌在包含蛋白质抑制剂且缺乏EDTA的10ml磷酸盐裂解缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液pH7.0、150mMNaCl、1％Triton×100)中进行裂解。重悬浮的细菌培养物在湿冰上以40％的功率超声处理4×20秒。裂解的细胞以14,000rpm在BeckmanJA20.1旋转器中于4℃离心15分钟。细胞粒状沉淀用10ml磷酸盐裂解缓冲液进行洗涤，且再次通过离心收集细胞粒状沉淀。具有标签的KRP分子主要是不溶性的。将不溶性的具有标签的KRP′s溶解在尿素缓冲液(8M尿素、100mMTrispH7.5)中。重悬浮的细胞粒状沉淀在湿冰上以40％的功率短暂超声处理3×15秒。不溶于尿素的蛋白质通过以14,000rpm在BeckmanJA20.1旋转器中于4℃离心15分钟来去除。使用在尿素缓冲液中平衡的BDTalonCo2+金属亲和树脂来分批纯化具有标签的KRPs。将分批纯化物在缓慢旋转情况下于4℃温育3小时至过夜。将浆状物装载到柱上，并用36个柱床体积的尿素缓冲液，随后用12个柱床体积的包含5mM咪唑pH7.5的尿素缓冲液来洗涤树脂。使用包含300mM咪唑pH7.5的尿素缓冲液洗脱结合的具有标签的KRP蛋白。通过SDS-Page和/或通过Bradford蛋白质测定法(BioRad)就具有标签的KRP来监控级分。变性的具有标签的KRP1的重折叠使用分步稀释透析来进行。合并包含大多数具有标签的KRP蛋白的级分，且在1M尿素、100mMTrispH7.5、150mMNaCl和5mMβ-巯基乙醇加5mM苄脒中于4℃透析20小时。然后，透析缓冲液变成0.5M尿素、100mMTrispH7.5、150mMNaCl和5mMβ-巯基乙醇加5mM苄脒，且另外再继续12小时。收集重组蛋白质，通过Bradford测定法进行定量，并贮藏于4℃。
Krps的诱变
将野生型形式的AtKRP家族成员和BnKRP家族成员亚克隆到基础pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中以用于测序和诱变目的。
将包含改造的5′-BamHI位点和3′XhoI位点(参见上文“将KrpcDNAs克隆到细菌表达载体中”)的相同AtKRP1野生型cDNAPCR片段亚克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中以用于诱变。所得到的载体Topo-AtKrp#385B包含AtKRP1野生型cDNA，并使用标准自动化测序来验证正确序列。将来自上文的相同BnKRP1野生型cDNA片段亚克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中以用于诱变。所得到的载体Topo-BnKrp#539包含BnKRP1野生型cDNA，并使用标准自动化测序分析来验证正确序列。
根据关于Stratagene′sQuikChange定点诱变试剂盒的方案来进行定点诱变。
为了构建在推定的细胞周期蛋白结合区域中具有多个氨基酸置换(E129A、E130A、I131A、D132A)的BnKrp1#462，使用有义BnKrp1DbleMut#1(GGAGCAACCACCAACGGCAGTGGCTGCTGCTGCTTTTTTCGTG；SEQIDNO：28)和反义BnKrp1DbleMut#1b(CACGAAAAAAGCAGCAGCAGCCACTGCCGTTGGTGGTTGCTCC；SEQIDNO：29)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在。随后将突变体产物亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内，以最终产生BnKrp1#462。
为了构建在CDK结合区域的高度保守残基中具有2个氨基酸置换(F151A、F153A)的BnKrp1#512，使用有义BnKrp1DbleMut#2寡核苷酸(CCTTCTAATGGCTTCTCCTTTTCAGCATCAGCGTTATACTTCTTCTTGAA；SEQIDNO：30)和反义BnKrp1DbleMut#2b寡核苷酸(TTCAAGAAGAAGTATAACGCTGATGCTGAAAAGGAGAAGCCATTAGAAGG；SEQIDNO：31)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。使用AtKrp1-Topo#385B作为模板同样将相同氨基酸置换引入AtKRP1内，其中使用下述寡核苷酸“QCICK1cdsF173A，F175A-coding”5′-TTCAAGAAGAAGTACAATGCCGATGCCGAGAAGGAGAAGCCATTA-3′(SEQIDNO：32)和“QCICK1cdsF173A，F175A-noncod”5′-TTATGGCTTCTCCTTCTGGGCATCGGCATTGTACTTCTTCTTGAA-3′(SEQIDNO：33)。
对于关于推定的细胞周期蛋白结合区域和在CDK结合区域中高度保守残基具有氨基酸置换(E129A、E130A、I131A、D132A、+F151A、F153A)的BnKrp1#463，使用有义BnKrp1DbleMut#2寡核苷酸(CCTTCTAATGGCTTCTCCTTTTCAGCATCAGCGTTATACTTCTTCTTGAA；SEQIDNO：30)和反义BnKrp1DbleMut#2b寡核苷酸(TTCAAGAAGAAGTATAACGCTGATGCTGAAAAGGAGAAGCCATTAGAAGG；SEQIDNO：32)用于QuikChange定点诱变，其中BnKrp#462作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有单个氨基酸置换(K148A)的BnKrp1#586，使用有义BnKrp1K148A寡核苷酸(GATAATTTCAAGAAGGCGTATAACTTTGATTTC；SEQIDNO：34)和反义BnKrp1K148A寡核苷酸(GAAATCAAAGTTATACGCCTTCTTGAAATTATC；SEQIDNO：35)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有单个氨基酸置换(Y149A)的BnKrp1#587，使用有义BnKrp1Y149A寡核苷酸(AATTTCAAGAAGAAGGCTAACTTTGATTTCGAA；SEQIDNO：36)和反义BnKrp1Y149A寡核苷酸(TTCGAAATCAAAGTTAGCCTTCTTCTTGAAATT；SEQIDNO：37)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有单个氨基酸置换(N150A)的BnKrp1#588，使用有义BnKrp1N150A寡核苷酸(TTCAAGAAGAAGTATGCCTTTGATTTCGAAAAG；SEQIDNO：38)和反义BnKrp1N150A寡核苷酸(CTTTTCGAAATCAAAGGCATACTTCTTCTTGAA；SEQIDNO：39)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有单个氨基酸置换(F151A)的BnKrp1#572，使用有义BnKrp1F151A寡核苷酸(AGAAGAAGTATAACGCTGATTTCGGAAAGGA；SEQIDNO：40)和反义BnKrp1F151A寡核苷酸(TCCTTTTCGAAATCAGCGTTATACTTCTTCT；SEQIDNO：41)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有单个氨基酸置换(F153A)的BnKrp1#573，使用有义BnKrp1F153A寡核苷酸(AGTATAACTTTGATGCCGAAAAGGAGAAGCC；SEQIDNO：42)和反义BnKrp1F153A寡核苷酸(GGCTTCTCCTTTTCGGCATCAAAGTTATACT；SEQIDNO：43)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有2个氨基酸置换(K157A；P158A)的BnKrp1#553，使用有义BnKrp1KP->AA寡核苷酸(GATTTCGAAAAGGAGGCGGCATTAGAAGGACGCT；SEQIDNO：44)和反义BnKrp1KP->AA寡核苷酸(AGCGTCCTTCTAATGCCGCCTCCTTTTCGAAATC)(SEQIDNO：45)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有2个氨基酸置换(R162A；Y163A)的BnKrp1#554，使用有义BnKrp1RY->AA寡核苷酸(GCCATTAGAAGGAGCCGCCGAGTGGGTTAAATT；SEQIDNO：46)和反义BnKrp1RY->AA寡核苷酸(AATTTAACCCACTCGGCGGCTCCTTCTAATGGC；SEQIDNO：47)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有2个氨基酸置换(E164A；W165A)的BnKrp1#555，使用有义BnKrp1EW->AA寡核苷酸(AGAAGGACGCTACGCGGCGGTTAAATTATCAGA；SEQIDNO：48)和反义BnKrp1EW->AA寡核苷酸(TCTGATAATTTAACCGCCGCGTAGCGTCCTTCT；SEQIDNO：49)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有2个氨基酸置换(K167A；L168A)的BnKrp1#556，使用有义BnKrp1KL->AA寡核苷酸(CGCTACGAGTGGGTTGCAGCATCAGAGTGAGAGC；SEQIDNO：50)和反义BnKrp1KL->AA寡核苷酸(GCTCTCACTCTGATGCTGCAACCCACTCGTAGCG；SEQIDNO：51)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#539作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有多个氨基酸置换(F151A；F153A；E164A；W165A)的BnKrp1#574，使用BnKrp1F151A，F153A寡核苷酸(CCTTCTAATGGCTTCTCCTTTTCAGCATCAGCGTTATACTTCTTCTTGAA；SEQIDNO：52)和反义F151A，F153A寡核苷酸(TTCAAGAAGAAGTATAACGCTGATGCTGAAAAGGAGAAGCCATTAGAAGG；SEQIDNO：53)用于QuikChange定点诱变，其中BnKrp1#555作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建在CDK结合区域中具有多个氨基酸置换(Y149A；F151A；F153A)的BnKrp1#598，使用有义BnKrp1Y149A寡核苷酸(AATTTCAAGAAGAAGGCTAACGCTGATGCTGAA；SEQIDNO：54)和反义BnKrp1Y149A寡核苷酸(TTCAGCATCAGCGTTAGCCTTCTTCTTGAAATT；SEQIDNO：55)用于QuikChange定点诱变，其中TopoBnKrp#512作为模板。对诱变产物进行测序以验证所需突变的存在，随后亚克隆到pET16b-5MYC的BamHI/XhoI位点内。
为了构建BnKrp1#547，下述2种寡核苷酸用于扩增缺乏最C-末端的2个氨基酸即Ser和Glu、在BnKrp1的3′末端上添加5′BamHI/NedI位点和XhoI限制位点的BnKrp1cDNA(5′BnKrp1BamHI/NedI：ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATGC(SEQIDNO：26)和3′BnKrp1SE>stopXhoI：CTCGAGTCAAGCAGCTAATTTAACCCACTCGTA(SEQIDNO：56))。从pTG#313(TopoIIBnKrp1)中扩增出PCR片段，并且亚克隆到pET16b-5myc的BamHI和XhoI位点内并测序。所得到的载体BnKrp#547以与6×His和myc标签按阅读框的方式包含BnKrp1cDNA。
为了构建BnKrp1#614，下述2种寡核苷酸用于扩增缺乏整个CDK结合结构域的BnKrp1cDNA。5′BnKrp1BamHI/NdeI：ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATGC(SEQIDNO：26)和包含XhoI位点的3′BnKrp1Δcdk：CTCGAGTCACTTCTTGAAATTATC(SEQIDNO：57)。从pTG#420(TopoIIBnKrp1)中扩增出PCR片段，并且亚克隆到TopoII(Invitrogen)中并测序。将BamHI/XhoI片段亚克隆到pET16b-5myc中。所得到的载体BnKrp#614以与6×His和myc标签按阅读框的方式包含缺乏CDK结合区域的编码序列的BnKrp1cDNA。
实施例2.哺乳动物p27KIP1和植物KRPs之间的氨基酸同源性。
CKIs的CIP1/KIP1家族利用2个接触区域来结合并抑制激酶复合物。基于这种结合和抑制方式，改变这2个区域之一的结合能力可能可以导致产生显性失活蛋白质，所述显性失活蛋白质仍能与该复合物(经由完整结构域)相互作用，不再抑制激酶活性，并且干扰野生型CKI抑制活性细胞周期蛋白/CDK复合物。例如，如果细胞周期蛋白结合区域变得无功能，那么突变体蛋白将仍通过CDK结合区域经由完整结构域与激酶复合物相互作用。类似地，如果CDK结合区域变得无功能，那么突变体蛋白将仍通过细胞周期蛋白结合区域与激酶复合物相互作用。
CKI′s的AtKrp家族在整个蛋白各处共享同源性，其中最高的同源性位于最C-末端的40-45个氨基酸中(参见Wang等人，Nature386：451-452，1997；Wang等人，PlantJ.15：501-510，1998；Lui等人，PlantJ.21：379-385，2000；DeVeylder等人，PlantCell13：1653-1667，2001；Jasinski等人，PlantPhysiol.130：1871-1882，2002；Zhou等人，PlantCellRep.20：967-975，2002；Zhou等人，PlantJ.35：476-489，2003)。然而，只有Krp家族的最后约23个氨基酸显示出与哺乳动物p27kip1的同源性(参见图1)。
进行体外结合实验以帮助阐明代表性KRP即BnKRP1与AtcyclinD2；1和AtCDKA之间的结合相互作用。其他KRP家族成员的结合相互作用也可以使用下文所述相同的体外结合实验来进行阐明。使用突变形式的BnKrp1的体外结合实验揭示出单独的这个区域是与CDK结合所必需的，而与Atcyclin的结合仍是完整的，所述突变形式的BnKrp1包含在CDK结合区域中高度保守氨基酸的氨基酸置换。更重要的是，完整的CDK结合结构域绝对是抑制AtCyclinD2/CDKA复合物所必需的。位于CDK结合区域紧上游(在本发明人提议为细胞周期蛋白结合区域的区域中)的氨基酸在KRP家族成员中是保守的(参见图1)，但在p27KIP1中则不是。在这个提议的细胞周期蛋白结合结构域内的几个保守残基的突变撤消了与AtcyclinD2；1的相互作用，而与AtCDKA的相互作用保持完整。有趣的是，这个推定的细胞周期蛋白结合区域突变体仍抑制AtcyclinD2/CDKA激酶复合物，但不如野生型KRP1有效。使激酶活性减少50％的抑制浓度(IC50)对于野生型KRP1(BnKrp#461)是0.035μg，而对于细胞周期蛋白结合突变体(BnKrp#462)的IC50是1.25μg。
使用哺乳动物p27KIP1对应物可见类似观察(参见Vlach等人，EMBOJ.16：5334-44，1997)。与野生型p27KIP1相比较，p27KIP1细胞周期蛋白结合突变体的IC50增加。然而，相反地，高浓度的p27KIP1CDK结合突变体仍能抑制激酶复合物。这可能由哺乳动物p27KIP1中存在310螺旋来解释，所述310螺旋在植物Krps中不存在(关于解释参见实施例3)。
这些数据暗示，KRPs中存在类似于哺乳动物p27KIP1对应物的2个区域，其负责与活性激酶复合物的相互作用。有趣的是，细胞周期蛋白结构域突变体仍能抑制激酶复合物，这暗示CDK结合区域主要负责细胞周期蛋白/CDK激酶抑制。类似地，p27KIP1的细胞周期蛋白结合区域在活性CDK复合物的抑制中起附加作用。然而，这些结果说明，与p27KIP1不同，KRP1的CDK结合区域在激酶抑制中起更重要的作用。
因此，集中于在CDK结合区域中在KRP家族和p27KIP1之间的高同源性，将改变残基以最终形成显性失活BnKrp1分子，所述显性失活BnKrp1分子仍能结合复合物、干扰野生型BnKRP1抑制激酶复合物，但它不抑制复合物本身。
实施例3.与细胞周期蛋白/CDK复合的哺乳动物p27KIP1的蛋白质结构用于鉴定关键氨基酸，所述关键氨基酸接触在植物KRPs中保守的CDK。
为了促进将最终干扰野生型KRP功能的显性失活Krp分子的设计，使用先前公开的与细胞周期蛋白A-CDK2激酶复合物相复合的哺乳动物p27KIP1结构(参见Russo等人，Nature382：325-331，1996)。合并结构信息连同比对信息以鉴定关键氨基酸，所述关键氨基酸当变成丙氨酸或其他氨基酸残基时，导致产生具有显性失活特征的蛋白质。这些显性特征如下：1)突变体Krp与细胞周期蛋白/CDK复合物结合，2)突变体蛋白即使在高浓度时也基本上不抑制细胞周期蛋白/CDK复合物的形成，和3)突变体蛋白应实质上与野生型KRP分子竞争结合细胞周期蛋白/CDK复合物。在体内，满足这些特征的突变体Krps将导致细胞中的细胞周期蛋白/CDK激酶活性升高，这将最终导致细胞增殖增加和更高的有丝分裂指数。
哺乳动物细胞周期蛋白A/CDK2激酶活性通过p27KIP1的结合而完全关闭。p27KIP1制细胞周期蛋白A/CDK2激酶复合物的机制已显示是复杂的过程(参见Russo等人，同上)。p27KIP1利用2种方式抑制活性激酶复合物。抑制的第一种组分涉及p27KIP1310螺旋，所述310螺旋在CKIs的任何植物KRP家族中显然不是保守的。310螺旋使其本身插入激酶的催化裂缝中以模拟ATP底物。这个裂缝区域被310螺旋占据有效地阻断ATP结合和激酶活性。然而，即使在不存在310螺旋的情况下，p27KIP1仍能抑制激酶复合物(参见Polyak等人，Cell78：59-66，1994)。
与细胞周期蛋白A/CDK2结合的p27KIP1和单独的激酶复合物的晶体结构比较说明，CDK2的N-末端裂片在结合p27KIP1后经历显著的构象变化(参见Russo等人，同上)。事实上，激酶N-末端裂片中的特异性β-折叠在p27KIP1结合后丧失，所述β-折叠通常帮助协调活性位点中的ATP。p27KIP1的结合诱导重折叠，所述重折叠涉及p27KIP1的β-发夹、β-链残基和310螺旋以及CDK2的N-末端裂片的β-折叠氨基酸，其重折叠而形成分子间的β-夹层(参见同上)。这种单独的构象变化能够显著抑制细胞周期蛋白A/CDK2的激酶活性。形成这种β-夹层的在p27KIP1内的残基在所有哺乳动物p27KIP1家族成员中是高度保守的，且在所有KRP家族成员也是非常保守的。基于实施例1中所述结果以及保守310螺旋的缺乏，KRP家族成员中的保守CDK结合区域很可能结合活性激酶复合物，且通过诱导AtCDKA激酶的N-末端裂片中的构象变化来抑制激酶活性。然而，不能排除KRP的另一个区域，因为正如310螺旋在哺乳动物p27kip1中所做的一样，通过插入催化裂缝中实际上模拟了ATP结合。
KRP家族的最羧基末端的23个氨基酸显示出最大的与哺乳动物p27kip1的氨基酸同一性(参见图1)。基于与哺乳动物p27KIP1的序列同一性，在CKI和激酶复合物之间形成β-夹层中起作用的在BnKRP1中的几个保守残基系统性地进行改变。将每个突变体就其抑制激酶复合物的能力与野生型BnKRP1(BnKrp#461)进行比较。在某些情况下，还就与AtcyclinD2；1或AtCDKA的结合来监控突变体BnKrp1。关于这些实验的结果概括于下表2中。
如实施例4的“突变体KRPCKI多肽”中所详细描述的来引入突变。
在CDK结合区域的最N-末端存在LysTyrAsnPheAspPhe(KYNFDF)基序(SEQIDNO：58)。该基序在来自拟南芥属植物和欧洲油菜种类的KRP家族成员中是高度保守的。这些残基在p27KIP1中几乎全部是保守的。在p27KIP1中，它们形成β-发夹转角的一部分，其最终与细胞周期蛋白A-CDK2复合物中的CDK2一起形成β-夹层。将这些保守残基中的每一个变成丙氨酸，并就其抑制激酶复合物的能力进行测试(参见表2)。许多单个氨基酸置换突变不影响在体外抑制激酶复合物的能力。然而，BnKrp1#587和BnKrp1#572显示出有趣的结果。在每种情况下，与野生型蛋白质相比较，激酶抑制减弱，这暗示KRP1的这个区域在激酶抑制中起作用。
p27KIP1中的苯丙氨酸62和64的侧链接触CDK2，在形成β-夹层中起整合作用，且在KRP1中是保守的。(参见图1)。因为Krp1F151A(BnKrp1#572)的抑制活性被部分损害，所以将苯丙氨酸151和153均变成丙氨酸。该双重突变体BnKrp1#512不再抑制激酶复合物，尽管其仍能经由cyclinD2；1结合激酶复合物。可能仍存在一定的该突变体与复合物的CDK部分的残留结合。
KRP1的酪氨酸149在p27KIP1中不是保守的；然而，它位于β-发夹的N-末端位置中，所述β-发夹接触CDK2且形成β-夹层的一部分。酪氨酸149在拟南芥属植物和芸苔属植物的KRPs家族成员中是高度保守的。当酪氨酸149变成丙氨酸(BnKrp1#587)时，抑制活性被部分损害，这暗示它在CDKA的结合和/或抑制中起重要作用。因此，这个位置的突变(Y149A)可以与双重突变体Krp1F151A；F153A相组合。该三重突变体预期保留了其与激酶复合物的结合，同时失去了其抑制激酶活性的能力。
KRP1中在KYNFDF基序(SEQIDNO：58)C-末端的区域也包含在p27KIP1中保守的几个氨基酸。(参见图1)。这些残基中的许多在p27KIP1的β-链中是保守的，所述β-链形成β-夹层的一部分。将这些保守氨基酸中的几个成对变成丙氨酸(关于概括参见表2)。在除一个外的全部情况下，抑制功能没有明显受损。例外是Krp1#545(E164A；W165A)突变体，它是比野生型KRP1弱得多的抑制剂。色氨酸165将其侧链延伸入β-夹层内。将苯丙氨酸151、153以及E164和W165全部变成丙氨酸(Krp1#574)。这种复合的突变体BnKrp1即使当以高浓度使用时也不能抑制激酶复合物。
KRP1的完整CDK结合区域的截短也不能抑制激酶复合物。这并不令人惊讶，因为缺失了负责结合CDK的整个区域。然而，相信很可能此类截短将导致不稳定的蛋白质。
实施例4.突变体KRPCKI多肽。
作为超过用于在转录后RNA水平上沉默基因表达的先前技术的改进，使用显性失活策略已在蛋白质水平上完成了植物中KRP家族成员的抑制。显性失活策略的基本原则是改造基因以生产突变蛋白，所述突变蛋白阻止相同蛋白质的正常拷贝执行其功能。在这种情况下，正常KRP蛋白与细胞周期蛋白/CDK复合物形成多亚基复合物从而灭活激酶活性。因此，表达突变形式的野生型KRP1将干扰KRP1的正常拷贝抑制细胞周期蛋白/CDK激酶活性。此外，考虑到芸苔属植物的7个KRP家族成员之间的高度同源性，突变体Krp1将对于其他家族成员或可能所有家族成员表现为显性失活。最后，KRPs的细胞周期蛋白和CDK结合区域在其他植物种类中是非常保守的。因此，这种显性失活Krp1将保护细胞周期蛋白/CDK激酶复合物在其他植物中不受内源性KRPs的抑制，所述其他植物例如为玉米、小麦、卡诺拉油菜、大豆、稻、棉花、杨树等。
先前，显性失活突变体已用于帮助阐明各种信号转导途径。特别地，显性失活Ras(一种GTP酶)是迄今为止最常用的显性失活蛋白质，且在用于研究其他GTP酶的策略中已发挥主要作用(Feig和Cooper，Mol.Cell.Biol.8：3235-3243，1988)。类似地，显性失活形式的CDKs用于鉴定CDKs在细胞周期控制中的作用(vandenHeuvel和Harlow，Science262：2050-2054，1993)。
CKIs的KIP/CIP家族在其用于抑制激酶复合物的机制方面不同于INK家族的抑制剂。尽管INK家族只与CDK结合，但CIP/KIP家族具有独立地结合细胞周期蛋白和CDK的2个保守区域。CKIs的CIP1/KIP1家族和CKIs的KRP家族利用2个接触区域来结合复合物的事实使得它们成为用于显性失活策略的理想候选物。这是因为可以靶向CDK结合区域以为了得到突变体，所述突变体取消与CDK的相互作用而同时使结合细胞周期蛋白的KRP1的区域保持完整。
在本发明中，已克隆了卡诺拉油菜、欧洲油菜(Bn)、KRPs和鼠耳芥(拟南芥)(At)KRP分子，且证实了其抑制细胞周期蛋白/CDK活性的能力。为此，开发了体外测定法以测试各种KRP抑制细胞周期蛋白/CDK复合物的能力。将拟南芥属植物细胞周期蛋白D2；1(AtcyclinD2；1)和拟南芥属植物CDKA(AtCDKA)经用表位加上标签，并克隆到杆状病毒表达载体系统(BDBiosciences)内。AtCyclinD2；1在N-末端上用FLAG表位(Sigma-Aldrich)加上标签。将血凝素(HA)表位相对于AtCDKA的5′末端按阅读框放置。AtcyclinD2；1蛋白的产生通过用AtcyclinD2；1杆状病毒感染草地夜蛾Sf9细胞来完成。AtCDKA的产生通过用CDKA杆状病毒感染草地夜蛾Sf9细胞来完成。细胞周期蛋白D2；1/CDKA的活性复合物通过用AtcyclinD2；1加AtCDKA杆状病毒共感染草地夜蛾Sf9来完成。将细胞周期蛋白、CDK和活性复合物进行纯化并测定激酶活性。通过采用使用组蛋白HI(HHI)作为底物的标准激酶测定法，或通过使用重组NtRb(Nakagami等人，PlantCell14：1847-1857，2002)来监控激酶活性。细胞周期蛋白D2；1感染的昆虫细胞不产生活性复合物。类似地，CDKA感染的细胞不产生活性激酶。当用AtcyclinD2；1和AtCDKA感染细胞时，容易地检测到激酶活性。活性细胞周期蛋白CDK复合物也可以通过使用p13sucl琼脂糖珠从植物蛋白质组织提取物中，或从植物组织培养细胞提取物中进行纯化(Wang等人，PlantJ.15：501-510，1998)。
通过将KrpcDNA以与HIS标签的编码序列按阅读框的方式亚克隆入pET16b载体(Novagen)中，将Krps设计成包含N-末端聚组氨酸表位标签(HIS标签)。在细菌中诱导野生型和突变体Krp蛋白的表达，且随后作为HIS标签融合蛋白使用Ni-琼脂糖进行纯化。
所测试的所有野生型欧洲油菜(Bn)Krps(BnKRP1、BnKRP4、BnKRP5)在抑制细胞周期蛋白D2；1/CDKA复合物方面都极其有效。在所有情况下，抑制也是剂量应答型的。几种其他的拟南芥属植物AtKrps(AtKRP1、AtKRP2)也是有效的抑制剂。
CKIs的CIP1/KIP1家族利用2个接触区域来结合并抑制激酶复合物。基于这种结合和抑制方式，改变这2个区域之一的结合能力可以潜在地导致产生具有显性失活特征的突变体蛋白。例如，如果细胞周期蛋白结合区域变得无功能，那么突变体蛋白将仍通过CDK结合区域经由完整结构域与激酶复合物相互作用。类似地，如果CDK结合区域变得无功能，那么突变体蛋白将仍通过细胞周期蛋白结合区域与激酶复合物相互作用。
ICK/KRP家族成员与哺乳动物p27KIP1家族具有有限的氨基酸同一性。这种同一性局限于最C-末端的24-30个氨基酸。事实上，哺乳动物p27KIP1的细胞周期蛋白/CDK结合结构域的位置定位于蛋白质的N-末端，而植物Krps中的同源区域在蛋白质的最C-末端部分被发现。(参见图1，其显示了p27KIP1和各种Krp家族成员的比对)。哺乳动物p27KIP1内的细胞周期蛋白结合区域在植物KRPs中不是保守的。然而，推定的CDK结合区域的紧上游的区域在所有植物KRPs中都是保守的。这个保守区域尽管不与p27KIP1同源，但能够负责与细胞周期蛋白的相互作用。在BnKRP1的这个提议的细胞周期蛋白结合区域(氨基酸125-138)中几个残基的氨基酸置换，取消了与细胞周期蛋白的结合，但不影响与CDK的结合。这些数据暗示，在KRPs中存在类似于哺乳动物p27KIP1对应物的2个区域，所述2个区域介导与活性激酶复合物的相互作用。有趣的是，使细胞周期蛋白结构区域突变不能完全取消激酶复合物的抑制，这暗示了CDK结合区域主要负责细胞周期蛋白/CDK激酶抑制。
考虑到植物和哺乳动物CKIs的CDK结合区域之间的高度同源性，使用与细胞周期蛋白A/CDK2复合物结合的p27KIP1的晶体结构来帮助鉴定p27KIP1的接触残基，所述接触残基结合细胞周期蛋白和CDK(Russo等人，Nature382：325-331，1996)。将接触残基与各种KRP序列进行比较，以确定它们在携带与p27KIP1的最高同源性的区域中是否是保守的。CDK结合区域的最N-末端存在LysTyrAsnPheAspPhe(KYNFDF)(SEQIDNO：588)基序。这些残基在p27中几乎全部是保守的。它们形成在细胞周期蛋白A-CDK2复合物中接触CDK2的β-折叠。
将这些保守残基中的每一个变成丙氨酸，并就其抑制激酶复合物的能力进行测试。有趣的是，这些单个氨基酸置换突变中的许多不影响在体外抑制激酶复合物的能力。然而，Krp1F151A和Krp1Y149A突变体不减少CKI活性，不影响与激酶复合物的结合。
因为苯丙氨酸151和153的侧链都接触CDK，并且Krp1F151A的抑制活性被部分损害，所以将苯丙氨酸151和153均替换为丙氨酸。该双重突变体BnKrp1(BnKrp1F151A；F153A)不再抑制激酶复合物，尽管其仍能经由cyclinD2；1结合激酶复合物。不能排除可能仍存在一定的该突变体与复合物的CDK部分的残留结合。
Krp1中的酪氨酸149在p27KIP1中不是保守的，然而，在哺乳动物p27的结构模型中，类似氨基酸残基位于接触CDK2的β-折叠的位置中。当变成丙氨酸(Krp1Y149A)时，抑制活性被部分损害，这暗示这个氨基酸残基在CDKA的结合和/或抑制中起重要作用。因此，与双重突变体Krp1F151A；F153A相组合的这个位置的突变(Y149A)产生不再抑制激酶复合物的变体蛋白质。预期该三重突变体(BnKrp1Y149A；F151A；F153A)仍保留与激酶复合物的结合，而同时不能抑制激酶活性。
如上所述，Y149A和F151A的单个氨基酸置换均个别地减少突变体BnKrp1多肽抑制激酶复合物的能力。双重突变体BnKrp1Y149A；F151A预期产生不再抑制激酶复合物的突变体蛋白。
KRP1中在KYNFDF基序(SEQIDNO：58)C-末端的区域也包含在p27KIP1中保守的几个氨基酸。将这些保守氨基酸成对变成丙氨酸。在除一个外的全部情况下，抑制功能没有明显受损。例外是Krp1E164A；W165A突变体，它是比野生型KRP1弱得多的抑制剂。在分开的衍生蛋白质中，将苯丙氨酸151、153以及E164和W165全部替换为丙氨酸。该BnKrp1多重突变体也不能抑制激酶复合物。
KRP1的完整CDK结合区域的截短也不能抑制激酶复合物。这并不令人惊讶，因为缺失了负责结合CDK的整个区域。
关于生物活性而对于各种BnKrp1突变体的评价结果概括于表2中。
表2.BnKrD1突变体的生物活性
保护激酶复合物不受野生型BnKrp1的抑制。
2N/A意指不可应用。
3ND意指未测定。
4即使当以高达取消激酶活性所需的野生型抑制剂的最小量的10倍使用时，候选物也不抑制激酶活性。
如前所述，破坏细胞周期蛋白结合结构域导致仍保留一些抑制活性的突变体Krp1蛋白。然而，在推定的细胞周期蛋白结合区域(氨基酸125-138)内很可能存在这样的其他氨基酸，所述其他氨基酸可以被改变以形成满足任选的显性失活特征的突变体蛋白。此外，尽管在这些特定研究中的所有置换之中使用丙氨酸，但预期用另一个在一种或多种物理性质方面显著不同的非丙氨酸氨基酸残基替换鉴定的氨基酸残基(其他非保守置换)仍将产生显性失活蛋白质。特别地，预期用带相反电荷的氨基酸、或者用具有基本上不同的限定特征的氨基酸残基替换特定氨基酸残基，例如用疏水残基替换亲水残基和反之亦然等，将产生更佳的显性失活候选物。
即使当以高达取消激酶活性所需的野生型抑制剂的最小量的10倍使用时，理想的显性失活候选物也不会抑制激酶活性。几种突变体满足这个要求(参见表2)。这个特征的重要性在于下述事实：当在体内表达时，与野生型蛋白相比较，突变体蛋白的水平可以处于过量水平。
在这个研究中鉴定的显性失活BnKrp1分子有效地保护cyclinD2；1/CDKA复合物不受野生型BnKRP1的抑制。相同的显性失活衍生Krp1分子还保护激酶复合物不受来自其他物种的KRP分子的抑制，所述其他物种例如为玉米、大豆、稻、棉花、杨树和苜蓿(参见实施例7)。
实施例5.突变体BnKrp1蛋白竞争性地阻断野生型CKI蛋白抑制激酶复合物。
即使当以高达取消激酶活性所需的野生型抑制剂的最小量的10倍使用时，特别有用的显性失活候选物也不会抑制激酶活性。几种突变体满足这个要求(参见表2、图1和实施例2)。这个特征的重要性在于下述事实：当在体内表达时，与野生型蛋白相比较，突变体蛋白的水平可以处于过量水平，并且重要的是突变体蛋白在几乎任何浓度上基本上不抑制激酶复合物。
就其保护cyclinD2；1/CDKA复合物不受野生型BnKRP1影响的能力来测试几种显性失活候选物。竞争实验如下进行。将活性cyclinD2；1/CDKA激酶复合物(7μg)与候选显性失活BnKrp1突变体(5μg或10μg)一起在1×激酶缓冲液中预温育20分钟。随后在不存在野生型BnKrp1的情况下或在添加野生型BnKrp1(0.5μg、1.0μg或2μg)后，使用HHI作为底物来测试复合物的激酶活性。然后，如实施例1的“激酶测定法”中所述通过SDSPAGE来解析激酶反应体系。结果通过phosphorImager(MolecularDynamics)进行定量。
BnKrp1F151A；F153A(BnKrp1#512)能够保护激酶复合物不受野生型BnKRP1的抑制。在0.6μg野生型KRP1的存在下，5μgBnKrp1F151A；F153A恢复高达40％的激酶活性。这种显性失活效应是剂量依赖性的，当使用10μgBnKrp1F151A；F153A时，高达60％的激酶活性被恢复。
突变体BnKrp1#555(E164A；W165A)是有希望的显性失活候选物，因为即使当以10μg/反应进行使用时，它也不能抑制激酶活性。在竞争实验中，该突变体保护活性激酶复合物不受野生型KRP1的抑制，但在使用5μg时只恢复14％的活性，和当使用10μg时恢复15％。将来自BnKrp1#512和BnKrp1#555的突变合并到称为BnKrp1#574(F151A，F153A，E164A，W165A)的一种突变体蛋白内。这种复合的突变体以5μg和10μg的量独自不能抑制激酶活性。这种复合的突变体能够保护激酶复合物不受野生型BnKRP1的抑制，但只能使活性恢复多达35％。突变体BnKrp1#598(Y149A；F151A；F153A)能够保护激酶复合物不受野生型BnKRP1的抑制。在0.6μg野生型KRP1的存在下，5μgBnKrp1F151A；F153A恢复高达55％的激酶活性。这种显性失活效应是剂量依赖性的，当使用10μgBnKrp1Y149A；F151A；F153A时，高达80％的激酶活性被恢复。
这些数据暗示，被靶向用于显性失活的最佳区域是β-发夹区域。然而，并非任何残基都可以被改变。几种单个氨基酸置换不能形成显性失活Krp(参见实施例3)，但事实上，改变太多的保守残基也导致满足大部分显性失活要求的突变体，除了它最后不能表现为显性失活。AtKrp2与BnKrp1和AtKrp1最紧密相关。其中KYNFDF基序(SEQIDNO：58)变成KAAAAA(SEQIDNO：59)的突变体AtKrp2具有有希望的显性失活Krp分子特征。如所预期的，在高浓度时，这种BnKrp2突变体不能抑制激酶复合物。有趣的是，这种突变体不能保护激酶不受野生型BnKRP1的抑制。
总之：BnKrp1F151A；F153A阻断野生型KRP抑制激酶，Krp1E164A；W165A在阻断野生型KRP方面不够好，而BnKrp1(Y149A；F151A；F153A)在体外竞争测定法中是最佳的显性失活候选物。双重突变体BnKrp1(Y149A；F151A)还可能能够保护激酶复合物不受抑制。
如前所述，破坏细胞周期蛋白结合结构域导致保留一些抑制活性的突变体Krp1蛋白。然而，很可能存在这样的其他氨基酸，所述其他氨基酸可以被改变以形成满足所有显性失活特征的突变体蛋白。此外，丙氨酸是对于所有置换的所选择的氨基酸。在所呈现的许多突变体中，用非保守氨基酸替换该残基可以产生更佳的显性失活候选物。
实施例6.BnKrp1F151A；F153A和BnKrp1Y149A；F151A；F153A对于其他欧洲油菜KRP家族成员表现为显性失活。
显性失活策略的总体目标之一是将突变引入KRP家族的单个成员中，所述单个成员不仅对于其野生型对应物，而且对于所有其家族成员表现为显性失活。欧洲油菜和拟南芥属植物中CKIs的KRP家族的比对说明在蛋白质的最C-末端存在高序列同一性。上文已呈现的数据证明，对于CDK结合结构域来说紧N-末端的保守区域负责结合细胞周期蛋白。此外，几个团体已给出了双杂交筛选数据，其说明几种KRP分子对于细胞周期蛋白结合具有重叠的特异性。
BnKRP4在β-发夹方面不同于BnKRP1。Phe151在BnKRP1和BnKRP4之间是保守的，然而，BnKRP1F153在BnKRP4中是脯氨酸。这不必是保守氨基酸置换，并且暗示BnKRP4与细胞周期蛋白/CDKA复合物的相互作用可能不同于BnKRP1。然而，已显示，在CDK结合结构域内的这个位置似乎在细胞周期蛋白/CDKA抑制中不发挥显著作用(突变体BnKrp1#573，参见实施例1)。
克隆BnKRP4，使用下述2种寡核苷酸来扩增在BnKrp4-1的3′末端上添5′BamHI/NdeI位点和XhoI限制位点的BnKrp4cDNA(5′BnKrp4-1BamHI/NdeI：GGATCCCATATGGGAAAATACATAAAG(SEQIDNO：60)和3′BnKrp4-1XhoI：CTCGAGCTAATCATCTACCTTCTT(SEQIDNO：61)。从pTG#315(TopoIIBnKrp4-1)中扩增出PCR片段，并且亚克隆到pET16b-5myc的BamHI和XhoI位点内并测序。所得到的载体BnKrp#605以与6×His和myc标签按阅读框的方式包含BnKRP4野生型cDNA。蛋白质如实施例1中所述进行表达和纯化。
BnKrp4是AtcyclinD2；1/CDKA激酶复合物的有效抑制剂，其IC50-非常类似于野生型BnKRP1。竞争实验如实施例4中所述进行。在这种情况下，BnKrp1#512(F151A；F153A)和BnKrp1#598(Y149A；F151A；F153A)都能够保护激酶复合物不受野生型BnKRP4的抑制。基于这种观察，预期BnKrp1#512和BnKrp1#598将对于大多数(如果不是全部)BnKRP家族成员表现为显性失活。
实施例7.BnKrp1F151A；F153A和BnKrp1Y149A；F151A；F153A对于其他植物物种的Krps表现为显性失活。
显性失活策略的总体目标是将一个或多个突变引入KRP家族的单个成员中，所述单个成员不仅对于其野生型家族成员，而且针对不同植物物种中的KRP家族成员表现为显性失活。本发明中的目的作物植物包括但不限于，大豆、卡诺拉油菜、玉米、小麦、苜蓿、稻、蔬菜作物例如番茄，以及甚至树例如杨树。
将AtKRP1(GenBank#U94772)的核苷酸序列用于进行关于玉米、大豆、杨树、烟草和稻的KRP序列的tBLASTn搜索。几个短ESTs显示出局限于细胞周期蛋白/CDK结合结构域的高同源性。这些短序列中的几个进行比对，并且图解说明这个区域在各种植物物种中的保守性。(参见图2)
在玉米中，一个具体条目，Genbank登录号AY986792，包含573bp的开放读码框，编码与几个BnKRP家族成员具有高同一性的全长蛋白质。这种蛋白质被称为ZmKRP4，但它不一定是BnKRP4或AtKRP4的玉米同系物。如同BnKRP4一样，ZmKRP4在β-发夹方面不同于BnKRP1。Phe151在BnKRP1与BnKRP4和ZmKRP4之间是保守的，然而，BnKRP1F153在BnKRP4和ZmKRP4中均是脯氨酸。ZmKRP4从由总RNA制备的cDNA中进行扩增，所述总RNA从成熟的玉米雄花穗中分离。寡核苷酸序列从Genbank登录号AY986792中收集。ZmKRP45′BamHI/NdeI：GGATCCCATATGGGCAAGTACATGCGC(SEQIDNO：62)和ZmKRP43′BamHI：GGATCCTCAGTCTAGCTTCACCCA(SEQIDNO：63)。将PCR产物亚克隆到TOPOII(Invitrogen)中并测序。对于ZmKRP4的蛋白质产物，将573bpBamHI片段克隆到pET16b-5Myc载体的BamHI位点内，并且插入方向通过限制酶作图来测定。如实施例4中所述产生重组蛋白质。
类似地，在大豆中，一个具体条目，Genbank登录号AY439104，包含499bp的开放读码框，编码与几个BnKRP家族成员具有高同一性的全长蛋白质。被称为GmKRP2-2的这种蛋白质在β-发夹内基本上等同于BnKRP1。GmKRP2-2从由总RNA制备的cDNA中进行扩增，所述总RNA从幼小的发育中的大豆苗中分离。由Genbank登录号AY439104的序列设计寡核苷酸：GmKRP2-25′XhoI/NdeI：ctcgaggacatatggagatggctcaggttaaggca(SEQIDNO：64)和GmKRP2-13′XhoI：ctcgagtcaactgaacccactcgtatcgtcc(SEQIDNO：65)。将PCR产物亚克隆到TOPOII(Invitrogen)中并测序。对于GmKRP2-2蛋白的表达，将499bpXhoI片段克隆到pET16b-5Myc载体的XhoI位点内，并且插入方向通过限制酶作图来测定。如实施例4中所述产生重组蛋白质。
测试ZmKRP4和GmKrp2-2抑制重组cyclinD2；1/CDKA激酶复合物的能力。ZmKRP4是激酶复合物的有效抑制剂，其IC50非常类似于野生型BnKRP1的IC50，0.035μg。类似地，GmKrp2-2也是激酶复合物的有效抑制剂。2种显性失活BnKrp1(BnKrp1#512和#598)都能够阻断ZmKRP4和GmKrp2-2抑制激酶复合物。在每种情况下，保护作用与BnKrp1#512对于BnKRP1抑制产生的保护作用相当。这个结果说明了本发明的显性失活Krp的跨物种效应。
该实验还暗示，BnKrp#512和BnKrp#598对其他跨物种的KRP家族成员将具有类似的效应，所述其他跨物种的KRP家族成员例如来自稻、小麦、高粱、甘蔗、糖用甜菜等的那些。来自这些植物物种的KRP分子连同其他一起，可以被克隆，表达为重组蛋白质，并在类似研究中进行评估，以证实BnKrp1#512和BnKrp1#598对于这些家族成员具有类似的效应。
实施例8.在其他植物物种的KRP分子中的平行突变导致显性失活分子。
BnKRP1中经改变以产生显性失活效应的残基在卡诺拉油菜、玉米、大豆、稻、苜蓿、杨树、烟草等的几个KRPs家族成员中是保守的。保守的苯丙氨酸至丙氨酸残基的置换可以在这些作物植物的几个KRPs中进行，并就其表现为显性失活分子的能力进行测试。
F151和F153在卡诺拉油菜、大豆、玉米的某些但并非全部KRPs中是保守的。在大豆和玉米KRPs中这些保守残基的突变将导致类似的显性失活Krp分子。
实施例9.设计表达转基因构建体的转基因卡诺拉油菜植物以赋予Krp1(F151a；F153a)的胚特异性和组成型表达。
基于上文实施例中呈现的体外结果，本发明在培养的植物细胞或转基因植物中的表达预期增加内源性CDK激酶活性。CDK激酶活性的这种增加将对细胞周期具有正面驱动影响。将本发明克隆到植物表达载体内。植物表达载体包含与上述本发明连接的天然或非天然启动子。启动子可以是强、弱、诱导型、组织特异性、器官特异性和发育特异性的。
将BnKrp1(F151A；F153A)突变的等价物引入AtKRP1内，使用下述寡核苷酸：“QCAtKrp1cdsF173A；F175A-coding”5′-TTCAAGAAGAAGTACAATGCCGATGCCGAGAAGGAGAAGCCATTA-3′(SEQIDNO：66)和“QCAtKrp1cdsF173A；F175A-noncod”5′-TTATGGCTTCTCCTTCTGGGCATCGGCATTGTACTTCTTCTTGAA-3′(SEQIDNO：67)。AtKrp1#359用作模板，使用StratageneQuikchangeSiteDirectedMutagenesisKit。通过测序来证实AtKrp1F173A；F175A(pTG356)。在2个步骤中将LFAH12启动子插入到pTG356中的突变体AtKrp1(F173A；F175A)的5′末端上。首先，将来自pCAMBIA2381Z(pTG254)的SalI和PstILFAH12启动子亚克隆到pBluescriptII(Stratagene)内的SalI和PstI位点中，产生pTG357。然后，使用PstI和BamHI从pTG357中切出LFAH12启动子，并插入pTG356中，产生pTG361。最后，pTG361用KpnI和NotI进行消化，pLAY112用NotI和BglII进行消化(mas3′utr组分)，和pCGN1547用KpnI和BamHI进行消化，并进行3向连接。这导致产生LFAH12-AtICK1cdsDN-mas3′utr盒(pTG369)。
包含在组成型启动子35S控制下的BnKrp1(F151A；F153A)的植物表达载体以下述方式进行构建。使用相同位点将包含BnKrp1(F151A；F153A)cds的BamHI/XhoI片段克隆到pTG271(35S/TOPOBlunt)内。所得到的构建体(pTG529)使用KpnI和XbaI进行切割。pLAY112用XbaI和HindIII进行切割，和pCGN1547用KpnI和HindIII进行切割，并进行3向连接。这导致产生35S-BnKrp1(F151A；F153A)-mas3utr盒(pTG533)。
卡诺拉油菜(欧洲油菜)的转化
基于Maloney等人(Maloney等人，PlantCellReports8：238，1989)所述的方法，使用土壤杆菌介导的转化方法，用LFAH-12AtKrp1(F173A；F175A)和35-SBnKrp1(F151A；F153A)转基因表达构建体(在这个实施例中也统称为“突变体Krp1转基因表达构建体”)转化双单倍体卡诺拉油菜变种DH12075。
将经灭菌的种子在15×60mm培养皿中在含1％蔗糖的1/2MS(Murashige&Skoog)培养基上萌芽5天，其中约40-约60粒种子/板。对于每个转化构建体使总共约1500粒种子萌芽。种子并未全部浸入萌芽培养基中。萌芽的幼苗在组织培养室中于25℃以16小时光/8小时黑暗循环进行生长。
在顶端分生组织正上方切割子叶，而不获得任何分生组织。这通过用镊子紧在顶端分生组织区上方轻轻夹住2个叶柄来完成。小心不要用镊子压碎叶柄。
使用镊子尖端作为引导，使用解剖刀用锋利的12号刀片切割叶柄。将子叶放到15mm×100mm共同培养基板上。经正确切割的子叶容易地分开。如果不是这样，很可能已获得分生组织，并且不能使用这样的子叶。每块板容纳约20片子叶。每制备几块板后用土壤杆菌接种子叶外植体以避免萎蔫，所述萎蔫对于方案的下述阶段将会具有负面影响。
使用电穿孔将突变体Krp1转基因表达构建体引入根瘤土壤杆菌内。具有突变体Krp1转基因表达构建体的土壤杆菌在含有合适抗生素的AB培养基中于28℃摇动生长2天。为了接种子叶外植体，将少量土壤杆菌培养物加入10mm×35mm培养皿中。将每个外植体的叶柄浸入土壤杆菌培养物中，并且将经切割的末端置于培养皿的共培养基内。板被密封并置于25℃的组织培养室内，16小时光照/8小时黑暗，保持3天。
3天后，将外植体以10个成组地转移到包含出芽诱导培养基的干净的25mm×100mm培养皿中。这种培养基包含选择试剂(20mg/L卡那霉素)和激素(4.5mg/LBA)。只转移看起来健康的外植体。使外植体维持在出芽诱导培养基上14-21天。在这时，可能可以观察到绿色的愈伤组织和可能一些枝条发育和一些非转化芽。非转化芽通过其白色和紫色而可以容易地识别。卡那霉素敏感型的芽通过将其切除来去除，并将所有看起来健康的愈伤组织转移至出芽诱导培养基的新鲜板中。使外植体维持在这些板上另外14-21天。
2-3周后，将颜色为暗绿色的芽转移至包含芽伸长培养基的板上。这种培养基包含选择试剂(20mg/L卡那霉素)但不包含任何激素。将5个芽转移至每块板。板被密封且送回至组织培养室。将看起来玻璃状(vitrious)转化芽转移至包含间苯三酚(150mg/L)的芽伸长培养基中。将变得健康和绿色的芽送回芽伸长培养基板。在某些情况下，需要将玻璃状芽反复转移至相同培养基的新鲜板，以获得看起来正常的芽。
将具有正常形态的芽转移至具有生根培养基的4盎司婴儿食品瓶中，所述生根培养基包含0.5mg/L吲哚丁酸。当将芽转移至瓶时，切除任何过量的愈伤组织。通过约每6周将其转移至包含0.2mg/L吲哚丁酸的新鲜瓶，可以将芽无限地维持在瓶中。
一旦良好根系形成后，从瓶中取出T0代芽，从根中去除琼脂，并将小植株转移至盆栽土中。每个独立的T0小植株代表了转基因插入卡诺拉油菜基因组内的独立发生，且被称为事件。将透明杯置于小植株上数天，允许植物适应新环境。一旦植物变硬后，将杯去除。然后，让T0转基因事件在温室中生长至成熟，并收集T1种子。
T0事件的表征
在每个事件中通过Southern分析来测定转基因插入位点基因座的数目。T0事件中的突变体Krp1转基因表达通过Northern分析或终点RT-PCR来验证。对于胚胎发育中的单个时间点，授粉后19天(DAP)获得突变体Krp1转基因表达数据。从这些数据得出结论，在这个发育时间点时，LFAH12启动子驱动高水平的AtKrp1(F173A；F175A)mRNA。监控叶样品中的35SBnKrp1(F151A；F153A)转基因表达，所述叶样品在许多事件中具有中至高水平表达。表达数据证明，2种启动子在驱动在转基因卡诺拉油菜植物中的突变体Krp1转基因表达之中都起作用。
也可以测量激酶活性，以确定突变体Krp1蛋白表达对内源性细胞周期蛋白-CDK激酶活性的影响。使用p13Sucl树脂(Upstate，Chicago，IL)使来自转基因和非转基因植物组织或细胞的等量蛋白质提取物富含CDK，并如实施例4中或Wang等人(PlantJ.15：501-510，1998)所述进行组蛋白激酶测定法。激酶反应体系通过SDS-PAGE来进行解析，和HHI磷酸化通过PhosphorImager来定量。
关于2种突变体Krp1转基因表达构建体，成功产生了T0植物。测试的构建体包括(a)LFAH12/AtKrp1(F173A；F175A)；(b)35SBnKrp1(F151A；F153A)。
实施例10.体内表达加速了生长/早期萌芽。
本发明的突变体蛋白在转基因植物中的表达将通过提高细胞周期蛋白-CDK激酶活性来发挥其效应。这将对细胞周期具有正面驱动影响，其最终导致器官大小增加。在植物中，使用反向重复法通过抑制内源性Krp基因在胚胎中的表达来减少Krp1表达水平，导致种子大小和作物产量增加。除了对产量的影响，种子大小增加可以导致种子活力增加。更大的种子包含更多量的在萌芽和幼苗生长期间利用的贮藏蛋白质和淀粉储备。这可以导致更早期的萌芽和更快速的早期生长。早期萌芽和早期快速生长是有农艺学上有价值的性状，因为它们导致作物更快速地建立。通过减少对于严苛环境条件的易损性窗以及在建立前可以损害或毁灭作物的可能性，这增加了成功作物的机会。
在转基因卡诺拉油菜植物的温室萌芽幼苗中观察到生长和发育步调增加，所述转基因卡诺拉油菜植物用实施例9中所述的AtKrp1(F173A；F175A)显性失活表达构建体(pTG369)转化。将来自AtKrp1(F173A；F175A)显性失活表达构建体的15个独立转化事件中每一个的24粒种子种植在托盘中的Jiffy泥炭粒状物中，并在温室中萌芽。平行种植来自用野生型KRP1基因转化的15个独立事件中每一个的24粒种子，所述野生型KRP1基因也在LFAH12启动子的控制下。此外，同时种植未转化的亲代DH12075卡诺拉油菜品种，以及用9个无关转基因构建体中任何一个转化的总共135个转基因事件。
生长3周后，将所有幼苗移植至田地以生长至结籽。作为单个地块，将关于每个事件的每组24株幼苗进行种植。移植后，在地块之间在幼苗生长方面很容易地观察到差异。在关于所有转基因构建体的整个幼苗群体中，尺寸从1英寸高到约4-5英寸高不等。发育进展也不同，从只呈现子叶的少数幼苗到具有几片真叶的幼苗。未转化的亲代品种地块落入这个范围中间。转基因地块中的差异是构建体特异性的。包含处于该尺寸和发育范围顶端的幼苗的田地中的大多数地块是，包含用AtKrp1(F173A；F175A)显性失活表达构建体(pTG369)转化的植物的地块。其他构建体没有显示出这种特征，其中大多数地块显示出相当于或少于未转化的亲代品种的生长和发育。这些结果表明，显性失活突变体Krp转基因的表达赋予增加的早期生长率和加速的发育步调。
待监控的其他特征包括例如，发苗/萌芽前持续时间、子叶出现的时间、子叶大小、第一片真叶暴露的时间和第二片真叶暴露。还可以监控转基因和非转基因植物中的莲座直径。还可以监控转基因和非转基因植物之间的其他特征，包括例如芽出现时间和芽柄(budbolt)大小、主要总状花序的最终大小、第一朵花出现的时间、第一个荚出现的时间等。
实施例11.体内表达产生更佳的生根。
卡诺拉油菜种子非常小，需要相对较高的湿度用于萌芽，且必须接近于土壤表面种植以使幼苗活力达到最大。小的种子和浅种植使得该作物易受非生物应激例如土壤干燥和水泛滥的攻击。本发明的突变体多肽在各种启动子控制下普遍存在表达或在根发育中早期表达，将产生加速的根生长和发育。通过比非转基因植物对照更迅速地建立牢固的根基和可能更大的根基，根发育期间增加的细胞分裂将有助于幼苗活力。可以将转基因植物的根系大小与非转基因植物进行比较。
实施例12.在重复田间试验中评估AtKrp1(F173A；F175A)转基因表达在胚胎发育期间对卡诺拉油菜产量的影响。
在这个实施例中，在田间试验中测试包含在LFAH12胚特异性启动子控制下的拟南芥属植物Krp1(F173A；F175A)转基因(pTG369)的转基因卡诺拉油菜植物。
转基因AtKrp1(F173A；F175A)事件对于田间试验的进展。
基于转基因表达和转基因插入基因座数目的组合，就对于田间试验的进展来选择T0事件。具有经验证的转基因表达和单个转基因插入基因座的事件被指定为具有用于向前进行田间测试的最高优先权。在某些情况下，如果多个基因的存在由于基因剂量而产生高的总体转基因表达水平，那么选择具有多个插入基因座的事件。
将来自所选事件的T1种子在田间地块中作为分离T1群体进行生长。每个事件作为2行，24个植物地块进行种植。对于具有单个转基因插入基因座的事件，24个T1植物中的转基因分离将产生约6个缺乏转基因的无效植物、12个杂合植物和6个纯合植物的分布。每个T1植物在开花前分别地装入袋内以防止异型杂交。分开收获来自24个T1植物中每一个的T2种子。
将T2种子贮存物用于鉴定24个亲代T1植物中的哪些是无效的、杂合的或纯合的。在培养皿中使来自每个T1植物的约30粒T2种子在滤纸上萌芽，所述培养皿具有包含抗生素G418(卡那霉素类似物)的溶液。因为用作为选择标记的nptII抗性基因共转化植物，所以只有携带转基因的那些种子会萌芽和继续生长。如果板上的所有种子被证明对G418敏感，那么T1亲代就被鉴定为无效系。如果板上的所有种子对G418有抗性，那么T1亲代就被鉴定为纯合系。如果板上的约四分之一种子敏感和其余有抗性，那么T1亲代就被鉴定为杂合系。将来自源于相同转化事件的纯合T1亲代的T2种子混合在一起，以产生纯合种子贮存物用于田间试验测试。将来自源于相同转化事件的无效T1亲代的T2种子混合在一起，以产生无效同胞种子贮存物用于田间试验测试。
田间试验设计
通过在田间在大规模重复试验中直接比较每个转基因系与其无效同胞来评估AtKrp1(F173A；F175A)转基因对转基因卡诺拉油菜系的产量性状的影响。因为无效同胞起因于T1代中的转基因分离，所以无效和纯合同胞在遗传上几乎是相同的。唯一的显著差异是AtKrp1(F173A；F175A)转基因的存在或不存在。这种接近的遗传同一性使得无效同胞成为用于评估AtKrp1(F173A；F175A)转基因的影响的最佳对照。因为该试验的主要目的是比较来自事件的转基因系与其无效分离子，所以选择分散的地块设计。这种设计产生对于转基因和非转基因分项之间的相互作用、以及事件之间的转基因小地块之间的差异(小地块和主要地块的相互作用)的高水平评估，和对于总体事件或主要地块之间的差异的较低水平评估。
在大草原区中的多个地点上进行田间试验，以在其中通常生长卡诺拉油菜的环境条件范围下评估产量表型。在所有地点上，每个转基因事件与在邻近地块中的其无效同胞物理配对。纯合和无效同胞的每个地块对在每个试验地点上重复4次。每次试验中4个重复地块对的地点在每个试验地点上随机分布。地块是1.6m×6m，并且以约142粒种子/平方米的密度种植。使用对于卡诺拉油菜的商业生产来说典型的标准农艺学实践来使植物生长至成熟。
实施例13.使用胚特异性启动子，在胚胎发育期间，在表达AtKrp1(F173A；F175A)的转基因卡诺拉油菜中产量增加。
每个产量田间试验地点上的所有地块用联合收割机单独地收获。作为来自每个地块的就水份含量经过调整的种子总重量来收集种子总产量数据。对于每次试验中的每个转基因事件，将来自每个纯合系的4个重复地块的总产量平均值与来自相关无效同胞系的4个重复地块的总产量平均值进行比较。这种比较用于评估AtKrp1(F173A；F175A)转基因对于种子总产量的影响。将来自多个试验地点中每一个地点的结果进行组合，以得到AtKrp1(F173A；F175A)转基因对种子总产量的影响的跨试验分析。每个试验地点上的变量统计分析允许对于在纯合转基因系和其无效同胞之间种子总产量的差异指定关于显著性的阈值(P＝0.05)。
显示出种子总产量统计学上显著增加的转基因AtKrp1(F173A；F175A)卡诺拉油菜系概括于表3中。这些结果证明，使用胚特异性启动子(LFAH12)过表达AtKrp1(F173A；F175A)导致种子产量增加。
表3.相对于其无效同胞，纯合AtKrp1(F173A；F175A)植物中的种子总产量的变化。所有值都是统计学上显著的(P＝0.05)
事件 启动子 转基因 产量增加％
TG39-2 LFAH12 AtKrp1(F173A；F175A) 13.0
TG39-26 LFAH12 AtKrp1(F173A；F175A) 18.6
TG39-32 LFAH12 AtKrp1(F173A；F175A) 12.0
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明目的，并且根据其的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的，且应包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的在此整体引入作为参考。

Claims (21)

1.分离的突变体植物KIP相关蛋白(KRP)多肽，其由下述氨基酸序列组成：
相对于野生型植物KRP多肽具有修饰的KRP氨基酸序列，所述野生型KRP多肽包含(a)赋予对于细胞周期蛋白的结合亲和力的细胞周期蛋白结合区域和(b)赋予对于CDK的结合亲和力的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)结合区域；
其中所述修饰在所述CDK结合区域内，以便相对于所述野生型KRP多肽，赋予所述突变体KRP多肽对于所述CDK的经修饰的结合亲和力；
其中相对于所述野生型KRP多肽，所述突变体KRP多肽基本上维持对于所述细胞周期蛋白的结合亲和力；
其中所述突变体KRP多肽可以与所述野生型KRP多肽竞争结合所述CDK；
其中所述修饰在相应于芸苔属植物KRP1(BnKRP1)氨基酸145-168的区域内，并且仅涉及选自下述的位置组合：
(a)相应于BnKRP1氨基酸151的位置和相应于BnKRP1氨基酸153的位置；
(b)相应于BnKRP1氨基酸149的位置、相应于BnKRP1氨基酸151的位置和相应于BnKRP1氨基酸153的位置；
(c)相应于BnKRP1氨基酸164的位置和相应于BnKRP1氨基酸165的位置；和
(d)相应于BnKRP1氨基酸151的位置、相应于BnKRP1氨基酸153的位置、相应于BnKRP1氨基酸164的位置和相应于BnKRP1氨基酸165的位置；
其中所述修饰为氨基酸置换；并且
其中所述BnKRP1由核苷酸序列SEQIDNO：23编码。
2.权利要求1的突变体植物KRP多肽，其中所述野生型KRP多肽是欧洲油菜、拟南芥、大豆、玉米、小麦、稻、苜蓿、棉花、亚麻荠或杨树KRP多肽。
3.权利要求1的突变体植物KRP多肽，其中所述野生型KRP多肽是拟南芥属植物或芸苔属植物KRP1多肽。
4.权利要求1的突变体植物KRP多肽，其中所述氨基酸置换是非丙氨酸至丙氨酸的置换或者是非保守氨基酸置换。
5.权利要求3的突变体植物KRP多肽，其相对于由核苷酸序列SEQIDNO：23编码的野生型BnKRP1多肽而言，是突变体BnKRP1多肽。
6.权利要求5的突变体植物KRP多肽，其是
(1)BnKRP1F151A；F153A，即SEQIDNO：81；
(2)BnKRP1Y149A；F151A；F153A，即SEQIDNO：82；
(3)BnKRP1E164A；W165A，即SEQIDNO：89；或
(4)BnKRP1F151A；F153A；E164A；W165A，即SEQIDNO：85。
7.权利要求3的突变体植物KRP多肽，其是相对于由核苷酸序列SEQIDNO：2编码的野生型AtKRP1多肽而言的突变体AtKRP1多肽，其中所述氨基酸置换是F173A和F175A。
8.重组核酸，其编码权利要求1-7中任一项的突变体KRP多肽。
9.表达载体，其包含复制子和权利要求8的重组核酸。
10.权利要求9的表达载体，其是进一步包含与所述重组核酸可操作地连接的启动子区的表达载体。
11.权利要求10的表达载体，其中所述启动子区在植物细胞中是可操作的。
12.权利要求11的表达载体，其中所述启动子区包含CaMV35S启动子或LFAH12启动子。
13.权利要求10的表达载体，其中所述启动子区以组织和/或器官特异性方式在转录上有活性。
14.宿主细胞，其包含权利要求8的重组核酸。
15.宿主细胞，其包含权利要求9-13中任一项的载体。
16.用于产生突变体KRP多肽的方法，所述方法包括：
在适合于表达编码所述突变体KRP多肽的所述核酸的条件下培养权利要求14或15的宿主细胞。
17.权利要求16的方法，其进一步包括回收所述突变体KRP多肽。
18.用于产生转基因植物细胞的方法，其包括：
将包含编码权利要求1-7中任一项的突变体KRP多肽的转基因的载体引入植物细胞中，其中所述转基因植物细胞为选自欧洲油菜、拟南芥、大豆、玉米、小麦、稻、苜蓿、棉花、杨树和亚麻荠的植物的细胞。
19.用于调节表达野生型KRP多肽的植物细胞中的细胞分裂的方法，所述野生型KRP多肽包含(a)赋予对于细胞周期蛋白的结合亲和力的细胞周期蛋白结合区域和(b)赋予对于CDK的结合亲和力的CDK结合区域，所述方法包括：
在所述细胞内表达权利要求1-7中任一项的突变体KRP多肽；和
允许所述突变体KRP多肽抑制所述植物细胞内的野生型KRP生物活性。
20.权利要求19的方法，其中所述植物细胞来自选自欧洲油菜、拟南芥、大豆、亚麻荠、小麦、稻、棉花、苜蓿、杨树和玉米的植物。
21.用于增加植物产量的方法，其包括：
在所述植物内表达包括权利要求1-7中任一项的KRP的突变体KRP多肽，和
允许所述突变体KRP多肽抑制所述植物内的野生型KRP生物活性，以便增加植物产量。
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