BR122020026837B1

BR122020026837B1 - Método de aumento do rendimento de planta em solo contendo níveis elevados de al3+, método de aumento da tolerância de uma planta

Info

Publication number: BR122020026837B1
Application number: BR122020026837-9A
Authority: BR
Inventors: Julissa Sosa; Wuyi Wang
Original assignee: Ceres, Inc
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2012-11-01
Publication date: 2021-04-13
Also published as: US10557143B2; US20150004302A1; US10472646B2; US20220348948A1; US9938536B2; US20200080103A1; BR112014010546A2; US20180223305A1; BR112014010546B1; WO2013067128A1; BR122020026845B1; US20200087675A1; US20220195451A1; US11254948B2; US11339403B2; US20180223304A1

Abstract

são divulgados métodos e materiais para a modulação da tolerância ao alumínio em plantas. por exemplo, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio são divulgados, bem como os métodos para o uso desses ácidos nucleicos para transformar as células vegetais. também são divulgadas plantas com maior tolerância ao alumínio e os métodos de aumento do rendimento da planta no solo contendo níveis elevados de alumínio.

Description

[0001] Dividido do BR 11 2014 010546 4, depositado em 01 de novembro de 2012.

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[0002] Este pedido reivindica prioridade para Pedido U.S N°. de Série 61/554.788, arquivado em 2 de novembro de 2011, intitulado TRANSGENIC PLANTS HAVING INCREASED TOLERANCE TO ALUMINUM, cuja divulgação está incorporada neste documento para referência.

CAMPO TÉCNICO

[0003] Este documento refere-se a métodos e materiais envolvidos na modulação da tolerância ao estresse abiótico em plantas. Por exemplo, este documento fornece plantas com maior tolerância ao alumínio, materiais e métodos para produzir as plantas com maior tolerância ao alumínio, bem como os métodos de aumento do rendimento da planta no solo, contendo níveis elevados de alumínio.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0004] O material na listagem sequência acompanhante está incorporado por meio deste para referência neste pedido. O arquivo acompanhante, chamado Sequence_Listing_2012-10-30.txt foi criado em 30 de outubro de 2012 e tem 1,69 MB. O arquivo pode ser acessado usando o Microsoft Word em um computador que usa o Windows OS.

FUNDAMENTOS

[0005] O alumínio (Al) é onipresente nos solos e em valores de pH abaixo de 5,0, é solubilizado na solução do solo como espécie Al 3+ altamente fitotóxica, que inibe o crescimento da raiz e danifica os sistemas da raiz (Kochian, 1995, Annu. Rev. Plant Biol. 46: 237-260). Como tal, a toxicidade do alumínio é agravada pela precipitação ácida (por exemplo, chuva ácida). Por exemplo, solos contaminados no Brasil contêm alumínio em quantidades que variam de 11 a 124g/Kg de solo. Outra restrição em solos ácidos é a deficiência de fósforo (P), que é causada pela fixação de P com óxidos de Al e Fe na superfície dos minerais de argila nos solos ácidos. Vide Sanchez et al. 1997. In: Replenishing Soil Fertility in Africa, ed. R Buresh, P Sanchez, F Calhoun, pp. 1-46). O dano à raiz reduz a absorção de água e nutrientes e, assim, a produtividade das colheitas. Um baixo pH do solo tem sido documentado reduzir o rendimento em quase 25% das terras do mundo, atualmente em produção. Vide, Wood, et al. (2000) in Pilot Analysis of Global Ecosystems: Agroecosystems (Int. Food Policy Res, Inst. And World Resources Inst., Washington, DC), pp 45-54). Assim, há uma necessidade de fornecer os métodos e materiais para aumentar a tolerância ao alumínio nas plantas.

SUMÁRIO

[0006] Este documento fornece métodos e materiais relacionados a plantas com maior tolerância ao alumínio (Al3+). Por exemplo, este documento fornece plantas transgênicas e células vegetais tendo maior tolerância ao alumínio, ácidos nucleicos usados para gerar plantas transgênicas e células vegetais tendo maior tolerância ao alumínio, métodos para a produção de plantas tendo maior tolerância ao alumínio, e métodos para a produção de células vegetais que podem ser usadas para gerar plantas tendo maior tolerância ao alumínio. Tais plantas e células vegetais podem ser cultivadas em solos ácidos que contém níveis elevados de Al3+, resultando em maior rendimento nesses solos.

[0007] Em um aspecto, este documento apresenta um método de aumentar o rendimento da planta no solo contendo níveis elevados de Al3+. O método inclui o cultivo de uma planta, que compreende um ácido nucleico exógeno, no solo tendo um nível elevado de Al3+, em que o rendimento da planta é aumentado em comparação com o rendimento correspondente de uma planta controle que não compreende o referido ácido nucleico.

[0008] Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno inclui uma região reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a pontuação de bit de HMM da sequência de aminoácidos do polipeptídeo é maior que cerca de 65, o HMM baseado nas sequências de aminoácidos representadas em qualquer uma das Figuras 1-4.

[0009] Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno inclui uma região reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo tendo 90 por cento ou maior identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 246, 248, 250, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 353, 355, 357, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 535, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 558, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 579, 580, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717,0 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772.

[0010] Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno inclui uma região reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos com 90 por cento ou maior identidade de sequência à sequência de nucleotídeos estabelecida nas SEQ ID NOs: 1, 6 , 16, 18, 21, 23, 25, 27, 30, 34, 37, 39, 46, 51, 53, 60, 62, 68, 71 , 74 , 76, 80, 92, 95, 101, 112, 114, 116, 118, 123, 128, 130, 133, 135, 139, 141, 143, 145, 157, 161, 165, 168, 170, 189, 196, 204, 206, 208, 210, 222, 226, 236, 238, 240, 242, 244, 247, 249, 252, 254, 256, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 275, 277, 279, 282, 286, 289, 291, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 330, 332, 334, 336, 340, 352, 354, 356, 359, 361, 363, 365, 367, 370, 372, 374, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 394, 403, 406, 408, 410, 412, 415, 417, 419, 422, 427, 430, 448, 450, 452, 455, 464, 466, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 536, 538, 541, 543, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 559, 561, 563, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 659, 661, 663, 665, 667, 678, 680, 682, 684, 688, 690, 692, 694, 697, 700, 708, 720, 741, 743, 748, 751, 756, 758, e 763.

[0011] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, a sequência de nucleotídeos pode codificar um polipeptídeo com 95 por cento ou maior identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 246, 248, 250, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 353, 355, 357, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461 462, 463, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528 530, 532, 534, 535, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551 553, 555, 557, 558, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578 579, 580, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601 603, 605, 607, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772.

[0012] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, a sequência de nucleotídeos pode codificar um polipeptídeo tendo 98 por cento ou maior identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 180, 181, 194, 195, 212, 213, 227, 228, 245, 246, 267, 269, 288, 290, 312, 314, 337, 338, 351, 353, 375, 376, 395, 396, 413, 414, 432, 433, 445, 446, 462, 463, 478, 480, 504, 506, 530, 532, 553, 555, 579, 580, 603, 605, 627, 629, 651, 652, 669, 670, 686, 687, 705, 706, 719, 721, 167, 169, 182, 183, 197, 198, 214, 215, 229, 230, 248, 250, 271, 273, 292, 293, 316, 318, 339, 341, 355, 357, 377, 378, 397, 398, 416, 418, 434, 435, 447, 449, 465, 467, 482, 484, 508, 510, 534, 535, 557, 558, 581, 583, 607, 608, 631, 633, 653, 654, 671, 672, 689, 691, 707, 709, 722, 723, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 239, 241, 243, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772.

[0013] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, a sequência de nucleotídeos pode ter 95 por cento ou maior (por exemplo, 98 por cento ou 99 por cento ou mais) sequência de identidade à sequência de nucleotídeos estabelecida nas SEQ ID NOs: 1, 6, 16, 18, 21, 23, 25, 27, 30, 34, 37, 39, 46, 51, 53, 60, 62, 68, 71, 74, 76, 80, 92, 95, 101, 112, 114, 116, 118, 123, 128, 130, 133, 135, 139, 141, 143, 145, 157, 161, 165, 168, 170, 189, 196, 204, 206, 208, 210, 222, 226, 236, 238, 240, 242, 244, 247, 249, 252, 254, 256, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 275, 277, 279, 282, 286, 289, 291, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 330, 332, 334, 336, 340, 352, 354, 356, 359, 361, 363, 365, 367, 370, 372, 374, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 394, 403, 406, 408, 410, 412, 415, 417, 419, 422, 427, 430, 448, 450, 452, 455, 464, 466, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 536, 538, 541, 543, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 559, 561, 563, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 659, 661, 663, 665, 667, 678, 680, 682, 684, 688, 690, 692, 694, 697, 700, 708, 720, 741, 743, 748, 751, 756, 758, e 763.

[0014] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, a sequência de nucleotídeos pode codificar o polipeptídeo estabelecido nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59 61, 63, 64, 65 66 , 67, 69, 70 72 , 73, 75, 77 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90 91, 93, 94, 96 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 246, 248, 250, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 353, 355, 357, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 535, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 558, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 579, 580, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772.

[0015] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, o método pode incluir ainda a colheita da biomassa a partir da planta.

[0016] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, a região reguladora pode ser um promotor. Por exemplo, o promotor pode ser selecionado do grupo consistindo em YP0092, PT0676, PT0708, PT0613, PT0672, PT0678, PT0688, PT0837, o promotor da napina, o promotor da Arcelina-5, o promotor do gene da faseolina, o promotor do inibidor da tripsina de soja, o promotor da ACP, o promotor do gene da estearoil-ACP desaturase, o promotor da subunidade α' da β-conglicinina de soja, o promotor da oleosina, o promotor da zeína de 15 kD, o promotor da zeína de 16 kD, o promotor da zeína de 19 kD, o promotor da zeína de 22 kD, o promotor da zeína de 27 kD, o promotor da Osgt-1, o promotor do gene da beta-amilase, o promotor do gene da hordeína da cevada, p326, YP0144, YP190, pl3879, YP0050, p32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, o promotor 35S do vírus do mosaico (CaMV) da couve-flor, o promotor da manopina sintase (MAS), o promotor 1' ou 2' derivado do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor 34S do vírus do mosaico da escrofulária, promotor da actina do arroz, promotor da ubiquitina-1 do milho, promotor da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (Rbcs), o promotor da cab6 do pinho, o promotor do gene da Cab-1 do trigo, o promotor da CAB-1 do espinafre, o promotor da cab1R do arroz, o promotor da piruvato ortofosfato diquinase (PPDK) do milho, o promotor da Lhcb1*2 do tabaco, o promotor do simportador da SUC2 sacarose-H+ da Arabidopsis thaliana, e um promotor da proteína de membrana do tilacoide do espinafre, e PT0585.

[0017] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, a planta que contêm o ácido nucleico exógeno pode ter uma taxa de crescimento aumentada em relação a uma planta correspondente que não contém o ácido nucleico.

[0018] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, a planta que contém o ácido nucleico exógeno pode ter um crescimento vegetativo aumentado em relação a uma planta correspondente que não contém o ácido nucleico.

[0019] Este documento também apresenta um método de aumentar a tolerância de uma planta a níveis elevados de alumínio. O método inclui a introdução em uma pluralidade de células vegetais de um ácido nucleico isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com 90 por cento ou maior identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 65, 66, 67 69, 70, 72, 73 75, 77, 78, 79 81, 82, 83, 84 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 98 99, 105, 106, 107, 122, 124, 125, 142, 144, 146, 158, 159, 160, 175, 176, 177, 188, 190, 191, 203, 205, 207, 220, 221, 223, 235, 237, 239, 258, 259, 261, 281, 283, 284, 302, 304, 306, 328, 329, 331, 346, 347, 348, 366, 368, 369, 386, 388, 390, 404, 405, 407, 425, 426, 428, 440, 441, 442, 457, 458, 459, 472, 473, 474, 494, 496, 498, 520, 522, 524, 544, 545, 547, 570, 572, 574, 593, 595, 597, 618, 620, 622, 643, 645, 647, 660, 662, 664, 108, 109, 110, 126, 127, 129, 147, 148, 149, 162, 163, 164, 178, 179, 180, 192, 193, 194, 209, 211, 212, 224, 225, 227, 241, 243, 245, 263, 265, 267, 285, 287, 288, 308, 310, 312, 333, 335, 337, 349, 350, 351, 371, 373, 375, 392, 393, 395, 409, 411, 413, 429, 431, 432, 443, 444, 445, 460, 461, 462, 475, 476, 478, 500, 502, 504, 526, 528, 530, 549, 551, 553, 576, 578, 579, 599, 601, 603, 624, 625, 627, 649, 650, 651, 666, 668, 669, 111, 113, 115, 131, 132, 134, 150, 151, 152, 166, 167, 169, 181, 182, 183, 195, 197, 198, 213, 214, 215, 228, 229, 230, 246, 248, 250, 269, 271, 273, 290, 292, 293, 314, 316, 318, 338, 339, 341, 353, 355, 357, 376, 377, 378, 396, 397, 398, 414, 416, 418, 433, 434, 435, 446, 447, 449, 463, 465, 467, 480, 482, 484, 506, 508, 510, 532, 534, 535, 555, 557, 558, 580, 581, 583, 605, 607, 608, 629, 631, 633, 652, 653, 654, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755 , 757 , 759 , 760 , 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772; produzindo uma planta a partir de uma célula vegetal; e cultivando a planta no solo com um nível elevado de Al3+, em que a plant a tem maior rendimento, em comparação àquele da planta controle que não compreende o ácido nucleico. A sequência do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo pode estar operacionalmente ligada a uma região reguladora.

[0020] Este documento também apresenta um método de aumentar a tolerância de uma planta a níveis elevados de alumínio. O método inclui a introdução em uma pluralidade de células vegetais de um ácido nucleico isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com 90 por cento ou maior identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 246, 248, 250, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 353, 355, 357, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 535, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 558, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 579, 580, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769,770, 771, e 772; e selecionando uma planta produzida a partir da pluralidade de células vegetais que tem uma maior tolerância ao Al3+ elevado, em comparação com a tolerância numa planta controle correspondente que não compreende o ácido nucleico isolado. A sequência do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo pode estar operacionalmente ligada a uma região reguladora.

[0021] Este documento também apresenta uma célula vegetal que contém um ácido nucleico exógeno, o ácido nucleico exógeno compreendendo uma região reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a pontuação de bit de HMM da sequência de aminoácidos do polipeptídeo é maior que cerca de 65, o HMM baseado na sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das Figuras 1-4, e em que uma planta produzida a partir da célula vegetal é tolerante aos níveis elevados de Al3+ do solo, em comparação com aquele de uma planta controle que não compreende o ácido nucleico, e em que a planta não é tolerante aos níveis elevados de salina.

[0022] Este documento também apresenta uma célula vegetal que contém um ácido nucleico exógeno, o ácido nucleico exógeno compreendendo uma região reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com 90 por cento ou maior identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 129, 131, 149, 150, 164, 166, 180, 181, 194, 195, 212, 213, 227, 228, 245, 246, 267, 269, 288, 290, 312, 314, 337, 338, 351, 353, 375, 376, 395, 396, 413, 414, 432, 433, 445, 446, 462, 463, 478, 480, 504, 506, 530, 532, 553, 555, 579, 580, 603, 605, 627, 629, 651, 652, 113, 115, 132, 134, 151, 152, 167, 169, 182, 183, 197, 198, 214, 215, 229, 230, 248, 250, 271, 273, 292, 293, 316, 318, 339, 341, 355, 357, 377, 378, 397, 398, 416, 418, 434, 435, 447, 449, 465, 467, 482, 484, 508, 510, 534, 535, 557, 558, 581, 583, 607, 608, 631, 633, 653, 654, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 239, 241, 243, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772, e em que uma planta produzida a partir da célula vegetal é tolerante aos níveis elevados de Al3+ do solo, em comparação com aquele de uma planta controle que não compreende o ácido nucleico, e em que a planta não é tolerante aos níveis elevados de salina.

[0023] Este documento também apresenta uma planta transgênica compreendendo uma célula vegetal descrita neste documento, a progênie das plantas que têm maior tolerância às condições de Al3+ elevado, em comparação àquelas de uma planta controle que não compreende o ácido nucleico, e em que a progênie não é tolerante com os níveis elevados de salina, sementes das plantas transgênicas, e tecido vegetativo das plantas transgênicas, bem como alimentos e produtos alimentares que incluem o tecido vegetativo. A planta pode ser selecionada do grupo consistindo em Panicum virgatum, Sorghum bicolor, Miscanthus giganteus, Saccharum sp., Populus balsamifera, Zea mays, Glycine max, Brassica napus, Triticum aestivum, Gossypium hirsutum, Oryza sativa, Helianthus annuus, Medicago sativa, Beta vulgaris, ou Pennisetum glaucum.

[0024] A menos que definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por um versado na técnica ao qual pertence esta invenção. Apesar dos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos neste documento poderem ser usados para a prática da invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas para referência em suas totalidades. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo as definições, irá prevalecer. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser um fator limitante.

[0025] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção estão estabelecidos nos desenhos acompanhantes e a descrição abaixo. Outros recursos, objetos e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações. A palavra "compreendendo" nas reivindicações pode ser substituída por "consistindo essencialmente em" ou por "consistindo em", de acordo com a prática padrão na legislação de patentes.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] As Figuras 1A-1D contêm um alinhamento da sequência de aminoácidos de CeresClone: 375578 (SEQ ID NO: 353) com sequências de aminoácidos homólogas e/ou ortólogas. Em todas as figuras de alinhamento mostradas neste documento, um traço em uma sequência alinhada representa uma lacuna, isto é, a falta de um aminoácido naquela posição. Aminoácidos idênticos ou substituições de aminoácidos conservados entre as sequências alinhadas são identificadas por caixas. A Figura 1 e as outras figuras de alinhamento fornecidas neste documento foram geradas usando o programa MUSCLE versão 3.52.

[0027] As Figuras 2A-2C contêm um alinhamento da sequência de aminoácidos de CeresClone: 11684 (SEQ ID NO: 237) com sequências de aminoácidos homólogas e/ou ortólogas.

[0028] As Figuras 3A-3C contêm um alinhamento da sequência de aminoácidos de CeresClone: 24255 (SEQ ID NO: 451) com sequências de aminoácidos homólogas e/ou ortólogas.

[0029] As Figuras 4A-4G contêm um alinhamento da sequência de aminoácidos de CeresClone: 1752915 (SEQ ID NO: 2) com sequências de aminoácidos homólogas e/ou ortólogas.

[0030] A Figura 5 é um gráfico de barras do peso total da planta (brotos mais raízes) dos controles do tipo selvagem (WT) ou da switchgrass transgênica (Ceres Clone 375578) tratada com pH 7,26 da água (pH7); pH 4,0 da água (pH4); ou pH 4,0 da água com alumínio (~11 g AlCl3/Kg de solo; -0, 00621 μM Al+3) (AlpH4). A toxicidade do alumínio não teve pouco ou nenhum efeito sobre o peso da planta das plantas transgênicas em comparação com o controle.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0031] A invenção apresenta métodos e materiais relacionados à modulação da tolerância ao alumínio em plantas. Em algumas modalidades, as plantas também podem ter, por exemplo, níveis modulados de lignina, arquitetura da raiz modificada, resistência a herbicida modificada, biossíntese de carotenoides modificada ou conteúdo da parede celular modulado. Os métodos descritos neste documento podem incluir a transformação de uma célula vegetal com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de modulação da tolerância ao alumínio, em que a expressão do polipeptídeo resulta em um nível modulado de tolerância ao alumínio. As células vegetais produzidas usando esses métodos podem ser cultivadas para produzir plantas com uma maior tolerância aos níveis elevados de alumínio. Tais plantas podem ter um maior rendimento da planta no solo contendo níveis elevados de Al3+. I. Definições:

[0032] "Aminoácido" refere-se a um dos vinte aminoácidos de ocorrência biológica e aos aminoácidos sintéticos, incluindo isômeros ópticos D/L.

[0033] "Promotor preferencial de tipo de célula" ou "promotor preferencial de tecido" refere-se a um promotor que conduz a expressão preferencialmente em um tipo de célula ou tecido alvo, respectivamente, mas também pode levar a uma transcrição em outros tipos de células ou tecidos também.

[0034] "Planta controle" refere-se a uma planta que não contém o ácido nucleico exógeno presente numa planta transgênica de interesse, mas, por outro lado, tem o fundo genético igual ou semelhante, tal como uma planta transgênica. Uma planta controle adequada pode ser uma planta do tipo selvagem não transgênica, um segregante não transgênico de um experimento de transformação, ou uma planta transgênica que contém um ácido nucleico exógeno diferente do ácido nucleico exógeno de interesse.

[0035] "Domínios" são grupos de aminoácidos substancialmente contíguos em um polipeptídeo que podem ser usados para caracterizar as famílias de proteínas e/ou partes das proteínas. Tais domínios têm uma "impressão digital" ou "assinatura" que pode compreender a sequência primária conservada, estrutura secundária e/ou conformação tridimensional. Geralmente, os domínios estão correlacionados com atividades específicas in vitro e/ou in vivo. Um domínio pode ter um comprimento de 10 aminoácidos a 400 aminoácidos, por exemplo, 10 a 50 aminoácidos, ou 25 a 100 aminoácidos, ou 35 a 65 aminoácidos, ou 35 a 55 aminoácidos, ou 45 a 60 aminoácidos, ou 200 a 300 aminoácidos, ou 300 a 400 aminoácidos.

[0036] "Regulação negativa" refere-se à regulação que diminui a produção dos produtos de expressão (mRNA, polipeptídeo ou ambos) em relação ao estado basal ou nativo.

[0037] "Exógeno", em relação a um ácido nucleico, indica que o ácido nucleico é parte de um construto de ácidos nucleico recombinante, ou não está no seu ambiente natural. Por exemplo, um ácido nucleico exógeno pode ser uma sequência de uma espécie introduzida uma outra espécie, isto é, um ácido nucleico heterólogo. Normalmente, esse ácido nucleico exógeno é introduzido nas outra espécie através de um construto de ácidos nucleico recombinante. Um ácido nucleico exógeno também pode ser uma sequência que é nativa para um organismo e que foi reintroduzida nas células desse organismo. Um ácido nucleico exógeno que inclui uma sequência nativa pode, muitas vezes, ser distinguida da sequência de ocorrência natural pela presença de sequências não naturais ligada ao ácido nucleico exógeno, por exemplo, sequências reguladoras não nativas flanqueiam uma sequência nativa em um construto de ácido nucleico recombinante. Além disso, os ácidos nucleicos exógenos estáveis transformados normalmente estão integrados em posições diferentes da posição onde a sequência nativa é encontrada. Será apreciado que um ácido nucleico exógeno pode ter sido introduzido em um progenitor e não na célula sob consideração. Por exemplo, uma planta transgênica que contém um ácido nucleico exógeno pode ser a progênie de um cruzamento entre uma planta estável transformada e uma planta não transgênica. Essa progênie é considerada como contendo o ácido nucleico exógeno.

[0038] "Expressão" refere-se ao processo de conversão da informação genética de um polinucleotídeo em RNA através da transcrição, que é catalisado por uma enzima, a RNA polimerase, e em proteína, através da tradução do mRNA nos ribossomas.

[0039] "Polipeptídeo heterólogo", conforme usado neste documento, refere-se a um polipeptídeo que não é um polipeptídeo de ocorrência natural em uma célula vegetal, por exemplo, uma planta de Panicum virgatum transgênica transformada e expressando a sequência codificadora para um polipeptídeo transportador de nitrogênio a partir de uma planta de Zea mays.

[0040] "Ácido nucleico isolado", conforme usado neste documento, inclui um ácido nucleico de ocorrência natural, desde que uma ou ambas as sequências que flanqueiam imediatamente esse ácido nucleico em seu genoma de ocorrência natural seja removida ou esteja ausente. Assim, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, um ácido nucleico que existe como uma molécula purificada ou uma molécula de ácido nucleico que é incorporada em um vetor ou um vírus. Um ácido nucleico existente entre as centenas a milhões de outros ácidos nucleicos dentro, por exemplo, de bibliotecas de cDNA, bibliotecas genômicas ou fatias de gel contendo uma digestão de restrição de DNA genômico, não deve ser considerado um ácido nucleico isolado.

[0041] "Modulação" do nível de tolerância ao alumínio refere- se à alteração do nível da tolerância ao alumínio que é observada como um resultado da expressão, ou transcrição, de um ácido nucleico exógeno em uma célula vegetal e/ou planta. A alteração de nível é medida em relação ao nível correspondente em plantas controle. A tolerância ao alumínio pode ser avaliada pela medição do crescimento da raiz e/ou da altura da planta de plantas cultivadas em solos acidificados contendo níveis elevados de Al3+. A concentração de Al3+ considerada como sendo elevada pode ser ajustada, dependendo da espécie sendo testada, uma vez que espécies de plantas variam em sua capacidade de tolerar o alumínio. Por exemplo, o arroz é mais tolerante ao alumínio do que o sorgo. Como tal, para determinar a tolerância maior ao alumínio no arroz, as concentrações superiores a 160 μM Al3+ podem ser usadas. No sorgo, as concentrações de cerca de 27 μM Al3+ podem ser usadas. Para a switchgrass, as concentrações de cerca de 600 μM podem ser usadas.

[0042] "Ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados permutavelmente neste documento e se referem ao RNA e ao DNA, incluindo o cDNA, DNA genômico, DNA sintético, e DNA ou RNA contendo os análogos de ácido nucleico. Um ácido nucleico pode ser de fita dupla ou de fita única (isto é, uma fita sense ou uma fita antisense). Exemplos não limitantes de polinucleotídeos incluem genes, fragmentos de gene, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA transportador, RNA ribossômico, siRNA, micro-RNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, sondas de ácido nucleico e iniciadores de ácido nucleico. Um polinucleotídeo pode conter nucleotídeos não convencionais ou modificados.

[0043] "operacionalmente ligado" refere-se ao posicionamento de uma região reguladora e uma sequência a ser transcrita num ácido nucleico para que a região reguladora seja eficaz na regulação da transcrição ou tradução da sequência. Por exemplo, para ligar operacionalmente uma sequência codificadora e uma região reguladora, o sítio de iniciação da tradução do quadro de leitura traducional da sequência codificadora é normalmente posicionado entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante da região reguladora. Uma região reguladora pode, no entanto, ser posicionada tanto quanto cerca de 5.000 nucleotídeos a montante do sítio de iniciação da tradução, ou cerca de 2.000 nucleotídeos a montante do sítio de início da transcrição.

[0044] "Polipeptídeo", conforme usado neste documento, refere-se a um composto de dois ou mais aminoácidos de subunidade, análogos de aminoácidos, ou outros peptidomiméticos, independentemente da modificação pós-traducional, por exemplo, a fosforilação ou glicosilação. As subunidades podem estar ligadas por ligações peptídicas ou outras ligações, tais como, por exemplo, ligações éster ou éter. Polipeptídeos de comprimento total, polipeptídeos truncados, mutantes pontuais, mutantes de inserção, variantes de splice, proteínas quiméricas e os fragmentos dos mesmos são englobados por esta definição.

[0045] "Progênie" inclui os descendentes de uma planta ou linhagem de planta específica. A progênie de uma planta do momento inclui sementes formadas em F1, F2, F3, F4, F5, F6 e plantas de geração subsequente, ou sementes formadas sobre BC1, BC2, BC3, e plantas de geração subsequente, ou sementes formadas sobre F1BC1, F1BC2, F1BC3, e plantas de geração subsequente. A designação F1 refere-se à progênie de um cruzamento entre dois pais que são geneticamente distintos. As designações F2, F3, F4, F5 e F6 referem-se a gerações subsequentes de progênie auto ou sib-polinizada de uma planta F1.

[0046] "Região reguladora" refere-se a um ácido nucleico tendo sequências nucleotídicas que influenciam a iniciação e a taxa da transcrição ou da tradução, e estabilidade e/ou mobilidade de um produto da transcrição ou da tradução. As regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências de potenciador, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteína, elementos induzíveis, sequências de ligação de proteína, regiões não traduzidas (UTRs) 5' e 3' , sítios de início da transcrição, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, íntrons, e combinações dos mesmos. Uma região reguladora normalmente compreende pelo menos um promotor de núcleo (basal). Uma região reguladora também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência de potenciador, um elemento a montante ou uma região de ativação a montante (UAR). Por exemplo, um potenciador adequado é um elemento cis-regulatório (-212 a -154) da região a montante do gene da octopina sintase (ocs). Fromm et al, The Plant Cell, 1 :977-984 (1989).

[0047] "Regulação positiva" refere-se à regulação que aumenta o nível de um produto de expressão (mRNA, polipeptídeo ou ambos) em relação ao estado basal ou nativo.

[0048] "Vetor" refere-se a um replicon, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, no qual outro segmento de DNA pode ser inserido de modo a realizar a replicação do segmento inserido. Geralmente, um vetor é capaz de replicação quando associado aos elementos de controle apropriados. O termo "vetor" inclui vetores de clonagem e de expressão, bem como vetores virais e vetores de integração. Um "vetor de expressão" é um vetor que inclui uma região reguladora. II. Polipeptídeos

[0049] Os polipeptídeos descritos neste documento incluem polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio. Os polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio podem ser eficazes para modular (por exemplo, aumentar) a tolerância ao alumínio quando expressos numa planta ou célula vegetal. Esses polipeptídeos normalmente contêm pelo menos um domínio indicativo dos polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio, conforme descrito em mais detalhes neste documento. Os polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio normalmente têm uma pontuação de bit de HMM que é superior a 65, conforme descrito em mais detalhes neste documento. Em algumas modalidades, os polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio têm mais que 80% de identidade às SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 246, 248, 250, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312 , 314 , 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 353, 355, 357, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 535, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 558, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 579, 580, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767 , 768 , 769 , 770 , 771, ou 772, conforme descrito em mais detalhes neste documento. A. Domínios Indicativos de Polipeptídeos Moduladores da Tolerância ao Alumínio

[0050] Um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode conter um domínio NAC, que está previsto para ser característico de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio. A SEQ ID NO: 2 estabelece a sequência de aminoácidos de um clone de Panicum virgatum, identificado neste documento como CeresClone: 1752915 (SEQ ID NO: l), que é prevista para conter um domínio da proteína NAC. Por exemplo, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode compreender um domínio da proteína NAC tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100%) identidade de sequência aos resíduos 14 a 139 da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode compreender um domínio da proteína NAC tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100%) identidade de sequência ao domínio da proteína NAC de um ou mais dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, e 235. Os domínios da proteína NAC desses sequências estão estabelecidos na Listagem de Sequência. O domínio NAC (cerca de 160 aminoácidos) foi identificado a partir do domínio da proteína do meristema apical No (NAM), ATF1-2 e CUC2 (Cotilédone em Forma de Taça). Vide Ooka et al. 2003, DNA Res. 20: 239-247; Fang et al. 2008, Mol. Genet. Genomics 280: 547-563). O domínio da proteína NAM é característico das proteínas de desenvolvimento da planta. As proteínas NAM têm um papel na determinação das posições dos meristemas e primordiais. As mutações na NAM resultam na falha em desenvolver um meristema apical de crescimento em embriões de petúnia. Vide, por exemplo, Souer, et al., Cell 85: 159-170 (1996).

[0051] Um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode conter um domínio de dedo de zinco semelhante a AN1 e um domínio de dedo de zinco semelhante a A20, que são previstos para serem característicos de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio. Por exemplo, a SEQ ID NO: 237 estabelece a sequência de aminoácidos de um clone de Arabidopsis thaliana, identificado neste documento como CeresClone: 11684 (SEQ ID NO: 236), que é previsto para conter os domínios de dedo de zinco semelhante a AN1 e semelhante a A20. Por exemplo, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode compreender um domínio de dedo de zinco semelhante a AN1 tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100%) identidade de sequência aos resíduos 101 a 140 da SEQ ID NO: 237 e pode compreender um domínio de dedo de zinco semelhante a A20 tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100%) identidade de sequência aos resíduos 25 a 47 da SEQ ID NO: 237. Em algumas modalidades, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode compreender um domínio de dedo de zinco semelhante a AN1 e um domínio de dedo de zinco semelhante a A20 tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100%) identidade de sequência aos domínios de dedo de zinco semelhante a AN1 e semelhante a A20 de um ou mais polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 239, 241, 243, 245, 246, 248, 250, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, e 351. Os domínios de dedo de zinco semelhante a AN1 e semelhante a A20 dessas sequências estão estabelecidos na Listagem de Sequência. O domínio de dedo de zinco semelhante a AN1 é um dobramento alfa/beta ligado a um dimetal (zinco), com seis cisteínas conservadas e duas histidinas que podem coordenar 2 átomos de zinco. O domínio de dedo de zinco semelhante a A20 pode ser um domínio de ligação da ubiquitina que medeia uma auto-associação. As proteínas associadas ao estresse (SAPs) podem ter um domínio de dedo de zinco semelhante a AN1 e um domínio de dedo de zinco semelhante a A20. Vide, por exemplo, Vij and Tyag, Mol Genet Genomics, 276(6):565-75 (2006).

[0052] A SEQ ID NO: 451 estabelece a sequência de aminoácidos de um clone de Arabidopsis thaliana, identificado neste documento como CeresClone: 24255 (SEQ ID NO: 450), que também é previsto para conter os domínios de dedo de zinco semelhante a AN1 e semelhante a A20. Por exemplo, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode compreender um domínio de dedo de zinco semelhante a AN1 tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100%) identidade de sequência aos resíduos 102 a 141 da SEQ ID NO: 451 e pode compreender um domínio de dedo de zinco semelhante a A20 tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100%) identidade de sequência aos resíduos 14 a 36 da SEQ ID NO: 451.

[0053] Em algumas modalidades, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode compreender um domínio de dedo de zinco semelhante a AN1 e um domínio de dedo de zinco semelhante A20 tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, ou 100%) identidade de sequência aos domínios de dedo de zinco semelhante a AN1 e semelhante a A20 de um ou mais dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 467, 468, 469 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 535, 537, 539 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 558 ,560, 562 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 579, 580, 581, 583, 585, 587 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 612 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656,657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772.

[0054] Um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode conter um domínio IQ, que está previsto para ser característico de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio. A SEQ ID NO: 353 estabelece a sequência de aminoácidos de um clone de Zea mays, identificado neste documento como CeresClone: 375578 (SEQ ID NO: 352), que é previsto para conter um domínio de IQ. Por exemplo, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode compreender um domínio IQ tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100%) identidade de sequência aos resíduos 139 a 157 da SEQ ID NO: 353. Em algumas modalidades, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode compreender um domínio IQ tendo 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100%) identidade de sequência ao domínio IQ de um ou mais dos polipeptídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 355, 357, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, e 449. O domínio IQ é um consenso para a ligação independente de cálcio da calmodulina, que é um sensor de cálcio e ajuda a regular os eventos através de sua interação com um grupo diverso de proteínas celulares. Vide Rhoads and Friedberg, FASEB J., 11(5):331-40 (1997).

[0055] Em algumas modalidades, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio é truncado na extremidade do terminal amino ou carbóxi de um polipeptídeo de ocorrência natural. Um polipeptídeo truncado pode reter determinados domínios do polipeptídeo de ocorrência natural enquanto faltam outros. Assim, as variantes de comprimento que são até 5 aminoácidos mais curtas ou mais longas normalmente exibem a atividade moduladora da tolerância ao alumínio de um polipeptídeo truncado. Em algumas modalidades, um polipeptídeo truncado é um polipeptídeo negativo dominante.

[0056] A expressão numa planta desse polipeptídeo truncado confere uma diferença no nível da tolerância ao alumínio de uma planta, em comparação ao nível correspondente de uma planta controle que não compreende o truncamento. B. Homólogos Funcionais Identificados pelo BLAST Recíproco

[0057] Em algumas modalidades, um ou mais homólogos funcionais de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio de referência definido por uma ou mais das descrições de Pfam indicada acima é adequado para uso como polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio. Um homólogo funcional é um polipeptídeo que tem similaridade de sequência a um polipeptídeo de referência, e que realiza uma ou mais das funções bioquímicas ou fisiológicas do polipeptídeo de referência. Um homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser polipeptídeos de ocorrência natural, e a similaridade de sequência pode ser devida a eventos evolutivos convergentes ou divergentes. Como tal, os homólogos funcionais são às vezes designados na literatura como homólogos, ou ortólogos ou parálogos. As variantes de um homólogo funcional de ocorrência natural, tal como polipeptídeos codificados por mutantes de uma sequência codificadora do tipo selvagem, podem, eles mesmos, ser homólogos funcionais. Os homólogos funcionais também podem ser criados através de mutagênese sítio-dirigida da sequência codificadora para um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, ou por combinação dos domínios a partir das sequências codificadoras para os diferentes polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio de ocorrência natural ("troca de domínio"). O termo "homólogo funcional" é, às vezes, aplicado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente homólogo.

[0058] Os homólogos funcionais podem ser identificados pela análise do nucleotídeo e dos alinhamentos de sequência do polipeptídeo. Por exemplo, a execução de uma consulta em um banco de dados das sequências de nucleotídeos ou do polipeptídeo pode identificar homólogos de polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio. A análise da sequência pode envolver o BLAST, BLAST Recíproco, ou análise por PSI-BLAST de banco de dados não redundantes que usam uma sequência de aminoácidos do polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio como a sequência de referência. A sequência de aminoácidos é, em alguns casos, deduzida a partir da sequência nucleotídica. Esses polipeptídeos no banco de dados que têm mais de 40% de identidade de sequência são candidatos para avaliação adicional para adequação como um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio. A similaridade da sequência de aminoácidos permite substituições de aminoácidos conservativas, tais como a substituição de um resíduo hidrofóbico por outro ou a substituição de um resíduo polar por outro. Se desejado, uma inspeção manual desses candidatos pode ser realizada a fim de reduzir o número de candidatos a ser avaliada posteriormente. A inspeção manual pode ser executada selecionando aqueles candidatos que parecem ter domínios presentes em polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio, por exemplo, domínios funcionais conservados.

[0059] As regiões conservadas podem ser identificadas através da localização de uma região dentro da sequência primária de aminoácidos de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, que é uma sequência repetida, que forma uma estrutura secundária (por exemplo, hélices e folhas beta), que estabelece os domínios carregados positiva ou negativamente, ou que representa um motivo de proteína ou domínio. Vide, por exemplo, o website da Pfam que descreve as sequências consenso para uma variedade de motivos de proteína e domínios na World Wide Web em sanger.ac.uk/Software/Pfam/ and pfam.janelia.org/. Uma descrição das informações incluídas no banco de dados de Pfam é descrita em Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); e Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999). As regiões conservadas também podem ser determinadas pelo alinhamento das sequências dos mesmos polipeptídeos ou dos relacionados de espécies estreitamente relacionadas. As espécies estreitamente relacionadas, preferencialmente, são da mesma família. Em algumas modalidades, o alinhamento das sequências de duas espécies diferentes é adequado.

[0060] Normalmente, os polipeptídeos que exibem pelo menos cerca de 40% de identidade de sequência de aminoácidos são úteis para identificar as regiões conservadas. As regiões conservadas dos polipeptídeos relacionados exibem pelo menos 45% de identidade de sequência de aminoácidos (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos, 60%), pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos). Em algumas modalidades, uma região conservada exibe pelo menos 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos.

[0061] Exemplos de sequências de aminoácidos de homólogos funcionais do polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 353 são fornecidos na Figura 1 e na Listagem de Sequência. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, CeresClone 106263 (SEQ ID NO: 355), CeresClone_335348 (SEQ ID NO: 357), GI_115440873 (SEQ ID NO: 358), CeresClone_826796 (SEQ ID NO: 360), CeresAnnot_1465047 (SEQ ID NO: 362), CeresClone_1919901 (SEQ ID NO: 364), SEEDLINE:ME02064_CeresClone 375578_com mutação (SEQ ID NO: 366), CeresClone_520008 (SEQ ID NO: 368), GI_7413581 (SEQ ID NO: 369), CeresClone_228069 (SEQ ID NO: 371), CeresClone_167508 (SEQ ID NO: 373), CeresClone_1829581 (SEQ ID NO: 375), GI_125550655 (SEQ ID NO: 376), GI_15231175 (SEQ ID NO: 377), GI_145357576 (SEQ ID NO: 378), GI_125528277 (SEQ ID NO: 379), GI_224032591 (SEQ ID NO: 380), CeresAnnot_8669409 (SEQ ID NO: 382), CeresClone_1901601 (SEQ ID NO: 384), CeresClone_2034697 (SEQ ID NO: 386), CeresClone_1747444 (SEQ ID NO: 388), CeresClone_1998974 (SEQ ID NO: 390), CeresClone_1883040 (SEQ ID NO: 392), GI_326520123 (SEQ ID NO: 393), CeresClone_101697218 (SEQ ID NO: 395), GI_215701453 (SEQ ID NO: 396), GI_225449126 (SEQ ID NO: 397), GI_147809623 (SEQ ID NO: 398), GI_224109704 (SEQ ID NO: 399), GI_225439898 (SEQ ID NO: 400), GI_218196002 (SEQ ID NO: 401), GI_54306075 (SEQ ID NO: 402), CeresAnnot_1484880 (SEQ ID NO: 404), GI_224028605 (SEQ ID NO: 405), CeresAnnot_1528800 (SEQ ID NO: 407), CeresClone_1792902 (SEQ ID NO: 409), CeresClone_1806867 (SEQ ID NO: 411), CeresClone_1727738 (SEQ ID NO: 413), GI_238007500 (SEQ ID NO: 414), CeresAnnot_8724651 (SEQ ID NO: 416), CeresClone_1897134 (SEQ ID NO: 418), CeresClone_1859266 (SEQ ID NO: 420), GI_194696788 (SEQ ID NO: 421), CeresAnnot_1475350 (SEQ ID NO: 423), GI_326490361 (SEQ ID NO: 424), GI_224140165 (SEQ ID NO: 425), GI_255577665 (SEQ ID NO: 426), CeresClone_1886384 (SEQ ID NO: 428), GI_255568402 (SEQ ID NO: 429), CeresClone_1942871 (SEQ ID NO: 431), GI_326527367 (SEQ ID NO: 432), GI_297816500 (SEQ ID NO: 433), GI_297810377 (SEQ ID NO: 434), GI_302762472 (SEQ ID NO: 435), GI_302815615 (SEQ ID NO: 436), GI_326525172 (SEQ ID NO: 437), GI_116787496 (SEQ ID NO: 438), GI_224029961 (SEQ ID NO: 439), GI_312282973 (SEQ ID NO: 440), GI_15232741 (SEQ ID NO: 441), GI_302806862 (SEQ ID NO: 442), GI_302772817 (SEQ ID NO: 443), GI_240254538 (SEQ ID NO: 444), GI_297833734 (SEQ ID NO: 445), GI_2739366 (SEQ ID NO: 446), GI_297825811 (SEQ ID NO: 447), e CeresClone_229668 (SEQ ID NO: 449). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 353 tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 353. Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 353 tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a um ou mais homólogos funcionais da SEQ ID NO: 353 descrita acima ou estabelecida na Listagem de Sequência. O polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 353, ou os homólogos funcionais estabelecidos acima ou na Listagem de Sequência podem estar truncados nos terminais N ou C. Em uma modalidade, um homólogo funcional da SEQ ID NO:353 contém um truncamento no terminal N. Por exemplo, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 353, tal como a SEQ ID NO: 366 pode incluir aminoácidos que se alinham com os resíduos 188 a 498 da SEQ ID NO: 353.

[0062] Exemplos de sequências de aminoácidos de homólogos funcionais do polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 237 são fornecidos na Figura 2 e na Listagem de Sequência. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, CeresClone_1847516 (SEQ ID NO: 239), CeresAnnot_8714481 (SEQ ID NO: 241), CeresClone_1961986 (SEQ ID NO: 243), CeresClone_1464596 (SEQ ID NO: 245), GI_225450173 (SEQ ID NO: 246), CeresClone_532446 (SEQ ID NO: 248), CeresAnnot_1493109 (SEQ ID NO: 250), GI_88866527 (SEQ ID NO: 251), CeresClone_1609861 (SEQ ID NO: 253), CeresClone_1620215 (SEQ ID NO: 255), CeresClone_1732772 (SEQ ID NO: 257), GI_295148935 (SEQ ID NO: 258), GI_125606142 (SEQ ID NO: 259), CeresClone_1040399 (SEQ ID NO: 261), CeresClone_1093691 (SEQ ID NO: 263), CeresClone_974539 (SEQ ID NO: 265), CeresClone_1832340 (SEQ ID NO: 267), CeresClone_1933211 (SEQ ID NO: 269), CeresClone_997558 (SEQ ID NO: 271), CeresAnnot_6041596 (SEQ ID NO: 273), GI_125564176 (SEQ ID NO: 274), CeresClone_1836064 (SEQ ID NO: 276), CeresClone_1909693 (SEQ ID NO: 278), CeresClone_1765346 (SEQ ID NO: 280), GI_125546008 (SEQ ID NO: 281), CeresClone_1950900 (SEQ ID NO: 283), GI_41350259 (SEQ ID NO: 284), GI_125588210 (SEQ ID NO: 285), CeresClone_1954395 (SEQ ID NO: 287), GI_18403408 (SEQ ID NO: 288), CeresClone_2010121 (SEQ ID NO: 290), CeresAnnot_6011486 (SEQ ID NO: 292), GI_25082726 (SEQ ID NO: 293), GI_113196593 (SEQ ID NO: 294), CeresClone_1843021 (SEQ ID NO: 296), CeresClone_1931194 (SEQ ID NO: 298), CeresClone_1850070 (SEQ ID NO: 300), CeresAnnot_6034955 (SEQ ID NO: 302), CeresAnnot_6119444 (SEQ ID NO: 304), CeresAnnot_6063956 (SEQ ID NO: 306), CeresAnnot_6015461 (SEQ ID NO: 308), CeresClone_696244 (SEQ ID NO: 310), CeresAnnot_1468973 (SEQ ID NO: 312), CeresClone_2019529 (SEQ ID NO: 314), CeresClone_1492169 (SEQ ID NO: 316), CeresClone_1652996 (SEQ ID NO: 318), CeresClone_100861292 (SEQ ID NO: 320), CeresClone_1875452 (SEQ ID NO: 322), CeresClone_296366 (SEQ ID NO: 324), CeresClone_1468822 (SEQ ID NO: 326), CeresClone_1793946 (SEQ ID NO: 328), GI_297829802 (SEQ ID NO: 329), CeresClone_1094610 (SEQ ID NO: 331), CeresClone_1084216 (SEQ ID NO: 333), CeresClone_100041169 (SEQ ID NO: 335), CeresClone_1619774 (SEQ ID NO: 337), GI_218685692 (SEQ ID NO: 338), GI_295148937 (SEQ ID NO: 339), CeresClone_1783953 (SEQ ID NO: 341), GI_242045152 (SEQ ID NO: 342), GI_223972713 (SEQ ID NO: 343), GI_326494504 (SEQ ID NO: 344), GI_326515226 (SEQ ID NO: 345), GI_163838754 (SEQ ID NO: 346), GI_163838756 (SEQ ID NO: 347), GI_163838762 (SEQ ID NO: 348), GI_326523409 (SEQ ID NO: 349), GI_255544230 (SEQ ID NO: 350), e GI_222822669 (SEQ ID NO: 351). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 237 tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 237. Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 237 tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a um ou mais homólogos funcionais da SEQ ID NO: 237 descrita acima ou estabelecida na Listagem de Sequência.

[0063] Exemplos de sequências de aminoácidos de homólogos funcionais do polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 451 são fornecidos na Figura 3 e na Listagem de Sequência. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, CeresClone_1931889 (SEQ ID NO: 453), GI_225440926 (SEQ ID NO: 454), CeresClone_708446 (SEQ ID NO: 456), GI_255575635 (SEQ ID NO: 457), GI_193237563 (SEQ ID NO: 458), GI_222822693 (SEQ ID NO: 459), GI_224103059 (SEQ ID NO: 460), GI_302398693 (SEQ ID NO: 461), GI_222822667 (SEQ ID NO: 462), GI_116778998 (SEQ ID NO: 463), CeresClone_1748922 (SEQ ID NO: 465), CeresClone_1775820 (SEQ ID NO: 467), GI_115468934 (SEQ ID NO: 468), GI_118424243 (SEQ ID NO: 469), GI_147783026 (SEQ ID NO: 470), GI_119367488 (SEQ ID NO: 471), GI_147860340 (SEQ ID NO: 472), GI_147792975 (SEQ ID NO: 473), GI_21359918 (SEQ ID NO: 474), GI_73951300 (SEQ ID NO: 475), GI_115477170 (SEQ ID NO: 476), CeresClone_1798756 (SEQ ID NO: 478), CeresClone_1918424 (SEQ ID NO: 480), CeresClone_1929645 (SEQ ID NO: 482), CeresClone_1845154 (SEQ ID NO: 484), CeresClone_1840507 (SEQ ID NO: 486), CeresClone_1853430 (SEQ ID NO: 488), CeresClone_1853189 (SEQ ID NO: 490), CeresClone_1808578 (SEQ ID NO: 492), CeresClone_1857508 (SEQ ID NO: 494), CeresClone_1946245 (SEQ ID NO: 496), CeresClone_1974721 (SEQ ID NO: 498), CeresClone_1940441 (SEQ ID NO: 500), CeresClone_1834813 (SEQ ID NO: 502), CeresClone_1848383 (SEQ ID NO: 504), CeresClone_1895219 (SEQ ID NO: 506), CeresClone_1866608 (SEQ ID NO: 508), CeresAnnot_1481252 (SEQ ID NO: 510), CeresAnnot_1474904 (SEQ ID NO: 512), CeresAnnot_1450673 (SEQ ID NO: 514), CeresAnnot_1437933 (SEQ ID NO: 516), CeresAnnot_1448174 (SEQ ID NO: 518), CeresAnnot_1447323 (SEQ ID NO : 520), CeresAnnot_1456578 (SEQ ID NO: 522), CeresAnnot_1491680 (SEQ ID NO: 524), CeresAnnot_1438851 (SEQ ID NO: 526), CeresAnnot_1440235 (SEQ ID NO: 528), CeresAnnot_1461453 (SEQ ID NO: 530), CeresAnnot_1468974 (SEQ ID NO: 532), CeresAnnot_1474244 (SEQ ID NO: 534), GI_15231686 (SEQ ID NO: 535), CeresClone_5522 (SEQ ID NO: 537), CeresClone_30543 (SEQ ID NO: 539), GI_14596167 (SEQ ID NO: 540), CeresClone_14203 (SEQ ID NO: 542), CeresClone_13832 (SEQ ID NO: 544), GI_15221329 (SEQ ID NO: 545), CeresClone_975913 (SEQ ID NO: 547), CeresClone_967417 (SEQ ID NO: 549), CeresClone_974951 (SEQ ID NO: 551), CeresClone_958471 (SEQ ID NO: 553), CeresClone_979956 (SEQ ID NO: 555), CeresClone_962327 (SEQ ID NO: 557), GI_119720772 (SEQ ID NO: 558), CeresClone_1614593 (SEQ ID NO: 560), CeresClone_567184 (SEQ ID NO: 562), CeresClone_580467 (SEQ ID NO: 564), CeresClone_1021029 (SEQ ID NO: 568), CeresClone_1072112 (SEQ ID NO: 570), CeresClone_481246 (SEQ ID NO: 572), CeresClone_1242573 (SEQ ID NO: 574), CeresClone_537439 (SEQ ID NO: 576), CeresClone_547126 (SEQ ID NO: 578), GI_92896423 (SEQ ID NO: 579), GI_124360119 (SEQ ID NO: 580), GI_122069751 (SEQ ID NO: 581), CeresClone_1030374 (SEQ ID NO: 583), CeresClone_1030540 (SEQ ID NO: 585), CeresClone_634261 (SEQ ID NO: 587), CeresClone_696374 (SEQ ID NO: 589), CeresClone_698573 (SEQ ID NO: 591), CeresClone_701370 (SEQ ID NO: 593), CeresClone_893059 (SEQ ID NO: 595), CeresClone_757664 (SEQ ID NO: 597), CeresClone_1387149 (SEQ ID NO: 599), CeresClone_1411371 (SEQ ID NO: 601), CeresClone_1380920 (SEQ ID NO: 603), CeresClone_1360570 (SEQ ID NO: 605), CeresClone_1458498 (SEQ ID NO: 607), GI_60202503 (SEQ ID NO: 608), CeresClone_1554153 (SEQ ID NO: 610), CeresClone_1362320 (SEQ ID NO: 612), CeresClone_1545291 (SEQ ID NO: 614), CeresClone_1589047 (SEQ ID NO: 616), CeresClone_101142707 (SEQ ID NO: 618), CeresClone_1433926 (SEQ ID NO: 620), CeresClone_1734621 (SEQ ID NO: 622), CeresClone_1731531 (SEQ ID NO: 624), GI_5031281 (SEQ ID NO: 625), CeresClone_1911017 (SEQ ID NO: 627), CeresClone _1955228 (SEQ ID NO: 629), CeresClone_1867313 (SEQ ID NO: 631), CeresClone_1955668 (SEQ ID NO: 633), CeresClone_1765871 (SEQ ID NO: 635), CeresClone_1870976 (SEQ ID NO: 637), CeresClone_1990071 (SEQ ID NO: 639), CeresClone_1965620 (SEQ ID NO: 641), CeresClone_1995041 (SEQ ID NO: 643), CeresClone_2015820 (SEQ ID NO: 645), CeresClone_1724157 (SEQ ID NO: 647), CeresClone_1724165 (SEQ ID NO: 649), GI_35187687 (SEQ ID NO: 650), GI_125556051 (SEQ ID NO: 651), GI_125561658 (SEQ ID NO: 652), GI_115470773 (SEQ ID NO: 653), GI_115444813 (SEQ ID NO: 654), GI_115446479 (SEQ ID NO: 655), GI_115455855 (SEQ ID NO: 656), GI_115479855 (SEQ ID NO: 657), GI_57899571 (SEQ ID NO: 658), CeresAnnot_6035031 (SEQ ID NO: 660), CeresAnnot_6111586 (SEQ ID NO: 662), CeresAnnot_6011488 (SEQ ID NO: 664), CeresAnnot_6063958 (SEQ ID NO: 666), CeresAnnot_6063957 (SEQ ID NO: 668), GI_38016527_Gossypium_barbadense (SEQ ID NO: 669), GI_75133829_Oryza_sativa (SEQ ID NO: 670), GI_125546011_Oryza_sativa_indica (SEQ ID NO: 671), GI_116778802_Picea (SEQ ID NO: 672), GI_116778893_Picea (SEQ ID NO: 673), GI_157849766_Brassica_rapa (SEQ ID NO: 674), GI_159474166_Chlamydomonas_reinhardtii (SEQ ID GI_168036656_Physcomitrella_patens (SEQ ID GI_168053490_Physcomitrella_patens (SEQ ID CeresClone_100879386_Zea_mays (SEQ ID CeresClone_1738028_Musa_acuminata (SEQ ID CeresClone_2055733_Miscanthus (SEQ ID CeresClone_2056478_Miscanthus (SEQ ID NO: 685), (SEQ ID NO: 686), GI_297816570 (SEQ ID NO: CeresClone_1428270 (SEQ ID NO: 689), CeresClone_1447811 NO: 691), CeresClone_1093477 (SEQ ID NO: CeresClone_1260056 (SEQ ID NO: 695), GI_255565591 (SEQ 696), CeresClone_1626661 (SEQ ID NO: 698), GI_222822665 NO: 699), CeresClone_1842119 (SEQ ID NO: 701) ID NO: 702), GI_222822691 (SEQ ID NO: 703) NO: 704), GI_297847482 (SEQ ID NO: 705), NO: 706), GI297809513 (SEQ ID NO: 707), GI_222822685 (SEQ ID GI_225426659 (SEQ ID GI_15234402 (SEQ ID GI_222423788 (SEQ ID GI_222822653 (SEQ ID (SEQ ID NO: 719), GI_222822655 (SEQ ID GI_15235819 (SEQ ID GI_116787141 (SEQ ID GI_326515250 (SEQ ID GI_222622367 (SEQ ID GI_194692334 (SEQ ID GI168007673 (SEQ ID GI_326499404 (SEQ ID NO: 736), GI_255628951 (SEQ ID NO: 737), GI_326496248 (SEQ ID NO: 738), GI_297849616 (SEQ ID NO: 739), GI_326489039 (SEQ ID NO: 740), CeresAnnot_8672029 (SEQ ID NO: 742), CeresClone_24253 (SEQ ID NO: 744), GI_297739707 (SEQ ID NO: 745), GI_217075452 (SEQ ID NO: 746), GI_168037934 (SEQ ID NO: 747), CeresClone_682858 (SEQ ID NO: 749), GI_222822689 (SEQ ID NO: 750), CeresAnnot_8644539 (SEQ ID NO: 752), GI_222822663 (SEQ ID NO: 753), GI_168018442 (SEQ ID NO: 754), GI_242081565 (SEQ ID NO: 755), CeresClone_1463779 (SEQ ID NO: 757), CeresAnnot_8713173 (SEQ ID NO: 759), GI_225455582 (SEQ ID NO: 760), GI_218189113 (SEQ ID NO: 761), GI_302755624 (SEQ ID NO: 762), CeresClone_1778054 (SEQ ID NO: 764), GI_302822895 (SEQ ID NO: 765), GI_255638082 (SEQ ID NO: 766), GI_297746352 (SEQ ID NO: 767), GI_255640538 (SEQ ID NO: 768), GI_13276697 (SEQ ID NO: 769), GI_255628269 (SEQ ID NO: 770), GI_297804888 (SEQ ID NO: 771), e GI_297736227 (SEQ ID NO: 772). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 451 tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 451. Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 451 tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a um ou mais homólogos funcionais da SEQ ID NO: 451 descrita acima ou estabelecida na Listagem de Sequência.

[0064] Exemplos de sequências de aminoácidos de homólogos funcionais do polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 2 são fornecidos na Figura 4 e na Listagem de Sequência. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, GI_239053200 (SEQ ID NO: 3), GI_242043390 (SEQ ID NO: 4), GI_4218535 (SEQ ID NO: 5), CeresAnnot_1706255 (SEQ ID NO: 7), GI_82400207 (SEQ ID NO: 8), GI_326514348 (SEQ ID NO: 9), GI_225435840 (SEQ ID NO: 10), GI_155965519 (SEQ ID NO: 11), GI_116791569 (SEQ ID NO: 12), GI_82568708 (SEQ ID NO: 13), GI_21105748 (SEQ ID NO: 14), GI_154362215 (SEQ ID NO: 15), CeresClone_1804251 (SEQ ID NO: 17), CeresClone_219367 (SEQ ID NO: 19), GI_226528637 (SEQ ID NO: 20), CeresClone_100906935 (SEQ ID NO: 22), CeresClone_1902485 (SEQ ID NO: 24), CeresClone_754901 (SEQ ID NO: 26), CeresClone_1804740 (SEQ ID NO: 28), GI_88770831 (SEQ ID NO: 29), CeresClone_100885834 (SEQ ID NO: 31), GI_125557725 (SEQ ID NO: 32), GI_115471229 (SEQ ID NO: 33), CeresAnnot_8631975 (SEQ ID NO: 35), GI_261349144 (SEQ ID NO: 36), CeresClone_261978 (SEQ ID NO: 38), CeresClone_1797688 (SEQ ID NO: 40), GI_300510868 (SEQ ID NO: 41), GI_51702426 (SEQ ID NO: 42), GI_219884691 (SEQ ID NO: 43), GI_292659262 (SEQ ID NO: 44), GI_82400213 (SEQ ID NO: 45), CeresClone_1566599 (SEQ ID NO: 47), GI_6730938 (SEQ ID NO: 48), GI_125528153 (SEQ ID NO: 49), GI_185179439 (SEQ ID NO: 50), CeresClone_1810747 (SEQ ID NO: 52), CeresClone_736293 (SEQ ID NO: 54), GI_292659260 (SEQ ID NO: 55), GI_242059063 (SEQ ID NO: 56), GI_82400209 (SEQ ID NO: 57), GI_223975401 (SEQ ID NO: 58), GI_138753440 (SEQ ID NO: 59), CeresClone_101131915 (SEQ ID NO: 61), CeresClone_100821085 (SEQ ID NO: 63), GI_302399001 (SEQ ID NO: 64), GI_225459603 (SEQ ID NO: 65), GI_302141792 (SEQ ID NO: 66), GI_125572421 (SEQ ID NO: 67), CeresClone_542522 (SEQ ID NO: 69), GI_195549547 (SEQ ID NO: 70), CeresClone_100961037 (SEQ ID NO: 72), GI_255640977 (SEQ ID NO: 73), CeresClone_1850651 (SEQ ID NO: 75), Ceres Annot_8462230 (SEQ ID NO: 77), GI_198400323 (SEQ ID NO: 78), GI_254034330 (SEQ ID NO: 79), CeresClone_100066176 (SEQ ID NO: 81), GI_206584339 (SEQ ID NO: 82), GI_224063050 (SEQ ID NO: 83), GI_312282805 (SEQ ID NO: 84), GI_255558632 (SEQ ID NO: 85), GI_21105734 (SEQ ID NO: 86), GI_116784797 (SEQ ID NO: 87), GI_187940307 (SEQ ID NO: 88), GI_184097796 (SEQ ID NO: 89), GI_222631638 (SEQ ID NO: 90), GI_116782512 (SEQ ID NO: 91), CeresClone_1220729 (SEQ ID NO: 93), GI_14485513 (SEQ ID NO: 94), CeresClone_514804 (SEQ ID NO: 96), GI_155008462 (SEQ ID NO: 97), GI_292659252 (SEQ ID NO: 98), GI_296044564 (SEQ ID NO: 99), GI_187940295 (SEQ ID NO: 100), CeresAnnot_8732688 (SEQ ID NO: 102), GI_302789271 (SEQ ID NO: 103), GI_206584337 (SEQ ID NO: 104), GI_326490045 (SEQ ID NO: 105), GI_31322570 (SEQ ID NO: 106), GI_168000027 (SEQ ID NO: 107), GI_297839605 (SEQ ID NO: 108), GI_62546185 (SEQ ID NO: 109), GI_147802535 (SEQ ID NO: 110), GI_302820063 (SEQ ID NO: 111), CeresClone_1769201 (SEQ ID NO: 113), CeresClone_477097 (SEQ ID NO: 115), CeresClone_1910025 (SEQ ID NO: 117), CeresAnnot_8669922 (SEQ ID NO: 119), GI_31322574 (SEQ ID NO: 120), GI_187940273 (SEQ ID NO: 121), GI_15223963 (SEQ ID NO: 122), CeresClone_100038358 (SEQ ID NO: 124), GI_148615629 (SEQ ID NO: 125), GI_225461361 (SEQ ID NO: 126), GI_255563837 (SEQ ID NO: 127), CeresClone_1727754 (SEQ ID NO: 129), CeresClone_1808216 (SEQ ID NO: 131), GI_195549534 (SEQ ID NO: 132), CeresAnnot_1466775 (SEQ ID NO: 134), CeresClone_23342 (SEQ ID NO: 136), GI_209171097 (SEQ ID NO: 137), GI_138753442 (SEQ ID NO: 138), CeresClone_1431867 (SEQ ID NO: 140), CeresClone_36478 (SEQ ID NO: 142), CeresClone_1864096 (SEQ ID NO: 144), CeresAnnot_1452119 (SEQ ID NO: 146), GI_302774106 (SEQ ID NO: 147), GI_171452372 (SEQ ID NO: 148), GI_297810999 (SEQ ID NO: 149), GI_21593134 (SEQ ID NO: 150), GI_125572883 (SEQ ID NO: 151), GI_242877145 (SEQ ID NO: 152), GI_125528621 (SEQ ID NO: 153), GI_115441473 (SEQ ID NO: 154), GI_31322566 (SEQ ID NO: 155), GI_224128213 (SEQ ID NO: 156), CeresClone_481915 (SEQ ID NO: 158), GI_31322580 (SEQ ID NO: 159), GI_311701727 (SEQ ID NO: 160), CeresClone_1434586 (SEQ ID NO: 162), GI_58013003 (SEQ ID NO: 163), GI_255586554 (SEQ ID NO: 164), CeresClone_1370400 (SEQ ID NO: 166), GI_312283489 (SEQ ID NO: 167), CeresAnnot_8453910 (SEQ ID NO: 169), CeresClone_1824711 (SEQ ID NO: 171), GI_57233056 (SEQ ID NO: 172), GI_167614348 (SEQ ID NO: 173), GI_296082607 (SEQ ID NO: 174), GI_62546187 (SEQ ID NO: 175), GI_62546189 (SEQ ID NO: 176), GI_31322568 (SEQ ID NO: 177), GI_66275774 (SEQ ID NO: 178), GI_225438363 (SEQ ID NO: 179), GI_124021383 (SEQ ID NO: 180), GI_224081060 (SEQ ID NO: 181), GI_255583865 (SEQ ID NO: 182), GI_217073174 (SEQ ID NO: 183), GI_168038326 (SEQ ID NO: 184), GI_295913643 (SEQ ID NO: 185), GI_31322578 (SEQ ID NO: 186), GI_118486672 (SEQ ID NO: 187), GI_15232604 (SEQ ID NO: 188), CeresAnnot_8683724 (SEQ ID NO: 190), GI_187940303 (SEQ ID NO: 191), GI_311780299 (SEQ ID NO: 192), GI_297830130 (SEQ ID NO: 193), GI_117586720 (SEQ ID NO: 194), GI_193237579 (SEQ ID NO: 195), CeresClone_1827014 (SEQ ID NO: 197), GI_31322576 (SEQ ID NO: 198), GI_255555947 (SEQ ID NO: 199), GI_125533643 (SEQ ID NO: 200), GI_118490007 (SEQ ID NO: 201), GI_21536744 (SEQ ID NO: 202), GI_302399025 (SEQ ID NO: 203), CeresClone_100046091 (SEQ ID NO: 205), CeresClone_20909 (SEQ ID NO: 207), CeresClone_1803889 (SEQ ID NO: 209), CeresAnnot_1456291 (SEQ ID NO: 211), GI_311976585 (SEQ ID NO: 212), GI_302399005 (SEQ ID NO: 213), GI_297744870 (SEQ ID NO: 214), GI_15223456 (SEQ ID NO: 215), GI_63252923 (SEQ ID NO: 216), GI_255636538 (SEQ ID NO: 217), GI_113205414 (SEQ ID NO: 218), GI_113205453 (SEQ ID NO: 219), GI_255635167 (SEQ ID NO: 220), GI_206584345 (SEQ ID NO: 221), CeresAnnot_867355 (SEQ ID NO: 223), GI_242877103 (SEQ ID NO: 224), GI_302793560 (SEQ ID NO: 225), CeresClone_38344 (SEQ ID NO: 227), GI_31322582 (SEQ ID NO: 228), GI_115336269 (SEQ ID NO: 229), GI_311115260 (SEQ ID NO: 230), GI_168054147 (SEQ ID NO: 231), GI_311115262 (SEQ ID NO: 232), GI_168034283 (SEQ ID NO: 233), GI_15148914 (SEQ ID NO: 234), e GI_302767458 (SEQ ID NO: 235). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 2 tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 2 tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98 %, ou 99% de identidade de sequência a um ou mais homólogos funcionais da SEQ ID NO: 2 descrita acima ou estabelecida na Listagem de Sequência.

[0065] A identificação das regiões conservadas num polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio facilita a produção de variantes de polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio. As Variantes dos polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio normalmente têm 10 ou menos substituições de aminoácidos conservativas dentro da sequência primária de aminoácidos, por exemplo, 7 ou menos substituições de aminoácidos conservativas, 5 ou menos substituições de aminoácidos conservativas, ou entre 1 e 5 substituições conservativas. Um polipeptídeo variante útil pode ser construído com base em um dos alinhamentos estabelecidos na Figura 1, Figura 2, Figura 3 ou Figura 4, e/ou nos homólogos identificados na Listagem de Sequência. Esse polipeptídeo inclui as regiões conservadas, arranjadas na ordem representada na Figura a partir da extremidade amino-terminal para a extremidade carbóxi- terminal. Esse polipeptídeo também pode incluir zero, um ou mais de um aminoácido em posições marcadas pelos traços. Quando nenhum aminoácido está presente nas posições marcadas pelos traços, o comprimento desse polipeptídeo é a soma dos resíduos de aminoácidos em todas as regiões conservadas. Quando os aminoácidos estão presentes numa posição marcada pelos traços, esse polipeptídeo tem um comprimento que é a soma dos resíduos dos aminoácidos em todas as regiões conservadas e todos os traços. C. Homólogos Funcionais Identificados por HMMER

[0066] Em algumas modalidades, os polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio incluem aqueles que se ajustam num Modelo Oculto de Markov com base nos polipeptídeos estabelecidos em qualquer uma das Figuras 1-4. Um Modelo Oculto de Markov (HMM) é um modelo estatístico de uma sequência consenso para um grupo de homólogos funcionais. Vide, Durbin et al., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (1998). Um HMM é gerado pelo programa HMMER 2.3.2 com parâmetros de programa padrão, usando as sequências do grupo de homólogos funcionais como entrada. O alinhamento de sequências múltiplas é gerado por ProbCons (Do et al., Genome Res., 15(2):330-40 (2005)) versão 1.11, usando um conjunto de parâmetros padrão: -c,—REPS de consistência de 2; -ir,—REPS de refinamento-iterativo de 100; - pre,—pre-REPS de treinamento de 0. ProbCons é um programa de software de domínio público fornecido pela Stanford University.

[0067] Os parâmetros padrão para a construção de um HMM (hmmbuild) são os seguintes: a "arquitetura prévia" padrão (archpri) usada pela construção de arquitetura de MAP é 0,85, e o limite de corte padrão (idlevel) usado para determinar o número de sequência efetivo é 0,62. HMMER 2.3.2 foi lançado em 3 de outubro de 2003 sob a licença pública geral de GNU e está disponível a partir de várias fontes na World Wide Web como hmmer.janelia.org; hmmer.wustl.edu;and fr.com/hmmer232/. Hmmbuild produz o modelo como um arquivo de texto.

[0068] O HMM para um grupo de homólogos funcionais pode ser usado para determinar a probabilidade de que uma sequência candidata do polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio é um ajuste melhor para esse HMM particular do que para um HMM nulo gerado usando um grupo de sequências que não são estruturalmente ou funcionalmente relacionadas. A probabilidade de que uma sequência candidata de polipeptídeo é um ajuste melhor para um HMM do que para um HMM nulo é indicada pela pontuação de bit de HMM, um número gerado quando a sequência candidata está ajustada para o perfil de HMM, usando o programa de hmmsearch de HMMER. Os seguintes parâmetros padrão são usados ao executar o hmmsearch: o corte do E-valor padrão (E) é 10,0, o corte da pontuação de bit padrão (T) é infinito negativo, o número padrão de sequências em um banco de dados (Z) é o número real de sequências no banco de dados, o corte do valor E padrão para a lista de hit classificada por domínio (domE) é infinito, e o corte da pontuação de bit padrão para a lista de hit classificada por domínio (domT) é infinito negativo. Uma alta pontuação de bit de HMM indica uma maior probabilidade de que a sequência candidata realiza uma ou mais das funções bioquímicas ou fisiológicas dos polipeptídeos usados para gerar o HMM. Uma alta pontuação de bit de HMM é pelo menos 20, e é frequentemente maior. Pequenas variações na pontuação de bit de HMM de uma sequência particular pode ocorrer devido a fatores, tais como a ordem na qual as sequências são processadas para o alinhamento por múltiplos algoritmos de alinhamento de sequência, tal como o programa ProbCons. No entanto, essa variação da pontuação de bit de HMM é menor.

[0069] Os polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio discutidos abaixo se ajustam ao HMM indicado com uma pontuação de bit de HMM superior a 65 (por exemplo, superior a 70, 80, 90, 100, 120, 140, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, ou 2000). Em algumas modalidades, a pontuação de bit de HMM de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio discutida abaixo é cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% da pontuação de bit de HMM de um homólogo funcional fornecido na Listagem de Sequência deste pedido. Em algumas modalidades, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio discutido abaixo se ajusta ao HMM indicado com uma pontuação de bit de HMM superior a 210, e tem um domínio indicativo de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio. Em algumas modalidades, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio discutido abaixo se ajusta ao HMM indicado com uma pontuação de bit de HMM superior a 210, e tem 65% ou maior identidade de sequência (por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% de identidade de sequência) a uma sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das Figuras 1-4.

[0070] Exemplos de polipeptídeos são mostrados na listagem de sequência que tem pontuações de bit de HMM superiores a 159 (por exemplo, superiores a 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, ou 1260) quando ajustado a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácidos estabelecidas na Figura 1 são identificadas na Listagem de Sequência deste pedido. Esses polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 353, 355, 357, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 402, 404, 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, e 449.

[0071] Exemplos de polipeptídeos são mostrados na listagem de sequência que tem pontuações de bit de HMM superior a 83 (por exemplo, superior a 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 275, ou 300) quando ajustados a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácidos estabelecida na Figura 2 e são identificados na Listagem de Sequência deste pedido. Esses polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 237, 239, 241, 243, 245, 246, 248, 250, 251 , 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281 , 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, e 351.

[0072] Exemplos de polipeptídeos são mostrados na listagem de sequência que tem pontuações de bit de HMM superiores a 100 (por exemplo, superiores a 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 410, 420, ou 430) quando ajustados a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácidos estabelecidas na Figura 3 são identificados na Listagem de Sequência deste pedido. Esses polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 535, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 558 ,560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 579, 580, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769,770, 771, e 772 .

[0073] Exemplos de polipeptídeos são mostrados na listagem de sequência que tem pontuações de bit de HMM superiores a 204 (por exemplo, superiores a 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, ou 700) quando ajustados a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácidos estabelecidas na Figura 4 são identificados na Listagem de Sequência deste pedido. Esses polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 2, 3, 4 , 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26 , 28, 29, 31, 32, 33, 35 , 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48 , 49, 50, 52, 54, 55, 56 , 57, 58, 59, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 69 , 70, 72, 73, 75, 77, 78 , 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91, 93, 94, 96, 97 , 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, e 235. D. Identidade Percentual

[0074] Em algumas modalidades, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17 19, 20, 22, 24 26, 28,29,31 32,33,35,36 38,40,41,42 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52 54,55,56,57 58,59,61,63 64, 65, 66, 67 69, 70, 72, 73 75, 77, 78, 79, 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 93 94 96 97 98 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 239, 241 , 243 , 245, 246, 248, 2450, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 353, 355, 357, 358, 360, 362, 3647 , 366 , 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 535, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 558, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 579, 580, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772. Os polipeptídeos tendo essa porcentagem da identidade de sequência, frequentemente, têm um domínio indicativo de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio e/ou têm uma pontuação de bit de HMM que é superior a 65, conforme discutido acima. As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio tendo pelo menos 80% de identidade sequência a uma das sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52 54, 55, 56, 57 58, 59, 61, 63 64, 65, 66, 67 69, 70, 72, 73 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 93 94, 96, 97, 98 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 246, 248, 250, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281, 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 353, 355, 357, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425, 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 535, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 558, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 579, 580, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772 são fornecidas nas Figuras 1-4 e na Listagem de Sequência.

[0075] "Identidade de sequência percentual" refere-se ao grau de identidade de sequência entre qualquer sequência de referência dada, por exemplo, SEQ ID NO: 1 e uma sequência candidata moduladora da tolerância ao alumínio. Uma sequência candidata normalmente tem um comprimento que é de 80 por cento a 200 por cento do comprimento da sequência de referência, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 por cento do comprimento da sequência de referência. Uma porcentagem da identidade para qualquer ácido nucleico ou polipeptídeo candidato em relação a um ácido nucleico ou polipeptídeo de referência pode ser determinada conforme se segue. Uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos) é alinhada a uma ou mais sequências candidatas, usando o programa de computador ClustalW (versão 1.83, parâmetros padrão), que permite os alinhamentos das sequências do ácido nucleico ou do polipeptídeo a serem realizados em toda sua extensão (alinhamento global). Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500 (2003).

[0076] O ClustalW calcula a melhor correspondência entre uma sequência de referência e uma ou mais sequências candidatas, e as alinha para que as identidades, similaridades e diferenças possam ser determinadas. As lacunas de um ou mais resíduos podem ser inseridos numa sequência de referência, numa sequência candidata, ou em ambas, para maximizar os alinhamentos da sequência. Para o rápido alinhamento por pares das sequências de ácidos nucleicos, os seguintes parâmetros padrão são usados: tamanho da palavra: 2; tamanho da janela: 4; método de pontuação: porcentagem; número de diagonais superiores: 4; e penalidade de lacuna: 5. Para alinhamento múltiplo de sequências de ácidos nucleicos, os seguintes parâmetros são usados: penalidade de abertura de lacuna: 10.0; penalidade de extensão de lacuna: 5.0; e transições de peso: sim. Para o rápido alinhamento por pares das sequências proteicas, os seguintes parâmetros são usados: tamanho da palavra: 1; tamanho da janela: 5; método de pontuação: porcentagem; número de diagonais superiores: 5; penalidade de lacuna: 3. Para alinhamento múltiplo de sequências proteicas, os seguintes parâmetros são usados: matriz de peso: blosum; penalidade de abertura de lacuna: 10.0; penalidade de extensão de lacuna: 0.05; lacunas hidrofílicas: ativado; resíduos hidrofílicos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gin, Glu, Arg, e Lys; penalidades de lacuna específicas de resíduos: ativado. A produção do ClustalW é um alinhamento de sequência que reflete a relação entre as sequências. O ClustalW pode ser executado, por exemplo, no site da Baylor College of Medicine Search Launcher na World Wide Web (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi- align/multi-align.html) e no site do European Bioinformatics Institute na World Wide Web (ebi.ac.uk/clustalw).

[0077] Para determinar a identidade percentual de uma sequência candidata de ácidos nucleicos ou de aminoácidos para uma sequência de referência, as sequências são alinhadas usando o ClustalW, o número de correspondências idênticas no alinhamento é dividido pelo comprimento da sequência de referência e o resultado é multiplicado por 100. Note-se que o valor da identidade percentual pode ser arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13, e 78,14 são arrendondados para baixo para 78,1, enquanto 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, e 78,19 são arredondados para cima para 78,2.

[0078] Em alguns casos, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 353. As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos tendo mais que 45% de identidade de sequência ao polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 353 são fornecidos na Figura 1 e na Listagem de Sequência.

[0079] Em alguns casos, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 237. As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos tendo mais que 45% de identidade de sequência ao polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 237 são fornecidas na Figura 2 e na Listagem de Sequência.

[0080] Em alguns casos, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 451. As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos tendo mais que 45% de identidade de sequência ao polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 451 são fornecidos na Figura 3 e na Listagem de Sequência.

[0081] Em alguns casos, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo, 50%, 52%, 56%, 59%, 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2. As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos tendo mais que 45% de identidade de sequência ao polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 2 são fornecidos na Figura 4 e na Listagem de Sequência. E. Outras Sequências

[0082] Deve ser apreciado que um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode incluir aminoácidos adicionais que não estão envolvidos na modulação da tolerância ao alumínio, e, assim, esse polipeptídeo pode ser mais longo do que seria o caso, por outro lado. Por exemplo, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode incluir uma marca de purificação, um peptídeo de trânsito do cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocondrial, um peptídeo de amiloplasto, ou uma sequência líder adicionada ao terminal amino ou carbóxi. Em algumas modalidades, um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio inclui uma sequência de aminoácidos que funciona como um repórter, por exemplo, uma proteína verde fluorescente ou uma proteína amarela fluorescente. III. Ácidos Nucleicos

[0083] Os ácidos nucleicos descritos neste documento incluem ácidos nucleicos que são eficazes na modulação dos níveis de tolerância ao alumínio quando transcritos numa planta ou célula vegetal. Esses ácidos nucleicos incluem, sem limitação, aqueles que codificam um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio e aqueles que são usados para inibir a expressão de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio através de um método baseado no ácido nucleico. A. Ácidos nucleicos codificadores de polipetídeos moduladores da tolerância ao alumínio

[0084] Os ácidos nucleicos que codificam os polipetídeos moduladores da tolerância ao alumínio são descritos neste documento . Exemplos desses ácidos nucleicos inc luem as SEQ ID NOs: 1, 6 , 16, 18, 21, 23, 25, 27, 30, 34, 37, 39, 46, 51, 53, 60, 62, 68, 71, 74 , 76, 80, 92, 95, 101, 112, 114, 116, 118, 123, 128, 130, 133, 135, 139, 141, 143, 145, 157, 161, 165, 168, 170, 189, 196, 204, 206, 208, 210, 222, 226, 236, 238, 240, 242, 244, 247, 249, 252, 254, 256, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 275, 277, 279, 282, 286, 289, 291, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 330, 332, 334, 336, 340, 352, 354, 356, 359, 361, 363, 365, 367, 370, 372, 374, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 394, 403, 406, 408, 410, 412, 415, 417, 419, 422, 427, 430, 448, 450, 452, 455, 464, 466, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 536, 538, 541, 543, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 559, 561, 563, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 659, 661, 663, 665, 667, 678, 680, 682, 684, 688, 690, 692, 694, 697, 700, 708, 720, 741 , 743, 748 , 751, 756, 758, e 763, conforme descritas em mais detalhes abaixo. Um ácido nucleico também pode ser um fragmento que tem pelo menos 40% (por exemplo, pelo menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 99%) do comprimento do ácido nucleico de comprimento total estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 6, 16, 18, 21, 23, 25, 27, 30, 34, 37, 39, 46, 51, 53, 60, 62, 68, 71, 74, 76, 80, 92, 95, 101, 112, 114, 116, 118, 123, 128, 130, 133, 135, 139, 141, 143, 145 157, 161, 165, 168, 170, 189, 196, 204, 206, 208, 210, 222, 226 236, 238, 240, 242, 244, 247, 249, 252, 254, 256, 260, 262, 264 266, 268, 270, 272, 275, 277, 279, 282, 286, 289, 291, 295, 297 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 325, 327, 330, 332, 334, 336, 340, 352, 354, 356, 359, 361, 363 365, 367, 370, 372, 374, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 394, 403 406, 408, 410, 412, 415, 417, 419, 422, 427, 430, 448, 450, 452 455, 464, 466, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521 523, 525, 527, 529, 531, 533, 536, 538, 541, 543, 546, 548, 550 552, 554, 556, 559, 561, 563, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 582 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 609 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 626, 628, 630, 632, 634, 636 638, 640, 642, 644, 646, 648, 659, 661, 663, 665, 667, 678, 680 682, 684, 688, 690, 692, 694, 697, 700, 708, 720, 741, 743, 748 751, 756, 758, e 763.

[0085] Um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode compreender a sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 352. Alternativamente, um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode ser uma variante do ácido nucleico que tem a sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 352. Por exemplo, um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode ter uma sequência nucleotídica com pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 352.

[0086] Um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 236. Alternativamente, um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode ser uma variante do ácido nucleico que tem a sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 236. Por exemplo, um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode ter uma sequência nucleotídica com pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 236.

[0087] Um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode compreender a sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 450. Alternativamente, um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode ser uma variante do ácido nucleico que tem a sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 450. Por exemplo, um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode ter uma sequência nucleotídica com pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 450.

[0088] Um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode compreender a sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 1. Alternativamente, um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode ser uma variante do ácido nucleico que tem a sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 1. Por exemplo, um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio pode ter uma sequência nucleotídica com pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 1.

[0089] As moléculas de ácido nucleico isoladas podem ser produzidas por técnicas padrão. Por exemplo, técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) podem ser usadas para obter um ácido nucleico isolado contendo uma sequência nucleotídica descrita neste documento. A PCR pode ser usada para amplificar sequências específicas de DNA, bem como de RNA, incluindo sequências de DNA genômico total ou RNA celular total. Vários métodos de PCR são descritos, por exemplo, em PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Geralmente, as informações da sequência das extremidades da região de interesse ou além são empregadas para projetar os iniciadores de oligonucleotídeo que são idênticos ou semelhantes na sequência para fitas opostas do modelo a ser amplificado.

[0090] Várias estratégias de PCR também estão disponíveis, pelas quais as modificações de sequência nucleotídicas de sítio específico podem ser introduzidas em um ácido nucleico de modelo. Os ácidos nucleicos isolados também podem ser quimicamente sintetizados, como uma molécula única de ácido nucleico (por exemplo, usando a síntese de DNA automatizada na direção 3 ' para 5 ' , usando tecnologia de fosforamidita) ou como uma série de oligonucleotídeos. Por exemplo, um ou mais pares de oligonucleotídeos longos (por exemplo, >100 nucleotídeos) pode ser sintetizado, tal que contenha a sequência desejada, com cada par contendo um segmento curto da complementaridade (por exemplo, cerca de 15 nucleotídeos), tal que um duplex seja formado quando o par de oligonucleotídeos for anelado. A DNA polimerase é usada para estender os oligonucleotídeos, resultando numa única molécula de ácido nucleico de fita dupla por par de oligonucleotídeo, a qual, então, pode ser ligada em um vetor. Os ácidos nucleicos isolados da invenção também podem ser obtidos por mutagênese, por exemplo, um DNA de ocorrência natural. B. Uso de Ácidos Nucleicos para Modular a Expressão dos Polipeptídeos

[0091] i. Expressão de um Polipeptídeo Modulador da Tolerância ao Alumínio

[0092] Um ácido nucleico que codifica um dos polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio descritos neste documento pode ser usado para expressar o polipeptídeo numa espécie de planta de interesse, normalmente pela transformação de uma célula vegetal com um ácido nucleico tendo a sequência codificadora para o polipeptídeo operacionalmente ligado, na orientação sense, a uma ou mais regiões reguladoras. Será apreciado que devido à degeneração do código genético, um número de ácidos nucleicos pode codificar um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio particular; isto é, para diversos aminoácidos, há mais de uma tríade de nucleotídeos que serve como o códon para o aminoácido. Assim, os códon na sequência codificadora para um determinado polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio podem ser modificados, tais que a expressão ideal numa espécie de planta específica seja obtida usando as tabelas de viés de códon apropriadas para essa espécie.

[0093] Em alguns casos, a expressão de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio inibe uma ou mais funções de um polipeptídeo endógeno. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo negativo dominante pode ser usado para inibir a função da proteína. Um polipeptídeo negativo dominante normalmente tem mutação ou é truncado em relação a um polipeptídeo endógeno do tipo selvagem, e sua presença numa célula inibe uma ou mais funções do polipeptídeo do tipo selvagem nessas células, isto é, o polipeptídeo negativo dominante é geneticamente dominante e confere uma perda de função. O mecanismo pelo qual um polipeptídeo negativo dominante confere esse fenótipo pode variar, mas frequentemente envolve uma interação proteína-proteína ou uma interação proteína-DNA. Por exemplo, um polipeptídeo negativo dominante pode ser uma enzima que é truncada em relação a uma enzima nativa do tipo selvagem, tal que o polipeptídeo truncado mantém os domínios envolvidos na ligação de uma primeira proteína, mas carece dos domínios envolvidos na ligação de uma segunda proteína. O polipeptídeo truncado é, portanto, incapaz de modular apropriadamente a atividade da segunda proteína. Vide, por exemplo, US 2007/0056058. Como outro exemplo, uma mutação pontual que resulta numa substituição de aminoácidos não conservativos num domínio catalítico pode resultar num polipeptídeo negativo dominante. Vide, por exemplo, US 2005/032221. Como outro exemplo, um polipeptídeo negativo dominante pode ser um fator de transcrição que é truncado em relação a um fator de transcrição nativo do tipo selvagem, tal que o polipeptídeo truncado mantém o(s) domínio(s) de ligação de DNA, mas carece do(s) domínio(s) de ativação. Esse polipeptídeo truncado pode inibir o fator de transcrição do tipo selvagem de se ligar ao DNA, inibindo, desse modo, a ativação da transcrição.

[0094] ii. A inibição da Expressão de um Polipeptídeo Modulador da Tolerância ao Alumínio

[0095] Os polinucleotídeos e construtos recombinantes descritos neste documento podem ser usados para inibir a expressão de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio numa espécie de planta de interesse. Vide, por exemplo, Matzke and Birchler, Nature Reviews Genetics 6:24-35 (2005); Akashi et al., Nature Reviews Mol. Cell Biology 6:413-422 (2005); Mittal, Nature Reviews Genetics 5:355-365 (2004); e Nature Reviews RNA interference collection, Out. 2005 na World Wide Web em nature.com/reviews/focus/mai. Um número de métodos baseados em ácidos nucleicos, incluindo RNA antisense, clivagem de RNA dirigida por ribozima, silenciamento de gene pós-transcricional (PTGS), por exemplo, RNA de interferência (RNAi) e silenciamento de gene transcricional (TGS) são conhecidos por inibir a expressão gênica em plantas. Os polinucleotídeos adequados incluem ácidos nucleicos de comprimento total que codificam polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio ou fragmentos desses ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, um complemento do ácido nucleico de comprimento total ou um fragmento do mesmo pode ser usado. Normalmente, um fragmento tem pelo menos 10 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleotídeos ou mais. Geralmente, uma alta homologia pode ser usada para compensar o uso de uma sequência mais curta.

[0096] A tecnologia antisense é um método bem conhecido. Neste método, um ácido nucleico de um gene a ser reprimido é clonado e operacionalmente ligado a uma região reguladora e uma sequência de terminação de transcrição para que a fita antisense de RNA seja transcrita. O construto recombinante é, então, transformado em plantas, conforme descrito neste documento, e a fita antisense de RNA é produzida. O ácido nucleico não precisa ser a sequência inteira do gene a ser reprimido, mas normalmente será substancialmente complementar pelo menos a uma porção da fita sense do gene a ser reprimido.

[0097] Em outro método, um ácido nucleico pode ser transcrito numa ribozima, ou RNA catalítico, que afeta a expressão de um mRNA. Vide Patente U.S. N°. 6,423,885. As ribozimas podem ser projetadas para parear especificamente com virtualmente qualquer RNA alvo e clivar a estrutura principal de fosfodiéster numa localização específica, inativando funcionalmente, desse modo, o RNA alvo. Os ácidos nucleicos heterólogos podem codificar ribozimas projetadas para clivar transcritos de mRNA específicos, prevenindo, assim, a expressão de um polipeptídeo. As ribozimas cabeça-de-martelo são úteis para destruir mRNAs específicos, embora várias ribozimas que clivam o mRNA em sequências de reconhecimento de sítio específico possam ser usadas. As ribozimas cabeça-de-martelo clivam os mRNAs em locais indicados pelas regiões flanqueadoras que formam pares de base complementares com o mRNA alvo. O único requisito é que o RNA alvo contenha uma sequência nucleotídica 5 '-UG-3 ' . A construção e produção de ribozimas cabeça-de-martelo são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.254.678 e WO 02/46449 e referências citadas neste documento. As sequências da ribozima cabeça-de-martelo podem ser incorporadas em um RNA estável, tal como uma RNA transportador (tRNA) para aumentar a eficiência da clivagem in vivo. Perriman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(13):6175-6179 (1995); de Feyter and Gaudron, Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Capítulo 43, "Expressing Ribozymes in Plants", Editado por Turner, P.C., Humana Press Inc., Totowa, NJ. As endorribonucleases de RNA que foram descritas, tal como aquela que ocorre naturalmente em Tetrahymena thermophila podem ser úteis. Vide, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 4.987.071 e 6.423.885.

[0098] PTGS, por exemplo, RNAi, também pode ser usado para inibir a expressão de um gene. Por exemplo, um construto pode ser preparado, tal que inclua uma sequência que é transcrita em um RNA que pode anelar a si mesmo, por exemplo, um RNA de fita dupla tendo uma estrutura em haste e alça. Em algumas modalidades, uma fita da porção da haste de um RNA de fita dupla compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à sequência codificadora sense ou a um fragmento da mesma de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, e que tem de cerca de 10 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos de comprimento. O comprimento da sequência que é semelhante ou idêntico à sequência codificadora sense pode ser de 10 nucleotídeos a 500 nucleotídeos, de 15 nucleotídeos a 300 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos a 100 nucleotídeos, ou de 25 nucleotídeos a 100 nucleotídeos. A outra fita da porção da haste de um RNA de fita dupla compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à fita antisense ou a um fragmento da mesma da sequência codificadora do polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, e pode ter um comprimento que é mais curto, ou igual, ou maior do que o comprimento correspondente da sequência sense. Em alguns casos, uma fita da porção da haste de um RNA de fita dupla compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à região não traduzida 3' ou 5', ou um fragmento da mesma, de um mRNA que codifica um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, e a outra fita da porção da haste do RNA de fita dupla compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à sequência que é complementar à região não traduzida 3' ou 5' , respectivamente, ou um fragmento da mesma, do mRNA que codifica o polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio. Em outras modalidades, uma fita da porção da haste de um RNA de fita dupla compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à sequência de um íntron, ou um fragmento da mesma, no pré-mRNA codificando um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, e a outra fita da porção da haste compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à sequência que é complementar à sequência do íntron, ou um fragmento da mesma, no pré-mRNA.

[0099] A porção da alça de um RNA de fita dupla pode ser ter de 3 nucleotídeos a 5.000 nucleotídeos, por exemplo, de 3 nucleotídeos a 25 nucleotídeos, de 15 nucleotídeos a 1.000 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos a 500 nucleotídeos, ou de 25 nucleotídeos a 200 nucleotídeos. A porção da alça do RNA pode incluir um íntron ou um fragmento do mesmo. Um RNA de fia dupla pode ter zero, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais estruturas em haste e alça.

[0100] Um construto incluindo uma sequência que está operacionalmente ligada a uma região reguladora e uma sequência de terminação de transcrição, e que é transcrito em um RNA que pode formar um RNA de fita dupla, é transformado em plantas, conforme descrito neste documento. Os métodos para uso do RNAi para a expressão de um gene são conhecidos para aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 5.034.323; 6.326.527; 6.452.067; 6.573.099; 6.753.139; e 6.777.588. Vide também WO 97/01952; WO 98/53083; WO 99/32619; WO 98/36083; e Publicações de Patente U.S. 20030175965, 20030175783, 20040214330, e 20030180945.

[0101] Os construtos, contendo regiões reguladoras operacionalmente ligadas a moléculas de ácido nucleico na orientação sense, também podem ser usados para inibir a expressão de um gene. O produto de transcrição pode ser semelhante ou idêntico à sequência codificadora sense, ou um fragmento da mesma, de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio. O produto da transcrição também pode ser não poliadenilada, carecer de uma estrutura cap 5 ' , ou conter um íntron que não faz splice. Os métodos de inibição da expressão gênica usando um cDNA de comprimento total, bem como uma sequência de cDNA parcial são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Pat. U.S. N°. 5.231.020.

[0102] Em algumas modalidades, um construto, contendo um ácido nucleico tendo pelo menos uma fita que é um modelo para ambas as sequências sense e antisense que são complementares entre si, é usado para inibir a expressão de um gene. As sequências sense e antisense podem ser parte de uma molécula de ácido nucleico maior ou podem ser parte de moléculas de ácido nucleico separadas tendo sequências que não são complementares. A sequência sense ou antisense pode ser uma sequência que é idêntica ou complementar à sequência de um mRNA, a região não traduzida 3' ou 5' de um mRNA, ou um íntron num pré-mRNA codificando um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, ou um fragmento dessas sequências. Em algumas modalidades, a sequência sense ou antisense é idêntica ou complementar a uma sequência da região reguladora que conduz a transcrição do gene que codifica um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio. Em cada caso, a sequência sense é a sequência que é complementar à sequência antisense.

[0103] As sequências sense e antisense podem ter um comprimento maior que cerca de 10 nucleotídeos (por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou mais nucleotídeos). Por exemplo, uma sequência antisense pode ter 21 ou 22 nucleotídeos de comprimento. Normalmente, as sequências sense e antisense variam em comprimento de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 30 nucleotídeos, por exemplo, de cerca de 18 nucleotídeos a cerca de 28 nucleotídeos, ou de cerca de 21 nucleotídeos a cerca de 25 nucleotídeos.

[0104] Em algumas modalidades, uma sequência antisense é uma sequência complementar a uma sequência de mRNA, ou um fragmento da mesma, que codifica um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio descrito neste documento. A sequência sense complementar à sequência antisense pode ser uma sequência presente dentro do mRNA do polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio. Normalmente, as sequências sense e antisense são projetadas para corresponder a uma sequência de 15-30 nucleotídeos de um mRNA alvo, tal que o nível desse mRNA alvo seja reduzido.

[0105] Em algumas modalidades, um construto contendo um ácido nucleico tendo pelo menos uma fita que seja um modelo para mais de uma sequência sense (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências sense) pode ser usado para inibir a expressão de um gene. Da mesma forma, um construto contendo um ácido nucleico tendo pelo menos uma fita que seja um modelo para mais de uma sequência antisense (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências antisense) pode ser usado para inibir a expressão de um gene. Por exemplo, um construto pode conter um ácido nucleico tendo pelo menos uma fita que seja um modelo para duas sequências sense e duas sequências antisense. As múltiplas sequências sense podem ser idênticas ou diferentes, e as múltiplas sequências antisense podem ser idênticas ou diferentes. Por exemplo, um construto pode ter um ácido nucleico tendo uma fita que seja um modelo para duas sequências sense idênticas e duas sequências antisense idênticas que são complementares às duas sequências sense idênticas. Alternativamente, um ácido nucleico isolado pode ter uma fita que é que um modelo para (1) duas sequências sense idênticas com 20 nucleotídeos de comprimento, (2) uma sequência antisense que é complementar às duas sequências sense idênticas com 20 nucleotídeos de comprimento, (3) uma sequência sense com 30 nucleotídeos de comprimento, e (4) três sequências antisense idênticas que são complementares à sequência sense com 30 nucleotídeos de comprimento. Os construtos fornecidos neste documento podem ser projetados para ter um arranjo adequado de sequências sense e antisense. Por exemplo, duas sequências sense idênticas podem ser seguidas por duas sequências antisense idênticas ou podem ser posicionadas entre duas sequências antisense idênticas.

[0106] Um ácido nucleico tendo pelo menos uma fita que seja um modelo para uma ou mais sequências sense e/ou antisense pode estar operacionalmente ligado a uma região reguladora para conduzir a transcrição de uma molécula de RNA contendo a(s) sequência(s) sense e/ou antisense. Além disso, esse ácido nucleico pode estar operacionalmente ligado a uma sequência terminadora da transcrição, tal como o terminador do gene da nopalina sintase (nos). Em alguns casos, duas regiões reguladoras podem direcionar a transcrição dos dois transcritos: um a partir da fita superior e um a partir da fita inferior. Vide, por exemplo, Yan et al., Plant Physiol., 141 :1508-1518 (2006). As duas regiões reguladoras podem ser iguais ou diferentes. Os dois transcritos podem formar moléculas de RNA de fita dupla que induzem a degradação do RNA alvo. Em alguns casos, um ácido nucleico pode ser posicionado dentro de um T-DNA ou DNA de transferência derivado de planta (P-DNA), tal que as sequências do limite de T-DNA esquerdas e direitas ou as sequências semelhantes a limites esquerdas e direitas do flanco de P-DNA, ou estão em qualquer lado do ácido nucleico. Vide, Publicação de Patente U.S. N°. 2006/0265788. A sequência de ácido nucleico entre as duas regiões reguladoras pode ter de cerca de 15 a cerca de 300 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico entre as duas regiões reguladoras tem cerca de 15 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 15 a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 18 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 18 a cerca de 40 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 18 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, ou de cerca de 18 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento.

[0107] Em alguns métodos baseados em ácidos nucleicos para a inibição da expressão de gene em plantas, um ácido nucleico adequado pode ser um análogo de ácido nucleico. Os análogos de ácido nucleico podem ser modificados na fração da base, fração do açúcar ou na estrutura principal do fosfato para melhorar, por exemplo, a estabilidade, hibridização ou solubilidade do ácido nucleico. As modificações na fração da base incluem desoxiuridina para desoxitimidina, e 5-metil-2'-desoxicitidina e 5-bromo-2'-desoxicitidina para desoxicitidina. As modificações para a fração do açúcar incluem a modificação da hidroxila 2' do açúcar ribose para formar açúcares de 2'-0-metila ou 2'-0-alila. A estrutura principal do fosfato da desoxirribose pode ser modificada para produzir ácidos nucleicos de morfolino, nos quais cada fração da base é ligada a um anel de morfolino com seis membros, ou ácidos nucleicos dos peptídeos, nos quais a estrutura principal do desoxifosfato é substituída por uma estrutura principal de pseudopeptídeo e as quatro bases são mantidas. Vide, por exemplo, Summerton and Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7: 187-195 (1997); Hyrup et al., Bioorgan. Med. Chem., 4:5-23 (1996). Além disso, a estrutura principal do desoxifosfato pode ser substituída, por exemplo, por uma estrutura principal de fosforotioato ou de fosforoditioato, uma fosforoamidita, ou por uma estrutura principal de alquil fosfotriéster. C. Construtos/vetores

[0108] Os construtos recombinantes fornecidos neste documento podem ser usados para transformar plantas e células vegetais a fim de modular os níveis de tolerância ao alumínio. Um construto de ácido nucleico recombinante pode compreender um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, conforme descrito neste documento, operacionalmente ligado a uma região reguladora adequada para a expressão do polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio na planta ou célula. Assim, um ácido nucleico pode compreender a sequência codificadora que codifica um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 2 3, 4 , 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 17, 19, 20 , 22, 24 26, 28, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38 , 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 47 48, 49, 50, 52, 54, 55, 56, 57, 58 , 59, 61, 63, 64, 65 , 66, 67 69, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 81 , 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88 89, 90, 91, 93 , 94 , 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 117, 119, 120, 121, 122 124, 125, 126, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 137, 138, 140, 142 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158 159, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220 221, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235 237, 239, 241, 243, 245, 246, 248, 250, 251, 253, 255, 257, 258 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 274, 276, 278, 280, 281 283, 284, 285, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 296, 298, 300, 302 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328 329, 331, 333, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 344, 345, 346 347, 348, 349, 350, 351, 353, 355, 357, 358, 360, 362, 364, 366 368, 369, 371, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 384, 386 388, 390, 392, 393, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404 405, 407, 409, 411, 413, 414, 416, 418, 420, 421, 423, 424, 425 426, 428, 429, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 451, 453, 454, 456, 457 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 472 473, 474, 475, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 535, 537, 539, 540, 542, 544, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 558, 560, 562, 564, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 579, 580, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655 , 656 ,657, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 679, 681, 683, 685, 686, 687, 689, 691, 693, 695, 696, 698, 699, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 742, 744, 745, 746, 747, 749, 750, 752, 753, 754, 755, 757, 759, 760, 761, 762, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, e 772 . Exemplos de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos moduladores da tolerância ao alumínio são estabelecidos nas SEQ ID NOs: 1, 6, 16, 18, 21, 23, 25, 71, 74, 76, 80, 92, 27, 95, 30, 34, 37, 39, 46, 116, 51, 53, 60, 62, 68, 130, 101, 112, 114, 118, 123, 128, 133, 135, 139, 141, 143, 145, 157, 161, 165, 168, 170, 189, 196, 204, 206, 208, 210, 222, 226, 236, 238, 240, 242, 244, 247, 249, 252, 254, 256, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 275, 277, 279, 282, 286, 289, 291, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 330, 332, 334, 336, 340, 352, 354, 356, 359, 361, 363, 365, 367, 370, 372, 374, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 394, 403, 406, 408, 410, 412, 415, 417, 419, 422, 427, 430, 448, 450, 452, 455, 464, 466, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 536, 538, 541, 543, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 559, 561, 563, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 659, 661, 663, 665, 667, 678, 680, 682, 684, 688, 690, 692, 694, 697, 700, 708, 720, 741, 743, 748, 751, 756, 758, e 763, ou na Listagem de Sequência. O polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio codificado por um ácido nucleico recombinante pode ser um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio nativo, ou pode ser heterólogo para a célula. Em alguns casos, o construto recombinante contém um ácido nucleico que inibe a expressão de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, operacionalmente ligado a uma região reguladora. Exemplos de regiões reguladoras adequadas são descritas na seção intitulada "Regiões reguladoras".

[0109] Os vetores contendo construtos de ácidos nucleicos recombinantes, tais como aqueles descritos neste documento, também são fornecidos. As estruturas principais do vetor adequadas incluem, por exemplo, aquelas rotineiramente usadas na técnica, tais como plasmídeos, vírus, cromossomos artificiais, BACs, YACs ou PACs. Vetores de expressão adequados incluem, sem limitação, plasmídeos e vetores virais derivados de, por exemplo, bacteriófagos, baculovírus e retrovírus. Numerosos vetores e sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis por corporações como Novagen® (Madison, WI), Clontech® (Palo Alto, CA), Stratagene® (La Jolla, CA), e Invitrogen/LifeTechnologies® (Carlsbad, CA).

[0110] Os vetores fornecidos neste documento também podem incluir, por exemplo, origens de replicação, regiões de fixação de andaimes (SARs), e/ou marcadores. Um gene marcador pode conferir um fenótipo selecionável em uma célula vegetal. Por exemplo, um marcador pode conferir resistência biocida, tal como resistência a um antibiótico (por exemplo, canamicina, G418, bleomicina ou higromicina), ou um herbicida (por exemplo, glifosato, clorsulfurona ou fosfinotricina). Além disso, um vetor de expressão pode incluir uma sequência com marca projetada para facilitar a manipulação ou detecção (por exemplo, purificação ou localização) do polipeptídeo expresso. As sequências com marca, tais como sequências de luciferase, β- glucuronidase (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), glutationa S-transferase (GST), poli-histidina, c-myc, hemaglutinina, ou marca Flag™ (Kodak, New Haven, CT) normalmente são expressas como uma fusão com o polipeptídeo codificado. Essas marcas podem ser inseridas em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, incluindo nos terminais carboxila ou amino. D. Regiões reguladoras

[0111] A escolha das regiões reguladoras a serem incluídas em um construto recombinante depende de vários fatores, incluindo, mas não se limitando a, eficiência, viabilidade de seleção, viabilidade de indução, nível de expressão desejado e expressão preferencial de célula ou tecido. É uma questão de rotina para uma pessoa versada na técnica modular a expressão de uma sequência codificadora, selecionando e posicionamento apropriadamente as regiões reguladoras em relação à sequência codificadora. A transcrição de um ácido nucleico pode ser modulada de forma semelhante.

[0112] Algumas regiões reguladoras adequadas iniciam apenas a transcrição, ou predominantemente, em determinados tipos de células. Os métodos para identificar e caracterizar as regiões reguladoras no DNA genômico de planta são conhecidos, incluindo, por exemplo, aqueles descritos nas seguintes referências: Jordano et al., Plant Cell, 1 :855-866 (1989); Bustos et al., Plant Cell, 1 :839-854 (1989); Green et al., EMBO J., 7:40354044 (1988); Meier et al., Plant Cell, 3:309-316 (1991); e Zhang et al., Plant Physiology, 110: 1069-1079 (1996).

[0113] Exemplos de várias classes de regiões reguladoras são descritos abaixo. Algumas das regiões reguladoras indicadas abaixo, bem como as regiões reguladoras adicionais são descritas em mais detalhes no Pedido de Patente U.S. Nos. de Série 60/505,689; 60/518,075; 60/544,771; 60/558,869; 60/583,691; 60/619,181; 60/637,140; 60/757,544; 60/776,307; 10/957,569; 11/058,689; 11/172,703; 11/208,308; 11/274,890; 60/583,609; 60/612,891; 11/097,589; 11/233,726; 11/408,791; 11/414,142; 10/950,321; 11/360,017; PCT/US05/011105; PCT/US05/23639; PCT/US05/034308; PCT/US05/034343; e PCT/US06/038236; PCT/US06/040572; PCT/US07/62762; PCT/US2009/032485; e PCT/US2009/038792.

[0114] Por exemplo, as sequências das regiões reguladoras p326, YP0144, YP0190, pl3879, YP0050, p32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0128, YP0275, PT0660, PT0683, PT0758, PT0613, PT0672, PT0688, PT0837, YP0092, PT0676, PT0708, YP0396, YP0007, YP0111, YP0103, YP0028, YP0121, YP0008, YP0039, YP0115, YP0119, YP0120, YP0374, YPOIOI, YP0102, YP0110, YP0117, YP0137, YP0285, YP0212, YP0097, YP0107, YP0088, YP0143, YP0156, PT0650, PT0695, PT0723, PT0838, PT0879, PT0740, PT0535, PT0668, PT0886, PT0585, YP0381, YP0337, PT0710, YP0356, YP0385, YP0384, YP0286, YP0377, PD1367, PT0863, PT0829, PT0665, PT0678, YP0086, YP0188, YP0263, PT0743 e YP0096 estão estabelecidas na listagem de sequência de PCT/US06/040572; a sequência da região reguladora PT0625 está estabelecida na listagem de sequência de PCT/US05/034343; as sequências das regiões reguladoras PT0623, YP0388, YP0087, YP0093, YP0108, YP0022 e YP0080 estão estabelecidas na listagem de sequência do Pedido de Patente U.S. N°. de Série 11/172,703; a sequência da região reguladora PR0924 está estabelecida na listagem de sequência de PCT/US07/62762; e as sequências das regiões reguladoras p530cl0, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYpl02, e pOsYp285 estão estabelecidas na listagem de sequência de PCT/US06/038236.

[0115] Será apreciado que uma região reguladora pode atender os critérios para uma classificação com base em sua atividade em uma espécie de planta, e ainda atender os critérios para uma classificação diferente com base em sua atividade em outras espécies de plantas. i. Promotores de Ampla Expressão

[0116] Um promotor pode ser dito ser "de ampla expressão" quando este promove a transcrição em muitos tecidos de plantas, mas não necessariamente todos. Por exemplo, um promotor de ampla expressão pode promover a transcrição de uma sequência operacionalmente ligada em um ou mais dos brotos, ponta do broto (ápice), e folhas, mas fracamente ou nenhuma transcrição nos tecidos, tais como raízes ou caules. Como outro exemplo, um promotor de ampla expressão pode promover a transcrição de uma sequência operacionalmente ligada em um ou mais do caule, broto, ponta do broto (ápice), e folhas, mas pode promover a transcrição fracamente ou nenhuma transcrição nos tecidos, tais como tecidos reprodutivos de flores e de desenvolvimento de sementes. Exemplos não limitantes de promotores de ampla expressão que podem ser incluídos nos construtos de ácido nucleico fornecidos neste documento incluem os promotores p326, YP0144, YP0190, pl3879, YP0050, p32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, e PT0633. Exemplos adicionais incluem o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor da manopina sintase (MAS), os promotores 1' ou 2' derivados do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor 34S do vírus do mosaico da escrofulária, promotores da actina, tais como o promotor da actina do arroz, e promotores da ubiquitina, tais como o promotor da ubiquitina- 1 do milho. Em alguns casos, o promotor 35S de CaMV é excluído da categoria de promotores de ampla expressão.

[0117] Outro exemplo de um promotor amplo é a sequência da região reguladora PD3141 estabelecida na listagem de sequência de PCT/US2009/032485. Nele, o padrão da expressão da região reguladora PD3141 é descrito para plantas de arroz TO superexpressando um construto que compreende a PD3141 conduzindo a expressão de EGFP. Nas mudas, a expressão foi observada em: Broto: não-específico; Colmo principal: não-específico; Raiz: não-específica; Folha: não-específica; e Meristema: não- específico. Em plantas maduras, a expressão foi observada em: Colmo principal: bainha em feixe, endoderme, epiderme, entrenó, lígula, nó, periciclo, floema, camada de esclerênquima, sistema vascular, xilema; Raiz: córtex, vascular; Panícula: folha bandeira, ovário, pedúnculo, ramo primário, ráquila, ráquis, espigueta; Espigueta: folha bandeira, floret(palea), lema, óvulo, pedículo, pólen, semente, estigma; Folha: epiderme, lâmina da folha, bainha da folha, mesofilo; e Meristema: meristema floral, meristema apical do broto, meristema vegetativo.

[0118] Outro exemplo de um promotor amplo é a sequência da região reguladora p326 estabelecida na listagem de sequência do Pedido U.S. Número de Série 10/981.334. Nele, o padrão de expressão da região reguladora p326 é descrito para plantas de Arabidopsis. O p326 é expresso ao longo da maioria dos tecidos maduros selecionados. A expressão era um pouco maior no tecido epidérmico, tecido vascular e fotossintético das mudas. As linhagens caracterizadas foram passadas por várias gerações.

[0119] Outro exemplo de um promotor amplo é a sequência da região reguladora PD2995 (uma versão de 600 bp de p326) estabelecida na listagem de sequência de PCT/US2009/32485. Nas plantas de arroz TO, o PD2995 expressa-se muito fracamente ao longo de todos os tecidos da planta nas mudas e nos estágios maduros. Expressão mais forte detectada no tecido da raiz e no embrião. ii. Promotores da Raiz

[0120] Os promotores ativos da raiz conferem transcrição no tecido da raiz, por exemplo, endoderme da raiz, epiderme da raiz, ou tecidos vasculares da raiz. Em algumas modalidades, os promotores ativos da raiz são promotores preferenciais de raiz, isto é, conferem transcrição, apenas ou predominantemente no tecido da raiz. Os promotores preferenciais de raiz incluem os promotores YP0128, YP0275, PT0625, PT0660, PT0683, e PT0758. Outros promotores preferenciais de raiz incluem os promotores PT0613, PT0672, PT0688, e PT0837, que conduzem a transcrição primariamente no tecido da raiz e em menor grau nos óvulos e/ou sementes. Outros exemplos de promotores preferenciais de raiz incluem os subdomínios específicos de raiz do promotor 35S de CaMV (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7890-7894 (1989)), promotores específicos de células da raiz relatados por Conklmg et al., Plant Physiol, 93: 1203-1211 (1990), e o promotor de RD2 do tabaco.

[0121] Outro exemplo de um promotor da raiz é a sequência da região reguladora PD3561 estabelecida na listagem de sequência de PCT/US2009/038792. Nele, o padrão de expressão da região reguladora PD3561 é descrito para as plantas de arroz TO superexpressando um construto que compreende PD3561 conduzindo a expressão de EGFP. A expressão foi observada em raízes de mudas no córtex, epiderme e tecidos vasculares. Em plantas maduras, a expressão foi observada fortemente por toda a raiz, com a exceção da cobertura da raiz e no córtex, epiderme e tecidos vasculares. iii. Promotores do Endosperma em Maturação

[0122] Em algumas modalidades, os promotores que conduzem a transcrição no endosperma em maturação podem ser úteis. A transcrição a partir de um promotor de endosperma em maturação normalmente começa após a fertilização e ocorre primariamente no tecido do endosperma durante o desenvolvimento da semente e é normalmente mais alta durante a fase de celularização. Mais adequados são os promotores que são ativos predominantemente no endosperma em maturação, embora os promotores que também são ativos em outros tecidos possam, às vezes, ser usados. Exemplos não limitantes de promotores de endosperma em maturação que podem ser incluídos nos construtos de ácido nucleico fornecidos neste documento incluem o promotor da napina, o promotor da Arcelina- 5, o promotor da faseolina (Bustos et al., Plant Cell, 1(9):839- 853 (1989)), o promotor do inibidor da tripsina da soja (Riggs et al., Plant Cell, 1(6):609-621 (1989)), o promotor da ACP (Baerson et al., Plant Mol. Biol, 22(2):255-267 (1993)), o promotor da estearoil-ACP desaturase (Slocombe et al., Plant Physiol, 104(4): 167-176 (1994)), a subunidade α' da soja do promotor da β-conglicinina (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8560-8564 (1986)), o promotor da oleosina (Hong et al., Plant Mol. Biol, 34(3):549-555 (1997)), e promotores da zeína, tais como o promotor da zeína de 15 kD, o promotor da zeína de 16 kD, o promotor da zeína de 19 kD, o promotor da zeína de 22 kD e o promotor da zeína de 27 kD. Também são adequados o promotor de Osgt-1 do gene da glutelina-1 do arroz (Zheng et al., Mol. Cell Biol, 13:5829-5842 (1993)), o promotor da beta-amilase e o promotor da hordeína da cevada. Outros promotores do endosperma em maturação incluem os promotores YP0092, PT0676 e PT0708. iv. Promotores do Tecido Ovariano

[0123] Os promotores que são ativos em tecidos ovarianos, tais como a parede o óvulo e o mesocarpo podem ser úteis, por exemplo, um promotor da poligalacturonidase, o promotor de TRX da banana, o promotor da actina do melão, YP0396, e PT0623. Exemplos de promotores que são ativos primariamente nos óvulos incluem YP0007, YP0111, YP0092, YP0103, YP0028, YP0121, YP0008, YP0039, YP0115, YP0119, YP0120, e YP0374. v. Promotores do Endosperma do Saco/Precoce do Embrião

[0124] Para atingir a expressão no endosperma do saco/precoce do embrião, as regiões reguladoras podem ser usadas, tal que são ativas nos núcleos polares e/ou na célula central, ou em precursores do núcleo polar, mas não em células do ovo ou precursores de células do ovo. Mais adequados são os promotores que conduzem a expressão, apenas ou predominantemente nos núcleos polares ou precursores dos mesmos e/ou a célula central. Um padrão de transcrição que se estende de núcleos polares em desenvolvimento precoce do endosperma também pode ser encontrado com promotores preferenciais do endosperma do saco/precoce do embrião, embora a transcrição normalmente diminua significativamente no desenvolvimento tardio do endosperma durante e após a fase de celularização. A expressão no embrião ou zigoto em desenvolvimento normalmente não está presente com os promotores do endosperma do saco/precoce do embrião.

[0125] Os promotores que podem ser adequados incluem aqueles derivados dos seguintes genes: Arabidopsis viviparous-1 (vide, GenBank N°. U93215); Arabidopsis atmycl (vide, Urao, Plant Mol. Biol, 32:571-57 (1996); Conceicao, Plant, 5:493-505 (1994)); Arabidopsis FIE (GenBank N°. AF129516); Arabidopsis MEA; Arabidopsis FIS2 (GenBank N°. AF096096); e FIE 1.1 (Patente U.S. N°. 6.906.244). Outros promotores que podem ser adequados incluem aqueles derivados dos seguintes genes: MAC1 do milho (vide, Sheridan, Genetics, 142: 1009-1020 (1996)); Cat3 do milho (vide, GenBank N°. L05934; Abler, Plant Mol. Biol. , 22: 10131-1038 (1993)). Outros promotores incluem os seguintes promotores de Arabidopsis: YP0039, YP0101, YP0102, YP0110, YP0117, YP0119, YP0137, DME, YP0285, e YP0212. Outros promotores que podem ser úteis incluem os seguintes promotores do arroz: p530cl0, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYpl02, e pOsYp285. vi. Promotores do Embrião

[0126] As regiões reguladoras que preferencialmente conduzem a transcrição nas células zigóticas após a fertilização podem proporcionar a expressão preferencial no embrião. Mais adequados são os promotores que preferencialmente conduzem a transcrição em embriões no estágio precoce antes do estágio do coração, mas a expressão no estágio tardio e nos embriões em maturação também é adequada. Os promotores preferenciais do embrião incluem o promotor da proteína da transferência de lipídio da cevada (Ltp1) (Plant Cell Rep 20:647-654 (2001)), YP0097, YP0107, YP0088, YP0143, YP0156, PT0650, PT0695, PT0723, PT0838, PT0879, e PT0740. vii. Promotores do Tecido Fotossintético

[0127] Os promotores ativos no tecido fotossintético confere transcrição nos tecidos verdes, tais como folhas e caules. Mais adequados são os promotores que conduzem a expressão, apenas ou predominantemente nesses tecidos. Exemplos desses promotores incluem os promotores da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (RbcS), tais como o promotor de RbcS do lariço oriental (Larix laricina), o promotor de cab6 da pinha (Yamamoto et al., Plant Cell Physiol., 35:773-778 (1994)), o promotor de Cab-1 do trigo (Fejes et al., Plant Mol Biol, 15:921-932 (1990)), o promotor de CAB-1 do espinafre (Lubberstedt et al., Plant Physiol, 104:9971006 (1994)), o promotor de cab1R do arroz (Luan et al., Plant Cell, 4:971-981 (1992)), o promotor da piruvato ortofosfato diquinase (PPDK) do milho (Matsuoka et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:9586-9590 (1993)), o promotor de Lhcb1*2 do tabaco (Cerdan et al., Plant Mol. Biol, 33:245-255 (1997)), o promotor do simportador SUC2 de sacarose-H+ de Arabidopsis thaliana (Truernit et al., Planta, 196:564-570 (1995)), e os promotores da proteína da membrana do tilacoide do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Outros promotores do tecido fotossintético incluem PT0535, PT0668, PT0886, YP0144, YP0380 e PT0585. viii. Promotores do Tecido Vascular

[0128] Exemplos dos promotores que têm atividade alta ou preferencial nos feixes vasculares incluem YP0087, YP0093, YP0108, YP0022, e YP0080. Outros promotores preferenciais do tecido vascular incluem o promotor GRP 1.8 da proteína da parede celular rica em glicina (Keller and Baumgartner, Plant Cell, 3(10): 1051-1061 (1991)), o promotor do vírus do mosqueado Commelina yellow (CoYMV) (Medberry et al., Plant Cell, 4(2): 185-192 (1992)),e o promotor do vírus baciliforme tungro do arroz (RTBV) (Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(2):687-692 (2004)). ix. Promotores Induzíveis

[0129] Os promotores induzíveis conferem transcrição em resposta a estímulos externos, tais como agentes químicos ou estímulos ambientais. Por exemplo, os promotores induzíveis podem conferir a transcrição em resposta a hormônios, tais como ácido giberélico ou etileno, ou em resposta à luz ou à seca. Exemplos de promotores induzíveis pela seca incluem YP0380, PT0848, YP0381, YP0337, PT0633, YP0374, PT0710, YP0356, YP0385, YP0396, YP0388, YP0384, PT0688, YP0286, YP0377, PD1367, e PD0901. Exemplos de promotores induzíveis por nitrogênio incluem PT0863, PT0829, PT0665, e PT0886. Exemplos de promotores induzível pela sombra incluem PR0924 e PT0678. Um exemplo de um promotor induzido por sal é rd29A (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech 17: 287-291). x. Promotores Basais

[0130] Um promotor basal é a sequência mínima necessária para a montagem de um complexo de transcrição exigido para a iniciação da transcrição. Os promotores basais frequentemente incluem um elemento de "caixa TATA" que pode estar localizado entre cerca de 15 e cerca de 35 nucleotídeos a montante a partir do sítio de iniciação da transcrição. Os promotores basais também podem incluir um elemento de "caixa CCAAT" (normalmente, a sequência CCAAT) e/ou uma sequência GGGCG, que pode estar localizada entre cerca de 40 e cerca de 200 nucleotídeos, normalmente cerca de 60 a cerca de 120 nucleotídeos, a montante do sítio de iniciação da transcrição. xi. Promotores do Caule

[0131] Um promotor do caule pode ser específico para um ou mais tecidos do caule ou específico para o caule e para outras partes da planta. Os promotores do caule podem ter atividade alta ou preferencial, por exemplo, na epiderme e córtex, câmbio vascular, pró-câmbio, ou xilema. Exemplos de promotores do caule incluem YP0018, o qual é divulgado em US20060015970 e CryIA(b) e CrylA(c) (Braga et al. 2003, Journal of New Seeds 5:209-221). xii. Outros Promotores

[0132] Outras classes de promotores incluem, mas não estão limitadas a, promotores preferenciais do broto, preferenciais do calo, preferenciais das células do tricoma, preferenciais da célula-guarda, tais como PT0678, preferenciais do tubérculo, preferenciais das células do parênquima e preferenciais de senescência. Os promotores designados YP0086, YP0188, YP0263, PT0758, PT0743, PT0829, YP0119, e YP0096, conforme descrito nos pedidos de patente referidos acima, também podem ser úteis. xiii. Outras Regiões Reguladoras

[0133] Uma região não traduzida 5' (UTR) pode ser incluída nos construtos de ácido nucleico descritos neste documento. Uma UTR 5' é transcrita, mas não é traduzida, e fica entre o sítio de iniciação do transcrito e o códon de iniciação da tradução e pode incluir o nucleotídeo +1. Uma UTR 3' pode ser posicionada entre o códon de terminação da tradução e a extremidade do transcrito. As UTRs podem ter funções particulares, tais como um aumento da estabilidade do mRNA ou atenuação da tradução. Os exemplos de UTRs 3' incluem, mas não estão limitados a, sequências sinais de poliadenilação e de terminação de transcrição, por exemplo, uma sequência de terminação da nopalina sintase.

[0134] Será entendido que mais de uma região reguladora pode estar presente num polinucleotídeo recombinante, por exemplo, íntrons, potenciadores, regiões de ativação a montante, terminadores de transcrição e elementos induzíveis. Assim, por exemplo, mais de uma região reguladora pode estar operacionalmente ligada à sequência de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio.

[0135] As regiões reguladoras, tais como promotores para genes endógenos, podem ser obtidas por síntese química ou por subclonagem a partir de um DNA genômico que inclua essa região reguladora. Um ácido nucleico que compreende essa região reguladora também pode incluir sequências flanqueadoras que contêm sítios de enzimas de restrição que facilitam a manipulação posterior. IV. Plantas e Células Vegetais Transgênicas A. Transformação

[0136] A invenção também apresenta células vegetais e plantas transgênicas que compreendem pelo menos um construto de ácido nucleico recombinante descrito neste documento. Uma planta ou uma célula vegetal pode ser transformada, tendo um construto integrado em seu genoma, isto é, pode ser estavelmente transformado. As células estavelmente transformadas normalmente mantêm o ácido nucleico introduzido com cada divisão celular. Uma planta ou uma célula vegetal também pode ser transitoriamente transformada, tal que o construto não está integrado em seu genoma. Células transitoriamente transformadas normalmente perdem toda ou alguma porção do construto ácido nucleico introduzido com cada divisão celular, tal que o ácido nucleico introduzido não possa ser detectado nas células-filhas após um número suficiente de divisões celulares. As plantas e células vegetais transgênicas transitoriamente e estavelmente transformadas podem ser úteis nos métodos descritos neste documento.

[0137] As células vegetais transgênicas usadas nos métodos descritas neste documento podem constituir parte ou o todo de uma planta inteira. Essas plantas podem ser cultivadas de forma adequada para as espécies sob consideração, numa câmara de cultivo, uma estufa, ou em um campo. As plantas transgênicas podem ser produzidas, conforme desejado, para uma finalidade específica, por exemplo, para introduzir um ácido nucleico recombinante em outras linhagens, para transferir um ácido nucleico recombinante para outras espécie, ou para posterior seleção de outros traços desejáveis. Alternativamente, as plantas transgênicas podem ser propagadas vegetativamente para aquelas espécies receptíveis a essas técnicas. Conforme usado neste documento, uma planta transgênica também se refere à progênie de uma planta transgênica inicial desde que a progênie herde o transgene. As sementes produzidas por uma planta transgênica podem ser cultivadas e em seguida autocruzadas (ou cruzadas e autocruzadas) para obter sementes de homozigotos para o construto de ácido nucleico.

[0138] As plantas transgênicas podem ser cultivadas em cultura de suspensão, ou cultura de tecido ou de órgão. Para os fins desta invenção, técnicas de cultura de tecido sólido e/ou líquido podem ser usadas. Ao usar o meio sólido, as células de plantas transgênicas podem ser colocadas diretamente no meio ou podem ser colocadas em um filtro, que é então colocado em contato com o meio. Ao usar o meio líquido, as células de plantas transgênicas podem ser colocadas em um dispositivo de flutuação, por exemplo, uma membrana porosa que entra em contato com o meio líquido. Um meio sólido pode ser, por exemplo, o meio de Murashige e Skoog (MS) contendo ágar e uma concentração adequada de uma auxina, por exemplo, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4- D) e uma concentração adequada de uma citocinina, por exemplo, quinetina.

[0139] Quando células vegetais transitoriamente transformadas são usadas, uma sequência repórter que codifica um polipeptídeo repórter com uma atividade repórter pode ser incluída no procedimento de transformação e um ensaio para a atividade repórter ou expressão pode ser realizado em um tempo adequado após a transformação. Um tempo adequado para a realização do ensaio normalmente é cerca de 1-21 dias após a transformação, por exemplo, cerca de 1-14 dias, cerca de 1-7 dias ou cerca de 1-3 dias. O uso de ensaios transientes é particularmente conveniente para a análise rápida em diferentes espécies, ou para confirmar a expressão de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio, cuja expressão não foi anteriormente confirmada em células receptoras específicas.

[0140] As técnicas para a introdução de ácidos nucleicos em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas são conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, a transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vetor viral, eletroporação e transformação de arma de partículas, por exemplo, Patentes U.S. 5.538.880; 5.204.253; 6.329.571 e 6.013.863. Se uma célula ou tecido cultivado é usado como o tecido receptor para a transformação, as plantas podem ser regeneradas a partir de culturas transformadas, se desejado, por técnicas conhecidas a aqueles versados na técnica. B. Triagem/seleção

[0141] Uma população de plantas transgênicas pode ser triada e/ou selecionada para aqueles membros da população que têm um traço ou fenótipo conferido pela expressão do transgene. Por exemplo, uma população da progênie de um único evento de transformação pode ser triada para aquelas plantas tendo um nível desejado de expressão de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, pode ser selecionada uma população de plantas que tem maior tolerância aos níveis elevados de Al3+ no solo, sem maior tolerância à seca ou aos níveis elevados de salina. As espécies de plantas variam em sua capacidade de tolerar a salinidade. "Salinidade" refere- se a um conjunto de condições ambientais sob as quais uma planta irá começar a sofrer os efeitos da elevada concentração de sal, tais como o desequilíbrio de íon, diminuição da condutância dos estômatos, diminuição da fotossíntese, diminuição da taxa de crescimento, aumento da morte celular, perda do turgor (murcha), ou aborto do óvulo. Por estas razões, as plantas que experimentam o estresse de salinidade normalmente exibem uma redução significativa na biomassa e/ou na produção.

[0142] Métodos físicos e bioquímicos podem ser usados para identificar os níveis de expressão. Esses incluem análise por Southern ou amplificação por PCR para a detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção da S 1 RNase, extensão por iniciador, ou amplificação por RT-PCR para a detecção de transcritos de RNA; ensaios enzimáticos para a detecção de atividade enzimática ou da ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese em gel de proteína, Western blots, imunoprecipitação e imunoensaios ligados a enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas, tais como hibridização in situ, coloração enzimática e imunocoloração também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão de polipeptídeos e/ou polinucleotídeos. Métodos para executar todas as técnicas referidas são conhecidos. Como uma alternativa, uma população de plantas que compreende os eventos independentes de transformação pode ser triada para aquelas plantas tendo um traço desejado, tais como maior tolerância aos níveis elevados de alumínio. A seleção e/ou triagem podem ser realizadas ao longo de uma ou mais gerações, e/ou em mais de uma localização geográfica. Em alguns casos, as plantas transgênicas podem ser cultivadas e selecionadas sob condições que induzem um fenótipo desejado ou, de outra forma, são necessárias para produzir um fenótipo desejado em uma planta transgênica. Além disso, a seleção e/ou triagem podem ser aplicadas durante um estágio de desenvolvimento específico, no qual o fenótipo é esperado para ser exibido pela planta. A seleção e/ou triagem podem ser realizadas para escolher aquelas plantas transgênicas tendo uma diferença estatisticamente significante de um nível de tolerância ao alumínio em relação a uma planta controle em que falta o transgene. As plantas selecionadas ou triadas têm um fenótipo alterado, em comparação a uma planta controle correspondente, conforme descrito na seção "Fenótipos de Plantas Transgênicas" neste documento. C. Espécies de Plantas

[0143] Os polinucleotídeos e vetores descritos neste documento podem ser usados para transformar uma série de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e sistemas de células vegetais, incluindo espécies de uma das seguintes famílias: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae, ou Vitaceae.

[0144] Espécies adequadas podem incluir membros dos gêneros Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis, e Zea.

[0145] Espécies adequadas incluem Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (bluestem grande), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea (alpiste de cana), Cynodon dactylon (grama-bermudas), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartina da pradaria), Medicago sativa (alfafa), Arundo donax (cana gigante), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale (triticum - centeio trigo X) e bambu.

[0146] Espécies adequadas também incluem Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (palmeira), Linum usitatissimum (linho) e Brassica juncea.

[0147] Espécies adequadas também incluem Beta vulgaris (beterraba) e Manihot esculenta (mandioca).

[0148] Espécies adequadas também incluem Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimentão picante & doce), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), e Solanum melongena (berinjela).

[0149] Espécies adequadas também incluem Papaver somniferum (papoila opiácea), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, e Tanacetum parthenium.

[0150] Espécies adequadas também incluem Parthenium argentatum (guaiúle), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana, e Alstroemeria spp.

[0151] Espécies adequadas também incluem Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia) e Poinsettia pulcherrima (poinsétia).

[0152] Espécies adequadas também incluem Nicotiana tabacum (tabaco, Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (avelãs), agróstis (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo tremedor), Pinus spp. (pinho), Abies spp. (abeto), Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (gramíneas), Lolium spp. (azevém) e Phleum pratense (capim-de-rebanho).

[0153] Em algumas modalidades, uma espécie adequada pode ser uma espécie selvagem, semelhante a erva daninha, ou cultivada de Pennisetum, tal como, mas não limitada a, Pennisetum alopecuroides, Pennisetum arnhemicum, Pennisetum caffrum, Pennisetum clandestinum, Pennisetum divisum, Pennisetum glaucum, Pennisetum latifolium, Pennisetum macrostachyum, Pennisetum macrourum, Pennisetum orientale, Pennisetum pedicellatum, Pennisetum polystachion, Pennisetum polystachion ssp. Setosum, Pennisetum purpureum, Pennisetum setaceum, Pennisetum subangustum, Pennisetum typhoides, Pennisetum villosum, ou seus híbridos (por exemplo, Pennisetum purpureum x Pennisetum typhoidum).

[0154] Em algumas modalidades, uma espécie adequada pode ser uma espécie e/ou variedade selvagem, semelhante a erva daninha, ou cultivada de Miscanthus, tal como, mas não limitada a, Miscanthus x giganteus, Miscanthus sinensis, Miscanthus x ogiformis, Miscanthus floridulus, Miscanthus transmorrisonensis, Miscanthus oligostachyus, Miscanthus nepalensis, Miscanthus sacchariflorus, Miscanthus x giganteus 'Amuri', Miscanthus x giganteus 'Nagara', Miscanthus x giganteus 'Illinois', Miscanthus sinensis var. 'Goliath', Miscanthus sinensis var. 'Roland', Miscanthus sinensis var. 'Africa', Miscanthus sinensis var. 'Fern Osten' , Miscanthus sinensis var. gracillimus, Miscanthus sinensis var. variegates, Miscanthus sinensis var. purpurascens, Miscanthus sinensis var. 'Malepartus', Miscanthus sacchariflorus var. 'Robusta' , Miscanthus sinensis var. 'Silberfedher' (também conhecida como Silver Feather (Pluma de Prata)), Miscanthus transmorrisonensis, Miscanthus condensatus, Miscanthus yakushimanum, Miscanthus var. 'Alexander', Miscanthus var. 'Adagio', Miscanthus var. 'Autumn Light' (Luz do Outono), Miscanthus var. 'Cabaret', Miscanthus var. 'Condensatus', Miscanthus var. 'Cosmopolitan', Miscanthus var. 'Dixieland', Miscanthus var. 'Gilded Tower' (Torre Dourada) (Patente U.S. N°. PP 14.743), Miscanthus var. 'Gold Bar' (Barra de Ouro) (Patente U.S. N°. PP15.193), Miscanthus var. 'Gracillimus', Miscanthus var. 'Graziella', Miscanthus var. 'Grosse Fontaine', Miscanthus var. 'Hinjo também conhecido como Little Nicky'™, Miscanthus var. 'Juli', Miscanthus var. 'Kaskade', Miscanthus var. 'Kirk Alexander', Miscanthus var. 'Kleine Fontaine', Miscanthus var. 'Kleine Silberspinne' (também conhecido como 'Little Silver Spider' (Pequena Aranha de Prata), Miscanthus var. 'Little Kitten’ (Gatinho Pequeno), Miscanthus var. 'Little Zebra' (Zebra Pequena) (Patente U.S. N°. PP13.008), Miscanthus var. 'Lottum', Miscanthus var. 'Malepartus', Miscanthus var. 'Morning Light' (Luz da Manhã), Miscanthus var. 'Mysterious Maiden’ (Donzela Misteriosa) (Patente U.S. N°. PP16.176), Miscanthus var. 'Nippon', Miscanthus var. 'November Sunset' (Pôr-do-Sol de Novembro), Miscanthus var. 'Parachute' (Pára-quedas), Miscanthus var. 'Positano', Miscanthus var. 'Puenktchen' (também conhecido como 'Pequeno Ponto'), Miscanthus var. 'Rigoletto', Miscanthus var. 'Sarabande' (Sarabanda), Miscanthus var. 'Silberpfeil' (também conhecido como Silver Arrow (Flecha de Prata)), Miscanthus var. 'Listra de Prata', Miscanthus var. 'Super Stripe' (Super Listra) (Patente U.S. N°. PP18.161), Miscanthus var. 'Strictus', ou Miscanthus var. 'Zebrinus'.

[0155] Em algumas modalidades, uma espécie adequada pode ser uma espécie e/ou variedade selvagem, semelhante a erva daninha, ou cultivada de sorghum, tal como, mas não limitada a, Sorghum almum, Sorghum amplum, Sorghum angustum, Sorghum arundinaceum, Sorghum bicolor (tal como bicolor, guinea, caudatum, kafir, e durra), Sorghum brachypodum, Sorghum bulbosum, Sorghum burmahicum, Sorghum controversum, Sorghum drummondii, Sorghum ecarinatum, Sorghum exstans, Sorghum grande, Sorghum halepense, Sorghum interjectum, Sorghum intrans, Sorghum laxiflorum, Sorghum leiocladum, Sorghum macrospermum, Sorghum matarankense, Sorghum miliaceum, Sorghum nigrum, Sorghum nitidum, Sorghum plumosum, Sorghum propinquum, Sorghum purpureosericeum, Sorghum stipoideum, Sorghum sudanensese, Sorghum timorense, Sorghum trichocladum, Sorghum versicolor, Sorghum virgatum, Sorghum vulgare, ou híbridos, tais como Sorghum x almum, Sorghum x sudangrass ou Sorghum x drummondii.

[0156] Assim, os métodos e composições podem ser usados sobre uma ampla gama de espécies de plantas, incluindo espécies dos gêneros das dicotiledôneas Brassica, Carthamus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Jatropha, Parthenium, Populus, e Ricinus; e dos gêneros das dicotiledôneas Elaeis, Festuca, Hordeum, Lolium, Oryza, Panicum, Pennisetum, Phleum, Poa, Saccharum, Secale, Sorghum, Triticosecale, Triticum, e Zea. Em algumas modalidades, uma planta é um membro das espécies Panicum virgatum (switchgrass), Sorghum bicolor (sorgo, sorgo-sudão), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (cana energética), Populus balsamifera (choupo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba), ou Pennisetum glaucum (milheto).

[0157] Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos e vetores descritos neste documento podem ser usados para transformar uma série de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e sistemas de células vegetais, em que essas plantas são híbridos de diferentes espécies ou variedades de uma espécie específica (por exemplo, Saccharum sp. X Miscanthus sp., Sorghum sp. X Miscanthus sp., por exemplo, Panicum virgatum x Panicum amarum, Panicum virgatum x Panicum amarulum, e Pennisetum purpureum x Pennisetum typhoidum). D. Fenótipos de Plantas Transgênicas

[0158] Em algumas modalidades, uma planta expressando um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio pode ter níveis aumentados de tolerância ao alumínio nas plantas. O nível da tolerância ao alumínio pode ser aumentando em pelo menos 2 por cento, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, ou mais que 60 por cento, em comparação ao nível de tolerância ao alumínio numa planta controle correspondente que não expressa o transgene. Conforme descrito acima, a tolerância ao alumínio pode ser avaliada, monitorando o crescimento da raiz ou a altura da planta em solos ácidos contendo níveis elevados de Al3+.

[0159] Uma planta, na qual a expressão de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio é modulada, pode ter níveis aumentados ou diminuídos da produção de semente. O nível pode ser aumentado ou diminuído em pelo menos 2 por cento, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, ou mais que 35 por cento, em comparação ao nível de produção de sementes num planta controle correspondente que não expressa o transgene. Os aumentos na produção de semente podem proporcionar melhor disponibilidade nutricional em locais geográficos, onde a ingestão de alimentos vegetais é frequentemente insuficiente, ou para a produção de biocombustível.

[0160] Normalmente, uma diferença na quantidade da tolerância ao alumínio (por exemplo, conforme medido pelo crescimento da raiz ou da altura da planta) numa planta transgênica, em relação a uma planta controle é considerada estatisticamente significativo em p<0,05 com uma estatística paramétrica ou não paramétrica apropriada, por exemplo, teste qui-quadrado, teste- t de Student, teste de Mann-Whitney, ou teste-F. Em algumas modalidades, uma diferença na quantidade da tolerância ao alumínio é estatisticamente significativa p<0,01, p<0,005, ou p< 0,001. Uma diferença estatisticamente significativa em, por exemplo, a quantidade de tolerância de alumínio em uma planta transgênica, em comparação à quantidade de uma planta controle indica que o ácido nucleico recombinante presente na planta transgênica resulta em níveis alterados da tolerância ao alumínio.

[0161] O fenótipo de uma planta transgênica é avaliado em relação a uma planta controle. Uma planta é dita "não expressar" um polipeptídeo quando a planta exibe menos que 10%, por exemplo, menos que 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01%, ou 0,001%, da quantidade do polipeptídeo ou mRNA que codifica o polipeptídeo exibido pela planta de interesse. A expressão pode ser avaliada usando métodos incluindo, por exemplo, RT-PCR, Northern blots, proteção da S 1 RNase, extensões por iniciador, Western blots, eletroforese em gel de proteína, imunoprecipitação, imunoensaios ligados a enzima, ensaios de lamínulas e espectrometria de massa. Deve ser notado que se um polipeptídeo for expresso sob o controle de um promotor de ampla expressão ou preferencial de tecido, a expressão pode ser avaliada na planta inteira ou num tecido selecionado. De forma semelhante, se um polipeptídeo for expresso num momento específico, por exemplo, num tempo específico no desenvolvimento ou após a indução, a expressão pode ser avaliada seletivamente num período de tempo desejado. V. Modificação de Ácidos Nucleicos Endógenos que Codificam Polipeptídeos Moduladores da Tolerância ao Alumínio

[0162] Este documento também apresenta células vegetais e plantas, nas quais um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio endógeno descrito neste documento foi modificado (por exemplo, uma região reguladora, íntron, ou região codificadora do ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio foi modificada). A tolerância ao alumínio dessas plantas é alterada em relação ao nível correspondente de uma planta controle, na qual o ácido nucleico endógeno não está modificado. Essas plantas são referidas neste documento como plantas modificadas e podem ser usadas para produzir, por exemplo, maiores quantidades da tolerância ao alumínio.

[0163] O ácido nucleico endógeno pode ser modificado por técnicas de recombinação homóloga. Por exemplo, endonucleases de sequência específica (por exemplo, nucleases de dedo de zinco (ZFNs)) e meganucleases podem ser usadas para estimular a recombinação homóloga em genes endógenos de plantas. Vide, por exemplo, Townsend et al., Nature 459:442-445 (2009); Tovkach et al., Plant J., 57:747-757 (2009); e Lloyd et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:2232-2237 (2005). Em particular, as ZFNs projetadas para criar quebras na fita dupla de DNA em loci específicos podem ser usadas para produzir mudanças na sequência alvo em genes endógenos da planta. Por exemplo, um gene endógeno da planta pode ser substituído por uma variante que contém uma ou mais mutações (por exemplo, produzida usando mutagênese sítio-dirigida ou evolução direcionada). Em algumas modalidades, a mutagênese sítio direcionada é alcançada através de uma junção de extremidade não homóloga, tal que após a quebra do DNA, os mecanismos de reparo do DNA endógeno ligam a quebra, geralmente introduzindo suaves deleções ou adições que podem ser triadas no nível da célula ou da planta para os fenótipos desejados. Moore and Haber, Mol Cell Biol, 16(5):2164-73 (1996).

[0164] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos endógenos podem ser modificados por metilação ou desmetilação, tal que a expressão o ácido nucleico modificado é alterado. Por exemplo, um RNA de fita dupla pode ser usado para ativar a expressão gênica através do direcionamento de regiões reguladoras não codificantes nos promotores do gene. Vide Shibuya et al., Proc Natl Acad Sci USA, 106(5): 1660-1665 (2009); e Li et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103(46): 17337-42 (2006). Em algumas modalidades, as ZFNs projetadas para criar quebras da fita dupla do DNA em loci específicos podem ser usadas para inserir um fragmento de DNA tendo pelo menos uma região que se sobrepõe ao DNA endógeno para facilitar a recombinação homóloga, tal que a porção que não se sobrepõe do fragmento de DNA está integrada no sítio da quebra. Por exemplo, um fragmento pode ser inserido um promotor endógeno e/ou numa região reguladora em um sítio específico, onde uma ZFN cria uma quebra da fita dupla para alterar a expressão de um gene endógeno. Por exemplo, um fragmento que é inserido em uma região de codificação do gene endógeno em um sítio específico, onde uma ZFN cria uma quebra na fita dupla pode resultar na expressão de um gene quimérico. Por exemplo, um fragmento que funciona como uma região reguladora ou promotor que é inserido em uma região do DNA endógeno, imediatamente a montante de uma sequência codificante do gene em um sítio específico uma ZFN cria uma quebra da fita dupla, pode resultar numa expressão alterada do gene endógeno.

[0165] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos endógenos podem ser modificados usando marcação de ativação. Por exemplo, um vetor contendo múltiplas cópias de um elemento potenciador do promotor constitutivamente ativo do gene 35 S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) pode ser usado para ativar um gene endógeno. Vide, Weigel et al., Plant Physiology, 122: 1003-1013 (2000).

[0166] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos endógenos podem ser modificados pela introdução de um fator de ativação/repressão da transcrição projetado (por exemplo, fator de transcrição da proteína de dedo de zinco ou ZPT TF). Vide, por exemplo, a world wide web em sangamo.eom/tech/tech_plat_over.html#whatarezfp). Por exemplo, uma sequência sintética do fator de transcrição de um domínio de ligação do DNA de dedo de zinco e de um domínio de ativação VP 16 pode ser projetada para se ligar a um sítio de DNA endógeno específico e alterar a expressão de um gene endógeno. Um fator de ativação/repressão da transcrição projetado (tal como ZFP TF) pode ativar, reprimir ou mudar a expressão do gene endógeno alvo da tolerância ao alumínio por se ligar especificamente a uma região promotora ou região codificadora do gene endógeno. As nucleases projetadas que clivam sequências de DNA específicas in vivo também podem ser reagentes valiosos para a mutagênese direcionada. Uma dessas classes de nucleases de sequência específica pode ser criada pela fusão de efetores semelhantes a ativadores da transcrição (TALEs) com o domínio catalítico da endonuclease Fokl. Ambas as fusões de TALE-nuclease personalizadas e nativas dirigem as quebras da fita dupla do DNA para sítios direcionados específicos. Christian et al., Genetics 186: 757-761 (2010).

[0167] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos endógenos podem ser modificados por mutagênese. Mutações genéticas podem ser introduzidas no tecido vegetal regenerável, usando um ou mais agentes mutagênicos. Agentes mutagênicos adequados incluem, por exemplo, etil metano sulfonato (EMS), N-nitroso-N-etilureia (ENU), metil N-nitrosoguanidina (MNNG), brometo de etídio, diepoxibutano, radiação ionizante, raios-x, raios UV e outros mutagenos conhecidos na técnica. Tipos adequados de mutações incluem, por exemplo, inserções ou deleções de nucleotídeos, e transições ou transversões na sequência do ácido nucleico endógeno. Em uma modalidade, TILLING (Lesões Locais Induzidas Direcionadas Em Genomas) podem ser usadas para produzir plantas tendo um ácido nucleico endógeno modificado. TILLING combina a mutagênese de alta densidade aos métodos de triagem de alta produtividade. Vide, por exemplo, McCallum et al., Nat Biotechnol 18: 455-457 (2000); revisado por Stemple, Nat Rev Genet 5(2): 145-50 (2004).

[0168] Em algumas modalidades, um ácido nucleico endógeno pode ser modificado através de uma técnica de silenciamento de gene. Vide, por exemplo, a seção neste documento relativa a "Inibição da Expressão de um Polipeptídeo Modulador da Tolerância ao Alumínio".

[0169] A população de plantas pode ser triada e/ou selecionada para aqueles membros da população que têm um ácido nucleico modificado. Uma população de plantas também pode ser triada e/ou selecionada para aqueles membros da população que têm um traço ou fenótipo conferido pela expressão do ácido nucleico modificado. Como uma alternativa, uma população de plantas pode ser triada para aquelas plantas tendo um traço desejado, tal como um nível modulado de tolerância ao alumínio. Por exemplo, uma população da progênie pode ser triada para aquelas plantas tendo um nível desejado de expressão de um polipeptídeo modulador da tolerância ao alumínio ou do ácido nucleico. Métodos físicos e bioquímicos podem ser usados para identificar os ácidos nucleicos modificados e/ou níveis de expressão, conforme descrito com plantas transgênicas. A seleção e/ou triagem podem ser realizadas ao longo de uma ou mais gerações, e/ou em mais de uma localização geográfica. Em alguns casos, as plantas podem ser cultivadas e selecionadas sob condições que induzem um fenótipo desejado ou, de outra forma, são necessárias para produzir um fenótipo desejado em uma planta modificada. Além disso, a seleção e/ou triagem podem ser aplicadas durante um estágio de desenvolvimento específico, no qual o fenótipo é esperado para ser exibido pela planta. A seleção e/ou triagem pode ser realizada para escolher aquelas plantas modificadas tendo diferença estatisticamente significativa em um nível de tolerância ao alumínio em relação a uma planta controle, na qual o ácido nucleico não foi modificado. As plantas modificadas selecionadas ou triadas têm um fenótipo alterado, em comparação a uma planta controle correspondente, conforme descrito na seção "Fenótipos de Plantas Transgênicas" neste documento.

[0170] Embora uma planta ou célula vegetal na qual um ácido nucleico modulador da tolerância ao alumínio endógeno tenha sido modificada, ela não é transgênica para esse ácido nucleico em particular, será apreciado que essa planta ou célula pode conter transgenes. Por exemplo, uma planta modificada pode conter um transgene para outros traços, tais como a tolerância a herbicida ou resistência a insetos. Como outro exemplo, uma planta modificada pode conter um ou mais transgenes que, em conjunto com as modificações de um ou mais ácidos nucleicos endógenos, exibe um aumento na tolerância ao alumínio.

[0171] Assim como com as células vegetais transgênicas, as células vegetais modificadas podem constituir parte ou o todo de uma planta inteira. Essas plantas podem ser cultivadas da mesma forma conforme descrito para plantas transgênicas e podem ser reproduzidas ou propagadas da mesma forma, conforme descrito para plantas transgênicas. VI. Reprodução de Plantas

[0172] Polimorfismos genéticos que são úteis nesses métodos incluem repetições simples de sequência (SSRs, ou microssatélites), amplificação rápida de DNA polimórfico (RAPDs), polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs), polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLPs) e polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs). Os polimorfismos SSR podem ser identificados, por exemplo, produzindo sondas específicas de sequência e amplificando o DNA do modelo de indivíduos na população de interesse por PCR. Por exemplo, as técnicas PCR podem ser usadas para amplificar enzimaticamente um marcador genético associado a uma sequência nucleotídica, conferindo um traço específico (por exemplo, sequências nucleotídicas descritas neste documento). A PCR pode ser usada para amplificar sequências específicas de DNA, bem como de RNA, incluindo sequências de DNA genômico total ou RNA celular total. Ao usar o RNA como uma fonte de modelo, a transcriptase reversa pode ser usada para sintetizar fitas de DNA complementares (cDNA). Vários métodos de PCR são descritos, por exemplo, em PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995.

[0173] Geralmente, as informações da sequência de polinucleotídeos, que flanqueiam a região de interesse ou além desta, são empregadas para projetar iniciadores de oligonucleotídeos que são idênticos ou semelhantes na sequência a fitas opostas do modelo a ser amplificado. Os iniciadores têm normalmente de 14 a 40 nucleotídeos de comprimento, mas podem variar de 10 nucleotídeos a centenas de nucleotídeos de comprimento. O DNA do modelo e o amplificado é repetidamente desnaturado numa alta temperatura para separar a fita dupla, em seguida, resfriado para permitir o anelamento dos iniciadores e a extensão das sequências de nucleotídeos através do microssatélite, resultando em DNA suficiente para a detecção dos produtos de PCR. Se as sondas flanquearem um SSR na população, produtos de PCR de diferentes tamanhos serão produzidos. Vide, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.766.847.

[0174] Os produtos de PCR podem ser qualitativa ou quantitativamente analisados usando diversas técnicas. Por exemplo, os produtos de PCR podem ser corados com uma molécula fluorescente (por exemplo, PicoGreen® ou OliGreen®) e detectados em solução usando espectrofotometria ou eletroforese capilar. Em alguns casos, os produtos de PCR podem ser separados em uma matriz de gel (por exemplo, agarose ou poliacrilamida) por eletroforese, e as bandas de tamanho fracionado que compreendem os produtos de PCR podem ser visualizados usando corantes de ácidos nucleicos. Corantes adequados podem fluorescer sob a luz UV (por exemplo, Brometo de Etídio, GR Safe, SYBR® Green, ou SYBR® Gold). Os resultados podem ser visualizados através de transiluminação ou epi-iluminação, e uma imagem de padrão fluorescente pode ser adquirida usando uma câmera ou scanner, por exemplo. A imagem pode ser processada e analisada usando um software especializado (por exemplo, Image J) para medir e comparar a intensidade de uma banda de interesse contra um padrão carregado no mesmo gel.

[0175] Alternativamente, os polimorfismos SSR podem ser identificados usando produto(s) de PCR como uma sonda contra os Southern blots de diferentes indivíduos na população. Vide, U.H. Refseth et al., (1997) Electrophoresis 18: 1519. Brevemente, os produtos de PCR são separados pelo comprimento através da eletroforese em gel e transferidos para uma membrana. Sondas de DNA específicas de SSR, tais como oligonucleotídeos marcados moléculas radioativas, fluorescentes ou cromogênicas, são aplicadas à membrana e hibridizam em produtos de PCR ligados com uma sequência nucleotídica complementar. O padrão de hibridação pode ser visualizado por autorradiografia ou pelo desenvolvimento de cor na membrana, por exemplo.

[0176] Em alguns casos, os produtos de PCR podem ser quantificados usando um sistema de detecção do termociclador em tempo real. Por exemplo, o PCR quantitativo em tempo real pode usar um corante fluorescente que forma um complexo DNA-corante (por exemplo, SYBR® Green), ou uma sonda de DNA contendo fluoróforo, tal como oligonucleotídeos de fita única covalentemente ligados a um repórter fluorescente ou fluoróforo (por exemplo, 6-carboxifluoresceína ou tetraclorofluresceína) e um extintor (por exemplo, ligante de encaixe menor de tripeptídeo de tetrametilrrodamina ou dihidrociclopirroloindol). O sinal fluorescente permite a detecção do produto amplificado em tempo real, indicando, desse modo, a presença de uma sequência de interesse e permitindo a quantificação do número de cópias de uma sequência de interesse no DNA celular ou do nível de expressão de uma sequência de interesse do mRNA celular.

[0177] A identificação de RFLPs é discutida, por exemplo, em Alonso-Blanco et al. (Methods in Molecular Biology, vol.82, "Arabidopsis Protocols", pp. 137-146, J.M. Martinez-Zapater and J. Salinas, eds., c. 1998 por Humana Press, Totowa, NJ); Burr ("Mapping Genes with Recombinant Inbreds", pp. 249-254, em Freeling, M. and V. Walbot (Ed.), The Maize Handbook, c. 1994 por Springer-Verlag New York, Inc.: Nova Iorque, NY, USA; Berlim, Alemanha; Burr et al. Genetics (1998) 118: 519; e Gardiner, J. et al., (1993) Genetics 134: 917). Por exemplo, para produzir uma biblioteca de RFLP enriquecida com sequências de baixas ou únicas cópias expressas, o DNA total pode ser digerido com uma enzima sensível à metilação (por exemplo, Pstl). O DNA digerido pode ser separado por tamanho em um gel preparativo. Fragmentos polinucleotídicos (500 a 2000 bp) podem ser retirados, eluídos e clonados em um vetor do plasmídeo (por exemplo, pUC18). Os Southern blots do digeridos do plasmídeo podem ser sondados com o DNA cortado total para selecionar clones que hibridizam em sequências de baixas e únicas cópias. As endonucleases de restrição adicionais podem ser testadas para aumentar o número de polimorfismos detectados.

[0178] A identificação de AFLPs é discutida, por exemplo, em EP 0 534 858 e Pat. US N°. 5.878.215. Em geral, o DNA celular total é digerido com uma ou mais enzimas de restrição. Adaptadores de meio-sítio específico de restrição são ligados a todos os fragmentos de restrição e os fragmentos são seletivamente amplificados com dois iniciadores de PCR que têm sequências específicas de sítio de restrição e de adaptador correspondentes. Os produtos de PCR podem ser visualizados após o fracionamento de tamanho, conforme descrito acima.

[0179] Em algumas modalidades, os métodos são dirigidos para a reprodução de uma linhagem de planta. Esses métodos usam polimorfismos genéticos identificados conforme descrito acima em um programa de reprodução auxiliado por um marcador para facilitar o desenvolvimento de linhagens que têm uma alteração desejada no traço da tolerância ao alumínio. Uma vez que um polimorfismo genético adequado é identificado como estando associado à variação para o traço, uma ou mais plantas individuais são identificadas como possuindo o alelo polimórfico correlacionado à variação desejada. Essas plantas são então usadas em um programa de reprodução para combinar o alelo polimórfico com uma pluralidade de outros alelos em outros loci que são correlacionados com a variação desejada. Técnicas adequadas para uso em um programa de reprodução de plantas são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, retrocruzamento, seleção em massa, reprodução de pedigree, seleção em massa, cruzamento com outra população e seleção recorrente. Essas técnicas podem ser usadas sozinhas ou em combinação com uma ou mais outras técnicas em um programa de reprodução. Assim, cada planta identificada é autocruzada ou cruzada com uma planta diferente para produzir sementes, que são então germinadas para formar plantas de progênie. Pelo menos um dessas plantas a progênie é então autocruzada ou cruzada com uma planta diferente para formar uma geração de progênie subsequente. O programa de reprodução pode repetir as etapas de autocruzamento ou cruzamento externo para 0 a 5 gerações adicionais, conforme apropriado, a fim de alcançar a uniformidade e estabilidade desejadas na linhagem de planta resultante, que mantém o alelo polimórfico. Na maioria dos programas de reprodução, a análise para o alelo polimórfico particular será realizada em cada geração, embora a análise possa ser realizada em gerações alternadas, se desejado.

[0180] Em alguns casos, a seleção para outros traços úteis é também realizada, por exemplo, seleção para resistência fúngica ou resistência bacteriana. A seleção para esses outros traços pode ser realizada antes, durante ou após a identificação de plantas individuais que possuem o alelo polimórfico desejado. VII. Artigos de Fabricação

[0181] As plantas transgênicas fornecidas neste documento têm diversos usos na indústria agrícola e de produção de energia. Por exemplo, as plantas transgênicas descritas neste documento podem ser usadas para produzir alimentos animais e produtos alimentícios. Essas plantas, no entanto, são muitas vezes particularmente úteis como uma matéria-prima para a produção de energia.

[0182] As plantas transgênicas descritas neste documento produzem altos rendimentos de grão e/ou biomassa por hectare, em relação às plantas controle que carecem do ácido nucleico exógeno ou que carecem do ácido nucleico endógeno modificado quando cultivadas em solos com um pH menor que 5 e níveis elevados de alumínio. Por exemplo, as plantas transgênicas descritas neste documento podem ter um rendimento de grão que é aumentado em cerca de 5% a cerca de 20% (por exemplo, aumentado 5% a 10%, 5% a 15%, 10% a 15%, 10% a 20%, ou 15% a 20%) em relação àquele das plantas controles que carecem do ácido nucleico exógeno ou que carecem o ácido nucleico endógeno modificado. Em algumas modalidades, essas plantas transgênicas fornecem rendimentos iguais ou até mesmo aumentados de grão e/ou biomassa por hectare em relação às plantas controle, quando cultivadas sob condições de produções reduzidas, tais como fertilizante e/ou água. Assim, essas plantas transgênicas podem ser usadas para fornecer a estabilidade do rendimento em uma produção de menor custo e/ou sob condições ambientalmente estressantes, tais como baixo pH e níveis elevados de alumínio.

[0183] Em algumas modalidades, as plantas descritas neste documento têm uma composição que permite um processamento mais eficiente em açúcares livres, e subsequentemente etanol, para a produção de energia. Em algumas modalidades, essas plantas fornecem rendimentos maiores de etanol, butanol, dimetil éter, outras moléculas de biocombustível, e/ou co-produtos derivados do açúcar por quilograma de material da planta, em relação às plantas controles. Essas eficiências de processamento são acreditadas serem derivadas da composição do material da planta, incluindo, mas não se limitando a, o teor de glucano, celulose, hemicelulose e lignina. Fornecendo rendimentos mais altos a um custo de produção equivalente ou mesmo diminuído, as plantas transgênicas descritas neste documento melhoram a rentabilidade para os agricultores e processadores, bem como diminuem os custos para os consumidores.

[0184] As sementes de plantas transgênicas descritas neste documento podem ser condicionadas e ensacadas em material de embalagem por meios conhecidos na técnica para formar um artigo de fabricação.

[0185] O material de embalagem, tal como papel e tecido, são bem conhecidos na técnica. Um pacote de sementes pode ter um rótulo, por exemplo, uma etiqueta ou rótulo fixado ao material da embalagem, um rótulo impresso sobre o material da embalagem, ou um rótulo inserido dentro do pacote, que descreve a natureza das sementes nele.

[0186] A invenção será descrita ainda nos exemplos a seguir, que não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações. VIII. Exemplos Exemplo 1 - Materiais e Métodos

[0187] Meios de cultura de planta de ágar carecendo de fosfato foram preparados em garrafas de vidro Pyrex de 2 L e continham o seguinte por 1 L: 0,78 g/L de ^ x MS sem KH2PO4 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,5g/L de MES (Sigma Chemical Co.) e 7g/L de 0,7% de Phytagar (EM Science, Gibbstown, Nova Jersey). Os meios foram agitados por 30 minutos após a adição de ^ MS. O pH após o MS foi completamente dissolvido próximo a pH 5,7 e ajustado usando KOH. O pH final de cada lote foi medido devido à variação de pH entre os lotes. As preparações dos meios foram autoclavadas a cerca de 121°C por 25 minutos em uma configuração líquida. Aproximadamente 40 mL dos meios foram adicionados a cada placa quadrada (100 x 100 x 15 mm) em uma capela de fluxo laminar, usando um dispositivo de distribuição de líquido ou pipeta estéril de 50 mL. As placas foram imediatamente cobertas com tampas para evitar a contaminação. As placas foram deixadas resfriar em uma capela de fluxo laminar por pelo menos 1 hora, mas não mais de 3 horas, com um ventilador. As placas foram armazenadas a 4°C em sacos.

[0188] Os meios líquidos carecendo de fosfato para uso em ensaios de Al+3 foram preparados em garrafas de vidro Pyrex de 2 L e continham por 1 L: 0,78 g/L de sal MS sem KH2PO4 (Sigma Chemical Co.), 0,5 g/L de MES (Sigma Chemical Co.) e 6 mL de AICI3 0,1 M (Sigma Chemical Co.) (600 μM AICI3 e prevista a atividade de Al +3 de 160 μM). Os meios foram agitados por 30 minutos enquanto o pH foi ajustado lentamente para pH 4,0, usando HCL 1N. O AICI3 foi adicionado após a autoclavagem. As preparações foram autoclavadas a cerca de 121°C por 25 minutos em uma configuração líquida.

[0189] Os meios de tampão de ágar carecendo de fosfato, para uso em ensaios de Al+3 , foram preparados em garrafas de vidro Pyrex de 2 L e continham por 1 L: 0,78 g/L de sal MS sem KH2PO4 (Sigma Chemical Co.), 0,5 g/L de MES (Sigma Chemical Co.), e 4 g/L de Phytagar (EM Science), com HCL 1N usado para ajustar a um pH de 4,8. Os meios foram agitados por 30 minutos após a adição de Phytagar e HCL 1 N. O pH final de cada lote foi registrado devido à variação de pH entre os lotes. As preparações dos meios foram autoclavadas a cerca de 121°C por 25 minutos em uma configuração líquida. Aproximadamente 20 mL de ágar aquecido contendo os meios de Al+3 foram aliquotadas para cada um dos 10 poços horizontais dentro de cada caixa hidropônica (10 poços horizontais por caixa/10 sementes por poço horizontal), usando uma pipeta estéril de 50 mL e deixados solidificar por cerca de 2 horas antes da produção de camadas de 10 mL de meios de Al+3 líquidos resfriados em cima dos meios de ágar descritos acima. Uma fina camada dos meios líquidos flutuava e foi suspensa sobre os meios de ágar solidificado carecendo de fosfato e contendo Al+3. As caixas hidropônicas foram imediatamente cobertas com tampas para evitar a contaminação e a evaporação da camada de líquido antes de infiltrações de Al+3 na camada de ágar sólido. As caixas hidropônicas foram deixadas descansar na capela de fluxo laminar por pelo menos 1 hora, mas não mais de 3 horas, com um ventilador (para evitar a evaporação da camada de líquido durante a infiltração). As caixas hidropônicas foram armazenadas em 4°C.

[0190] Para esterilizar as sementes, o número apropriado de sementes de cada planta candidata ou evento de linha de ME foi transferido para tubos individuais de 2 mL e 1 mL de descolorante Clorox 30% foi adicionado a cada tubo e agitado manualmente por pelo menos 5 minutos até que todas as sementes se tornem suspensas. Solução de descolorante foi, em seguida, descartada e as sementes foram lavadas assepticamente com água estéril nanopura pelo menos 4 vezes ou até que as sementes sejam completamente lavadas. Exemplo 2 Ensaio de Al+3 para Arabidopsis thaliana Transgênica

[0191] Quarenta e oito sementes da geração T3 de cada um dos eventos ME02064 transgênicos -01, -04, - 03, mais um controle de vetor vazio (SR00559), foram esterilizados e colocados em placas de meios de ágar carecendo de fosfato hidroponicamente suspenso sobre meios líquidos de Al+3 (vide o Exemplo 1). Em cada caixa mini-hidropônica, 48 sementes controle mais 48 sementes de ME02064 foram semeadas. As caixas foram mantidas em um refrigerador a 4°C no escuro por 3 dias para promover a germinação uniforme. Após 3 dias de tratamento pelo frio, as caixas foram colocadas horizontalmente em uma câmara de crescimento Conviron, conforme descrito acima. As placas foram examinadas usando um scanner formador de imagens de fluorescência (Techno logica Ltd, Colchester, UK) em 7 dias e 14 dias após a semeadura das sementes. As plantas foram pontuadas pelo crescimento quando a toxicidade de Al+3 (por exemplo, o crescimento impedido da raiz e área de roseta diminuída) tornou- se aparente, geralmente em torno de 10 dias.

[0192] A área das mudas e a intensidade de fluorescência (Fv/Fm) foram quantificadas de forma agrupada. As medidas de FV/Fm, bem como o crescimento da área de roseta para cada planta individual não foram feitas. Em vez disso, as populações das mudas -01,-04, &-03 (48 mudas) foram comparadas com o controle agrupado (48 mudas) dentro da mesma caixa mini-hidropônica. O crescimento total de roseta foi medido para 48 mudas a partir de linhagens transgênicas e para 48 mudas das linhagens controle. O estresse que resultou em diminuições da eficiência quântica da fotoquímica (centros de reação de FSII abertos), determinado pelo Fv/Fm de plantas adaptadas ao escuro, foi considerado um indicador de inibição da fotossíntese pelo Al+3. A resistência de Basta não foi testada, uma vez que outros ensaios indicaram que essas linhagens eram transgênicas.

[0193] A área de roseta foi maior em 10 dias, em todos os eventos transgênicos de -01,-04, &-03, quando comparados aos controles de vetores vazios (SR00559), conforme mostrado na Tabela 1. No entanto, nenhuma diferença visual no crescimento da raiz foi observada (dados não mostrados). As raízes para os transgênicos e controles estavam todas gravemente atrofiadas, falhando na penetração do suporte dos meios de ágar nos meios líquidos de alto Al+3 . A média Fv/Fm parecia ser moderadamente maior nos eventos transgênicos -01,-04, &-03, em relação aos controles, mas não houve diferença estatisticamente significativa. TABELA 1

Exemplo 3 Ensaio de Al para Plantas Switchgrass Transgênicas

[0194] Um vetor binário de T-DNA contendo Ceres Clone 375578 (SEQ ID NO:352) foi introduzido em switchgrass pela transformação mediada por Agrobacterium essencialmente descrita em Richards et al. , Plant Cell. Rep. 20:48-54 (2001) e Somleva, et al., Crop Sci. 42:2080-2087 (2002). A presença do transgene foi confirmada por PCR. As plantas compreendendo o transgene foram cultivadas em solo ácido contendo altos níveis de Al+3. O solo foi feito por dissolução de A1C13 em água e regamento do solo com a água aluminizada. O solo foi, em seguida, acidificado usando água tamponada com pH 4 para liberar o íon de alumínio tóxico. Devido à acidez do solo determinar quanto do Al+3 está presente como o íon livre tóxico, o valor de Al+3 era variável. As plantas switchgrass não transgênicas controle (Wt) e plantas transgênicas (CeresClone 375578) foram colocadas no solo em vasos separados em uma ambiente de crescimento e deixadas crescer sob as condições padrão do ambiente de crescimento. As plantas não transgênicas foram geradas a partir de calos sem o co-cultivo com agrobactéria. Havia uma planta por vaso. As plântulas foram regadas com um dos seguintes três tratamentos: Tratamento 1: 2 L de água, pH 7,26; Tratamento 2: 2 L de água, pH 4,0; e Tratamento 3: 2 L de água, pH 4,0 + ~ 11 g/Kg de solo Al+3 (-621 μM). O tamanho dos transgênicos e controles pareceu semelhante quando o tratamento foi iniciado, mas nenhuma medida foi feita. Após 16 dias, as mudas foram colhidas, lavadas e secas em um forno de secagem. A biomassa de peso seco foi medida para cada planta.

[0195] O crescimento da planta aérea transgênica foi maior nos eventos de switchgrass transgênica do que nos controles, conforme indicado por um aumento no peso total da planta (brotos e raízes). O aumento foi estatisticamente significativo em um valor de P de 0,05 quando comparado às plantas do tipo selvagem (vide a Figura 5, Tabelas 2 e 3). O crescimento da raiz nas linhagens transgênicas foi visualmente mais robusto do que nos controles do tipo selvagem. Esses resultados indicam que a switchgrass contendo Ceres Clone 375578 pode sobreviver no solo acidificado com uma concentração de cloreto de alumínio de cerca de 11 g/kg de solo. TABELA 2

TABELA 3.

[0196] Os resultados também indicam que as plantas do tipo selvagem regadas com o Tratamento 3 (pH 4, mas sem AICI3) tinham um peso total da planta que foi menor do que o peso seco total da planta das plantas do tipo selvagem regadas com o Tratamento 3. Os resultados também indicam que a diminuição no peso seco total da planta visto sob as condições do Tratamento 3 foi o resultado da toxicidade de Al+3 , porque as plantas do tipo selvagem cultivadas sob as condições do Tratamento 2 (pH 4, mas sem A1C13 ) não mostraram essa diminuição no peso seco total da planta (vide a Tabela 3). Exemplo 4 - Germinação de Mudas de Arroz em Meios Contendo Alumínio

[0197] Neste exemplo, o papel de CeresClone 24255 (Os713, 3 eventos), CeresClone 1752915 (Os825, 3 eventos), e CeresClone 11684 (Os879, 3 eventos) foi avaliado em sementes de arroz germinadas na presença de alumínio. As sementes do controle interno do tipo selvagem (segregante nulo) e as plantas transgênicas homozigotas foram colocadas em duas placas separadas para cada evento. Cada prato tinha duas fileiras de 12 sementes alinhadas em paralelo. As sementes externas do tipo selvagem foram semeadas ao mesmo tempo sob condições do controle (sem cloreto de alumínio), usando o mesmo formato para a comparação da taxa de germinação e de crescimento das condições de Al+3.

[0198] As sementes descascadas, não esterilizadas, foram germinadas sob condições normais ou de estresse por alumínio, conforme se segue: As condições normais incluíam uma placa (150 mm x 100 mm x 15 mm) contendo 30 mL de meio ^ MS sem fosfato e nitrogênio, sem açúcar, 4g de ágar/L, pH 5,7. As condições de estresse por alumínio incluíam uma placa (150 mm x 100 mm x 15 mm) contendo 20 mL do meio ^ MS sem fosfato e nitrogênio, sem açúcar, 4g de ágar/L, pH 5,7, infiltrado com 10 mL de meio de infiltração líquido de AICI3 contendo 600 μM de AICI3 (que corresponde a uma atividade de íon prevista de 160 μM nas placas) em ^ MS, pH 4. O meio de infiltração líquido de AICI3 foi adicionado no topo do meio de alumínio e deixado repousar por 24 horas antes da colocação da semente na superfície. O meio de infiltração líquido de AICI3 consistia em: meios ^ MS sem fosfato ou nitrogênio; sem açúcar ou ágar; e 600 μM de A1C13, com o pH ajustado para 4,0 com HC1 1N. As atividades previstas de Al+3 foram confirmadas com GEOCHEM-EZ, um programa de especiação química de múltiplas finalidades. Vide, Shaff et al., Plant Soil 330: 207-214 (2010).

[0199] As placas com tampas não foram vedadas, mas foram colocadas dentro de sacos ziplock grandes para manter a umidade na câmara de crescimento (25°C, 70% de umidade por 8 horas de luz/16 horas de escuro). Em 13 dias, as mudas foram medidas para a altura e o comprimento da raiz da planta. Vide as Tabelas 4 e 5. Para Os713, a altura e o comprimento da raiz da planta não foram significativamente diferentes entre as plantas transgênicas e os controles não transgênicos. Para o evento 9 de Os825, observou-se um aumento significativo na altura da planta em comparação com o controle não transgênico agrupado. Para o evento 7 de Os879, observou-se um aumento significativo na altura da planta em comparação com o controle interno não transgênico. Para evento 4 de Os879, observou-se um aumento significativo na altura da planta em comparação com o controle interno não transgênico, bem como um aumento significativo no comprimento da raiz em comparação com o controle não transgênico agrupado. Para evento 8 de Os870, observou-se um aumento significativo no comprimento da raiz em comparação com os controles não transgênicos internos e agrupados. Petição 870200162076, de 28/12/2020, pág. 154/192 TABELA 4

TABELA 5

Exemplo 5 - Crescimento da Muda de Arroz Transgênico Contendo CeresClone 375578, CeresClone 24255, e CeresClone 11684 em Arroz

[0200] Os experimentos descritos no Exemplo 4 foram repetidos usando eventos de arroz transgênico para CeresClone 375578 (Linhagem 745282, um dos 7 eventos), CeresClone 24255 (Os713, 3 eventos) e CeresClone 11684 (Os879, 3 eventos). Após a germinação em condições normais ou de alumínio, conforme descrito no Exemplo 4, e incubação por 10 ou 11 dias na câmara de crescimento, as mudas sobreviventes foram transplantadas para o solo (60% de Sunshine Professional Mix (com vermiculita); 40% de Turface; 1 colher de sopa/3L de Osmocote; 1,5 colher de sopa/3L de farinha de ossos; e 0,5 colher de sopa/3L de Marathon).

[0201] As plantas foram genotipadas conforme se segue. As plantas foram deixadas recuperar até o estágio de duas folha, em seguida, genotipadas através do corte de segmentos de folha de 5 a 6 mm da maior das duas folhas e colocadas em placas de meio de canamicina contendo 160mg/L de canamicina (meio de sal basal M MS; 4,5 g/L de Phytoagar; 100 μE/L de Tween 80; e ajustado para o pH 5,7 com KOH 1N. O meio foi esterilizado sob o ciclo molhado por 30 minutos a 120°C e deixado resfriar antes de adicionar a canamicina para uma concentração final de 160 mg/L). As placas foram vedadas em sacos Ziplock e colocadas em uma câmara de crescimento em cerca de 26 ± 2°C, sob regime de luz crescente normal (16h de luz e 8h de escuro).

[0202] As placas foram removidas da câmara durante um período de luz e examinadas, iniciando no dia 4 do tratamento. Se não estivesse claro, as placas seriam re-examinadas em 5 ou 6 dias após o tratamento. As placas foram examinadas para a quantificação da eficiência fotossintética (PE) para determinar o genótipo. Geralmente, a PE é um parâmetro (Fv/Fm, a razão de florescimento variável sobre o valor de florescimento máximo) usado para indicar a eficiência quântica das reações do fotossistema tipo II (PSII) dentro os cloroplastos das plantas. O parâmetro Fv/Fm é uma indicação da saúde do tecido fotossintético. As amostras de tecido saudável normalmente atingem um valor de Fv/Fm de aproximadamente 0,7-0,85. Valores inferiores são observados se uma amostra for exposta a um fator de estresse biótico ou abiótico que reduz a capacidade do arrefecimento fotoquímico da energia dentro do PSII.

[0203] As imagens da fluorescência da clorofila e os parâmetros de florescimento foram obtidos com o imager Chlorophyll Fluorescence (Techno logica, UK) usando as instruções do fabricante para os materiais adaptados à luz. As regiões representativas da imagem, por exemplo, distantes de qualquer extremidade de corte para evitar efeitos de danos, foram escolhidas para a leitura dos valores de Fv/Fm. A análise por PCR foi usada para confirmar a presença dos transgenes.

[0204] Após a genotipagem, as plantas foram cultivadas em solo e tratadas com qualquer água (normal) ou com água acidificada (~pH 4,0) contendo 600 μM de AICI3. Após 19 dias, o comprimento da raiz e a altura da planta foram medidos. Os dados da raiz e da altura da planta para plantas transgênicas foram estatisticamente comparados às linhagens segregantes internas não transgênicas (NT), linhagens segregantes internas NT agrupadas, linhagens NT externas e todas as linhagens NT. As comparações também foram feitas para plantas não tratadas com água contendo AL.

[0205] As Tabelas 6 e 7 contêm os resultados da linhagem 745282 (7 eventos) para a expansão da raiz em 19 dias e altura da planta em 19 dias, respectivamente. Para a linhagem 745282, observou-se um aumento significativo na expansão da raiz para os eventos 745282, 745284, 745252, e 745307; observou-se um aumento significativo na altura da planta para os eventos 745284 e 745236.

[0206] As Tabelas 8 e 9 contêm os resultados para Os713 e Os879 para a expansão da raiz em 19 dias e altura da planta em 19 dias, respectivamente. Para Os879, observou-se um aumento significativo na altura da planta para o evento 7. TABELA 6

TABELA 7

TABELA 8

TABELA 9

Exemplo 6 - Determinação dos Homólogos Funcionais por BLAST Recíproco

[0207] A sequência candidata foi considerada um homólogo funcional de uma sequência de referência se o candidato e as sequências de referência codificassem proteínas tendo uma função e/ou atividade semelhantes. Um processo conhecido como BLAST Recíproco (Rivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 :6239- 6244 (1998)) foi usado para identificar potenciais sequências homólogas funcionais a partir de bancos de dados de todas as sequências de peptídeos públicas e particulares disponíveis, incluindo NR do NCBU e traduções de peptídeos de clones Ceres.

[0208] Antes de iniciar um processo de BLAST Recíproco, um polipeptídeo de referência específico foi buscado contra todos os peptídeos de suas espécies fonte usando BLAST a fim de identificar os polipeptídeos tendo identidade de sequência de BLAST de 80% ou maior para o polipeptídeo de referência e um comprimento de alinhamento de 85% ou maior ao longo da sequência mais curta no alinhamento. O polipeptídeo de referência e qualquer um dos polipeptídeos identificados mencionados acima foram designados como um cluster.

[0209] O programa BLASTP versão 2.0 da Washington University em Saint Louis, Missouri, Estados Unidos foi usado para determinar a identidade da sequência de BLAST e o valor-E. O programa BLASTP versão 2.0 inclui os seguintes parâmetros: 1) um corte do valor-E de 1.0e-5; 2) um tamanho de palavra de 5; e 3) a opção -postsw. A identidade de sequência de BLAST foi calculada com base no alinhamento do primeiro BLAST HSP (Pares de Segmento de Alta Pontuação) da potencial sequência homóloga funcional com um polipeptídeo de referência específico. O número de resíduos correspondidos de forma idêntica no alinhamento BLAST HSP foi dividido pelo comprimento de HSP, e em seguida multiplicado por 100 para obter a identidade de sequência de BLAST. O comprimento de HSP normalmente incluía lacunas no alinhamento, mas, em alguns casos, as lacunas eram excluídas.

[0210] O processo de BLAST Recíproco principal consiste de duas rodadas de buscas de BLAST; busca direta e busca reversa. Na etapa de busca direta, uma sequência do polipeptídeo de referência, "polipeptídeo A", da espécie de origem SA foi posta no BLAST contra todas as sequências de proteína de uma espécie de interesse. Os hits superiores foram determinados usando um corte de valor-E de 10" 5 e um corte da identidade de sequência de 35%. Entre os hits superiores, a sequência com o valor-E mais baixo foi designada como o melhor hit, e considerado um potencial homólogo funcional ou ortólogo. Qualquer outro hit superior que tinha uma identidade de sequência de 80% ou maior para o melhor hit ou para o polipeptídeo de referência original era considerado um potencial homólogo funcional ou ortólogo também. Este processo foi repetido para todas as espécies de interesse.

[0211] Na rodada da busca reversa, os hits superiores identificados na busca direta de todas as espécies foram postas em BLAST contra todas as sequências de proteínas da espécie de origem SA. Um hit superior da busca direta que retornou um polipeptídeo do cluster mencionado acima como seu melhor hit foi também considerado como um potencial homólogo funcional.

[0212] Os homólogos funcionais foram identificados por inspeção manual de potenciais sequências homólogas funcionais. Os homólogos funcionais representativos para as SEQ ID NOs: 353, 237, 451 e 2 são mostrados nas Figuras 1-4, respectivamente. Os homólogos adicionais exemplares são correlacionados a determinadas Figuras na Listagem de Sequência. Exemplo 7 - Determinação de Homólogos Funcionais por Modelos Ocultos de Markov

[0213] Os Modelos Ocultos de Markov (HMMs) foram gerados pelo programa HMMER 2.3.2. Para gerar cada HMM, os parâmetros padrão do programa HMMER 2.3.2, configurados para os alinhamentos globais, foram usados.

[0214] Um HMM foi gerado usando as sequências mostradas na Figura 1 como entrada. Essas sequências foram ajustadas ao modelo e uma pontuação de bit de HMM representativa para cada sequência é mostrada na Listagem de Sequência. As sequências adicionais foram ajustadas ao modelo, e as pontuações de bit de HMM representativas para quaisquer dessas sequências adicionais são mostradas na Listagem de Sequência. Os resultados indicam que essas sequências adicionais são homólogos funcionais da SEQ ID NO: 353.

[0215] O procedimento acima foi repetido e um HMM foi gerado para cada grupo de sequências mostradas nas Figuras 2-4, usando as sequências mostradas em cada Figura como entrada esse HMM. Uma pontuação de bit representativa para cada sequência é mostrada na Listagem de Sequência. As sequências adicionais foram ajustadas a determinados HMMs, e as pontuações de bit de HMM representativas para essas sequências adicionais são mostradas na Listagem de Sequência. Os resultados indicam que essas sequências adicionais são homólogos funcionais das sequências usadas para gerar esse HMM. Outras Modalidades

[0216] Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com sua descrição detalhada, a descrição anterior destina-se a ilustrar e não a limitar o escopo da invenção, o qual está definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims

1. Método de aumento do rendimento de planta em solo contendo níveis elevados de Al3+, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende o crescimento de uma planta compreendendo um ácido nucleico exógeno no solo tendo um nível elevado de Al3+, o referido ácido nucleico exógeno compreendendo uma região reguladora operacionalmente ligada à sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 365, em que o rendimento da referida planta é maior, em comparação ao rendimento correspondente de uma planta controle que não compreende o referido ácido nucleico, em que a região reguladora é heteróloga no que diz respeito à sequência nucleotídica, e em que a planta pertence à Poaceae.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende ainda a colheita da biomassa da referida planta.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região reguladora é um promotor.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado do grupo consistindo em YP0092, PT0676, PT0708, PT0613, PT0672, PT0678, PT0688, PT0837, o promotor da napina, o promotor da Arcelina-5, o promotor do gene da faseolina, o promotor do inibidor da tripsina de soja, o promotor da ACP, o promotor do gene da estearoil-ACP desaturase, o promotor da subunidade α' da β- conglicinina de soja, o promotor da oleosina, o promotor da zeína de 15 kD, o promotor da zeína de 16 kD, o promotor da zeína de 19 kD, o promotor da zeína de 22 kD, o promotor da zeína de 27 kD, o promotor da Osgt-1, o promotor do gene da beta-amilase, o promotor do gene da hordeína da cevada, p326, YP0144, YP190, p13879, YP0050, p32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, o promotor 35S do vírus do mosaico (CaMV) da couve-flor, o promotor da manopina sintase (MAS), o promotor 1' ou 2' derivado do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor 34S do vírus do mosaico da escrofulária, promotor da actina do arroz, promotor da ubiquitina-1 do milho, promotor da ribulose-1,5- bisfosfato carboxilase (RbcS), o promotor da cab6 do pinho, o promotor do gene da Cab-1 do trigo, o promotor da CAB-1 do espinafre, o promotor da cab1R do arroz, o promotor da piruvato ortofosfato diquinase (PPDK) do milho, o promotor da Lhcb1*2 do tabaco, o promotor do simportador da SUC2 sacarose-H+ da Arabidopsis thaliana, e um promotor da proteína de membrana do tilacoide do espinafre, e PT0585.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta compreendendo o referido ácido nucleico exógeno tem uma taxa de crescimento melhorada em relação a uma planta correspondente que não compreende o referido ácido nucleico.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta compreendendo o referido ácido nucleico exógeno tem um crescimento vegetativo melhorado em relação a uma planta correspondente que não compreende o referido ácido nucleico.

7. Método de aumento da tolerância de uma planta aos níveis elevados de alumínio, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a) a introdução em uma pluralidade de células vegetais de um ácido nucleico exógeno compreendendo uma região reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico heteróloga compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 365; b) a produção de uma planta a partir da referida célula vegetal; e c) o crescimento da referida planta no solo tendo um nível elevado de Al3+, em que a referida planta tem maior rendimento, comparado àquele de uma planta controle que não compreende o referido ácido nucleico, e em que a planta pertence à Poaceae.

8. Método de aumento da tolerância de uma planta aos níveis elevados de alumínio, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a) a introdução em uma pluralidade de células vegetais de um ácido nucleico exógeno compreendendo uma região reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico heteróloga compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 365; e b) a seleção de uma planta produzida a partir de referida pluralidade de células vegetais que tem uma maior tolerância ao Al3+ elevado, em comparação com a tolerância em uma planta controle correspondente que não compreende o referido ácido nucleico exógeno, em que a planta pertence à Poaceae.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região reguladora é um promotor.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de arroz.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de trigo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de milho.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de sorgo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta Switchgrass.