BR112017000760B1 - Métodos para aumentar o rendimento vegetal em uma planta cultivada sob o estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio, e para produzir uma planta com tolerância a estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio - Google Patents

Abstract

São divulgados métodos e materiais para aumentar a tolerância ao estresse abiótico nas plantas. Por exemplo, ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos que aumentam a tolerância ao estresse abiótico são divulgados, assim como os métodos para a utilização de tais ácidos nucleicos para transformar as células vegetais. São também divulgadas as plantas tendo tolerância aumentada ao estresse abiótico e métodos para aumentar o rendimento da planta sob condições de estresse abiótico.

Description

DECLARAÇÃO SOBRE A PESQUISA PATROCINADA DE MODO FEDERAL

[001] Esta invenção foi produzida com o apoio do governo sob EDH-A-00-09-00009 concedido pela USAID. O governo possui certos direitos na invenção.

CAMPO TÉCNICO

[002] Este documento refere-se aos métodos e materiais envolvi dos no aumento do rendimento em vegetais. Por exemplo, este documento fornece plantas e materiais e métodos para a produção de vegetais e produtos vegetais, onde os vegetais possuem um rendimento aumentado em condições de estresse abiótico.

ANTECEDENTES

[003] O estresse abiótico ambiental diminui a produtividade das culturas agrícolas. A seca é um exemplo bem conhecido de um estresse abiótico que periódica ou cronicamente afeta as operações agrícolas. Plantas expostas às condições de pouca água ou seca geralmente têm baixos rendimentos de matéria vegetal, sementes, frutas e outros produtos comestíveis. Algumas áreas do mundo possuem baixa precipitação pluviométrica e oportunidades limitadas de irrigação e, portanto, têm problemas de cultivo de culturas alimentícias suficientes para sua população.

[004] Outro tipo de estresse abiótico refere-se aos altos níveis de sal no solo. Se a concentração de sal excede um limiar relativamente baixo, muitas plantas sofrem de crescimento retardado, necrose e até morte, o que resulta em rendimentos globais reduzidos de matéria vegetal, sementes, frutos e outros produtos valiosos.

[005] Ainda outro estresse abiótico pode ser provocado pela ferti lização do solo mais baixa do que a ideal. O nitrogênio, como pode ser fornecido por fertilizantes contendo nitrogênio, é um nutriente essencial e limitativo requerido para o crescimento da planta. Os suplementos de fertilizante são eficazes no aumento dos rendimentos da cultura, mas o seu uso pesado é prejudicial para o ambiente, a sua aplicação é dispendiosa e a sua oferta limitada em algumas partes do mundo. Assim, existe uma necessidade contínua de métodos e materiais que permitam aumentar a produção de colheita para as culturas cultivadas sob várias condições de estresse abiótico.

SUMÁRIO

[006] Este documento fornece métodos e materiais relacionados às plantas tendo maior tolerância aos estresses abióticos. Por exemplo, este documento fornece plantas transgênicas e células vegetais tendo tolerância aumentada à seca, estresse osmótico e deficiência de nitrogênio, ácidos nucleicos utilizados para gerar plantas transgênicas e células vegetais tendo maior tolerância a tais estresse abióticos, métodos para a produção de plantas com tolerância aumentada aos estresses abióticos, e métodos para a produção de células vegetais que podem ser utilizadas para gerar plantas tendo tolerância aumentada à seca, estresse osmótico e deficiência de nitrogênio. Tais plantas e células vegetais podem ser cultivadas sob tal estresse abiótico, com um rendimento aumentado.

[007] Em um aspecto, este documento apresenta um método para aumentar o rendimento de plantas em uma planta cultivada sob estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio. O método inclui o crescimento de uma planta compreendendo um ácido nucleico exógeno sob estresse de seca, tensão osmótica ou deficiência de nitrogênio, o ácido nucleico exógeno compreendendo uma região reguladora ligada de maneira operável a uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou um truncamento do polipeptídeo, em que a pontuação de bits do HMM da sequência de aminoácido do polipeptídeo é maior do que cerca de 65, o HMM com base nas sequências de ami- noácido representadas em qualquer uma das Figuras de 1 a 7, e em que o rendimento da planta é aumentado em comparação com o rendimento correspondente de uma planta de controle que não compreende dito ácido nucleico.

[008] Este documento também descreve um método para aumen tar o rendimento de plantas em uma planta cultivada sob estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio. O método inclui o cultivo de uma planta compreendendo um ácido nucleico exógeno sob estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio, o ácido nucleico exógeno compreendendo uma região reguladora ligada de maneira operável a uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 80 % (por exemplo, pelo menos 90 %) de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 123, 124, 126, 128, 130, 131, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 227, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 306, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 322, 323, 324, 326, 328, 330, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 362, 364, 365, 366, 367, 368, 370, 372, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 397, 399, 401 e 403, ou um truncamento do polipeptídeo, e em que o rendimento da planta é aumentado em comparação com o rendimento correspondente de uma planta de controle que não compreende o ácido nucleico.

[009] Em qualquer um dos métodos, o método ainda pode incluir a colheita da biomassa de dita planta.

[0010] Em outro aspecto, este documento descreve um método de produção de uma planta com tolerância ao estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio. O método inclui expressar em uma pluralidade de plantas um ácido nucleico exógeno compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou um truncamento do polipeptídeo, em que a pontuação de bits do HMM da sequência de aminoácido do polipeptídeo é maior do que cerca de 65, o HMM com base nas sequências de aminoácido representadas em qualquer uma das Figuras de 1 a 7, e em que o rendimento da planta é aumentado em comparação com o rendimento correspondente de uma planta de controle que não compreende o ácido nucleico, e selecionar da pluralidade uma planta que tenha tolerância aumentada ao estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio.

[0011] Este documento também apresenta um método de produção de uma planta com tolerância ao estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio. O método inclui expressar em uma pluralidade de plantas um ácido nucleico exógeno compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou um truncamento do polipeptídeo, o ácido nucleico exógeno compreendendo uma região reguladora ligada de maneira operável a uma sequência de nu- cleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 80 % (por exemplo, pelo menos 90 %) de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 123, 124, 126, 128, 130, 131, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 227, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 306, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 322, 323, 324, 326, 328, 330, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 362, 364, 365, 366, 367, 368, 370, 372, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 397, 399, 401 e 403, ou um truncamento de dito polipeptídeo, e em que o rendimento da planta é aumentado em comparação com o rendimento correspondente de uma planta de controle que não compreende o ácido nucleico, e selecionar a partir da pluralidade, uma planta que possui tolerância aumentada ao estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio.

[0012] Em qualquer um dos métodos, a planta pode ser cultivada sob estresse de seca (por exemplo, estresse de seca de pré-floração ou pós-floração).

[0013] Em qualquer um dos métodos, a planta pode ser cultivada sob estresse osmótico. Por exemplo, o estresse osmótico pode ser se-lecionado de uma condutividade elétrica do solo entre 4 e 5 dS/m, e uma condutividade do solo entre 6 e 7 dS/m.

[0014] Em qualquer um dos métodos, a planta pode ser cultivada sob deficiência de nitrogênio. A deficiência de nitrogênio pode ser selecionada a partir de uma aplicação de nitrogênio de 50 Kg por hectare e uma aplicação de nitrogênio de 75 Kg por hectare.

[0015] Em qualquer um dos métodos, o ácido nucleico exógeno pode ter 80 % ou mais de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em 1, 3, 5, 7, 12, 14, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 43, 45, 47, 50, 60, 62, 65, 67, 73, 78, 80, 83, 87, 90, 92, 94, 97, 101, 106, 110, 112, 114, 119, 121, 125, 127, 129, 132, 134, 136, 148, 150, 152, 161, 164, 166, 168, 170, 173, 175, 177, 180, 185, 188, 204, 208, 210, 215, 217, 224, 226, 228, 234, 241, 243, 245, 248, 252, 254, 256, 258, 260, 264, 268, 270, 272, 274, 277, 279, 281, 288, 290, 293, 295, 297, 303, 305, 307, 310, 313, 316, 318, 321, 325, 327, 329, 331, 336, 343, 346, 349, 351, 361, 363, 369, 371, 373, 380, 389, 393, 398, 400 e 402.

[0016] Em qualquer um dos métodos, a planta pode ser selecionada do grupo que consiste em Panicum virgatum, Sorghum bicolor, Mis- canthus giganteus, Saccharum sp., Populus balsamifera, Zea mays, Glycine max, Brassica napus, Triticum aestivum, Gossypium hirsutum, Oryza sativa, Helianthus annuus, Medicago sativa, Beta vulgaris, ou Pennisetum glaucum.

[0017] Em qualquer um dos métodos, o método pode incluir o cul tivo da planta sob estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio, em que a pontuação de bits do HMM da sequência de aminoácido do poli- peptídeo é maior do que cerca de 65, o HMM com base nas sequências de aminoácidos representadas nas Figuras 2 ou 3.

[0018] Em qualquer um dos métodos, o método pode incluir o cul tivo da planta sob seca ou deficiência de nitrogênio, em que a pontuação de bits do HMM da sequência de aminoácido do polipeptídeo é maior do que cerca de 65, o HMM com base nas sequências de aminoácidos representadas na Figura 4.

[0019] Este documento também descreve uma célula vegetal con tendo um ácido nucleico endógeno modificado. O ácido nucleico com-preendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptí- deo, em que a pontuação de bits do HMM da sequência de aminoácido do polipeptídeo é maior do que cerca de 65, o HMM com base nas sequências de aminoácido representadas em uma das Figuras de 1 a 7, e em que uma planta produzida a partir da célula vegetal possui uma diferença na tolerância ao estresse de secas, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio em comparação com a composição correspondente de uma planta de controle onde dito ácido nucleico não foi modificado. A planta pode ser selecionada do grupo que consiste em Pani- cum virgatum, Sorghum bicolor, Miscanthus giganteus, Saccharum sp., Populus balsamifera, Zea mays, Glycine max, Brassica napus, Triticum aestivum, Gossypium hirsutum, Oryza sativa, Helianthus annuus, Medi- cago sativa, Beta vulgaris, ou Pennisetum glaucum.

[0020] O polipeptídeo pode ter 80 por cento ou mais de identidade de sequência (por exemplo, 90 por cento ou mais ou 95 por cento ou mais) com uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 123, 124, 126, 128, 130, 131, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 227, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 306, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 322, 323, 324, 326, 328, 330, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 362, 364, 365, 366, 367, 368, 370, 372, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 397, 399, 401, e 403.

[0021] Em outro aspecto, este documento descreve um método para aumentar o rendimento vegetal em uma planta cultivada sob estresse de seca, estresse osmótico ou estresse de deficiência de nitrogênio. O método inclui o cultivo de uma planta compreendendo uma célula vegetal aqui descrita sob estresse de seca, estresse osmótico, ou estresse de deficiência de nitrogênio, e em que o rendimento da planta é aumentado em comparação com o rendimento correspondente de uma planta de controle que não compreende o ácido nucleico endógeno modificado.

[0022] A não ser que de outra maneira definida, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como nor-malmente entendido por uma pessoa de habilidade prática na técnica a qual esta invenção se refere. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados para a prática da invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

[0023] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outros aspectos, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos, e das reivindicações. A palavra "compreendendo" nas reivindicações pode ser substituída por "consistindo essencialmente de" ou com "consistindo de", de acordo com a prática padrão na lei de patentes.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] As Figuras de 1A a 1D contêm um alinhamento da sequência de aminoácido do Clone 1805402 (SEQ ID NO: 2) com sequências de aminoácido homólogas e/ou ortólogas. Em todas as figuras de alinhamento aqui mostradas, um traço em uma sequência alinhada representa um intervalo, isto é, uma falta de um aminoácido nessa posição. Os ami- noácidos idênticos ou as substituições de aminoácido conservadas entre as sequências alinhadas são identificados por caixas. A Figura 1 e as outras figuras de alinhamento aqui fornecidas foram geradas utilizando o programa MUSCLE versão 3.52.

[0025] As Figuras de 2A a 2F contêm um alinhamento da sequência de aminoácido de Annot 872104m (SEQ ID NO: 337) com as sequências de aminoácido homólogas e/ou ortólogas.

[0026] As Figuras de 3A a 3D contêm um alinhamento da sequência de aminoácido do Clone 26006 (SEQ ID NO: 61) com as sequências de aminoácido homólogas e/ou ortólogas.

[0027] As Figuras de 4A a 4E contêm um alinhamento da sequência de aminoácido do Clone 375578 (SEQ ID NO: 111) com as sequências de aminoácido homólogas e/ou ortólogas.

[0028] As Figuras de 5A a 5E contêm um alinhamento da sequência de aminoácido do Clone 625057 (SEQ ID NO: 27) com as sequências de aminoácido homólogas e/ou ortólogas.

[0029] As Figuras de 6A a 6Q contêm um alinhamento da sequência de aminoácido de Annot 878355 (SEQ ID NO: 209) com as sequências de aminoácido homólogas e/ou ortólogas.

[0030] As Figuras de 7A a 7D contêm um alinhamento da sequência de aminoácido do Clone 258841 (SEQ ID NO: 370) com as sequências de aminoácido homólogas e/ou ortólogas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0031] A invenção apresenta métodos e materiais relacionados com o aumento da tolerância ao estresse abiótico nas plantas. Em algumas modalidades, as plantas podem ter, por exemplo, níveis aumentados de tolerância à seca, tolerância ao estresse osmótico ou tolerância à deficiência de nitrogênio. Os métodos aqui descritos podem incluir a transformação de uma célula vegetal com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico, em que a expressão do polipeptídeo resulta em um nível aumentado de tolerância ao estresse abiótico. As células vegetais produzidas utilizando tais métodos podem ser cultivadas para produzir plantas tendo uma tolerância aumentada à seca, estresse osmótico e deficiência de nitrogênio. Tais plantas podem ter um aumento no rendimento da planta em campos sub-irrigados ou em solo contendo alto teor de sal ou deficiência de nitrogênio.

I. Definições:

[0032] "Aminoácido" refere-se a um dos vinte aminoácidos de ocor rência biológica e aos aminoácidos sintéticos, incluindo os isômeros óticos D/L.

[0033] "Promotor preferencial do tipo de célula" ou "promotor prefe rencial do tecido" refere-se a um promotor que direciona a expressão preferencialmente em um tipo de célula ou tecido alvo, respectivamente, mas também pode levar a alguma transcrição em outros tipos de células ou tecidos igualmente.

[0034] "Planta de controle" refere-se a uma planta que não contém o ácido nucleico exógeno presente em uma planta transgênica de interesse, mas de outro modo possui o mesmo fundo genético ou semelhante como tal planta transgênica. Uma planta de controle adequada pode ser uma planta do tipo silvestre não transgênica, um segregante não transgênico de uma experiência de transformação, ou uma planta transgênica que contém um ácido nucleico exógeno diferente do ácido nucleico exógeno de interesse.

[0035] "Domínios" são grupos de aminoácidos substancialmente contíguos em um polipeptídeo que podem ser utilizados para caracterizar as famílias de proteína e/ou partes de proteínas. Tais domínios possuem uma "impressão digital" ou "assinatura" que pode compreender a sequência primária conservada, estrutura secundária e/ou conformação tridimensional. Geralmente, os domínios estão correlacionados com as atividades específicas in vitro e/ou in vivo. Um domínio pode ter um comprimento de 10 aminoácidos a 400 aminoácidos, por exemplo, 10 a 50 aminoácidos, ou 25 a 100 aminoácidos, ou 35 a 65 aminoácidos, ou 35 a 55 aminoácidos, ou 45 a 60 aminoácidos, ou 200 a 300 aminoácidos, ou 300 a 400 aminoácidos.

[0036] A "infra-regulação" refere-se à regulação que diminui a pro dução de produtos de expressão (mRNA, polipeptídeo, ou ambos) em relação aos estados basais ou nativos.

[0037] "Exógeno" em relação a um ácido nucleico indica que o ácido nucleico é parte de uma construção de ácido nucleico recombinante, ou não está no seu ambiente natural. Por exemplo, um ácido nucleico exógeno pode ser uma sequência de uma espécie introduzida em outra espécie, isto é, um ácido nucleico heterólogo. Tipicamente, um tal ácido nucleico exógeno é introduzido nas outras espécies através de uma construção de ácido nucleico recombinante. Um ácido nucleico exógeno também pode ser uma sequência que é nativa a um organismo e que foi reintroduzido nas células desse organismo. Um ácido nucleico exógeno que inclui uma sequência nativa pode muitas vezes ser distinto da sequência de ocorrência natural pela presença de sequências não naturais ligadas ao ácido nucleico exógeno, por exemplo, sequências reguladoras não nativas que flanqueiam uma sequência nativa em uma construção de ácido nucleico recombinante. Além disso, os ácidos nu- cleicos exógenos transformados de forma estável são tipicamente integrados em posições diferentes da posição onde a sequência nativa é encontrada. Será observado que um ácido nucleico exógeno pode ter sido introduzido em um progenitor e não na célula em consideração. Por exemplo, uma planta transgênica contendo um ácido nucleico exógeno pode ser a progênie de um cruzamento entre uma planta estavelmente transformada e uma planta não transgênica. Considera-se que tal pro- gênie contenha o ácido nucleico exógeno.

[0038] "Expressão" refere-se ao processo de conversão da informa ção genética de um polinucleotídeo em RNA através da transcrição, a qual é catalisada por uma enzima, RNA polimerase, e na proteína, através da tradução do mRNA em ribossomas.

[0039] "Polipeptídeo heterólogo", como aqui utilizado refere-se a um polipeptídeo que não é um polipeptídeo de ocorrência natural em uma célula vegetal, por exemplo, uma planta transgênica de Oryza sativa transformada e expressa com a sequência de codificação de um poli- peptídeo transportador de nitrogênio de uma planta Zea mays.

[0040] "Ácido nucleico isolado" como aqui utilizado inclui um ácido nucleico de ocorrência natural, contanto que uma ou ambas as sequências que imediatamente flanqueiam o ácido nucleico no seu ge- noma de ocorrência natural sejam removidas ou ausentes. Assim, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, um ácido nucleico que existe como uma molécula purificada ou uma molécula de ácido nu- cleico que é incorporada em um vetor ou em um vírus. Um ácido nu- cleico existente entre centenas ou milhões de outros ácidos nucleicos dentro, por exemplo, de bibliotecas de cDNA, bibliotecas genômicas ou fatias de gel contendo um digestão de restrição de DNA genômico, não deve ser considerado um ácido nucleico isolado.

[0041] "Modulação" do nível de tolerância ao estresse refere-se à alteração no nível da tolerância ao estresse que é observada como um resultado da expressão ou transcrição de um ácido nucleico exógeno ou endógeno em uma célula vegetal e/ou planta. A alteração no nível é medida em relação ao nível correspondente nas plantas de controle.

[0042] "Ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são aqui utilizados modo trocável e referem-se tanto ao RNA quanto ao DNA, incluindo cDNA, DNA genômico, DNA sintético e DNA ou RNA contendo análogos de ácido nucleico. Um ácido nucleico pode ser de filamento duplo ou filamento único (isto é, um filamento sentido ou um filamento anti-sentido). Os exemplos não limitativos de polinucleotídeos incluem genes, fragmentos de genes, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, siRNA, micro-RNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, sondas de ácido nucleico e iniciadores de ácido nucleico. Um polinucleotídeo pode conter nucleotídeos não convencionais ou modificados.

[0043] "Ligado de maneira operável" refere-se ao posicionamento de uma região reguladora e de uma sequência a ser transcrita em um ácido nucleico de modo que a região reguladora seja eficaz para a regulação da transcrição ou translação da sequência. Por exemplo, para ligar de maneira operável uma sequência de codificação e uma região reguladora, o sítio de iniciação da translação da estrutura de leitura translacional da sequência de codificação é tipicamente posicionado entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante da região reguladora. Uma região reguladora pode, no entanto, ser posicionada tanto quanto ao redor de 5.000 nucleotídeos a montante do sítio de iniciação da translação, ou ao redor de 2.000 nucleotídeos a montante do sítio de início da transcrição.

[0044] "Polipeptídeo" como aqui utilizado refere-se a um composto de dois ou mais aminoácidos de subunidade, análogos de aminoácido ou outros peptidomiméticos, independentemente da modificação pós- translacional, por exemplo, fosforilação ou glicosilação. As subunidades podem ser ligadas por ligações peptídicas ou outras ligações tais como, por exemplo, ligações éster ou éter. Os polipeptídeos de comprimento total, polipeptídeos truncados, mutantes pontuais, mutantes de inserção, variantes de união, proteínas quiméricas, e seus fragmentos são incluídos por esta definição.

[0045] "Progênie" inclui descendentes de uma planta ou linhagem vegetal particular. As progênies de uma planta instantânea incluem sementes formadas em F1, F2, F3, F4, F5, F6 e plantas de geração subsequente, ou sementes formadas em BC1, BC2, BC3, e plantas de geração subsequente, ou sementes formadas em F1BC1, F1BC2, F1BC3, e plantas de geração subsequente. A designação F1 refere-se à progénie de um cruzamento entre dois parentes que são geneticamente distintos. As designações F2, F3, F4, F5 e F6 referem-se às gerações subsequentes de progenitura auto- ou sib-polinizada de uma planta F1.

[0046] "Região reguladora" refere-se a um ácido nucleico tendo se quências de nucleotídeo que influenciam o início e taxa da transcrição ou translação, e estabilidade e/ou mobilidade de um produto de transcrição ou translação. As regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências intensificadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteína, elementos induzíveis, sequências de ligação a proteínas, regiões não transladadas 5' e 3' (UTRs), sítios de iniciação transcricional, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, íntrons, e suas combinações. Uma região reguladora tipicamente compreende pelo menos um promotor de núcleo (basal). Uma região reguladora também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência intensificadora, um elemento a montante ou uma região de ativação a montante (UAR). Por exemplo, um intensificador adequado é um elemento cis-regulador (212 a -154) da região a montante do gene da octopina sintase (ocs). Fromm et al., The Plant Cell, 1:977-984 (1989).

[0047] "Supra-regulação" refere-se à regulação que aumenta o ní vel de um produto de expressão (mRNA, polipeptídeo, ou ambos) em relação aos estados basais ou nativos.

[0048] "Vector" refere-se a um replicon, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, no qual outro segmento de DNA pode ser inserido de modo a efetuar a replicação do segmento inserido. Geralmente, um vector é capaz de replicação quando associado com os elementos de controle apropriados. O termo "vetor" inclui vetores de clonagem e de expressão, assim como vetores virais e vetores de integração. Um "vetor de expressão" é um vetor que inclui uma região reguladora.

[0049] "Polipeptídeos Exemplificados" referem-se às SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 123, 124, 126, 128, 130, 131, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 227, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 306, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 322, 323, 324, 326, 328, 330, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 362, 364, 365, 366, 367, 368, 370, 372, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 397, 399, 401 e 403.

II. Polipeptídeos

[0050] Os polipeptídeos aqui descritos incluem polipeptídeos de au mento da tolerância ao estresse abiótico. Os polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico podem ser eficazes para modular (por exemplo, aumentar) a tolerância ao estresse abiótico quando expressos em uma planta ou célula. Tais polipeptídeos tipicamente contêm pelo menos um domínio indicativo de polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico, como descrito com maiores detalhes neste documento. Os polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico tipicamente possuem uma pontuação de bits do HMM que é maior do que 65 como descrito com maiores detalhes neste documento. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico possuem mais do que 80 % de identidade com os Poli- peptídeos Exemplificados como descritos com maiores detalhes neste documento.

A. Domínios Indicativos de Polipeptídeos de Aumento da Tolerância ao Estresse Abiótico

[0051] Um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abió- tico pode conter um domínio AP2 e/ou motivos CMX-1 e CMX-2, que são previstos de serem característicos de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. A SEQ ID NO: 2 apresenta a sequência de aminoácido de um clone de Panicum virgatum, aqui identificado como CeresClone: 1805402, que é previsto de codificar um polipeptídeo contendo um domínio AP2 e motivos CMX-1 e CMX-2. Por exemplo, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio AP2 tendo uma identidade de sequência de 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) com os resíduos 132 a 181 da SEQ ID NO: 2 e/ou um motivo CMX-1 e um motivo CMX-2 tendo identidade de sequência de 60 por cento ou maior (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) com os resíduos de 56 a 78 e com os resíduos de 88 a 99 da SEQ ID NO: 2, respectivamente. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de aumento de tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio AP2 tendo 60 por cento ou mais de identidade de sequência (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) com o domínio AP2 e/ou um motivo CMX-1 e um motivo CMX-2 com 60 por cento ou mais de identidade de sequência (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) com o motivo CMX-1 e motivo CMX-2 de um ou mais dos polipeptídeos apresentados nas SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24 ou 25. Os domínios AP2, CMX-1 e CMX-2 de tais sequências são apresentados na Listagem de Sequências. Os resíduos de aminoácido do domínio AP2 podem ligar-se ao DNA e são tipicamente encontrados nas proteínas do fator de transcrição. Os motivos CMX-1 e CMX-2 foram identificados nos fatores de transcrição ERF da soja e arroz.

[0052] Um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abió- tico pode conter um domínio RPE65, o qual é previsto de ser característico de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abió- tico. A SEQ ID NO: 337 apresenta a sequência de aminoácidos de um clone de Arabidopsis thaliana, aqui identificado como CeresAnnot: 872104m, que é previsto de codificar um polipeptídeo contendo um domínio de proteína da membrana epitelial do pigmento retinal (RPE65). Por exemplo, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio RPE65 tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com os resíduos de 124 a 589 da SEQ ID NO: 337. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio RPE65 tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com o do-mínio RPE65 de um ou mais dos polipeptídeos apresentados nas SEQ ID NO: 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 352, 353, 356, 357, 358, 359, 360, 362, 364, 365, 366, 367 ou 368. Os domínios RPE65 de tais sequências são apresentados na Listagem de Sequências. Um polipeptídeo tendo um domínio RPE65 pode ter atividade enzimática de 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase, que é classificada de acordo com a EC 3.1.1.64.

[0053] Um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abió- tico pode conter um domínio da família de dobra da alfa/beta hidrolase, que é previsto de ser característico de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. A SEQ ID NO: 61 apresenta a sequência de aminoácido de um clone de Arabidopsis thaliana, aqui identificado como CeresClone: 26006, que é previsto de codificar um polipeptídeo contendo um domínio da família de dobra da alfa/beta hidrolase. Por exemplo, um polipeptídeo de aumento de tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio de dobra da alfa/beta hidrolase tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com os resíduos de 10 a 252 da SEQ ID NO: 61. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de aumento de tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio de dobra da alfa/beta hidrolase tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com o domínio de dobra da alfa/beta hidrolase de um ou mais dos polipeptídeos apresentados nas SEQ ID NOs: 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108 ou 109. Os domínios de dobra da alfa/beta hidrolase de tais sequências são apresentados na Listagem de Sequências. A dobra da alfa/beta hidrolase é comum em várias enzimas hidrolíticas de origem filogenética muito diferente e de função catalítica. O núcleo de cada enzima é uma lâmina alfa/beta (em vez de um barril), contendo 8 filamentos conectados por hélices. Acredita-se que as enzimas tenham divergido de um ancestral comum, preservando a disposição dos resíduos catalíticos. Todas possuem uma tríade catalítica, cujos elementos são gerados em circuitos, que são os melhores aspectos estruturais conservados da dobra. Um polipeptídeo tendo um domínio de dobra da alfa/beta hidrolase pode ter atividade enzimática de acetona-cianoidrina liase/metil esterase (EC: 3.1.1.-).

[0054] Um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abió- tico pode conter domínio de motivo de ligação a calmodulina IQ e/ou um domínio DUF4005, os quais são previstos de serem característicos de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. A SEQ ID NO: 111 apresenta a sequência de aminoácido de um clone de Zea mays, aqui identificado como CeresClone: 375578, que é previsto de codificar um polipeptídeo contendo um domínio de motivo de ligação a calmodulina IQ e um domínio DUF4005. Por exemplo, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio de motivo de ligação à calmodulina QI tendo 60 por cento ou mais de identidade de sequência (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) com os resíduos de 139 a 157 da SEQ ID NO: 111 e/ou um domínio DUF4005 tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100) de identidade de sequência com os resíduos de 360 a 427 da SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de aumento de tolerância ao estresse abiótico pode compreender um motivo de ligação de calmodulina IQ e/ou um domínio DUF4005 com 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com o motivo de ligação a calmodulina IQ e/ou ao domínio DUF4005 de um ou mais dos polipeptídeos apresentados nas SEQ ID NOs: 113, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 123, 124, 126, 128, 130, 131, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206 ou 207. O motivo de ligação de calmodulina IQ e os domínios DUF4005 de tais sequências são apresentados na Listagem de Sequências. O domínio do motivo de ligação à calmodulina IQ é um consenso para a ligação independente de cálcio de calmodulina, que é um sensor de cálcio e ajuda a regular os eventos através da sua interação com um grupo diversificado de proteínas celulares. Ver Rhoads and Friedberg, FASEB J., 11(5):331-40 (1997). O domínio DUF4005 encontra-se na região C-terminal do domínio IQ da planta contendo proteínas de ligação à calmodulina.

[0055] Um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abió- tico pode conter um domínio de aminotransferase classe I e II e/ou um domínio de alinase, os quais são previstos de serem característicos de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. A SEQ ID NO: 27 apresenta a sequência de aminoácido de um clone de Glycine max, aqui identificado como CeresClone: 625057, que é previsto de codificar um polipeptídeo contendo um domínio de aminotransferase classe I e II e um domínio de alinase. Por exemplo, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio de aminotransferase classe I e II tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com os resíduos 89 a 453 da SEQ ID NO: 27 e/ou um domínio de alinase tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com os resíduos de 230 a 318 da SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio de aminotransferase classe I e II e/ou um domínio de alinase tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com a aminotransferase classe I e II e domínios de alinase de um ou mais dos polipeptídeos apresentados nas SEQ ID NOs: 29, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 ou 59. As aminotransferases classe I e II e os domínios de alinase de tais sequências são apresentados na Listagem de Sequências. As aminotransferases compartilham certas características mecânicas com outras enzimas dependentes de piridoxal-fosfato, tais como a ligação covalente do grupo de piridoxal-fosfato a um resíduo de lisina. Com base na similaridade de sequências, estas várias enzimas podem ser agrupadas na classe I e na classe II. Exemplos de polipeptí- deos compreendendo domínios de aminotransferase classe I e II incluem polipeptídeos LL-DAP (EC 2.6.1.83) (Watanabe et al., Mechanism of Substrate Recognition and PLP-induced Conformational Changes in LL-Diaminopimelate aminotransferase from Arabidopsis thaliana. J. Mol. Biol. 384, 1314-1329 (2008)). LL-DAP catalisa a interconversão de LL-2,6-diaminoeptanodioato e 2-oxoglutarato em (S)-2,3,4,5-tetrai- dropiridina-2,6-dicarboxilato, L-glutamato e água. O domínio da alinase é um domínio semelhante ao EFG que é rico em dissulfetos que se encontra na alinase, uma enzima dependente de piridoxal-5'-fosfato. Ver, por exemplo, Kuettner et al., J. Biol. Chem., 277(48):46402-46407 (2002).

[0056] Um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abió- tico pode conter um domínio da família de PTR2 POT, que é previsto de ser característico de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. A SEQ ID NO: 209 apresenta a sequência de aminoá- cido de um clone de Arabidopsis thaliana, aqui identificado como Cere- sAnnot: 878355, que é previsto de codificar um polipeptídeo contendo um domínio da família de PTR2 POT. Por exemplo, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio de PTR2 POT tendo uma identidade de sequência de 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) com os resíduos de 101 a 508 da SEQ ID NO: 209. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio de PTR2 POT tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com o domínio de dobra da alfa/beta hidrolase de um ou mais dos polipeptídeos apresentados nas SEQ ID NOs: 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 227, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 306, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 322, 323, 324, 326, 328, 330, 332, 333, 334 ou 335. Os domínios de PTR2 POT de tais sequências são apresentados na Listagem de Sequências. O transporte de peptí- deos dentro das células é um fenômeno biológico bem documentado que é executado por transportadores específicos dependentes de energia encontrados em vários organismos tão diversos quanto as bactérias e seres humanos. A família PTR de proteínas é distinta dos transportadores de peptídeo do tipo ABC e foi exposta por análises de sequência de várias proteínas de transporte de peptídeo recentemente descobertas. Estas proteínas parecem estar principalmente envolvidas na ingestão de peptídeos pequenos com a absorção concomitante de um próton.

[0057] Um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abió- tico pode conter um domínio de MFMR da proteína de ligação G-box e/ou um domínio do fator de transcrição bZIP, que são previstos de serem característicos de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. A SEQ ID NO: 370 apresenta a sequência de aminoáci- dos de um clone de Zea mays, aqui identificado como CeresClone: 258841, que é previsto de codificar um polipeptídeo contendo um domínio de MFMR e um domínio de bZIP. Por exemplo, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio de MFMR tendo uma identidade de sequência de 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) com os resíduos de 1 a 188 da SEQ ID NO: 370 e/ou um domínio bZIP tendo 60 por cento ou mais (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com os resíduos de 279 a 341 da SEQ ID NO: 370. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode compreender um domínio de MFMR e/ou bZIP tendo 60 por cento ou mais (por exemplo 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 por cento) de identidade de sequência com os domínios de MFMR e/ou bZIP de um ou mais dos polipeptídeos apresentados nas SEQ ID NOs: 372, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 397, 399, 401 e 403. Os domínios de MFMR e bZIP de tais sequências são apresentados na Listagem de Sequências. A região de MFMR é tipicamente encontrada no N-terminal do domínio do fator de transcrição PF00170. Está tipicamente entre 150 e 200 aminoácidos de comprimento. A metade N-terminal é tipicamente bastante rica em resíduos de prolina e foi denominada PRD (domínio rico em prolina) enquanto que a metade C-terminal é tipicamente mais polar e foi denominada MFMR (região de mosaico multifuncional). Esta família pode ser composta de três sub-famílias chamadas A, B e C classificadas de acordo com a composição do motivo. Alguns destes motivos podem estar envolvidos na mediação de interações proteína-proteína. A região MFMR pode conter um sinal de localização nuclear em bZIP opaco e GBF-2. A MFMR também pode conter uma atividade transregulatória em TAF-1. A MFMR em CPRF-2 pode conter sinais de retenção citoplasmática. Os fatores de transcrição do zíper de leucina básico (bZIP) das células eucarióticas são proteínas que contêm uma região básica que medeia a ligação de DNA específica da sequência seguida por uma região de zíper de leucina requerida para a dimeriza- ção.

[0058] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico é truncado na extremidade amino ou car- bóxi-terminal de um polipeptídeo de ocorrência natural. Um polipeptídeo truncado pode reter certos domínios do polipeptídeo de ocorrência natural enquanto carece de outros. Assim, as variantes de comprimento que são até 5 aminoácidos mais curtos ou mais longos tipicamente apresentam a atividade de aumento da tolerância ao estresse abiótico de um polipeptídeo truncado. Em algumas modalidades, um polipeptídeo truncado é um polipeptídeo negativo dominante. A expressão em uma planta de um tal polipeptídeo truncado confere uma diferença no nível de tolerância ao estresse abiótico de uma planta em comparação com o nível correspondente de uma planta de controle que não compreende o truncamento. O fenótipo é a causa de um truncamento.

B. Homólogos Funcionais Identificados por BLAST Recíproco

[0059] Em algumas modalidades, um ou mais homólogos funcionais de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico de referência definido por uma ou mais das descrições Pfam acima indicadas são adequados para uso como polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico. Um homólogo funcional é um polipeptídeo que possui semelhança de sequência com um polipeptídeo de referência e que realiza uma ou mais das funções bioquímicas ou fisiológicas do polipeptídeo de referência. Um homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser polipeptídeos de ocorrência natural, e a similaridade de sequência pode ser devido aos eventos evolutivos convergentes ou divergentes. Como tais, os homólogos funcionais são às vezes designados na literatura como homólogos, ou ortólogos, ou parálogos. As variantes de um homólogo funcional de ocorrência natural tais como os polipeptídeos codificados por mutantes de uma sequência de codifi-cação do tipo silvestre, podem ser elas mesmas homólogos funcionais. Os homólogos funcionais também podem ser criados por meio da mu- tagênese direcionada pelo sítio da sequência de codificação para um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico, ou por meio dos domínios de combinação das sequências de codificação para diferentes polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico de ocorrência natural ("troca de domínios"). O termo "homólogo funcional" é às vezes aplicado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente homólogo.

[0060] Os homólogos funcionais podem ser identificados através da análise de alinhamentos de sequências de nucleotídeo e polipeptídeo. Por exemplo, a execução de uma consulta em um banco de dados de sequências de nucleotídeo ou polipeptídeo pode identificar homólogos de polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico. A análise de sequências pode envolver a análise BLAST, BLAST Reciprocal ou PSI-BLAST de bancos de dados não redundantes utilizando uma sequência de aminoácido de polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico como a sequência de referência. A sequência de amino- ácido é, em alguns casos, deduzida da sequência de nucleotídeo. Esses polipeptídeos no banco de dados que possuem mais do que 40 % de identidade de sequência são candidatos para outra avaliação para a adequação como um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. A similaridade de sequência de aminoácido leva em conta as substituições conservadoras de aminoácido, tais como a substituição de um resíduo hidrofóbico por outro ou a substituição de um resíduo polar por outro. Se desejável, a inspeção manual de tais candidatos pode ser realizada a fim de diminuir o número de candidatos a serem ainda avaliados. A inspeção manual pode ser executada através da seleção desses candidatos que parecem ter domínios presentes nos polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico, por exemplo, domínios funcionais conservados.

[0061] As regiões conservadas podem ser identificadas através da localização de uma região dentro da sequência de aminoácido primária de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico que é uma sequência repetida, forma alguma estrutura secundária (por exemplo, hélices e lâminas beta), estabelece os domínios positiva ou negativamente carregados, ou representa um motivo ou domínio de proteína. Ver, por exemplo, o website Pfam que descreve as sequências de consenso para uma variedade de motivos e domínios de proteína na World Wide Web em sanger.ac.uk/Software/Pfam/ e pfam.janelia.org/. Uma descrição das informações incluídas no banco de dados Pfam está descrita em Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); e Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999). As regiões conservadas também podem ser determinadas pelo alinhamento de sequências dos mesmos polipeptídeos ou relacionados de espécies estritamente relacionadas. As espécies estritamente relacionadas preferivelmente são da mesma família. Em algumas modalidades, o alinhamento de sequências de duas espécies diferentes é adequado.

[0062] Tipicamente, os polipeptídeos que apresentam pelo menos cerca de 40 % de identidade de sequência de aminoácido são úteis para identificar regiões conservadas. As regiões conservadas de polipeptí- deos relacionados apresentam pelo menos 45 % de identidade de sequência de aminoácido (por exemplo, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 % ou pelo menos 90 % de identidade de sequência de aminoácido). Em algumas modalidades, uma região conservada apresenta pelo menos 92 %, 94 %, 96 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de aminoácido.

[0063] Exemplos de sequências de aminoácido de homólogos fun cionais do polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 2 são fornecidos na Figura 1 e na Listagem de Sequências. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, CeresClone: 278992 (SEQ ID NO: 4), CeresAn- not: 6014857 (SEQ ID NO: 6), CeresAnnot: 6318302 (SEQ ID NO: 8), GI: 125603736 (SEQ ID NO: 9), GI: 357148089 (SEQ ID NO: 10), GI: 326518784 (SEQ ID NO: 11), CeresClone: 634402 (SEQ ID NO: 13), CeresClone: 1494990 (SEQ ID NO: 15), GI: 115479555 (SEQ ID NO: 16), GI: 297802528 (SEQ ID NO: 17), GI: 224123482 (SEQ ID NO: 18), CeresClone: 123905 (SEQ ID NO: 20), GI: 255555461 (SEQ ID NO: 21), GI: 129560505 (SEQ ID NO: 22), CeresAnnot: 1460991 (SEQ ID NO: 24), ou GI: 225428806 (SEQ ID NO: 25). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 2 possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45% de identidade de sequência, por exemplo 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 2 possui uma sequência de amino- ácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com um ou mais homólogos funcionais da SEQ ID NO: 2 descritos acima ou apresentados na Listagem de Sequências.

[0064] Exemplos de sequências de aminoácido de homólogos fun cionais do polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 337 são fornecidos na Figura 2 e na Listagem de Sequências. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, GI: 112181147 (SEQ ID NO:338), GI: 15810433 (SEQ ID NO:339), GI: 297834326 (SEQ ID NO:340), GI: 336420053 (SEQ ID NO:341), GI: 345451248 (SEQ ID NO:342), CeresAnnot: 1480808 (SEQ ID NO:344), GI: 355398706 (SEQ ID NO:345), CeresAn- not: 1519993 (SEQ ID NO:347), GI: 7209269 (SEQ ID NO:348), Ceres- Clone: 1943815 (SEQ ID NO:350), CeresAnnot: 1138943 (SEQ ID NO:352), GI: 38112198 (SEQ ID NO:353), GI: 79155296 (SEQ ID NO:354), GI: 317016344 (SEQ ID NO:355), GI: 75185609 (SEQ ID NO:356), GI: 22335699 (SEQ ID NO:357), GI: 359806478 (SEQ ID NO:358), GI: 112181145 (SEQ ID NO:359), GI: 115454329 (SEQ ID NO:360), CeresClone: 1806409 (SEQ ID NO:362), CeresAnnot: 8633702 (SEQ ID NO:364), GI: 226529341 (SEQ ID NO:365), GI: 357120366 (SEQ ID NO:366), GI: 356577857 (SEQ ID NO:367), ou GI: 168065310 (SEQ ID NO:368). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 337 possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a/ sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 337. Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 337 possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com um ou mais homólogos funcionais da SEQ ID NO: 337 descritos acima ou apresentados na Listagem de Sequências.

[0065] Exemplos de sequências de aminoácido de homólogos fun cionais do polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 61 são fornecidos na Figura 3 e na Listagem de Sequências. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, CeresClone: 644331 (SEQ ID NO: 63), GI: 15227859 (SEQ ID NO: 64), CeresAnnot: 1504349 (SEQ ID NO: 66), CeresAnnot: 1265088 (SEQ ID NO: 68), US20070214517-97126 (SEQ ID NO: 69), GI: 125527987 (SEQ ID NO: 70), GI: 14279437 (SEQ ID NO: 71), ES902065 (SEQ ID NO: 72), CeresClone: 1065042 (SEQ ID NO: 74), GI: 157329790 (SEQ ID NO: 75), GI: 15227861 (SEQ ID NO: 76), GI: 146272407 (SEQ ID NO: 77), CeresClone: 95094 (SEQ ID NO: 79), CeresClone: 1714893 (SEQ ID NO: 81), GI: 157329890 (SEQ ID NO: 82), CeresAnnot: 859635 (SEQ ID NO: 84), GI: 115440397 (SEQ ID NO: 85), GI: 40549303 (SEQ ID NO: 86), CeresAnnot: 1457048 (SEQ ID NO: 88), GI: 50401192 (SEQ ID NO: 89), CeresAnnot: 1451281 (SEQ ID NO: 91), CeresAnnot: 1510252 (SEQ ID NO: 93), CeresClone: 1822691 (SEQ ID NO: 95), GI: 197312921 (SEQ ID NO: 96), CeresAn- not: 8456439 (SEQ ID NO: 98), SEQ ID NO: 99, GI: 15028131 (SEQ ID NO: 100), CeresClone: 270875 (SEQ ID NO: 102), GI: 27754457 (SEQ ID NO: 103), GI: 16648679 (SEQ ID NO: 104), GI: 15227863 (SEQ ID NO: 105), CeresAnnot: 1451282 (SEQ ID NO: 107), GI: 53830670 (SEQ ID NO: 108), ou GI: 146272405 (SEQ ID NO: 109). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 61 possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 61. Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 61 possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com um ou mais homólogos funcionais da SEQ ID NO: 61 descritos acima ou apresentados na Listagem de Sequências.

[0066] Exemplos de sequências de aminoácido de homólogos fun cionais do polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 111 são fornecidos na Figura 4 e na Listagem de Sequências. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, CeresAnnot: 8669409 (SEQ ID NO: 113), Ceres- Clone: 2034697 (SEQ ID NO: 115), GI: 115440873 (SEQ ID NO: 116), GI: 357125736 (SEQ ID NO: 117), GI: 225449126 (SEQ ID NO: 118), CeresAnnot: 1465047 (SEQ ID NO: 120), CeresClone: 1919901 (SEQ ID NO: 122), GI: 356565733 (SEQ ID NO: 123), GI: 15231175 (SEQ ID NO: 124), CeresClone: 106263 (SEQ ID NO: 126), CeresAnnot: 247223212 (SEQ ID NO: 128), CeresAnnot: 200200100 (SEQ ID NO: 130), GI: 7413581 (SEQ ID NO: 131), CeresClone: 228069 (SEQ ID NO: 133), CeresClone: 467508 (SEQ ID NO: 135), CeresClone: 1829581 (SEQ ID NO: 137), GI: 357510601 (SEQ ID NO: 138), GI: 357129039 (SEQ ID NO: 139), GI: 326525172 (SEQ ID NO: 140), GI: 357443381 (SEQ ID NO: 141), GI: 168063380 (SEQ ID NO: 142), GI: 312282973 (SEQ ID NO: 143), GI: 125550655 (SEQ ID NO: 144), GI: 145357576 (SEQ ID NO: 145), GI: 125528277 (SEQ ID NO: 146), GI: 224032591 (SEQ ID NO: 147), CeresClone: 1747444 (SEQ ID NO: 149), Ceres- Clone: 1998974 (SEQ ID NO: 151), CeresClone: 1883040 (SEQ ID NO: 153), GI: 326520123 (SEQ ID NO: 154), GI: 215701453 (SEQ ID NO: 155), GI: 147809623 (SEQ ID NO: 156), GI: 224109704 (SEQ ID NO: 157), GI: 225439898 (SEQ ID NO: 158), GI: 218196002 (SEQ ID NO: 159), GI: 54306075 (SEQ ID NO: 160), CeresAnnot: 1484880 (SEQ ID NO: 162), GI: 224028605 (SEQ ID NO: 163), CeresAnnot: 1528800 (SEQ ID NO: 165), CeresClone: 1792902 (SEQ ID NO: 167), Ceres- Clone: 1806867 (SEQ ID NO: 169), CeresClone: 1727738 (SEQ ID NO: 171), GI: 238007500 (SEQ ID NO: 172), CeresAnnot: 8724651 (SEQ ID NO: 174), CeresClone: 1897134 (SEQ ID NO: 176), CeresClone: 1859266 (SEQ ID NO: 178), GI: 194696788 (SEQ ID NO: 179), Cere- sAnnot: 1475350 (SEQ ID NO: 181), GI: 326490361 (SEQ ID NO: 182), GI: 224140165 (SEQ ID NO: 183), GI: 255577665 (SEQ ID NO: 184), CeresClone: 1886384 (SEQ ID NO: 186), GI: 255568402 (SEQ ID NO: 187), CeresClone: 1942871 (SEQ ID NO: 189), GI: 326527367 (SEQ ID NO: 190), GI: 297816500 (SEQ ID NO: 191), GI: 297810377 (SEQ ID NO: 192), GI: 302762472 (SEQ ID NO: 193), GI: 302815615 (SEQ ID NO: 194), GI: 116787496 (SEQ ID NO: 195), GI: 224029961 (SEQ ID NO: 196), GI: 15232741 (SEQ ID NO: 197), GI: 302806862 (SEQ ID NO: 198), GI: 302772817 (SEQ ID NO: 199), GI: 240254538 (SEQ ID NO: 200), GI: 297833734 (SEQ ID NO: 201), GI: 2739366 (SEQ ID NO: 202), GI: 297825811 (SEQ ID NO: 203), CeresClone: 375578m1 (SEQ ID NO: 205), CeresClone: 375578m2 (SEQ ID NO: 206), ou GI: 307135879 (SEQ ID NO: 207). Em alguns casos, um homólogo funcional de SEQ ID NO: 111 possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 111. Em alguns casos, um homólogo funcional de SEQ ID NO: 111 possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com um ou mais homólogos funcionais de SEQ ID NO: 111 descritos acima ou apresentados na Listagem de Sequências.

[0067] O polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 111, ou os homólogos funcionais apresentados acima ou na Listagem de Sequências, podem ser truncados no N- ou C-terminal ou ambos. Em uma modalidade, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 111 contém um truncamento C-terminal. Por exemplo, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 111 pode incluir uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência significativa com a região que corresponde aproximadamente aos resíduos de 1 a 135 da SEQ ID NO: 111, tal como a SEQ ID NO: 205.

[0068] Exemplos de sequências de aminoácido de homólogos fun cionais do polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 27 são fornecidos na Figura 5 e na Listagem de Sequências. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, CeresClone: 1925947 (SEQ ID NO: 29), Cere- sAnnot: 1514501 (SEQ ID NO: 31), CeresAnnot: 849672 (SEQ ID NO: 33), GI: 157355942 (SEQ ID NO: 34), GI: 115452503 (SEQ ID NO: 35), CeresClone: 1790933 (SEQ ID NO: 37), CeresAnnot: 8641620 (SEQ ID NO: 39), CeresClone: 281497 (SEQ ID NO: 41), GI: 168013851 (SEQ ID NO: 42), CeresClone: 143214 (SEQ ID NO: 44), CeresClone: 1781022 (SEQ ID NO: 46), CeresClone: 618639 (SEQ ID NO: 48), GI: 118483001 (SEQ ID NO: 49), CeresClone: 38404 (SEQ ID NO: 51), GI: 3549670 (SEQ ID NO: 52), GI: 37703720 (SEQ ID NO: 53), GI: 24414269 (SEQ ID NO: 54), GI: 125603687 (SEQ ID NO: 55), GI: 108707679 (SEQ ID NO: 56), GI: 157352390 (SEQ ID NO: 57), GI: 159469820 (SEQ ID NO: 58), ou GI: 145344081 (SEQ ID NO: 59). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 27 possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 27. Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 27 possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com um ou mais homólogos funcionais de SEQ ID NO: 27 descritos acima ou apresentados na Listagem de Sequências.

[0069] Exemplos de sequências de aminoácido de homólogos fun cionais do polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 209 são fornecidos na Figura 6 e na Listagem de Sequências. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, CeresAnnot: 1472338_Pb (SEQ ID NO: 211), GI: 157344683_Vv (SEQ ID NO: 212), GI: 87240677_Mt (SEQ ID NO: 213), GI: 115448297_Os (SEQ ID NO: 214), CeresClone: 1844568_Pv (SEQ ID NO: 216), CeresClone: 797829_Tm (SEQ ID NO: 218), GI: 168033816_Pp (SEQ ID NO: 219), GI: 116788004_Ps (SEQ ID NO: 220), GI: 149900503_Ha (SEQ ID NO: 221), GI: 4102839_Sl (SEQ ID NO: 222), GI: 31088360_Vf (SEQ ID NO: 223), CeresAnnot: 8681236_Sb (SEQ ID NO: 225), CeresAnnot: 8519531_Gm (SEQ ID NO: 227), CeresAnnot: 8631372_Zm (SEQ ID NO: 229), GI: 151426449_Hv (SEQ ID NO: 230), GI: 192757675_Br (SEQ ID NO: 231), GI: 2655098 (SEQ ID NO: 232), GI: 194690746 (SEQ ID NO: 233), CeresClone: 752925 (SEQ ID NO: 235), GI: 125540898 (SEQ ID NO: 236), GI: 26451333 (SEQ ID NO: 237), GI: 2160144 (SEQ ID NO: 238), GI: 30696666 (SEQ ID NO: 239), GI: 125556922 (SEQ ID NO: 240), CeresAnnot: 1529287 (SEQ ID NO: 242), CeresClone: 1806748 (SEQ ID NO: 244), CeresAnnot: 8755095 (SEQ ID NO: 246), GI: 147827175 (SEQ ID NO: 247), CeresClone: 1888865 (SEQ ID NO: 249), GI: 157337163 (SEQ ID NO: 250), GI: 115434472 (SEQ ID NO: 251), Cere- sAnnot: 6252512 (SEQ ID NO: 253), CeresAnnot: 1569074_Mt (SEQ ID NO: 255), CeresAnnot: 1475845 (SEQ ID NO: 257), CeresAnnot: 1501483 (SEQ ID NO: 259), CeresAnnot: 8755079 (SEQ ID NO: 261), GI: 115470147 (SEQ ID NO: 262), GI: 15240905 (SEQ ID NO: 263), CeresAnnot: 8755085 (SEQ ID NO: 265), GI: 147853446 (SEQ ID NO: 266), GI: 157346087 (SEQ ID NO: 267), CeresAnnot: 1538867 (SEQ ID NO: 269), CeresAnnot: 8755091 (SEQ ID NO: 271), CeresAnnot: 1492702 (SEQ ID NO: 273), CeresClone: 325604 (SEQ ID NO: 275), GI: 108707040 (SEQ ID NO: 276), CeresAnnot: 1302517_At (SEQ ID NO: 278), CeresAnnot: 1355964 (SEQ ID NO: 280), CeresAnnot: 8755104 (SEQ ID NO: 282), GI: 147802380 (SEQ ID NO: 283), GI: 510238 (SEQ ID NO: 284), GI: 157341962 (SEQ ID NO: 285), GI: 6635838 (SEQ ID NO: 286), GI: 4455276 (SEQ ID NO: 287), CeresAnnot: 8642246 (SEQ ID NO: 289), CeresAnnot: 8633032 (SEQ ID NO: 291), GI: 157337654 (SEQ ID NO: 292), CeresAnnot: 8642241 (SEQ ID NO: 294), CeresAn- not: 1520085 (SEQ ID NO: 296), CeresAnnot: 1514979 (SEQ ID NO: 298), GI: 147858202 (SEQ ID NO: 299), GI: 125545538 (SEQ ID NO: 300), GI: 115451771 (SEQ ID NO: 301), GI: 125587732 (SEQ ID NO: 302), CeresAnnot: 1516968 (SEQ ID NO: 304), CeresClone: 350844 (SEQ ID NO: 306), CeresAnnot: 8658700 (SEQ ID NO: 308), GI: 157346088 (SEQ ID NO: 309), CeresClone: 1926916 (SEQ ID NO: 311), GI: 15226861 (SEQ ID NO: 312), CeresClone: 816960 (SEQ ID NO: 314), GI: 15232435 (SEQ ID NO: 315), CeresAnnot: 8643789 (SEQ ID NO: 317), CeresAnnot: 8631367 (SEQ ID NO: 319), GI: 157339093 (SEQ ID NO: 320), CeresAnnot: 8633031 (SEQ ID NO: 322), GI: 125543029 (SEQ ID NO: 323), GI: 115454995 (SEQ ID NO: 324), Cere- sAnnot: 8755090 (SEQ ID NO: 326), CeresAnnot: 8755097 (SEQ ID NO: 328), CeresAnnot: 8755098 (SEQ ID NO: 330), CeresAnnot: 8755099 (SEQ ID NO: 332), WO2008034648-158133 (SEQ ID NO: 333), WO2008034648-158187 (SEQ ID NO: 334), ou US7390893-0003 (SEQ ID NO: 335). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 209 possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 209. Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 209 possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com um ou mais homólogos funcionais de SEQ ID NO: 209 descritos acima ou apresentados na Listagem de Sequências.

[0070] Exemplos de sequências de aminoácido de homólogos fun cionais do polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 370 são fornecidos na Figura 7 e na Listagem de Sequências. Tais homólogos funcionais incluem, por exemplo, CeresClone: 645403 (SEQ ID NO: 372), Cere- sAnnot: 8717693 (SEQ ID NO: 374), GI: 212721672 (SEQ ID NO: 375), GI: 115487934 (SEQ ID NO: 376), GI: 357160384 (SEQ ID NO: 377), GI: 208431904 (SEQ ID NO: 378), GI: 326531522 (SEQ ID NO: 379), CeresClone: 1910316 (SEQ ID NO: 381), GI: 27469354 (SEQ ID NO: 382), GI: 125536186 (SEQ ID NO: 383), GI: 255555917 (SEQ ID NO: 384), GI: 224074359 (SEQ ID NO: 385), GI: 147845138 (SEQ ID NO: 386), GI: 224139026 (SEQ ID NO: 387), GI: 225427091 (SEQ ID NO: 388), CeresAnnot: 1538994 (SEQ ID NO: 390), GI: 356531457 (SEQ ID NO: 391), GI: 13775109 (SEQ ID NO: 392), CeresAnnot: 1447080 (SEQ ID NO: 394), GI: 356496180 (SEQ ID NO: 395), GI: 5381313 (SEQ ID NO: 396), GI: 3336906 (SEQ ID NO: 397), CeresClone: 1611686 (SEQ ID NO: 399), CeresClone: 1927515 (SEQ ID NO: 401), e CeresAnnot: 834509 (SEQ ID NO: 403). Em alguns casos, um homólogo funcional da SEQ ID NO: 370 possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoá- cido apresentada na SEQ ID NO: 370. Em alguns casos, um homólogo funcional de SEQ ID NO: 370 possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com um ou mais homólogos funcionais da SEQ ID NO: 370 descritos acima ou apresentados na Listagem de Sequências.

[0071] A identificação de regiões conservadas em um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico facilita a produção de variantes de polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico. As variantes dos polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico tipicamente possuem 10 ou menos substituições de aminoáci- dos conservadoras dentro da sequência de aminoácido primária, por exemplo, 7 ou menos substituições de aminoácido conservativas, 5 ou menos substituições de aminoácido conservativas ou entre 1 e 5 substituições conservativas. Um polipeptídeo variante útil pode ser construído com base em um dos alinhamentos apresentados na Figura 1, Figura 2, Figura 3, ou Figura 4, Figura 5, Figura 6 ou Figura 7 e/ou homólogos identificados na Listagem de Sequências. Um tal polipeptídeo inclui as regiões conservadas, dispostas na ordem representada na Figura da extremidade amino-terminal até a extremidade carbóxi-terminal. Um tal polipeptídeo também pode incluir zero, um ou mais do que um aminoácido nas posições marcadas por traços. Quando nenhum amino- ácido está presente nas posições marcadas por traços, o comprimento de um tal polipeptídeo é a soma dos resíduos de aminoácido em todas as regiões conservadas. Quando os aminoácidos estão presentes em uma posição marcada por traços, um tal polipeptídeo possui um comprimento que é a soma dos resíduos de aminoácido em todas as regiões conservadas e todos os traços.

C. Homólogos Funcionais Identificados por HMMER

[0072] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico úteis incluem aqueles que se ajustam a um Hidden Markov Model baseado nos polipeptídeos apresentados em qualquer uma das Figuras de 1 a 7. Um Hidden Markov Model (HMM) é um modelo estatístico de uma sequência de consenso para um grupo de homólogos funcionais. Ver, Durbin et al., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (1998). Um HMM é gerado pelo programa HMMer 3.0 com parâmetros de programa padrão, utilizando as sequências do grupo de homólogos funcionais como entrada. Em alguns casos, os arquivos de entrada podem estar no formato FASTA. HMMer é fornecido pelo Howard Hughes Medical Institute (http://hmmer.janelia.org).

[0073] O alinhamento de sequência múltiplo é gerado por ProbCons (Do et al., Genome Res., 15(2):330-40 (2005)) versão 1.12 utilizando os parâmetros padrão: ProbCons é um programa de software de domínio público. ProbCons e HMMer podem ser encontrados na world wide web em fr.com/probcons/.

[0074] O HMM para um grupo de homólogos funcionais pode ser utilizado para determinar a probabilidade de que uma sequência candidata de polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico é um melhor ajuste para esse HMM particular do que para um HMM nulo gerada utilizando um grupo de sequências que não estão estrutural ou funcionalmente relacionados. A probabilidade de que uma sequência de polipeptídeo candidata seja um melhor ajuste para um HMM do que para um HMM nulo, é indicada pela pontuação de bits do HMM, um número gerado quando a sequência candidata é ajustada ao perfil do HMM utilizando o programa HMMer hmmsearch. O seguinte parâmetro é utilizado quando se opera o hmmsearch: o corte do E-valor para o relatório é definido como 1 ("-E 1"). Uma pontuação de bits do HMM elevada indica uma maior probabilidade da sequência candidata realizar uma ou mais das funções bioquímicas ou fisiológicas dos polipeptídeos utilizados para gerar o HMM. Uma pontuação de bits do HMM elevada é pelo menos 20, e muitas vezes é maior. Pequenas variações na pontuação de bits do HMM de uma sequência particular podem ocorrer devido aos fatores tais como a ordem na qual as sequências são processadas para alinhamento por múltiplos algoritmos de alinhamento de sequência tais como o programa ProbCons. No entanto, tal variação da pontuação de bits do HMM é menor.

[0075] Os polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico debatidos abaixo ajustam o HMM indicado com uma pontuação de bits do HMM maior do que 65 (por exemplo, maior do que 70, 80, 90, 100, 120, 140, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 ou 2000). Em algumas modalidades, a pontuação de bits do HMM de um polipeptídeo de aumento de tolerância ao estresse abiótico debatido abaixo é de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % da pontuação de bits do HMM de um homólogo funcional fornecido na Listagem de Sequências deste aplicativo. Em algumas modalidades, um polipep- tídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico debatido abaixo ajusta o HMM indicado com uma pontuação de bits do HMM maior do que 210 e possui um domínio indicativo de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. Em algumas modalidades, um poli- peptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico debatido abaixo ajusta o HMM indicado com uma pontuação de bits do HMM maior do que 210, e possui uma identidade de sequência de 65 % ou mais (por exemplo, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % de identidade de sequência) com uma sequência de aminoácido apresentada em qualquer uma das Figuras de 1 a 7.

[0076] Exemplos de polipeptídeos são apresentados na listagem de sequências que possuem pontuações de bits do HMM maiores do que 260 (por exemplo, maiores do que 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340 ou 342) quando adaptados a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácido apresentadas na Figura 1 os quais são identificados na Listagem de Sequências deste pedido. Tais polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24 ou 25.

[0077] Exemplos de polipeptídeos são apresentados na listagem de sequências que têm pontuações de bits do HMM maiores do que 730 (por exemplo, maiores do que 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1210 ou 1215) quando ajustados a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácido apresentadas na Figura 2, os quais são identificados na Listagem de Sequências deste pedido. Tais polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 337, 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 362, 364, 365, 366, 367 ou 368.

[0078] Exemplos de polipeptídeos são apresentados na listagem de sequências que possuem pontuações de bits do HMM maiores do que 350 (por exemplo, maiores do que 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445 ou 450) quando ajustados a um HMM gerado a partir das sequências de amino- ácido apresentadas na Figura 3 que são identificadas na Listagem de Sequências deste pedido. Tais polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 61, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108 ou 109.

[0079] Exemplos de polipeptídeos são apresentados na listagem de sequências que possuem pontuações de bits do HMM maiores do que 240 (por exemplo, maiores do que 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 840 ou 850) quando adaptados a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácido apresentadas na Figura 4 que são identificadas na Listagem de Sequências deste pedido. Tais polipeptí- deos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 111, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 123, 124, 126, 128, 130, 131, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206 ou 207.

[0080] Exemplos de polipeptídeos são apresentados na listagem de sequências que possuem pontuações de bits do HMM maiores do que 610 (por exemplo, maiores do que 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975 ou 980) quando adaptados a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácido apresentadas na Figura 5 que são identificadas na Listagem de Sequências deste pedido. Tais polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 ou 59.

[0081] Exemplos de polipeptídeos são apresentados na listagem de sequências que possuem pontuações de bits do HMM maiores do que 520 (por exemplo, maiores do que 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025 ou 1040) quando adaptados a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácidos apresentadas na Figura 6 que são identificadas na Listagem de Sequências deste pedido. Tais polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 209, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 227, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 306, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 322, 323, 324, 326, 328, 330, 332, 333, 334 ou 335.

[0082] Exemplos de polipeptídeos são apresentados na listagem de sequências que possuem pontuações de bits do HMM maiores do que 525 (por exemplo, maiores do que 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725 ou 750) quando ajustados a um HMM gerado a partir das sequências de aminoácido apresentadas na Figura 7 que são identificadas na Listagem de Sequências deste pedido. Tais polipeptídeos incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 370, 372, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 397, 399, 401 e 403.

D. Porcentagem de Identidade

[0083] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de aumento de tolerância ao estresse abiótico possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com uma das sequências de aminoácido apresentadas nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 123, 124, 126, 128, 130, 131, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 227, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 306, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 322, 323, 324, 326, 328, 330, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 362, 364, 365, 366, 367, 368, 370, 372, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 397, 399, 401 ou 403. Os polipeptídeos tendo uma tal porcentagem de identidade de sequência muitas vezes possuem um domínio indicativo de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico e/ou possuem uma pontuação de bits do HMM que é maior do que 65, como debatido acima. As sequências de aminoácidos de polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico com pelo menos 80 % de identidade de sequência com uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 123, 124, 126, 128, 130, 131, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 227, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 306, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 322, 323, 324, 326, 328, 330, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 362, 364, 365, 366, 367, 368, 370, 372, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 397, 399, 401 e 403 são fornecidas nas Figuras de 1 a 7 e na Listagem de Sequências.

[0084] "Porcentagem de identidade de sequência" refere-se ao grau de identidade de sequência entre qualquer sequência de referência dada, por exemplo, SEQ ID NO: 2, e uma sequência candidata de aumento da tolerância ao estresse abiótico. Uma sequência candidata possui tipicamente um comprimento que é de 80 por cento a 200 por cento do comprimento da sequência de referência, por exemplo, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 por cento do comprimento da sequência de referência. Uma porcentagem de identidade para qualquer ácido nucleico ou polipeptídeo candidato em relação a um ácido nucleico ou polipeptí- deo de referência pode ser determinada como se segue. Uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácido) está alinhada com uma ou mais sequências candidatas utilizando o programa de computador ClustalW (versão 1.83, parâmetros padrão), que permite que os alinhamentos de sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo sejam realizados através de todo o seu comprimento (alinhamento global). Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500 (2003).

[0085] ClustalW calcula a melhor correspondência entre uma refe rência e uma ou mais sequências candidatas, e as alinha de modo que as identidades, similaridades e diferenças possam ser determinadas. As lacunas de um ou mais resíduos podem ser inseridas em uma sequência de referência, em uma sequência candidata, ou ambas, para maximizar os alinhamentos das sequências. Para o alinhamento rápido por pares de sequências de ácido nucleico, os seguintes parâmetros padrão são utilizados: tamanho da palavra: 2; tamanho da janela: 4; método de pontuação: porcentagem; número de diagonais superiores: 4; e penalidade de lacuna: 5. Para o alinhamento múltiplo de sequências de ácido nucleico, os seguintes parâmetros são utilizados: penalização de abertura de lacuna: 10,0; penalidade de extensão de lacuna: 5,0; e transições de peso: sim. Para o alinhamento rápido por pares das sequências de proteína, os seguintes parâmetros são utilizados: tamanho da palavra: 1; tamanho da janela: 5; método de pontuação: porcentagem; número de diagonais superiores: 5; penalidade de lacuna 3. Para o alinhamento múltiplo de sequências de proteína, os seguintes parâmetros são utilizados: matriz de peso: matriz blosum; penalidade de abertura de lacuna: 10,0; penalidade de extensão de lacuna: 0,05; lacunas hidrófilas: ligadas; resíduos hidrófilos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg e Lys; penalidades de lacuna específicas do resíduo: ligadas. A saída Clus- talW é um alinhamento de sequências que reflete a conexão entre as sequências. O ClustalW pode ser executado, por exemplo, no site do Baylor College of Medicine Search Launcher na World Wide Web (sear- chlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) e no site do European Bioinformatics Institute World Wide Web (ebi.ac.uk/clustalw).

[0086] Para determinar a porcentagem de identidade de uma se quência candidata de ácido nucleico ou de aminoácido a uma sequência de referência, as sequências são alinhadas utilizando ClustalW, o número de correspondências idênticas no alinhamento é dividido pelo comprimento da sequência de referência, e o resultado é multiplicado por 100. Observa-se que o valor de identidade percentual pode ser arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13 e 78,14 são arredondados para 78,1, enquanto que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 e 78,19 são arredondados para 78,2.

[0087] Em alguns casos, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2. As sequências de aminoácido de poli- peptídeos tendo mais do que 45 % de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 2 são fornecidas na Figura 1 e na Listagem de Sequências.

[0088] Em alguns casos, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 337. As sequências de aminoácido de po- lipeptídeos tendo mais de 45 % de identidade de sequência com o poli- peptídeo apresentado na SEQ ID NO: 337 são fornecidos na Figura 2 e na Listagem de Sequências.

[0089] Em alguns casos, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 %, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 61. As sequências de aminoácido de polipeptídeos tendo mais do que 45 % de identidade de sequência com polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 61 são fornecidas na Figura 3 e na Listagem de Sequências.

[0090] Em alguns casos, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 111. As sequências de aminoácido de polipep- tídeos tendo uma identidade de sequência maior do que 45 % com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 111 são fornecidas na Figura 4 e na Listagem de Sequências.

[0091] Em alguns casos, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 %, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 27. As sequências de aminoácido de polipeptídeos tendo mais do que 45 % de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 27 são fornecidas na Figura 5 e na Listagem de Sequências.

[0092] Em alguns casos, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 209. As sequências de aminoácido de po- lipeptídeos tendo mais do que 45 % de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 209 são concedidas na Figura 6 e na Listagem de Sequências.

[0093] Em alguns casos, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico possui uma sequência de aminoácido com pelo menos 45 % de identidade de sequência, por exemplo, 50 %, 52 %, 56 %, 59 %, 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 370. As sequências de aminoácido de polipep- tídeos tendo identidade de sequência maior do que 45 % com o polipep- tídeo apresentado na SEQ ID NO: 370 são concedidas na Figura 7 e na Listagem de Sequências.

E. Outras Sequências

[0094] Deve ser observado que um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode incluir aminoácidos adicionais que não estão envolvidos na modulação da tolerância ao estresse abiótico e, assim, um tal polipeptídeo pode ser mais longo do que de outra maneira seria o caso. Por exemplo, um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode incluir uma marca de purificação, um peptídeo de trânsito de cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocon- drial, um peptídeo de amiloplasto, ou uma sequência líder adicionada ao terminal amino ou carbóxi. Em algumas modalidades, um polipeptí- deo de aumento da tolerância ao estresse abiótico inclui uma sequência de aminoácido que funciona como um repórter, por exemplo, uma proteína fluorescente verde ou uma proteína fluorescente amarela.

III. Ácidos Nucleicos

[0095] Os ácidos nucleicos aqui descritos incluem ácidos nucleicos que são eficazes para aumentar os níveis de tolerância ao estresse abi- ótico quando transcritos em uma planta ou célula vegetal. Tais ácidos nucleicos incluem, sem limitação, aqueles que codificam um polipeptí- deo de aumento da tolerância ao estresse abiótico e aqueles que podem ser utilizados para inibir a expressão de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico através de um método baseado em ácido nucleico.

A. Ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico

[0096] Os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos de au mento da tolerância ao estresse abiótico são aqui descritos. Exemplos de tais ácidos nucleicos incluem as SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 12, 14, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 43, 45, 47, 50, 60, 62, 65, 67, 73, 78, 80, 83, 87, 90, 92, 94, 97, 101, 106, 110, 112, 114, 119, 121, 125, 127, 129, 132, 134, 136, 148, 150, 152, 161, 164, 166, 168, 170, 173, 175, 177, 180, 185, 188, 204, 208, 210, 215, 217, 224, 226, 228, 234, 241, 243, 245, 248, 252, 254, 256, 258, 260, 264, 268, 270, 272, 274, 277, 279, 281, 288, 290, 293, 295, 297, 303, 305, 307, 310, 313, 316, 318, 321, 325, 327, 329, 331, 336, 343, 346, 349, 351, 361, 363, 369, 371, 373, 380, 389, 393, 398, 400 e 402 como descrito com mais detalhes abaixo. Um ácido nucleico também pode ser um fragmento que é pelo menos 40 % (por exemplo, pelo menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 %) do comprimento do ácido nucleico de comprimento total apresentado nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 12, 14, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 43, 45, 47, 50, 60, 62, 65, 67, 73, 78, 80, 83, 87, 90, 92, 94, 97, 101, 106, 110, 112, 114, 119, 121, 125, 127, 129, 132, 134, 136, 148, 150, 152, 161, 164, 166, 168, 170, 173, 175, 177, 180, 185, 188, 204, 208, 210, 215, 217, 224, 226, 228, 234, 241, 243, 245, 248, 252, 254, 256, 258, 260, 264, 268, 270, 272, 274, 277, 279, 281, 288, 290, 293, 295, 297, 303, 305, 307, 310, 313, 316, 318, 321, 325, 327, 329, 331, 336, 343, 346, 349, 351, 361, 363, 369, 371, 373, 380, 389, 393, 398, 400 e 402.

[0097] Um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode compreender a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 1. Alternativamente, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode ser uma variante do ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 1. Por exemplo, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode ter uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 80 % de identidade de sequência, por exemplo, 81 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência, com a sequência de nucleo- tídeo apresentada na SEQ ID NO: 1.

[0098] Um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode compreender a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 336. Alternativamente, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode ser uma variante do ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 336. Por exemplo, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode ter uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, com a sequência de nucleotí- deo apresentada na SEQ ID NO: 336.

[0099] Um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode compreender a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 60. Alternativamente, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode ser uma variante do ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 60. Por exemplo, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode ter uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, com a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 60.

[00100] Um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode compreender a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 110. Alternativamente, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode ser uma variante do ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 110. Por exemplo, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode ter uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, com a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 110.

[00101] Um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode compreender a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 26. Alternativamente, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode ser uma variante do ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 26. Por exemplo, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode ter uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 80 % de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, com a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 26.

[00102] Um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode compreender a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 208. Alternativamente, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode ser uma variante do ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 208. Por exemplo, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode ter uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, com a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 208.

[00103] Um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode compreender a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 369. Alternativamente, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode ser uma variante do ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 369. Por exemplo, um ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico pode ter uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80 % de identidade de sequência, por exemplo, 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, com a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 369.

[00104] As moléculas de ácido nucleico isoladas podem ser produzidas por técnicas padrão. Por exemplo, as técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) podem ser utilizadas para obter um ácido nucleico isolado contendo uma sequência de nucleotídeo aqui descrita. A PCR pode ser utilizada para amplificar as sequências específicas de DNA, assim como RNA, incluindo as sequências de DNA genômico total ou RNA celular total. Vários métodos de PCR são descritos, por exemplo, em PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Geralmente, a informação de sequência a partir das extremidades da região de interesse ou mais adiante é empregada para projetar os iniciadores de oligonucleotídeo que são idênticos ou semelhantes na sequência nos filamentos opostos do modelo a ser amplificado. As várias estratégias de PCR também estão disponíveis pelas quais as modificações de sequência de nucleotí- deo específicas do sítio podem ser introduzidas em um ácido nucleico modelo. Os ácidos nucleicos isolados também podem ser sintetizados quimicamente, como uma única molécula de ácido nucleico (por exemplo, utilizando a síntese automatizada de DNA na direção 3 a 5’ utilizando tecnologia de fosforamidita) ou como uma série de oligonucleotí- deos. Por exemplo, um ou mais pares de oligonucleotídeos longos (por exemplo, > 100 nucleotídeos) podem sintetizados os quais contêm a sequência desejada, com cada par contendo um segmento curto de complementaridade (por exemplo, cerca de 15 nucleotídeos) de tal modo que um duplex é formado quando o par de oligonucleotídeo é re- cozido. A polimerase de DNA é utilizada para estender os oligonucleo- tídeos, resultando em uma única molécula de ácido nucleico de filamento duplo por par de oligonucleotídeo, ao qual depois pode ser ligada em um vetor. Os ácidos nucleicos isolados da invenção também podem ser obtidos por mutagênese, por exemplo, de um DNA de ocorrência natural.

B. Uso de Ácidos Nucleicos para Modular a Expressão de Polipep- tídeos i. Expressão de um Polipeptídeo de Aumento da Tolerância ao Estresse Abiótico

[00105] Um ácido nucleico que codifica um dos polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico aqui descritos pode ser utilizado para expressar o polipeptídeo em uma espécie vegetal de interesse, tipicamente através da transformação de uma célula vegetal com um ácido nucleico tendo a sequência de codificação para o polipeptídeo ligado de maneira operável na orientação sentido a uma ou mais regiões reguladoras. Será observado que por causa da degeneração do código genético, vários ácidos nucleicos podem codificar um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico particular; isto é, para muitos aminoácidos, existe mais de um tripleto de nucleotídeo que serve como o códon para o aminoácido. Assim, os códons na sequência de codificação para um determinado polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico podem ser modificados de tal modo que a expressão ideal em uma espécie vegetal particular seja obtida, utilizando tabelas de polarização de códons apropriadas para essa espécie.

[00106] Em alguns casos, a expressão de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico inibe uma ou mais funções de um polipeptídeo endógeno. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo negativo dominante pode ser utilizado para inibir a função da proteína. Um polipeptídeo negativo dominante tipicamente é modificado ou truncado em relação a um polipeptídeo do tipo silvestre endógeno, e a sua presença em uma célula inibe uma ou mais funções do polipeptídeo do tipo silvestre nessa célula, isto é, o polipeptídeo negativo dominante é geneticamente dominante e confere uma perda de função. O mecanismo pelo qual um polipeptídeo negativo dominante confere um tal fenótipo pode variar, mas muitas vezes envolve uma interação proteína-proteína ou uma interação proteína-DNA. Por exemplo, um polipeptídeo negativo dominante pode ser uma enzima que é truncada em relação a uma enzima do tipo silvestre nativa, de tal modo que o polipeptídeo truncado retém os domínios envolvidos na ligação a uma primeira proteína, mas carece de domínios envolvidos na ligação de uma segunda proteína. O polipeptídeo truncado é assim incapaz de modular apropriadamente a atividade da segunda proteína. Ver, por exemplo, a US 2007/0056058. Como outro exemplo, uma mutação pontual que resulta em uma substituição de aminoácido não conservadora em um domínio catalítico pode resultar em um polipeptídeo negativo dominante. Ver, por exemplo, a US 2005/032221. Como outro exemplo, um polipeptídeo negativo dominante pode ser um fator de transcrição que é truncado em relação a um fator de transcrição do tipo silvestre nativo, de tal modo que o polipeptídeo truncado retém os domínios de ligação ao DNA, mas carece dos domínios de ativação. Um tal polipeptídeo truncado pode inibir o fator de transcrição do tipo silvestre a partir do DNA de ligação, inibindo assim a ativação da transcrição.

ii. Inibição da Expressão de um Polipeptídeo de Aumento da Tolerância ao Estresse Abiótico

[00107] Os polinucleotídeos e as construções recombinantes aqui descritos podem ser utilizados para inibir a expressão de um polipeptí- deo de aumento da tolerância ao estresse abiótico em uma espécie vegetal de interesse. Ver, por exemplo, Matzke and Birchler, Nature Reviews Genetics 6:24-35 (2005); Akashi et al., Nature Reviews Mol. Cell Biology 6:413-422 (2005); Mittal, Nature Reviews Genetics 5:355-365 (2004); e Nature Reviews RNA interference collection, Oct. 2005 na World Wide Web em nature.com/reviews/focus/mai. Vários métodos baseados em ácido nucleico, incluindo o RNA anti-sentido, clivagem de RNA direcionada ao ribozima, silenciamento de gene pós-transcricional (PTGS), por exemplo, interferência de RNA (RNAi) e silenciamento de gene de transcricional (TGS) são conhecidos de inibir a expressão do gene nos vegetais. Os polinucleotídeos adequados incluem ácidos nu- cleicos de comprimento total que codificam polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abiótico ou fragmentos de tais ácidos nuclei- cos de comprimento total. Em algumas modalidades, um complemento do ácido nucleico de comprimento total ou um fragmento deste pode ser utilizado. Tipicamente, um fragmento é pelo menos 10 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleotídeos ou mais. Geralmente, uma homologia mais elevada pode ser utilizada para compensar o uso de uma sequência mais curta.

[00108] A tecnologia anti-sentido é um método bem conhecido. Neste método, um ácido nucleico de um gene a ser reprimido é clonado e ligado de maneira operável a uma região reguladora e a uma sequência de término da transcrição de modo que o filamento anti-sentido de RNA seja transcrito. A construção recombinante é então transformada em plantas, como aqui descrito, e o filamento anti-sentido de RNA é produzido. O ácido nucleico não necessita de ser a sequência completa do gene a ser reprimido, mas tipicamente será substancialmente complementar a pelo menos uma parte do filamento sentido do gene a ser reprimido.

[00109] Em outro método, um ácido nucleico pode ser transcrito em uma ribozima, ou RNA catalítico, que afeta a expressão de um mRNA. Ver, a Patente U.S. No. 6.423.885. As ribozimas podem ser concebidas para emparelhar especificamente com praticamente qualquer RNA alvo e clivar a cadeia principal de fosfodiéster em uma localização específica, inativando assim funcionalmente o RNA alvo. Os ácidos nucleicos hete- rólogos podem codificar ribozimas concebidas para clivar os transcritos de mRNA particulares, prevenindo assim a expressão de um polipeptí- deo. As ribozimas de tubarão-martelo são úteis para destruir os mRNAs particulares, embora várias ribozimas que clivam o mRNA nas sequências de reconhecimento específicas do sítio possam ser utilizadas. As ribozimas de tubarão-martelo clivam os mRNAs em locais ditados por regiões de flanqueamento que formam pares de base complementares com o mRNA alvo. A única exigência é que o RNA alvo contenha uma sequência de nucleotídeo 5'-UG-3'. A construção e produção de ribozi- mas de tubarão-martelo é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5.254.678 e a WO 02/46449 e as referências nelas citadas. As sequências de ribozima de tubarão-martelo podem ser incorporadas em um RNA estável tal como um RNA de transferência (tRNA) para aumentar a eficiência de clivagem in vivo. Perriman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(13):6175-6179 (1995); de Feyter and Gaudron, Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Chapter 43, “Expressing Ribozymes in Plants”, Edited by Turner, P.C., Humana Press Inc., Totowa, NJ. As endorribonucleases de RNA que foram descritas, tais como aquelas de ocorrência natural em Tetrahymena thermophila, podem ser úteis. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 4.987.071 e 6.423.885.

[00110] PTGS, por exemplo, RNAi, também pode ser utilizado para inibir a expressão de um gene. Por exemplo, uma construção pode ser preparada que inclui uma sequência que é transcrita dentro de um RNA que pode recozer a si próprio, por exemplo, um RNA de filamento duplo tendo uma estrutura de alça penducular. Em algumas modalidades, um filamento da parte da haste de um RNA de filamento duplo compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à sequência de codificação sentido ou a um fragmento desta de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico e que é de cerca de 10 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos de comprimento. O comprimento da sequência que é semelhante ou idêntico à sequência de codificação sentido pode ser de 10 nucleotídeos a 500 nucleotídeos, de 15 nucleotídeos a 300 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos a 100 nucleotídeos ou de 25 nucleotídeos a 100 nucleotídeos. O outro filamento da parte do caule de um RNA de filamento duplo compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica ao filamento anti-sentido ou a um fragmento deste da sequência de codificação do polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico, e pode ter um comprimento que é mais curto, igual ou mais longo do que o comprimento correspondente da sequência de sentido. Em alguns casos, um filamento da parte do caule de um RNA de filamento duplo compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à região 3' ou 5' não transladada, ou um fragmento desta, de um mRNA que codifica um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico, e o outro filamento da parte do caule do RNA de filamento duplo compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à sequência que é complementar à região 3' ou 5' não transladada, respectivamente, ou um fragmento desta, do mRNA que codifica o polipep- tídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. Em outras modalidades, um filamento da porção do caule de um RNA de filamento duplo compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à sequência de um íntron, ou seu fragmento, no pré-mRNA que codifica um polipep- tídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico, e o outro filamento da parte do caule compreende uma sequência que é semelhante ou idêntica à sequência que é complementar à sequência do íntron, ou um fragmento deste, no pré-mRNA.

[00111] A parte da alça de um RNA de filamento duplo pode ser de 3 nucleotídeos a 5000 nucleotídeos, por exemplo, de 3 nucleotídeos a 25 nucleotídeos, de 15 nucleotídeos a 1000 nucleotídeos, de 20 nucle- otídeos a 500 nucleotídeos ou de 25 nucleotídeos a 200 nucleotídeos. A parte da alça do RNA pode incluir um íntron ou um fragmento deste. Um RNA de filamento duplo pode ter zero, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais estruturas de alça penducular.

[00112] Uma construção que inclui uma sequência que está operacionalmente ligada a uma região reguladora e uma sequência de término da transcrição, e que é transcrita em um RNA que pode formar um RNA de filamento duplo, é transformada em plantas como aqui descrito. Os métodos para uso de RNAi para inibir a expressão de um gene são conhecidos por aqueles de habilidade técnica. Ver, por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 5.034.323; 6.326.527; 6.452.067; 6.573.099; 6.753.139; e 6.777.588. Ver também WO 97/01952; WO 98/53083; WO 99/32619; WO 98/36083; e Publicações de Patente U.S. 20030175965, 20030175783, 20040214330 e 20030180945.

[00113] As construções contendo regiões reguladoras ligadas de maneira operável às moléculas de ácido nucleico na orientação sentido também podem ser utilizadas para inibir a expressão de um gene. O produto de transcrição pode ser semelhante ou idêntico à sequência codificação sentido, ou seu fragmento, de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. O produto de transcrição também pode ser não poliadenilado, carecer de uma estrutura tampão 5', ou conter um íntron não substituível. Os métodos de inibição da expressão do gene utilizando um cDNA de comprimento completo assim como uma sequência parcial de cDNA são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5.231.020.

[00114] Em algumas modalidades, uma construção contendo um ácido nucleico tendo pelo menos um filamento que é um modelo para as sequências tanto sentido quanto anti-sentido que são complementares entre si, é utilizada para inibir a expressão de um gene. As sequências sentido e anti-sentido podem fazer parte de uma molécula de ácido nucleico maior ou podem fazer parte de moléculas de ácido nucleico separadas tendo sequências que não são complementares. A sequência sentido ou anti-sentido pode ser uma sequência que é idêntica ou complementar à sequência de um mRNA, a região não transladada 3' ou 5' de um mRNA ou um íntron em um pré-mRNA que codifica um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico, ou um fra-gmento de tais sequências. Em algumas modalidades, a sequência sentido ou anti-sentido é idêntica ou complementar a uma sequência da região reguladora que conduz a transcrição do gene que codifica um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. Em cada caso, a sequência de sentido é a sequência que é complementar à sequência anti-sentido.

[00115] As sequências sentido e anti-sentido podem ser de um comprimento maior do que cerca de 10 nucleotídeos (por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou mais nucleotídeos). Por exemplo, uma sequência anti-sentido pode ser de 21 ou de 22 nucleotídeos de comprimento. Tipicamente, as sequências sentido e anti-sentido variam em comprimento de cerca de 15 nucleotí- deos a cerca de 30 nucleotídeos, por exemplo, de cerca de 18 nucleotí- deos a cerca de 28 nucleotídeos ou de cerca de 21 nucleotídeos a cerca de 25 nucleotídeos.

[00116] Em algumas modalidades, uma sequência anti-sentido é uma sequência complementar a uma sequência de mRNA, ou um fragmento desta, que codifica um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico aqui descrito. A sequência sentido complementar à sequência anti-sentido pode ser uma sequência presente dentro do mRNA do polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. Tipicamente, as sequências sentido e anti-sentido são concebidas para corresponder a uma sequência de 15 a 30 nucleotídeos de um mRNA alvo de tal modo que o nível desse mRNA alvo seja reduzido.

[00117] Em algumas modalidades, uma construção contendo um ácido nucleico tendo pelo menos um filamento que é um modelo para mais do que uma sequência de sentido (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências de sentido), podem ser utilizada para inibir a expressão de um gene. Do mesmo modo, uma construção contendo um ácido nucleico tendo pelo menos um filamento que é um modelo para mais do que uma sequência anti-sentido (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências anti-sentido), pode ser utilizada para inibir a expressão de um gene. Por exemplo, uma construção pode conter um ácido nucleico tendo pelo menos um filamento que é um modelo para duas sequências de sentido e duas sequências anti-sentido. As múltiplas sequências de sentido podem ser idênticas ou diferentes, e as múltiplas sequências anti-sentido podem ser idênticas ou diferentes. Por exemplo, uma construção pode ter um ácido nucleico tendo um filamento que é um modelo para duas sequências de sentido idênticas e duas sequências anti-sentido idênticas que são complementares às duas sequências sentido idênticas. Alternativamente, um ácido nucleico isolado pode ter um filamento que é um modelo para (1) duas sequências de sentido idênticas de 20 nucleotídeos de comprimento, (2) uma sequência anti-sentido que é complementar às duas sequências de sentido idênticas de 20 nucleotídeos de comprimento, (3) uma sequência de sentido de 30 nucleotídeos de comprimento e (4) três sequências anti-sentido idênticas que são complementares à sequência de sentido de 30 nucleotídeos de comprimento. As construções aqui fornecidas podem ser concebidas para terem uma disposição adequada de sequências sentido e anti-sentido. Por exemplo, duas sequências de sentido idênticas podem ser seguidas por duas sequências anti-sentido idênticas ou podem ser posicionadas entre duas sequências anti-sentido idênticas.

[00118] Um ácido nucleico tendo pelo menos um filamento que é um modelo para uma ou mais sequências sentido e/ou anti-sentido pode ser ligado de maneira operável a uma região reguladora para conduzir a transcrição de uma molécula de RNA contendo as sequência sentido e/ou anti-sentido. Além disso, um tal ácido nucleico pode ser ligado de maneira operável a uma sequência terminadora de transcrição, tal como o terminador do gene da nopalina sintase (nos). Em alguns casos, duas regiões reguladoras podem direcionar a transcrição de dois transcritos: um do filamento superior e um do filamento inferior. Ver, por exemplo, Yan et al., Plant Physiol., 141:1508-1518 (2006). As duas regiões reguladoras podem ser iguais ou diferentes. Os dois transcritos podem formar moléculas de RNA de filamento duplo que induzem a degradação do RNA alvo. Em alguns casos, um ácido nucleico pode ser posicionado dentro de um T-DNA ou DNA de transferência derivado de planta (P-DNA) de tal modo que as sequências de fronteira de T-DNA esquerdas e direitas ou as sequências semelhantes a fronteira esquerdas e direitas do flanco de P-DNA, ou estão em cada lado do ácido nucleico. Ver, a Publicação de Patente U.S. No. 2006/0265788. A sequência de ácido nucleico entre as duas regiões reguladoras pode ser de cerca de 15 a cerca de 300 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico entre as duas regiões reguladoras é de cerca de 15 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 15 a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 18 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 18 a cerca de 40 nucleo- tídeos de comprimento, de cerca de 18 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, ou de cerca de 18 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento.

[00119] Em alguns métodos baseados em ácido nucleico para a inibição da expressão do gene em plantas, um ácido nucleico adequado pode ser um análogo de ácido nucleico. Os análogos de ácido nucleicos podem ser modificados no componente de base, componente de açúcar, ou cadeia principal de fosfato para melhorar, por exemplo, a estabilidade, hibridação ou solubilidade do ácido nucleico. As modificações no componente de base incluem desoxiuridina para desoxitimidina, e 5- metil-2'-desoxicitidina e 5-bromo-2'-desoxicitidina para desoxicitidina. As modificações do componente de açúcar incluem a modificação da hidroxila 2' do açúcar de ribose para formar açúcares de 2'-O-metila ou 2'-O-alila. A cadeia principal de fosfato de desoxirribose pode ser modificado para produzir ácidos nucleicos morfolino, em que cada componente de base está ligada a um anel de morfolino de seis membros, ou ácidos nucleicos peptídicos, em que a cadeia principal de desoxifosfato é substituída por uma cadeia principal de pseudo-peptídeo e as quatro bases são retidas. Ver, por exemplo, Summerton and Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7:187-195 (1997); Hyrup et al., Bioorgan. Med. Chem., 4:5-23 (1996). Além disso, a cadeia principal de desoxifosfato pode ser substituída com, por exemplo, uma cadeia principal de fosfo- rotioato ou fosforoditioato, um fosforoamidito, ou uma cadeia principal de fosfotriéster alquílico.

C. Construções/Vetores

[00120] As construções recombinantes aqui fornecidas podem ser utilizadas para transformar as plantas ou células vegetais de modo a modular os níveis de tolerância ao estresse abiótico. Uma construção de ácido nucleico recombinante pode compreender um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico como aqui descrito, ligado de maneira operável a uma região reguladora adequada para expressar o polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico na planta ou célula. Assim, um ácido nu- cleico pode compreender uma sequência de codificação que codifica um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico tal como apresentado nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 123, 124, 126, 128, 130, 131, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 227, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 304, 306, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 322, 323, 324, 326, 328, 330, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 362, 364, 365, 366, 367, 368, 370, 372, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 390, 391, 392, 394, 395, 396, 397, 399, 401 ou 403. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos de aumento da tolerância ao estresse abió- tico são apresentados nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 12, 14, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 43, 45, 47, 50, 60, 62, 65, 67, 73, 78, 80, 83, 87, 90, 92, 94, 97, 101, 106, 110, 112, 114, 119, 121, 125, 127, 129, 132, 134, 136, 148, 150, 152, 161, 164, 166, 168, 170, 173, 175, 177, 180, 185, 188, 204, 208, 210, 215, 217, 224, 226, 228, 234, 241, 243, 245, 248, 252, 254, 256, 258, 260, 264, 268, 270, 272, 274, 277, 279, 281, 288, 290, 293, 295, 297, 303, 305, 307, 310, 313, 316, 318, 321, 325, 327, 329, 331, 336, 343, 346, 349, 351, 361, 363, 369, 371, 373, 380, 389, 393, 398, 400 e 402, ou na Listagem de Sequências. O polipeptí- deo de aumento da tolerância ao estresse abiótico codificado por um ácido nucleico recombinante pode ser um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico nativo ou pode ser heterólogo para a célula. Em alguns casos, a construção recombinante contém um ácido nu- cleico que inibe a expressão de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico, ligado de maneira operável a uma região reguladora. Exemplos de regiões reguladoras adequadas são descritos na seção intitulada "Regiões Reguladoras".

[00121] Os vetores contendo construções de ácido nucleico recom- binantes tais como aquelas aqui descritas também são fornecidos. As cadeias principais de vetor adequadas incluem, por exemplo, aquelas rotineiramente utilizadas na técnica tais como plasmídeos, vírus, cro-mossomas artificiais, BACs, YACs ou PACs. Os vetores de expressão adequados incluem, sem limitação, plasmídeos e vetores virais derivados, por exemplo, de bacteriófagos, baculovírus e retrovírus. Numerosos vetores e sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis em tais empresas como Novagen® (Madison, WI), Clontech® (Palo Alto, CA), Stratagene® (La Jolla, CA), e Invitrogen/Life Technologies® (Carlsbad, CA).

[00122] Os vetores aqui fornecidos também podem incluir, por exemplo, origens de replicação, regiões de fixação de andaime (SARs) e/ou marcadores. Um gene marcador pode conferir um fenótipo selecionável em uma célula vegetal. Por exemplo, um marcador pode conferir resistência a biocida, tal como resistência a um antibiótico (por exemplo, ca- namicina, G418, bleomicina ou higromicina) ou um herbicida (por exemplo, glifosato, clorsulfuron ou fosfinotricina). Além disso, um vetor de expressão pode incluir uma sequência de marca concebida para facilitar a manipulação ou detecção (por exemplo, purificação ou localização) do polipeptídeo expresso. As sequências de marca, tais como as sequências de luciferase, β-glucuronidase (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), glutationa S-transferase (GST), poliistidina, c-myc, hemagluti- nina ou marca Flag™ (Kodak, New Haven, CT), tipicamente são expressas como uma fusão com o polipeptídeo codificado. Tais marcas podem ser inseridas em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, incluindo no terminal carboxila ou amino.

D. Regiões reguladoras

[00123] A escolha de regiões reguladoras a serem incluídas em uma construção recombinante depende de vários fatores, incluindo, mas não limitado a estes, eficiência, seletividade, indutibilidade, nível de expressão desejado e expressão preferencial de células ou tecidos. É um assunto rotineiro para uma pessoa de habilidade na técnica modular a expressão de uma sequência de codificação que seleciona e posiciona apropriadamente as regiões reguladoras em relação à sequência de co-dificação. A transcrição de um ácido nucleico pode ser modulada de um modo semelhante.

[00124] Algumas regiões reguladoras adequadas iniciam a transcrição apenas, ou predominantemente, em certos tipos de células. Métodos para a identificação e caracterização das regiões reguladoras no DNA genômico de plantas são conhecidos, incluindo, por exemplo, aqueles descritos nas seguintes referências: Jordano et al., Plant Cell, 1:855-866 (1989); Bustos et al., Plant Cell, 1:839-854 (1989); Green et al., EMBO J., 7:4035-4044 (1988); Meier et al., Plant Cell, 3:309-316 (1991); e Zhang et al., Plant Physiology, 110:1069-1079 (1996).

[00125] Exemplos de várias classes de regiões reguladoras são descritos abaixo. Algumas das regiões reguladoras indicadas abaixo, assim como as regiões reguladoras adicionais, são descritas com maiores detalhes nos Pedidos de Patente U.S. Nos. de Ser. 60/518.075; 60/544.771; 60/558.869; 60/583.691; 60/619.181; 60/637.140; 60/757.544; 60/776.307; 10/957.569; 11/058.689; 11/172.703; 11/208.308; 11/274.890; 60/583.609; 60/612.891; 11/097.589; 11/233.726; 11/408.791; 11/414.142; 10/950.321; 11/360.017; PCT/US05/011105; PCT/US05/23639; PCT/US05/034308; PCT/US05/034343; e PCT/US06/038236; PCT/US06/040572; PCT/US07/62762; PCT/US2009/032485; e PCT/US2009/038792.

[00126] Por exemplo, as sequências das regiões reguladoras p326, YP0144, YP0190, p13879, YP0050, p32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0128, YP0275, PT0660, PT0683, PT0758, PT0613, PT0672, PT0688, PT0837, YP0092, PT0676, PT0708, YP0396, YP0007, YP0111, YP0103, YP0028, YP0121, YP0008, YP0039, YP0115, YP0119, YP0120, YP0374, YP0101, YP0102, YP0110, YP0117, YP0137, YP0285, YP0212, YP0097, YP0107, YP0088, YP0143, YP0156, PT0650, PT0695, PT0723, PT0838, PT0879, PT0740, PT0535, PT0668, PT0886, PT0585, YP0381, YP0337, PT0710, YP0356, YP0385, YP0384, YP0286, YP0377, PD1367, PT0863, PT0829, PT0665, PT0678, YP0086, YP0188, YP0263, PT0743 e YP0096 são apresentadas na listagem de sequências da PCT/US06/040572; a sequência da região reguladora PT0625 é apresentada na listagem de sequências da PCT/US05/034343; as sequências das regiões reguladoras PT0623, YP0388, YP0087, YP0093, YP0108, YP0022 e YP0080 são apresentadas na listagem de sequências do Pedido de Patente U.S. No. de Ser. 11/172.703; a sequência da região reguladora PR0924 é apresentada na listagem de sequências da PCT/US07/62762; e as sequências das regiões reguladoras p530c10, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYp102 e pOsYp285 são apresentadas na listagem de sequências da PCT/US06/038236.

[00127] Será observado que uma região reguladora pode satisfazer os critérios para uma classificação com base na sua atividade em uma espécie vegetal, e ainda satisfazer os critérios para uma classificação diferente com base na sua atividade em outra espécie vegetal.

i. Promotores de Expressão Ampla

[00128] Um promotor pode ser dito de ser de "expressão ampla" quando promove a transcrição em muitos, mas não necessariamente em todos, tecidos vegetais. Por exemplo, um promotor de expressão ampla pode promover a transcrição de uma sequência ligada de maneira operável em uma ou mais dos brotos, ponta da brotos (ápice) e folhas, mas fracamente ou não em tecidos tais como raízes ou caules. Como outro exemplo, um promotor de expressão ampla pode promover a transcrição de uma sequência ligada de maneira operável em um ou mais do caule, broto, ponta da broto (ápice) e folhas, mas pode promover a transcrição fracamente ou de modo algum em tecidos tais como tecidos reprodutivos de flores e desenvolvimento de sementes. Exemplos não limitativos de promotores de expressão ampla que podem ser incluídos nas construções de ácido nucleico aqui fornecidas incluem os promotores p326, YP0144, YP0190, p13879, YP0050, p32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848 e PT0633. Exemplos adicionais incluem o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor da manopina sintase (MAS), os promotores 1' ou 2' derivados de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor 34S do vírus do mosaico da figwort, promotores de actina tais como o promotor da actina do arroz e promotores de ubiquitina tais como o promotor de ubiquitina- 1 de milho. Em alguns casos, o promotor CaMV 35S é excluído da categoria de promotores de expressão ampla.

[00129] Outro exemplo de um promotor amplo é a sequência da região reguladora PD3141 apresentada na listagem de sequências da PCT/US2009/032485. Neste caso, o padrão de expressão da região reguladora PD3141 é descrito para plantas de arroz T0 que superexpres- sam uma construção que compreende PD3141 que conduz a expressão de EGFP. Nas mudas, a expressão foi observada em: Lavrador: não específico; Colmo principal: não específico; Raiz: não específica; Folha: não específica; e Meristema: não específico. Nas plantas maduras, a expressão foi observada em: Colmo principal: bainha do feixe, endode- rme, epiderme, entrenó, língula, nó, periciclo, floema, camada de escle- rênquima, vasculatura, xilema; Raiz: córtex, vascular; Panícula: folha do lírio-roxo, ovário, pedúnculo, ramo primário, rachilla, eixo de uma inflo- rescência, espigueta; Espiga: folha de lírio-roxo, flósculo (tricoma), glu- mela inferior, óvulo, pedículo, pólen, semente, estigma; Folha: epiderme, lâmina foliar, bainha foliar, mesófilo; e Meristema: meristema floral, meristema apical do broto, meristema vegetativo.

[00130] Outro exemplo de um promotor amplo é a sequência da região reguladora p326 apresentada na listagem de sequências do pedido U.S. número de série 10/981.334. A esse respeito, o padrão de expressão da região reguladora de p326 é descrito para plantas de Arabi- dopsis. P326 expressa através da maior parte dos tecidos maduros submetidos a triagem. A expressão foi um pouco maior no tecido epidérmico, vascular e fotossintético da muda. As linhas caracterizadas atravessariam várias gerações.

[00131] Outro exemplo de um promotor amplo é a sequência da região reguladora PD2995 (uma versão de 600 pb do p326) apresentada na listagem de sequências da PCT/US2009/32485. Nas plantas de arroz T0, a PD2995 expressa muito fracamente em todos os tecidos da planta nos estágios tanto de muda quanto madura. A expressão mais forte detectada no tecido radicular e no embrião.

ii. Promotores da raiz

[00132] Os promotores ativos da raiz conferem a transcrição no tecido da raiz, por exemplo, endoderme da raiz, epiderme da raiz ou tecidos vasculares da raiz. Em algumas modalidades, os promotores ativos da raiz são promotores preferenciais da raiz, isto é, conferem transcrição apenas ou predominantemente no tecido da raiz. Os promotores preferenciais da raiz incluem os promotores YP0128, YP0275, PT0625, PT0660, PT0683 e PT0758. Outros promotores preferenciais da raiz incluem os promotores PT0613, PT0672, PT0688 e PT0837, os quais conduzem a transcrição principalmente no tecido da raiz e, em menor grau, nos óvulos e/ou sementes. Outros exemplos de promotores preferenciais da raiz incluem os subdomínios específicos da raiz do promotor CaMV 35S (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7890-7894 (1989)), dos promotores específicos da célula da raiz relatados por Conkling et al., Plant Physiol., 93:1203-1211 (1990), e o promotor RD2 do tabaco.

[00133] Outro exemplo de um promotor de raiz é a sequência da região reguladora PD3561 apresentada na listagem de sequências da PCT/US2009/038792. Neste caso, o padrão de expressão da região reguladora PD3561 é descrito para plantas de arroz T0 que super-expres- sam uma construção que compreende PD3561 que conduz a expressão de EGFP. A expressão foi observada nas raízes de mudas no córtex, epiderme e tecidos vasculares. Nas plantas maduras, a expressão foi observada fortemente ao longo da raiz com a exceção da cápsula radicular e do córtex, epiderme e tecidos vasculares.

iii. Maturação dos Promotores de Endosperma

[00134] Em algumas modalidades, os promotores que conduzem a transcrição na maturação do endosperma podem ser úteis. A transcrição de um promotor de endosperma em maturação tipicamente começa após a fertilização e ocorre principalmente no tecido do endosperma durante o desenvolvimento da semente e é tipicamente mais elevada durante a fase de celularização. Os mais adequados são os promotores que são ativos predominantemente no endosperma em maturação, embora os promotores que também são ativos em outros tecidos possam às vezes ser utilizados. Exemplos não limitativos de promotores de en- dosperma em maturação que podem ser incluídos nas construções de ácido nucleico aqui fornecidas incluem o promotor de napina, o promotor de Arcelin-5, o promotor de faseolina (Bustos et al., Plant Cell, 1(9):839-853 (1989)), o promotor de inibidor da tripsina de soja (Riggs et al., Plant Cell, 1(6):609-621 (1989)), o promotor de ACP (Baerson et al., Plant Mol. Biol., 22(2):255-267 (1993)), o promotor da estearoil-ACP desaturasa (Slocombe et al., Plant Physiol., 104(4):167-176 (1994)), a subunidade α’ da soja do promotor de β-conglicinina (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8560-8564 (1986)), o promotor de oleosina (Hong et al., Plant Mol. Biol., 34(3):549-555 (1997)), e promotores de zeína, tais como o promotor de zeína de 15 kD, o promotor de zeína de 16 kD, o promotor de zeína de 19 kD, o promotor de zeína de 22 kD e o promotor de zeína de 27 kD. Também são adequados o promotor de Osgt-1 do gene da glutelina-1 do arroz (Zheng et al., Mol. Cell Biol., 13:5829-5842 (1993)), o promotor beta-amilase e o promotor de horde- ína da cevada. Outros promotores de endosperma em maturação incluem os promotores YP0092, PT0676 e PT0708.

iv. Promotores do Tecido Ovariano

[00135] Os promotores que são ativos nos tecidos do ovário tais como a parede e o mesocarpo do óvulo também podem ser úteis, por exemplo, um promotor de poligalacturonidase, o promotor de TRX da banana, o promotor de actina do melão, YP0396 e PT0623. Exemplos de promotores que são ativos principalmente nos óvulos incluem YP0007, YP0111, YP0092, YP0103, YP0028, YP0121, YP0008, YP0039, YP0115, YP0119, YP0120 e YP0374.

v. Promotores da Cavidade Embrionária/Endosperma Prematuro

[00136] Para conseguir a expressão na cavidade embrionária/endos- perma prematuro, as regiões reguladoras podem ser utilizadas que são ativas nos núcleos polares e/ou na célula central, ou nos precursores em núcleos polares, mas não nos óvulos ou precursores de óvulos. Os mais adequados são promotores que conduzem a expressão apenas ou predominantemente nos núcleos polares ou seus precursores e/ou na célula central. Um padrão de transcrição que se estende a partir dos núcleos polares dentro do endosperma precoce em desenvolvimento também pode ser encontrado com os promotores preferenciais da cavidade embrionária/endosperma prematuro, embora a transcrição tipicamente diminua significativamente no desenvolvimento posterior do en- dosperma durante e após a fase de celularização. A expressão no zigoto ou embrião em desenvolvimento tipicamente não está presente com os promotores da cavidade embrionária/endosperma prematuro.

[00137] Os promotores que podem ser adequados incluem aqueles derivados dos seguintes genes: Arabidopsis viviparous-1 (ver, GenBank No. U93215); Arabidopsis atmycl (ver, Urao, Plant Mol. Biol., 32:571-57 (1996); Conceicao, Plant, 5:493-505 (1994)); Arabidopsis FIE (GenBank No. AF129516); Arabidopsis MEA; Arabidopsis FIS2 (GenBank No. AF096096); e FIE 1.1 (Patente U.S. No 6.906.244). Outros promotores que podem ser adequados incluem aqueles derivados dos seguintes genes: MAC1 do milho (ver, Sheridan, Genetics, 142:1009-1020 (1996)); Cat3 do milho (ver, GenBank No. L05934; Abler, Plant Mol. Biol., 22:10131-1038 (1993)). Outros promotores incluem os seguintes promotores de Arabidopsis: YP0039, YP0101, YP0102, YP0110, YP0117, YP0119, YP0137, DME, YP0285 e YP0212. Outros promotores que podem ser úteis incluem os seguintes promotores de arroz: p530c10, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYp102 e pOsYp285.

vi. Promotores de Embriões

[00138] As regiões reguladoras que preferencialmente impulsionam a transcrição sobre as células zigóticas após a fertilização podem proporcionar uma expressão preferencial para o embrião. Os mais adequados são promotores que preferencialmente conduzem a transcrição nos embriões de estádio precoce antes do estádio cardíaco, mas a expressão nos estádios tardios e em embriões em maturação também é adequada. Os promotores preferenciais para embriões incluem o promotor da proteína de transferência de lipídeo da cevada (Ltp1) (Plant Cell Rep 20:647-654 (2001)), YP0097, YP0107, YP0088, YP0143, YP0156, PT0650, PT0695, PT0723, PT0838, PT0879 e PT0740.

vii. Promotores de Tecido Fotossintéticos

[00139] Os promotores ativos no tecido fotossintético conferem transcrição em tecidos verdes tais como as folhas e caules. Os mais adequados são promotores que conduzem a expressão apenas ou predominantemente nesses tecidos. Exemplos de tais promotores incluem os promotores da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (RbcS) tais como o promotor RbcS do lariço oriental (Larix laricina), o promotor cab6 do pinho (Yamamoto et al., Plant Cell Physiol., 35:773-778 (1994)), o promotor Cab-1 do trigo (Fejes et al., Plant Mol. Biol., 15:921-932 (1990)), o promoter CAB-1 do espinafre (Lubberstedt et al., Plant Physiol., 104:997-1006 (1994)), o promoter cab1R do arroz (Luan et al., Plant Cell, 4:971-981 (1992)), o promotor de piruvato ortofosfato dici- nase (PPDK) do milhon (Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9586-9590 (1993)), o promoter Lhcb1*2 do tabaco (Cerdan et al., Plant Mol. Biol., 33:245-255 (1997)), o promote symporter SUC2 saca- rose-H+ de Arabidopsis thaliana (Truernit et al., Planta, 196:564-570 (1995)), e promotores de proteína da membrana tilacóide do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Outros promotores de tecido fotossintéticos incluem PT0535, PT0668, PT0886, YP0144, YP0380 e PT0585.

viii. Promotores do Tecido Vascular

[00140] Exemplos de promotores que possuem atividade elevada ou preferencial em feixes vasculares incluem YP0087, YP0093, YP0108, YP0022 e YP0080. Outros promotores preferenciais do tecido vascular incluem o promotor da proteína da parede celular rica em glicina GRP 1.8 (Keller and Baumgartner, Plant Cell, 3(10):1051-1061 (1991)), o promotor do vírus mosqueado amarelo de Commelina (CoYMV) (Medberry et al., Plant Cell, 4(2):185-192 (1992)), e o promotor do vírus tungro ba- cilliforme do arroz (RTBV) (Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(2):687-692 (2004)).

ix. Promotores Induzíveis

[00141] Os promotores induzíveis conferem a transcrição em resposta a estímulos externos tais como agentes químicos ou estímulos ambientais. Por exemplo, os promotores induzíveis podem conferir a transcrição em resposta a hormônios tais como ácido giberélico ou eti- leno, ou em resposta à luz ou à estiagem. Exemplos de promotores in- duzíveis pela estiagem incluem YP0380, PT0848, YP0381, YP0337, PT0633, YP0374, PT0710, YP0356, YP0385, YP0396, YP0388, YP0384, PT0688, YP0286, YP0377, PD1367 e PD0901. Exemplos de promotores induzíveis por nitrogênio incluem PT0863, PT0829, PT0665 e PT0886. Exemplos de promotores induzíveis por sombreamento incluem PR0924 e PT0678. Um exemplo de um promotor induzido pelo sal é rd29A (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech 17: 287-291).

x. Promotores Basais

[00142] Um promotor basal é a sequência mínima necessária para a montagem de um complexo de transcrição requerido para o início da transcrição. Os promotores basais frequentemente incluem um elemento "caixa TATA" que pode estar localizado entre cerca de 15 e cerca de 35 nucleotídeos a montante do local de início da transcrição. Os promotores basais também podem incluir um elemento de "caixa CCAAT" (tipicamente a sequência CCAAT) e/ou uma sequência GGGCG, que pode estar localizada entre cerca de 40 e cerca de 200 nucleotídeos, tipicamente cerca de 60 a cerca de 120 nucleotídeos, a montante do local de início da transcrição.

xi. Promotores do Caule

[00143] Um promotor de caule pode ser específico a um ou mais tecidos de caule ou específico ao caule e outras partes da planta. Os promotores de caule podem ter uma atividade elevada ou preferencial, por exemplo, na epiderme e no córtex, camada vascular, pró-camada ou xilema. Exemplos de promotores de caule incluem YP0018 que é divulgado na US20060015970 e CryIA(b) e CryIA(c) (Braga et al. 2003, Journal of New Seeds 5:209-221).

xii. Outros Promotores

[00144] Outras classes de promotores incluem, mas não são limitados a estes, preferencial de broto, preferencial de calo, preferencial de células de tricoma, preferencial de células de guarda tais como PT0678, preferencial de tubérculo, preferencial de células de parênquima e promotores preferenciais de senescência. Os promotores designados YP0086, YP0188, YP0263, PT0758, PT0743, PT0829, YP0119 e YP0096, como descritos nos pedidos de patente acima referidos, também podem ser úteis.

xiii. Outras Regiões Reguladoras

[00145] Uma região não transladada 5' (UTR) pode ser incluída nas construções de ácido nucleico aqui descritas. Uma UTR 5' é transcrita, mas não é transladada, e situa-se entre o sítio inicial do transcrito e o códon de início da translação e pode incluir o nucleotídeo +1. Uma UTR 3' pode ser posicionada entre o códon de terminação da translação e o final do transcrito. As UTRs podem ter funções particulares tais como o aumento da estabilidade do mRNA ou a atenuação da translação. Exemplos de UTRs 3' incluem, mas não são limitados a estes, sinais de poliadenilação e sequências de término da transcrição, por exemplo, uma sequência de término da nopalina sintase.

[00146] Ficará entendido que mais de uma região reguladora pode estar presente em um polinucleotídeo recombinante, e.g., íntrons, inten- sificadores, regiões de ativação a montante, terminadores de transcrição e elementos induzíveis. Assim, por exemplo, mais do que uma região reguladora pode ser ligada de maneira operável à sequência de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico.

[00147] As regiões reguladoras, tais como promotores para genes endógenos, podem ser obtidas pela síntese química ou pela subclona- gem a partir de um DNA genômico que inclui uma tal região reguladora. Um ácido nucleico compreendendo uma tal região reguladora também pode incluir as sequências flanqueadoras que contêm sítios de enzima de restrição que facilitam a manipulação subsequente.

IV. Plantas Transgênicas e Células Vegetais A. Transformação

[00148] A invenção também descreve células vegetais e plantas transgênicas compreendendo pelo menos uma construção de ácido nu- cleico recombinante aqui descrita. Uma planta ou célula vegetal pode ser transformada por ter uma construção integrada no seu genoma, isto é, pode ser transformada de forma estável. As células transformadas de forma estável tipicamente retêm o ácido nucleico introduzido com cada divisão celular. Uma planta ou célula vegetal também pode ser provisoriamente transformada de tal modo que a construção não seja integrada no seu genoma. As células provisoriamente transformadas tipicamente perdem todas ou algumas partes da construção de ácido nucleico introduzida com cada divisão celular de tal modo que o ácido nucleico introduzido não possa ser detectado em células filhas após um número suficiente de divisões celulares. As plantas e células vegetais transgênicas tanto provisoriamente transformadas quanto estavelmente transforma-das podem ser úteis nos métodos aqui descritos.

[00149] As células vegetais transgênicas utilizadas nos métodos aqui descritos podem constituir parte ou o todo de uma planta inteira. Tais plantas podem ser cultivadas de uma maneira adequada com relação à espécie em consideração, em uma câmara de desenvolvimento, uma estufa ou em um campo. As plantas transgênicas podem ser criadas como desejável para um propósito particular, por exemplo, para introduzir um ácido nucleico recombinante em outras linhagens, para transferir um ácido nucleico recombinante a outras espécies, ou para uma outra seleção de outros traços desejáveis. Alternativamente, as plantas trans- gênicas podem ser propagadas vegetativamente para as espécies suscetíveis a tais técnicas. Como aqui utilizado, uma planta transgênica refere-se também à progênie de uma planta transgênica inicial contanto que a progênie herde o transgene. As sementes produzidas por uma planta transgênica podem ser cultivadas e depois autofecundadas (ou cruzadas e autofecundadas) para obter sementes homozigotas para a construção de ácido nucleico.

[00150] As plantas transgênicas podem ser cultivadas na cultura em suspensão, ou cultura de tecido ou órgão. Para os propósitos desta invenção, as técnicas de cultura de tecido sólido e/ou líquido podem ser utilizadas. Quando se utiliza meio sólido, as células vegetais transgêni- cas podem ser colocadas diretamente sobre o meio ou podem ser colocadas em um filtro que é então colocado em contato com o meio. Quando se utiliza meio líquido, as células vegetais transgênicas podem ser colocadas em um dispositivo de flutuação, por exemplo, uma membrana porosa que entra em contato com o meio líquido. Um meio sólido pode ser, por exemplo, o meio de Murashige and Skoog (MS) contendo ágar e uma concentração adequada de uma auxina, por exemplo, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e uma concentração adequada de uma citocinina, Por exemplo, cinetina.

[00151] Quando as células vegetais transitoriamente transformadas forem utilizadas, uma sequência repórter que codifica um polipeptídeo repórter tendo uma atividade repórter pode ser incluída no processo de transformação e um ensaio para a atividade ou expressão repórter pode ser executado em um momento adequado após a transformação. Um momento adequado para conduzir o ensaio é tipicamente ao redor de 1 a 21 dias após a transformação, por exemplo, ao redor de 1 a 14 dias, ao redor de 1 a 7 dias, ou ao redor de 1 a 3 dias. O uso de ensaios transitórios é particularmente conveniente para a análise rápida em diferentes espécies ou para confirmar a expressão de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico cuja expressão não tenha sido anteriormente confirmada nas células receptoras particulares.

[00152] As técnicas para a introdução de ácidos nucleicos em plantas monocotilédones e dicotilédones são conhecidas na especialidade, e incluem, sem limitação, a transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vetor viral, eletroporação e transformação por pistola de partículas, por exemplo, as Patentes U.S. 5.538.880; 5.204.253; 6.329.571 e 6.013.863. Se uma célula ou tecido cultivado for utilizado como tecido receptor para a transformação, as plantas podem ser regeneradas a partir de culturas transformadas se desejável, por técnicas conhecidas daqueles versados na técnica.

B. Triagem/seleção

[00153] Uma população de plantas transgênicas pode ser submetida a triagem e/ou selecionada com relação àqueles membros da população que possuem um traço ou fenótipo conferido pela expressão dos transgenes. Em algumas modalidades, uma população de plantas pode ser selecionada que tenha uma tolerância aumentada à seca ou níveis salinos elevados, ou maior eficiência de uso de nitrogênio. Em alguns casos, a seleção e/ou a triagem podem ser realizadas em múltiplos eventos de transformação. A seleção e/ou a triagem podem ser realizadas em uma ou mais gerações, e/ou em mais do que uma localização geográfica. Em alguns casos, as plantas transgênicas podem ser cultivadas e selecionadas sob condições que induzem a um fenótipo desejado ou ser de outro jeito necessárias para produzir um fenótipo desejado em uma planta transgênica. Além disso, a seleção e/ou a triagem podem ser aplicadas durante um estágio de desenvolvimento particular em que o fenótipo é esperado de ser apresentado pela planta. A seleção e/ou a triagem podem ser realizadoa para escolher aquelas plantas transgênicas que possuem uma diferença estatisticamente significativa no rendimento (por exemplo, grão, biomassa vegetativa ou rendimento de sacarose do caule) em relação a uma planta de controle que carece do transgene. A seleção e/ou a triagem podem ser realizadas para escolher aquelas plantas transgênicas tendo uma diferença estatisticamente significativa em um nível de tolerância ao estresse abiótico em relação a uma planta de controle que carece do transgene. As plantas transgênicas selecionadas ou submetidas a triagem possuem um fenó- tipo alterado em comparação com uma planta de controle correspondente, como descrito na seção "Fenótipos de Plantas Trans- gênicas" neste documento.

[00154] Uma população de progênie de um evento de transformação isolado ou distinto pode ser submetida a triagem para aquelas plantas que possuem um nível desejado de expressão de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. Métodos físicos e bioquímicos podem ser utilizados para identificar os níveis de expressão. Estes incluem a análise de Southern ou a amplificação por PCR para a detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção de S1 RNase, extensão de iniciador, ou amplificação de RT-PCR para detectar os transcritos de RNA; ensaios enzimáticos para detectar a atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese em gel de proteína, Western blots, imunoprecipitação e imunoensaios ligados a enzimas para detectar polipeptídeos. Outras técnicas tais como hibri- dização in situ, coloração enzimática e imuno-coloração também podem ser utilizadas para detectar a presença ou expressão de polipeptídeos e/ou polinucleotídeos. Métodos para a execução de todas as técnicas tomadas como referência são conhecidos.

C. Espécies Vegetais

[00155] Os polinucleotídeos e vetores aqui descritos podem ser utilizados para transformar várias plantas monocotilédones e dicotilédones e sistemas de células vegetais, incluindo as espécies a partir de uma das seguintes famílias: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophylla- ceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbita- ceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthi- aceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae ou Vitaceae.

[00156] As espécies adequadas podem incluir membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, An- drographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cyno- don, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gos- sypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguina- ria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanace- tum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis e Zea.

[00157] As espécies adequadas incluem Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (vetiver grande), Pennisetum purpureum (capim- elefante), Phalaris arundinacea (capim amarelo), Cynodon dactylon (grama das bermudas), Festuca arundinacea (tipo de erva), Spartina pectinata (gramínia da pradaria), Medicago sativa (alfalfa), Arundo do- nax (junco gigante), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale (triticum - trigo X centeio) e bamboo.

[00158] As espécies adequadas incluem também Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (cartámo), Jatropha curcas (jatrofa), Ri- cinus communis (mamona), Elaeis guineensis (palmeira), Linum usita- tissimum (linho), e Brassica juncea.

[00159] As espécies adequadas também incluem Beta vulgaris (beterraba açucareira) e Manihot esculenta (mandioca).

[00160] As espécies adequadas incluem também Lycopersicon es- culentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve de bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta picante & doce), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmos- chus esculentus (quiabo), e Solanum melongena (berinjela).

[00161] Espécies adequadas também incluem Papaver somniferum (papoula de ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catha- ranthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berbe- ris spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huper- zia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, e Tanacetum parthe- nium.

[00162] As espécies adequadas incluem também Parthenium argen- tatum (guayule), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (hortelã), Mentha piperita (hortelã), Bixa orellana e Alstroemeria spp.

[00163] As espécies adequadas também incluem Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia) e Poinsettia pul- cherrima (copo-de-leite).

[00164] As espécies adequadas também incluem Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), capim (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo), Pinus spp. (pinho), Abies spp. (abeto), Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa praten- sis (capim do campo), Lolium spp. (azevém) e Phleum pratense (tipo de erva).

[00165] Em algumas modalidades, uma espécie adequada pode ser uma espécie Pennisetum silvestre, erva daninha ou cultivada tal como, mas não limitado a estas, Pennisetum alopecuroides, Pennisetum ar- nhemicum, Pennisetum caffrum, Pennisetum clandestinum, Pennisetum divisum, Pennisetum glaucum, Pennisetum latifolium, Pennisetum ma- crostachyum, Pennisetum macrourum, Pennisetum orientale, Pennise- tum pedicellatum, Pennisetum polystachion, Pennisetum polystachion ssp. Setosum, Pennisetum purpureum, Pennisetum setaceum, Pennise- tum subangustum, Pennisetum typhoides, Pennisetum villosum, ou seus híbridos (por exemplo, Pennisetum purpureum x Pennisetum typhoidum).

[00166] Em algumas modalidades, uma espécie adequada pode ser uma espécie e/ou variedade de Miscanthus silvestre, erva daninha ou cultivada tal como, mas não limitado a estas, Miscanthus x giganteus, Miscanthus sinensis, Miscanthus x ogiformis, Miscanthus floridulus, Mis- canthus transmorrisonensis, Miscanthus oligostachyus, Miscanthus ne- palensis, Miscanthus sacchariflorus, Miscanthus x giganteus ‘Amuri’, Miscanthus x giganteus ‘Nagara’, Miscanthus x giganteus ‘Illinois’, Mis- canthus sinensis var. ‘Goliath’, Miscanthus sinensis var. ‘Roland’, Mis- canthus sinensis var. ‘Africa’, Miscanthus sinensis var. ‘Fern Osten’, Miscanthus sinensis var. gracillimus, Miscanthus sinensis var. variegates, Miscanthus sinensis var. purpurascens, Miscanthus sinensis var. ‘Malepartus’, Miscanthus sacchariflorus var. ‘Robusta’, Miscanthus sinensis var. ‘Silberfedher’ (aka. Silver Feather), Miscanthus transmorrisonensis, Miscanthus condensatus, Miscanthus yakushi- manum, Miscanthus var. ‘Alexander’, Miscanthus var. ‘Adagio’, Miscan- thus var. ‘Autumn Light’, Miscanthus var. ‘Cabaret’, Miscanthus var. ‘Condensatus’, Miscanthus var. ‘Cosmopolitan’, Miscanthus var. ‘Dixieland’, Miscanthus var. ‘Gilded Tower’ (Patente U.S. No PP14.743), Mis- canthus var. ‘Gold Bar’ (Patente U.S. No PP15.193), Miscanthus var. ‘Gracillimus’, Miscanthus var. ‘Graziella’, Miscanthus var. ‘Grosse Fontaine’, Miscanthus var. ‘Hinjo aka Little Nicky’ ™, Miscanthus var. ‘Juli’, Miscanthus var. ‘Kaskade’, Miscanthus var. ‘Kirk Alexander’, Miscanthus var. ‘Kleine Fontaine’, Miscanthus var. ‘Kleine Silberspinne’ (aka. ‘Little Silver Spider’), Miscanthus var. ‘Little Kitten’, Miscanthus var. ‘Little Zebra’ (Patente U.S. No PP13.008), Miscanthus var. ‘Lottum’, Miscan- thus var. ‘Malepartus’, Miscanthus var. ‘Morning Light’, Miscanthus var. ‘Mysterious Maiden’ (Patente U.S. No PP16.176), Miscanthus var. ‘Nippon’, Miscanthus var. ‘November Sunset’, Miscanthus var. ‘Parachute’, Miscanthus var. ‘Positano’, Miscanthus var. ‘Puenktchen’(aka ‘Little Dot’), Miscanthus var. ‘Rigoletto’, Miscanthus var. ‘Sarabande’, Miscan- thus var. ‘Silberpfeil’ (aka.Silver Arrow), Miscanthus var. ‘Silverstripe’, Miscanthus var. ‘Super Stripe’ (Patente U.S. No PP18.161), Miscanthus var. ‘Strictus’, ou Miscanthus var. ‘Zebrinus’.

[00167] Em algumas modalidades, uma espécie adequada pode ser uma espécie e/ou variedade de sorgo silvestre, erva daninha ou cultivada tal como, mas não limitado a estas, Sorghum almum, Sorghum amplum, Sorghum angustum, Sorghum arundinaceum, Sorghum bicolor (tal como as bicolor, guinea, caudatum, kafir e durra), Sorghum bra- chypodum, Sorghum bulbosum, Sorghum burmahicum, Sorghum con- troversum, Sorghum drummondii, Sorghum ecarinatum, Sorghum exstans, Sorghum grande, Sorghum halepense, Sorghum interjectum, Sorghum intrans, Sorghum laxiflorum, Sorghum leiocladum, Sorghum macrospermum, Sorghum matarankense, Sorghum miliaceum, Sorghum nigrum, Sorghum nitidum, Sorghum plumosum, Sorghum pro- pinquum, Sorghum purpureosericeum, Sorghum stipoideum, Sorghum sudanensese, Sorghum timorense, Sorghum trichocladum, Sorghum versicolor, Sorghum virgatum, Sorghum vulgare, ou híbridos tais como Sorghum x almum, Sorghum x sudangrass ou Sorghum x drummondii.

[00168] Assim, os métodos e composições podem ser utilizados em uma ampla faixa de espécies vegetais, incluindo espécies dos gêneros dicotilédones Brassica, Carthamus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Jatropha, Parthenium, Populus, e Ricinus; e os gêneros monocotilédo- nes Elaeis, Festuca, Hordeum, Lolium, Oryza, Panicum, Pennisetum, Phleum, Poa, Saccharum, Secale, Sorghum, Triticosecale, Triticum, e Zea. Em algumas modalidades, uma planta é um membro da espécie Panicum virgatum (grama), Sorghum bicolor (sorgo, capim Sudão), Mis- canthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (cana de energia), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (al-godão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (beterraba açucareira), ou Pennisetum glaucum (painço perolado).

[00169] Em certas modalidades, os polinucleotídeos e vetores aqui descritos podem ser utilizados para transformar várias plantas monoco- tilédones e dicotilédones e sistemas de células vegetais, em que tais plantas são híbridos de diferentes espécies ou variedades de uma espécie específica (por exemplo, Saccharum sp. X Miscanthus sp., Sorghum sp. X Miscanthus sp., por exemplo, Panicum virgatum x Pani- cum amarum, Panicum virgatum x Panicum amarulum, e Pennisetum purpureum x Pennisetum typhoidum).

D. Fenótipos de Plantas Transgênicas

[00170] As plantas transgênicas possuem maior tolerância ao estresse abiótico, tal como maior tolerância ao estresse pela seca ou melhor eficiência na utilização da água, aumento da tolerância ao estresse osmótico ou níveis elevados de salinidade e/ou maior tolerância ao estresse por deficiência de nitrogênio ou maior eficiência do uso de nitrogênio.

[00171] As espécies de plantas variam em sua capacidade de tolerar o estresse osmótico. Salinidade ou estresse osmótico refere-se a um conjunto de condições ambientais sob as quais uma planta começará a sofrer os efeitos da concentração elevada de sal, tal como o desequilíbrio iônico, diminuição da condutância estomática, diminuição da fotos- síntese, diminuição da taxa de crescimento, aumento da morte celular e perda de turgência (murcha), ou aborto do óvulo. Por estas razões, as plantas que experimentam estresse de salinidade tipicamente apresentam uma redução significativa na biomassa e/ou rendimento. O aumento da taxa de crescimento em condições de baixo teor de nitrogênio nas plantas pode fornecer um melhor crescimento das plantas e um estabelecimento inicial em locais geográficos onde a ingestão pela planta de fertilizantes nitrogenados é muitas vezes insuficiente. Melhorias na eficiência do uso da água garantem uma melhor estabilidade de rendimento agrícola nos anos de seca e aumento do rendimento em regiões com chuva e irrigação limitadas. Os aumentos no rendimento das plantas podem fornecer uma quantidade de alimento melhorada, ou uma produção de energia melhorada. O aumento da produção de sementes nas plantas pode fornecer uma melhor disponibilidade nutricional em locais geográficos onde a ingestão de alimentos vegetais é muitas vezes insuficiente ou para a produção de biocombustíveis.

[00172] Em algumas modalidades, o nível de tolerância ao estresse abiótico pode ser aumentado em uma planta em pelo menos 2 por cento, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais de 60 por cento, em comparação com o nível de tolerância ao estresse abiótico em uma planta de controle correspondente que não expressa o transgene. A tolerância ao estresse abiótico pode ser avaliada pelo descrito abaixo ou por outros meios aceitáveis.

[00173] Exemplos de características modificadas incluem eficiência fotossintética, área de mudas e biomassa visto que pode ser medida através da altura da planta, área de folhas ou roseta, ou massa seca. As características modificadas podem ser observadas e medidas em diferentes estádios de desenvolvimento da planta, por exemplo, semente, muda, peneiração, senescência, etc. Muitas vezes, a tolerância ao estresse abiótico pode ser expressa como relações ou combinações de medidas.

[00174] A biomassa pode incluir tecidos vegetais de colheita, tais como folhas, caules e estruturas reprodutivas, ou todos os tecidos vegetais tais como folhas, caules, raízes e estruturas reprodutivas. Em algumas modalidades, a biomassa abrange apenas as partes de planta acima do solo. Em algumas modalidades, a biomassa abrange apenas partes da planta do caule. Em algumas modalidades, a biomassa abrange apenas as partes da planta acima do solo exceto a inflorescên- cia e as partes de sementes de uma planta. A biomassa pode ser quantificada como o rendimento de matéria seca, que é a massa de biomassa produzida (normalmente relatada em T/acre) se a contribuição da água for subtraída do peso da matéria fresca. O rendimento de matéria seca (DMY) é calculado utilizando o peso de matéria fresca (FMW) e uma medição da umidade percentual em peso (M) na seguinte equação. DMY = ((100-M)/100)* FMW. A biomassa pode ser quantificada como o rendimento de matéria fresca, que é a massa de biomassa produzida (normalmente relatada em T/acre) em uma base como recebida, que inclui o peso de umidade.

[00175] Em algumas modalidades, uma planta transgênica que possui ácido nucleico exógeno expressando um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico pode ter níveis aumentados de eficiência fotossintética nas mudas. Por exemplo, as combinações de poli- peptídeos aqui descritos podem ser expressas em uma planta transgê- nica, que resulta em níveis aumentados de eficiência fotossintética em condições de crescimento de estresse abiótico. O nível de eficiência fo- tossintética pode ser aumentado em pelo menos 0,25 por cento, por exemplo, 0,25, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais de 60 por cento, em comparação com o nível de eficiência fotossintética em uma planta de controle correspondente que não expressa o polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico. Em alguns casos, os níveis aumentados de eficiência fotossintética podem estar em um ou mais tecidos verdes, por exemplo, folhas, caules, bulbos, flores, frutos, sementes jovens. Por exemplo, o nível de eficiência fotossintética pode ser aumentado em pelo menos 0,25 por cento, por exemplo, 0,25, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais de 60 por cento, em comparação com o nível de eficiência fo- tossintética em uma planta de controle correspondente que não expressa a combinação de transgenes.

[00176] Em algumas modalidades, uma planta transgênica aqui fornecida pode ter taxas de crescimento aumentadas em mudas. Por exemplo, uma combinação dos polipeptídeos aqui descritos pode ser expressa em uma planta transgênica, resultando em uma taxa de crescimento aumentada em condições de crescimento de estresse abiótico. A taxa de crescimento pode ser aumentada em pelo menos 2 por cento, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, ou mais do que 60 por cento, em comparação com a taxa de crescimento em uma planta de controle correspondente que não expressa a combinação. A taxa de crescimento pode ser medida em mudas, plantas em desenvolvimento ou maduras e medida durante períodos de tempo tais como cerca de 1 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 1 dia, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 12 meses, ou toda a expectativa de vida de uma planta.

[00177] Em algumas modalidades, uma planta transgênica aqui fornecida pode ter taxas de crescimento aumentadas em um ou mais tecidos vegetativos e reprodutivos, por exemplo, folhas, caules, flores, bulbos, frutos, sementes jovens. Por exemplo, a taxa de crescimento pode ser aumentada em pelo menos 2 por cento, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais do que 60 por cento, em comparação com a taxa de crescimento em uma planta de controle correspondente que não expressa o transgene.

[00178] Em alguns casos, uma planta transgênica aqui descrita e que possui uma estabilidade de rendimento melhorada pode apresentar uma altura que é de cerca de 5 % a cerca de 100 % maior (por exemplo, cerca de 5 % a cerca de 12 %; cerca de 5 % a cerca de 40 %; cerca de 5 % a cerca de 80 %; cerca de 7 % a cerca de 20 %; cerca de 10 % a cerca de 15 %; cerca de 10 % a cerca de 50 %; cerca de 10 % a cerca de 90 %; cerca de 20 % a cerca de 25 %; cerca de 20 % a cerca de 45 %; cerca de 20 % a cerca de 75 %; cerca de 25 % a cerca de 60 %; cerca de 25 % a cerca de 100 %; cerca de 30 % a cerca de 50 %; cerca de 30 % a cerca de 70 %; cerca de 40 % a cerca de 50 %; cerca de 45 % a cerca de 60 %; cerca de 50 % a cerca de 80 %; cerca de 55 % a cerca de 75 %; cerca de 60 % a cerca de 80 %; cerca de 60 % a cerca de 95 %; cerca de 75 % a cerca de 100 %; cerca de 80 % a cerca de 100 %; cerca de 90 % a cerca de 95 %; ou cerca de 95 % a cerca de 100 % maior) do que uma planta que não expressa um ou dois dos po- lipeptídeos codificados pelo ácido nucleico exógeno quando cultivada sob condições de estresse abiótico ou após tais condições.

[00179] Em alguns casos, uma planta transgênica aqui fornecida e tendo uma estabilidade de rendimento acentuada pode apresentar maior área foliar ou maior comprimento de folha do que uma planta de controle correspondente (por exemplo, planta do tipo silvestre ou uma planta que carece de pelo menos um dos transgenes da planta transgê- nica). Por exemplo, uma planta transgênica pode ter uma área foliar que é 5 % a cerca de 100 % maior (por exemplo, cerca de 5 % a cerca de 7 %; cerca de 5 % a cerca de 20 %; cerca de 8 % a cerca de 80 %; cerca de 10 % a cerca de 20 %; cerca de 10 % a cerca de 25 %; cerca de 10 % a cerca de 50 %; cerca de 10 % a cerca de 90 %; cerca de 15 % a cerca de 25 %; cerca de 20 % a cerca de 45 %; cerca de 20 % a cerca de 70 %; cerca de 25 % a cerca de 40 %; cerca de 25 % a cerca de 100 %; cerca de 30 % a cerca de 50 %; cerca de 30 % a cerca de 70 %; cerca de 40 % a cerca de 50 %; cerca de 45 % a cerca de 60 %; cerca de 50 % a cerca de 80 %; cerca de 55 % a cerca de 75 %; cerca de 60 % a cerca de 80 %; cerca de 60 % a cerca de 95 %; cerca de 75 % a cerca de 100 %; cerca de 80 % a cerca de 100 %; cerca de 90 % a cerca de 95 %; ou cerca de 95 % a cerca de 100 % maior) do que uma planta de controle correspondente quando cultivada sob estresse abiótico ou após tais condições.

[00180] Uma planta na qual a expressão de um polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abiótico é modulada pode ter níveis aumentados de produção de sementes. O nível pode ser aumentado em pelo menos 2 por cento, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 por cento ou mais, em comparação com o nível de produção de sementes em uma planta de controle correspondente que não expressa o transgene. Aumentos na produção de sementes podem fornecer melhor disponibilidade nutricional em locais geográficos onde a ingestão de alimentos vegetais é muitas vezes insuficiente, ou para a produção de biocombustíveis.

[00181] Em outros casos, quando um polipeptídeo aqui descrito é expresso em uma planta transgênica, a planta transgênica pode apresentar uma estabilidade de rendimento melhorada e pode apresentar um número de semente (número de sementes por planta) de cerca de 10 % a cerca de 95 % maior (por exemplo, de cerca de 10 % a cerca de 20 %; de cerca de 10 % a cerca de 50 %; de cerca de 10 % a cerca de 70 %; de cerca de 20 % a cerca de 60 %; de cerca de 20 % a cerca de 75 %; de cerca de 25 % a cerca de 85 %; de cerca de 30 % a cerca de 70 %; de cerca de 35 % a cerca de 90 %; de cerca de 40 % a cerca de 60 %; de cerca de 40 % a cerca de 85 %; de cerca de 50 % a cerca de 80 %; de cerca de 50 % a cerca de 90 %; ou de cerca de 70 % a cerca de 90 % maior) do que uma planta de controle que não expressa a combinação de polipeptídeos quando cultivada sob condições de estresse abiótico. Em certos casos, quando um polipeptídeo aqui descrito é expresso em uma planta transgênica, a planta transgênica pode apresentar uma estabilidade de rendimento melhorada e pode apresentar um aumento no peso da semente por planta de cerca de 5 % a cerca de 100 % maior (por exemplo, cerca de 5 % a cerca de 12 %; cerca de 5 % a cerca de 40 %; cerca de 5 % a cerca de 80 %; cerca de 7 % a cerca de 20 %; cerca de 10 % a cerca de 15 %; cerca de 10 % a cerca de 50 %; cerca de 10 % a cerca de 90 %; cerca de 20 % a cerca de 25 %; cerca de 20 % a cerca de 45 %; cerca de 20 % a cerca de 75 %; cerca de 25 % a cerca de 60 %; cerca de 25 % a cerca de 100 %; cerca de 30 % a cerca de 50 %; cerca de 30 % a cerca de 70 %; cerca de 40 % a cerca de 50 %; cerca de 45 % a cerca de 60 %; cerca de 50 % a cerca de 80 %; cerca de 55 % a cerca de 75 %; cerca de 60 % a cerca de 80 %; cerca de 60 % a cerca de 95 %; cerca de 75 % a cerca de 100 %; cerca de 80 % a cerca de 100 %; cerca de 90 % a cerca de 95 %; ou cerca de 95 % a cerca de 100 % maior) do que o peso da semente em uma planta que não expressa o polipeptídeo quando cultivada sob condições de estresse abiótico.

[00182] As plantas transgênicas aqui fornecidas e tendo resistência ao estresse por estiagem podem apresentar uma taxa de transpiração mais baixa em comparação com as plantas de controle da mesma formação genética. A taxa de transpiração é um parâmetro fisiológico que é indicativo de quão bem uma planta pode tolerar as condições de seca. Por exemplo, as plantas com uma baixa taxa de transpiração são esperadas de perder água mais lentamente do que as plantas com taxas de transpiração mais elevadas e, portanto, espera-se uma melhor resistência às condições de seca (isto é, ter melhor tolerância à seca). Quando um polipeptídeo aqui descrito é expresso em uma planta transgênica, a planta transgênica pode apresentar uma estabilidade de rendimento melhorada e pode apresentar uma taxa de transpiração que é reduzida ao redor de 0,25 % a 100 % (por exemplo, 0,27 %, 0,3 %, 0,43 %, 0,55 %, 0,7 %, 0,99 %, 1 %, 2 %, 4 %, 6 %, 8 %, 10 %, 12 %, 15 %, 18 %, 22 %, 28 %, 35 %, 37 %, 42 %, 45 %, 47 %, 50 %, 55 %, 64 %, 68 %, 71 %, 75 %, 77 %, 80 %, 83 %, 86 %, 89 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, ou 99 %) em comparação com a taxa de transpiração em uma planta de controle correspondente quando cultivada sob condições de estiagem.

[00183] Em alguns casos, uma planta transgênica que expressa um polipeptídeo aqui descrito pode apresentar estabilidade de rendimento intensificada e pode apresentar uma alteração diminuída na atividade fotossintética (ΔFv/Fm) após exposição às condições de estresse abió- tico em comparação com uma planta de controle correspondente que não expressa os polipeptídeos quando cultivada sob as mesmas condições. Em alguns casos, uma planta transgênica que expressa um poli- peptídeo aqui descrito pode apresentar uma estabilidade de rendimento melhorada e pode apresentar uma alteração aumentada na atividade fotossintética (ΔFv/Fm-D2) após o tratamento de estresse em comparação com uma planta de controle correspondente quando cultivada sob as mesmas condições. Por exemplo, uma planta transgênica que expressa um polipeptídeo aqui descrito pode apresentar um ΔFv/Fm de cerca de 0,1 a cerca de 0,8 (por exemplo, cerca de 0,2 a cerca de 0,28; cerca de 0,2 a cerca de 0,32; cerca de 0,22 a cerca de 0,35; cerca de 0,29 a cerca de 0,4; cerca de 0,3 a cerca de 0,45; cerca de 0,33 a cerca de 0,41; cerca de 0,35 a cerca de 0,5; cerca de 0,4 a cerca de 0,8; cerca de 0,46 a cerca de 0,52; cerca de 0,5 a cerca de 0,65; cerca de 0,5 a cerca de 0,8; cerca de 0,6 a cerca de 0,7; cerca de 0,6 a cerca de 0,9; cerca de 0,65 a cerca de 0,75; cerca de 0,7 a cerca de 0,9; ou cerca de 0,75 a cerca de 0,8) ou uma faixa de ΔFv/Fm-D2 de cerca de 0,03 a cerca de 0,8 (por exemplo, cerca de 0,03 a cerca de 0,08; cerca de 0,03 a cerca de 0,032; cerca de 0,04 a cerca de 0,05; cerca de 0,09 a cerca de 0,4; cerca de 0,05 a cerca de 0,5; cerca de 0,075 a cerca de 0,1; cerca de 0,08 a cerca de 0,2; cerca de 0,3 a cerca de 0,45; cerca de 0,33 a cerca de 0,41; cerca de 0,35 a cerca de 0,5; cerca de 0,4 a cerca de 0,8; cerca de 0,46 a cerca de 0,52; cerca de 0,5 a cerca de 0,65; cerca de 0,5 a cerca de 0,8; cerca de 0,6 a cerca de 0,7; cerca de 0,6 a cerca de 0,9; cerca de 0,65 a cerca de 0,75; cerca de 0,7 a cerca de 0,9; cerca de 0,75 a cerca de 0,85; ou cerca de 0,8 a cerca de 0,9). Em algumas modalidades, a atividade fotossintética pode ser reduzida em cerca de 0,25 % a cerca de 100 % (por exemplo, cerca de 0,25 % a cerca de 0,4 %, cerca de 0,25 % a cerca de 1 %, cerca de 0,25 % a cerca de 5 %, cerca de 0,5 % a cerca de 10 %, cerca de 1 % a cerca de 5 %, cerca de 1 % a cerca de 10 %, cerca de 2 % a cerca de 8 %, cerca de 3 % a cerca de 20 %, cerca de 5 % a cerca de 7 %; cerca de 5 % a cerca de 20 %; cerca de 5 % a cerca de 45 %, cerca de 8 % a cerca de 80 %; cerca de 10 % a cerca de 20 %; cerca de 10 % a cerca de 25 %; cerca de 10 % a cerca de 50 %; cerca de 10 % a cerca de 90 %; cerca de 15 % a cerca de 25 %; cerca de 20 % a cerca de 45 %; cerca de 20 % a cerca de 70 %; cerca de 25 % a cerca de 40 %; cerca de 25 % a cerca de 99 %; cerca de 30 % a cerca de 50 %; cerca de 30 % a cerca de 70 %; cerca de 40 % a cerca de 50 %; cerca de 45 % a cerca de 60 %; cerca de 50 % a cerca de 80 %; cerca de 55 % a cerca de 75 %; cerca de 60 % a cerca de 80 %; cerca de 60 % a cerca de 95 %; cerca de 75 % a cerca de 99 %; cerca de 80 % a cerca de 99 %; cerca de 90 % a cerca de 95 %; ou cerca de 95 % a cerca de 100 %) em comparação com a atividade fotossintética em uma planta de controle correspondente após as condições de estresse abiótico.

[00184] Tipicamente, uma diferença na quantidade de tolerância ao estresse abiótico em uma planta transgênica em relação a uma planta de controle é considerada estatisticamente significativa a p < 0,05 com uma estatística paramétrica ou não paramétrica apropriada, por exemplo, teste de qui-quadrado, teste t de Student, teste de Mann-Whitney, ou teste F. Em algumas modalidades, uma diferença na quantidade de tolerância ao estresse abiótico é estatisticamente significativa a p < 0,01, p < 0,005 ou p < 0,001. Uma diferença estatisticamente significativa, por exemplo, na quantidade de tolerância ao estresse abiótico em uma planta transgênica em comparação com a quantidade de uma planta de controle indica que o ácido nucleico recombinante presente na planta transgênica resulta em níveis de tolerância ao estresse abió- tico alterados.

[00185] O fenótipo de uma planta transgênica é avaliado em relação a uma planta de controle. Uma planta é dita "não expressar" um poli- peptídeo quando a planta apresenta menos do que 10 %, por exemplo menos do que 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,01 % ou 0,001 %, da quantidade de polipeptídeo ou mRNA que codifica o polipeptídeo apresentado pela planta de interesse. A expressão pode ser avaliada utilizando méetodos que incluem, por exemplo, RT-PCR, Northern blots, proteção de S1 RNase, extensões de iniciadores, Western blots, eletroforese em gel de proteína, imunoprecipitação, imunoensaios ligados a enzima, ensaios com chip e espectrometria de massa. Deve ser mencionado que se um polipeptídeo for expresso sob o controle de um promotor preferencial de tecido ou de expressão ampla, a expressão pode ser avaliada em toda a planta ou em um tecido selecionado. De modo semelhante, se um polipeptídeo for expresso em um momento particular, por exemplo, em um momento particular de desenvolvimento ou após a indução, a expressão pode ser avaliada seletivamente em um período de tempo desejado.

V. Modificação de Ácidos Nucleicos Endógenos que Codificam os Polipeptídeos de Aumento da Tolerância ao Estresse Abiótico

[00186] Este documento também descreve células vegetais e plantas nas quais um ácido nucleico endógeno de aumento da tolerância ao estresse abiótico aqui descrito foi modificado (por exemplo, uma região reguladora, íntron ou região de codificação do ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico foi modificada). A tolerância ao estresse abiótico de tais plantas é alterada em relação ao nível correspondente de uma planta de controle na qual o ácido nucleico endógeno não é modificado. Tais plantas são aqui referidas como plantas modificadas e podem ser utilizadas para produzir, por exemplo, graus aumentados de tolerância ao estresse abiótico.

[00187] O ácido nucleico endógeno pode ser modificado por técnicas de recombinação homóloga. Por exemplo, endonucleases de sequência específica (por exemplo, nucleases dedo de zinco (ZFNs)) e meganucleases podem ser utilizadas para estimular a recombinação homóloga em genes de plantas endógenas. Ver, por exemplo, Townsend et al., Nature 459:442-445 (2009); Tovkach et al., Plant J., 57:747-757 (2009); e Lloyd et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:2232-2237 (2005). Em particular, as ZFNs planejadas para criar quebras de filamento duplo de DNA em locais específicos podem ser utilizadas para produzir alterações de sequência direcionadas nos genes de plantas endógenas. Por exemplo, um gene de planta endógena pode ser substituído por uma variante contendo uma ou mais mutações (por exemplo, produzidas utilizando a mutagênese direcionada ao sítio ou evolução direcionada). Em algumas modalidades, a mutagênese direcionada é obtida através de união de extremidades não homólogas de tal modo que após a ruptura do DNA, os mecanismos endógenos de reparação do DNA se ligam a ruptura, muitas vezes introduzindo ligeiras deleções ou adições que podem ser submetidas a triagem ao nível da célula ou planta com relação aos fenótipos desejados. Moore and Haber, Mol Cell Biol., 16(5):2164-73 (1996).

[00188] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos endógenos podem ser modificados por metilação ou desmetilação de tal modo que a expressão do ácido nucleico endógeno modificado seja alterada. Por exemplo, um RNA de filamento duplo pode ser utilizado para ativar a expressão de genes mediante o direcionamento das regiões reguladoras de não codificação em promotores de genes. Ver Shibuya et al., Proc Natl Acad Sci USA, 106(5): 1660-1665 (2009); e Li et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103(46):17337-42 (2006). Em algumas modalidades, as ZFNs planejadas para criar rupturas de filamento duplo de DNA em locais específicos podem ser utilizadas para inserir um fragmento de DNA tendo pelo menos uma região que se sobrepõe com o DNA endógeno para facilitar a recombinação homóloga, de tal modo que a porção não sobreposta do fragmento de DNA é integrada no local da quebra. Por exemplo, um fragmento pode ser inserido em um promotor endógeno e/ou região reguladora em um local específico onde uma ZFN cria uma ruptura de filamento duplo para alterar a expressão de um gene endógeno. Por exemplo, um fragmento que é inserido em uma região de codificação de gene endógeno em um local específico onde uma ZFN cria uma quebra de filamento duplo pode resultar na expressão de um gene quimérico. Por exemplo, um fragmento que funciona como uma região reguladora ou como um promotor que é inserido em uma região de DNA endógeno imediatamente a montante de uma sequência de codificação do gene em um local específico onde uma ZFN cria uma quebra de filamento duplo, pode resultar em expressão alterada do gene endógeno.

[00189] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos endógenos podem ser modificados utilizando a marcação de ativação. Por exemplo, um vetor contendo múltiplas cópias de um elemento de intensificação do promotor constitutivamente ativo do gene 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) pode ser utilizado para ativar um gene endógeno. Ver, Weigel et al., Plant Physiology, 122:1003-1013 (2000).

[00190] Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos endógenos podem ser modificados pela introdução de um fator de ativação/repres- são da transcrição planejada (por exemplo, fator de transcrição de proteína dedo de zinco, ou ZFP TF, ver, por exemplo, a rede mundial de computadores em sangamo.com/tech/tech_plat_over.html#whata- rezfp). Por exemplo, uma sequência do fator de transcrição sintética de um domínio de ligação de DNA dedo de zinco e um domínio de ativação de VP16 pode ser concebida para se ligar a um sítio de DNA endógeno específico e alterar a expressão de um gene endógeno. Um fator de ativação/repressão da transcrição planejada (tal como ZFP TF) pode ativar, reprimir ou mudar a expressão do gene da tolerância ao estresse abiótico endógena alvo através da ligação específica à região promotora ou região de codificação do gene endógeno. As nucleases planejadas que clivam as sequências de DNA específicas in vivo também podem ser reagentes valiosos para a mutagênese direcionada. Uma tal classe de nucleases específicas da sequência pode ser criada pela fusão de efetores semelhantes ao ativador de transcrição (TALEs) ao domínio catalítico da endonuclease FokI. As fusões TALE-nuclease tanto nativas quanto personalizadas direcionam as rupturas de filamento duplo de DNA para locais específicos e direcionados. Christian et al., Genetics 186: 757-761 (2010).

[00191] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos endógenos podem ser modificados por mutagênese. As mutações genéticas podem ser introduzidas dentro do tecido vegetal regenerável utilizando um ou mais agentes mutagênicos. Os agentes mutagênicos adequados incluem, por exemplo, metano sulfonato de etila (EMS), N-nitroso-N-etilu- réia (ENU), N-nitrosoguanidina de metila (MNNG), brometo de etídio, diepoxibutano, radiação ionizante, raios-X, raios UV e outros agentes mutagênicos conhecidos na técnica. Tipos adequados de mutações incluem, por exemplo, inserções ou eliminações de nucleotídeos e transições ou transversões na sequência de ácido nucleico endógeno. Em uma modalidade, TILLING (Lesões Locais Induzidas Direcionadas nos Genomas) pode ser utilizada para produzir plantas tendo um ácido nu- cleico endógeno modificado. A TILLING combina mutagênese de alta densidade com métodos de triagem de alto rendimento. Ver, por exemplo, McCallum et al., Nat Biotechnol 18: 455-457 (2000); reviewed by Stemple, Nat Rev Genet 5(2):145-50 (2004).

[00192] Em algumas modalidades, um ácido nucleico endógeno pode ser modificado através de uma técnica de silenciamento de gene. Ver, por exemplo, a seção neste documento referente à "Inibição da Expressão de um Polipeptídeo de aumento da tolerância ao estresse abi- ótico".

[00193] Uma população de plantas pode ser submetida a triagem e/ou selecionada por aqueles membros da população que possuem um ácido nucleico modificado. Uma população de plantas também pode ser submetida a triagem e/ou selecionada por aqueles membros da população que possuem um traço ou fenótipo conferido pela expressão do ácido nucleico modificado. Como uma alternativa, uma população de plantas pode ser submetida a triagem por aquelas plantas tendo um traço desejado, tal como um nível modulado de tolerância ao estresse abiótico. Por exemplo, uma população de progênie pode ser submetida a triagem por aquelas plantas tendo um nível desejado de expressão de um polipeptídeo ou ácido nucleico de aumento da tolerância ao estresse abiótico. Métodos físicos e bioquímicos podem ser utilizados para identificar ácidos nucleicos modificados e/ou níveis de expressão como descrito com as plantas transgênicas. A seleção e/ou triagem podem ser realizadas em uma ou mais gerações, e/ou em mais do que uma localização geográfica. Em alguns casos, as plantas podem ser cultivadas e selecionadas sob condições que induzem um fenótipo desejado, ou, de outro modo, são necessárias para produzir um fenótipo desejado em uma planta modificada. Além disso, a seleção e/ou a triagem podem ser aplicadas durante uma fase de desenvolvimento particular em que o fe- nótipo é esperado de ser demonstrado pela planta. A seleção e/ou a triagem podem ser realizadas para selecionar aquelas plantas modificadas tendo uma diferença estatisticamente significativa em um nível de tolerância ao estresse abiótico em relação a uma planta de controle na qual o ácido nucleico não foi modificado. As plantas modificadas selecionadas ou submetidas a triagem possuem um fenótipo alterado em comparação com uma planta de controle correspondente, como descrito na seção "Fenótipos de Plantas Transgênicas" neste documento.

[00194] Embora uma planta ou célula vegetal na qual um ácido nu- cleico endógeno de aumento da tolerância ao estresse abiótico foi modificado não seja transgênica para esse ácido nucleico particular, será observado que uma tal planta ou célula pode conter transgenes. Por exemplo, uma planta modificada pode conter um transgene para outras traços, tais como tolerância a herbicidas ou resistência a insetos. Como outro exemplo, uma planta modificada pode conter um ou mais transgenes que, em conjunto com as modificações de um ou mais ácidos nu- cleicos endógenos, apresentam um aumento na tolerância ao estresse abiótico.

[00195] Tal como com as células vegetais transgênicas, as células vegetais modificadas podem constituir parte ou a totalidade de uma planta inteira. Tais plantas podem ser cultivadas da mesma maneira como descritas para as plantas transgênicas e podem ser criadas ou propagadas da mesma maneira como descrito para as plantas transgê- nicas.

VI. Reprodução de Plantas

[00196] Os polimorfismos genéticos que são úteis em tais métodos incluem repetições simples de sequência (SSRs, ou microssatélites), amplificação rápida de DNA polimórfico (RAPDs), polimorfismos de nu- cleotídeo isolado (SNPs), polimorfismos de comprimento de fragmento amplificados (AFLPs) e polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs). Os polimorfismos de SSR podem ser identificados, por exemplo, através da produção de sondas específicas da sequência e amplificação do DNA modelo de indivíduos na população de interesse por PCR. Por exemplo, as técnicas de PCR podem ser utilizadas para amplificar enzimaticamente um marcador genético associado com uma sequência de nucleotídeo que confere um traço específico (por exemplo, sequências de nucleotídeo aqui descritas). A PCR pode ser utilizada para amplificar sequências específicas de DNA, assim como RNA, incluindo as sequências de DNA genômico total ou RNA celular total. Quando se utiliza RNA como uma fonte de modelo, a transcriptase reversa pode ser utilizada para sintetizar os filamentos de DNA complementares (cDNA). Vários métodos de PCR são descritos, por exemplo, em PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995.

[00197] Geralmente, a informação de sequência a partir de polinucle- otídeos que flanqueiam a região de interesse ou mais adiante é empregada para projetar os iniciadores de oligonucleotídeo que são idênticos ou semelhantes em sequência aos filamentos opostos do modelo a ser amplificado. Os iniciadores são tipicamente de 14 a 40 nucleotídeos de comprimento, mas podem variar de 10 nucleotídeos a centenas de nu- cleotídeos de comprimento. O modelo e o DNA amplificado são repetidamente desnaturados em uma temperatura elevada para separar o filamento duplo, depois esfriados para permitir o recozimento dos iniciadores e a extensão das sequências de nucleotídeo através do micros- satélite, que resulta em DNA suficiente para a detecção de produtos da PCR. Se as sondas flanqueiam uma SSR na população, produtos da PCR de diferentes tamanhos serão produzidos. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5.766.847.

[00198] Os produtos da PCR podem ser qualitativos ou quantitativamente analisados utilizando várias técnicas. Por exemplo, os produtos da PCR podem ser marcados com uma molécula fluorescente (por exemplo, PicoGreen® ou OliGreen®) e detectados em solução utilizando espectrofotometria ou eletroforese capilar. Em alguns casos, os produtos da PCR podem ser separados em uma matriz de gel (por exemplo, agarose ou poliacrilamida) por eletroforese e as faixas fracionadas por tamanho compreendendo produtos da PCR podem ser visualizadas utilizando marcas de ácido nucleico. As marcas adequadas podem fluorescer sob luz UV (por exemplo, brometo de etídio, GR Safe, SYBR® Green ou SYBR® Gold). Os resultados podem ser visualizados por meio da transiluminação ou epi-iluminação, e uma imagem do padrão fluorescente pode ser adquirida utilizando uma câmara ou digitali- zador, por exemplo. A imagem pode ser processada e analisada utilizando um software especializado (por exemplo, ImageJ) para medir e comparar a intensidade de uma faixas de interesse contra um padrão carregado no mesmo gel.

[00199] Alternativamente, os polimorfismos de SSR podem ser identificados utilizando os produtos da PCR como uma sonda contra Southern blots de diferentes indivíduos na população. Ver, U.H. Refseth et al., (1997) Electrophoresis 18: 1519. Resumidamente, os produtos da PCR são separados por comprimento através da eletroforese em gel e transferidos para uma membrana. As sondas de DNA específicas de SSR, tais como oligonucleotídeos marcados com moléculas radioativas, fluorescentes ou cromogênicas, são aplicadas à membrana e hibridam com produtos da PCR ligados com uma sequência de nucleotídeo complementar. O padrão de hibridação pode ser visualizado por autorradio- grafia ou através do desenvolvimento de cor na membrana, por exemplo.

[00200] Em alguns casos, os produtos da PCR podem ser quantificados utilizando um sistema de detecção de termocicladores em tempo real. Por exemplo, a PCR quantitativa em tempo real pode utilizar uma tintura fluorescente que forma um complexo de tintura de DNA (por exemplo, SYBR® Green) ou uma sonda de DNA contendo fluoróforo, tal como oligonucleotídeos de filamento único covalentemente ligados a um repórter fluorescente ou fluoróforo (por exemplo, 6-carboxifluoresce- ína ou tetraclorofluoresceína) e extintor (por exemplo, tetrametilroda- mina ou aglutinante de sulco secundário de tripeptídeo de diidrociclopir- roloindol). O sinal fluorescente permite a detecção do produto amplificado em tempo real, indicando assim a presença de uma sequência de interesse, e permitindo a quantificação do número de cópias de uma sequência de interesse no DNA celular ou no nível de expressão de uma sequência de interesse a partir do mRNA celular.

[00201] A identificação de RFLPs é debatida, por exemplo, em Alonso-Blanco et al. (Methods in Molecular Biology, vol.82, “Arabidopsis Protocols”, pp. 137-146, J.M. Martinez-Zapater and J. Salinas, eds., c. 1998 by Humana Press, Totowa, NJ); Burr (“Mapping Genes with Recombinant Inbreds”, pp. 249-254, in Freeling, M. and V. Walbot (Ed.), The Maize Handbook, c. 1994 by Springer-Verlag New York, Inc.: New York, NY, USA; Berlin Germany; Burr et al. Genetics (1998) 118: 519; e Gardiner, J. et al., (1993) Genetics 134: 917). Por exemplo, para produzir uma biblioteca de RFLP enriquecida com sequências expressas com uma ou poucas cópias, o DNA total pode ser digerido com uma enzima sensível à metilação (por exemplo, PstI). O DNA digerido pode ser separado por tamanho em um gel preparativo. Os fragmentos de polinu- cleotídeo (500 a 2000 pb) podem ser cortados, eluídos e clonados em um vetor de plasmídeo (por exemplo, pUC18). As Southern blots de digestões de plasmídeo podem ser experimentadas com DNA total cortado para selecionar clones que hibridam com as sequências de uma ou poucas cópias. As endonucleases de restrição adicionais podem ser testadas para aumentar o número de polimorfismos detectados.

[00202] A identificação de AFLPs é debatida, por exemplo, na EP 0 534 858 e na Patente U.S. No 5.878.215. Em geral, o DNA celular total é digerido com uma ou mais enzimas de restrição. Os adaptadores específicos de meio-sítio de restrição são ligados a todos os fragmentos de restrição e os fragmentos são seletivamente amplificados com dois iniciadores da PCR que possuem sequências específicas do sítio adaptador e de restrição correspondentes. Os produtos da PCR podem ser visualizados após o fracionamento de tamanho, como descrito acima.

[00203] Em algumas modalidades, os métodos são direcionados para a reprodução de uma linhagem vegetal. Tais métodos utilizam polimorfismos genéeticos identificados como descrito acima em um programa de reprodução assistida por marcadores para facilitar o desenvolvimento de linhagens que possuem uma alteração desejada no traço de tolerância ao estresse abiótico. Assim que um polimorfismo genético adequado é identificado como estando associado com variação para o traço, uma ou mais plantas individuais são identificadas as quais possuem o alelo polimórfico correlacionado com a variação desejada. Estas plantas são então utilizadas em um programa de reprodução para combinar o alelo polimórfico com uma pluralidade de outros alelos em outros locais que estão correlacionados com a variação desejada. Técnicas adequadas para uso em um programa de reprodução de plantas são conhecidas na arte e incluem, sem limitação, retrocruzamento, seleção de massa, reprodução de genealogia, seleção de volume, cruzamento com outra população e seleção recorrente. Estas técnicas podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação com uma ou mais outras técnicas em um programa de reprodução. Assim, cada planta identificada é autofecundada ou cruzada por uma planta diferente para produzir sementes que são depois germinadas para formar plantas progênies. Pelo menos uma tal planta progênie é então autofecundada ou cruzada com uma planta diferente para formar uma subsequente geração de progênies. O programa de reprodução pode repetir as etapas de auto- fecundação ou cruzamento durante um adicional de 0 a 5 gerações conforme apropriado, de modo a conseguir a desejada uniformidade e estabilidade na linhagem vegetal resultante, que retém o alelo polimórfico. Na maioria dos programas de reprodução, a análise para o alelo poli- mórfico particular será realizada em cada geração, embora a análise possa ser realizada em gerações alternativas, se desejável.

[00204] Em alguns casos, a seleção para outros traços úteis é também realizada, por exemplo, seleção para resistência fúngica ou resistência bacteriana. A seleção destes outros traços pode ser realizada antes, durante ou após a identificação de plantas individuais que possuam o alelo polimórfico desejado.

VII. Artigos de Fabricação

[00205] As plantas transgênicas aqui fornecidas possuem várias utilizações nas indústrias de produção agrícola e energética. Por exemplo, as plantas transgênicas aqui descritas podem ser utilizadas para produzir alimentos para animais e produtos alimentares. Tais plantas, no entanto, são muitas vezes particularmente úteis como uma matéria-prima para a produção de energia.

[00206] As plantas transgênicas aqui descritas produzem maiores rendimentos de grãos e/ou biomassa por hectare, em relação às plantas de controle que carecem do ácido nucleico exógeno ou carecem do ácido nucleico endógeno modificado quando cultivadas em solos com níveis elevados de estresse abiótico. Por exemplo, as plantas transgê- nicas aqui descritas podem ter um rendimento de grãos que é aumentado de cerca de 5 % a cerca de 20 % (por exemplo, aumentado 5 % a 10 %, 5 % a 15 %, 10 % a 15 %, 10 % a 20 % ou 15 % a 20 %) em relação ao das plantas de controle que carecem do ácido nucleico exógeno ou que carecem do ácido nucleico endógeno modificado. Em algumas modalidades, tais plantas transgênicas fornecem rendimentos equivalentes ou mesmo aumentados de grãos e/ou biomassa por hectare em relação às plantas de controle quando cultivadas sob condições de insumos reduzidos tais como fertilizante e/ou água. Deste modo, tais plantas transgênicas podem ser utilizadas para fornecer estabilidade de rendimento a um custo de insumo mais baixo e/ou sob condições ambientalmente estressantes tais como níveis elevados de estresse abiótico.

[00207] Em algumas modalidades, as plantas aqui descritas possuem uma composição que permite um processamento mais eficiente em açúcares livres e, subsequentemente etanol, para a produção de energia. Em algumas modalidades, tais plantas fornecem maiores rendimentos de etanol, butanol, éter dimetílico, outras moléculas de bio- combustível, e/ou co-produtos derivados de açúcar por quilograma de matéria vegetal, em relação às plantas de controle. Acredita-se que tais eficiências de processamento derivam da composição da matéria vegetal, incluindo, mas não limitado a estes, o teor de glucano, celulose, he- micelulose e lignina. Ao fornecer rendimentos mais elevados a um custo de produção equivalente ou mesmo reduzido, as plantas transgênicas aqui descritas melhoram a rentabilidade para os agricultores e processadores, assim como diminuem os custos para os consumidores.

[00208] As sementes de plantas transgênicas aqui descritas podem ser acondicionadas e ensacadas em material de acondicionamento por meios conhecidos na arte para formar um artigo de fabricação. O material de acondicionamento tal como papel e tecido, é bem conhecido na técnica. Um pacote de semente pode ter um rótulo, por exemplo, uma etiqueta ou rótulo fixado ao material de acondicionamento, um rótulo impresso no material de acondicionamento ou um rótulo inserido dentro do pacote, que descreve a natureza das sementes a esse respeito.

[00209] A invenção será ainda descrita nos exemplos que se seguem, os quais não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Produção de Plantas de Arroz Trangênicas

[00210] Plantas de arroz Indica IR64 transformadas foram produzidas com e sem marcadores de seleção. As plantas sem marcadores (MF) foram produzidas pela co-transformação de vetores binários distintos para expressar o gene marcador de seleção neomicina fosfotrans- ferase (NPT II) ou o transgene de interesse. As plantas regeneradas foram então autofecundadas, e os segregantes livres de marcadores positivos para o transgene de interesse foram selecionados para teste. Algumas plantas (M+) foram produzidas através da transformação com vetores binários isolados que expressam tanto o gene de seleção marcador quanto o transgene de interesse, e assim as plantas transformadas retinham o marcador.

[00211] Os embriões imaturos da variedade de arroz Indica IR64 foram colhidos, transformados, selecionados, e as plantas transgênicas regeneradas utilizando métodos estabelecidos (ver a US 6.329.571). A transformação foi verificada e seguida nas gerações subsequentes por PCR.

[00212] As plantas testadas são mostradas na Tabela 1. Noventa e cinco (95) eventos de transformação independentes foram gerados e testados. Tabela 1 Plantas de arroz Indica transgênicas testadas.

EXEMPLO 2 Testes de estresse abiótico

[00213] Mudas de 40 dias de idade dos eventos transgênicos acrescidos de controles IR64 não transformados foram plantadas no lote de teste, para o teste em blocos aleatórios com três repetições, sob cada uma das seis condições de estresse abiótico descritas abaixo. A densidade de plantio foi de 20 x 15 cm.

[00214] Para o estresse de seca D1, a irrigação cessou ao redor de 15 dias antes da floração. O estresse foi imposto durante 15 a 18 dias, e depois liberado na fase pós-floração. Para o estresse de seca D2, a irrigação cessou após a floração, e o estresse foi mantido até a maturidade.

[00215] Para os testes de estresse de salinidade S1 e S2, os lotes de teste foram irrigados com uma solução de cloreto de sódio a partir da muda ate os estágios de maturidade. Para o teste S1, a condutivi- dade elétrica do solo (EC) foi mantida entre 4 e 5 deciSiemens por metro (dS/m), e para o teste S2 a EC foi entre 6 e 7 dS/m.

[00216] Para os ensaios de estresse por deficiência de nitrogênio N1 e N2, o fertilizante foi aplicado em três doses em diferentes estágios de crescimento a partir da muda até a maturidade nas taxas totais de 50 e 75 kg de nitrogênio por hectare, respectivamente, isto é, a metade e três quartos da taxa normal respectivamente.

EXEMPLO 3 Resultados dos Testes de Estresse Abiótico

[00217] O grão foi colhido de plantas maduras, e o peso do grão por planta foi registrado para cinco plantas de cada repetição em todos os tratamentos. As Tabelas de 2 a 7 mostram os resultados de rendimento para plantas com desempenho de rendimento estatisticamente superior aos respectivos controles. Nas Tabelas de 2 a 7, os sufixos de designações transformantes significam eventos de transformação distintos. Tabela 2 Resultados do teste D1; Diferença Menos Significativa em p < 0,01 para o controle IR64 (LSD) é 5,15 Tabela 3 Resultados do teste D2; LSD = 1,809 Tabela 4 Resultados do teste S1; LSD = 2,82 Tabela 5 Resultados do teste S2; LSD = 2,66 Tabela 6 Resultados do teste N1; LSD = 4,07 Tabela 7 Resultados do teste de N2; LSD = 3,6609

EXEMPLO 4 Determinação de Homólogos Funcionais por Reciprocal BLAST

[00218] Uma sequência candidata foi considerada um homólogo funcional de uma sequência de referência se as sequências candidatas e de referência codificassem proteínas tendo uma função e/ou atividade semelhantes. Um processo conhecido como Reciprocal BLAST (Rivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6239-6244 (1998)) foi utilizado para identificar as sequências homólogas funcionais potenciais a partir de bancos de dados que consistem de todas as sequências de peptídeo públicas e proprietárias disponíveis, Incluindo NR de NCBI e translações de peptídeo de clones Ceres.

[00219] Antes de iniciar um processo Reciprocal BLAST, um polipep- tídeo de referência específico foi pesquisado contra todos os peptídeos das suas espécies de origem utilizando BLAST de modo a identificar polipeptídeos possuindo identidade de sequência BLAST de 80 % ou mais com o polipeptídeo de referência e um comprimento de alinhamento de 85 % ou mais ao longo da sequência mais curta no alinhamento. O polipeptídeo de referência e qualquer um dos polipeptídeos identificados anteriormente mencionados foram designados como um agrupamento.

[00220] O programa BLASTP versão 2.0 da Washington University at Saint Louis, Missouri, USA foi utilizado para determinar a identidade da sequência BLAST e o valor E. O programa BLASTP versão 2.0 inclui os seguintes parâmetros: 1) um valor E de corte de 1.0e-5; 2) um tamanho de palavra de 5; E 3) a opção -postsw. A identidade de sequência de BLAST foi calculada com base no alinhamento do primeiro BLAST HSP (pares de segmento de alta pontuação) da sequência de homólogo funcional potencial identificada com um polipeptídeo de referência es-pecífico. O número de resíduos combinados de forma idêntica no alinhamento BLAST HSP foi dividido pelo comprimento de HSP, e em seguida multiplicado por 100 para obter a identidade da sequência BLAST. O comprimento de HSP tipicamente incluiu lacunas no alinhamento, mas em alguns casos as lacunas foram excluídas.

[00221] O principal processo Reciprocal BLAST consiste em duas rodadas de pesquisas BLAST; pesquisa avançada e pesquisa reversa. Na etapa de pesquisa avançada, uma sequência de polipeptídeo de referência, "polipeptídeo A", a partir da espécie de fonte SA foi submetida a BLAST contra todas as sequências de proteína de uma espécie de interesse. Os resultados superiores foram determinados utilizando um valor E de corte de 10-5 e um corte de identidade de sequência de 35 %. Entre os resultados superiores, a sequência com o valor E mais baixo foi designada como a melhor resposta, e considerada um homólogo ou ortólogo funcional potencial. Qualquer outro resultado superior que tivesse uma identidade de sequência de 80 % ou mais para o melhor resultado ou para o polipeptídeo de referência original foi considerado um homólogo ou ortólogo funcional potencial igualmente. Este processo foi repetido para todas as espécies de interesse.

[00222] Na rodada de pesquisa reversa, os resultados superiores identificados na pesquisa avançada de todas as espécies foram submetidos a BLAST contra todas as sequências de proteína das espécies de origem SA. Um resultado superior da pesquisa avançada que retornou um polipeptídeo do aglomerado acima mencionado como seu melhor resultado, também foi considerado como um homólogo funcional potencial.

[00223] Os homólogos funcionais foram identificados através da inspeção manual de sequências homólogas funcionais potenciais. Os homólogos funcionais representativos para as SEQ ID NOs: 2, 337, 61, 111, 27, 209 e 370 são mostrados nas Figuras de 1 a 7, respectivamente. Os homólogos exemplares adicionais estão correlacionados com certas Figuras na Listagem de Sequências.

EXEMPLO 5 Determinação de Homólogos Funcionais através de Hidden Markov Models

[00224] Hidden Markov Models (HMMs) foram gerados pelo programa HMMER 3.0. Para gerar cada HMM, os parâmetros do programa HMMER 3.0 padrão foram utilizados.

[00225] Um HMM foi gerado utilizando as sequências mostradas na Figura 1 como entrada. Estas sequências foram ajustadas ao modelo e uma pontuação de bits do HMM representativa para cada sequência é mostrada na Listagem de Sequências. As sequências adicionais foram ajustadas ao modelo, e as pontuações de bits do HMM representativas para qualquer uma de tais sequências adicionais são mostradas na Listagem de Sequências. Os resultados indicam que estas sequências adicionais são homólogos funcionais da SEQ ID NO: 2.

[00226] O procedimento acima foi repetido e um HMM foi gerado para cada grupo de sequências mostradas nas Figuras 2 a 7, utilizando as sequências mostradas em cada Figura como entrada para esse HMM. Uma pontuação de bits representativa para cada sequência é mostrada na Listagem de Sequências. As sequências adicionais foram ajustadas a certos HMMs, e as pontuações de bits do HMM representativas para tais sequências adicionais são apresentadas na Listagem de Sequências. Os resultados indicam que estas sequências adicionais são homólogos funcionais das sequências utilizadas para gerar esse HMM.

OUTRAS MODALIDADES

[00227] Deve ficar entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a sua descrição detalhada, a descrição anterior destina-se a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, o qual é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações que se seguem.

Claims (11)

1. Método para aumentar o rendimento vegetal em uma planta cultivada sob o estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o cultivo de plantas transformadas com um ácido nucleico exógeno sob estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio, o referido ácido nucleico exógeno compreendendo um promotor heterólogo ligado de maneira operável a uma sequência de nucleo- tídeo que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de codificação de SEQ ID NO:1 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a mesma sequência de aminoácidos, e (b) a seleção de uma planta transformada dentre as plantas transformadas que expressam o referido polipeptídeo e tem rendimento aumentado quando cultivada sob estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio em comparação com o rendimento conrres- pondente de uma planta controle da mesma espécie que não compreende o referido ácido nucleico exógeno e cultivada sob condições de estresse idênticas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cultivo das referidas plantas transformadas é sob estresse de seca, e o referido estresse de seca é selecionado dentre o grupo que consiste em estresse de seca pré-floração e estresse de seca pós-floração.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cultivo das referidas plantas transformadas é sob estresse osmótico, e o referido estresse osmótico é selecionado dentre o grupo que consiste em uma condutividade elétrica do solo entre 4 dS/m e 5 dS/m, e uma condutividade do solo entre 6 dS/m e 7 dS/m.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cultivo das referidas plantas transformadas é sob deficiência de nitrogênio, e a referida deficiência de nitrogênio é selecionada dentre o grupo consistindo em uma aplicação de nitrogênio de 50 Kg por hectare e uma aplicação de nitrogênio de 75 Kg por hectare.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a colheita da biomassa da referida planta transformada selecionada.

6. Método para produzir uma planta com tolerância a estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma pluralidade de plantas com um ácido nu- cleico exógeno compreendendo um promotor heterólogo operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipep- tídeo, em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de codificação de SEQ ID NO:1 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos; (b) a seleção, dentre a referida pluralidade de plantas transformadas, de uma planta transformada que expressa o referido polipep- tídeo e possui tolerância aumentada ao estresse de seca, estresse os- mótico ou deficiência de nitrogênio em comparação com uma planta controle da mesma espécie que não compreende o referido ácido nu- cleico exógeno e foi cultivada sob condições de estresse idênticas; e (c) o cultivo da planta transformada selecionada possuindo tolerância aumentada ao estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio em comparação com uma planta controle da mesma espécie que não compreende o referido ácido nucleico exógeno e foi cultivada sob condições de estresse idênticas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida planta transformada selecionada possui a referida tolerância aumentada ao estresse de seca, e o referido estresse de seca é selecionado dentre o grupo que consiste em estresse de seca pré-floração e estresse de seca pós-floração.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida planta transformada selecionada possui a referida tolerância aumentada ao estresse osmótico, e o referido estresse osmótico é selecionado dentre o grupo consistindo em uma con- dutividade elétrica do solo entre 4 dS/m e 5 e uma condutividade do solo entre 6 dS/m e 7 dS/m.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida planta transformada selecionada possui a referida tolerância aumentada ao estresse de deficiência de nitrogênio, e o referido estresse de deficiência de nitrogênio é selecionado dentre o grupo consistindo em uma aplicação de nitrogênio de 50 Kg por hectare e uma aplicação de nitrogênio de 75 Kg por hectare.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado pelo fato de que a referida planta é selecionada dentre o grupo que consiste em Panicum virgatum, Sorghum bicolor, Miscanthus gigan- teus, Saccharum sp., Populus balsamifera, Zea mays, Glycine max, Brassica napus, Triticum aestivum, Gossypium hirsutum, Oryza sativa, Helianthus annuus, Medicago sativa, Beta vulgaris, and Pennisetum glaucum.

12. Método para produzir uma planta transgênica com rendimento aumentado cultivada sob estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o cultivo de células vegetais transformadas com um ácido nucleico exógeno, em que o referido ácido nucleico exógeno compreende um promotor heterólogo operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de codificação da SEQ ID NO:1 ou suas sequências de nucleotídeos degeneradas que codificam a mesma sequência de aminoácidos, e em que a referida sequência de nucleotídeoa está ligada de maneira operável a um promotor heteró- logo; (b) a produção de plantas transgênicas a partir das referidas células vegetais transformadas; e (c) a seleção para uma planta transgênica a partir das referidas plantas transgênicas que expresse o referido polipeptídeo na planta transgênica selecionada e possua rendimento aumentado quando cultivada sob estresse de seca, estresse osmótico ou deficiência de nitrogênio em comparação com uma planta controle da mesma espécie que não compreende o referido ácido nucleico exógeno e foi cultivada sob condições de estresse idênticas.