BR112012002543B1 - método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, e/ou vigor de uma planta, e, construto de ácido nucléico isolado - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA AUMENTAR A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO, O RENDIMENTO, A BIOMASSA, TAXA DE CRESCIMENTO, O VIGOR, O TEOR DE ÓLEO, O RENDIMENTO DAS FIBRAS, A QUALIDADE DAS FIBRAS E/OU A EFICIÊNCIA DO USO DO NITROGÊNIO DE UMA PLANTA, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO E CÉLULA VEGETAL, compreende polínucleotídeos isolados que sejam pelo menos 80% homólogos às ID. SEQ. Nos: 75, 1-74, 76-473, 783-1272, 1277-4139, 4142, 4146-5508 ou 5509: e polipeptideos isolados que sejam pelo menos 80% homólogos a 548, 474-547, 549-562, 564-620, 622-750, 752-782, 5510-5939, 5946-6856, 6858-7540, 7543, 7544, 7548-8735 ou 8736 construções de ácido nucléico compreendendo os polinucleotídeos isolados, plantas transgênicas expressando os mesmos e método para uso dos mesmos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, o fator de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta.

Description

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO
[001] O presente pedido de patente de invenção, em algumas de suas aplicações, se refere à polipeptídeos e polinucleotídeos isolados, construções de ácido nucléico compreendendo os mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e a métodos para uso dos mesmos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico (ABST), a eficiência do uso de água (WUE), o rendimento (p.ex., a quantidade e/ou a qualidade dos grãos), a biomassa, o teor de óleo, a taxa de crescimento, o vigor, a eficiência do uso do nitrogênio (NUE) e/ou a eficiência do uso de fertilizantes (FUE) de uma planta.
[002] A população mundial sempre crescente e a diminuição da disponibilidade de terras aráveis para a agricultura afetam o rendimento das plantas e de produtos relacionados às plantas. A diminuição global da oferta de água, a desertificação, as condições de estresse abiótico (ABS) (p.ex., salinidade, seca, inundação, emperatura subótima e poluição química tóxica), e/ou fontes limitadas de nitrogênio e fertilizante causam um prejuízo substancial às plantas agrícolas como as grandes alterações no metabolismo da planta, a morte celular e a diminuição do crescimento da planta e da produtividade da cultura.
[003] A seca é um fenômeno gradual, que envolve períodos de tempo anormalmente seco que persiste o suficiente para produzir desequilíbrios hidrológicos sérios como danos à cultura, diminuição do suprimento de água e aumento da susceptibilidade a diversas doenças.
[004] A salinidade, níveis elevados de sal, afeta um em cada cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco principais culturas alimentares, isto é, trigo, milho, arroz, batatas e soja, consegue tolerar o excesso de sal. Os efeitos prejudiciais do sal sobre as planta resulta tanto da deficiência de água, que leva ao estresse osmótico (semelhante ao estresse causado pela seca), e o efeito do excesso de íons de sódio sobre processos bioquímicos importantes. Assim como o congelamento e a seca, quantidades elevadas de sal causam déficit de água; e a presença de níveis elevados de sal torna difícil para as raízes das plantas extraírem água de seu ambiente. Dessa forma, a salinação dos solos que são utilizados para a produção agrícola é um problema significativo e crescente em regiões que dependem principalmente da agricultura, e é piorada pela utilização e fertilização excessivas e pela falta de água, tipicamente causada pela mudança climática e pelas demandas da população crescente.
[005] As temperaturas subótimas afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta durante todo o seu ciclo de vida. Dessa forma, baixas temperaturas reduzem a taxa de germinação e temperaturas elevadas resultam na necrose da folha. Além disso, plantas maduras expostas ao excesso de calor podem experimentar o choque de calor, que pode surgir em vários órgãos, incluindo as folhas e, principalmente, os frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse causado pelo calor. O calor também danifica as estruturas celulares, incluindo as organelas e o citoesqueleto, e prejudica a função da membrana. O choque de calor pode produzir uma diminuição na síntese geral das proteínas, acompanhada pela expressão de proteínas de choque de calor, p.ex., as chaperonas, que estão envolvidas no rearranjo das proteínas desnaturadas pelo calor. O dano causado pela alta temperatura ao pólen quase sempre ocorre em conjunto com o estresse causado pela seca e, raramente, ocorre sob boas condições de irrigação. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta de novas maneiras. Condições de frio excessivo, p.ex., temperaturas baixas, mas, acima do ponto de congelamento, afetam as culturas de origem tropical, como a soja, o arroz, o milho e o algodão. O dano típico causado pelo frio inclui o emurchecimento, a necrose, a clorose ou perda de íons das membranas celulares. Além disso, o frio pode levar a perdas de rendimento e à qualidade inferior do produto através do amadurecimento tardio do milho. Condições de luz excessiva, que ocorrem sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites frias do final do verão/outono, podem levar à fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese).
[006] Nutrientes subótimos (macro e micronutrientes) afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta ao longo de todo o seu ciclo de vida. Um dos macronutrientes essenciais para a planta é o Nitrogênio. O nitrogênio é responsável pela biossíntese dos aminoácidos e do ácido nucléico, grupos prostéticos, hormônios vegetais, defesas químicas das plantas, etc. O nitrogênio é, frequentemente, o elemento limitante da taxa no crescimento da planta e todas as culturas arvenses apresentam uma dependência fundamental do nitrogênio nitrogenado inorgânico. Como o fertilizante é rapidamente depletado da maioria dos tipos de solo, ele deve ser aplicado em culturas em desenvolvimento duas ou três vezes durante o período de cultivo. Macronutrientes importantes adicionais são o Fósforo (P) e o Potássio (K), que possuem uma correlação direta com o rendimento e a tolerância geral da planta.
[007] O rendimento é afetados por diversos fatores, como o número e o tamanho dos órgãos da planta, a arquitetura da planta (p.ex., o número de ramificações), o comprimento estabelecido dos grãos, o número de grãos cheios, o vigor (p.ex., a muda), a taxa de crescimento, o desenvolvimento da raiz, a utilização de água, nutrientes (p.ex., o nitrogênio) e fertilizantes e a tolerância ao estresse.
[008] Culturas como as do milho, arroz, trigo, colza e soja respondem por mais da metade da ingestão calórica total humana, seja através do consumo direto de sementes ou através do consumo de produtos de carne de animais criados com sementes processadas ou forragem. As sementes também são uma fonte de açúcares, proteínas e óleos e metabólitos utilizados em processos industriais. A capacidade de aumentar o rendimento da planta, seja através do aumento da taxa de acúmulo de matéria seca, modificando a celulose ou a composição da lignina, aumento da resistência do caule, aumento do tamanho do meristema, mudança do padrão de ramificação da planta, firmeza das folhas, aumento da eficiência da fertilização, aumento da taxa de acúmulo de matéria seca da semente, modificação do desenvolvimento da semente, melhora do enchimento da semente ou o aumento do teor de óleo, amido ou proteína nas sementes teria muitas aplicações no uso agrícola e não-agrícola como na produção biotecnológica de produtos farmacêuticos, anticorpos ou vacinas.
[009] Estudos demonstraram que as adaptações da planta a condições ambientais adversas são traços genéticos complexos com natureza poligênica. Meios convencionais de cultura e melhoras horticulturais utilizam técnicas de melhoramento seletivas para identificar plantas que apresentem características desejáveis. No entanto, o melhoramento seletivo é tedioso, consome tempo e apresenta resultado imprevisível. Além disso, recursos germoplasmáticos limitados para melhora do rendimento e a incompatibilidade nos cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionadas representam problemas significativos encontrados no melhoramento convencional. Avanços na engenharia genética permitiram que o homem modificasse o germoplasma das plantas pela expressão de genes de interesse nas plantas. Essa tecnologia tem a capacidade de gerar culturas ou plantas com traços econômicos, agronômicos ou horticulturais melhorados.
[0010] A publicação WO No 2009/013750 revela genes, construções e métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, a biomassa e/ou o rendimento de plantas geradas através deles.
[0011] A publicação WO No 2008/122980 revela construções genéticas e métodos para aumentar o teor de óleo, a taxa de crescimento e a biomassa de plantas.
[0012] A publicação WO No 2008/075364 revela polinucleotídeos envolvidos no desenvolvimento de fibras vegetais e método para utilizá-los.
[0013] A publicação WO No 2007/049275 revela polipeptídeos isolados, polinucleotídeos codificando os mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e métodos para utilizá-los para aumentar a eficiência do uso de fertilizantes, a tolerância da planta ao estresse abiótico e a biomassa.
[0014] A publicação WO No 2004/104162 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas geradas através deles.
[0015] A publicação WO No 2005/121364 revela polinucleotídeos e polipeptídeos envolvidos no desenvolvimento de fibras vegetais e método para utilizá-los a fim de melhorar a qualidade das fibras, o rendimento e/ou a biomassa de uma planta produtora de fibras.
[0016] A publicação WO No 2007/020638 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas geradas através deles.
[0017] A publicação WO No 2009/083958 revela métodos para aumentar a eficiência do uso da água, a eficiência do uso de fertilizantes, a tolerância ao estresse biótico/abiótico, o rendimento e a biomassa em plantas e em plantas geradas através deles.
[0018] A publicação WO No 2010/020941 revela métodos para aumentar a eficiência do uso do nitrogênio, a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento e a biomassa em plantas e em plantas geradas através deles.
RESUMO DA INVENÇÃO
[0019] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica às ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-1272, 1277-4139, 4142, 4146-5508 ou 5509 aumentando, dessa forma, a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio da planta.
[0020] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-1272, 1274, 1275, 1277-4142 e 4146-5509 aumentando, dessa forma, a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio da planta.
[0021] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo pelo menos 80% idêntica às ID. SEQ. Nos: 474-562, 564-620, 622-750, 752-782, 55105939, 5946-6856, 6858-7540, 7543, 7544, 7548-8735 ou 8736 aumentando, dessa forma, a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio da planta.
[0022] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste das ID. SEQ Nos: 474-782, 5510-5940, 5942, 5943, 59456856, 6858-7544 e 7548-8736 aumentando, dessa forma, a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio da planta.
[0023] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80 % idêntica às ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-1272, 1277-4139, 4142, 4146-5508 ou 5509, onde a sequência de ácido nucleico é capaz de aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta.
[0024] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ Nos: 1-473, 783-1272, 1274, 1275, 1277-4142 e 4146-5509.
[0025] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo que compreenda uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga à sequência de aminoácidos estabelecida nas ID. SEQ. Nos: 474-562, 564-620, 622-750, 752-782, 5510-5939, 5946-6856, 6858-7540, 7543, 7544, 7548-8735 ou 8736, onde a sequência de aminoácidos seja capaz de aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio da planta.
[0026] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo que compreenda a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 474-782, 5510-5940, 5942, 5943, 5945-6856, 6858-7544 e 7548-8736.
[0027] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se uma construção de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, e um promotor para e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucléico em uma célula hospedeira.
[0028] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga às ID. SEQ. Nos: 474-562, 564-620, 622-750, 752-782, 5510-5939, 5946-6856, 6858-7540, 7543, 7544, 7548-8735 ou 8736, onde a sequência de aminoácidos seja capaz de aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta.
[0029] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 474-782, 5510-5940, 5942, 5943, 5945-6856, 6858-7544 e 7548-8736.
[0030] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se uma célula de uma planta exogenamente expressando o polinucleotídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, ou a construção de ácido nucléico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.
[0031] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se uma célula de uma planta exogenamente expressando o polipeptídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.
[0032] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucléico é conforme estabelecido nas ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-1272, 1274, 1275, 1277-4142, 4146-5508 ou 5509.
[0033] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo consiste da sequência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 1-473, 7831272, 1274, 1275, 1277-4142 e 4146-5509.
[0034] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucléico codifica uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga às ID. SEQ. Nos: 474-562, 564-620, 622-750, 752-782, 5510-5939, 5946-6856, 6858-7540, 7543, 7544, 7548-8735 ou 8736.
[0035] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucléico codifica a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 474-782, 5510-5940, 5942, 5943, 5945-6856, 6858-7544 e 7548-8736.
[0036] De acordo com algumas partes do presente pedido de patente de invenção, a célula da planta forma uma parte de uma planta.
[0037] De acordo com algumas partes do presente pedido de patente de invenção, o método também envolve o crescimento da planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob estresse abiótico.
[0038] De acordo com algumas partes do presente pedido de patente de invenção, o estresse abiótico é selecionado a partir do grupo consistindo na salinidade, seca, falta de água, inundação, etiolação, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade de metal pesado, anaerobiose, deficiência de nutriente, excesso de nutriente, poluição atmosférica e irradiação UV.
[0039] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o rendimento compreende o rendimento de sementes ou o rendimento de óleo.
[0040] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.
[0041] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado conforme é comumente compreendido por alguém com habilidade comum na técnica à qual o presente pedido de patente de invenção se refere. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou no testes das aplicações do presente pedido de patente de invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo as definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser, necessariamente, limitantes.
[0042] A implementação do método e/ou sistema de aplicações do presente pedido de patente de invenção pode envolver a realização ou a complementação de tarefas selecionadas manualmente, automaticamente ou uma combinação delas. Além do mais, de acordo com a instrumentação e os equipamentos reais das aplicações do método e/ou do sistema do presente pedido de patente de invenção, várias tarefas selecionadas podem ser implementadas com hardware, software ou por firmware ou com uma combinação deles utilizando-se um sistema operacional.
[0043] P.ex., um hardware para a realização de tarefas selecionadas de acordo com as aplicações do presente pedido de patente de invenção pode ser implementado na forma de um chip ou circuito. Como software, tarefas selecionadas de acordo com as aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser implementadas como uma pluralidade de instruções de software sendo executado por um computador utilizando qualquer sistema operacional apropriado. Em uma aplicação exemplar do presente pedido de patente de invenção, uma ou mais tarefas de acordo com aplicações exemplares do método e/ou do sistema descrito aqui são realizadas por um processador de dados, como uma plataforma de computação para executar diversas instruções. Opcionalmente, o processador de dados inclui uma memória volátil para armazenar instruções e/ou dados e/ou uma memória não volátil, p.ex., um disco rígido magnético e/ou mídia removível para armazenar instruções e/ou dados. Opcionalmente, uma conexão de rede também pode ser fornecida. Um monitor e/ou um dispositivo de entrada do usuário como um teclado ou mouse também são fornecidos opcionalmente.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0044] Algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção são descritas aqui, apenas como exemplos, com referência aos desenhos que as acompanham. Com referência específica, agora, aos desenhos em detalhes, enfatiza-se que as particularidades apresentadas são por meio de exemplos e para propósitos de discussão ilustrativa das aplicações do presente pedido de patente de invenção. A esse respeito, a descrição juntamente com os desenhos torna aparente para aqueles conhecedores da técnica como as aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser praticadas.
[0045] Nos desenhos: a figura 1 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID. SEQ. No: 8741) e o GUSintron (pQYN_6669) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; MCS - Sítio de clonagem múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Poly-A signal (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron). As sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção foram clonadas no vetor enquanto substituíam o gene repórter GUSintron; a figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID. SEQ. No: 8741) (pQFN) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; MCS - Sítio de clonagem múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT- II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Poly-A signal (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron). As sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção foram clonadas no MCS do vetor; as figuras 3A-F são imagens que descrevem a visualização do desenvolvimento da raiz de plantas transgênicas exogenamente expressando o polinucleotídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção quando cultivadas em placas de ágar transparentes sob condições normais (Figuras 3A-B), estresse osmótico (15% de PEG. Figuras 3C-D) ou limitação de nitrogênio (Figuras 3E-F). Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de ágar transparente por 17 dias (7 dias de viveiro e 10 dias após a transplantação). As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias iniciando no dia 1 após a transplantação. Figura 3A - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar quando cultivadas sob condições normais (padrão). Figura 3B - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Figura 3A na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Figura 3C - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar, cultivadas sob condições altamente osmóticas (PEG 15%). Figura 3D - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Figura 3C na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Figura 3E - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar, cultivadas sob condições de baixo teor de nitrogênio. Figura 3F - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Figura 3E na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas; e a figura 4 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o Promotor de Raiz (pQNa_RP) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Poly-A signal (sinal de poliadenilação); As sequências do polinucleotídeo isolado de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção foram clonadas no MCS do vetor.
DESCRIÇÃO DE APLICAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO
[0046] O presente pedido de patente de invenção, em algumas de suas aplicações, se refere a polipeptídeos e polinucleotídeos isolados, construções de ácido nucleico compreendendo os polipeptídeos isolados, plantas transgênicas expressando os mesmos e método de uso dos mesmos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico (ABST), a eficiência do uso de água (WUE), o rendimento (p.ex., a quantidade e/ou qualidade do grão), a biomassa, o teor de óleo, a taxa de crescimento, o vigor, a eficiência do uso do nitrogênio (NUE) e/ou a eficiência do uso de fertilizantes (FUE) de uma planta.
[0047] Antes de explicar pelo menos uma aplicação do presente pedido de patente de invenção detalhadamente, deve-se compreender que o presente pedido de patente de invenção não é necessariamente limitado em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificada pelos Exemplos. O presente pedido de patente de invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticado ou realizado de várias maneiras.
[0048] Os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser utilizados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta.
[0049] Dessa forma, conforme mostra a seção de Exemplos que segue, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática para identificar polinucleotídeos que melhoram a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento (p.ex., o rendimento da semente, o rendimento de óleo, o teor de óleo), a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta. Os genes que afetam o traço de interesse foram identificados com base nos perfis de expressão de genes de diversos ecotipos e tecidos de Arabidopsis, variedades de Tomate, Sorgo, Milho e Cevada (Exemplos 1-8), na homologia com genes conhecidos por afetarem o traço de interesse e utilizando perfis de expressão digitais em tecidos e condições específicos (Tabelas 1-53, Exemplos 1-8; ID. SEQ. de polinucleotídeos Nos: 1-274; ID. SEQ. de polipeptídeos Nos: 474-731). Polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos apresentando a mesma função também foram identificados (Tabela 54, Exemplo 10; ID. SEQ. de polinucleotídeos Nos: 783-5509; ID. SEQ. de polipeptídeos Nos: 5510-8736). Descobriu-se que plantas transgênicas superexpressando os polinucleotídeos e polipeptídeos identificados (Tabela 55, Exemplo 11) apresentam aumento da tolerância ao estresse abiótico (p.ex., sob estresse osmótico ou estresse causado pela salinidade), a eficiência do uso do nitrogênio (p.ex., o desempenho da raiz), a biomassa (sob condições de estresse ou sob condições normais/padrão), a taxa de crescimento (sob condições de estresse ou sob condições normais/padrão) e o rendimento (Tabelas 56-83); Exemplos 14-15). Juntos, esses resultados sugerem o uso dos novos polinucleotídeos e polipeptídeos do presente pedido de patente de invenção para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento (incluindo o rendimento de óleo, o rendimento da semente e o teor de óleo), a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor e a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta.
[0050] Dessa forma, de acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se um método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica às ID. SEQ Nos: 1-473, 783-1272, 1277-4139, 4142, 4146-5508 ou 5509 aumentando, dessa forma, a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio da planta.
[0051] A frase “estresse abiótico”, conforme usada no presente, refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade da planta. Dessa forma, o estresse abiótico pode ser induzido por condições de crescimento ambientais abaixo do ideal como, p.ex., salinidade, falta de água, enchentes, geada, temperatura baixa ou alta, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou irradiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção de Histórico.
[0052] A frase “tolerância de estresse abiótico”, conforme usada no presente, refere-se à capacidade de uma planta de suportar o estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.
[0053] As plantas estão sujeitas a uma variedade de provocações ambientais. Diversas delas, incluindo o estresse causado pelo sal, o estresse osmótico geral, o estresse causado pela seca e o estresse causado pelo congelamento, têm a capacidade de afetar toda a planta e a disponibilidade celular de água. Não surpreendentemente, então, as respostas da planta a esse conjunto de estresses estão relacionadas. Zhu (2002) Ann. Rev. Plant Biol. 53: 247-273 et al. observam que "a maioria dos estudos sobre a sinalização do estresse relativo à água se concentrou primariamente no estresse causado pelo sal porque as respostas da planta ao sal e à seca estão intimamente relacionadas e os mecanismos se sobrepõem". Muitos exemplos de respostas e caminhos semelhantes a esse conjunto de estresses foram documentados. P.ex., os fatores de transcrição CBF demonstraram condicionar a resistência ao sal, ao congelamento e à seca (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). O gene rd29B da Arabidopsis é induzido em resposta tanto ao estresse causado pelo sal quanto pela desidratação, um processo que é amplamente mediado através de um processo de transdução do sinal do ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11632-11637), resultando na alteração da atividade dos fatores de transcrição que se ligam a um elemento montante dentro do promoter rd29B. No Mesembryanthemum crystallinum (planta de gelo), Patharker e Cushman demonstraram que uma proteína quinase dependente do cálcio (McCDPK1) é induzida pela exposição tanto ao estresse causado pela seca quanto ao estresse causado pelo sal (Patharker e Cushman (2000) Plant J. 24: 679-691). A quinase induzida pelo estresse também demonstrou fosforilar um fator de transcrição, presumivelmente alterando sua atividade, embora os níveis de transcrição do fator de transcrição alvo não sejam alterados em resposta ao estresse causado pelo sal ou pela seca. Semelhantemente, Saijo et al. demonstraram que uma proteína quinase dependente da calmodulina (OsCDPK7) induzida pelo sal/seca no arroz conferiu um aumento da tolerância ao sal e à seca no arroz quando superexpressada (Saijo et al. (2000) Plant J. 23: 319-327).
[0054] A exposição à desidratação provoca estratégias de sobrevida semelhantes nas plantas assim como o estresse causado pelo congelamento (veja, p.ex., Yelenosky (1989) Plant Physiol 89: 444-451) e o estresse causado pela seca induz a tolerância ao congelamento (veja, p.ex., Siminovitch et al. (1982) Plant Physiol 69: 250-255; e Guy et al. (1992) Planta 188: 265-270). Além da indução de proteínas de aclimatação ao frio, estratégias que permitem que as plantas sobrevivam em condições de baixos níveis de água incluem, p.ex., a área superficial reduzida, ou óleo na superfície ou a produção de cera. Em outro exemplo, o teor de soluto da planta previne a evaporação e a perda de água devido ao calor, à seca, à salinidade, ao osmótico e a condições semelhantes, dessa forma, proporcionando uma melhor tolerância da planta aos estresses acima.
[0055] Será apreciado que alguns caminhos envolvidos na resistência a um estresse (conforme descrito acima), também estarão envolvidos na resistência a outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou por genes homólogos. É claro que os caminhos da resistência geral estejam relacionados, não sejam idênticos e, portanto, nem todos os genes que controlam a resistência a um estresse controlarão a resistência a outros estresses. Todavia, se um gene condicionar resistência a um desses estresses, seria aparente para alguém com habilidade na técnica testar a resistência a esses estresses relacionados. Métodos para avaliar a resistência ao estresse são apresentados adicionalmente na seção de Exemplos que segue.
[0056] Conforme usado no presente, a frase “eficiência do uso de água (WUE)” refere-se ao nível de matéria orgânica por unidade de água consumida pela planta, isto é, o peso seco da planta em relação ao uso de água da planta, p.ex., a biomassa produzida por transpiração de unidade.
[0057] Conforme utilizada aqui, a frase “eficiência do uso de fertilizantes” se refere ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento do rendimento, da biomassa, do vigor e da taxa de crescimento da planta por unidade de fertilizante aplicada. O processo metabólico pode ser a absorção, a difusão, o absorvente, o acúmulo, o reposicionamento (dentro da planta) e o uso de um ou mais dos minerais e da parcela orgânica absorvida pela planta, como o nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.
[0058] Conforme utilizada aqui, a frase “condições limitantes do fertilizante” se refere a condições de crescimento que incluem um nível (p.ex., a concentração) de um fertilizante aplicado que esteja abaixo do nível necessário para o metabolismo normal, o crescimento, a reprodução e/ou a viabilidade da planta.
[0059] Conforme utilizada aqui, a frase “eficiência do uso do nitrogênio (NUE)” se refere ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento do rendimento, da biomassa, do vigor e da taxa de crescimento da plantapor unidade de nitrogênio aplicada. O processo metabólico pode ser a absorção, a difusão, o absorvente, o acúmulo, o reposicionamento (dentro da planta) e o uso do nitrogênio absorvido pela planta.
[0060] Conforme utilizada aqui, a frase “condições limitantes de nitrogênio” se refere a condições de crescimento que incluem um nível (p.ex., a concentração) de nitrogênio (p.ex., amônio ou nitrato) aplicado que esteja abaixo do nível necessário para o metabolismo normal, o crescimento, a reprodução e/ou a viabilidade da planta.
[0061] A NUE e a FUE melhoradas da planta são traduzidas no campo em quantidades de rendimento semelhantes na colheita, embora implementando menos fertilizantes, ou em aumento de rendimento obtido pela implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Dessa forma a NUE e a FUE melhoradas têm efeito direto sobre o rendimento da planta no campo. Dessa forma, os polinucleotídeos e polipeptídeos de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção afetam positivamente o rendimento da planta, o rendimento da semente e a biomassa da planta. Além disso, o benefício da NUE melhorada da planta certamente melhorará a qualidade da cultura e os componentes bioquímicos da semente como o rendimento das proteínas e o rendimento de óleo.
[0062] Deve-se observar que a melhora da ABST conferirá às plantas um vigor melhorado, também sob condições livres de estresse, resultando em culturas que apresentam biomassa e/ou rendimento melhorados, p.ex., fibras alongadas para a indústria de algodão, maior teor de óleo.
[0063] Conforme usado no presente, a frase “produção da planta” refere-se à quantidade (p.ex.,: conforme determinada por peso/tamanho) ou quantidade (números) de tecido produzidos pela planta ou por época de cultivo. Assim, uma maior produção poderia afetar o benefício econômico que alguém poderia obter a partir da planta em certa área de cultivo e/ou tempo de cultivo.
[0064] Deve-se observar que o rendimento de uma planta pode ser afetado por vários parâmetros incluindo, mas não se limitando à biomassa da planta; ao vigor da planta; à taxa de crescimento da planta; ao rendimento da semente; à quantidade de sementes ou grãos; à qualidade das sementes ou grãos; ao rendimento de óleo; ao teor de óleo; ao amido e/ou proteína dos órgãos colhidos (p.ex., sementes ou partes vegetativas da planta); ao número de flores (ramos) por panícula (expresso como uma relação do número de sementes cheias sobre o número de panículas primárias); ao índice da colheita; ao número de plantas cultivadas por área; ao número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área; ao número de plantas por área de cultivo (densidade); ao número de órgãos colhidos no campo; à área foliar total; à assimilação do carbono e à partição de carbono (a distribuição/alocação de carbono dentro da planta); à resistência à sombra; ao número de órgãos com possibilidade de colheita (p.ex., as sementes), sementes por vagem, ao peso por semente e à arquitetura modificada [como o aumento do diâmetro do caule, a espessura ou a melhora das propriedades físicas (p.ex., a elasticidade)].
[0065] Conforme utilizada aqui, a frase “rendimento da semente” se refere ao número ou ao peso das sementes por planta, sementes por vagem ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, o rendimento da semente pode ser afetado pelas dimensões da semente (p.ex., comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), pelo número de sementes (cheias) e pela taxa de enchimento da semente e pelo teor de óleo da semente. Portanto, o aumento de rendimento da semente por planta pode afetar o benefício econômico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo; e o aumento do rendimento da semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando o rendimento da semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas cultivadas em uma determinada área.
[0066] O termo “semente” (também chamado de “grão” ou “caroço”), conforme utilizado aqui, se refere a uma pequena planta embrionária contida em uma cobertura chamada de revestimento da semente (geralmente com algum alimento armazenado), o produto do óvulo amadurecido de plantas gimnospermas e angiospermas que ocorre depois da fertilização e de algum crescimento dentro da planta mãe.
[0067] A frase “teor de óleo, conforme utilizada aqui, se refere à quantidade de lipídeos de um determinado órgão da planta, sejam as sementes (teor de óleo da semente) ou a porção vegetativa da planta (teor de óleo vegetal) e é expressa como um percentual de peso seco (10% de umidade das sementes) ou peso úmido (para a porção vegetativa).
[0068] Deve-se observar que o teor de óleo é afetado pela produção intrínseca de óleo de um tecido (p.ex., semente, porção vegetativa), bem como pela massa ou pelo tamanho do tecido produtor de óleo por planta ou por período de cultivo.
[0069] Em uma aplicação, o aumento do teor de óleo da planta pode ser atingido aumentando o tamanho/massa de tecido(s) de uma planta, que compreende o óleo por período de cultivo. Dessa forma, o aumento do teor de óleo de uma planta pode ser alcançado aumentando o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa e o vigor da planta.
[0070] Conforme usado no presente, a frase “biomassa da planta” refere-se à quantidade (p.ex.,: medida em gramas de tecido seco em ar) de um tecido produzida pela planta em uma época de cultivo, que também poderia determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por área de cultivo. Um aumento da biomassa da planta pode ocorrer em toda a planta ou em partes dela como partes acima do nível do solo (passível de colheita), biomassa vegetativa, raízes e sementes.
[0071] Conforme utilizada aqui, a frase “taxa de crescimento” se refere ao aumento do tamanho do órgão/tecido da planta por período (pode ser medido em cm2 por dia).
[0072] Conforme usada no presente, a frase “vigor da planta” refere- se à quantidade (medida por peso) de tecido produzida pela planta em um determinado tempo. Assim, o aumento no vigor poderia determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por tempo de cultivo ou área de cultivo. Além disso, o vigor prematuro (semente e/ou muda) resulta em melhor posição no campo.
[0073] Melhorar o vigor prematuro é um objetivo importante dos programas modernos de melhoramento do arroz tanto em cultivares temperados quanto tropicais de arroz. Raízes longas são importantes para a ancoragem adequada no solo em culturas de arroz semeadas na água. Quando o arroz for semeado diretamente em campos alagados, e quando as plantas tiverem que emergir rapidamente através da água, brotos mais longos são associados com o vigor. Quando a semeadura for por perfuração, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para boa emergência da muda. A capacidade de desenvolver o vigor prematuro nas plantas é de grande importância na agricultura. P.ex., o vigor prematuro insatisfatório tem sido uma limitação à introdução de híbridos de milho (Zea mays L.) com base no germoplasma do Cinturão do Milho no Atlântico Europeu.
[0074] Deve-se observar que o rendimento de uma planta pode ser determinado sob estresse (p.ex., estresse abiótico, condições limitantes de nitrogênio) e/ou condições de não-estresse (normais).
[0075] Conforme utilizada aqui, a frase “condições de não-estresse” se refere às condições de cultivo (p.ex., água, temperatura, ciclos de luz- escuridão), umidade, concentração salina, concentração de fertilizante no solo, suprimento de nutrientes como o nitrogênio, o fósforo e/ou potássio), que não significativamente vão além das condições climáticas e de outras condições abióticas diárias que as plantas podem encontrar, e que permitem o crescimento, o metabolismo, a reprodução e/ou viabilidade adequados de uma planta em qualquer estágio de seu ciclo de vida (p.ex., na planta de uma cultura, da semente à planta madura e de volta para a semente novamente). Pessoas com habilidade na técnica conhecem as condições normais do solo e as condições climáticas para uma determinada planta em uma determinada localização geográfica. Deve-se observar que embora as condições de não-estresse possam incluir algumas variações leves das condições adequadas (que pode variar de um tipo/espécie de uma planta para outra), essas variações não fazem com que a planta pare de crescer sem a capacidade de retomar o crescimento.
[0076] O termo “fibra” é, geralmente, inclusivo de células condutoras de parede espessa como vasos e traqueídes e de agregados fibrilares de muitas células de fibras individuais. Portanto, o termo “fibra” se refere a (a) células condutoras e não-condutoras de parede espessa do xilema; (b) fibras de origem extraxilar, incluindo aquelas de floemas, casca, tecido de preenchimento e epiderme; e (c) fibras de caules, folhas, raízes, sementes e flores ou de inflorescências (como aquelas de Sorgo vulgare utilizadas na fabricação de escovas e vassouras).
[0077] Exemplos de plantas produtoras de fibras incluem, mas não se limitam a culturas agrícolas como o algodão, a paineira (Kapok, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosoto, sálvia branca, pau-de- balsa, cânhamo de hibisco, rosela, juta, sisal, abacá, linho, milho, cana de açúcar, cânhamo, rami, paina, fibra de coco, bambu, musgo espanhol e Agave spp. (p.ex., sisal).
[0078] Conforme utilizada aqui, a frase “qualidade das fibras” se refere a pelo menos um parâmetro da fibra que é agriculturalmente desejado, ou exigido na indústria de fibras (descrita adicionalmente abaixo). Exemplos desses parâmetros incluem, mas não se limitam ao comprimento das fibras, à resistência das fibras, à conveniência das fibras, ao peso das fibras por comprimento unitário, à relação de maturidade e à uniformidade (descrita adicionalmente abaixo).
[0079] A qualidade da fibra de algodão (fiapo) é medida, normalmente, de acordo com o comprimento, a resistência e a finura da fibra. Consequentemente, a qualidade do fiapo é considerada maior quando a fibra é mais longa, mais resistente e mais fina.
[0080] Conforme utilizada aqui, a frase “rendimento das fibras” se refere à quantia ou à quantidade de fibras produzidas a partir de uma planta produtora de fibras.
[0081] Conforme usado no presente, o termo “aumento” refere-se a pelo menos cerca de 2%, a pelo menos cerca de 3 %, a pelo menos cerca de 4%, a pelo menos cerca de 5%, a pelo menos cerca de 10%, a pelo menos cerca de 15%, a pelo menos cerca de 20%, a pelo menos cerca de 30%, a pelo menos cerca de 40%, a pelo menos cerca de 50%, a pelo menos cerca de 60%, a pelo menos cerca de 70%, a pelo menos cerca de 80% de aumento na tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio e/ou vigor da planta em comparação à planta nativa [isto é, uma planta não modificada pelas biomoléculas (polinucleotídeos ou polipeptídeos) do presente pedido de patente de invenção, p. ex., uma planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de cultivo).
[0082] A frase “expressando, dentro da planta, um polinucleotídeo exógeno", conforme utilizada aqui, se refere à suprarregulação do nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro da planta introduzindo o polinucleotídeo exógeno dentro de uma célula de planta ou planta e expressando-o por meios recombinantes, conforme será descrito adicionalmente abaixo.
[0083] Conforme utilizado aqui “expressando” se refere à expressão no mRNA e, opcionalmente, no nível do polipeptídeo.
[0084] Conforme usada no presente, a frase “polinucleotídeo exógeno” refere-se a uma sequência de ácido nucléico heterólogo que pode não ser naturalmente expresso dentro da planta ou cuja superexpressão na plana é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta de forma permanente ou temporária, de forma a produzir uma molécula de ácido ribonucléico (RNA) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve-se observar que o polinucleotídeo exógeno pode envolver uma sequência de ácido nucléico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência de ácido nucléico endógeno da planta.
[0085] O termo “endógeno”, conforme utilizado aqui, se refere a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo que esteja presente e/ou naturalmente expresso dentro de uma planta ou de uma célula dela.
[0086] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucléico que seja pelo menos aproximadamente 80%, pelo aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 99%, p.ex., selecionada a partir do grupo 1272, 1277-4139, 4142 e 4146-5509. menos 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo menos menos menos menos menos menos menos menos menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, menos menos menos menos menos menos menos menos menos pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo 100% idêntica à sequência de ácido nucléico que consiste das ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-
[0087] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a homologia é uma homologia global, isto é, uma homologia sobre todas as sequências de aminoácidos ou de ácido nucléico do presente pedido de patente de invenção e não sobre porções delas.
[0088] A identidade (p. ex., homologia percentual) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, p.ex., o software BlastN do National Center of Biotechnology Information (NCBI), como ao usar parâmetros padrão.
[0089] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, p.ex., 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-1272, 1277-4139, 4142 e 4146-5509.
[0090] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pelas ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-1272, 1274, 1275, 1277-4142, 4146-5508 ou 5509.
[0091] Conforme usado no presente, o termo “polinucleotídeo” refere-se a uma sequência única ou dupla de ácido nucléico que é isolada e apresentada na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência de polinucleotídeo genômica e/ou sequências de polinucleotídeos compostas (p. ex., uma combinação do exposto acima).
[0092] O termo “isolado(a)” se refere a pelo menos parcialmente separado(a) do ambiente natural, p.ex., de uma célula da planta.
[0093] Conforme usada no presente, “sequência de polinucleotídeos complementar” refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa de um RNA mensageiro usando transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Tal sequência pode ser subsequentemente amplificada in vivo ou in vitro usando uma polimerase de DNA dependente de DNA.
[0094] Conforme usada no presente, “sequência de polinucleotídeo genômica” refere-se a uma sequência derivada (isolada) de um cromossomo e, assim, representa uma parte próxima de um cromossomo.
[0095] Conforme utilizada no presente, a frase “sequência de polinucleotídeo composta” refere-se a uma sequência que é ao menos parcialmente complementar e ao menos parcialmente genômica. Uma sequência composta pode incluir algumas sequências de éxons necessárias para codificar o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção, bem como algumas sequências intrônicas interpoladas. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo de outros genes e, tipicamente, incluirão sequências de sinal de união conservados. Essas sequências intrônicas também podem incluir elementos regulatórios da expressão de ação cis.
[0096] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção codifica um polipeptídeo que apresenta uma sequência de aminoácidos pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 81%, pelo menos 83%, pelo menos 85%, pelo menos 87%, pelo menos 89%, pelo menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 91%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 474-562, 564-620, 622-750, 752-782, 5510-5939, 5946-6856, 6858-7540, 7543, 7544 e 7548-8736.
[0097] A homologia (p. ex., homologia percentual) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, p.ex., o software BlastP ou TBLASTN do National Center of Biotechnology Information (NCBI), como ao usar parâmetros padrão ao iniciar a partir de uma sequência de polipeptídeo; ou o algoritmo tBLASTX (disponível via NCBI), como ao usar parâmetros padrão, que compara os produtos da tradução conceitual de seis estruturas de uma sequência de nucleotídeo (dois filamentos) em comparação a um banco de dados da sequência de proteína.
[0098] As sequências homólogas incluem sequências ortólogas e parálogas. O termo “parálogos” refere-se a duplicações genéticas dentro do genoma de uma espécie levando a genes parálogos. O termo “ortólogo” refere-se aos genes homólogos em diferentes organismos em razão de relação ancestral.
[0099] Uma opção de identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledôneas é fazendo uma pesquisa blast recíproca. Isso pode ser feito por um primeiro blast envolvendo o blasting da sequência de interesse com qualquer banco de dados de sequência, como o banco de dados do NCBI disponível ao público, que pode ser encontrado em: Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Se fossem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse passaria pelo blast comparando, p.ex., os clones de cDNA de 28.469 de total da Oryza sativa Nipponbare disponível no NCBI. Os resultados blast podem ser filtrados. As sequências totais dos resultados filtrados ou resultados não filtrados passam, então, por novo blast (segundo blast) com as sequências do organismo a partir do qual a sequência de interesse é derivada. Os resultados do primeiro e do Segundo blast são, então, comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultando na maior pontuação (melhor hit) no primeiro blast identifica, no segundo blast, a sequência query (a sequência de interesse original) como o melhor hit. Usando o mesmo raciocínio, é identificado um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo). No caso de famílias de grande sequência, o programa ClustalW pode ser usado [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido por uma árvore neighbor-joining (Hypertext Transfer Protocol://en (ponto) wikipedia (ponto) org/wiki/Neighbor-joining) que ajuda a visualizar o clustering.
[00100] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos estabelecida pelas ID. SEQ. Nos: 474782, 5510-5940, 5942, 5943, 5945-6856, 6858-7544, 7548-8735 ou 8736.
[00101] As sequências de ácido nucléico codificando os polipeptídeos do presente pedido de patente de invenção podem ser otimizados para expressão. Exemplos dessas modificações de sequências incluem, mas não se limitam a um teor de G/C alterado de uma abordagem mais cuidadosa do que aquela comumente encontrada nas espécies de plantas de interesse, e à remoção de códons atipicamente encontrados nas espécies de plantas comumente chamada de otimização de códons.
[00102] A frase “otimização de códon” refere-se à seleção de nucleotídeos apropriados de DNA para uso dentro de um gene estrutural ou fragmento que aborda o uso do códon dentro da planta de interesse. Assim, um gene otimizado ou sequência de ácido nucléico refere-se a um gene em que a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou ocorrendo naturalmente foi modificado visando utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favoráveis dentro da planta. A sequência de nucleotídeo é examinada tipicamente no nível de DNA e a região de codificação para expressão nas espécies de planta determinadas usando qualquer procedimento adequado, p.ex., conforme descrito por Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Nesse método, o desvio padrão do uso de códon, uma medida da tendência do uso de códon, pode ser calculado primeiramente achando o desvio proporcional quadrado do uso de cada códon do gene nativo relativo ao dos genes de plantas com grande expressão, seguido pelo cálculo do desvio quadrado médio. A fórmula usada é: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn)/Yn ] 2/N, em que Xn refere-se à frequência de uso do códon em genes de planta de alta expressão, em que Yn refere-se à frequência de uso do códon no gene de interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Uma tabela do uso de códon de genes com alta expressão de plantas dicotiledônea é compilada usando os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).
[00103] Um método de otimizar a sequência de ácido nucléico de acordo com o uso de Codó preferido para um tipo de célula de planta específico é baseado no uso direto, sem realizar qualquer cálculo estatístico extra, de Tabelas de otimização de códon, como aquelas fornecidas online no Banco de Dados de Uso de Códon pelo banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) no Japão (Hypertext Transfer Protocol ://World Wide Web (dot) kazusa (dot) ou (dot) jp/codon/). O Banco de Dados do Uso de Códon contém tabelas do uso de códon para um número de diferentes dados presentes no GenBank.
[00104] Usando as Tabelas acima para determinar os códons preferenciais ou favoráveis para cada aminoácido em uma espécie específica (p.ex., arroz), uma sequência de nucleotídeo ocorrendo naturalmente codificando uma proteína de interesse pode ser otimizada por códon para essa espécie de planta específica. Isso é feito ao substituir os códons que podem ter uma incidência estatística inferior no genoma de espécies específicas por códons correspondentes, em relação a um aminoácido, que são estatisticamente mais favoráveis. Entretanto, um ou mais códons menos favoráveis podem ser selecionados para deletar os locais de restrição existentes, para criar novos com junções potencialmente úteis (terminações 5’ e 3’ para adicionar peptídeo sinal ou cassetes de terminação, locais internos que podem ser usados para cortar e unir segmentos para gerar uma sequência total correta) ou eliminar sequências de nucleotídeos que podem afetar negativamente a estabilidade ou expressão de mRNA.
[00105] A sequência de nucleotídeo de codificação ocorrendo naturalmente já pode, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponde a um códon estatisticamente favorável em certas espécies de planta. Assim, a otimização de códon da sequência de nucleotídeo nativa pode envolver a determinação de quais códons, dentro da sequência de nucleotídeo nativo, não são estatisticamente favoráveis em relação a uma planta específica, e a modificação desses códons de acordo com uma tabela de uso de códon de uma planta específica par gerar um derivado otimizado de códon. Uma sequência de nucleotídeo modificada pode ser total ou parcialmente otimizada para o uso de códon da planta contanto que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo modificada seja produzida em um nível maior do que a proteína codificada pelo gene nativo ou ocorrendo naturalmente correspondente. A construção de genes sintéticos por meio da alteração do uso de códon é descrita, p.ex., no Pedido de Patente PCT 93/07278.
[00106] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno é um RNA não-codificador.
[00107] Conforme utilizada aqui, a frase ‘RNA não-codificador” se refere a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácidos (um polipeptídeo). Exemplos dessas moléculas de RNA não- codificador incluem, mas não se limitam a um RNA antisenso, um pré- miRNA (precursor de um microRNA), ou um precursor de um RNA que interage com Piwi (piRNA).
[00108] Exemplos não-limitantes de polinucleotídeos de RNA não- codificador são apresentados nas ID. SEQ. Nos: 217, 273, 274 e 473.
[00109] Assim, o presente pedido de patente de invenção envolve as sequências de ácido nucléico descritas acima; seus fragmentos, sequências hibridizáveis, sequências homólogas, sequências codificando polipeptídeos semelhantes com uso de diferentes códons, sequências alteradas caracterizadas por mutações tais como supressão, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, ocorrendo naturalmente ou induzido pelo homem, de forma randômica ou objetivada.
[00110] O presente pedido de patente de invenção apresenta um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, p.ex., 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-1272, 1277-4139, 4142 e 4146-5509.
[00111] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucléico é capaz de aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta.
[00112] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico é selecionado do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-1272, 1274, 1275, 1277-4142 e 4146-5509.
[00113] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado é estabelecido pelas ID. SEQ. Nos: 1-473, 783-1272, 1274, 1275, 1277-4142, 4146-5508 ou 5509.
[00114] O presente pedido de patente de invenção apresenta um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 474-562, 564-620, 622-750, 752-782, 55105939, 5946-6856, 6858-7540, 7543, 7544 e 7548-8736.
[00115] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio de uma planta.
[00116] O presente pedido de patente de invenção apresenta um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 474-782, 5510-5940, 5942, 5943, 5945-6856, 6858-7544 e 7548-8736.
[00117] O presente pedido de patente de invenção apresenta um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou, digamos, 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 474-562, 564-620, 622-750, 752-782, 5510-5939, 5946-6856, 6858-7540, 7543, 7544 e 7548-8736.
[00118] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID. SEQ. Nos: 474-782, 5510-5940, 5942, 5943, 5945-6856, 6858-7544 e 7548-8736.
[00119] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polipeptídeo é estabelecido pelas ID. SEQ. Nos:474- 782, 5510-5940, 5942, 5943, 5945-6856, 6858-7544, 7548-8735 ou 8736.
[00120] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se uma construção de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção, e um promotor para orientar a transcrição da sequência do ácido nucléico do polinucleotídeo isolado em uma célula hospedeira.
[00121] O presente pedido de patente de invenção também envolve fragmentos dos polipeptídeos descritos acima e polipeptídeos com mutações tais como supressão, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos, ocorrendo naturalmente ou induzido pelo homem, de forma randômica ou objetivada.
[00122] O termo “planta” usado no presente documento envolve plantas inteiras, progenitoras e descendentes das plantas e partes de plantas, incluindo sementes, galhos, tronco, raízes (incluindo tubérculos) e células, tecidos e órgãos de plantas. A planta pode, de qualquer forma, incluindo culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, gametófito, esporófito, pólen e microsporas. As plantas que são particularmente úteis nos métodos do presente pedido de patente de invenção incluem todas as plantas que pertencem a superfamília Viridiplantae, particularmente as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo um legumes de forragem, plantas ornamentais, agricultura, árvore ou arbustos selecionados da lista envolvendo Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus 5 spp., Phoenix canadensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, colza, cenoura, couve-flor, aipo, couve de folhas, linho, couve, lentilha, semente de colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, açúcar beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfalfa, algodão, colza, colza, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, uma árvore, planta ornamental, grama e forragem. Alternativamente, algas e outras plantas não Viridiplantae podem ser usadas para os métodos do presente pedido de patente de invenção.
[00123] De acordo com algumas partes do presente pedido de patente de invenção, a planta usada pelo método do presente pedido de patente de invenção são plantas de cultivo tais como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, palmeira de óleo, banana, soja, girassol, colza, cana de açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, colza, tabaco, cholpo e algodão.
[00124] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se uma célula vegetal expressando exogenamente o polinucleotídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a construção de ácido nucléico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e/ou o polipeptídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.
[00125] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção dentro da planta é efetuada pela transformação de uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguida pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivando a planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.
[00126] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a transformação é efetuada pela introdução de uma construção de ácido nucléico na célula da planta que inclua o polinucleotídeo exógeno de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e pelo menos um promotor para orientar a transcrição do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula vegetal). Mais detalhes da abordagem de transformação adequada são fornecidos abaixo.
[00127] Conforme mencionado, a construção de ácido nucléico de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção compreende uma sequência promotora e o polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção.
[00128] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado está operacionalmente ligado à sequência promotora.
[00129] Uma sequência de ácido nucléico codificadora é “operacionalmente ligada” a uma sequência reguladora (p.ex., o promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência codificadora ligada a ela.
[00130] Conforme utilizado no presente, o termo “promotor” refere-se a uma região do DNA que fica acima do local do início da transcrição de um gene ao qual a polimerase do RNA se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (p. ex., qual parte de uma planta) e/ou quando (p. ex., em que estágio ou condição na vida de um organismo) o gene é expresso.
[00131] Qualquer sequência de promotor adequada pode ser usada pelo constructo de ácido nucléico do presente pedido de patente de invenção. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou um induzível de estresse abiótico.
[00132] Os promotores constitutivos adequados incluem, p.ex., o promotor CaMV 35S (ID SEQ N°s: 8739; Odell et al., Nature 313:810-812, 1985); promotor Arabidopsis At6669 (ID SEQ N°: 8738; ver Publicação PCT N° WO04081173A2); Arabidopsis new At6669 promoter (SEQ ID NO:8741); Ubi-1 de milho (Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); ciclofilina de arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837- 43, 1994); Histona H3 de milho (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276285, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10(1);107-121, 1996) e MAS Super Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles das Pat. Amer. N°s 5,659,026, 5,608,149; 5.608,144; 5,604,121; 5.569,597: 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; e 5,608,142.
[00133] Os promotores específicos de tecido apropriados incluem, entre outros, promotores específicos de folha [como descrito, p.ex., por Yamamoto et al., Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:11291138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993], promotores preferidos para sementes [e.g., Napin (originados de Brassica napus que são caracterizados por uma atividade promotora específica para sementes; Stuitje A. R. et.al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301309; SEQ ID NO:8740), de genes específicos de sementes (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), Albumina de castanha-do-pará (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zeína (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), SPA trigo (Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, etal., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992)], promotores específicos de endosperma [p. ex., LMW e HMW de trigo, glutenina-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), gliadinas a, b e g de trigo (EMBO3:1409- 15, 1984), promotor ltrl de cevada, hordeína B1, C, D de cevada (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), DOF de cevada (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina NRP33 de arroz, globulina Glb-1 de arroz (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), alfa-globulina REB/OHP- 1 de arroz (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glicose PP de arroz (Trans Res 6:157-68, 1997), família do gene ESR do milho (Plant J 12:235-46, 1997), gama-kafirina do sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores específicos de embrião [p. ex., OSH1 de arroz (Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), oleosina de arroz (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores específicos de flor [p. ex., AtPRP4, síntase de chalene (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apetala- 3], e promotores de raízes como o promotor ROOTP [ID. SEQ. No: 8742].
[00134] Os promotores induzíveis de estresse abiótico apropriados incluem, entre outros, promotores induzíveis de sal como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induzíveis de estiagem, como o promotor do gene rab17 do milho (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), promoter do gene rab28 do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997) e promotor do gene Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores induzíveis de calor, como promotor hsp80 do tomate por calor (Pat. Americana N° 5,187,267).
[00135] O constructo de ácido nucléico de algumas partes do presente pedido de patente de invenção também podem incluir um marcador selecionável e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas partes do presente pedido de patente de invenção, o constructo de ácido nucléico usado é um vetor ponte (shuttle), que pode se propagar em E. coli (em que o constructo envolve um marcador selecionável apropriado e a origem da replicação) e ser compatível com a propagação em células. O constructo de acordo com o presente pedido de patente de invenção por ser, p.ex., um plasmídeo, um bacmídeo, um fagómido, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.
[00136] O constructo de ácido nucléico de algumas partes do presente pedido de patente de invenção pode ser utilizado para transformar permanente ou temporariamente as células das plantas. Em transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado ao genoma da planta e, assim, representa um traço estável e herdado. Na transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrado ao genoma e, assim, representa um traço temporário.
[00137] Existem vários métodos para introduzir genes estranhos tanto em monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).
[00138] Os princípios dos métodos de causar a integração permanente do DNA exógeno no DNA das plantas incluem duas abordagens principais: (i) Transferência de gene mediada por agrobactérias: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93- 112.
[00139] (ii) Absorção direta do DNA: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos de captação direta de DNA em protoplastas, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captação de DNA induzida por breve choque elétrico das células da planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células de planta ou tecidos por bombardeio de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pelo uso de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de fibra de vidro ou carboneto de silicone das culturas celulares, embriões ou tecido de calo, Pat. Am. N° 5,464,765 ou pela incubação direta do DNA com pólen de germinação, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.
[00140] O sistema de agrobactéria inclui o uso de vetores plasmídeos que contêm segmentos de DNA definidos que se integram ao DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo da espécie da planta e do sistema de entrega da Agrobactéria. Uma abordagem amplamente usada é o procedimento de disco da folha, que pode ser realizado com qualquer tecido que fornece uma boa fonte para o início de uma diferenciação de planta total. Vide, p.ex., Horsch et al. em Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de entrega de agrobactérias em combinação com infiltração de vácuo. O sistema de agrobactéria é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.
[00141] Há vários métodos de transferência de DNA direta em células de planta. Na eletroporação, os protoplastas são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células usando micropipetas muito pequenas. No bombardeio de micropartículas, o DNA é adsorvido em microprojéteis, como cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos de planta.
[00142] Após a transformação fixa, a propagação da planta é feita. O método mais comum de propagação da planta é por semente. A regeneração por propagação de semente, entretanto, tem o defeito de, em razão da heterozigosidade, há uma falta de uniformidade no cultivo, uma vez que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variações genéticas controladas pelas regras das leis de Mendel. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e crescerá com seus próprios traços específicos. Assim, é preferível que a planta transformada seja produzida de forma que a planta regenerada tenha traços e características idênticos aos da planta transgênica original. Assim, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação, que gera uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.
[00143] A micropropagação é um processo de cultivar plantas de nova geração a partir de uma única parte de tecido, que foi obtida de uma planta original selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas que apresentam o tecido preferencial expressando a proteína da fusão. As plantas da nova geração que são produzidas são geneticamente idênticas e possuem as mesmas características da planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material de planta de qualidade em curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta transformada ou transgênica original. As vantagens de clonar plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.
[00144] A micropropagação é um procedimento de múltiplas etapas que requere a alteração do meio de cultura ou condições de crescimento entre as etapas. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro etapas básicas: Etapa um, cultura de tecido inicial; etapa dois, multiplicação de cultura de tecido; etapa três, diferenciação e formação de planta; e etapa quatro, cultivo em estufa e hardening. Durante a etapa um, cultura inicial do tecido, a cultura do tecido é estabelecida e certificada de estar livre de contaminante. Durante a etapa dois, a cultura de tecido inicial é multiplicada até um número suficiente de amostras de tecido ser produzido para atender as metas de produção. Durante a etapa três, as amostras de tecido cultivadas na etapa dois são divididas e cultivadas em plântulas individuais. No estágio quarto, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para passar pelo hardening, em que a tolerância das plantas à luz é gradualmente elevada, de forma que possa ser cultivada no ambiente natural.
[00145] De acordo com algumas partes do presente pedido de patente de invenção, as plantas transgênicas são geradas por transformação transitória das células das folhas, células meristemáticas ou de toda a planta.
[00146] Transformação temporária pode ser afetada por qualquer método de transferência de DNA direta descrito acima ou por infecção viral usando vírus de planta modificados.
[00147] Os vírus que mostraram ser úteis para a transformação dos hospedeiros da planta incluem, CaMV, vírus do mosaico do tabaco (TMV), vírus do mosaico do capim bromo (BMV) e vírus do mosaico comum do feijoeiro (BV ou BCMV). A transformação de plantas utilizando vírus de plantas é descrita na Patente dos EUA No 4.855.237 (vírus mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67.553 (TMV), Solicitação Japonesa Publicada No 63-14693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). As partículas de pseudovírus para uso na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas em WO 87/06261.
[00148] De acordo com algumas partes do presente pedido de patente de invenção, o vírus usado para transformações transitórias é avirulento e, assim, é incapaz de causar sintomas graves, como taxa de crescimento reduzido, mosaico, mancha anular, enrolamento da folha, amarelamento, listras, formação de bolhas, formação de tumores e buracos. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento que ocorra naturalmente ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação do vírus pode ser efetuada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando ao aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese dirigidas conforme descrito, p.ex., por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).
[00149] Cepas de vírus adequadas podem ser obtidas a partir de fontes disponíveis, como, p.ex., a American Type culture Collection (ATCC) ou por isolamento das plantas infectadas. O isolamento do vírus dos tecidos da planta infectada pode ser feito por técnicas bem conhecidas como descrito, p.ex., por Foster e Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Em suma, os tecidos de uma planta infectada em que se crê haver uma alta concentração de um vírus adequado, preferencialmente folhas jovens e pétalas de flor, são fundamentados em uma solução tampão (p. ex., solução tamponada de fosfato) para gerar uma seiva infectada de vírus que pode ser usada em inoculações futuras.
[00150] A construção do vírus de RNA de planta para a introdução e expressão de sequências exógenas não virais em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e Patente dos EUA No 5.316.931.
[00151] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser feitas no vírus propriamente dito. Alternativamente, o vírus pode ser clonada primeiro em um plasmídeo bacteriano para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA estranho. O vírus pode ser, então, removido do plasmídeo. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacteriana da replicação pode ser anexada ao DNA viral, que é, então replicado pelas bactérias. A transcrição e a tradução desse DNA produzirá a proteína capsidial que irá encapsidar o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é, geralmente, clonado como um cDNA e inserido em um plasmídeo. O plasmídeo é, então, utilizado para fazer todas as construções. O vírus RNA é, então, produzido transcrevendo a sequência viral do plasmídeo e a tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsida o RNA viral.
[00152] Em uma parte, é dado um polinucleotídeo viral de planta em que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativa foi deletada de um polinucleotídeo viral, uma sequência de codificação da proteína de revestimento viral de planta não nativa e um promotor não nativo, preferencialmente o promotor subgenômico da sequência de codificação da proteína de revestimento não nativa, capaz da expressão no hospedeiro da planta, empacotamento do polinucleotídeo viral da planta recombinante e garantia de infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral da planta recombinante foi inserido. Alternativamente, o gene da proteína de revestimento pode ser inativado por inserção da sequência de polinucleotídeo não nativo dentro dele, de forma que seja produzida uma proteína. O polinucleotídeos viral da planta recombinante pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos adicionais. Cada promoter subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar os genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeos no hospedeiro da planta e incapaz da recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeos não nativos (estranhos) podem ser inseridas de forma adjacente ao promotor subgenômico viral de planta nativa ou os promotores subgenômicos virais de planta não nativa e nativa se mais de uma sequência de polinucleotídeo é incluída. As sequências de polinucleotídeos não nativos são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.
[00153] Em uma segunda parte, é dado um polinucleotídeo viral de planta recombinante como na primeira parte, exceto que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativa é posicionada adjacente a um dos promotores subgenômicos da proteína de revestimento não nativa em vez de uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.
[00154] Em uma terceira parte, é dado um polinucleotídeo viral de planta recombinante em que o gene da proteína de revestimento nativo está adjacente a seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foram inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar os genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeos não nativos podem ser inseridas adjacentes aos promotores virais de planta subgenômicos não nativos, de forma que as sequências sejam transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle dos promotores subgenômicos para produzir o produto desejado.
[00155] Em uma quarta parte, é dado um polinucleotídeo viral de planta recombinante como na terceira parte, exceto que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.
[00156] Os vetores virais são encapsidados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotídeo viral da planta recombinante para produzir um vírus de planta recombinante. O polinucleotídeo viral da planta recombinante ou o vírus da planta recombinante é usado para infectar as plantas hospedeiras apropriadas. O polinucleotídeos viral da planta recombinante é capaz de replicação no hospedeiro, dispersão sistêmica no hospedeiro e transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para gerar a proteína desejada.
[00157] Técnicas de inoculação de vírus em plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado and Agrawa, eds. "Principles and Techniques in Plant Virology", Van Nostrand-Reinhold, New York.
[00158] Além do exposto acima, o polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção também pode ser introduzido em um genoma cloroplasto, permitindo, assim, a expressão de cloroplasto.
[00159] Uma técnica para introduzir sequências de polinucleotídeos exógenos ao genoma do cloroplasto já é de conhecimento. Essa técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, as células das plantas são quimicamente tratadas de forma a reduzir o número de cloroplastos por célula para um. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido por meio de bombardeio de partícula nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos são selecionados de forma que são integráveis no genoma de cloroplastos via recombinação homóloga, que é prontamente feita pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Com essa finalidade, os polinucleotídeos exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos uma extensão de polinucleotídeo, que é derivada do genoma de cloroplasto. Além disso, os polinucleotídeos exógeno inclui um marcador selecionável, que serve, por meio de procedimentos de seleção sequencial, para constatar se todas ou quase todas as cópias dos genomas de cloroplasto após essa seleção incluirão os polinucleotídeo exógeno. Detalhes adicionais relativos a essa técnica são encontrados nas Patentes dos EUA dos EUA Nos 4.945.050; e 5.693.507 que são incorporadas aqui como referência. Um polipeptídeo pode, assim, ser produzido pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e se tornar integrado à membrana interna do cloroplasto.
[00160] Como os processos que aumentam a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio podem envolver múltiplos genes atuando aditivamente ou em sinergia (veja, p.ex., em Quesda et al., Plant Physiol. 130:951-063, 2002), o presente pedido de patente de invenção também considera a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira para, dessa forma, atingir um efeito superior sobre a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento das fibras, a qualidade das fibras e/ou a eficiência do uso do nitrogênio.
[00161] A expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser feita pela introdução concomitante de múltiplos constructos de ácido nucléico, cada um incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma célula de planta única. A célula transformada pode, então, ser regenerada em uma planta madura, usando os métodos descritos acima.
[00162] Alternativamente, a expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser feita pela introdução concomitante, em uma célula de planta única, de um único constructo de ácido nucléico, incluindo diversos polinucleotídeos exógenos diferentes. Tal constructo pode ser elaborado com uma única sequência de promotor, que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico, incluindo todas as sequências de polinucleotídeos exógenos. Para permitir a tradução concomitante dos diferentes polipeptídeos codificados pelo RNA mensageiro policistrônico, as sequências de polinucleotídeos podem ser interligadas via uma sequência de sítio interno de entrada do ribossomo (IRES), que facilita a tradução de sequências de polinucleotídeos posicionadas abaixo da sequência de IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita codificando os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida a partir da terminação 5’ revestida e das duas sequências de IRES internos da molécula de RNA policistrônico para, assim, produzir todos os polipeptídeos diferentes na célula. Alternativamente, o constructo pode incluir diferentes sequências de promotores, cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.
[00163] A célula da planta transformada com o constructo incluindo diversos polinucleotídeos exógenos diferentes pode ser regenerada em uma planta madura, usando os métodos descritos acima.
[00164] Alternativamente, a expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser feita pela introdução de diferentes constructos de ácido nucléico, incluindo diferentes polinucleotídeos exógenos, em diversas plantas. As plantas transformadas regeneradas podem, então, ser cruzadas e resultar na geração selecionada para apresentar traços superiores de tolerância ao estresse abiótico, eficiência do uso de água, eficiência do uso de fertilizante, crescimento, biomassa, produção e/ou no vigor, usando técnicas de geração de planta convencionais.
[00165] De acordo com algumas partes do presente pedido de patente de invenção, o método também envolve o crescimento da planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob estresse abiótico.
[00166] Exemplos não-limitantes de condições de estresse abiótico incluem salinidade, seca, privação de água, excesso de água (p.ex., inundação, encharcamento), etiolação, baixa temperatura, temperatura elevada, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférico e irradiação UV.
[00167] Dessa forma, o presente pedido de patente de invenção abrange plantas expressando exogenamente o(s) polinucleotídeo(s), as construções de ácido nucléico e/ou polipeptídeo(s) do presente pedido de patente de invenção. Uma vez expresso na célula da planta ou na planta inteira, o nível de polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos como, ensaios de atividade, Western blots usando anticorpos capazes de ligação específica do polipeptídeo, Ensaio imunoabsorvente com ligação enzimática (ELISA), Radioimunoensaios (RIA), imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e semelhantes.
[00168] Os métodos de determinação do nível, na planta, do RNA transcrito a partir do polinucleotídeo exógeno são bem conhecidos e incluem, p.ex., a análise Northern blot, análise da reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa (RT-PCR) (incluindo RT-PCR quantitativa, semi- quantitativa ou em tempo real) e hibridização in situ de RNA.
[00169] As informações e anotações da sequência não cobertas pelos presentes ensinamentos podem ser aproveitadas em favor do melhoramento clássico. Assim, os dados da subsequência daqueles polinucleotídeos descritos acima, podem ser utilizados como marcadores para seleção assistida pelo marcador (MAS), na qual um marcador é utilizado para seleção indireta de um determinante ou determinantes genético(s) de um traço de interesse (p.ex., tolerância ao estresse abiótico, rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento das fibras, qualidade das fibras e/ou eficiência do uso do nitrogênio). Os dados do ácido nucléico dos presentes ensinamentos (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou estar ligados a sítios polimórficos ou a marcadores genéticos no genoma como o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP), microsatélites e polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), impressão genética (DFP), polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptídeo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou de RNA.
[00170] Exemplos de seleções assistidas do marcador incluem, mas não se limitam à seleção de um traço morfológico (p.ex., um gene que afete a forma, a coloração, a esterilidade masculina ou a resistência como a presença ou a ausência de aresta, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma do arroz); seleção de um traço bioquímico (p.ex., um gene que codifique uma proteína que possa ser extraída e observada; p.ex., isozimas e proteínas de reserva); seleção de um traço biológico (p.ex., raças patogênicas ou biotipos de insetos baseados no patógeno hospedeiro ou a interação com o parasita hospedeiro pode ser utilizada como um marcador desde que a constituição genética de um organismo possa afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).
[00171] Os polinucleotídeos e os polipeptídeos descritos acima podem ser usados em uma grande variedade de plantas econômicas, de forma segura e econômica.
[00172] Linhagens vegetais expressando exogenamente os polinucleotídeo ou o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção são triadas para identificar aquelas que mostram o maior aumento do traço desejado da planta.
[00173] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno codificando o polipeptídeo) sobre a tolerância o estresse abiótico podem ser determinado utilizando métodos conhecidos conforme detalhado abaixo e na seção Exemplos, que segue.
[00174] Tolerância ao estresse abiótico - As plantas transformadas (isto é, expressando o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, como falta de água, temperatura abaixo do ideal (baixa e alta temperatura), deficiência de nutriente, excesso de nutriente, condição de estresse salino, estresse osmótico, toxicidade de metal pesado, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação UV.
[00175] Ensaio de tolerância à salinidade - Plantas transgênicas com tolerância a concentrações muito altas de sal podem exibir melhor germinação, vigor ou crescimento de muda com alta salinidade. O estresse ao sal pode ser efetuado de muitas formas, como, p.ex., irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando as plantas hidroponicamente em uma solução de cultivo hiperosmótica (p.ex., solução de Hoaglan) ou cultivando as plantas em um meio de cultivo hiperosmótico (p.ex., 50% meio de Murashige-Skoog [meio MS]). Uma vez que plantas diferentes variam consideravelmente em sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, solução de cultivo ou meio de cultivo pode ser ajustada de acordo com características específicas do cultivar ou variedade da planta específica, de forma a causar um efeito leve ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para diretrizes sobre a concentração apropriada, consulte Bernstein and Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A and Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., New York, 2002, e suas referências).
[00176] P.ex., um teste de tolerância à salinidade pode ser feito irrigando as plantas em estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (p.ex., 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM NaCl) aplicadas debaixo e de cima para garantir uma dispersão por igual do sal. Após a exposição à condição de estresse, as plantas são frequentemente monitoradas até efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais aparecerem nas plantas do tipo selvagem. Assim, a aparência fenotípica externa, grau em que a planta murchou e o sucesso geral para atingir a maturidade e resultado são comparados entre as plantas de controle e transgênicas.
[00177] Os parâmetros quantitativos de tolerância medidos incluem, mas não se limitam ao peso úmido e seco médio, à taxa de crescimento, ao tamanho da folha, à cobertura foliar (área foliar geral), ao peso das sementes geradas, ao tamanho médio das sementes e ao número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas não exibindo efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou exibindo biomassa maior do que das plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.
[00178] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios de cloreto de sódio e manitol) são realizados para determinar se um fenótipo osmótico era específico de cloreto de sódio ou se era um fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. As plantas que são tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou geadas. Para os experimentos de germinação com estresse salino e osmótico, o meio é fornecido, p.ex., com 50 mM, 100 mM, 200 mM NaCl ou 100 mM, 200 mM NaCl, 400 mM manitol.
[00179] Ensaio de tolerância à seca/ensaio osmótico - A tolerância à seca é feita para identificar os genes gerando melhor sobrevida de plantas após falta de água aguda. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, pode ser realizado um estresse osmótico gerado pelo osmólito não iônico sorbitol no meio. As plantas de controle e transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de ágar de plantas por 4 dias, após no qual são transferidas para placas contendo 500mM de sorbitol. O tratamento causa retardamento no crescimento, então, as plantas de controle e transgênicas são comparadas, medindo o peso da planta (úmido e seco), a produção e pelos índices de crescimento medidos no momento da floração.
[00180] Ao contrário, são feitas seleções da seca baseadas no solo com plantas superexpressando os polinucleotídeos detalhados acima. As sementes das plantas Arabidopsis de controle, ou outras plantas transgênicas superexpressando o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção são germinadas e transferidas para vasos. O estresse à seca é obtido após cessada a irrigação, seguida pela colocação dos vasos em papel absorvente para aumentar o índice de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controle são comparadas entre si quando a maioria das plantas de controle desenvolve definhamento grave. As plantas são novamente irrigadas após obter uma fração significativa das plantas de controle mostrando definhamento grave. As plantas são classificadas comparando-as aos controles em cada um dos dois critérios: tolerância às condições de seca e recuperação (sobrevida) após a nova irrigação.
[00181] Tolerância ao estresse de frio - Para analisar o estresse ao frio, plantas maduras (com 25 dias) são transferidas para câmaras de 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz elementar. Mais tarde, as plantas são transferidas para a estufa. Duas semanas depois, os danos do período de frio, resultando em retardamento no crescimento e outros fenótipos, são comparados entre as plantas de controle e transgênicas, medindo o peso da planta (úmido e seco) e comparando os índices de crescimento medidos no momento da floração, o tamanho da planta, a produção, entre outros.
[00182] Tolerância ao estresse ao calor - A tolerância ao estresse ao calor é atingida expondo as plantas a temperaturas acima de 34°C por um período determinado. A tolerância da planta é examinada após transferi-las novamente a 22°C para recuperação e avaliação após 5 dias em relação aos controles internos (plantas não transgênicas) ou plantas não expostas ao estresse ao frio ou ao calor.
[00183] Eficiência do uso de água - pode ser determinada como a biomassa gerada por unidade transpiração. Para analisar a WUE, o conteúdo de água relativo da folha pode ser medido em plantas de controle e transgênicas. O peso fresco (FW) é imediatamente registrado; então, as folhas são molhadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente, no escuro, e o peso túrgido (TW) é registrado. O peso seco (DW) total é registrado depois da secagem das folhas a 60 °C a um peso constante. O conteúdo de água relativo (RWC) é calculado de acordo com a seguinte fórmula I: Fórmula I: RWC = [(FW-DW)/(TW-DW)]x100
[00184] Eficiência do uso de fertilizantes - Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas são cultivadas em placas de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante, conforme descrito, p.ex., em Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101:7833-8). As plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo de florescimento, produção, conteúdo de proteína do galho e/ou grão. Os parâmetros verificados são o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio das sementes e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o conteúdo de clorofila das folhas (uma vez que o status de nitrogênio e o grau de verdor da folha estão correlacionados), conteúdo de aminoácido e proteína total das sementes ou outras partes das plantas, como folhas ou galhos, conteúdo de óleo, etc. De forma semelhante, em vez de fornecerem nitrogênio em quantidades limitadas, podem ser adicionados fosfato ou potássio em concentrações elevadas. Novamente, os mesmos parâmetros medidos são os mesmos relacionados acima. Dessa forma, a eficiência do uso de nitrogênio (NUE), eficiência do uso de fosfato (PUE) e eficiência do uso de potássio (KUE) são avaliadas, verificando a capacidade das plantas transgênicas de florescerem sob condições restritas de nutrientes.
[00185] Eficiência do uso do nitrogênio - Para analisar se as plantas transgênicas (p.ex., plantas Arabidopsis) são mais responsivas ao nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75-3 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou 6-10 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permite-se que as plantas cresçam por 25 dias adicionais ou até a produção de semente. As plantas são então analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo de florescimento, produção, conteúdo de proteína do galho e/ou produção de semente /grão. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos e o teor de óleo. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem níveis maiores dos parâmetros medidos do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas eficientes no uso do nitrogênio.
[00186] Ensaio de eficiência do uso do nitrogênio utilizando plântulas - O ensaio é realizado de acordo com Yanagisawa-S. et al. com pequenas modificações ("Metabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation and growth under low-nitrogen conditions” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7833-7838). Brevemente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7-10 dias em 0,5 x MS [Murashige- Skoog] suplementado com um agente de seleção são transferidos para duas condições limitantes de nitrogênio: O meio MS no qual a concentração de nitrogênio combinada (NH4NO3 e KNO3) era de 0,75 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou de 6-15 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permitiu-se que as plantas crescessem por 30-40 dias adicionais e, então, foram fotografadas, removidas individualmente do Ágar (o broto sem as raízes) e pesadas imediatamente (peso fresco) para análise estatística posterior. Construções para as quais somente sementes T1 estão disponíveis são semeadas em meio seletivo e pelo menos 20 mudas (cada uma representando um evento de transformação independente) são cuidadosamente transferidas para o meio limitante de nitrogênio. Para construções nas quais sementes T2 estão disponíveis, eventos de transformação diferentes são analisadas. Geralmente, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para o meio limitante de nitrogênio e permite-se que elas cresçam por 3-4 semanas adicionais e são pesadas individualmente no final daquele período. As plantas transgênicas são comparadas às plantas de controle cultivadas paralelamente sob as mesmas condições. Plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor ou plantas transgênicas carregando o mesmo promotor mas sem um gene repórter são utilizadas como controle.
[00187] Determinação de nitrogênio - O procedimento de determinação da concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolve o método da digestão com persulfato de potássio para converter N orgânico em NO3 (Purcell and King 1996 Argon. J. 88:111-113, the modified Cd mediated reduction of NO3 to NO2 (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrito pelo ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorvência são medidos a 550 nm contra uma curva padrão de NaNO2. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.
[00188] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes de plantas transgênicas que podem realizar o processo de germinação ao percentual de sementes das plantas de controle que são tratadas da mesma forma. As condições normais são consideradas, p.ex., incubações a 22°C durante ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas sem luz. A avaliação da germinação e vigor da muda é feita entre 4 e 14 dias após o plantio. A média basal é 50% de meio MS (Murashige and Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).
[00189] A germinação é verificada também em condições desfavoráveis, como frio (incubando com temperaturas inferiores a 10°C em vez de 22°C) ou usando soluções de inibição de sementes que contenham concentrações altas de um osmólito, como sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM e até 1000 mM) ou aplicando concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM NaCl)
[00190] O efeito do transgene sobre o vigor, a taxa de crescimento, a biomassa, o rendimento e/ou o teor de óleo da planta pode ser determinado utilizando métodos conhecidos.
[00191] O vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento nos parâmetros de crescimento, como área da folha, comprimento da fibra, diâmetro da roseta, peso fresco da planta e semelhantes no período.
[00192] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida utilizando a análise digital de plantas cultivadas. P.ex., as imagens das plantas crescendo em estufas na base do terreno podem ser obtidas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área de roseta é calculado usando a diferença da área de roseta entre o dia de amostragem dividida pela diferença nos dias entre as amostras.
[00193] A avaliação do índice de crescimento pode ser feita medindo a biomassa da planta produzida, área de roseta, tamanho da folha ou comprimento da raiz por tempo (pode ser medido em cm por dia da área da folha).
[00194] A área de crescimento relativo pode ser calculada utilizando a Fórmula II. Fórmula II: Área da taxa de crescimento relativo = Coeficiente de regressão da área ao longo do ciclo de tempo.
[00195] Avaliação da semente - A avaliação da produção de semente por planta pode ser feita medindo a quantidade (peso ou tamanho) ou quantidade (isto é, número) de sementes secas produzidas e colhidas de 8-16 plantas e dividida pelo número de plantas.
[00196] P.ex., as sementes totais de 8-16 plantas podem ser coletadas, pesadas utilizando, p.ex., uma balança analítica e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. O número de semente por área de crescimento pode ser calculado da mesma forma, levando em consideração a área de crescimento dada a uma única planta. O aumento na produção de semente por área de crescimento pode ser atingido aumentando a produção de semente por planta e/ou aumentando o número de plantas capazes de crescerem em uma determinada área.
[00197] Além disso, o rendimento da semente pode ser determinado através do peso de 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado como segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e uma fotografia é tirada. Cada amostra é pesada e, então, utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculado.
[00198] As 1000 sementes pesadas podem ser calculadas utilizando a fórmula III: Fórmula III: Peso de 1000 Sementes = número de sementes na amostra/peso da amostra X 1000.
[00199] O Índice de Colheita pode ser calculado utilizando a Fórmula IV. Fórmula IV: Índice de Colheita = Média de produção de semente por planta/Peso seco médio
[00200] Concentração de proteína do grão - O conteúdo de proteína do grão (g proteína grão m-2) é estimado como o produto da massa do grão N (g grão N m-2) multiplicado pela razão de conversão de N/proteína de k-5.13 (Mosse 1990, supra). A concentração de proteína do grão é estimada como a razão do conteúdo de proteína do grão por unidade/massa do grão (g grão proteína kg-1 grão).
[00201] Comprimento das fibras - O comprimento das fibras pode ser medido utilizando um fibrógrafo. O sistema de fibrógrafo foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento “Médio de 50% das Fibras Maiores”. A média de 50% das fibras maiores (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição das fibras. O fibrógrafo mede o comprimento em comprimentos dimensionais em um determinado ponto percentual (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) algodãoinc (dot) com/ClassificationofAlgodão/?Pg=4#Length).
[00202] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o aumento do rendimento de milho pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes itens: aumento do número de plantas por área de cultivo, aumento do número de espigas por planta, aumento do número de fileiras por espiga, número de grãos por fileira da espiga, o peso do grão, o peso de mil grãos (peso por 1000), comprimento/diâmetro da espiga, aumento do teor de óleo por grão e aumento do teor de amido por grão.
[00203] Conforme mencionado, o aumento do rendimento da planta pode ser determinado por vários parâmetros. P.ex., o aumento do rendimento de arroz pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento do peso por mil grãos (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de amido por semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00204] Semelhantemente, o aumento do rendimento da soja pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de proteínas pro semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00205] O aumento do rendimento da colza pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00206] O aumento do rendimento do algodão pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de cápsulas por planta, número de sementes por cápsula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de mil sementes (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, melhora do comprimento das fibras, resistência das fibras, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00207] Conteúdo de óleo - O conteúdo de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou porção vegetativa da planta. Resumindo, lipídios (óleo) podem ser removidos da planta (p. ex., semente) cortando o tecido da planta na presença de solventes específicos (p. ex., hexano ou éter de petróleo) e extraindo o óleo em um extrator contínuo. A análise do conteúdo de óleo indireto pode ser feita usando vários métodos conhecidos, como Espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, p.ex., Conway TF. and Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin/Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Impresso) 1558-9331 (Online)]; Espectroscopia de Infravermelho Próximo (NIR), que utilize a absorção de energia infravermelha próxima (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito em WO/2001/023884, que se baseia na extração de óleo, de solvente, evaporando o solvente em um fluxo de gás que forma partículas de óleo e direcionado uma luz ao fluxo de gás e partículas de óleo que formam uma luz refletida detectável.
[00208] Assim, este pedido de patente de invenção é de grande valor à agricultura por promover a produção de colheitas desejadas comercialmente (p. ex., biomassa do órgão vegetativo como madeira de álamo ou órgão reprodutivo, como número de sementes ou biomassa de semente).
[00209] Quaisquer das plantas transgênicas descritas acima ou partes delas podem ser processadas para produzir um alimento, uma ração, proteína ou preparação de óleo, como para animais ruminantes.
[00210] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um aumento do teor de óleo podem ser utilizadas para produzir óleo vegetal (extraindo o óleo da planta).
[00211] O óleo vegetal (incluindo o óleo da semente e/ou o óleo da porção vegetal) produzido de acordo com o método do presente pedido de patente de invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com o uso pretendido. Produtos exemplares incluem ração animal, matéria-prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício misturado, óleo edível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos e matéria- prima para processo de fermentação. Produtos exemplares a serem incorporados no óleo vegetal incluem rações animais, produtos alimentícios humanos como salgadinhos extrudados, pães, como um agente de ligação aos alimentos, rações para aquacultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas desportivas, barras alimentícias nutricionais, suplementos multivitamínicos, bebidas dietéticas e cereais.
[00212] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o óleo compreende um óleo de semente.
[00213] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o óleo compreende um óleo da porção vegetal.
[00214] De acordo com algumas partes do presente pedido de patente de invenção, a célula da planta forma uma parte de uma planta.
[00215] Conforme utilizado aqui, o termo “aproximadamente” refere- se a ± 10 %.
[00216] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e seus conjugados significam “incluindo, mas não se limitando a”.
[00217] O termo “consistindo de” significa “incluindo e limitado a”.
[00218] O termo “consistindo essencialmente de” significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas somente se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada(o).
[00219] Da forma utilizada aqui, a forma singular “um”, “uma” e “o/a” inclui referências de plural a menos que o contexto imponha claramente o contrário. P.ex., o termo “um composto” ou “pelo menos um composto” pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo as misturas deles.
[00220] Ao longo dessa solicitação, várias aplicações do presente pedido de patente de invenção podem estar presentes em formato variado. Deve-se compreender que a descrição no formato variado é simplesmente para conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível do escopo do presente pedido de patente de invenção. Consequentemente, deve-se considerar que a descrição de uma variação deve ter revelado especificamente todas as subvariações possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro daquela variação. P.ex., deve-se considerar que a descrição de uma variação como a de 1 a 6 tenha revelado especificamente subvariações como as de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro daquela variação, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isso se aplica independente da amplitude da variação.
[00221] Sempre que uma variação numérica for indicada aqui, significa que inclui qualquer numeral mencionado (fracionado ou integral) dentro da variação indicada. As frases “variando/varia entre”, uma primeira indica o número e uma segunda indica o número e “variando/varia de” uma primeira indica o número “para” uma segunda indica o número, são utilizadas aqui intercambiavelmente e significam que incluem o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionados ou integrais deles.
[00222] Conforme utilizado aqui, o termo “método” refere-se às maneiras, meios, técnicas e procedimentos para cumprir uma determinada tarefa incluindo, mas não se limitando àquelas maneiras, métodos, técnicas e procedimentos conhecidos ou prontamente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.
[00223] Aprecia-se que determinadas características do presente pedido de patente de invenção, que são, para propósito de esclarecimento, descritas no contexto de aplicações separadas, também possam ser fornecidas em combinação com uma única aplicação. Inversamente, diversas características do presente pedido de patente de invenção, que são, para brevidade, descritas no contexto de uma única aplicação, também podem ser apresentadas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou de forma adequada em qualquer outra aplicação descrita do presente pedido de patente de invenção. Determinadas características descritas no contexto de diversas aplicações não devem ser consideradas características essenciais daquelas aplicações, a menos que a aplicação seja inoperante sem esses elementos.
[00224] Diversas aplicações e aspectos do presente pedido de patente de invenção, conforme descritos acima e reivindicados na seção de reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos exemplos a seguir. EXEMPLOS
[00225] Agora, faz-se referência aos exemplos a seguir que, juntamente com as descrições acima, ilustram algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção de forma não limitante.
[00226] Em geral, a nomenclatura usada no presente e os procedimentos laboratoriais utilizados no presente pedido de patente de invenção incluem técnicas de DNA recombinante, moleculares, bioquímicas e microbiológicas. Essas técnicas são amplamente explicadas na literatura. Veja, p.ex., “Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias conforme os estabelecidos nas Patentes dos EUA Nos 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes IIII Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura de patentes e científica, veja, p.ex., as Patentes dos EUA Nos 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., e Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos foram incorporador para referência como totalmente estabelecido aqui. Outras referências gerais são apresentadas ao longo deste documento. Acredita-se que os procedimentos encontrados nelas sejam bem conhecidos na técnica e são apresentados para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas nelas são incorporadas aqui como referência.
MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA GERAIS
[00227] Extração de RNA - Tecidos cultivados em diversas condições de crescimento (conforme descrito abaixo) foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando Reagente TRIzol da Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) invitrogen (ponto) com/content (ponto)cfm?pageid=469]. Aproximadamente 30-50 mg de tecido foram coletados das amostras. Os tecidos pesados foram triturados utilizando pilão e almofariz em nitrogênio líquido e ressuspensos em 500 μl de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100 μl de clorofórmio foram adicionados seguidos por precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol a 75%. O RNA foi eluído em 30 μl de água livre de RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza como minikit RNeasy da Qiagen de acordo com o protocolo’do fabricante (QIAGEN Inc, CA USA). Para conveniência, cada tipo de tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu uma Identificação da expressão.
[00228] Análise de correlação - foi realizada para genes selecionados de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, nas quais os parâmetros caracterizados (parâmetros medidos de acordo com as Identidades de correlação) foram utilizados como “eixo x” para a correlação com a transcrição do tecido que foi utilizada como “eixo Y”. Para cada gene e parâmetro medido, foi calculado um coeficiente de correlação “R” (utilizando a correlação de Pearson) juntamente com um valor de p para a significância da correlação. Para cada gene e parâmetro medido, foi calculado um coeficiente de correlação “R” (utilizando a correlação de Pearson) juntamente com um valor de p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (R) entre os níveis de uma expressão genética em um determinado tecido e um desempenho fenotípico entre ecotipos/variedade/híbrido for elevado em valor absoluto (entre 0,5-1), há uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão desse gene) e a característica fenotípica (p.ex., melhora da eficiência do uso do nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, rendimento, taxa de crescimento e parâmetros semelhantes). EXEMPLO 1 FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA PARA IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO, O RENDIMENTO E TRAÇOS AGRONÔMICOS IMPORTANTES EM PLANTAS
[00229] Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos cuja suprarregulação de sua expressão pode aumentar a tolerância ao estresse abiótico (ABST), a eficiência do uso de água (WUE), o rendimento, o teor de óleo, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a eficiência do uso do nitrogênio (NUE) e a eficiência do uso de fertilizantes (FUE) de uma planta.
[00230] Todos os conjuntos de dados da sequência de nucleotídeos utilizados aqui foram originados de bases de dados disponíveis publicamente ou a partir da realização do sequenciamento utilizando a tecnologia Solexa (p.ex., Cevada e Sorgo). Dados das sequências de 100 espécies diferentes de plantas foram introduzidos em uma base de dados única, abrangente. Outras informações sobre expressão genética, anotação de proteínas, enzimas e caminhos também foram incorporadas. As maiores bases de dados utilizadas incluem: • Genomas o Genoma de Arabidopsis [Genoma TAIR versão 6 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (ponto) org/)] o Genoma de arroz [IRGSP build 4.0 (Hypertext Transfer Protocol://rgp (ponto) dna (ponto) affrc (ponto) go (ponto) jp/IRGSP/)]. o Choupo [Populus trichocarpa release 1.1 de JGI (assembly release vl.0) (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) genome (ponto) jgi-psf (ponto) org/)] o Brachypodium [JGI 4x assembly, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) brachpodium (ponto) org)] o Soja [DOE-JGI SCP, versão Glyma0 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) phytozome (ponto) net/)] o Uva [Consórcio Público Franco-Italiano para Caracterização do Genoma de Videiras (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) genoscope (ponto) cns (ponto) fr /)] o Mamona [TIGR/J Craig Venter Institute 4x assembly [(Hypertext Transfer Protocol://msc (ponto) jcvi (ponto) org/r_communis] o Sorgo [DOE-JGI SCP, versão Sbil [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) phytozome (ponto) net/)]. o Genoma parcialmente montado de Milho [Hypertext Transfer Protocol://milhosequence (ponto) org/] • Sequências expressas de EST e mRNA foram extraídas das seguintes bases de dados: o Versões GenBank 154, 157, 160, 161, 164, 165, 166 e 168 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/dbEST/) o RefSeq (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/RefSeq/). o TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (ponto) org/). • Bases de dados de proteínas e caminhos o Uniprot [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) uniprot (ponto) org/]. o AraCyc [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (ponto) org/biocyc/index (ponto) jsp]. o ENZYME [Hypertext Transfer Protocol://expasy (ponto) org/enzyme/]. • Conjuntos de dados de microarranjos foram baixados de: o GEO (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) o TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.arabidopsis.org/). o Dados de microarranjos de propriedade exclusiva (WO2008/122980 e Exemplo 2 abaixo). • Informações de QTL e SNPs o Gramene [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) gramene (ponto) org/qtl/]. o Panzea [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) panzea (ponto) org/index (ponto) html].
[00231] Montagem da Base de Dados - foi realizada para construir uma base de dados ampla, rica, anotada, confiável e fácil de analisar compreendendo sequências genômicas de mRNA, ESTs, DNA, publicamente disponíveis, dados de várias culturas, bem como dados de expressão genética, anotação e caminho de proteínas, dados de QTLs e outras informações relevantes.
[00232] O conjunto de bases de dados compreende uma caixa de ferramentas de aprimoramento, estruturação, anotação genético e ferramentas de análise que permitem construir uma base de dados sob medida para cada projeto de descoberta genética. As ferramentas de aprimoramento e estruturação genético(a) permitem detectar confiavelmente variantes reunidas e transcritos antisenso, gerando a compreensão de vários resultados fenotípicos potenciais de um único gene. As capacidades da plataforma “LEADS” da Compugen LTD de analisar o genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade científica [veja, p.ex., "Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 37985; "Splicing of Alu Sequences", Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; “Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information”, Xie H et al. Genomics 2002], e comprovaram ser mais eficientes na genômica vegetal, também.
[00233] Agrupamento de EST e genético - Para o agrupamento genético e o agrupamento de organismos com dados disponíveis da sequência genômica (arabidopsis, arroz, mamona, uva, brachypodium, choupo, soja, sorgo), foi utilizada a versão genômica (GANG) do LEADS. Essa ferramenta permite o agrupamento mais preciso de sequências de ESTs e mRNA no genoma, e prevê a estrutura genética, bem como, eventos alternativos de agrupamento e transcrição antisenso.
[00234] Para organismos sem dados completos de sequência genômica disponíveis, o software de agrupamento “expressed LEADS” foi aplicado.
[00235] Anotação genética - Genes e proteínas previstos foram anotados como segue: A busca de comparação de sequências [Hypertext Transfer Protocol://blast (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] contra todos os UniProt da planta [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) uniprot (ponto) org/] foi realizada. Estruturas de leitura abertas de cada transcrito putativo foram analisadas e o ORF mais longo com o número maior de homólogos foi selecionado como a proteína prevista do transcrito. As proteínas previstas foram analisadas pelo InterPro [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/interpro/].
[00236] A comparação contra proteínas das bases de dados AraCyc e ENZYME foi utilizada para mapear os transcritos previstos com os caminhos da AraCyc.
[00237] As proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas utilizando o algoritmo de comparação [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (dot) cgi] para validar a exatidão da sequência de proteínas prevista, e para a detecção eficiente de ortólogos.
[00238] Perfil da expressão genética - Diversas fontes de dados foram exploradas quanto ao perfil da expressão genética, a saber, dados de microarranjo e perfil de expressão digital (veja abaixo). De acordo com o perfil da expressão genética, uma análise de correlação foi realizada para identificar genes que são corregulados sob diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e associados com diferentes fenótipos.
[00239] Conjuntos de dados de microarranjos disponíveis publicamente foram baixados dos sites TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados na base de dados. O perfil de expressão é um dos mais importantes dados de recursos para identificar genes importantes para ABST, aumento do rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, WUE, NUE e FUE de uma planta.
[00240] Um resumo digital do perfil de expressão foi compilado para cada agrupamento de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros da sequência compreendendo o agrupamento. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe o perfil virtual da expressão com base nas sequências EST que formam o agrupamento genético. A ferramenta apresenta o perfil da expressão de um agrupamento em termos de anatomia da planta (p.ex., o tecido/órgão no qual o gene é expresso), o estágio desenvolvimental (os estágios desenvolvimentais nos quais um gene pode ser encontrado) e o perfil de tratamento (apresenta as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso, como seca, frio, infecção por patógeno, etc.). Dada a distribuição aleatória de ESTs nos diferentes agrupamentos, a expressão digital apresenta um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um agrupamento apresentar um total de N ESTs para conter X ESTs de uma determinada coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, leva-se em consideração o seguinte: a) o número de ESTs no agrupamento, b) o número de ESTs das bibliotecas envolvidas e relacionadas, c) o número geral de ESTs disponíveis representando a espécie. Desse modo, agrupamentos com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse indicando uma expressão especializada.
[00241] Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) na: XVII Conferência de Genomas Vegetais e Animais, San Diego, CA. A análise transcriptômica baseada na abundância relativa de ESTs nos dados foi realizada pelo pirosequenciamento 454 de cDNA representando o mRNA do melão. Quatorze amostras de cDNA de fita dupla obtidas de dois genótipos, dois tecidos de frutas (polpa e casca) e quatro estágios desenvolvimentais foram sequenciados. O pirosequenciamento por GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não-normalizadas e purificadas renderam 1.150.657 etiquetas de sequências expressas (ESTs) que se agruparam em 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 contigs). A análise dos dados obtidos contra a Base de Dados Genômica de Cucurbitáceas [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) icugi (ponto) org/] confirmou a exatidão do sequenciamento e do agrupamento. Padrões de expressão de genes selecionados se encaixaram bem em seus dados de qRT- PCR. EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE TOMATE E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO UTILIZANDO O MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS 44K DE TOMATE
[00242] A fim de produzir uma análise de correlação de alto rendimento entre os fenótipos relacionados à NUE e a expressão genética, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de Tomate, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa aproximadamente 44.000 genes e transcritos do Tomate. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento de NUE, ABST ou parâmetros relacionados ao vigor, várias características da planta de 18 variedades diferentes de Tomate foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades abrangendo a variação observada foram selecionadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00243] Correlação de variedades de tomate entre ecotipos cultivados sob condições de 50% de irrigação Procedimentos experimentais
[00244] Procedimento de cultivo - A variedade de Tomate foi cultivada sob condições normais (4-6 Litros/m2 por dia) até o estágio de florescimento. Nessa época, a irrigação foi reduzida para 50% em comparação com as condições normais.
[00245] Extração de RNA - Dois tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [flor e folha], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Por conveniência, cada tipo de tecido com informação de expressão de microarranjo recebeu uma ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 Conjuntos de expressão do transcriptoma do Tomate
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Tabela 1: São apresentadas as letras de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão do tomate.
[00246] Componentes do rendimento do tomate e os parâmetros relacionados ao vigor sob avaliação a 50% de irrigação com água - 10 variedades de Tomate em 3 blocos repetitivos (denominados A, B e C,), cada um contendo 6 plantas por lote foram cultivadas em estufa com rede. As plantas foram fenotipadas diariamente seguindo o descritor padrão de cevada (Tabela 2, abaixo). A colheita foi realizada quando 50% dos frutos estavam vermelhos (maduros). As plantas foram separadas em parte vegetal e frutos, destas, 2 nodos foram analisados quanto aos parâmetros de inflorescência adicionais como o tamanho, o número de flores e o peso da inflorescência. O peso fresco de todo o material vegetal foi mensurado. Os frutos foram separados de acordo com as cores (vermelho vs. green) Verde) e de acordo com o tamanho (pequeno, médio e grande). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o programa de análise estatística JMP (SAS Institute).
[00247] Os parâmetros dos dados coletados estão resumidos na Tabela 2 abaixo. Tabela 2 Parâmetros correlacionados do Tomate (vetores)
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Tabela 2. São apresentados os parâmetros correlacionados ao tomate. “gr.” = gramas; “SPAD” = níveis de clorofila;
[00248] Peso do Fruto (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)] todos os frutos dos lotes dentro dos blocos A-C foram colhidos. O total de frutos foi contado e pesado. O peso médio dos frutos foi calculado dividindo o peso total dos frutos pelo número de frutos.
[00249] Peso da parte vegetativa da planta (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)] todos os frutos dos lotes dentro dos blocos A-C foram colhidos. O peso fresco foi medido (gramas).
[00250] Peso da Inflorescência (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)] duas Inflorescências dos lotes dentro dos blocos A-C foram colhidas. O peso da inflorescência (gr.) e o número de flores por inflorescência foram contados.
[00251] SPAD - O teor de clorofila foi determinado com um medidor de clorofila SPAD 502 Minolta e a medição foi realizada na época da floração. As leituras do medidor SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas foram feitas por folha por parcela.
[00252] Eficiência do uso de água (WUE - pode ser determinada como a biomassa gerada por unidade transpiração. Para analisar a WUE, o teor de água relativo da folha foi medido em plantas de controle e transgênicas. O peso fresco (FW) foi imediatamente registrado; então, as folhas foram molhadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente, no escuro, e o peso túrgido (TW) foi registrado. O peso seco (DW) total foi registrado depois da secagem das folhas a 60 °C a um peso constante. O teor relativo de água (RWC) foi calculado de acordo com a seguinte Fórmula I [(FW - DW/TW - DW) x 100] conforme descrito acima.
[00253] As plantas que mantêm um teor relativo de água (RWC) elevado em comparação com as linhas de controle foram consideradas mais tolerantes à seca do que aquelas que apresentaram um teor relativo de água reduzido Resultados experimentais
[00254] 10 variedades diferentes de Tomate foram cultivadas e caracterizadas quanto a 27 parâmetros conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando-se o programa JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 3, 4 e 5 abaixo. Foi realizada a análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptomas (Tabela 1) e os parâmetros médios foram calculados e os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 3 Acessos do tomate, parâmetros medidos
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Tabela 3: São apresentados os componentes do rendimento medidos e os parâmetros relacionados ao vigor sob 50% de irrigação com água para os acessos de tomate (Variedades) de acordo com os números de Identificação da Correlação (descritos na Tabela 2 acima), como segue: 2 [50% de Irrigação; Frutos por planta (gr.)]; 10 [Irrigação Normal; Frutos por planta (gr.)]; 1 [50% de Irrigação; Peso fresco da parte vegetativa (gr.)]; 9 [Irrigação Normal; peso fresco da parte vegetativa (gr.)]; 7 [50% de Irrigação; peso médio do fruto maduro (gr.)]; 15 [Irrigação Normal; Peso médio do fruto maduro (gr.)]; 18 [50% de Irrigação; Frutos por planta (gr.)/Irrigação Normal; Frutos por planta (gr.)]; 17 [50% de Irrigação; Peso fresco da parte vegetativa (gr.)/Irrigação Normal; peso fresco da parte vegetativa (gr.)]. Tabela 4 Acessos de tomate, parâmetros adicionais medidos
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Tabela 4: São apresentados os componentes do rendimento medidos e os parâmetros relacionados ao vigor sob 50% de irrigação com água para os acessos do tomate (Variedades) de acordo com os números de Identificação da Correlação (Corr.) (descritos na Tabela 2 acima), como segue: 22 [50% de Irrigação; Peso médio do fruto maduro (gr.)/Irrigação Normal; Peso médio do fruto maduro (gr.)]; 8 [50% de Irrigação: SPAD]; 16 [Irrigação Normal; SPAD]; 5 [50% de Irrigação; eficiência relativa do uso de Água]; 13 [Irrigação Normal; eficiência relativa do uso de Água]; 23 [50% de Irrigação: SPAD/ Irrigação Normal; SPAD]. Tabela 5 Acessos de tomate, parâmetros adicionais medidos
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Tabela 5: São apresentados os componentes do rendimento medidos e os parâmetros relacionados ao vigor sob 50% de irrigação com água para os acessos do tomate (Variedades) de acordo com os números de Identificação da Correlação (Corr.) (descritos na Tabela 2 acima), como segue: 21 [50% de Irrigação; eficiência relativa do uso de Água/Irrigação Normal; eficiência do uso de Água]; 4 [50% de Irrigação; número de flores]; 12 [Irrigação Normal; número de flores]; 3 [50% de Irrigação; Peso da inflorescência (gr.)]; 11 [Irrigação Normal; Peso da inflorescência (gr.)]; 20 [50% de Irrigação; número de flores/ Irrigação Normal; número de flores]; 19 [50% de Irrigação; Peso da inflorescência (gr.)/Irrigação Normal; Peso da inflorescência (gr.)].
[00255] Correlação de traços de vigor prematuro entre a colheita de ecotipos de TOMATE sob concentração de salinidade elevada - Dez variedade de Tomate foram cultivadas em 3 lotes repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa com rede sob condições semi- hidropônicas. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: As sementes de tomate foram colocadas em bandejas preenchidas com uma mistura de vermiculita e turfa em uma relação de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas para a solução com alto teor de salinidade a 100 mM de NaCl ou para a solução de cultivo normal [Hogland com potência total; KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2 PO4 - 0,172 gramas/litro e 0,01 % (volume/volume) de microelementos ‘Super coratin' (Ferro-EDDHA [etilenodiamina-N,N'-bis(ácido 2- hidroxifenilacético)]- 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro; e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução’deve ser de 6,5 - 6,8].
[00256] Extração de RNA - Todas as 10 variedades de Tomate selecionadas foram amostradas por cada tratamento. Dois tecidos [folhas e flores] cultivados a 50% de irrigação ou sob condições Normais foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Tabela 6 Conjuntos experimentais de transcriptoma de tomate
Figure img0006
Tabela 6. São apresentados os conjuntos experimentais de transcriptoma de tomate Q-T.
[00257] Parâmetros relacionados ao vigor do tomate sob 100 mM de NaCl - após 5 semanas de cultivo, as plantas foram colhidas e analisadas quanto ao número de folhas, à altura da planta e ao peso da planta. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o programa de análise estatística JMP (SAS Institute).
[00258] Os parâmetros dos dados coletados estão resumidos na Tabela 7 abaixo. Tabela 7 Parâmetros correlacionados do Tomate (vetores)
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Tabela 7. São apresentados os parâmetros correlacionados do tomate (Números de Identificação 17). Resultados experimentais
[00259] 10 variedades diferentes de Tomate foram cultivadas e caracterizadas quanto a 3 parâmetros conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos na Tabela 8 abaixo. Foi realizada a análise da correlação entre os vários conjuntos de transcriptomas (Tabela 6) e dos parâmetros médios. A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 8 Acessos do tomate, parâmetros medidos
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Tabela 8. São apresentados os parâmetros relacionados ao vigor medidos sob 100 mM de NaCl para os acessos do tomate (Variedades) de acordo com os números de Identificação da Correlação (Corr.) (descritos na Tabela 7 acima), como segue: 24 [100 mM de NaCl: Número de folhas]; 27 [Normal: Número de folhas]; 25 [100 mM de NaCl: Altura da planta]; 28 [Normal: Altura da planta]; 26 [100 mM de NaCl: Biomassa da planta]; 29 [100 mM de NaCl: Número de folhas/Normal: Número de folhas]; 30 [100 mM de NaCl: Altura da planta/Normal: Altura da planta]. Tabela 9 Análise da correlação entre o nível de expressão de Genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais ou de seca
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Tabela 9. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabelas 2 e 7 acima. Tabela 10 Análise da correlação entre o nível de expressão dos genes Ortólogos selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais ou de seca
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Tabela 10. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabelas 2 e 7 acima. EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO UTILIZANDO O MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS 44K DE SORGO
[00260] A fim de produzir uma análise de correlação de alto rendimento, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de Sorgo, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa aproximadamente 44.000 genes e transcritos do Sorgo. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento de ABST ou parâmetros relacionados ao vigor, várias características da planta de 17 variedades diferentes de sorgo foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades abrangendo a variação observada foram selecionadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00261] Correlação das variedades de Sorgo entre os ecotipos cultivados sob condições de seca severa. Procedimentos experimentais
[00262] 17 Variedades de sorgo foram cultivadas em três parcelas repetidas, em campo. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: as sementes de sorgo foram plantadas no solo e cultivadas sob condição normal até aproximadamente 35 dias do plantio, por volta de V8 (Última folha visível, mas inda enrolada, espiga começando a avolumar-se). Neste ponto, a irrigação foi interrompida, e o estresse hídrico severo desenvolveu-se. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com NUE, seca e componentes de rendimento ou parâmetros relacionados ao vigor, foram analisadas as 17 variedades diferentes de sorgo. Dentre elas, 10 variedades abrangendo a variação observada foram selecionadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00263] Extração de RNA - Todas as 10 variedades de Sorgo selecionadas foram amostradas para cada tratamento. Os tecidos da planta [Folha bandeira e meristema Floral] cultivados sob estresse causado pela seca severa e plantas cultivadas sob condições Normais foram amostradas e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Por conveniência, cada tipo de tecido com informação de expressão de microarranjo recebeu uma ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 11 abaixo. Os parâmetros dos dados coletados estão resumidos na Tabela 12 abaixo. Tabela 11 Conjuntos experimentais de transcriptomas de Sorgo
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Tabela 11: São apresentados os conjuntos experimentais U-Z de transcriptomas de sorgo.
[00264] Os parâmetros dos dados coletados estão resumidos na Tabela 12 abaixo. Tabela 12 Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)
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Tabela 12. Apresenta-se os parâmetros correlacionados do Sorgo (vetores). “DW” = Peso Seco; (5I)” = Média de cinco Inflorescências; “FW” = Peso Fresco; “gr.” = gramas; “cm” = centímetro; “SPAD” = Níveis de clorofila; “TP1” = X dias após a semeadura; “TP2” = X dias após a semeadura; “TP3” = X dias após a semeadura; “TP4” = X dias após a semeadura; “TP5” = X dias após a semeadura; “TP6” = X dias após a semeadura.
[00265] Grãos por Planta (gr.) - No final do experimento (A inflorescência estava seca) todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-C foram colhidas. 5 A inflorescência foi debulhada separadamente e os grãos foram pesados, todas as inflorescências adicionais foram debulhadas e pesadas juntas. O peso médio por inflorescência foi calculado dividindo-se o peso total dos grãos pelo número de influorescências totais por lote, ou no caso de 5 inflorescências, por peso pelo número total de grãos por 5.
[00266] Altura da planta - A planta foi caracterizada quanto à altura durante o período de cultivo em 6 pontos de tempo. Em cada medição, as plantas foram mensuradas quanto à sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida do nível do solo ao topo da maior folha.
[00267] Peso da Inflorescência (gr.) - No final do experimento (quando a inflorescência estava seca) cinco inflorescências dos lotes dentro dos blocos A-C foram colhidas. A inflorescência foi pesada (gr.).
[00268] SPAD - O teor de clorofila foi determinado com um medidor de clorofila SPAD 502 Minolta e a medição foi realizada na época da floração. As leituras do medidor SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas foram feitas por folha por parcela.
[00269] Peso seco da parte vegetative e inflorescência - No final do experimento (quando a inflorescência estava seca) todo o material da inflorescência e da parte vegetativa dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado. A biomassa e o peso da inflorescência de cada parcela foram separados, medidos e divididos pelo número de inflorescência. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (excluindo as raízes), após secagem a 70°C ao forno por 48 horas; Índice de Colheita (para sorgo) - O índice de colheita é calculado utilizando a Fórmula V. Fórmula V: Índice de Colheita = Peso seco médio do grão por Inflorescência/(Peso seco médio da parte vegetativa por Inflorescência + Peso seco médio da Inflorescência Resultados experimentais
[00270] 16 variedades diferentes de sorgo foram cultivadas e caracterizadas quanto a 49 parâmetros conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos na Tabela 13 abaixo. Foi realizada a análise da correlação entre os vários conjuntos de transcriptomas (Tabela 11) e dos parâmetros médios. A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 13 Acessos de sorgo, parâmetros medidos
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Tabela 13: Apresenta-se os parâmetros medidos sob condições de 50% de irrigação de acessos do Sorgo (Identificação da Semente) de acordo com os números de Identificação de Correlação (descritos na Tabela 12 acima), como segue: 1 [DW Seca (gr.)]; 2 [W(5I) Seca (gr.)]; 3 [FW Inflorescência(5I) Seca (gr.)]; 4 [DW Inflorescência (5I) Seca (gr.)]; 5 [Grãos por Inflorescência Seca (gr.)]; 6 [Grãos por Inflorescência(5I) Seca (gr.)]; 7 [SPAD Seca]; 8 [Índice de Colheita Seca. Tabela 14 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos adicionais
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Tabela 14: Apresenta-se os parâmetros medidos sob condições de 50% de irrigação de acessos do Sorgo (Identificação da Semente) de acordo com os números de Identificação de Correlação (descritos na Tabela 12 acima), como segue: 9 [Folha TP1 Seca]; 10 [Folha TP2 Seca]; 11 [Folha TP3 Seca]; 12 [Folha TP4 Seca]; 13 [Folha TP5 Seca]; 14 [Folha TP6 Seca]; 15 [Altura da Planta TP2 Seca (cm)]; 16 [Altura da Planta TP3 Seca (cm)]. Tabela 15 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos adicionais
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Tabela 15: Apresenta-se os parâmetros medidos sob condições de 50% de irrigação de acessos do Sorgo (Identificação da Semente) de acordo com os números de Identificação de Correlação (descritos na Tabela 12 acima), como segue: 17 [Altura da Planta TP4 Seca (cm)]; 18 [Altura da Planta TP5 Seca (cm)]; 19 [Altura da Planta TP6 Seca (cm)]; 20 [DW Normal (gr.)]; 21 [DW (5I) Normal (gr.)]; 22 [FW Inflorescência(5I) Normal (gr.)]; 23 [DW Inflorescência(5I) Normal (gr.)]; 24 [Grãos por Planta Normal (gr.)]. Tabela 16 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos adicionais
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Tabela 16: Apresenta-se os parâmetros medidos sob condições de 50% de irrigação de acessos do Sorgo (Identificação da Semente) de acordo com os números de Identificação de Correlação (descritos na Tabela 12 acima), como segue: 25 [Grãos por Planta (5I) Normal (gr.)]; 26 [SPAD Normal]; 27 [Índice de Colheita Normal]; 28 [Folha TP1 Normal]; 29 [Folha TP2 Normal]; 30 [Folha TP3 Normal]; 31 [Folha TP4 Normal]; 32 [Folha TP5 Normal]. Tabela 17 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos adicionais
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Tabela 17: Apresenta-se os parâmetros medidos sob condições de 50% de irrigação de acessos do Sorgo (Identificação da Semente) de acordo com os números de Identificação de Correlação (descritos na Tabela 12 acima), como segue: 33 [Folha TP6 Normal]; 34 [Altura da Planta TP2 Normal (cm)]; 35 [Altura da Planta TP3 Normal (cm)]; 36 [Altura da Planta TP4 Normal (cm)]; 37 [Altura da Planta TP5 Normal (cm)]; 38 [Altura da Planta TP6 Normal (cm)]; 39 [DW Seca/Normal (gr.)]; 40 [Grãos por Planta Seca/Normal (gr.)]. Tabela 18 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos adicionais
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Tabela 18: Apresenta-se os parâmetros medidos sob condições de 50% de irrigação de acessos do Sorgo (Identificação da Semente) de acordo com os números de Identificação de Correlação (descritos na Tabela 12 acima), como segue: 41 [SPAD Seca/Normal]; 42 [Índice de Colheita Seca/Normal]; 43 [FW(5I) Seca/Normal (gr.)]; 44 [DW(5I) Seca/Normal (gr.)]; 45 [Grãos por Planta (5I) Seca/Normal (gr.)]; 46 [Altura da Planta TP5 Seca/Normal (cm)]; 47 [Folha TP5 Seca/Normal].
[00271] Parâmetros relacionados ao vigor do sorgo sob 100 mM de NaCl e baixa temperatura (8-10 °C) - Dez variedades de Sorgo foram cultivadas em 3 lotes repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa com rede sob condições semi-hidropônicas. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: As sementes de sorgo foram colocadas em bandejas contendo uma mistura de vermiculita e turfa em uma relação de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas para a solução com alto teor de salinidade (100 mM de NaCl), baixa temperatura (8-10 °C) ou solução de crescimento Normal [Hogland com potência total; KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2 PO4 - 0,172 gramas/litro e 0,01 % (volume/volume) de microelementos ‘Super coratin' (Ferro-EDDHA [etilenodiamina-N,N'-bis(ácido 2-hidroxifenilacético)]- 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro; e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução’deve ser de 6,5 - 6,8].
[00272] Extração de RNA - Todas as 10 variedades de Sorgo selecionadas foram amostradas para cada tratamento. Dois tecidos[folhas e raízes] cultivados a 100 mM de NaCl, baixa temperatura (8-10 °C) ou sob condições Normais foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Tabela 19 Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)
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Tabela 19: apresenta-se os parâmetros correlacionados do Sorgo (vetores). Resultados experimentais
[00273] 10 variedades diferentes de Sorgo foram cultivadas e caracterizadas quanto a 25 parâmetros conforme descrito acima (Tabela 19). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos na Tabela 20-22 abaixo. Foi realizada a análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptomas (Tabela 11) e os parâmetros médios (Tabelas 20-22) (Tabelas 23 e 24). A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 20 Acessos de sorgo, parâmetros medidos
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Tabela 20: São apresentados os parâmetros medidos sob condições de 100 mM de NaCl e baixa temperatura (8-10 °C) de acessos de Sorgo (Identificação da Semente) de acordo com os números de Identificação de Correlação (descritos na Tabela 19 acima), como segue: 48 [100 mM de NaCl: Número de folhas]; 51 [100 mM de NaCl: Raiz DW]; 50 [100 mM de NaCl: Broto DW]; 52 [100 mM de NaCl: SPAD]; 49 [100 mM de NaCl: Altura da Planta]; 53 [baixa temperatura: Número de folhas]; 56 [baixa temperatura: Raiz DW]. Tabela 21 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos adicionais
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Tabela 21: São apresentados os parâmetros medidos sob condições de 100 mM de NaCl e baixa temperatura (8-10 °C) de acessos de Sorgo (Identificação da Semente) de acordo com os números de Identificação de Correlação (descritos na Tabela 19 acima), como segue: 55 [baixa temperatura: Broto DW]; 57 [baixa temperatura: SPAD]; 54 [baixa temperatura: Altura da planta]; 58 [Normal: Número de folhas]; 59 [Normal: Altura da planta]; 61 [Normal: Raiz DW]; 60 [Normal: Broto DW]. Tabela 22 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos adicionais
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Tabela 22: São apresentados os parâmetros medidos sob condições de 100 mM de NaCl e baixa temperatura (8-10 °C) de acessos de Sorgo (Identificação da Semente) de acordo com os números de Identificação de Correlação (descritos na Tabela 19 acima), como segue: 66 [Raiz DW 100 mM de NaCl/Normal]; 71 [Raiz DW baixa temperatura /Normal]; 70 [Broto DW baixa temperatura /Normal]; 67 [SPAD 100 mM de NaCl/Normal]; 72 [SPAD baixa temperatura /Normal].
[00274] As Tabelas 23 e 24 abaixo, apresentam a análise de correlação entre os parâmetros caracterizados (conforme descrito acima nos Exemplos 2 e 3) e o transcriptoma tecidual. Tabela 23 Análise da correlação entre o nível de expressão de Genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais ou de seca
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Tabela 23. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela Tabela 24 Análise da correlação entre o nível de expressão dos genes Ortólogos selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais ou de seca
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Tabela 24. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela acima. EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA TRANSFERÊNCIA COM PARÂMETROS RELACIONADOS AO RENDIMENTO E NUE UTILIZANDO 44K MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO
[00275] No intuito de produzir uma análise de correlação de alta transferência entre o fenótipo da planta e o nível de expressão de genes, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa aproximadamente 44.000 genes e transcritos do milho. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA com e componentes NUE e de rendimento ou parâmetros relacionados com o vigor, foram analisadas diversas características de plantas de 12 híbridos diferentes de milho. Dentre eles, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00276] Correlação de híbridos de Milho entre ecotipos cultivados mediante condições de crescimento regulares Procedimentos experimentais
[00277] Foram cultivados 12 híbridos de Milho em 3 parcelas repetidas, em campo. As sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas em campo utilizando protocolos comerciais de fertilização e de irrigação. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento e NUE ou parâmetros relacionados com o vigor, foram analisados os 12 híbridos diferentes de milho. Dentre eles, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00278] Tecidos de Sorgo analisados - Todos os 10 híbridos de milho selecionados foram amostrados para cada tratamento. Foram amostrados tecidos vegetais [Folha Bandeira, Meristema de Flor, Grãos, Sabugos, Internódios] crescendo em condições Normais e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu um Conjunto de ID, conforme resumido na Tabela 25 abaixo. Tabela 25 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho
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Tabela 25: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho. Folha = a folha abaixo da espiga principal; Meristema da flor = Meristema apical seguido da iniciação da flor masculina; Espiga = a flor feminina no dia da antese. Grão Distal = milho desenvolvendo grãos a partir da área extrema do sabugo; Grão Basal = milho desenvolvendo grãos a partir da área basal do sabugo; Internódios = internódio localizados acima e abaixo da espiga principal na planta.
[00279] Os seguintes parâmetros foram coletados por meio do sistema digital de imagem: Área de Grãos (cm2) - Ao final do período de crescimento os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~ 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área dos grãos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00280] Comprimento dos Grãos e Largura dos Grãos (cm) - Ao final do período de crescimento os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~ 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos/ou largura (maior eixo) dos grãos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00281] Área da Espiga (cm2) - Ao final do período de crescimento 5 espigas foram fotografadas, e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da Espiga foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00282] Comprimento da Espiga e Largura da Espiga (cm) - Ao final do período de crescimento 5 espigas foram fotografadas, e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento da Espiga e a largura (eixo maior) foram medidos a partir dessas imagens e foram divididos pelo número de espigas.
[00283] Foi utilizado o sistema de processamento de imagem, o qual consiste de um computador desktop pessoal (Intel P4 com processador de 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e está disponibilizado livremente na Internet, em Hypertext Transfer Protocol:// rsbweb (ponto) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas na resolução de 10 megapixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato de baixa compressão JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados de saída do processamento de imagem para a área das sementes e para o comprimento das sementes foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o programa de análise estatística JMP (SAS Institute).
[00284] Parâmetros adicionais foram coletados tanto por amostragem de 6 plantas por parcela quanto pela medição do parâmetro através de todas as plantas dentro da parcela.
[00285] Peso Normalizado dos Grãos por planta (gr.) - Ao final do experimento todas as espigas das parcelas dentro dos blocos de A a C foram coletadas. Foram debulhadas separadamente 6 espigas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas em conjunto e pesadas também. O peso médio de grãos por espiga foi calculado dividindo o peso total de grãos pelo número total de espigas por parcela (com base na parcela). Em caso de 6 espigas, o peso total dos grãos de 6 espigas foi dividido por 6.
[00286] PF da Espiga (gr.) - Ao final do experimento (quando as espigas foram colhidas) todas e as 6 espigas selecionadas por parcelas dentro dos blocos de A a C foram coletadas separadamente. As plantas com (todas e as 6) foram pesadas (gr.) separadamente e a média de espigas por planta foi calculada para todas (PF da Espiga por parcela) e para as 6 (PF da Espiga por planta).
[00287] Altura da planta e Altura da espiga - As plantas foram caracterizadas em relação a sua altura durante a colheita. Em cada medida, 6 plantas foram medidas em relação a sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo do pendão. A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo ao local onde a espiga principal está localizada.
[00288] Número de folhas por planta - As plantas foram caracterizadas em relação ao número de folhas durante o período de crescimento em 5 pontos no tempo. Em cada medida, as plantas foram medidas em relação ao seu número de folhas, contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por parcela.
[00289] A Taxa de Crescimento Relativo foi calculada utilizando a Fórmula II (descrita acima): SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas foram feitas por folha por parcela. Os dados foram tomadas após 46 e 54 dias pós semeadura (DPS) Peso seco por planta - Ao final do experimento (quando a Inflorescência foi seca) todo o material vegetativo das parcelas dentro dos blocos de A a C foi coletado.
[00290] Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (excluindo as raízes), após secagem a 70 °C ao forno por 48 horas; Índice de colheita (IC) (Milho) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Formula XII. Fórmula VI: Índice de Colheita = Peso médio de grãos secos por Espiga/(Peso seco vegetativo médio por Espiga + Peso seco médio da Espiga) Porcentagem de Preenchimento da Espiga [%] - foi calculado como a porcentagem da área da Espiga com grãos fora da espiga toda.
[00291] Diâmetro do sabugo [cm] - O diâmetro do sabugo sem os grãos foi medido utilizando uma régua.
[00292] Número de Fileiras de Grãos por Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado. Resultados experimentais
[00293] Foram cultivados 12 híbridos de milho diferentes e os mesmos foram caracterizados em diferentes parâmetros: A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o programa JMP (Tabelas 27-88) e foi realizada uma análise de correlação subsequente (Tabelas 29-30). Os resultados foram então integrados ao banco de dados. Tabela 26 Parâmetros correlacionados ao milho (vetores).
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Tabela 26. SPAD 46DPS e SPAD 54DPS: Nível de Clorofila após 46 e 54 dias pós semeadura (DPS). Tabela 27 Parâmetros medidos em acessos de Milho mediante condições normais
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Tabela 27. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de milho (Identificação da Semente) sob condições de cultivo regulares. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimentos experimentais. Tabela 28 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Milho mediante condições de crescimento regular
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Tabela 28. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de milho (Identificação da Semente) sob condições de cultivo regulares. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimentos experimentais. Tabela 29 Petição 870190072313, de 29/07/2019, pág. 106/869 98 / 422 Correlação entre o nível de expressão de Genes selecionados de algumas configurações do presente pedido de patente de invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico mediante condições normais através de acessos de milho
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Tabela 29. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela acima. Tabela 30 Correlação entre o nível de expressão de genes homólogos ABST selecionados de algumas configurações do presente pedido de patente de invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico mediante condições normais através de acessos de milho
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Tabela 30. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela acima. EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO UTILIZANDO O MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS 44K DE CEVADA
[00294] No intuito de produzir uma análise de correlação de alta transferência entre o fenótipo da planta e o nível de expressão de genes, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de cevada, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa aproximadamente 47.500 genes e transcritos da Cevada. A fim de definir a correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao rendimento ou ao vigor, várias características vegetais de 25 acessos diferentes de Cevada foram analisados. Dentre elas, 13 acessos abrangendo a variação observada foram selecionadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos experimentais
[00295] Tecidos de Cevada analisados - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [meristema, flor, início da espiga, caule, folha bandeira], representando diferentes características vegetais, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu um Conjunto de ID, conforme resumido na Tabela 31 abaixo. Tabela 31 Conjuntos de expressão de transcriptoma da cevada
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Tabela 31.
[00296] Componentes de rendimento da cevada e avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor - Foram cultivados em uma estufa de tela 25 acessos de Cevada em 4 blocos repetidos (denominados A, B, C e D), cada um contendo 4 plantas por parcela. As plantas foram fenotipadas diariamente seguindo o descritor padrão de cevada (Tabela 32, abaixo). Foi realizada a colheita quando 50% das espigas estavam secas para evitar a liberação espontânea das sementes. As plantas foram separadas quanto a parte vegetativa e as espigas, dentre elas, cinco espigas foram debulhadas (os grãos foram separados das glumas) para uma análise adicional dos grãos, tal como a medição do tamanho, a contagem de grãos por espiga e o rendimento de grãos por espiga. Todo o material foi secado em estufa e as sementes foram debulhadas manualmente das espigas antes da medição das características das sementes (peso e tamanho) utilizando análise de varredura e imagem. O sistema de análise de imagem inclui um computador desktop pessoal (Intel P4 com processador de 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e está disponibilizado livremente na Internet, em Hypertext Transfer Protocol:// rsbweb (ponto) nih (dot) gov/. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o programa de análise estatística JMP (SAS Institute). Tabela 32 Descritores padrão da Cevada
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Tabela 32.
[00297] Grãos por espiga - Ao final do experimento (50% das espigas foram secas) todas as espigas das parcelas dentro dos blocos de A a D foram coletadas. O número total de grãos das 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi contado. A média de grãos por espiga é calculada dividindo o número total de grãos pelo número de espigas.
[00298] Tamanho médio dos grãos (cm) - Ao final do experimento (50% das espigas foram secas) todas as espigas das parcelas dentro dos blocos de A a D foram coletadas. O número total de grãos das 5 espigas, que foram debulhadas manualmente, foi escaneado e as imagens foram analisadas utilizando o sistema de imagem digital. A varredura do grão foi realizada utilizando um scanner Brother (modelo DCP-135), a uma resolução de 200 dpi e analisada com o software Image J. O tamanho médio do grão foi calculado dividindo-se o tamanho total do grão pelo número total de grãos.
[00299] Peso médio dos grãos (mgr) - Ao final do experimento (50% das espigas foram secas) todas as espigas das parcelas dentro dos blocos de A a D foram coletadas. O número total de grãos das 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi contado e pesado. O peso médio foi calculado dividindo-se o peso total pelo número total de grãos.
[00300] Rendimento de grãos por espiga (gr) - Ao final do experimento (50% das espigas foram secas) todas as espigas das parcelas dentro dos blocos de A a D foram coletadas. O número total de grãos das 5 espigas que foram debulhadas manualmente foi pesado. O rendimento de grãos foi calculado dividindo-se o peso total pelo número de espigas.
[00301] Análise de comprimento da espiga - Ao final do experimento (50% das espigas foram secas) todas as espigas das parcelas dentro dos blocos de A a D foram coletadas. As cinco espigas escolhidas por planta foram medidas através de fita métrica excluindo as aristas.
[00302] Análise de número de espigas - Ao final do experimento (50% das espigas foram secas) todas as espigas das parcelas dentro dos blocos de A a D foram coletadas. As espigas foram contadas por planta.
[00303] Pontuação de hábito de crescimento - No estágio de crescimento 10 (emborrachamento), cada uma das plantas obteve sua pontuação com base em sua natureza de hábito de crescimento. A escala utilizada foi de 1 para natureza de próstata até 9 para ereto.
[00304] Pilosidade das folhas basais - No estágio de crescimento 5 (com a bainha da folha firmemente ereta; ao final do perfilhamento), cada uma das plantas obteve sua pontuação com base em sua natureza de pilosidade da folha antes da última. A escala utilizada foi de 1 para natureza de próstata até 9 para ereto.
[00305] Altura da planta - No estágio de colheita (50% das espigas foram secas) cada uma das plantas teve sua altura medida através de fita métrica. A altura foi medida do nível do solo até o topo da espiga mais longa excluindo as aristas.
[00306] Dias para a floração - Cada uma das plantas foi monitorada em relação a data de floração. Os dias de floração foram calculados a partir da data de semeadura até a data de floração.
[00307] Pigmentação do caule - No estágio de crescimento 10 (emborrachamento), cada uma das plantas obteve sua pontuação com base em sua cor do caule. A escala utilizada foi 1 para verde até 5 para roxo por completo.
[00308] Peso seco vegetativo e rendimento da espiga - Ao final do experimento (50% das espigas foram secas) foram coletados todas as espigas e o material vegetativo das parcelas dentro dos blocos de A a D. O peso da biomassa e da espiga de cada parcela foi separado, medido e dividido pelo número de plantas. A biomassa e o peso das sementes de cada parcela foi separado, medido e dividido pelo número de plantas.
[00309] Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (excluindo as raízes), após secagem a 70 °C ao forno por 48 horas; Rendimento da espiga por planta = peso total da espiga por planta (gr) depois da secagem a 30 °C em forno por 48 horas.
[00310] Índice de colheita (para a cevada) - O índice de colheita é calculado utilizando a Formula VIII.
[00311] Formula XVI: Índice de Colheita = Peso médio da espiga seca por planta/(Peso seco vegetativo médio por planta + Peso seco médio da espiga por planta) Tabela 33 Parâmetros correlacionados a cevada (vetores)
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Tabela 33. Resultados experimentais
[00312] Foram cultivados 13 acessos diferentes de cevada e os mesmos foram caracterizados por 13 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando-se o programa JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 34 e 35 abaixo. Foi realizada uma análise de correlação posterior entre os diversos conjuntos de transcriptoma (Tabela 31) e os parâmetros de média (Tabelas 36 e 37). A seguir, os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 34 Parâmetros medidos de Ids de correlação em acessos de Cevada
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Tabela 34. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em acessos de Cevada, de acordo com as seguintes identificações de correlação (Ids de Correlação): 6 = Espigas por planta; 10 = Dias para a floração; 3 = Peso dos grãos; 5 = Comprimento da espiga; 2 = Tamanho dos grãos; 1 = Grãos por espiga; 7 = Hábito do crescimento. Tabela 35 Acessos de cevada, parâmetros adicionais medidos
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[00313] Tabela 35. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em acessos de Cevada, de acordo com as seguintes identificações de correlação (Ids de Correlação): 8 = Pilosidade de folhas basais, 9 = Altura da planta; 4 = Rendimento de grãos por espiga; 11 = Pigmentação do caule, 12 = Peso seco vegetativo, 13 = Índice de Colheita. Tabela 36 Correlação entre o nível de expressão de Genes selecionados de algumas configurações do presente pedido de patente de invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico mediante condições normais através de acessos de cevada
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Tabela 36. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela Tabela 37 Correlação entre o nível de expressão de genes ortólogos selecionados de algumas configurações do presente pedido de patente de invenção em diversos tecidos e o desempenho fenotípico mediante condições normais através de acessos de cevada
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Tabela 37. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela acima. EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO UTILIZANDO O MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS 44K DE ARABIDOPSIS
[00314] A fim de produzir uma análise de correlação de alto rendimento fazendo a comparação entre o fenótipo da planta e o nível de expressão genética, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeos de Arabidopsis, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa aproximadamente 44.000 genes e transcritos de Arabidopsis. Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com componentes de rendimento e NUE, dos componentes da biomassa ou dos parâmetros relacionados ao vigor, diversas características relativas à planta foram analisadas em 14 ecotipos diferentes de Arabidopsis. Entre eles, nove ecotipos abrangendo a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos Experimentais
[00315] Tecidos de Arabidopsis analisados - Dois tecidos de plantas [folhas e caules] cultivados em dois níveis de fertilização com nitrogênio diferentes (1,5 mM de Nitrogênio ou 6 mM de Nitrogênio) foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu um Conjunto de ID, conforme resumido na Tabela 38 abaixo. Tabela 38 Conjuntos experimentais de transcriptoma de Arabidopsis
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Tabela 38.
[00316] Avaliação dos componentes de rendimento da Arabidopsis e dos parâmetros relacionados ao vigor sob diferentes níveis de fertilização com nitrogênio - 10 acessos de Arabidopsis em dois lotes repetitivos cada contendo 8 plantas por lote foram cultivados em estufa. O protocolo de cultivo utilizado foi o seguinte: sementes com superfície esterilizada foram colocadas em tubos Eppendorf contendo 0,5 x meio salino basal de Murashige-Skoog e cultivadas a 23 °C sob ciclos de 12 horas de luz e 12 horas de escuro por 10 dias. Então, mudas de tamanho semelhante foram cuidadosamente transferidas para vasos contendo uma mistura de perlita e turfa em uma relação de 1:1. Condições de limitação constante de nitrogênio foram alcançadas irrigando as plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3, suplementado com 2 mM de CaCl2, 1,25 mM de KH2PO4, 1,50 mM de MgSO4, 5 mM de KCl, 0,01 mM de H3BO3 e microelementos, enquanto condições normais de irrigação foram alcançadas aplicando uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3, suplementada com 2 mM de CaCl2, 1,25 mM de KH2PO4, 1,50 mM de MgSO4, 0,01 mM de H3BO3 e microelementos. A fim de acompanhar o crescimento da planta, as bandejas foram fotografadas no dia em que as condições limitantes de nitrogênio foram iniciadas e, subsequentemente, a cada 3 dias por aproximadamente 15 dias adicionais. A área da roseta da planta foi, então, determinada a partir das fotografias digitais. O software ImageJ foi utilizado para quantificar o tamanho da planta a partir das fotografias digitais [Hypertext Transfer Protocol://rsb (ponto) info (ponto) nih (ponto) gov/ij/] utilizando scripts de propriedade exclusive desenhados para analisar o tamanho da área da roseta de plantas individuais como uma função do tempo. O sistema de análise de imagem inclui um computador desktop pessoal (Intel P4 com processador de 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e está disponibilizado livremente na Internet, em Hypertext Transfer Protocol:// rsbweb (ponto) nih (dot) gov/. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o programa de análise estatística JMP (SAS Institute).
[00317] Os parâmetros dos dados coletados estão resumidos na Tabela 39 abaixo. Tabela 39 Parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores)
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Tabela 39. “N” = Nitrogênio nas concentrações observadas; “gr.” = gramas; “SPAD” = níveis de clorofila; “t50” = tempo onde 50% das plantas floriram; “gr/ unidade de SPAD” = biomassa da planta expressa em gramas por unidade de nitrogênio na planta, medida por SPAD. “DW” = peso seco da planta; “Nível de N /DW” = nível de Nitrogênio da planta medido em unidade de SPAD por biomassa da planta [gr]; “DW/ Nível de N” = biomassa da planta por planta [gr]/unidade de SPAD;
[00318] Avaliação da NUE, componentes de rendimento e parâmetros relacionados ao vigor - Dez ecotipos de Arabidopsis foram cultivados em bandejas, cada uma contendo 8 plantas por lote, em uma estufa com condições de temperatura controlada por aproximadamente 12 semanas. As plantas foram irrigadas com concentração diferente de nitrogênio conforme descrito acima, dependendo do tratamento aplicado. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada por imagens digitais. Imagem digital - Ensaio da estufa
[00319] Um sistema de aquisição de imagens, que consiste de uma câmera reflex digital (Canon EOS 400D) equipada com lentes focais de 55 mm (Canon série EF-S) colocada em um suporte de alumínio personalizado, foi utilizado para capturar as imagens de plantas plantadas em recipientes dentro de uma estufa com controle ambiental. O processo de captura de imagem é repetido a cada 2-3 dias iniciando no dia 9-12 até o dia 16-19 (respectivamente) a partir da transplantação.
[00320] Foi utilizado o sistema de processamento de imagem, o qual consiste de um computador desktop pessoal (Intel P4 com processador de 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e está disponibilizado livremente na Internet, em Hypertext Transfer Protocol:// rsbweb (ponto) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas na resolução de 10 megapixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato de baixa compressão JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados de saída do processamento das imagens são salvos em arquivos de testo e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00321] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número de folhas, a área foliar, o diâmetro e a área da Roseta.
[00322] Índice de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (RGR) da área foliar (Fórmula VIII), número de folhas (Fórmula IX), área da roseta (Fórmula X), diâmetro da roseta (Fórmula XI), cobertura do lote (Fórmula XII) e a Área Relativa do Pecíolo (XIII) foram calculados como segue: Fórmula VIII: Taxa de crescimento relativo da área foliar = Coeficiente de regressão da área foliar ao longo do ciclo de tempo. Fórmula IX: Taxa de crescimento relativo do número de folhas da planta = Coeficiente de regressão do número de folhas da planta ao longo do ciclo de tempo. Formula X: Taxa de crescimento relativo da área da roseta = Coeficiente de regressão da área da roseta ao longo do ciclo de tempo. Fórmula XI: Taxa de crescimento relativo do diâmetro da roseta = Coeficiente de regressão do diâmetro da roseta ao longo do ciclo de tempo. Fórmula XII: Taxa de crescimento relativo da cobertura do lote = Coeficiente de regressão do lote. Fórmula XIII: Área Relativa do Pecíolo=[(Lâmina foliar*Número de folhas)/Roseta.
[00323] Rendimento da semente e peso de 1000 sementes - No final do experimento, todas as sementes de todos os lotes foram colhidas e pesadas a fim de medir o rendimento da semente por planta em termos de peso total das sementes por planta (gr). Para o cálculo do peso de 1000 sementes, um peso médio de 0,02 gramas foi medido a partir de cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma fotografia foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00324] Peso seco e rendimento da semente - No final do experimento, a planta foi colhida e deixada para secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa foi separada das sementes, pesada e dividida pelo número de plantas. Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) depois da secagem a 30 °C em uma câmara de secagem.
[00325] Índice de Colheita - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV conforme descrito acima.
[00326] T5o dias para a floração - Cada uma das repetições foi monitorada quanto à data de floração. Os dias de floração foram calculados a partir da data da semeadura até 50% dos lotes florados. Nível de nitrogênio da planta - O teor de clorofila das folhas é um bom indicador do status de nitrogênio da planta uma vez que o grau de verdura da folha está altamente correlacionado com esse parâmetro. O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada na época da floração. As leituras do medidor SPAD foram realizadas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas foram feitas por folha por parcela. Com base nessa medição, parâmetros com a relação entre o rendimento da semente por unidade de nitrogênio [rendimento da semente/Nível de N = rendimento da semente por planta [gr]/unidade de SPAD], DW da planta por unidade de nitrogênio [DW/ Nível de N= biomassa da planta por planta [g]/unidade de SPAD], e nível de nitrogênio por grama de biomassa [Nível de N/DW= unidade de SPAD/ biomassa da planta por planta (gr)] foram calculados.
[00327] Percentual de redução do rendimento da semente- mede a quantidade de sementes obtidas nas plantas quando cultivadas sob condições limitantes de nitrogênio em comparação com o rendimento da semente produzida com níveis normais de nitrogênio expressos em %. Resultados experimentais
[00328] 10 acessos (ecotipos) diferentes de Arabidopsis foram cultivados e caracterizados quanto a 37 parâmetros conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos na Tabela 40 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptomas (Tabela 38) e os parâmetros medidos foi realizada (Tabelas 41 e 42 abaixo). A seguir estão os resultados integrados à base de dados. Tabela 40 Parâmetros medidos em acessos de Arabidopsis
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Tabela 40. São apresentados os parâmetros medidos sob vários tratamentos em vários ecotipos (acessos de Arabidopsis). Tabela 41 Correlação entre o nível de expressão de Genes selecionados de algumas configurações do presente pedido de patente de invenção em diversos tecidos e do desempenho fenotípico mediante condições normais ou baixas de fertilização nitrogenada através de acessos de Arabidopsis
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Tabela 41. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela Tabela 42 Correlação entre o nível de expressão de genes ortólogos selecionados de algumas configurações do presente pedido de patente de invenção em diversos tecidos e do desempenho fenotípico mediante condições normais ou baixas de fertilização nitrogenada através de acessos de Arabidopsis
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Tabela 42. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela acima. EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA TRANSFERÊNCIA DOS PARÂMETROS RELACIONADOS AO RENDIMENTO, BIOMASSA E/OU VIGOR UTILIZANDO 44K MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO COM GENOMA COMPLETO DE ARABIDOPSIS
[00329] Para produzir uma análise de correlação de alta transferência realizando uma comparação entre o fenótipo da planta e o nível de expressão de genes, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Arabidopsis thaliana, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa aproximadamente 40.000 genes e transcritos de A. thaliana baseados em dados da base de dados TIGR ATH1 v.5 e bases de dados de Arabidopsis MPSS (Universidade de Delaware). Para definir as correlações entre os níveis de expressão e de rendimento de RNA, dos componentes da biomassa ou dos parâmetros relacionados ao vigor, diversas características relativas à planta foram analisadas em 15 ecotipos diferentes de Arabidopsis. Entre eles, nove ecotipos abrangendo a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos experimentais
[00330] Tecidos analisados de Arabidopsis - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento incluindo a raiz, folha, flor em antese, semeados 5 dias após a floração (DAF) e semeados 12 DAF, representando características diferentes de plantas, foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Cada tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu um Conjunto de ID, conforme resumido na Tabela 43 abaixo. Tabela 43 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão do transcriptoma de Arabidopsis
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Tabela 43: São fornecidas as letras de identificação (ID) para cada um dos conjuntos expressão de Arabidopsis (AE). DAF = dias após a floração.
[00331] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de rendimento e vigor - Oito dos nove ecotipos de Arabidopsis foram utilizados em cada um dos 5 blocos repetidos (denominados A, B, C, D e E), cada um contendo 20 plantas por parcela. As plantas foram cultivadas em uma estufa com condições controladas em 22 °C, e o fertilizante N: P: K (20:20:20; relações de peso) [nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K)] foi acrescentado. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados por meio do estágio de plântula de plantas cultivadas em cultura de tecidos em placas de ágar transparentes de cultivo vertical. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada por imagens digitais.
[00332] Imagem digital em cultura de tecidos - Um sistema de aquisição de imagem laboratorial foi utilizado para capturar imagens de mudas serradas em placas de ágar quadradas. O sistema de aquisição de imagem consiste de uma câmera digital reflex (Canon EOS 300D) acoplada a uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), incluindo 4 unidades de luz (4 lâmpadas de 150 Watts), e localizados em uma câmara escura.
[00333] Imagem digital na Estufa - O processo de captura de imagens foi repetido a cada 3 a 4 dias a partir do dia 7 até o dia 30. A mesma câmera Petição 870190072313, de 29/07/2019, pág. 123/869 115 / 422 acoplada a uma lente de 24 mm de comprimento focal (Canon EF series), colocada em um suporte de ferro customizado, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores serradas em tonéis brancos em uma estufa com controle de ambiente. Os tonéis brancos possuíam uma forma quadrada medindo 36 x 26,2 cm com 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, os tonéis foram colocados debaixo do suporte de ferro, evitando a luz direta do sol e a fundição de sombras. Este processo foi repetido a cada 3 a 4 dias por até 30 dias.
[00334] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador desktop pessoal (Intel P4 com processador de 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health [Instituto Nacional de Saúde dos EUA] e está disponibilizado livremente na Internet, em Hypertext Transfer Protocol:// rsbweb (ponto) nih (dot) gov/. Foram capturadas imagens na resolução de 6 megapixels (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em um formato de baixa compressão JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o programa de análise estatística JMP (SAS Institute).
[00335] Análise foliar - Foram calculados utilizando a análise digital os dados das folhas, incluindo o número de folhas, área, perímetro, comprimento e largura. No dia 30, 3 a 4 plantas representativas foram escolhidas a partir de cada parcela dos blocos A, B e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada e foi introduzida entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi tomada e os diversos parâmetros (tais como a área total da folha, comprimento laminar, etc.) foram calculados a partir das imagens. A circularidade da lâmina foi calculada em relação à largura laminar dividida pelo comprimento laminar.
[00336] Análise da raiz - Durante 17 dias, os diferentes ecotipos foram cultivados em placas de ágar transparentes. As placas foram fotografadas a cada 3 dias como início no dia 7 na sala de fotografias e o desenvolvimento das raízes foi documentado (veja os exemplos nas Figuras 3A-F). A taxa de crescimento das raízes foi calculada de acordo com a Fórmula XIV: Taxa de crescimento relativa da cobertura da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz ao longo do curso do tempo.
[00337] Análise da taxa de crescimento vegetativo - foi calculada de acordo com as Fórmulas VIII-XIII acima. A análise foi encerrada com o aparecimento da sobreposição de plantas.
[00338] Para a comparação entre os ecotipos, a taxa calculada foi normalizada utilizando o estágio de desenvolvimento da planta conforme representado pelo número de folhas verdadeiras. Nos casos em que as plantas com 8 folhas foram amostradas duas vezes (p. ex.,, no dia 10 e dia 13), apenas a amostra maior foi escolhida e adicionada à comparação Anova.
[00339] Análise de sementes em síliqua - No dia 70, 15 a 17 síliquas foram coletadas de cada parcela nos blocos D e E. As síliquas escolhidas apresentavam cor castanho claro, mas ainda estavam intactas. As síliquas foram abertas na câmara de fotografia e as sementes foram dispersas em uma bandeja de vidro, uma imagem digital de alta resolução foi tomada para cada parcela. O número de sementes por síliqua foi determinado utilizando-se imagens.
[00340] Peso médio das sementes - Ao final do experimento, todas as sementes das parcelas nos blocos de A à C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 gramas foi medido a partir de cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e foi tirada uma fotografia. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00341] Percentual de óleo nas sementes - Ao final do experimento todas as sementes nas parcelas dos blocos A a C foram coletadas. As sementes Columbia de três parcelas foram misturadas à terra e, em seguida, montadas na câmara de extração. Foi utilizado como solvente 210 ml de n- Hexano (N° de Cat. 080951 Biolab Ltd.). A extração foi realizada por 30 horas com aquecimento médio de 50° C. Uma vez terminada a extração, o n- Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35 °C e sob condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. As informações obtidas a partir do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) foram utilizadas para criar uma curva de calibração para o RMN de Baixa Ressonância [Ressonância magnética nuclear]. O teor de óleo de todas as amostras de sementes foi determinado utilizando o RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de sowftware MultiQuant.
[00342] Análise de comprimento da silíqua - No dia 50 após a semeadura, 30 silíquas de diferentes plantas em cada lote foram amostradas no bloco A. As silíquas escolhidas tinham cor verde-amarelo e foram coletados a partir das partes inferiores do tronco de uma planta cultivada. Foi tomada uma fotografia digital para determinar o comprimento da síliqua.
[00343] Peso seco e rendimento das sementes - No dia 80 após a semeadura, as plantas a partir dos blocos A a C foram colhidas e deixadas para secar a 30 °C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso das sementes de cada parcela foi separado, medido e dividido pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) após a secagem a 30 °C em uma câmara de secagem; Rendimento das sementes por planta = peso total das sementes por planta (gr).
[00344] Rendimento de óleo - O rendimento de óleo foi calculado utilizando a Fórmula XV. Fórmula XV: Rendimento do óleo de sementes = Rendimento de sementes por planta (gr)* % de óleo na semente.
[00345] Índice de colheita (sementes) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV (descrita acima). Resultados experimentais
[00346] Nove ecotipos diferentes de Arabidopsis foram cultivados e caracterizados por 18 parâmetros (nomeado como vetores). Tabela 44 Parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores)
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Tabela 44. São fornecidos os parâmetros correlacionados de Arabidopsis (correlação II N°s 18/01). 1-18). Abreviaturas: Cm = centímetro(s); gr = grama(s); mg = miligrama(s).
[00347] Os valores caracterizados estão resumidos nas Tabelas 45 e 46 abaixo. Tabela 45 Parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis
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Tabela 45. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: 15 = Rendimento da semente por planta (grama); 16 = rendimento de óleo por planta (mg); 12 = % de óleo por semente; 11 = peso de 1000 sementes (gr); 5 = matéria seca por planta (gr); 17 = índice de colheita; 10 = área foliar total por planta (cm); 13 = sementes por síliqua; 14 = Comprimento da síliqua (cm). Tabela 46 Parâmetros adicionais medidos em ecotipos de Arabidopsis
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Tabela 46. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: 6 = Taxa de crescimento vegetativo (cm2/dia) até 8 folhas verdadeiras, 3 = crescimento relativo da raiz (cm/dia) (dia 13), 2 = Comprimento da raiz no dia 7 (cm), 1 = Comprimento da raiz no dia 13 (cm); 4 = peso fresco por planta (gr) em estágio de broto, 9. = Comprimento da lâmina (cm); 8 = Largura da lâmina (cm); 18 = Largura/comprimento da folha; 7 = Circularidade da lâmina.
[00348] As Tabelas 47 e 48 fornecem as análises de correlação. Tabela 47 Correlação entre o nível de expressão de Genes selecionados de algumas configurações do presente pedido de patente de invenção em diversos tecidos e do desempenho fenotípico mediante condições normais ou baixas de fertilização nitrogenada através de acessos de Arabidopsis
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Tabela 47. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela acima. Tabela 48 Correlação entre o nível de expressão de genes ortólogos selecionados de algumas configurações do presente pedido de patente de invenção em diversos tecidos e do desempenho fenotípico mediante condições normais ou baixas de fertilização nitrogenada através de acessos de Arabidopsis
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Tabela 48. “Corr. Set ID “ - Identificação do conjunto de correlação de acordo com os parâmetros correlacionados Tabela acima. EXEMPLO 8 DESENVOLVIMENTO DE FIBRA VEGETAL EM ALGODÃO PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ALGODÃO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO UTILIZANDO O MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE ALGODÃO
[00349] A fim de realizar a análise de correlação da expressão genética de alto rendimento, os presentes inventores utilizaram o microarranjo de oligonucleotídeos de algodão, desenvolvidos e produzidos por “Comparative Evolutionary Genomics of Algodão” [Hypertext Transfer Protocol (http)://algodãoevolution (ponto) info/). Esse Microarranjo de Oligonucleotídeos de Algodão é composto de 12.006 oligonucleotídeos de Tecnologias Integradas de DNA (IDT) derivados de um conjunto de mais de 180.000 ESTs de Gossypium sequenciados de 30 bibliotecas de cDNA. Para obter detalhes adicionais, consulte a PCT/IL2005/000627 e PCT/IL2007/001590 que estão incorporadas aqui na íntegra como referência. Tabela 49 Conjuntos experimentais de transcript oma de algodão
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Tabela 49.
[00350] A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e o comprimento da fibra, fibras de 8 linhagens de algodão diferentes foram analisadas. Essas fibras foram selecionadas mostrando qualidade muito boa das fibras e alto índice de fiapos (tipos Pima, originários de outras espécies de algodão, a saber, G. barbadense), diferentes níveis de qualidade e índices de fiapos de várias linhagens de G. hirsutum: boa qualidade e alto índice de fiapos (tipo Acala), e qualidade insatisfatória e baixo índice de fiapos (tipo Tamcot, e variedades antigas). Um resumo do comprimento das fibras das diferentes linhagens é apresentado na Tabela 50. Procedimentos experimentais
[00351] Extração de RNA - Estágios de desenvolvimento das fibras, representando diferentes características das fibras, em 5, 10 e 15 DPA foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima.
[00352] Avaliação do comprimento das fibras - O comprimento das fibras das linhagens de algodão selecionadas foi medido utilizando um fibrógrafo. O sistema de fibrógrafo foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento “Médio de 50% das Fibras Maiores”. A média de 50% das fibras maiores (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição das fibras. O fibrógrafo mede o comprimento em envergadura a um determinado ponto percentual World Wide Web (ponto) algodãoinc (ponto) com/Classification of Algodão/?Pg= 4#Length].
[00353] Resultados experimentais
[00354] Oito linhagens diferentes de algodão foram cultivadas, e seu comprimento de fibra foi medido. Os valores UHM das fibras estão resumidos na Tabela 50 abaixo. O quadrado de R foi calculado para cada um dos genes. Tabela 50 Resumo do comprimento das fibras das 8 linhagens de algodão diferentes
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Tabela 50: São apresentadas as médias e os desvios padrão (STD) de 8 linhagens de algodão diferentes. Tabela 51 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais no algodão
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Tabela 51. “Corr. Set ID “ - conjunto de correlação se refere ao comprimento das fibras Tabela 52 Correlação entre o nível de expressão de genes ortólogos delecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho sob condições normais no algodão
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Tabela 52. “Corr. Set ID “ - conjunto de correlação se refere ao comprimento das fibras EXEMPLO 9 IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAM A ABST, A TAXA DE CRESCIMENTO, O VIGOR, O RENDIMENTO, A BIOMASSA, O TEOR DE ÓLEO, A WUE, A NUE E/OU FUE EM PLANTAS
[00355] Com base na bioinformática e nas ferramentas experimentais descritas acima, os presentes inventores identificaram 217 que apresentam um maior impacto sobre a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento da planta, o teor de óleo, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a taxa de crescimento, a eficiência do uso do nitrogênio, a eficiência do uso de água e a eficiência do uso de fertilizantes quando sua expressão é aumentada em plantas. Os genes identificados, suas sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos curadas, bem como suas sequência atualizadas de acordo com a base de dados do GenBank estão resumidos na Tabela 53 abaixo. Tabela 53 Genes identificados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, o rendimento, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a taxa de crescimento, o teor de óleo, a eficiência do uso do nitrogênio e a eficiência do uso de fertilizantes de uma planta
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Tabela 53. São apresentados os genes identificados cuja expressão nas plantas aumenta a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, o rendimento, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a taxa de crescimento, o teor de óleo a eficiência do uso do nitrogênio e a eficiência do uso de fertilizantes de uma planta. “Polinucl.” - polinucleotídeo; “Polipep.” - polipeptídeo. EXEMPLO 10 IDENTIFICAÇÃO DE HOMÓLOGOS QUE AFETAM A ABST, A WUE, O RENDIMENTO, A TAXA DE CRESCIMENTO, O VIGOR, A BIOMASSA, O TEOR DE ÓLEO, A NUE E/OU A FUE DE UMA PLANTA
[00356] Os conceitos de ortologia e parologia foram aplicados recentemente em caracterizações funcionais e classificações na escala de comparações genoma inteiro. Os ortólogos e parólogos constituem dois grandes tipos de homólogos: O primeiro evoluiu de um ancestral comum por especialização, e o último está relacionado a eventos de duplicação. Presume- se que parólogos que surgem de eventos de duplicação antigos provavelmente tenham divergido em termos de função enquanto é mais provável que os verdadeiros ortólogos retenham função idêntica ao longo do tempo evolutivo.
[00357] A fim de investigar adicionalmente e identificar genes ortólogos putativos dos genes que afetam a ABST, a WUE, o rendimento (p. ex., o rendimento da semente, o rendimento do óleo, a biomassa, a quantidade e/ou a qualidade do grão), o teor de óleo, a taxa de crescimento, o vigor, a NUE e a FUE (apresentados na Tabela 53, Exemplo 9 acima), todas as sequências foram alinhadas utilizando o BLAST (/Ferramenta de Busca de Homologia por Alinhamento Local/). Sequências suficientemente semelhantes foram tentativamente agrupadas. Esses ortólogos putativos foram organizados, ainda, sob um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) que, presume-se, seja uma representação das relações evolutivas entre a taxa biológica. Grupos ortólogos putativos foram analisados quanto à sua concordância com o filograma e, em caso de discordância, esses grupos ortólogos eram quebrados da forma apropriada.
[00358] Os dados da expressão foram analisados e a bibliotecas de EST foram classificadas utilizando um vocabulário fixo de termos de costume como estágios desenvolvimentais (p. ex.,, genes mostrando perfil de expressão semelhante através do desenvolvimento com suprarregulação em estágio específico, como no estágio de enchimento da semente) e/ou órgão da planta (p. ex.,, genes apresentando perfil de expressão semelhante entre seus órgãos com suprarregulação em órgãos específicos como a semente). As anotações de todos os ESTs agrupados em um gene foram analisadas estatisticamente comprando sua frequência no grupo versus sua abundância na base de dados, permitindo construir um perfil de expressão numérico e gráfico daquele gene, que é chamado de “expressão digital”. A fundamentação para o uso desses dois métodos complementares com método de estudos de associação fenotípica de QTLs, SNPs e correlação da expressão fenotípica é baseada na hipótese de que provavelmente os ortólogos verdadeiros retenham uma função idêntica ao longo do tempo evolutivo. Esses métodos apresentam diferentes conjuntos de indicações sobre semelhanças de função entre dois genes homólogos, semelhanças no nível da sequência - aminoácidos idênticos nos domínios da proteina e semelhança nos perfis de expressão.
[00359] Os métodos de busca e identificação de homólogos de rendimento e melhora dos traços agronômicos como a tolerância ao ABS e polipeptídeos ou polinucleotídeos relacionados à FUE estão dentro do domínio do artesão habilidoso. A busca e a identificação de genes homólogos envolve a triagem das informações disponíveis da sequência, p. ex., nas bases de dados públicas, o que inclui mas não se limita à Base de Dados de DNA do Japão (DDBJ), o Genbank, e a Base de Dados da Sequência de Ácido Nucléico do Laboratório de Biologia Molecular Europeu (EMBL) ou versões ela ou a base de dados MIPS. Diversos algoritmos de busca diferentes foram desenvolvidos, incluindo mas não se limitando à suite de programas chamada de programas BLAST. Existem cinco implementações do BLAST, três desenhadas para consultas à sequência de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e duas desenhadas para consultas à sequência de proteínas (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Esses métodos envolvem o alinhamento e a comparação de sequências. O algoritmo do BLAST calcula o percentual de identidade da sequência e realize uma análise estatística da semelhança entre as duas sequências. O software para realizar a análise no BLAST está disponível publicamente através do Centro Nacional de Informação Biotecnológica. Outros softwares ou algoritmos desse tipo são o GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. O GAP utilize o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para descobrir o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de combinações e minimize o número de intervalos.
[00360] Os genes homólogos podem pertencer à mesma família genética. A análise de uma família genética pode ser realizada utilizando a análise de semelhança da sequência. Para realizar essa análise, é possível utilizar programas padrão para múltiplos alinhamentos, p. ex., Clustal W. Uma árvore de neighbour-joining das proteínas homólogas aos genes nesse pedido de patente de invenção pode ser utilizada para proporcionar uma visão geral das relações estruturais e ancestrais. A identidade da sequência pode ser calculada utilizando um programa de alinhamento conforme descrito acima. Espera-se que outras plantas carreguem um gene funcional semelhante (ortólogo) ou uma família de genes semelhantes e aqueles genes apresentarão o mesmo fenótipo preferido que os genes apresentados aqui. Vantajosamente, os membros dessa família podem ser úteis nos métodos do presente pedido de patente de invenção. Exemplos de outras plantas estão incluídos aqui, mas não estão limitados à cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), milho (Zea mays), algodão (Gossypium), Colza (Brassica napus), Arroz (Oryza sativa), Cana de Açúcar (Saccharum officinarum), Sorgo (Sorgo bicolor), Soja (Glycine max), Girassol (Helianthus annuus), Tomate (Lycopersicon esculentum), Trigo (Triticum aestivum).
[00361] As análises mencionadas acima para homologia da sequência são, preferivelmente, realizadas em uma sequência de comprimento total, mas também pode ser baseada em uma comparação de determinadas regiões como os domínios conservados. A identificação desses domínios também estaria dentro do domínio da pessoa com habilidade na técnica e envolveria, p. ex., um formato legível por computador dos ácidos nucléicos do presente pedido de patente de invenção, o uso de programas de software de alinhamento e o uso de informações disponíveis publicamente sobre os domínios da proteina, padrões e caixas conservados. Essas informações estão disponíveis na base de dados do PRODOM (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) biochem (ponto) ucl (ponto) ac (ponto) uk/bsm/dbbrowser/protocol/ prodomqry (ponto) html), PIR (Hypertext Transfer Protocol://pir (ponto) Georgetown (ponto) edu/) or Pfam (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) sanger (ponto) ac (ponto) uk/Software/Pfam/). Programas de análise de sequência desenhados para busca de padrões podem ser utilizados para identificação de fragmentos, regiões ou domínios conservados conforme mencionado acima. Programas de computador preferidos incluem, mas não se limitam ao MEME, SIGNALSCAN e GENESCAN.
[00362] Uma pessoa com habilidade na técnica pode utilizar as sequência homólogas apresentada aqui para descobrir sequências semelhantes em outras espécies e outros organismos. Homólogos de uma proteína abrangem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas com substituições de aminoácidos, exclusões e/ou inserções relativas à proteína não-modificada em questão e apresentando atividade biológica e funcional semelhante à proteína não-modificada da qual eles são derivados. A fim de produzir esses homólogos, aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos com propriedades semelhantes (mudanças conservadoras, como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar ou quebrar estruturas a-helicais ou estruturas de 3 folhas). Tabelas de substituição conservadoras são bem conhecidas na técnica (veja, p. ex.,, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Homólogos de um ácido nucléico abrangem ácidos nucléicos apresentando substituições, exclusões e/ou inserções de nucleotídeos em relação ao ácido nucléico não-modificado em questão e apresentam atividade biológica e funcional semelhante à do ácido nucléico não-modificado do qual são derivados.
[00363] Polinuclotídeos e polipeptídeos com homologia significativa aos genes identificados e polipeptídeos descritos na Tabela 53 acima foram identificados a partir de bases de dados utilizando o software BLAST usando os algoritmos Blastp e tBlastn. As sequências de nucleotídeos e polipeptídeos consultadas estão descritas na Tabela 53 acima (ID. SEQ. de polinucleotídeos Nos: 1-217 e 218-274; ID. SEQ. de polipeptídeos Nos: 474-689 e 690-731) e os homólogos identificados são apresentados na Tabela 54, abaixo. Tabela 54 Homólogos dos genes/polipeptídeos identificados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência do uso de água, o rendimento, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, a biomassa, a taxa de crescimento, a eficiência do uso do nitrogênio e a eficiência do uso de fertilizantes de uma planta
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Tabela 54: São apresentados os polipeptídeos (polipep.) e polinucleotídeos (polinucl.) homólogos dos genes para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, a biomassa, a eficiência do uso do nitrogênio, a eficiência do uso de água e a eficiência do uso de fertilizantes de uma planta que estão listados na Tabela 53 acima. A homologia foi calculada como o % de identidade das sequências alinhadas. As sequências de entrada foram os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos na Tabela 53 acima, e as sequências da base de dados são as sequências de proteínas e polinucleotídeos identificados na base de dados com base em uma identidade global maior do que 80% das sequências de nucleotídeos e/ou polipeptídeos de entrada. Hom. = Homologia; Glob. = Global; Algor. = Algoritmo.
[00364] O resultado da abordagem genônica funcional descrita aqui é um conjunto de genes com alta previsão de melhorar a ABST, o rendimento e/ou outros traços agronômicos importantes como a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a taxa de crescimento, o teor de óleo, a eficiência do uso do nitrogênio, a eficiência do uso de água e a eficiência do uso de fertilizantes de uma planta aumentando sua expressão. Embora seja previsível que cada gene tenha seu próprio impacto, espera-se que a modificação do modo de expressão de mais de um gene apresente um efeito aditivo ou sinergístico sobre o rendimento e/ou desempenho de rendimentos agronômicos importantes da planta. Alterar a expressão de cada gene descrito aqui sozinho ou um conjunto de genes juntos, aumenta o rendimento geral e/ou outros traços agronômicos importantes, portanto, espera-se aumentar a produtividade agrícola. EXEMPLO 11 CLONAGEM GENÉTICA E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO DAS PLANTAS
[00365] A fim de validar seu papel na melhora da ABST, do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa, do vigor, do teor de óleo, da WUE, da NUE e/ou da FUE, genes selecionados foram superexpressados em plantas, como segue. Estratégia de clonagem
[00366] Genes selecionados daqueles apresentados nos Exemplos 4 e 5 acima são clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, as fases de leitura aberta (ORFs) totais foram identificadas. Os grupos de EST e, em alguns casos, as sequências de mRNA foram analisados para identificar a fase de leitura aberta total comparando os resultados de diversos algoritmos de tradução às proteínas conhecidas de outras espécies de planta.
[00367] A fim de clonar os cDNAs de comprimento total, a transcrição reversa (RT) seguida pela reação em cadeia da polimerase (PCR; RT-PCR) é realizada no RNA total extraído de folhas, raízes ou de outros tecidos vegetais, cultivados sob condições normais. A extração de RNA, produção de cDNA e amplificação de PCR foram feitas usando protocolos padrão descritos em outro local (Sambrook J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque.) que é bem conhecido por aqueles com habilidade na técnica. Os produtos da PCR são purificados utilizando um kit de purificação para PCR (Qiagen)
[00368] Geralmente, 2 conjuntos de primers são preparados para a amplificação de cada gene, através da nested PCR (se necessário). Ambos os conjuntos de primers são utilizados para amplificação no cDNA. Caso nenhum produto seja obtido, é realizada uma reação de nested PCR. A nested PCR é realizada pela amplificação do gene utilizando primers externos e, então, utilizando o produto da PCR produzido como um modelo para uma segunda reação de PCR, onde o conjunto interno de primers é utilizado. Alternativamente, um ou dois dos primers internos foram usados para amplificação genética, ambos na primeira e segunda reação PCR (o que significa que apenas 2-3 primers determinados para uma gene). Ainda para facilitar a clonagem dos cDNAs, uma extensão de 8-12 bp é adicionada ao 5’ de cada primer interno. A extensão do primer inclui um sítio de restrição de endonuclease. Os sítios de restrição são selecionados usando dois parâmetros: (a) o sítio de restrição não existe na sequência de cDNA; e (b) os sítios de restrição nos primers diretos e reversos são determinados para que o cDNA digerido seja inserido na formação de sentido no vetor binário utilizado para transformação.
[00369] Os produtos da PCR são digeridos com endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc) de acordo com os sítios desenhados nos primers. Cada produto da PCR digerido é introduzido em um vetor de alto número de cópias, o vetor plasmídeo pBlue-script KS [vetor plasmídeo pBlue-script KS, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) stratagene (ponto) com/manuals/212205 (ponto) pdf) ou pUC19 (New England BioLabs Inc], ou em plasmídeos originados a partir desse vetor. No caso do vetor de alto número de cópias originado do vetor plasmídeo pBlue- script KS (pGXN ou pGXNa), o produto da PCR foi introduzido no plasmídeo de alto número de cópias a montante no terminador NOS (ID. SEQ. No: 8737) originado do vetor binário pBI 101.3 (GenBank Acesso No U12640, nucleotídeos 4356 a 4693) e a jusante no promotor 35S. Em outros casos (pKSJ_6669a ou pUC19_pr6669), o promotor At6669 (ID. SEQ. No: 8741) já está clonado no pBlue-script KS ou pUC19 respectivamente, portanto o gene é introduzido a jusante do promotor.
[00370] O sequenciamento dos genes introduzidos é realizado utilizando o sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Em alguns casos, depois de confirmar as sequências dos genes clonados, o cDNA clonado acompanhado ou não do terminador NOS foi introduzido em um vetor binário pGI modificado contendo o promotor At6669 através da digestão com as endonucleases de restrição apropriadas (o gene clonado substitui o gene GUI). Em outros casos, o cDNA clonado acompanhado pelo promoter At6669 é introduzido em um vetor pGI (que não contém o promotor At6669). Em qualquer caso, a introdução é seguida por uma única cópia do terminador NOS (ID. SEQ. No: 8737). Os produtos digeridos e o vetor plasmídeo linearizado foram ligados utilizando a enzima T4 DNA ligase (Roche, Suíça).
[00371] Diversas sequências de DNA dos genes selecionados são sintetizadas pela GeneArt [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) geneart (ponto) com/]. O DNA sintético é desenhado in silico. Sítios adequados de enzimas de restrição são adicionados às sequências clonadas no terminal 5’ e no terminal 3’ para permitir a clonagem posterior no vetor binário desejado.
[00372] O vetor plasmídeo pPI é construído pela inserção de uma sequência de sinal de poliadenilação sintética, originária do vetor plasmídeo básico pGL3 (Promega, GenBank Acesso No U47295; nucleotídeos 46584811) no sítiode restrição Hind lll do vetor binário pBI101.3 (Clontech, GenBank Acesso No. U12640). O pGI (Figura 1) foi semelhante ao pPI, mas o gene original na espinha dorsal é o GUS-Intron e não o GUS.
[00373] O vetor pGI modificado (pQFN ou pQNa RP) é uma versão modificada do vetor pGI no qual o cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita de forma que o gene e seu promotor correspondente estejam próximos da borda direita e o gene NPTII está próximo da borda esquerda.
[00374] At6669, a sequência promotora de Arabidopsis thaliana (ID. SEQ. No: 8741) é introduzida no vetor binário pGI modificado, a jusante dos genes clonados, seguida por ligação ao DNA e a extração do plasmídeo binário de colônias de E. coli, conforme descrito acima. As colônias são analisadas por PCR utilizando os primers que cobrem o inserto, que foram desenhadas para atravessar o promotor introduzido e o gene. Plasmídeos positivos são identificados, isolados e seqüenciados.
[00375] Os genes selecionados clonados pelos presentes inventores são apresentados na Tabela 55 abaixo. Tabela 55 Genes clonados em plasmídeos com número elevado de cópias
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Tabela 55. “Polin.” - Polinucleotídeo; “Polip.” - polipeptídeo. Para a clonagem de cada gene, pelo menos 2 primers foram utilizados: Na direção (Fwd) ou Inverso (Rev). Em alguns casos, 4 primers foram utilizados: Externo na direção (EF), Externo inverso (ER), nested na direção (NF) ou nested inverso (NR). As sequências dos primers utilizados para a clonagem dos genes são apresentadas na listagem de sequências. EXEMPLO 12 TRANSFORMANDO CÉLULAS DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS COM VETORES BINÁRIOS ABRIGANDO OS POLINUCLEOTÍDEOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO
[00376] Cada um dos vetores binários descritos no Exemplo 11 acima, foram utilizados para transformar células de Agrobacterium. Duas construções binárias adicionais, apresentando somente o At6669, ou o promotor 35S ou nenhum promotor adicional foram utilizadas como CONTROLEs negativos.
[00377] Os vetores binários são introduzidos em células competentes de Agrobacterium tumefaciens GV301 ou LB4404 (aproximadamente 109 células/mL) por eletroporação. A eletroporação é realizada utilizando um eletroporador MicroPulser (Biorad), cuvetas de 0,2 cm (Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad). As células tratadas são submetidas à cultura em meio líquido LB a 28 °C por 3 horas, então, foram colocadas em placas sobre ágar LB suplementado com gentamicina (50 mg/L; para a cepa GV301 de Agrobacterium) ou estreptomicina (300 mg/L; para a cepa LB4404 de Agrobacterium) e canamicina (50 mg/L) a 28 °C por 48 horas. Colônias de Agrobacterium, que são desenvolvidas em meio seletivo, são analisadas adicionalmente por PCR utilizando os primers desenvolvidos para atravessar a sequência introduzida no plasmídeo pPI. Os produtos de PCR resultantes são isolados e sequenciados conforme descrito no Exemplo 11 acima, para verificar se as sequências de polinucleotídeos corretas do presente pedido de patente de invenção são adequadamente introduzidas nas células de Agrobacterium. EXEMPLO 13 TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DE ARABIDOPSIS THALIANA COM OS POLINUCLEOTÍDEOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO
[00378] Plantas de Arabidopsis thaliana Columbia (Plantas T0) são transformadas utilizando o procedimento Flora Dip descrito por Clough e Bent, 1998 (Floral dip: um método simplificado para transformação em meio de Agrobacterium em Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-43) e por Desfeux et al., 2000 (Female Reproductive Tissues Are the Primary Target of Agrobacterium-Mediated Transformation by the Arabidopsis Floral-Dip Method. Plant Physiol, July 2000, Vol. 123, pp. 895-904); com pequenas modificações. Brevemente, Plantas T0 são colocadas em vasos de 250 ml com mistura de cultivo baseada em turfa úmida. Os vasos são cobertos com folha de alumínio e uma cúpula plástica, mantidos a 4°C por 3-4 dias, então, descobertos e incubados em uma câmara de crescimento a 18-24 °C sob ciclos de luz/escuro de 16/8 horas. As plantas T0 estão prontas para transformação seis dias antes da antese.
[00379] Colônias simples de Agrobacterium, carregando as construções binárias, são geradas conforme descrito no Exemplo 3 acima. As colônias são submetidas à cultura em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas são incubadas a 28°C por 48 horas sob agitação vigorosa e, então, centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. Os pellets compreendendo as células de Agrobacterium são ressuspensas em um meio de transformação contendo Murashige-Skoog com meia potência (2.15 g/L) (Duchefa); 0,044 μM de benzilaminopurina (Sigma); 112 μg/L de vitaminas B5 de Gambourg (Sigma); 5% de sacarose; e 0,2 ml/L de Silwet L- 77 (OSI Specialists, CT) em água duplamente destilada, a um pH de 5,7.
[00380] A transformação de plantas T0 é realizada invertendo cada planta em uma suspensão de Agrobacterium, de forma que o tecido vegetal acima do solo fique submerso por 3-5 segundos. Cada planta T0 inoculada é colocada imediatamente em uma bandeja de plástico, em seguida, coberta com uma cúpula de plástico transparente para manter a umidade e então foi mantida no escuro em temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e a transformação. As plantas transformadas (transgênicas) foram, então, descobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas transgênicas T0 são cultivadas na estufa por 3-5 semanas até que as síliquas estejam marrons e secas. As sementes são colhidas das plantas e mantidas em temperatura ambiente até a semeadura.
[00381] Para a geração de plantas transgênicas T1 e T2 carregando os genes, as sementes coletadas de plantas T0 trangênicas tiveram sua superfície esterilizada por imersão em etanol 70% por 1 minuto, seguido por imersão em hipoclorito de sódio 5% e triton 0,05% por 5 minutos. As sementes esterilizadas na superfície são completamente lavadas em água destilada estéril e, então, colocadas em placas de cultura contendo Murashige-Skoog de meia-potência (Duchefa); 2 % sacarose; 0,8 % ágar de planta; 50 mM canamicina e 200 mM carbenicilina (Duchefa). As placas de cultura são incubadas a 4 °C por 48 horas e, então, transferidas para uma sala de cultivo a 25 °C para uma semana de incubação adicional. Plantas de Arabidopsis T1 vitais são transferidas para uma placa de cultura fresco por mais uma semana de incubação. Após a incubação, as plantas T1 são removidas das placas de cultura e plantadas em uma mistura de cultivo contidas em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas puderam crescer em uma estufa até a maturidade. As sementes colhidas das plantas T1 foram cultivadas e cresceram até sua maturidade como plantas T2 nas mesmas condições as quais foram utilizadas para cultura e crescimento das plantas T1. EXEMPLO 14 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DE PLANTA ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB ESTRESSE ABIÓTICO E SOB CONDIÇÕES FAVORÁVEIS EM ENSAIO DE CULTURA DE TECIDO
[00382] Ensaio I: crescimento da planta sob estresse osmótico [poli (etilenoglicol) (PEG)] em condições de cultura de tecido - Uma das consequências da seca é a indução do estresse osmótico na área ao redor das raízes; assim, em muitos estudos científicos, PEG (exemplo, 1,5% PEG) é usado para simular as condições de estresse osmótico semelhante à alta osmolaridade identificada durante o estresse de seca.
[00383] As sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em meio basal [50% meio Murashige-Skoog (MS) suplementado com 0,8% de ágar de planta como agente solidificante] na presença de canamicina (para seleção apenas de plantas transgênicas). Depois da semeadura, as placas são transferidas por 2-3 dias para estratificação a 4°C e, então, cultivadas a 25°C sob ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuro por 7 a 10 dias. Nesse momento, as mudas escolhidas randomicamente foram cuidadosamente transferidas para placas contendo 1,5% PEG: 0,5 meio MS ou condições de cultivo normais (0,5 meio MS). Cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico, e 3-4 placas diferentes (replicadas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção, pelo menos quatro eventos de transformação independente foram analisados a partir de cada constructo. As plantas expressando os polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção foram comparadas à medida média das plantas de CONTROLE (vetor vazio ou gene repórter GUS sob o mesmo promotor) usadas no mesmo experimento.
[00384] Imagem digital - Um sistema de obtenção de imagem de laboratório, que consiste em uma câmera digital reflex (Canon EOS 300D) com lentes focais de 55 mm (Canon série EF-S), montada sobre um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que incluiu 4 unidades de luz (4x lâmpadas elétricas de 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi usado para capturar imagens de plântulas cortadas em placas de ágar.
[00385] O processo de captura de imagem é repetido a cada 3-4 dias começando no dia 1 até o dia 10 (veja, por exemplo, as imagens nas Figuras 3A-F).
[00386] Um sistema de análise de imagem foi usado, que consiste em um computador de mesa pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 (programa de processamento de imagem em Java que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e disponível sem custo na internet no Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/). Foram capturadas imagens na resolução de 10 megapixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato de baixa compressão JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o programa de análise estatística JMP (SAS Institute).
[00387] Análise de mudas - Usando análise digital, os dados das mudas foram calculados, incluindo área de folha, cobertura da raiz e comprimento da raiz.
[00388] A taxa de crescimento relativo para os vários parâmetros das mudas foi calculado de acordo com as fórmulas XVI, XVII e XVIII a seguir. Formula XVI: Taxa de crescimento da área foliar = Coeficiente de regressão da área foliar ao longo do ciclo de tempo. Formula XVII: Taxa de crescimento relativa da cobertura da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz ao longo do curso do tempo. Formula XVIII: Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz = Coeficiente de regressão do comprimento da raiz ao longo do ciclo de tempo.
[00389] No final do experimento, as plântulas foram removidas do meio e pesadas para determinação do peso fresco da planta. As plântulas foram, então, secadas por 24 horas a 60°C, e pesadas novamente para medir o peso seco da planta para análise estatística posterior. O índice de crescimento foi determinado comparando a cobertura da área da folha, a cobertura da raiz e o comprimento da raiz, entre cada par de fotografias sequencias, e os resultados foram usados para determinar o efeito do gene introduzido no vigor da planta, sob estresse osmótico, bem como sob condições ideais. De forma semelhante, o efeito do gene introduzido no acúmulo de biomassa, sob condições de estresse osmótico e sob condições ideais, foi determinado comparando o peso fresco e seco da planta ao das plantas de CONTROLE (contendo um vetor vazio ou o gene repórter GUS sob o mesmo promotor). A partir de cada constructo criado, 3-5 eventos de transformação independentes foram examinados em réplicas.
[00390] Análises estatísticas - Para identificar os genes conferindo tolerância significativamente maior aos estresses abióticos ou maior arquitetura de raiz, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados aos obtidos das plantas de CONTROLE. Para identificar os genes e constructos com melhor desempenho, os resultados dos eventos de transformação independente testados foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento de gene sob um CONTROLE, os dados foram analisados pelo teste t de Student e o valor p foi calculado. Os resultados são considerados significativos se p < 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Resultados experimentais:
[00391] Os genes apresentados nas Tabelas 56-59 mostraram uma melhora significativa na ABST da planta uma vez que produziram uma biomassa vegetal maior (peso fresco e seco da planta e área foliar) na geração T2 (Tabelas 27-28) ou geração T1 (Tabelas 29-30) quando cultivadas sob condições de estresse osmótico, em comparação com as plantas de CONTROLE. Os genes foram clonados sob a regulação de um promoter constitutivo (At6669; ID. SEQ. No: 8741). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de números de eventos diferentes. Alguns dos genes foram avaliados em mais de uma ensaio de cultura tecidual. Os resultados obtidos nesses experimentos adicionais foram significativamente positivos também. Tabela 56 Genes que apresentam desempenho vegetal melhorado sob condições de estresse osmótico (geração T2)
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Tabela 56. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p. Tabela 57 Genes que apresentam desempenho vegetal melhorado sob condições de estresse osmótico (geração T2)
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Tabela 57. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p. Tabela 58 Genes que apresentam desempenho vegetal melhorado sob condições de estresse osmótico (geração T1)
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Tabela 58. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p. Tabela 59 Genes que apresentam desempenho vegetal melhorado sob condições de estresse osmótico (geração T1)
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Tabela 59. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p.
[00392] Os genes apresentados nas Tabelas 60-61 apresentaram uma melhora significativa na NUE da planta uma vez que produziram uma biomassa maior na raiz (comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando cultivados sob condições de estresse osmótico, em comparação com as plantas de CONTROLE. Planta que produzem biomassa de raiz maior apresentam melhores possibilidades de absorver quantidades maiores de água do solo. Os genes foram clonados sob a regulação de um promoter constitutivo (At6669; ID. SEQ. No: 8741). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de números de eventos diferentes. Alguns dos genes foram avaliados em mais de uma ensaio de cultura tecidual. Esse segundo experimento confirmou o aumento significativo no desempenho da raiz. Eventos com valor de p <0,1 eram considerados estatisticamente significativos Tabela 60 Genes que mostram melhor desempenho da raiz sob condições de estresse osmótico (geração T2)
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Tabela 60. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p. Tabela 61 Genes que mostra melhor desempenho da raiz sob condições de de stresse osmótico (geração T1)
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Tabela 61. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p.
[00393] Os genes listados nas Tabelas 62-65 apresentam taxa de crescimento melhorado (taxa de crescimento da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz) quando cultivados sob condições de estresse osmótico, em comparação com as plantas de CONTROLE. Plantas que apresentam taxa de crescimento rápido mostram melhor estabelecimento da planta no solo sob condições de estresse osmótico. Um crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área foliar e o comprimento e a cobertura da raiz foram medidos. Os genes foram clonados sob a regulação de um promoter constitutivo (At6669; ID. SEQ. No: 8741). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de números de eventos diferentes. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura tecidual e os resultados obtidos foram positives também. Eventos com valor de p <0,1 foram considerados estatisticamente significativos. Tabela 62 Genes que apresentam melhor taxa de crescimento da planta sob condições de estresse osmótico (geração T2)
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Tabela 62. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p. Tabela 63 Genes que apresentam melhor taxa de crescimento da planta sob condições de estresse osmótico (geração T2)
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Tabela 63. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p. Tabela 64 Genes que apresentam melhor taxa de crescimento da planta sob condições de estresse osmótico (geração T1)
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Tabela 64. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p. Tabela 65 Genes que apresentam melhor taxa de crescimento da planta sob condições de estresse osmótico (geração T1)
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Tabela 65. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p.
[00394] Os genes listados nas Tabelas 66-69 melhoraram a biomassa da planta quando cultivadas em condições padrão. Esses genes produziram biomassa vegetal maior (peso fresco e seco da planta e área foliar) quando cultivados sob condições padrão, em comparação com as plantas de CONTROLE. Uma biomassa maior da planta sob essas condições de cultivo indica a alta capacidade da planta de metabolizar melhor os nutrientes presentes no meio. Os genes foram clonados sob a regulação de um promoter constitutivo (At6669; ID. SEQ. No: 8741). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de números de eventos diferentes. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura tecidual e os resultados obtidos foram positives também. Eventos com valor de p <0,1 eram considerados estatisticamente significativos Tabela 66 Genes que apresentam melhor desempenho da planta em condições de cultivo padrão (geração T2)
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Tabela 66. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p. Tabela 67 Genes que apresentam melhor desempenho da planta em condições de cultivo padrão (geração T2)
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Tabela 67. “CONT.” - CONTROLE; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “p. value” - valor de p. Tabela 68 Genes que mostram melhor desempenho da planta em condições de cultivo padrão (geração T1)
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Tabela 68. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 69 Genes que mostram melhor desempenho da planta em condições de cultivo padrão (geração T1)
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Tabela 69. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p.
[00395] Os genes listados nas Tabelas 70-71 melhoraram a NUE da planta quando cultivados em condições padrão. Esses genes produziram maior biomassa da raiz (comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando cultivados sob condições de cultivo padrão, em comparação com as plantas de controle. Planta que produzem biomassa de raiz maior apresentam melhores possibilidades de absorver quantidades maiores de água do solo. Os genes foram clonados sob a regulação de um promoter constitutivo (At6669; ID. SEQ. No: 8741). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de números de eventos diferentes. Some of the genes were evaluated in more than one tissue culture assay resulting in positive results as well. Eventos com valor de p <0,1 eram considerados estatisticamente significativos Tabela 70 Genes que mostram melhor desempenho da raiz em condições de cultivo padrão (geração T2)
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Tabela 70. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 71 Genes que mostram melhor desempenho da raiz em condições de cultivo padrão (geração T1)
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Tabela 71. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p.
[00396] Os genes listados nas Tabelas 72-73 melhoraram a taxa de crescimento da planta (área foliar, comprimento da raiz e taxa de crescimento de cobertura da raiz) quando cultivados em condições de cultivo padrão. Essas plantas produzidas cresceram mais rapidamente do que as plantas de controle quando cultivadas sob condições padrão. Um crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área foliar e o comprimento e a cobertura da raiz foram medidos. Os genes foram clonados sob a regulação de um promoter constitutivo (At6669; ID. SEQ. No: 8741). A avaliação do gene foi realizada restando o desempenho de números de eventos diferentes. Some of the genes were evaluated in more than one tissue culture assay resulting in positive results as well. Eventos com valor de p <0,1 eram considerados estatisticamente significativos Tabela 72 Genes que mostra melhor taxa de crescimento em condições de cultivo padrão (geração T2)
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Tabela 72. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 73 Genes que mostra melhor taxa de crescimento em condições de cultivo padrão (geração T1)
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Tabela 73. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. EXEMPLO 15 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DA PLANTA ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB ESTRESSE ABIÓTICO, BEM COMO SOB CONDIÇÕES FAVORÁVEIS EM ENSAIO REALIZADO EM ESTUFA
[00397] Tolerância ao ABS: Rendimento e taxa de crescimento da planta com alta concentração de salinidade sob condições de estufa (até o crescimento do caule) - Esse ensaio segue a formação da biomassa da planta e o crescimento da área da roseta de plantas cultivadas em estufa com irrigação de alto teor de salinidade e sob irrigação normal. Transgenic Arabidopsis seeds were sown in phytogel media supplemented with ^ MS medium and a selection agent (Kanamycin). As mudas transgênicas T2 foram, então, transplantadas em 1,7 bandejas com turfa e pelita na proporção de 1:1. Metade das plantas foram irrigadas com uma solução salina (150 mM de NaCl) de forma a induzir o estresse por salinidade (condições de estresse). A outra metade das plantas foi irrigada com água não filtrada (condições normais). Todas as plantas são cultivadas na estufa até o estágio de crescimento do caule, então, são colhidas (o tecido acima do solo) e pesadas (imediatamente ou após a secagem em forno a 50 °C por 24 horas). Altas condições de salinidade foram atingidas irrigando com uma solução contendo 150 mM NaCl (condições de cultivo “ABS”) e foram comparadas às condições de cultivo regulares.
[00398] Cada constructo foi validado como sua geração T2. Plantas transgênicas transformadas com uma construção que envolve um vetor vazio carregando o promotor AT6669 (ID. SEQ. No:8741) e o marcador selecionável foi utilizado como controle.
[00399] As plantas foram analisadas quanto ao seu tamanho geral, taxa de crescimento, peso fresco e material seca. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Plantas transgênicas falsas sem qualquer gene, sob o mesmo promotor, foram utilizadas como controle.
[00400] O experimento foi planejado em distribuição randomizada de vasos aninhados. Para cada gene do presente pedido de patente de invenção, três a cinco eventos de transformação independente foram analisados de cada constructo.
[00401] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem laboratorial, o qual consiste de uma câmera digital reflex (Canon EOS 300D) acompanhada de uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon EF-S series), instalada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), o qual incluiu quatro unidades de luz (4 x lâmpadas de 150 Watts) é utilizado para capturar imagens de amostras de plantas.
[00402] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias, começando a partir do 1 após o transplante até o dia 16. A mesma câmera, colocada em uma base de ferro sob medida, foi usada para capturar as imagens de plantas maiores em tubos brancos em uma estufa com ambiente controlado. Os tubos eram quadrados com bandejas de 1,7 litros. Durante o processo de captura, os toneis foram colocados debaixo do suporte de ferro, evitando a luz direta do sol e a fundição de sombras.
[00403] Um sistema de análise de imagem foi usado, que consiste em um computador de mesa pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 (programa de processamento de imagem em Java que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e disponível sem custo na internet no Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/). Foram capturadas imagens na resolução de 10 megapixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato de baixa compressão JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o programa de análise estatística JMP (SAS Institute).
[00404] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número de folhas, a área da roseta, o diâmetro da roseta, a área da lamina foliar, a Área Relativa do Pecíolo e o comprimento do pecíolo foliar.
[00405] Índice de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (RGR) da área da lamina foliar (Fórmula VIII), o número de folhas (Fórmula IX), a área da roseta (Fórmula X), o diâmetro da roseta (Fórmula XI), a cobertura do lote (Fórmula XII) e a Área Relativa do Pecíolo (XIII) conforme descrito acima.
[00406] Peso fresco e seco da planta - Aproximadamente no dia 80 da semeadura, as plantas foram colhidas e pesadas diretamente para a determinação do peso fresco da planta (FW) e deixadas para secara a 50 °C emu ma câmara de secagem por aproximadamente 48 horas antes da pesagem para determinar o peso seco da planta (DW).
[00407] Análises estatísticas - Para identificar os genes conferindo tolerância significativamente maior aos estresses abióticos, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados aos obtidos das plantas de controle. Para identificar os genes e constructos com melhor desempenho, os resultados dos eventos de transformação independente testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o teste t de Student e os resultados foram considerados significativos se o valor de p fosse inferior a 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Resultados experimentais:
[00408] Os genes listados nas Tabelas 74-83 melhoraram a ABST da planta em alta concentração de salinidade. Esses genes produziram plantas maiores com área fotossintética, biomassa (peso fresco, peso seco, diâmetro da roseta, área da roseta e cobertura do lote) maiores quando cultivadas sob alta concentração de salinidade. Os genes foram clonados sob o regulamento de um constitutivo (At6669; ID. SEQ. No: 8741). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de números de eventos diferentes. Eventos com valor de p <0,1 eram considerados estatisticamente significativos Tabela 74 Genes que apresentaram melhor biomassa da planta sob condições de salinidade elevada
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Tabela 74. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 75 Genes que apresentaram melhor biomassa da planta sob condições de salinidade elevada
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Tabela 75. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 76 Genes que apresentam melhor capacidade fotossintética da planta sob condições de salinidade elevada
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Tabela 76. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 77 Genes que apresentam melhor capacidade fotossintética da planta sob condições de salinidade elevada
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Tabela 77. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 78 Genes que apresentam melhor desempenho de crescimento da roseta sob condições de salinidade elevada
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Tabela 78. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 79 Genes que apresentam melhor produção de biomassa da planta em condições de cultivo padrão
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Tabela 79. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 80 Genes que apresentam melhor produção de biomassa da planta em condições de cultivo padrão
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Tabela 80. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 81 Genes que apresentam melhor capacidade fotossintética em condições de cultivo padrão
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Tabela 81. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 82 Genes que apresentam melhor capacidade fotossintética da planta em condições de cultivo padrão
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Tabela 82. “CONT.” - Controle; “Ave.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; "p-val." - valor de p. Tabela 83 Genes que apresentam melhor desempenho de crescimento da roseta em condições de cultivo padrão
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[00409] Embora o presente pedido de patente de invenção tenha sido descrito em conjunto em aplicações específicas dela, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para aqueles que tenham habilidade na técnica. Consequentemente, ela pretende envolver todas as alternativas, modificações e variações que estejam dentro do espírito e do amplo escopo das reivindicações anexas.
[00410] Todas as publicações, patentes e solicitações de patentes mencionadas nessa especificação estão incorporadas aqui na íntegra por referência na especificação, como se cada publicação, patente ou solicitação de patente individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada aqui como referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência nessa solicitação não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência esteja disponível antes da técnica do presente pedido de patente de invenção. Na extensão de que os títulos da seção sejam utilizados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitantes.

Claims (13)

1. Método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, e/ou vigor de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende a superexpressão, dentro da planta, de um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácidos nucleicos (i) como apresentada pela SEQ ID NO: 321 ou 52, que codifica o polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 525, ou uma sequência degenerada da mesma que codifica o referido polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 525; ou (ii) um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácidos nucleicos apresentada pela SEQ ID NO: 1109, que codifica o polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 5796, ou uma sequência degenerada da mesma, que codifica o referido polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 5796, em comparação com uma planta nativa da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento, em que o estresse abiótico é o estresse de salinidade, aumentando, dessa forma, a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, e/ou vigor da planta.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinuleotídeo compreende a sequência de ácidos nucleicos apresentada pela SEQ ID NO: 321 ou 52, que codifica o polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 525, ou uma sequência degenerada da mesma, que codifica o referido polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 525.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 321, 52 ou 1109.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 321, e 52.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o crescimento da planta superexpressando o referido polinucleotídeo sob o estresse abiótico.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda selecionar a planta superexpressando o dito polinucleotídeo para uma tolerância ao estresse abiótico, rendimento, biomassa, taxa de crescimento, e/ou vigor aumentados em comparação com uma planta nativa da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento, em que o referido estresse abiótico é o estresse de salinidade.
7. Construto de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucléico (i) apresentada pela SEQ ID NO: 321 ou 52, que codifica o polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 525, ou uma sequência degenerada da mesma, que codifica o referido polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 525; ou (ii) um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácidos nucleicos apresentada pela SEQ ID NO: 1109, que codifica o polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 5796, ou uma sequência degenerada da mesma, que codifica o referido polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 5796, operacionalmente ligada a um promotor vegetal heterólogo para direcionar transcrição da referida sequência de ácido nucleico em uma célula vegetal.
8. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo compreende a sequência de ácidos nucleicos apresentada pela SEQ ID NO: 321 ou 52, que codifica o polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 525, ou uma sequência degenerada da mesma, que codifica o referido polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 525.
9. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 321, 52 e 1109.
10. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 321, e 52.
11. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.
12. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor específico de tecido.
13. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzível.
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