BR122020005661B1

BR122020005661B1 - Método para aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, taxa de crescimento, biomassa, vigor, conteúdo de óleo, rendimento de sementes, rendimento de fibra, qualidade de fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, método para selecionar uma planta transformada e construção de ácido nucleico

Info

Publication number: BR122020005661B1
Application number: BR122020005661-4A
Authority: BR
Inventors: Adi ETZIONI; Hagai Karchi
Original assignee: Evogene Ltd
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2022-10-25
Also published as: BR122020005664B1; CA2896426C; US11453888B2; AU2019257481A1; BR122020005662B1; AU2019257481B2; AU2013368878B2; MX355751B; WO2014102774A1; AU2013368878A1; US20180030469A1; BR122020005652B1; BR122020005657B1; AU2021266196A1; US10501751B2; US20230313218A1; BR122020005659B1; MX2015008377A; CA2896426A1; US20200063154A1

Abstract

Fornece polipeptídeos isolados que são, pelo menos, 80% homólogos às SEQ ID NO 496-794, 2898-3645 e 36474855, polinucleotídeos isolados que são, pelo menos, 80% idênticos às SEQ ID NO 1-495 e 795-2897, estruturas de ácido nucleico compreendendo os mesmos, células transgênicas expressando os mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e um método para uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso de nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, capacidade fotossintética, produção de sementes, produção de fibra, qualidade de fibra, comprimento da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

Description

CAMPO DE APLICAÇÃO E HISTÓRICO

[001] O presente pedido de patente de invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, estruturas de ácido nucleico compreendendo os mesmos, células transgênicas compreendendo os mesmos, plantas transgênicas expressando de forma exógena os mesmos e, mais particularmente, mas não exclusivamente, a métodos de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de fertilizantes (por exemplo, a eficiência de uso do nitrogênio), a produção (por exemplo, produção de sementes, produção do óleo), biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[002] Uma abordagem comum para promover o crescimento das plantas foi e continua a ser o uso de nutrientes naturais, bem como sintéticos (fertilizantes). Assim, os fertilizantes são o combustível por trás da “revolução verde”, diretamente responsáveis pelo aumento excepcional da produção das culturas durante os últimos 40 anos e são considerados a despesa geral número um na agricultura. Por exemplo, os fertilizantes nitrogenados inorgânicos, tais como o nitrato de amônio, nitrato de potássio ou ureia, normalmente são responsáveis por 40% dos custos relacionados a culturas como o milho e o trigo. Dos três macronutrientes fornecidos como fertilizantes principais [nitrogênio (N), fosfato (P) e potássio (K)], o nitrogênio é frequentemente o elemento limitante no crescimento das plantas e todas as culturas têm uma dependência fundamental em fertilizantes nitrogenados inorgânicos. O nitrogênio é responsável pela biossíntese de aminoácidos e ácidos nucleicos, grupos prostéticos, hormônios vegetais, defesas químicas das plantas, etc. e, geralmente, ele precisa ser reabastecido a cada ano, particularmente nos cereais, os quais compõem mais da metade das áreas cultivadas em todo o mundo. Assim, o nitrogênio é translocado para o rebento, onde é armazenado nas folhas e no caule durante a etapa rápida do desenvolvimento da planta e até a floração. No milho, por exemplo, as plantas acumulam a maior parte de seu nitrogênio orgânico durante o período de germinação de grãos e até a floração. Uma vez que ocorre a fecundação da planta, os grãos começam a se formar e se tornam os principais coletores do nitrogênio da planta. O nitrogênio armazenado pode ser redistribuído em seguida a partir das folhas e do caule que serviram como compartimentos de armazenamento até a formação de grãos.

[003] Uma vez que o fertilizante se esgota rapidamente da maioria dos tipos de solo, ele deve ser fornecido para o crescimento das colheitas duas ou três vezes durante a estação de crescimento. Além disso, a baixa eficiência no uso de nitrogênio (NUE | nitrogen use efficiency) das principais culturas (por exemplo, no intervalo de apenas 30-70%), afeta negativamente as despesas de entrada para o agricultor, devido ao excesso de fertilizantes aplicados. Além disso, o uso ineficiente ou sobreuso de fertilizantes são os principais fatores responsáveis pelos problemas ambientais, tais como a eutrofização das águas subterrâneas, lagos, rios e mares, poluição de nitratos na água potável, podendo causar a metemoglobinemia, a poluição de fosfato, a poluição atmosférica e afins. No entanto, apesar do impacto negativo dos fertilizantes no meio ambiente e os limites na utilização de fertilizantes, que foram legislados em vários países, o uso de fertilizantes deverá aumentar a fim de apoiar a produção de alimentos e fibras para um rápido crescimento populacional sobre os recursos limitados da terra. Por exemplo, estima-se que em 2050, mais de 150 milhões toneladas de fertilizantes azotados serão usadas em todo o mundo anualmente.

[004] O aumento da eficiência no uso de nitrogênio pelas plantas deve permitir que as culturas sejam cultivadas com baixa entrada de fertilizantes ou, alternativamente, sejam cultivadas em solos de pior qualidade e, portanto, tenha um impacto econômico significativo em sistemas agrícolas desenvolvidos e em desenvolvimento.

[005] O melhoramento genético da eficiência no uso de fertilizantes (FUE|fertilizer use efficiency) em plantas pode ser gerado através do cultivo tradicional ou através de engenharia genética.

[006] Tentativas de geração de plantas com FUE melhorada foram descritas na Publicação de Pedido de Patente Norte-americano N° 20020046419 (Pedido de Patente Norte- americano N° 7.262.055, de Choo, et al.); N° de Pedido de Patente Americano 20050108791, de Edgerton et al.; N° de Pedido de Patente Americano 20060179511, de Chomet et al.; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); e Good AG et al. 2004 (Trends Plant Sci. 9:597-605).

[007] Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.

[008] U.S.A. 2004 101:7833-8) descreve plantas transgênicas Dof1 que apresentam um crescimento melhorado sob condições de baixo nível de nitrogênio.

[009] O N° de Patente Americano 6.084.153, de Good et al. divulga o uso de um promotor sensível ao estresse para controlar a expressão da Alanina Aminotransferase (AlaAT| Alanine Amine Transferase) e das plantas de canola transgênica com resistência à seca e deficiência de nitrogênio melhorada quando comparadas às plantas de controle.

[0010] A produção é afetada por vários fatores, tais como o número e tamanho dos órgãos da planta, arquitetura da planta (p.ex., o número de ramificações), comprimento definido dos grãos, número de grãos cheios, vigor (p.ex., a muda), taxa de crescimento, desenvolvimento da raiz, utilização de água, nutrientes (p.ex., nitrogênio) e fertilizantes e tolerância ao estresse.

[0011] Culturas, tais como as do milho, arroz, trigo, canola e soja respondem por mais da metade da ingestão calórica total humana, seja através do consumo direto das próprias sementes ou através do consumo de produtos de carne de animais criados com sementes processadas ou forragem. As sementes também são uma fonte de açucares, proteínas e óleos e metabólitos utilizados em processos industriais. A habilidade de aumentar a produção de planta, seja através do aumento da taxa de acúmulo de matéria seca, modificando a celulose ou a composição da lignina, aumento da resistência do caule, aumento do tamanho do meristema, mudança do padrão de ramificação da planta, firmeza das folhas, aumento na eficiência da fertilização, aumento da taxa de acúmulo de matéria seca, modificação do desenvolvimento da semente, melhora do enchimento da semente ou o aumento do teor de óleo, amido ou proteína nas sementes teria muitas aplicações na utilização agrícola e não- agrícola tais como na produção biotecnológica de produtos farmacêuticos, anticorpos ou vacinas.

[0012] Os óleos de semente ou vegetais são a fonte principal de energia e nutrição na dieta humana e animal. Eles também são utilizados para a produção de produtos industriais, tais como pinturas, tintas e lubrificantes. Além disso, os óleos da planta representam fontes renováveis de hidrocarbonetos de cadeia longa, os quais podem ser utilizados como combustível. Uma vez que os combustíveis fósseis utilizados atualmente são fontes limitadas e estão sendo esgotadas gradualmente, as safras de biomassa de crescimento rápido podem ser utilizadas como combustíveis alternativos ou para matérias-primas de energia e podem reduzir a dependência dos fornecimentos de energia fóssil. No entanto, o obstáculo principal para o aumento do consumo de óleos de planta como biocombustível é o preço do óleo, o qual ainda é mais alto que o combustível fóssil. Além disso, a taxa de produção do óleo da planta é limitada através da disponibilidade de território agrícola e água. Desse modo, o aumento nas produções de óleo de planta da mesma área de crescimento pode superar efetivamente a escassez no espaço de produção e pode diminuir os preços do óleo vegetal ao mesmo tempo.

[0013] Estudos que visam o aumento das produções de óleo de planta focam-se na identificação dos genes envolvidos no metabolismo do óleo, bem como em genes capazes de aumentar as produções de semente e planta nas plantas transgênicas. Genes conhecidos por estar envolvidos no aumento das produções de óleo de planta incluem aqueles que participam na síntese ou captura do ácido graxo, tal como dessaturase [p.ex., DELTA6, DELTA12 ou acil-ACP (Ssi2; Fonte de Informação de Arabidopsis (TAIR; arabidopsis (ponto) org/), TAIR N° AT2G43710)], OleosinA (TAIR N°. AT3G01570) ou FAD3 (TAIR N°. AT2G29980) e vários fatores de transcrição e ativadores, tal como Lec1 [TAIR N°. AT1G21970, Lotan et al. 1998. Cell. 26;93(7):1195- 205], Lec2 [TAIR N°. AT1G28300, Santos Mendoza et al. 2005, FEBS Lett. 579(21):4666-70], Fus3 (TAIR No. AT3G26790), ABI3 [TAIR N°. AT3G24650, Lara et al. 2003. J Biol Chem. 278(23): 21003-11] e Wri1 [TAIR N°. AT3G54320, Cernac e Benning, 2004. Plant J. 40(4): 575-85]. [0013] Esforços da engenharia genética que visam o aumento no teor de óleo nas plantas (p.ex., em sementes) incluem a regulação ascendente do retículo endoplasmático (FAD3) e plasitidal (FAD7), ácido graxo desaturase em batata (Zabrouskov V., et al., 2002; Physiol Plant. 116:172-185); superexpressando os fatores de transcrição GmDof4 e GmDof11 (Wang HW et al., 2007; Plant J. 52:716-29); superexpressando glicerol-3-fosfato desidrogenase em leveduras sob o controle de um promotor específico de planta (Vigeolas H, et al. 2007, Plant Biotechnol J. 5:431-41; Pedido de Patente Norte- Americana N° 20060168684); utilizando genes FAE1 de Arabidopsis e SLC1-1 de leveduras para melhorias no ácido erúcico e teor de óleo em colza (Katavic V, et al., 2000, Biochem Soc Trans. 28:935-7).

[0014] Diversos pedidos de patente revelam genes e proteínas que podem aumentar o teor de óleo em plantas. Estes incluem, por exemplo, o Pedido de Patente Norte- Americana N° 20080076179 (proteína de metabolismo lipídico); o Pedido de Patente Norte-Americana N° 20060206961 (polipeptídeo Ypr140w); o Pedido de Patente Norte-Americana N° 20060174373 [síntese de triacilgliceróis que reforçam a proteína (TEP)]; os Pedidos de Patente Norte-Americana N° 20070169219, 20070006345, 20070006346 e 20060195943 (que revelam plantas transgênicas com aumento da eficiência no uso de nitrogênio que podem ser utilizadas para conversão em combustível ou matérias-primas químicas) e o WO2008/122980 (polinucleotídeos para aumento do teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, produção e/ou vigor de uma planta).

[0015] Condições de estresse abiótico (ABS| Abiotic stress; também conhecido como “estresse ambiental”) tais como salinidade, seca, inundação, temperatura subaproveitada e poluição química tóxica, causam danos substanciais às plantas agrícolas. A maioria das plantas desenvolveu estratégias para se proteger contra essas condições. No entanto, se a gravidade e a duração das condições do estresse forem grandes demais, os efeitos no desenvolvimento da planta, no crescimento e na produção da maioria das espécies vegetais são profundos. Além disso, a maioria das espécies vegetais é altamente suscetível ao estresse abiótico e, portanto, exigem condições de cultivo ideal para as safras da cultura comercial. A exposição contínua ao estresse causa alterações importantes no metabolismo vegetal que em última análise, leva à morte celular e, consequentemente, gera perdas. A seca é um fenômeno gradual, que envolve períodos de tempo anormalmente secos que duram o suficiente para produzir desequilíbrios hidrológicos sérios, como danos à cultura, falta de abastecimento de água e aumento da suscetibilidade a várias doenças. Em casos graves, a seca pode durar muitos anos e resulta em efeitos devastadores na agricultura e abastecimento de água. Além disso, a seca está associada com o aumento da suscetibilidade a várias doenças. [0017] Para a maioria das plantas de cultivo, as regiões de plantio do mundo são muito áridas. Além disso, o uso excessivo de água disponível resulta em maior perda de terra agrícola utilizável (desertificação), e aumento da acumulação de sal em solos adiciona à perda de água disponível em solos.

[0016] A salinidade, níveis elevados de sal, afeta um em cada cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco principais culturas alimentares, i.e. trigo, milho, arroz, batatas e soja, consegue tolerar o excesso de sal. Os efeitos prejudiciais do sal sobre as plantas resultam tanto da deficiência de água, que leva ao estresse osmótico (semelhante ao estresse causado pela seca), quanto do efeito do excesso de íons de sódio sobre processos bioquímicos importantes. Assim como o congelamento e a seca, quantidades elevadas de sal causam déficit de água; e a presença de níveis elevados de sal torna difícil para as raízes das plantas extraírem água de seu ambiente. A salinidade do solo, portanto, é uma das variáveis mais importantes que determinam se uma planta pode prosperar. Em muitas partes do mundo, áreas de terra consideráveis são incultiváveis devido à salinidade do solo ser naturalmente alta. Assim, a salinização dos solos que são utilizados para a produção agrícola é um problema significativo e crescente nas regiões que dependem fortemente da agricultura e está a agravar-se pelo excesso de utilização, excesso de fertilização e escassez de água, geralmente causado por alterações climáticas e pelas demandas do aumento da população. A tolerância ao sal é de particular importância no início do ciclo de vida da planta, já que a evaporação da superfície do solo faz com que o movimento ascendente de água e sal se acumule na camada superior do solo, onde as sementes são colocadas. Por outro lado, a germinação normalmente ocorre em uma concentração de sal que é maior do que o nível médio de sal em todo o perfil do solo.

[0017] A transdução do sinal de estresse do sal e da seca consiste em caminhos de sinalização da homeostase iônica e osmótica. O aspecto iônico do estresse do sal é sinalizado através do caminho SOS, onde um complexo de quinase de proteína SOS3-SOS2 responsiva a cálcio controla a expressão e a atividade dos transportadores de íons, como o SOS1. O componente osmótico do estresse de sal envolve reações complexas da planta que se sobrepõem com respostas de estresse da seca e/ou do frio.

[0018] As temperaturas subótimas afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta durante todo o seu ciclo de vida. Dessa forma, baixas temperaturas reduzem a taxa de germinação e temperaturas elevadas resultam na necrosa da folha. Além disso, plantas maduras expostas ao excesso de calor podem experimentar o choque de calor, que pode surgir em vários órgãos, incluindo as folhas e, principalmente, os frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse causado pelo calor. O calor também danifica as estruturas celulares, incluindo as organelas e o citoesqueleto e prejudica a função da membrana. O choque de calor pode produzir uma diminuição na síntese geral das proteínas, acompanhada pela expressão de proteínas de choque de calor, p.ex., as chaperonas, que estão envolvidas no rearranjo das proteínas desnaturadas pelo calor. O dano causado pela alta temperatura ao pólen quase sempre ocorre em conjunto com o estresse causado pela seca e, raramente, ocorre sob boas condições de irrigação. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta de novas maneiras. Condições de frio excessivo, p.ex., temperaturas baixas, mas acima do ponto de congelamento, afetam as culturas de origem tropical, como a soja, o arroz, o milho e o algodão. O dano típico causado pelo frio inclui emurchecimento, a necrose, a clorose ou perda de íons das membranas celulares. Os mecanismos subjacentes de sensibilidade ao frio não são completamente compreendidos ainda, mas provavelmente envolvem o nível de saturação de membrana e outras deficiências fisiológicas. Condições de luz excessiva, que ocorrem sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites frias do final do verão/outono, podem levar à fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese). Além disso, o frio pode levar a perdas de produção e à qualidade inferior do produto através do amadurecimento tardio do milho.

[0019] Aspectos comuns da seca, resposta ao estresse do frio e sal [Revisto em Xiong e Zhu (2002) Plant Cell Environ. 25:131-139] incluem: (a) alterações transitórias nos níveis de cálcio citoplasmático prévio no evento de sinalização; (b) sinal de transdução através de quinase de proteína dependente de cálcio (CDPKs | calcium dependent protein kinases) e/ou ativada por mitógeno e fosfatases da proteína; (c) aumentos nos níveis de ácido abscísico em resposta ao estresse, desencadeando um subconjunto das respostas; (d) fosfatos de inositol como moléculas de sinal (pelo menos para um subconjunto das alterações transitórias responsivas ao stress; (e) ativação de fosfolipases, que por sua vez, geram um leque diversificado de moléculas do segundo mensageiro, alguns dos quais podem regular a atividade das quinases responsivos ao stress; (f) a indução dos genes do tipo abundantes na embriogênese tardia (LEA | late embryogenesis abundant), incluindo os genes responsivos CR/RD CRT/DRE; (g) aumento dos níveis de antioxidantes e osmólitos compatíveis como prolina e açúcares solúveis; e (h) a acumulação de espécies reativas de oxigênio, como superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila. A biossíntese do ácido abscísico é regulada por estresse osmótico em várias etapas. A sinalização do estresse osmótico, tanto dependente da ABA quanto independente, modificam primeiramente os fatores de transcrição constitutivamente expressos, levando à expressão dos ativadores transcricionais de resposta prévia, que em seguida, ativam os genes efetores de tolerância ao estresse a jusante.

[0020] Vários genes que aumentam a tolerância ao estresse do frio ou sal também podem melhorar a proteção ao estresse de seca, incluindo, por exemplo, o fator de transcrição AtCBF/DREB1, OsCDPK7 (Saijo et al. 2000, Plant J. 23: 319-327) ou AVP1 (a vacuolar pyrophosphatase-proton pump, Gaxiola et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11444-11449).

[0021] Estudos demonstraram que adaptações da planta a condições ambientais adversas são traços genéticos complexos de natureza poligênica. Meios convencionais de cultura e melhoras de horticulturas utilizam técnicas de melhoramento seletivas para identificar plantas que apresentem características desejáveis. No entanto, o melhoramento seletivo é tedioso, consome tempo e apresenta resultado imprevisível. Além disso, recursos germoplasmáticos limitados para melhora da produção e a incompatibilidade nos cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionadas representam problemas significativos encontrados no melhoramento convencional. Avanços na engenharia genética permitiram que o homem modificasse o germoplasma das plantas pela expressão de genes de interesse nas plantas. Essa tecnologia tem a capacidade de gerar culturas ou plantas com traços econômicos, agronômicos ou horticulturais melhorados.

[0022] Os esforços da engenharia genética, focados em conferir tolerância ao estresse abiótico às culturas transgênicas, foram descritos em várias publicações [Apse e Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13:146-150, 2002), Quesada et al. (Plant Physiol. 130:951-963, 2002), Holmstrom et al. (Nature 379: 683-684, 1996), Xu et al. (Plant Physiol 110: 249-257, 1996), Pilon-Smits e Ebskamp (Plant Physiol 107: 125-130, 1995) e Tarczynski et al. (Science 259: 508- 510, 1993)].

[0023] Várias patentes e pedidos de patente divulgam os genes e as proteínas que podem ser utilizados para aumentar a tolerância das plantas ao estresse abiótico. Estas incluem, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas N° 5.296.462 e 5.356.816 (para aumentar a tolerância ao estresse ao frio); a Patente Norte-Americana N° 6.670.528 (para aumentar a ABST); a Patente Norte-Americana N° 6.720.477 (para aumentar a ABST); N° de Série de Pedido de Patente Norte-Americana 09/938842 e 10/342224 (para aumentar a ABST); N° de Série de Pedido de Patente Norte-Americana 10/231035 (para aumentar a ABST); WO2004/104162 (para aumentar a ABST e biomassa); WO2007/020638 (para aumentar a ABST, biomassa, vigor e/ou produção); WO2007/049275 (para aumentar a ABST, biomassa, vigor e/ou produção); WO2010/076756 (para aumentar a ABST, biomassa e/ou produção);. WO2009/083958 (para aumentar a eficiência no uso da água, eficiência no uso de fertilizantes, tolerância ao estresse biótico-abiótico, produção e/ou biomassa); WO2010/020941 (para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, produção e/ou biomassa); WO2009/141824 (para aumentar a utilidade da planta); WO2010/049897 (para aumentar a produção da planta).

[0024] A deficiência de nutrientes causa adaptações da arquitetura da raiz, particularmente notável, por exemplo, é a proliferação da raiz dentro de áreas ricas em nutrientes para aumentar a absorção dos nutrientes. A deficiência de nutrientes causa, também, a ativação de caminhos metabólicos da planta que maximizam os processos de absorção, assimilação e distribuição como pela ativação de mudanças da arquitetura. A engenharia da expressão dos genes desencadeados pode fazer com que a planta mostre as mudanças em sua arquitetura e o metabolismo melhorado, também, sob outras condições.

[0025] Além disso, é amplamente conhecido que as plantas geralmente respondem à deficiência de água criando um sistema de raízes mais profundas que permitem o acesso à umidade localizada em camadas mais profundas do solo. O desencadeamento desse efeito permitirá às plantas acessarem os nutrientes e a água localizados em horizontes mais profundos do solo, particularmente, aqueles prontamente dissolvidos na água, como os nitratos.

[0026] O algodão e subprodutos do algodão fornecem matérias- primas que são utilizadas para produzir uma grande variedade de produtos com base nos consumidores, além de têxteis, incluindo gêneros alimentícios do algodão, ração animal, fertilizante e papel. A produção, comercialização, consumo e comércio de produtos baseados em algodão geram um excesso de 100 bilhões de dólares anualmente apenas nos EUA, fazendo do algodão a cultura número um em termos de valor acrescentado.

[0027] Apesar de 90% do valor do algodão como uma cultura residir na fibra (fiapo), a produção e qualidade da fibra diminuiu devido à erosão geral na diversidade genética de variedades de algodão e uma vulnerabilidade acrescida da cultura às condições ambientais.

[0028] Existem muitas variedades de algodoeiros, das quais fibras de algodão com uma gama de características podem ser obtidas e utilizadas para várias aplicações. As fibras de algodão podem ser caracterizadas de acordo com uma variedade de propriedades, algumas das quais são consideradas altamente desejáveis dentro da indústria têxtil para a produção de produtos de qualidade cada vez mais alta e exploração otimizada de tecnologias de fiação modernas. Propriedades comercialmente desejáveis incluem comprimento, uniformidade do comprimento, finura, relação de maturidade, produção reduzida da fibra, micronário, resistência do feixe e resistência da fibra única. Muito esforço tem sido posto na melhoria das características das fibras de algodão, principalmente focando o comprimento da fibra e a finura da fibra. Em particular, há uma grande demanda de fibras de algodão de comprimentos específicos.

[0029] Uma fibra de algodão é composta de uma única célula que se diferenciou de uma célula epidérmica da cobertura da semente, desenvolvendo-se através de quatro estágios, ou seja, iniciação, alongamento, estágios de espessamento e maturação de parede celular secundária. Mais especificamente, o alongamento de uma fibra de algodão começa na célula epidérmica do óvulo imediatamente após o florescimento, depois do qual a fibra de algodão rapidamente se alonga por cerca de 21 dias. O alongamento da fibra é então finalizado, e uma parede celular secundária é formada e crescida através de maturação, tornando-se uma fibra de algodão madura.

[0030] Vários genes candidatos que estão associados ao alongamento, à formação, à qualidade e à produção das fibras de algodão foram divulgados em vários pedidos de patentes, tais como a Patente Norte-Americana N° 5.880.100 e N° de Série de Pedido de Patente Norte-Americana 08/580.545, 08/867.484 e 09/262.653 (que descrevem os genes envolvidos na fase de alongamento da fibra de algodão); WO0245485 (que melhoram a qualidade da fibra, modulando a sintase de sacarose); Patentes Norte-Americanas N° 6.472.588 e WO0117333 (que aumentam a qualidade da fibra por transformação com sintase de codificação de fosfato de sacarose do DNA); WO9508914 (que utiliza um promotor específico da fibra e uma sequência de codificação que codifica a peroxidase de algodão); WO9626639 (que utiliza uma sequência de promoção específica do ovário para expressar o cultivo da planta, modificando os hormônios no tecido do óvulo do algodão, alterando características de qualidade da fibra, tais como dimensão de fibra e força); Patente Norte-Americana N° 5.981.834, Patente Norte- Americana N° 5.597.718, Patente Norte-Americana N° 5.620.882, Patente Norte-Americana N° 5.521.708 e Patente Norte-Americana N° 5.495.070 (sequências de codificação para alterar as características das plantas que produzem fibras transgênicas); Pedido de Patente Norte-Americana N° 2002049999 e Patente Norte-Americana N° 2003074697 (que expressam um código genético para transferase endoxiloglucana, catalase ou peroxidase para melhorar as características da fibra de algodão); WO 01/40250 (que melhora a qualidade da fibra do algodão, modulando a expressão genética do fator de transcrição); WO 96/40924 (uma região reguladora da iniciação transcricional da fibra de algodão associada, a qual é expressa em fibra de algodão); EP0834566 (um gene que controla o mecanismo de formação da fibra no algodoeiro); WO2005/121364 (que melhora a qualidade da fibra do algodão, modulando a expressão do gene); WO2008/075364 (que melhora a tolerância de qualidade, produção/biomassa/vigor e/ou tolerância estresse abiótico da fibra das plantas).

[0031] A publicação WO N° 2004/104162 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas geradas deste modo.

[0032] A publicação WO N° 2004/111183 divulga sequências de nucleotídeos para regular a expressão do gene em tricomas e estruturas de plantas e métodos utilizando os mesmos.

[0033] A publicação WO N° 2004/081173 divulga novas sequências e estruturas regulatórias derivadas da planta e métodos de utilização de tais sequências para direcionar a expressão das sequências de polinucleotídeo exógeno nas plantas.

[0034] A publicação WO N° 2005/121364 revela polinucleotídeos e polipeptídeos envolvidos no desenvolvimento de fibras vegetais e método de uso dos mesmos, a fim de aumentar a qualidade das fibras, a produção e/ou biomassa de uma planta produtora de fibras.

[0035] A publicação WO N° 2007/049275 revela polipeptídeos isolados, polinucleotídeos que codificam os mesmos, plantas transgênicas que expressam os mesmos e método de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de fertilizantes, a tolerância ao estresse abiótico da planta e biomassa.

[0036] A publicação WO N° 2007/020638 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas e plantas geradas desse modo.

[0037] A publicação WO N° 2008/122980 revela estruturas de genes e métodos para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento e biomassa de plantas.

[0038] A publicação WO N° 2008/075364 revela polinucleotídeos envolvidos no desenvolvimento da fibra da planta e métodos de uso dos mesmos.

[0039] A publicação WO N° 2009/083958 revela métodos para aumentar a eficiência no uso de água, eficiência no uso de fertilizantes, tolerância ao estresse biótico/abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.

[0040] A publicação WO N° 2009/141824 revela polinucleotídeos isolados e métodos para uso dos mesmos para aumentar a utilidade da planta.

[0041] A publicação WO N° 2009/013750 revela genes, estruturas e métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, biomassa e / ou produção em plantas geradas desse modo.

[0042] A publicação WO N° 2010/020941 revela métodos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.

[0043] A publicação WO N° 2010/076756 divulga polinucleotídeos isolados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[0044] A publicação WO2010/100595 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.

[0045] A publicação WO N° 2010/049897 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso de nitrogênio.

[0046] A publicação WO2010/143138 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água.

[0047] A publicação WO N° 2011/080674 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso de nitrogênio.

[0048] A publicação WO2011/015985 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos para aumentar as qualidades desejáveis da planta.

[0049] A publicação WO2011/135527 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.

[0050] A publicação WO2012/028993 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar da eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico.

[0051] A publicação WO2012/085862 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para melhorar as propriedades da planta.

[0052] A publicação WO2012/150598 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico das plantas e eficiência no uso do nitrogênio.

[0053] A publicação WO2013/027223 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.

[0054] A publicação WO2013/080203 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico.

[0055] A publicação WO2013/098819 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção das plantas.

[0056] A publicação WO2013/128448 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico das plantas e eficiência no uso do nitrogênio.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0057] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo, pelo menos, 80% idêntico à ID SEQ. N° [Identificação de Sequência N°]: 496-794, 2898-3645, 3647-4854 ou 4855, aumentando, desta forma, a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico da planta.

[0058] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855, aumentando, desta forma, a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico da planta.

[0059] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para produzir uma colheita, compreendendo o cultivo de uma planta de colheita transformada com um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, 80% homólogo à sequência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855, caracterizado pela planta de colheita ser derivada de plantas selecionadas para aumento da eficiência no uso do nitrogênio, aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que foi cultivada sob as mesmas condições de cultivo, e a planta de colheita tendo aumento da eficiência no uso do nitrogênio, aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, produzindo, desta forma, a colheita.

[0060] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica à ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 ou 2897, aumentando, desta forma, a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico da planta.

[0061] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionado de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897, aumentando, desta forma, a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico da planta.

[0062] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para produzir uma colheita, compreendendo o cultivo de uma planta de colheita transformada com um polinucleotídeo exógeno que compreende uma sequência de ácido nucleico, a qual é, pelo menos, 80% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897, caracterizado pela planta de colheita ser derivada de plantas (plantas progenitoras) selecionadas para aumento da eficiência no uso do nitrogênio, aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que foi cultivada sob as mesmas condições de cultivo, e a planta de colheita tendo aumento da eficiência no uso do nitrogênio, aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, produzindo, desta forma, a colheita.

[0063] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, o qual compreende uma sequência de aminoácidos, pelo menos, 80% homóloga à sequência de aminoácidos estabelecida nas ID SEQ. N° 496- 794, 2898-3645, 3647-4854 ou 4855, caracterizado pela sequência de aminoácidos ser capaz de aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico de uma planta.

[0064] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, o qual compreende a sequência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[0065] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica à ID SEQ. N° 1-495, 795- 2896 ou 2897, caracterizado pela sequência de ácido nucleico ser capaz de aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico de uma planta.

[0066] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 1495, 795-2896 e 2897.

[0067] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

[0068] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos, 80% homóloga à ID SEQ. N° 496-794, 28983645, 3647- 4854 ou 4855, caracterizado pela sequência de aminoácidos ser capaz de aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância estresse abiótico de uma planta.

[0069] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[0070] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena o polinucleotídeo de algumas aplicações da invenção ou a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção.

[0071] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena o polipeptídeo de algumas aplicações da invenção.

[0072] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido uma planta transgênica, compreendendo a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção, ou a célula de planta de algumas aplicações da invenção.

[0073] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de cultivo de uma cultura, o método compreendendo a semeadura de sementes e/ou plantio de mudas de uma planta transformada com o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção ou a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo consistindo em aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção da fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e aumento do teor de óleo se comparada a uma planta não transformada, aumentando, desse modo, a colheita.

[0074] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de seleção de uma planta transformada tendo aumento da eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie cultivada sob as mesmas condições de cultivo, o método compreendendo: (a) fornecer plantas transformadas com um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo, compreendendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos, 80% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 36474854 e 4855, (b) selecionar, a partir das plantas, uma planta tendo aumento da eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico, selecionando, deste modo, a planta tendo aumento da eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de cultivo.

[0075] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de seleção de uma planta transformada, tendo aumento de eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie cultivada sob as mesmas condições de cultivo, o método compreendendo: (a) fornecer plantas transformadas com um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo, compreendendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos, 80% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ No 1-495, 795-2896 e 2897, (b) selecionar, a partir das plantas, uma planta tendo aumento da eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico, selecionado, deste modo, a planta tendo aumento de eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de cultivo.

[0076] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[0077] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 1495, 795-2896 e 2897.

[0078] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo consiste da sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897.

[0079] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[0080] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula hospedeira é uma célula de planta.

[0081] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula da planta forma parte de uma planta.

[0082] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o cultivo da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno em estresse abiótico.

[0083] De acordo com algumas aplicações da invenção, o estresse abiótico é selecionado de um grupo consistindo de salinidade, seca, estresse osmótico, privação de água, inundação, etiolação, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, deficiência de nitrogênio, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.

[0084] De acordo com algumas aplicações da invenção, a produção compreende a produção de semente ou produção de óleo.

[0085] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o cultivo da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno sob condições limitantes de nitrogênio.

[0086] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.

[0087] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado é heterólogo à célula da planta.

[0088] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem de base genética idêntica.

[0089] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem da mesma espécie.

[0090] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta não transformada é cultivada sob condições de cultivo idênticas.

[0091] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, selecionar uma planta tendo aumento de eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de cultivo.

[0092] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados aqui apresentam o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual a invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou no teste das aplicações da invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflito, o quadro reivindicatório da patente, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0093] Algumas aplicações da invenção são descritas aqui, apenas como exemplos, com referência aos desenhos anexos. Agora, com referência específica aos desenhos em detalhes, enfatiza-se que as particularidades mostradas são exemplares e para os propósitos de discussão ilustrativa das aplicações da invenção. Nesse sentido, a descrição que acompanha os desenhos torna aparente àqueles com habilidade na técnica como as aplicações da invenção podem ser praticadas. Nos desenhos: A Figura 1 é uma ilustração esquemática de um plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 4880) e o GUSintron (pQYN_6669) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; MCS - Sítio de clonagem múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron). As sequências do polinucleotídeo isolado da invenção foram clonadas no vetor enquanto substituíam o gene repórter GUSintron.

[0094] A Figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 4880) (pQFN ou pQFNc) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado da invenção. RB [right border] - borda direita do T-DNA; LB [left border] - borda esquerda do T-DNA; MCS [multiple cloning site]- Local de clonagem múltipla; RE [restriction enzyme] - qualquer enzima de restrição; NOS pro [nopalinha synthase promoter] = promotor da nopalina sintase; NPT-II [neomycin phosphotransferase] = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter [nopalinha synthase terminator] = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação). As sequências do polinucleotídeo isolado da invenção foram clonadas no MCS do vetor.

[0095] As Figuras 3A-F são imagens que descrevem a visualização do desenvolvimento da raiz de plantas transgênicas de forma exógena expressando o polinucleotídeo de algumas aplicações da invenção quando cultivadas em placas de ágar transparentes sob condições normais (Figuras 3A-B), estresse osmótico (15% de PEG. Figs. 3C-D) ou limitação de nitrogênio (Figuras 3E-F). Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de ágar transparente por 17 dias (7 dias de viveiro e 10 dias após a transplantação). As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias iniciando no dia 1 após a transplantação Fig. 3A - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar quando cultivadas sob condições normais (padrão). Fig. 3B - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3A na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Fig. 3C - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de Agar, cultivadas sob condições altamente osmóticas (PEG 15%). Fig. 3D - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3C na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Fig. 3E - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar, cultivadas sob condições de baixo teor de nitrogênio. Fig. 3F - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3E na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas.

[0096] A Figura 4 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o Promotor de Raiz (pQNa RP) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação; as sequências do polinucleotídeo isolado, de acordo com algumas aplicações da presente invenção, foram clonadas no MCS [Local de clonagem múltipla] do vetor.

[0097] A Figura 5 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQYN.

[0098] A Figura 6 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFN.

[0099] A Figura 7 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFYN.

[00100] A Figura 8 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário modificado pGI (pQXNc) utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção. RB - T-DNA borda direita; LB - T-DNA borda esquerda; NOS pro = promotor de nopalina sintase; NPT-II = gene de neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador de nopalina sintase; RE = qualquer enzima de restrição; sinal de Poli-A (sinal de poliadenilação); 35S - o promotor 35S (pqfnc; ID SEQ. N° 4876). As sequências de polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção foram clonadas no MCS (local de clonagem múltipla) do vetor.

[00101] As Figuras 9A-B são ilustrações esquemáticas dos plasmídeos pEBbVNi tDNA (Figura 9A) e pEBbNi tDNA (Figura 9B), utilizados nos experimentos com Brachypodium. O pEBbVNi tDNA (Figura 9A) foi utilizado para expressão das sequências de polinucleotídeos isolados de algumas aplicações da invenção em Brachypodium. O pEBbNi tDNA (Figura 9B) foi utilizado para a transformação em Brachypodium como um controle negativo. “RB [right border]” = borda direita; “2LBregion” = 2 repetições de borda esquerda; “35S” = promotor 35S (ID SEQ. N°: 4892); “NOS ter” = terminador da sintase de nopalina; “Bar ORF” - estrutura de leitura de abertura BAR (N° de Acesso GenBank JQ293091.1; ID SEQ. N°: 5436); A sequência de polinucleotídeo isolado das mesmas aplicações da invenção foi clonada no sítio de Clonagem Múltipla do vetor utilizando um ou mais do(s) sítio(s) de enzimas de restrição indicado(s).

DESCRIÇÃO DAS APLICAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[00102] Os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser utilizados para gerar estruturas de ácido nucleico, plantas transgênicas e aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água de uma planta.

[00103] Dessa forma, conforme mostrado na seção Exemplos a seguir, os presentes inventores utilizam ferramentas de bioinformática para identificar polinucleotídeos que aprimoram/aumentam a eficiência no uso de fertilizantes (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), produção (p.ex., produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta. Os genes que afetam o traço de interesse foram identificados (ID SEQ. N° 496-794 para polipeptídeos; e ID SEQ. N° 1-495 para polinucleotídeos), com base nos perfis de expressão dos gentes de diversos ecotipos de Arabidopsis, Cevada, Sorgo, Milho, tomate e Milho-Painço, e acessos em vários tecidos e condições de cultivo, homologia com genes conhecidos por afetarem o traço de interesse e utilizarem o perfil de expressão digital em tecidos e condições específicas (Tabelas 1 e 3-99, Exemplos 1 e 3-11 da secção de Exemplos a seguir). Polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos (p.ex., ortólogos) com a mesma função também foram identificados [ID SEQ. N° 2898-4855 (para polipeptídeos) e ID SEQ. N° 795-2897 (para polinucleotídeos); Tabela 2, Exemplo 2 da seção de Exemplos que se segue]. Os polinucleotídeos de algumas aplicações da invenção foram clonados em vetores binários (Exemplo 12, Tabela 100) e foram, ainda, transformados em plantas Arabidopsis e Brachypodium (Exemplos 13-15). Descobriu-se que as plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos identificados exibem um aumento da biomassa, da taxa de crescimento, do vigor e da produção em condições normais de cultivo ou em condições de cultivo limitantes de nitrogênio (Tabelas 101-128; Exemplos 16-20) e aumento da tolerância nas condições de estresse abiótico (p.ex., deficiência de nutriente) em comparação com o crescimento controlado das plantas nas mesmas condições de cultivo. Em conjunto, esses resultados sugerem o uso dos novos polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção (p.ex., ID SEQ. N° 496-794 e 2898-4855 e ID SEQ. N° 1-495 e 795-2897) para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção (p.ex., produção de óleo, produção de semente e teor de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, eficiência no uso da água e/ou tolerância ao estresse abiótico, de uma planta.

[00104] Desse modo, de acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizantes (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou, digamos, 100% homólogo à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855, aumentando, dessa forma, a eficiência no uso de fertilizantes (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00105] Conforme utilizada aqui, a expressão “produção da planta” refere-se ao montante (p.ex., conforme determinado por peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por plantas ou por estação de crescimento. Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o benefício econômico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo.

[00106] É importante observar que a produção da planta pode ser afetada por vários parâmetros, incluindo, mas não se limitando à biomassa da planta; vigor da planta; taxa de crescimento; produção de sementes; quantidade de sementes ou grãos; qualidade da semente ou grão; produção de óleo; teor de óleo, amido e/ou proteína em órgãos colhidos (p.ex., sementes ou partes vegetais da planta); número de flores (florezinhas) por panícula (expressado como uma proporção do número de sementes preenchidos sobre o número de panículas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área; número de plantas por área de crescimento (densidade); número de órgãos colhidos em campo; área total da folha; assimilação de carbono e particionamento de carbono (a distribuição/alocação de carbono dentro da planta); resistência à sombra; número de órgãos coletáveis (p.ex., sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [como aumento do diâmetro do caule, espessura ou melhoria das propriedades físicas (p.ex., elasticidade)].

[00107] Conforme utilizada aqui, a expressão “produção de semente” refere-se ao número ou ao peso das sementes por planta, sementes por vagem ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, a produção de semente pode ser afetada pelas dimensões da semente (p.ex., comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), pelo número de sementes (cheias) e pela taxa de enchimento da semente e pelo teor de óleo da semente. Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o benefício econômico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo; e o aumento da produção de semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando a produção de semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas cultivadas em uma determinada área.

[00108] O termo “semente” (também referido como “grão” ou “núcleo”), conforme utilizado aqui, refere-se a uma planta embriônica pequena confinada em uma cobertura chamada de revestimento de semente (normalmente com algum alimento armazenado), o produto do óvulo amadurecido de plantas gimnosperma e angiosperma que ocorre após a fertilização e algum crescimento dentro da planta mãe.

[00109] A expressão “teor de óleo”, conforme utilizada aqui, refere-se à quantidade de lipídeos de um determinado órgão da planta, sejam as sementes (teor de óleo da semente) ou a porção vegetal da planta (teor de óleo vegetal) e é expressa como um percentual de peso seco (10% de umidade das sementes) ou peso úmido (para a porção vegetal).

[00110] Deve-se observar que o teor de óleo é afetado pela produção intrínseca de óleo de um tecido (p.ex., semente, parte vegetal), bem como a massa ou tamanho do tecido de produção de óleo por planta ou por período de crescimento.

[00111] Em uma aplicação, o aumento do teor de óleo da planta pode ser atingido aumentando o tamanho/massa de tecido(s) de uma planta, que compreende o óleo por período de cultivo. Dessa forma, o aumento do teor de óleo de uma planta pode ser alcançado aumentando a produção, a taxa de crescimento, a biomassa e o vigor da planta.

[00112] Conforme utilizada aqui, a expressão “biomassa da planta” refere-se à quantidade (p.ex., medida em gramas de tecido secado pelo ar) de um tecido produzido a partir da planta em um período de cultivo, que também pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por área de cultivo. Um aumento da biomassa da planta pode ocorrer em toda a planta ou em partes dela como partes acima do nível do solo (passível de colheita), biomassa vegetal, raízes e sementes.

[00113] Conforme utilizada aqui, a expressão “taxa de crescimento” refere-se ao aumento do tamanho do órgão/tecido da planta por período (pode ser medida em cm2 por dia ou cm/dia).

[00114] Conforme utilizada aqui, a expressão “capacidade fotossintética” (também conhecida como “Amáx”) é uma medida da taxa máxima na qual as folhas são capazes de fixar o carbono durante a fotossíntese. É tipicamente medida como a quantidade de dióxido de carbono que é fixada por metro quadrado por segundo, por exemplo, como μmol m-2 seg- 1. As plantas são capazes de aumentar sua capacidade fotossintética por vários modos de ação, tais como por meio do aumento da área total de folhas (p.ex., por aumento da área de folhas, aumento do número de folhas e aumento do vigor da planta, p.ex., capacidade de a planta produzir novas folhas ao longo do curso de tempo), bem como por meio do aumento da capacidade da planta de executar de maneira eficiente a fixação do carbono nas folhas. Assim, o aumento da área total de folhas pode ser utilizado como um parâmetro de medição confiável para o aumento da capacidade fotossintética.

[00115] Conforme utilizada aqui, a expressão “vigor da planta” refere- se à quantidade (medida pelo peso) ou tecido produzido pela planta em um determinado período. Portanto o aumento do vigor pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por período de cultivo ou por área de cultivo. Além disso, o vigor prematuro (semente e/ou muda) resulta em melhor posição no campo.

[00116] Melhorar o vigor precoce é um objetivo importante de modernos programas de reprodução de arroz em cultivares de arroz temperado e tropical. Raízes longas são importantes para fixação adequada do solo em arroz pré- germinado. Quando o arroz é diretamente semeado em campos alagados e onde as plantas devem emergir rapidamente através da água, brotos mais longos são associados com vigor. Onde a semeadura de perfuração é praticada, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para bom surgimento das mudas. A habilidade de projetar vigor precoce nas plantas seria de grande importância na agricultura. P.ex., baixo vigor precoce tem sido uma limitação na introdução do milho (Zea mays L.) híbrido com base no germoplasma do Cinturão do Milho na Atlântica Europeia.

[00117] Deve-se observar que uma produção de planta pode ser determinada sob estresse (p.ex., estresse abiótico, condições limitantes de nitrogênio) e/ou condições de não estresse (normal).

[00118] Conforme utilizada aqui, a expressão “condições de não estresse” refere-se às condições de cultivo (p.ex., água, temperatura, ciclos claro-escuro, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutriente tal como nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que não significativamente vão além das condições climáticas diárias e outras abióticas que as plantas podem encontrar e que permitem o crescimento ideal, metabolismo, reprodução e/ou viabilidade de uma planta em qualquer estágio em seu ciclo de vida (p.ex., em uma planta de cultura da semente para uma planta madura e de volta para a semente novamente). Os técnicos no assunto estão cientes das condições normais do solo e climáticas para uma dada planta em uma dada localização geográfica. Deve ser notado que enquanto as condições de não estresse podem incluir algumas variações suaves das condições ideais (que variam de um tipo/espécie de uma planta para outra), tais variações não fazem com que a planta cesse o crescimento sem a capacidade de retomar o crescimento.

[00119] A expressão “estresse abiótico”, conforme utilizada aqui, refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, o crescimento, a reprodução e/ou a viabilidade da planta. Consequentemente, o estresse abiótico pode ser induzido por condições de cultivo ambiental subótimas como, p.ex., salinidade, estresse osmótico, privação de água, seca, inundação, congelamento, temperatura baixa ou elevada, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes (p.ex., deficiência de nitrogênio ou nitrogênio limitado), poluição atmosférica ou irradiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção Histórico.

[00120] A expressão “tolerância ao estresse abiótico”, conforme utilizada aqui, refere-se à capacidade de uma planta em resistir a um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.

[00121] As plantas são submetidas a uma gama de desafios ambientais. Diversos desses desafios, incluindo estresse salino, estresse osmótico geral, estresse por aridez e estresse por congelamento, têm a habilidade de impactar na planta integral e na disponibilidade de água celular. Não é de surpreender, então, que as respostas da planta a essa coleção de estresses sejam relacionadas. Zhu (2002) Ann. Rev. Planta Biol. 53: 247-273 et al. Observe que “a maioria dos estudos na sinalização de estresse hídrico focou no estresse salino primariamente porque as respostas da planta ao sal e estiagem estão intimamente relacionadas e os mecanismos se sobrepõem”. Muitos exemplos de respostas similares e caminhos para esse conjunto de estresses foram documentados. For exemplo, os fatores de transcrição de CBF demonstraram condicionamento de resistência ao sal, congelamento e estiagem (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). O gene Arabidopsis rd29B é induzido em resposta ao estresse de sal e desidratação, um processo que é mediado amplamente através de um processo de transdução de sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97: 11632-11637), resultando em atividade alterada de fatores de transcrição que se ligam a um elemento a montante dentro do promotor rd29B. Em Mesembryanthemum crystallinum (planta de gelo), Patharker e Cushman mostraram que uma proteína cinase dependente do cálcio (McCDPK1) é induzida pela exposição aos estresses de estiagem e sal (Patharker e Cushman (2000) Plant J. 24: 679-691). A cinase induzida por estresse também demonstraram fosforilar um fator de transcrição, provavelmente alterando sua atividade, embora os níveis transcrições do fator de transcrição alvo não sejam alterados em resposta ao estresse de sal ou estiagem. Similarmente, Saijo et al. demonstraram que uma proteína cinase dependente de calmodulina induzida por sal/estiagem de arroz (OsCDPK7) conferiu tolerância elevada ao sal e estiagem para o arroz quando superexpressa (Saijo et al. (2000) Planta J. 23: 319-327).

[00122] A exposição à desidratação evoca estratégias similares de sobrevivência em plantas, assim como o estresse de congelamento (vide, p.ex., Yelenosky (1989) Planta Physiol 89: 444-451) e o estresse de estiagem induz tolerância de congelamento (vide, p.ex., Siminovitch et al. (1982) Planta Physiol 69: 250-255; e Guy et al. (1992) Plant 188: 265-270). Além da indução de proteínas de aclimatação fria, estratégias que permitem que as plantas sobrevivam em baixas condições de água podem incluir, p.ex., área de superfície reduzida, ou produção de óleo ou cera da superfície. Em outro exemplo, o teor de soluto elevado da planta previne a evaporação e a perda de água devido ao calor, estiagem, salinidade, osmótico e similares, portanto provendo uma melhor tolerância aos estresses acima.

[00123] Será entendido que alguns caminhos envolvidos na resistência a um estresse (conforme descrito acima), também serão envolvidos em resistência a outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou homólogos. Certamente, os caminhos de resistência estão relacionados, não idênticos e, portanto, nem todos os genes que controlam a resistência a um estresse controlarão a resistência a outros estresses. Não obstante, se uma resistência de condições de gene a um desses estresses, estaria evidente ao especialista na técnica o teste para resistência a esses estresses relacionados. Os métodos de avaliação da resistência ao estresse também São fornecidos na seção de Exemplos a seguir.

[00124] Conforme utilizada aqui, a expressão “eficiência no uso da água (WUE|water use efficiency)” refere-se ao nível de matéria orgânica produzido por unidade de água consumida pela planta, isto é, o peso seco de uma planta em relação à utilização de água da planta, p.ex., a biomassa produzida por transpiração unitária.

[00125] Conforme utilizada aqui, a expressão “eficiência no uso de fertilizante” refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de fertilizante aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de um ou mais minerais e porções orgânicas absorvidas pela planta, tais como nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.

[00126] Conforme utilizada aqui, a expressão “condições limitantes de fertilizante” refere-se às condições de cultivo que incluem um nível (p.ex., concentração) de um fertilizante aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.

[00127] Conforme utilizada aqui, a expressão “eficiência no uso de nitrogênio (NUE)” refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de nitrogênio aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de nitrogênio absorvido pela planta.

[00128] Conforme utilizada aqui, a expressão “condições limitantes de nitrogênio” refere-se às condições de cultivo que incluem um nível (p.ex., concentração) de nitrogênio (isto é, amônia ou nitrato) aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.

[00129] A NUE e FUE melhorada da planta são traduzidas no campo em quantidades semelhantes de colheita da produção, enquanto implementam menos fertilizantes, ou produções melhoradas adquiridas pela implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Assim, NUE ou FUE melhorada tem um efeito direto na produção de planta no campo. Assim, os polinucleotídeos e polipeptídeos de algumas aplicações da invenção afetam positivamente a produção de planta, produção de semente e biomassa de planta. Além disso, o benefício da NUE melhorada de planta certamente melhorará a qualidade da cultura e constituintes bioquímicos da semente tais como produção de proteína e produção de óleo.

[00130] Deve-se observar que um ABST melhorado conferirá às plantas vigor melhorado também em condições de não estresse, resultando em culturas que possuem biomassa e/ou produção melhorada, p.ex., fibras alongadas para a indústria de algodão, teor de óleo mais alto.

[00131] O termo “fibra” é normalmente inclusivo de células de condução de parede espessa, tais como vasos e traqueídeos, e para fibrilares agregados de muitas células de fibra individual. Por isso, o termo “fibra” refere-se a (a) células de condução e não condução de parede espessa do xilema; (b) fibras de origem extraxilar, incluindo aquelas de floema, casca, tecido do solo e epiderme; e (c) fibras dos caules, folhas, raízes, sementes e flores ou inflorescências (tais como aquelas de Sorghum vulgare utilizadas na fabricação de escovas e vassouras).

[00132] Exemplos de planta que produz fibra, incluem, entre outros, culturas agrícolas tais como algodão, árvore de seda de algodão (Paina, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosoto, winterfat, balsa, quenafe, rosala, juta, sisal abaca, linho, milho, cana de açúcar, cânhamo, rami, paina, fibra de coco, bambu, musgo espanhol e Agave spp. (p.ex., sisal).

[00133] Conforme utilizada aqui, a expressão “qualidade da fibra” refere-se a pelo menos um parâmetro de fibra que é agricolamente desejado, ou requerido na indústria de fibra (também descrito adiante). Exemplos de tais parâmetros incluem, entre outros, comprimento da fibra, resistência da fibra, adequação da fibra, peso da fibra por comprimento da unidade, proporção de maturidade e uniformidade (também descrito adiante).

[00134] A qualidade da fibra de algodão (gaze) é tipicamente medida de acordo com o comprimento, resistência e delicadeza da fibra. Consequentemente, a qualidade da gaze é considerada mais alta quando a fibra é mais longa, mais forte e mais fina.

[00135] Conforme utilizada aqui, a expressão “produção da fibra” refere-se à quantidade ou qualidade das fibras produzidas da planta que produz fibra.

[00136] Conforme utilizado aqui, o termo “aumento” refere-se a, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% de aumento na eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio, produção, produção de semente, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta comparada a uma planta nativa ou planta do tipo selvagem [isto é, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeo ou polipeptídeos) da invenção, p.ex., um planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições (p.ex., idênticas) de crescimento].

[00137] A expressão “expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno”, conforme utilizada aqui, refere-se à regulação ascendente do nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro da planta, introduzindo o polinucleotídeo exógeno em uma planta ou célula da planta e expressando-o por meios recombinantes, conforme também descrito logo abaixo.

[00138] Conforme utilizado aqui, “expressar” refere-se à expressão no mRNA e, opcionalmente, no nível de polipeptídeo.

[00139] Conforme utilizada aqui, a expressão “polinucleotídeo exógeno” refere-se a uma sequência de ácido nucleico heterólogo que pode não ser naturalmente expressa dentro da planta (p.ex., uma sequência de ácido nucleico de espécies diferentes) ou na qual a superexpressão na planta é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta em uma maneira estável ou transitória, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA | ibonucleic acid) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve-se observar que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência de ácido nucleico endógena da planta.

[00140] O termo “endógeno”, conforme utilizado aqui, refere-se a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo que está presente e/ou naturalmente expresso dentro de uma planta ou uma célula da mesma.

[00141] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consiste das ID SEQ. N° 496-794, 2898- 3645, 36474854 e 4855.

[00142] As sequências homólogas incluem ambas as sequências, ortólogas e parálogas. O termo “parálogo” refere-se às duplicações de gene dentro do genoma de uma espécie, conduzindo aos genes parálogos. O termo “ortólogo” refere-se aos genes homólogos em diferentes organismos devido à relação ancestral. Assim, ortólogos são contrapartes evolucionárias derivadas de genes ancestrais únicos no último ancestral comum de duas espécies dadas (Koonin EV e Galperin MY (Sequence - Evolution - Function: Computational Approaches in Comparative Genomics. Boston: Kluwer Academic; 2003. Capítulo 2, Evolutionary Concept in Genetics e Genomics. Disponível em: ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/books/NBK20255) e, portanto, possuem grande possibilidade de terem a mesma função.

[00143] Uma opção para identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledônias é a realização de uma pesquisa de explosão recíproca. Isso pode ser feito através de uma primeira explosão, envolvendo explodir a sequência de interesse contra qualquer base de dados da sequência, tal como a base de dados do NCBI publicamente disponível que pode ser encontrada em: ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Se forem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse seria detonada novamente, p.ex., os 28.469 clones de cDNA de comprimento total de Oryza Sativa Nipponbare disponível em NCBI. Os resultados da explosão podem ser filtrados. As sequências de comprimento total dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são então detonadas de volta (segunda explosão) contra as sequências do organismo das quais a sequência de interesse é derivada. Os resultados das primeira e segunda explosões são, então, comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultando na maior pontuação (melhor acerto) na primeira explosão identifica na segunda explosão a sequência de consulta (a sequência de interesse original) como o melhor acerto. Utilizando o mesmo racional, um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de grandes famílias de sequência, o programa ClustalW pode ser utilizado [ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido por uma árvore de união vizinha (wikipedia (ponto) org/wiki/Neighbor-joining) que ajuda na visualização do agrupamento.

[00144] A homologia (p.ex., homologia percentual, identidade de sequência + similaridade de sequência) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia que calcule o alinhamento de sequência em pares.

[00145] Conforme utilizado aqui, “identidade de sequência” ou “identidade”, no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, inclui referência aos resíduos nas duas sequências, que são os mesmos quando alinhados. Quando a porcentagem de identidade de sequência é utilizada em referência às proteínas, reconhece-se que as posições dos resíduos que não são idênticos diferem frequentemente por substituições conservativas de aminoácidos, nas quais os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes (p.ex., carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservativas, a porcentagem de identidade de sequência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. As sequências que diferem por tais substituições conservativas são referidas como tendo “similaridade de sequência” ou “similaridade”. Os meios para fazer esse ajuste são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tipicamente, isso envolve atingir uma substituição conservativa como uma parcial em vez de uma incompatibilidade total, aumentando, desse modo, a porcentagem de identidade de sequência. Assim, por exemplo, quando for atribuída uma pontuação de 1 a um aminoácido idêntico e quando for atribuída uma pontuação de zero a uma substituição não conservativa, será atribuída uma pontuação entre zero e 1 a uma substituição conservativa. A pontuação de substituições conservativas é calculada, p.ex., de acordo com o algoritmo de Henikoff S e Henikoff JG. [Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89(22): 10915-9].

[00146] A identidade (p.ex., percentual de homologia) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do National Center of Biotechnology Information [NCBI Centro Nacional de Informação de Biotecnologia], tal como utilizando parâmetros padrões.

[00147] De acordo com algumas aplicações da invenção, a identidade é uma identidade global, ou seja, uma identidade sobre toda a sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico da invenção e não apenas sobre partes respectivas.

[00148] De acordo com algumas aplicações da invenção, o termo “homologia” ou “homólogo” refere-se à identidade de duas ou mais sequências de ácido nucleico; ou identidade de duas ou mais sequências de aminoácidos; ou a identidade de uma sequência de aminoácidos para uma ou mais sequências de ácido nucleico.

[00149] De acordo com algumas aplicações da invenção, a homologia é uma homologia global, ou seja, uma homologia sobre toda a sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico da invenção e não apenas sobre partes respectivas.

[00150] O grau de homologia ou de identidade entre duas ou mais sequências pode ser determinado usando várias ferramentas de comparação de sequências conhecidas. Na sequência há uma descrição não limitante de tais ferramentas, que podem ser utilizadas juntamente com algumas aplicações da invenção.

[00151] O alinhamento global em pares foi definido por S. B. Needleman e C. D. Wunsch, “A general method applicable to the search of similarities in the amino acid sequence of two proteins” Journal of Molecular Biology, 1970, páginas 443-53, volume 48).

[00152] Por exemplo, ao começar com uma sequência polipeptídica e comparar com outras sequências polipeptídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch (disponível em emboss(dot)sourceforge(dot)net/apps/cvs/ emboss/apps/needle(dot)html) pode ser utilizado para encontrar o alinhamento ideal (incluindo as lacunas) de duas sequências juntamente com seus comprimentos totais - um “Alinhamento global”. Os parâmetros padrões para o algoritmo de Needleman-Wunsch (EMBOSS-6.0.1) incluem: gapopen=10; gapextend=0.5; datafile= EBLOSUM62; brief=YES.

[00153] De acordo com algumas aplicações da invenção, os parâmetros utilizados com a ferramenta EMBOSS- 6.0.1 (para a comparação proteína- proteína) incluem: gapopen=8; gapextend=2; datafile= EBLOSUM62; brief=YES.

[00154] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia utilizando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00155] Ao começar com uma sequência polipeptídica e comparar a sequências polinucleotídicas, o algoritmo OneModel FramePlus (Halperin, E., Faigler,S. e Gill-More,R. (1999) - FramePlus: aligning DNA to protein sequences. Bioinformatics, 15, 867-873) (disponível em biocceleration(ponto)com/ Products(ponto)html) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões: model=frame+_p2n.model mode=local.

[00156] De acordo com algumas aplicações da invenção, os parâmetros utilizados com o algoritmo OneModel FramePlus são model=frame+_p2n.model, mode=qglobal.

[00157] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo OneModel FramePlus é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00158] Ao começar com uma sequência polinucleotídica e comparar com outras sequências polinucleotídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman- Wunsch (disponível em emboss(ponto)sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/apps/need le(ponto)html) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões. (EMBOSS-6.0.1) gapopen=10; gapextend=0.5; datafile= EDNAFULL; brief=YES.

[00159] De acordo com algumas aplicações da invenção, os parâmetros utilizados com o algoritmo EMBOSS- 6.0.1 de Needleman-Wunsch são gapopen=10; gapextend=0.2; datafile= EDNAFULL; brief=YES.

[00160] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch para a comparação de polinucleotídeos com polinucleotídeos é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00161] De acordo com algumas aplicações, as determinações do grau de homologia requerem adicionalmente o emprego do algoritmo de Smith-Waterman (para a comparação proteína-proteína ou comparação nucleotídeo- nucleotídeo).

[00162] Os parâmetros padrões para o algoritmo GenCore 6.0 Smith-Waterman incluem: modelo =sw.model.

[00163] De acordo com algumas aplicações da invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo de SmithWaterman é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00164] De acordo com algumas aplicações da invenção, a homologia global é realizada sobre as sequências pré-selecionadas por homologia local para o polipeptídeo ou polinucleotídeo de interesse (p.ex., 60% de identidade sobre 60% do comprimento da sequência) antes da realização da homologia global para o polipeptídeo ou polinucleotídeo de interesse (p.ex., 80% de homologia global sobre toda a sequência). Por exemplo, as sequências homólogas são selecionadas usando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn agindo como filtros para o primeiro estágio e a agulha (pacote EMBOSS) ou o alinhamento Estrutura+algorítmico para o segundo estágio. A identidade local (alinhamentos Blast) é definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências, porque é utilizada tão somente como um filtro para a fase de alinhamento global. Nesta aplicação específica (quando a identidade local é utilizada) a filtragem padrão do pacote Blast não é utilizada (estabelecendo o parâmetro “-F F”).

[00165] No segundo estágio, os homólogos são definidos com base na identidade global de, pelo menos, 80% para a sequência polipeptídica principal.

[00166] De acordo com algumas aplicações da invenção, duas formas distintas para a descoberta do alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou nucleotídica são utilizadas: 1. Entre duas proteínas (seguindo o filtro blastp): Algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. O restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões listadas aqui: Qualificadores padrões (Obrigatórios): [-asequence] sequência Nome do arquivo da sequência e formato opcional, ou referência (entrada EUA). [—bsequence] seqall Nome do arquivo da(s) sequência(s) e formato opcional, ou referência (entrada EUA) -gapopen flutuante [10,0 para qualquer sequência]. A penalidade da lacuna aberta é uma classificação tomada quando uma lacuna é criada. O melhor valor depende da escolha do arranjo de comparação. O valor padrão pressupõe que você esta usando o arranjo EBLOSUM62 para as sequências de proteína e a matriz EDNAFULL para as sequências nucleotídicas (número de vírgula flutuante de 1,0 a 100,0). -gapextend flutuante [0,5 para qualquer sequência]. A penalidade pela extensão da lacuna, é adicionada à penalidade da lacuna padrão para cada base ou resíduo na lacuna. Esta é o tempo pelo qual a lacuna é penalizada. Normalmente espera-se poucas lacunas grandes e não muitas lacunas pequenas, assim a penalidade sobre a extensão da lacuna deveria ser menor que a penalidade da lacuna. Uma exceção se dá quando uma ou mais sequências são lidas sozinhas com possíveis erros de sequência em cujo caso você esperaria muitas lacunas de base simples. Pode-se obter este resultado estabelecendo a penalidade por lacuna aberta para zero (ou muito baixa) e usando a penalidade de extensão da lacuna para controlar a classificação da lacuna, (número de vírgula flutuante de 0,0 a 10,0). [-outfile] alinhamento ['‘.needle] Nome do arquivo de alinhamento de saída Qualificadores Adicionais (Opcional): -datafile matrixf [EBLOSUM62 para proteína, EDNAFULL para DNA] . Este é um arquivo do arranjo de classificação utilizado ao comparar as sequências. Por padrão, este e o arquivo 'EBLOSUM62' (para proteínas) ou o arquivo 'EDNAFULL' (para sequências nucleicas) Estes arquivos são encontrados no diretório 'data' da instalação EMBOSS. Qualificadores Avançados (Espontâneos): —[no]brief booleano [Y] Breve identidade e similaridade. Qualificadores Associados: "—asequence" Qualificadores Associados. -sbeginl inteiro Inicia a sequência a ser utilizada. -sendl inteiro Finaliza a sequência a ser utilizada, -sreversel booleano Reverso (se DNA) . -sask.1 booleano Pede para iniciar/finalizar/reverter. —snucleotidel booleano A sequência é nucleotidica. —sproteínal booleano A sequência é de proteina. -slowerl booleano Faz minúsculas. -supperl booleano Faz maiúsculas. -sfonuatl cadeia Formato de sequência de entrada. -sdbnamel cadeia Nome da base de dados. -sidl cadeia Nome da entrada. -ufol cadeia Recursos UFO. —fformatl cadeia Formato dos Recursos. -fopenfilel cadeia Nome do arquivo dos recursos. "-bsequence" Qualificadores Associados. —sbegin2 inteiro Inicia cada sequência a ser utilizada. -send2 inteiro Finaliza cada sequência a ser utilizada. -sreverse2 booleano Reverso (se DNA). —sask2 booleano Pede para iniciar/finalizar/reverter. —snucleotide2 booleano A sequência é nucleotidica. -sproteina2 booleano A sequência é de proteína. -slower2 booleano Faz minúsculas. —supper2 booleano Faz maiúsculas. -sformat2 cadeia Formato de sequência de entrada. -sdbname2 cadeia Nome da base de dados. -sid2 cadeia Nome da entrada. -uf o2 cadeia Recursos UFO. -fformat2 cadeia Formato dos Recursos. —fopenfile2 cadeia Nome do arquivo dos recursos. —outfile" Qualificadores Associados. -af onuat3 cadeia Formato dos Alinhamentos. —aextension3 cadeia Extensão do nome do arquivo. —adirectoryS cadeia Diretório de Saída. —aname3 cadeia Nome do arquivo de base. -awidth3 inteiro Largura do alinhamento. -aaccshow3 booleano Mostra o número de acesso no cabeçalho. —adesshow3 booleano Mostra a descrição no cabeçalho. -ausashow3 booleano Mostra o USA completo no alinhamento. —aglobal3 Qualificadores booleano Gerais: Mostra a sequência completa no alinhamento booleano Desliga as solicitações. booleano Escreve o primeiro arquivo para a saída padrâos. booleano Lê o primeiro arquivo a partir da entrada padrão, escreve o primeiro arquivo para a saida padrão. booleano Solicita os valores padrão e adicionais. Escreve a saida de depuração do programa .dbg Registra algumas/todas as opções de linha de comando. Registra as opções de linha de comando. Maiores informações sobre os qualificadores associados e gerais podem ser encontradas com — help -verbose. Registra as advertências. Registra os erros. Registra os erros fatais. Registra as mensagens de expiração do programa. 2. Entre uma sequência de proteína e uma sequência nucleotídica (seguindo o filtro rblastn) Aplicação de Gencore 6.0 Onemodel utilizando a estrutura+algoritmo com os seguintes parâmetros: model=frame+_p2n.model mode=qglobal - q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. O restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões: Us o: om -model=<model_fname> [-q=]query [-db=]database [options]. -model=<model fname> Especifica o modelo que quer executar. Todc os modelos fornecidos pela Compugen este localizados no diretório SCGNROOT/models/. Parâmetros válidos de linha de comando: -dev—<dev_name> Seleciona o dispositivo a ser utilizado pela aplicação. Os dispositivos válidos são: -q=<query> bic - Bioccelerator (válido para SW, XSW, FRAME N2P, e modelos FRAME_P2N) . Xlg — BioXL/G (válido para todos os modelos, exceto XSW). xlp - BioXL/P (válido para SW, FRAME+_N2P, e modelos FRAME_P2N). xlh - BioXL/H (válido para SW, FRAME+_N2P, e modelos FRAME_P2N). soft — Dispositivo do software (para todos os modelos). Define o conjunto de consultas. As consultas podem -db=<database ser um arquivo de sequência ou uma referencia à base de dados. Você pode especificar uma consulta pelo nome ou por número de acesso. O formato é detectado automaticamente. Entretanto, pode-se especificar um formato usando o parâmetro —qfmt Se uma consulta não for especificada, o programa solicita uma. Se o conjunto de consultas for uma referência à base de dados, um arquivo de saida é produzido para cada sequência na consulta. Escolha o conjunto de base de dados. O conjunto de name> base de dados pode ser um arquivo de sequência ou -qacc uma referência à base de dados. O formato da base de dados é detectado automaticamente. Entretanto, pode- se especificar um formato usando o parâmetro —dfmt. Adiciona este parâmetro à linha de comando se uma -dacc consulta for especificada usando os números de acesso. Adiciona este parâmetro à linha de comando se uma -dfmt/- base de dados for especificada usando os números de acesso. Escolhe o tipo do formato da base de dados/consulta. qfmt=<format_ty Os formatos possiveis são: pe> fasta - fasta com o tipo de sequência autodetectada. fastap — sequência de proteína fasta. fastan — sequência nucleica fasta. gcg — formato gcg, o tipo é autodetectado. formato gcg9, o tipo é autodetectado. sequência de proteína de formato gcg9. sequência nucleica de formato gcg9. sequência nbrf, o tipo é autodetectado. sequência de proteína nbrf. sequência nucleica nbrf. formato embl e swissprot. formato genbank, (nucleico) . formato blast. sequência nbrf_gcg, o tipo é autodetectado. sequência de proteina nbrf-gcg. sequência nucleica nbrf-gcg. sequência raw ascii, o tipo é autodetectado. sequência de proteina raw ascii, sequência nucleica raw ascii. pir - formato pir codata, o tipo e autodetectado. Profile — perfil gcg (válido somente para -qfmt em SW, XSW, FRAME P2N e FRAME +_P2N) . O nome do arquivo de saida. O sufixo do nome do arquivo de saida. Penalidade sobre a abertura de lacuna. Este parâmetro não é válido para a FRAME+. Para a FrameSearch o padrão e 12,0. Para outras pesquisas o padrão é 10,0. Penalidade por extensão de lacuna. Este parâmetro não é válido para FRAME+. Para a FrameSearch o padrão é 4,0. Para outros modelos: o padrão para as pesquisas de proteina é 0,05 e o padrão para as pesquisas nucleicas é 1,0. A penalidade pela abertura de uma lacuna na sequência de consultas. O padrão é 10,0. Válido para XSW. A penalidade para a extensão de uma lacuna na sequência de questões. O padrão é 0,05. Válido para XSW. A posição na sequência de consulta para iniciar a pesquisa. A. posição na sequência de consulta para interromper a pesquisa. Realiza uma pesquisa traduzida, relevante para uma consulta nucleica contra uma base de dados de proteina. A consulta nucleica é traduzida para seis estruturas de leitura e um resultado é fornecido para cada estrutura. SW e XSW. -dtrans Realiza uma pesquisa traduzida, relevante para uma consulta proteica contra uma base de dados de DNA. Cada entrada da base de dados é traduzida para seis quadros de leitura e um resultado é dado para cada cruadro. Escore. —thr_max=<n> O limite mais alto da classificação. Resultados maiores que o valor -thr max não são mostrados. —thr_min=<n> O menor limite da classificação. Resultados menores que o valor —thr min não são mostrados. -align=<n> O número de alinhamentos registrados no arquivo de saida. -noalign Não exibe o alinhamento. Nota: os parâmetros "-align" e "-noalign" são mutuamente exclusivos. —outfmt=<format_name> Especifica o tipo de formato de saida. O formato padrão é PFS. Os valores possiveis são: PFS - Formato de texto PFS FASTA - formato de texto FASTA BLAST - formato de texto BLAST Não realiza a normalização da classificação. Especifique o método de normalização. As opções válidas são: log — normalização do algoritmo, std — normalização padrão. stat — Método estatistico de Ervilharson "-nonorm" e "-norm" não podem ser utilizados j untos. Nota: Parâmetros -xgapop, -xgapext, -fgapop, -fgapext, -ygapop, - ygapext, -delop e -delext se aplicam somente a FRAME + . -xgapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao inserir um codão (triplo). O padrão é 12,0. -xgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir um codão (triplo). O padrão é 4,0. -ygapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir um aminoácido. O padrão é 12,0. A penalidade para a extensão de uma lacuna ao excluir um aminoácido. O padrão é 4,0. A penalidade para a abertura de uma lacuna ao inserir uma base de DNA. O padrão é 6,0. A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir uma base de DNA. O padrão é 7,0. A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir uma base de DNA. O padrão é 6,0. A penalidade para a extensão de uma lacuna ao excluir uma base de DNA. O padrão é 7,0. Nenhuma saida para a tela é produzida. O nome do organizador sobre o qual o servidor funciona. Por padrão, a aplicação usa um organizador especifico no arquivo $CGNROOT/cgnhosts. Não acesse o segundo plano quando o dispositivo estiver ocupado. Esta opção não é relevante para o pseudodispositivo Parseq ou Soft. Execute o trabalho em segundo plano. Quando esta opção for especifica, o arquivo "$CGNROOT/defaults/batch.defaults" é utilizado para escolher o comando batch. Se o arquivo não existir, o comando "at now" é utilizado para executar o trabalho, "-batch" e "-wait" são mutuamente exclusivos. Imprime o número de versão do software. Exibe esta mensagem de ajuda. Para ajuda mais especifica digite: "om —model=<model fname> - help".

[00167] De acordo com algumas aplicações, a homologia é uma homologia local ou uma identidade local.

[00168] As ferramentas de algoritmo local incluem, mas não são limitadas ao software BlastP, BlastN, BlastX ou TBLASTN do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (NCBI), FASTA e o algoritmo de Smith-Waterman.

[00169] Uma pesquisa tblastn permite a comparação entre uma sequência de proteína e as traduções de seis estruturas de uma base de dados de nucleotídeos. Pode ser uma maneira bastante produtiva de encontrar regiões codificadas de proteína homóloga em sequências de nucleotídeos não anotadas, tais como as etiquetas de sequências expressas [ESTs expressed sequence tags] e projetos de registros do genoma [HTG draft genome records], localizados nas bases de dados BLAST est e htgs, respectivamente.

[00170] Os parâmetros padrões para o blastp incluem: Sequências de alvo máximo: 100; Limite esperado: e- 5; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - BLOSUM62; filtros e camuflagem: Filtro - regiões de baixa complexidade.

[00171] Ferramentas de alinhamento local que podem ser utilizadas incluem, mas não são limitadas ao algoritmo tBLASTX, que compara os produtos de tradução conceitual de seis estruturas de uma sequência de consultas de nucleotídeos (ambas as vertentes) contra uma base de dados de sequência de proteína. Os parâmetros padrões incluem: Sequências de alvo máximo: 100; Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - BLOSUM62; filtros e camuflagem: Filtro - regiões de baixa complexidade.

[00172] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos de, pelo menos, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou, digamos, 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistente de ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855.

[00173] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das ID. SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[00174] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta é efetuado ao expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou, digamos, 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[00175] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo de uma sequência de aminoácidos estabelecida pelas ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 ou 4855.

[00176] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, o método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta é efetuado expressando dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00177] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado de um grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00178] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos estabelecida pelas ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 ou 4855.

[00179] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste das ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897.

[00180] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica sequência de ácido nucleico selecionado do grupo consistindo das ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante, eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00181] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo das ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897.

[00182] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pelas ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 ou 2897.

[00183] De acordo com algumas aplicações da presente invenção, o método para aumentar a eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreende, ainda, selecionar uma planta com um aumento da eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de cultivo.

[00184] Deve-se notar que a seleção de uma planta transformada, tendo um aumento no trato se comparada a uma planta nativa (p.ex., não transformada) cultivada nas mesmas condições de cultivo, é realizada selecionando para o trato, p.ex., validando a capacidade da planta transformada em exibir um aumento do trato, ensaios bem conhecidos (p.ex., análises de plântula, ensaios de estufa), conforme será posteriormente descrito.

[00185] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de seleção de uma planta transformada, tendo um aumento da eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie cultivada sob as mesmas condições de cultivo, o método compreendendo: (a) fornecer plantas transformadas com um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo, compreendendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% homóloga (p.ex., tendo uma similaridade de sequência ou identidade de sequência) à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855, (b) selecionar, a partir das plantas, uma planta tendo aumento de eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico, selecionado, desse modo, a planta tendo aumento da eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de cultivo.

[00186] De acordo com um aspecto de algumasaplicações da presente invenção, é fornecido um método de seleção de uma planta transformada, tendo um aumento da eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie cultivada sob as mesmas condições de cultivo, o método compreendendo: (a) fornecer plantas transformadas com um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo, compreendendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. 1495, 795-2896 e 2897, (b) selecionar, a partir das referidas plantas, uma planta tendo aumento de eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico, selecionado, desse modo, a planta tendo aumento da eficiência no uso de fertilizantes, eficiência no uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de cultivo.

[00187] Conforme utilizado aqui, o termo “polinucleotídeo” refere-se a uma sequência de ácido nucleico de fita simples ou dupla que é isolado e fornecido na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotídeo e/ou uma sequência polinucleotídeo composta (p.ex., uma combinação das sequências acima).

[00188] O termo “isolado(a)” refere-se a pelo menos parcialmente separado(a) do ambiente natural, p.ex., de uma célula da planta.

[00189] Conforme utilizada aqui, a expressão “sequência de polinucleotídeo complementar” refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa de RNA mensageiro utilizando a transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Essa sequência pode ser amplificada subsequentemente in vivo ou in vitro utilizando uma polimerase de DNA dependente de DNA.

[00190] Conforme utilizada aqui, a expressão “sequência genômica de polinucleotídeo” refere-se a uma sequência derivada (isolada) de um cromossomo e, dessa forma, representa uma porção contígua de um cromossomo.

[00191] Conforme utilizada aqui, a expressão “sequência de polinucleotídeo composta” refere-se a uma sequência que seja pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. A sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídeo da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas interpostas entre si. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo outros genes e, tipicamente, incluirão sequências de sinais entrelaçados preservadas. Essas sequências intrônicas podem incluir, ainda, elementos reguladores da expressão cis- atuantes.

[00192] As sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos da presente invenção podem ser otimizadas para expressão. Exemplos dessas modificações de sequências incluem, mas não se limitam a um teor de G/C alterado de uma abordagem mais cuidadosa do que aquela comumente encontrada nas espécies de plantas de interesse e à remoção de códons atipicamente encontrados nas espécies de plantas comumente chamada de otimização de códons.

[00193] A expressão “otimização de códons” refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para a utilização dentro de um gene estrutural ou fragmento dele que aborde a utilização do códon dentro da planta de interesse. Portanto, um gene otimizado ou sequência de ácido nucleico refere-se a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou que ocorra naturalmente tenha sido modificado a fim de utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro da planta. Tipicamente, a sequência de nucleotídeo é examinada no nível do DNA e na região de codificação otimizada para expressão na espécie vegetal determinada utilizando qualquer procedimento adequado, p.ex., conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677- 681). Nesse método, o desvio padrão de utilização do códon, uma medida da tendência de utilização do códon, pode ser calculado descobrindo primeiramente o quadrado do desvio proporcional de utilização de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de plantas altamente expressos, seguido por um cálculo do quadrado do desvio médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [(Xn - Yn) /Yn] 2/N, onde Xn refere-se à frequência de utilização do códon n em genes de plantas altamente expressos, onde Yn refere-se à frequência de utilização do códon n no gene e interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela de utilização de códons de genes altamente expressos de dicotiledôneas está compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc AcIDs Res. 17:477-498).

[00194] Um método para otimizar a sequência de ácido nucleico de acordo com a utilização preferido do códon para um tipo de célula de planta particular é com base na utilização direto, sem realizar quaisquer cálculos estatísticos extras, de Tabelas de otimização de códons como aquelas disponíveis online na Base de Dados de utilização de Códons através do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences|Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas) no Japão (kazusa (ponto) ou (ponto) jp/codon/). A Base de Dados de utilização de Códons contém tabelas de utilização de códons para diversas espécies diferentes, com cada Tabela de utilização de códons tendo sido estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.

[00195] Utilizando as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos de cada aminoácido em uma espécie particular (p.ex., arroz), uma sequência de nucleotídeo que ocorre naturalmente e que codifica uma proteína de interesse pode ter o códon otimizado para aquela espécie de planta particular. Isso é efetuado substituindo os códons que possam ter uma incidência estatística baixa no genoma da espécie particular com códons correspondentes, em relação a um aminoácido, que sejam estatisticamente mais favorecidos. No entanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir sítios de restrição existentes, para criar novos em uniões potencialmente úteis (terminais 5’ e 3’ para adicionar o peptídeo sinal ou cassetes de terminação, sítios internos que possam ser utilizados para cortar e reunir segmentos para produzir uma sequência de comprimento total correta), ou para eliminar sequências de nucleotídeo que possam afetar negativamente a estabilidade ou a expressão do mRNA.

[00196] A sequência de nucleotídeo codificador que ocorre naturalmente já pode, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponda a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta particular. Portanto, a otimização do códon da sequência de nucleotídeo nativa pode compreender a determinação quais códons, dentro da sequência de nucleotídeo nativo, não são estatisticamente favorecidos com relação a uma planta particular e modificar esses códons de acordo com uma tabela de utilização de códons da planta particular para produzir um derivado do códon otimizado. Uma sequência de nucleotídeo modificado pode ser total ou parcialmente otimizada para a utilização do códon da planta desde que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo modificado seja produzida em um nível maior do que a proteína codificada pelo gene correspondente que ocorre naturalmente ou nativo. A estrutura de genes sintéticos alterando a utilização do códon é descrita, p.ex., no Pedido de Patente PCT (Patent Cooperation Treaty|Tratado de Cooperação em Matéria de Patentes) 93/07278.

[00197] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é um RNA não codificador.

[00198] Conforme utilizada aqui, a expressão “RNA não codificador” refere-se a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácidos (um polipeptídeo). Exemplos dessas moléculas de RNA não codificador incluem, mas não se limitam a um RNA antissentido, um pré- miRNA (precursor de um microRNA) ou um precursor de um RNA que interage com Piwi (piRNA).

[00199] Exemplos não limitantes de polinucleotídeos de RNA não codificados são fornecidos nas ID SEQ. N° 217, 218, 219, 287, 288, 495, 997, 1003, 1543 e 1703.

[00200] Dessa forma, a invenção abrange as sequências de ácido nucleico descritas acima, fragmentos delas, sequências hibridizantes encontradas nelas, sequências homólogas delas, sequências codificando polipeptídeos semelhantes com diferentes utilizações de códons, sequências alteradas caracterizadas por mutações, como exclusão, introdução ou substituição de um ou mais nucleotídeos, ocorrendo naturalmente ou induzidos pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.

[00201] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo, compreendendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de aminoácidos de uma planta cujo ortólogo ocorre naturalmente do polipeptídeo selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794 e 2898-4855.

[00202] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos, pelo menos 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de aminoácidos de uma planta cujo ortólogo ocorre naturalmente do polipeptídeo selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794 e 2898-4855.

[00203] A invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo das ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897.

[00204] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é capaz de aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, teor de óleo, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água de uma planta.

[00205] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, é selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897.

[00206] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo isolado é estabelecido pelas ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 ou 2897.

[00207] A invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855.

[00208] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, teor de óleo, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.

[00209] A invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[00210] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

[00211] A invenção fornece um polipeptídeo isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855.

[00212] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos é selecionado do grupo que consiste das ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[00213] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo é estabelecido pelas ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 ou 4855.

[00214] A invenção também abrange fragmentos dos polipeptídeos descritos acima e de polipeptídeos apresentando mutações, como exclusões, introduções ou substituições de um ou mais aminoácidos, ocorrendo naturalmente ou induzido pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.

[00215] O termo “planta”, conforme utilizado aqui, abrange plantas integrais, plantas enxertadas, ancestrais e progênies de plantas e partes da planta, incluindo sementes, brotos, caules, raízes (incluindo os tubérculos), rizomas, enxertos e células, tecidos e órgãos da planta. A planta pode estar em qualquer forma, incluindo culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular as monocotiledôneas e as dicotiledôneas, incluindo uma forragem ou leguminosa forrageira, planta ornamental, cultura alimentar, árvore ou arbusto selecionado da lista que compreende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Buchá frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lótus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseupontosuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinífera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, couve, canola, cenouras, couve-flor, aipo, couve-manteiga, linho, couve crespa, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilhas, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma grama perene e uma cultura forrageira. Alternativamente, algas e outras não- Viridiplantae podem ser utilizadas para os métodos da presente invenção.

[00216] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta utilizada pelo método da invenção é uma planta de cultura como o arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, colza, tabaco, choupo e algodão.

[00217] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta é uma planta dicotiledônea.

[00218] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta é uma planta monocotiledônia.

[00219] De acordo com algumas aplicações da invenção, apresenta-se uma célula vegetal expressando de forma exógena o polinucleotídeo de algumas aplicações da invenção, a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção e/ou o polipeptídeo de algumas aplicações da invenção.

[00220] De acordo com algumas aplicações da invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno da invenção dentro da planta é afetada pela transformação de uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguida pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivando a planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.

[00221] De acordo com algumas aplicações da invenção, a transformação é efetuada pela introdução de uma estrutura de ácido nucleico na célula da planta que inclua o polinucleotídeo exógeno de algumas aplicações da invenção e pelo menos um promotor para orientar a transcrição do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula vegetal). Detalhes adicionais de abordagens de transformação adequadas são apresentadas abaixo.

[00222] Conforme mencionado, a estrutura de ácido nucleico, de acordo com algumas aplicações da invenção, compreende uma sequência promotora e o polinucleotídeo isolado, de acordo com algumas aplicações da invenção.

[00223] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado está operacionalmente ligado à sequência promotora.

[00224] Uma sequência de ácido nucleico codificadora é “operacionalmente ligada” a uma sequência reguladora (p.ex., o promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência codificadora ligada a ela.

[00225] Conforme utilizado aqui, o termo “promotor” refere-se a uma região de DNA que fica a montante do sítio da inicial transcricional de um gene ao qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (p.ex., qual porção de uma planta) e/ou quando (p.ex., em que estágio ou condição no tempo de vida de um organismo) o gene é expresso.

[00226] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.Conforme utilizado aqui, o termo “promotor heterólogo” refere-se a um promotor de uma espécie diferente ou da mesma espécie, mas de um lócus de gene diferente, a partir da sequência de plinucleotídeo isolado.

[00227] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado é heterólogo à célula da planta.

[00228] Qualquer sequência adequada de promotor pode ser utilizada pela estrutura de ácido nucleico da presente invenção. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico do tecido ou induzível ao estresse abiótico.

[00229] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é um promotor de planta que é adequado para expressão do polinucleotídeo exógeno em uma célula de planta.

[00230] Promotores adequados para expressão em trigo incluem, mas não se limitam a promotor SPA de trigo (ID SEQ. N° 4856; Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997, que é totalmente incorporado aqui por referência), trigo LMW [ID SEQ. N° 4857 (promotor mais longo LMW) e ID SEQ. N° 4858 (promotor LMW)] e glutenina-1 HMW [ID SEQ. N° 4859 (promotor mais longo glutenina-1 trigo LMW) e ID SEQ. N° 4860 (Promotor glutenina- 1 trigo HMW); Thomas e Flavell, The Plant Cell 2:1171-1180; Furtado et al., 2009 Plant Biotechnology Journal 7:240-253, cada um é completamente incorporado aqui por referência] trigo alfa, beta e gama gliadinas [p.ex., SEQ ID NO: 4861 (trigo alfa gliadina, genoma B, promotor); ID SEQ. N° 4862 (trigo gama gliadina promotor); EMBO 3:1490-15, 1984, que é totalmente incorporado aqui por referência] trigo TdPR60 [ID SEQ. N° 4863 (trigo TdPR60 promotor mais longo) ou ID SEQ. N° 4864 (promotor do trigo TdPR60); Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71:81-98, 2009, que é totalmente incorporado aqui por referência], promotor do milho Ub1 [cultivares Nongda 105 (ID SEQ. N° 4865); GenBank: DQ141598.1; Taylor et al., Plant Cell Rep 1993 12: 491-495, que é totalmente incorporado aqui por referência), e cultivares B73 (ID SEQ. N° 4866); Christensen, AH, et al. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992), que é totalmente incorporado aqui por referência), arroz actina 1 (ID SEQ. N° 4867; Mc Elroy et al. 1990, The Plant Cell, Vol. 2, 163171, que é totalmente incorporado aqui por referência), e arroz GOS2 [ID SEQ. N° 4868 (promotor mais longo do arroz GOS2) e ID SEQ. N° 4869 (Promotor do arroz GOS2); De Pater et al. Plant J. 1992 ; 2: 837-44, que é totalmente incorporado aqui por referência), Arabidopsis Pho1 [ID SEQ. N° 4870 (Promotor Pho1 de Arabidopsis); Hamburger et al., Plant Cell. 2002 ; 14: 889- 902, que é totalmente incorporado aqui por referência), promotores ExpansinB, p.ex., arroz ExpB5 [ID SEQ. N° 4871 (promotor mais longo do arroz ExpB5) e SEQ ID NO: 4872 (promotor do arroz ExpB5) e Cevada ExpBl [ID SEQ. N° 4873 (promotor da cevada ExpBl), Won et al. Mol Cells. 2010; 30:369-76, que é totalmente incorporado aqui por referência), cevada SS2 (sacarose síntase 2) [(ID SEQ. N° 4874), Guerin e Carbonero, Plant Physiology May 1997 vol. 114 no. 1 55-62, que é totalmente incorporado aqui por referência], e arroz PG5a [ID SEQ. N° 4875, US 7.700.835, Nakase et al., Plant Mol Biol. 32:621-30, 1996, que é totalmente incorporado aqui por referência].

[00231] Promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, o promotor CaMV 35S [ID SEQ. N° 4876 (Promotor CaMV 35S (QFNC)); ID SEQ. N° 4877 (PJJ 35S de Brachypodium); ID SEQ. N° 4878 (Promtor CaMV 35S (OLD)) (Odell et al., Nature 313:810-812, 1985)], promotor At6669 Arabidopsis (ID SEQ. N° 4879 (Promotor Arabidopsis At6669 (OLD)); vide Publicação PCT N°. WO04081173A2 ou o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 4880 (Promotor At6669 Arabidopsis (NOVO)); Promotor do milho Ub1 [cultivares Nongda 105 (ID SEQ. N° 4865); GenBank: DQ141598.1; Taylor et al., Plant Cell Rep 1993 12: 491-495, que é totalmente incorporado aqui por referência), e cultivares B73 (ID SEQ. N° 4866); Christensen, AH, et al. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992), que é totalmente incorporado aqui por referência), arroz actina 1 (ID SEQ. N° 4867, McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456462, 1997); arroz GOS2 [ID SEQ. N° 4868 (promotor mais longo do arroz GOS2) e ID SEQ. N° 4869 (Promotor do arroz GOS2); De Pater et al., Plant J Nov;2(6):837-44, 1992]; promotor RBCS (ID SEQ. N° 4881); Ciclofilina do arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); histone H3 de milho (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10(1);107-121, 1996) e Super MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes Americanas N° 5.659.026, 5.608.149, 5.608.144, 5.604.121, 5.569.597, 5.466.785, 5.399.680, 5.268.463 e 5.608.142.

[00232] Promotores adequados específicos de tecido incluem, mas não se limitam a promotores específicos de folha [p.ex., AT5G06690 (Thioredoxin) (expressão elevada, ID SEQ. N° 4882), AT5G61520 (AtSTP3) (expressão rebaixada, ID SEQ. N° 4883) descrito em Buttner et al 2000 Plant, Cell and Environment 23, 175-184, ou os promotores descritos em Yamamoto et al., Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:11291138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:9586-9590, 1993; bem como o promotor STP3 Arabidopsis (AT5G61520) (Buttner et al., Plant, Cell and Environment 23:175-184, 2000)], promotores preferidos de semente [p.ex., Napin (originados da Brassica napus, sendo caracterizado por uma atividade promotora específica de semente; Stuitje A. R. et. al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309; ID SEQ. N°: 4884 (Promotor NAPIN Brassica napus) a partir dos genes específicos de semente (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), arroz PG5a (ID SEQ. N° 4875; US 7.700.835), desenvolvimento precoce de sementes Arabidopsis BAN (AT1G61720) (ID SEQ. N° 4885, US 2009/0031450 A1), desenvolvimento tardio de sementes Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) (ID SEQ. N° 4886 (Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) Promotor mais longo) ou 4887 (Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) Promotor)) (Ng et al., Plant Molecular Biology 54: 25-38, 2004), Albumina de castanha do Brasil (Pearson’ et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), leguminosas (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203- 214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), SPA de trigo (ID SEQ. N° 4856; Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992)], promotores específicos de endosperma [p.ex., trigo LMW (ID SEQ. N° 4857 (Trigo LMW Promotor mais longo), e ID SEQ. N° 4858 (promotor LMW de trigo)] e glutenina-1 HMW [ID SEQ. N° 4859 (promotor mais longo glutenina-1 LMW de trigo) e ID SEQ. N° 4860 (Promotor glutenina-1 HMW de trigo); Thomas e Flavell, The Plant Cell 2:1171-1180, 1990; Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), trigo alfa, beta e gama gliadinas (ID SEQ. N° 4861 (promotor alfa gliadina de trigo (genoma B)); ID SEQ. N° 4862 (promotor gama gliadina de trigo); EMBO 3:1409-15, 1984), promotor ltrl da cevada, cevada B1, C, D hordeína (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), cevada DOF (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 5362, 1998), Biz2 (EP99106056.7), Cevada SS2 (ID SEQ. N° 4874 (Promotor SS2 de Cevada); Guerin e Carbonero Plant Physiology 114: 1 55-62, 1997), trigo Tarp60 Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71:81- 98, 2009, cevada D- hordeína (D-Hor) e B-hordeína (B-Hor) (Agnelo Furtado, Robert J. Henry e Alessandro Pellegrineschi (2009)], promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), arroz prolamina NRP33, arroz- globulina Glb-1 (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), arroz alfa- globulina REB/OHP-1 (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glicose de arroz PP (Trans Res 6:157-68, 1997), família do gene de milho ESR (Plant J 12:235-46, 1997), gama-kafirina de sorgo (PMB 32:102935, 1996)], promotores específicos embrionários [p.ex., arroz OSH1 (Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma ef al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), arroz oleosina (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores de flor específicos [p.ex., AtPRP4, chalene sintase (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen. Genet. 217:240-245; 1989), Arabidopsis apetala-3 (Tilly et al., Development. 125:1647-57, 1998), Arabidopsis APETALA 1 (AT1G69120, API) (ID SEQ. N°: 4888 (Arabidopsis (AT1G69120) APETALA 1)) (Hempel et al., Development 124:3845-3853, 1997)], e promotor de raiz [p.ex., o promotor ROOTP [ID SEQ. N°: 4889]; arroz ExpB5 (ID SEQ. N° 4872 (Promotor de arroz ExpB5); ou ID SEQ. N° 4871 (Promotor mais longo de arroz ExpB5)) e promotores de cevada ExpB1 (ID SEQ. N° 4873) (Won et al. Mol. Cells 30: 369-376, 2010); promotor Arabidopsis ATTPS-CIN (AT3G25820) (ID SEQ. N° 4890; Chen et al., Plant Phys 135:1956-66, 2004); promotor Arabidopsis Phol (ID SEQ. N°: 4870, Hamburger et al., Plant Cell. 14: 889-902, 2002), que também é ligeiramente induzida por estresse].

[00233] Promotores induzíveis pelo estresse abiótico incluem, mas não se limitam a promotores induzíveis pelo sal, como o RD29A (Yamaguchi- Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induzíveis pela seca, como o gene promotor rab17 (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), o gene promotor rab28 do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997 e o gene promotor Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373- 380, 1999); promotores induzíveis pelo calor como o promotor hsp80 do tomate (Patente Norte-Americana N° 5.187.267).

[00234] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode incluir, ainda, um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas aplicações da invenção, a estrutura de ácido nucleico utilizada é um vetor ponte, que pode se propagar tanto em E. coli (onde a estrutura compreenda um marcador selecionável apropriado e a origem da replicação) quanto pode ser compatível com a propagação nas células. A estrutura de acordo com a presente invenção pode ser, p.ex., um plasmídeo, um bacmídeo, um fagemídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[00235] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode ser utilizado para transformar de maneira estável ou transitória as células da planta. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado ao genoma da planta e, como tal, representa um traço estável e herdado. Na transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrado no genoma e, como tal, representa um traço transitório.

[00236] Existem vários métodos para introduzir genes estranhos, tanto em monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol, Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

[00237] Os métodos do princípio de causa da integração estável de DNA exógeno em DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: (i) A transferência genética mediada pelo Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers em Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, em Plant Biotechnology, eds. Kung, S. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.

[00238] (ii) Absorção direta do DNA: Paszkowski et al., em Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para a absorção direta de DNA nos protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Absorção de DNA induzida pelo breve choque elétrico de células vegetais: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células ou tecidos vegetais por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923- 926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pela utilização de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de partículas de fibras de vidro ou carboneto de silício de culturas celulares, embriões ou tecido caloso, Patente Norte-Americana N° 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen germinante, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1986) 83:715- 719.

[00239] O sistema Agrobacterium inclui a utilização de vetores plasmidiais que contenham segmentos definidos de DNA que se integram no DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido vegetal variam dependendo da espécie da planta e do sistema de entrega do Agrobacterium. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante tecidual que oferece uma boa fonte para o início da diferenciação de toda a planta. Vide, p.ex., Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de entrega do Agrobacterium em combinação com infiltração a vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de dicotiledôneas transgênicas.

[00240] Existem vários métodos de transferência direta de DNA para células vegetais. Na eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é injetado de forma mecânica diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento de micropartículas, o DNA é absorvido em microprojéteis como os cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio e os microprojéteis são fisicamente acelerados nas células ou tecidos vegetais.

[00241] Após a transformação estável, a propagação vegetal é realizada. O método mais comum de propagação vegetal é pela semente. A regeneração pela propagação de sementes, no entanto, apresenta a deficiência de que devido à heterozigosidade há uma falta de uniformidade na cultura, uma vez que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas normas Mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma irá crescer com seus próprios traços específicos. Portanto, é preferível que a planta transformada seja produzida de forma que a planta regenerada tenha traços e características idênticos da planta transgênico arranjo. Portanto, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação que proporciona a reprodução rápida, consistente das plantas transformadas.

[00242] A micropropagação é um processo de cultivo de plantas de nova geração a partir de um pedaço de tecido que tenha sido retirado de uma planto arranjo selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas que tenham o tecido preferido expressando a proteína da fusão. As plantas da nova geração que forem produzidas são geneticamente idênticas à planta original e apresentam todas as suas características. A micropropagação permite a produção em massa de material vegetal de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta transgênica ou transformada original. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e a uniformidade das plantas produzidas.

[00243] A micropropagação é um procedimento de múltiplos estágios que requer a alteração do meio de cultura ou das condições de cultivo entre os estágios. Dessa forma, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura tecidual inicial; estágio dois, multiplicação da cultura tecidual; estágio três, diferenciação e formação da planta; e estágio quarto, cultura e fortalecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura tecidual inicial, a cultura tecidual é estabelecida e certificada como sendo livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura tecidual inicial é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atender aos objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são dividas e cultivadas em plântulas individuais. No estágio quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para fortalecimento, onde a tolerância das plantas à luz é gradativamente aumentada de forma que ela possa ser cultivada no ambiente natural.

[00244] De acordo com algumas aplicações da invenção, as plantas transgênicas são geradas pela transformação transitórias de células de folhas, de células meristemáticas ou de toda a planta.

[00245] A transformação transitória pode ser efetuada por quaisquer dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus modificados de plantas.

[00246] Os vírus que demonstraram ser úteis para a transformação de hospedeiros de plantas incluem o CaMV, o vírus mosaico do tabaco (TMV|tabaco mosaic virus), vírus mosaico do bromo (BMV| brome mosaic virus) e o vírus mosaico comum do feijoeiro (BV ou BCMV|beam common mosaic virus). A transformação de plantas utilizando vírus de plantas é descrita na Patente Norte-Americana N° 4.855.237 (vírus mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67.553 (TMV), Pedido Japonês Publicado N° 6314693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). As partículas pseudovirais para utilização na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas na WO 87/06261.

[00247] De acordo com algumas aplicações da invenção, o vírus utilizado para transformação transitória é avirulento e, dessa forma, é incapaz de causar sintomas graves como a taxa de crescimento reduzida, mosaico, manchas anelares, enrolamento da folha, amarelamento, estrias, formação de vesículas, formação de tumor e corrosão. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento que ocorra naturalmente ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação do vírus pode ser efetuada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando ao aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese dirigidas conforme descrito, p.ex., por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).

[00248] Cepas virais adequadas podem ser obtidas de fontes disponíveis, como, p.ex., da Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC|American Type Culture Collection) ou pelo isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos vegetais infectados pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na técnica, conforme descrito, p.ex., por Foster e Tatlor, Eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998. Acredita-se que rapidamente, os tecidos de uma planta infectada contenham uma concentração elevada de um vírus adequado, preferivelmente folhas jovens e pétalas de flores, são trituradas em uma solução tampão (p.ex., solução tampão fosfato) para produzir uma seiva infectada com vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.

[00249] A estrutura de vírus de RNA da planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleotídeo exógeno não-viral em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e Patente Norte-Americana N° 5.316.931.

[00250] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser feitas ao vírus propriamente dito. Alternativamente, o vírus pode primeiramente ser clonado em um plasmídeo bacteriano para facilitar a estrutura do vetor viral desejado com o DNA estranho. Então, o vírus pode ser extraído do plasmídeo. Se o vírus for um vírus do DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral que é, então, replicado pela bactéria. A transcrição e a tradução desse DNA produzirão a proteína de revestimento que irá encapsular o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é, geralmente, clonado como um cDNA e introduzido em um plasmídeo. Então, o plasmídeo é utilizado para fazer todas as estruturas. Então, o vírus de RNA é produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídeo e tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsula o RNA viral.

[00251] Em uma aplicação, um polinucleotídeo viral de uma planta é fornecido, no qual a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência foi excluída de um polinucleotídeo viral, uma proteína de revestimento viral não nativa da planta codificando a sequência e um promotor não nativo, preferivelmente o promotor subgenômico da proteína de revestimento não nativa que codifica a sequência, capaz de se expressar no hospedeiro da planta, no envoltório do polinucleotídeo viral recombinante da planta e garantindo uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta, foi introduzido. Alternativamente o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela introdução da sequência de polinucleotídeo não nativo dentro dele, de forma que uma proteína seja produzida. O polinucleotídeo viral recombinante da planta pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos adicionais. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou de expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeos no hospedeiro da planta e incapaz de recombinar uns com ou outros e com os promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeo não nativas (estranhas) podem ser introduzidas adjacentes ao promotor subgenômico viral nativo da planta ou o promotor subgenômico viral nativo e o promotor subgenômico viral não nativo da planta, se houver mais de uma sequência de polinucleotídeo for incluída. As sequências de polinucleotídeo não nativas são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.

[00252] Em uma segunda aplicação, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido, como na primeira aplicação, exceto que a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência é colocada adjacente a um dos promotores genômicos da proteína de revestimento não nativa ao invés de uma sequência codificadora da proteína de revestimento não nativa.

[00253] Em uma terceira aplicação, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é fornecido, no qual o gene da proteína de revestimento nativa é adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foi(ram) inserido(s) no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos introduzidos são capazes de transcrever ou de expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de recombinar uns com ou outros e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativas podem ser introduzidas adjacentes aos promotores subgenômicos virais não nativos da planta de forma que as sequências são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir o produto desejado.

[00254] Em uma quarta aplicação, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido, como na terceira aplicação, de forma que a sequência codificadora da proteína de revestimento nativa seja substituída por uma sequência codificadora da proteína de revestimento não nativa.

[00255] Os vetores virais são encapsulados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta para produzir um vírus da planta recombinante. O polinucleotídeo viral recombinante da planta ou o vírus da planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras apropriadas. O polinucleotídeo viral recombinante da planta é capaz de replicação no hospedeiro, difusão sistêmica no hospedeiro e transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[00256] Técnicas para inoculação de vírus para plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. “Methods in Virology” 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. “Methods in Plant Virology”, Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. “Applied Plant Virology”, Wiley, New York, 1985; e Kado e Agrawa, eds. “Principles e Techniques in Plant Virology”, Van Nostrand- Reinhold, New York.

[00257] Além do exposto acima, o polinucleotídeo da presente invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto permitindo, dessa forma, a expressão de cloroplasto.

[00258] Uma técnica para introduzir sequências de polinucleotídeo exógeno no genoma dos cloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os procedimentos a seguir. Primeiro, as células das plantas são tratadas quimicamente de forma a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente uma. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido através de bombardeamento de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula do polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos são selecionados de forma a serem integráveis no genoma do cloroplasto através de recombinação homóloga que é prontamente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Com essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos uma extensão do polinucleotídeo que é derivada do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável que serve, pelos procedimentos de seleção sequencial, para verificar se todas ou se substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto, após essa seleção, incluirão o polinucleotídeo exógeno. Detalhes adicionais relacionados a essa técnica são encontrados nas Patentes Norte- Americanas N° 4.945.050 e 5.693.507 que são incorporadas aqui por referência. Dessa forma, um polipeptídeo pode ser produzindo pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e se integra à membrana interna do cloroplasto.

[00259] De acordo com algumas aplicações, é fornecido um método para melhorar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta enxertada, o método compreendendo fornecer um enxerto que não expressa de forma transgênica um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, pelo menos, 80% homólogo à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. No 496-794 e 2898-4855 e um rizoma de planta que expressa de forma transgênica um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% homólogo (ou idêntico) à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855 (p.ex., em uma forma constitutiva ou responsiva ao estresse abiótico), melhorando, dessa forma, a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta enxertada.

[00260] Em algumas aplicações, o enxerto da planta é não transgênico.

[00261] Diversas aplicações referem-se a uma planta enxertada, exibindo um aumento da eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico, compreendendo um enxerto que não expressa de forma transgênica um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, pelo menos 80% homólogo à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794 e 2898-4855 e um rizoma de planta que expressa de forma transgênica um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% homólogo (ou idêntico) à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855.

[00262] Em algumas aplicações, o rizoma de planta expressa de forma transgênica um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p. ex., 100% homólogo (ou idêntico) à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855, de forma responsiva ao estresse.

[00263] De acordo com algumas aplicações da invenção, o rizoma de planta expressa de forma transgênica um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[00264] De acordo com algumas aplicações da invenção, o rizoma de planta expressa de forma transgênica um polinucleotídeo, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N°1-495 e 795-2897.

[00265] De acordo com algumas aplicações da invenção, o rizoma de planta expressa de forma transgênica um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N°1-495 e 795-2897.

[00266] Uma vez que os processos que aumentam a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, teor de óleo, produção, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta podem envolver múltiplos genes atuando de forma aditiva ou sinérgica (vide, por exemplo, Quesda et al., Plant Physiol. 130:951-063, 2002), a presente invenção também prevê expressar uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira para, deste modo, alcançar um efeito superior na eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, teor de óleo, produção, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico.

[00267] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se múltiplas estruturas de ácido nucleico, cada uma incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma única célula vegetal. A célula transformada pode, então, ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.

[00268] De forma alternativa, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se, em uma única célula da planta, uma única estrutura de ácido nucleico incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotídeos exógenos. Essa estrutura pode ser desenhada com uma única sequência promotora que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico incluindo todas as sequências diferentes de polinucleotídeo exógeno. A fim de permitir a cotradução dos polipeptídeos diferentes codificados pelo RNA mensageiro policistrônica, as sequências de polinucleotídeos podem ser interligadas através de uma sequência do local interno de entrada do ribossomo (IRES|internal ribosome entry site) que facilita a tradução das sequências de polinucleotídeo posicionadas a jusante da sequência do IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita que codifica os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida tanto no terminal 5’ que tem o cap quanto nas duas sequências internas do IRES da molécula de RNA policistrônico para, assim, produzir todos os diferentes polipeptídeos na célula. Alternativamente, a estrutura pode incluir diversas sequências promotoras, cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.

[00269] A célula da planta transformada com a estrutura, incluindo uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos diferentes, pode ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.

[00270] Alternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada introduzindo diferentes estruturas de ácido nucleico, incluindo polinucleotídeos exógenos diferentes, em uma pluralidade de plantas. As plantas transformadas regeneradas podem, então, ser cruzadas e a progênie resultante selecionada para obter traços superiores de tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso de fertilizante, crescimento, biomassa, produção e/ou vigor, utilizando técnicas convencionais de melhoramento de plantas.

[00271] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o cultivo da planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob estresse abiótico.

[00272] Exemplos não limitantes de condições de estresse abiótico incluem salinidade, estresse osmótico, seca, privação de água, excesso de água (p.ex., inundação, encharcamento), etiolação, baixa temperatura (p.ex., estresse por frio), alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes (p.ex., deficiência de nitrogênio ou limitação de nitrogênio), excesso de nutrientes, poluição atmosférico e irradiação UV.

[00273] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o cultivo da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno em condições limitantes do fertilizante (p.ex., condições limitantes de nitrogênio). Os exemplos não limitantes incluem o cultivo da planta nos solos com baixo teor de nitrogênio (40-50% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais), ou mesmo em deficiência de nitrogênio severa (0 a 10% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais).

[00274] Dessa forma, a invenção abrange plantas que expressam de forma exógena o(s) polinucleotídeo(s), as estruturas de ácido nucleico e/ou o(s) polipeptídeo(s) da invenção.

[00275] Uma vez expresso dentro da célula da planta ou de toda a planta, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica, como ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de se ligarem especificamente ao polipeptídeo, Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA | enzyme-linked immuno sorbent assay), radioimunoensaios (RIA|radio-immuno- assays), imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e outros métodos semelhantes.

[00276] Métodos para determinar o nível do RNA transcrito do polinucleotídeo exógeno na planta são bem conhecidos na técnica e incluem, p.ex., análise de Northern blot, análise de reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR|reverse transcription polymerase chain reaction) (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização in situ para RNA.

[00277] As informações e anotações da sequência não cobertas pelos presentes ensinamentos podem ser aproveitados em favor do melhoramento clássico. Assim, os dados da subsequência daqueles polinucleotídeos descritos acima podem ser utilizados como marcadores para seleção assistida pelo marcador (MAS | marker assisted selection), na qual um marcador é utilizado para seleção indireta de um determinante ou determinantes genético(s) de um traço de interesse (p.ex., biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, produção, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso de nitrogênio e/ou eficiência no uso de fertilizantes). Os dados do ácido nucleico dos presentes ensinamentos (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou estar ligados a sítios polimórficos ou a marcadores genéticos no genoma como o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP | restriction fragment length polymorphism), microssatélites e polimorfismo de nucleotídeo único (SNP|single nucleotide polymorphism), impressão genética (DFP|DNA fingerprinting), polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP|amplified fragment length polymorphism), polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptídeo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou de RNA.

[00278] Exemplos de seleções assistidas do marcador incluem, mas não se limitam à seleção de um traço morfológico (p.ex., um gene que afete a forma, a coloração, a esterilidade masculina ou a resistência como a presença ou a ausência de aresta, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma do arroz); seleção de um traço bioquímico (p.ex., um gene que codifique uma proteína que possa ser extraída e observada; p.ex., isozimas e proteínas de reserva); seleção de um traço biológico (p.ex., (raças patogênicas ou biotipos de insetos com bases no patógeno hospedeiro ou a interação com o parasita hospedeiro pode ser utilizada como um marcador desde que a constituição genética de um organismo possa afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).

[00279] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos acima podem ser utilizados em uma ampla variedade de plantas econômicas, de forma segura e eficiente em termos de custo.

[00280] Linhagens vegetais que expressam de forma exógena o polinucleotídeo ou o polipeptídeo da invenção são triadas para identificar aquelas que mostram o maior aumento do traço desejado da planta.

[00281] Portanto, de acordo com uma aplicação adicional da presente invenção, é fornecido um método de avaliação de um traço de uma planta, o método compreendendo: (a) express em uma planta ou em uma parte respectiva a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção; e (b) avaliar um traço de uma planta em comparação a uma planta do tipo selvagem do mesmo tipo (p.ex., não transformada com as biomoléculas reivindicadas); avaliando, deste modo, o traço da planta.

[00282] De acordo com algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de produção de uma colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotídeo exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 81 %, pelo menos cerca de 82 %, pelo menos cerca de 83 %, pelo menos cerca de 84 %, pelo menos, cerca de 85 %, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 %, pelo menos cerca de 89 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou, digamos, 100 % homólogo à sequência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855, caracterizado pela referida planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da eficiência no uso de fertilizante, aumento da eficiência no uso do nitrogênio, aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso da água, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra e/ou aumento da capacidade fotossintética se comparada a uma planta de controle, produzindo, deste modo, a colheita.

[00283] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de produção de uma cultura, compreendendo o cultivo de uma cultura de planta transformada com um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo, pelo menos 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou, digamos, 100% homólogo (p.ex., idêntico) à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 e 4855, caracterizado pela planta de cultura ser derivada de plantas selecionadas para um aumento na tolerância ao estresse abiótico, aumento na eficiência no uso da água, aumento na taxa de crescimento, aumento no vigor, aumento na biomassa, aumento no teor de óleo, aumento na produção, aumento na produção de sementes, aumento na produção de fibra, aumento na qualidade da fibra, aumento no comprimento da fibra, aumento na capacidade fotossintética e/ou aumento na eficiência no uso de fertilizantes (p.ex., aumento na eficiência no uso do nitrogênio) se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de cultivo, e a planta de cultivo tendo aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso da água, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da biomassa, aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da produção de sementes, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da eficiência no uso de fertilizantes (p.ex., aumento da eficiência no uso do nitrogênio), produzindo, deste modo, a cultura.

[00284] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptideo é selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[00285] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de produção de uma cultura, compreendendo o cultivo de uma cultura de uma planta expressando um polinucleotídeo exógeno que compreende uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 1-495, 7952896 e 2897, caracterizado pela referida planta ser derivada de uma planta (planta principal) que foi transformada para expressar o polinucleotídeo exógeno e que foi selecionada para aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso da água, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da biomassa, aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da produção de sementes, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da eficiência no uso de fertilizantes (p.ex., aumento da eficiência no uso do nitrogênio) se comparada a uma planta de controle, produzindo, deste modo, a cultura.

[00286] De acordo com um aspecto de algumas plicações da invenção, é fornecido um método de produção de uma cultura, compreendendo o cultivo de uma cultura de planta transformada com um polinucleotídeo exógeno, pelo menos 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo enos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou digamos, 100% idêntico à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 1- 495, 795-2896 e 2897, caracterizado pela planta de cultura ser derivada de plantas selecionadas para aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso da água, aumentara taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da biomassa, aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da produção de sementes, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da eficiência no uso de fertilizantes (p.ex., aumento da eficiência no uso do nitrogênio) se comparada a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de cultivo, e o planta de cultura tendo um aumento na tolerância ao estresse abiótico, aumento na eficiência no uso da água, aumento na taxa de crescimento, aumento no vigor, aumento na biomassa, aumento no teor de óleo, aumento na produção, aumento na produção de sementes, aumento na produção de fibra, aumento na qualidade da fibra, aumento no comprimento da fibra, aumento na capacidade fotossintética e/ou aumento na eficiência no uso de fertilizantes (p.ex., aumento na eficiência no uso do nitrogênio) produzindo, deste modo, a cultura.

[00287] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897.

[00288] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para cultivo de uma colheita, compreendendo a semeadura de sementes e/ou plantio de mudas de uma planta transformada com o polinucleotídeo exógeno da invenção, por exemplo, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de algumas aplicações da invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso da água, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da biomassa, aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da produção de sementes, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da eficiência no uso de fertilizantes (aumento da eficiência no uso de nitrogênio) se comparada a uma planta não transformada.

[00289] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotídeo exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntico às ID SEQ. N° 496-794, 2898-3645, 3647-4854 ou 4855, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso da água, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da biomassa, aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da produção de sementes, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da eficiência no uso de fertilizantes (aumento da eficiência no uso de nitrogênio) se comparada a uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.

[00290] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptideo é selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 496-794, 2898-4854 e 4855.

[00291] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotídeo exógeno, compreendendo a sequência de ácido nucleico, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica às ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 ou 2897, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da eficiência no uso da água, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da biomassa, aumento do teor de óleo, aumento da produção, aumento da produção de sementes, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento do comprimento da fibra, aumento da capacidade fotossintética e/ou aumento da eficiência no uso de fertilizantes (aumento da eficiência no uso de nitrogênio) se comparada a uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.

[00292] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é selecionado do grupo consistindo nas ID SEQ. N° 1-495, 795-2896 e 2897.

[00293] O efeito de transgene (o polinucleotídeo exógeno codificando o polipeptídeo) sobre a tolerância ao estresse abiótico pode ser determinado utilizando métodos conhecidos, conforme detalhado abaixo e na seção de Exemplos a seguir.

[00294] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (isto é, expressando o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, como privação de água, temperatura subótima (baixa temperatura, temperatura elevada), deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, uma condição de estresse causada pelo sal, estresse osmótico, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00295] Ensaio de tolerância à salinidade - Espera-se que plantas transgênicas com tolerância a concentrações elevadas de sal apresentem melhor germinação, vigor da muda ou crescimento em condições com níveis elevados de sal. O estresse por sal pode ser efetuado de muitas maneiras como, p.ex., irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando as plantas hidroponicamente em uma solução de cultivo hiperosmótica (p.ex., solução de Hoagland), ou submetendo as plantas à cultura em meio de crescimento hiperosmótico [p.ex., meio de Murashige-Skoog (meio MS) a 50%]. Como diferentes plantas variam consideravelmente em sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, na solução de crescimento ou no meio de crescimento pode ser ajustada de acordo com as características específicas do cultivar ou variedade específica da planta, de forma a infligir um efeito leve ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para conhecer as diretrizes com relação à concentração apropriada, consulte, Bernstein e Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A e Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., New York, 2002 e a referência lá contida).

[00296] Por exemplo, o teste de tolerância à salinidade pode ser realizado irrigando as plantas em diferentes estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (p.ex., 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM de NaCl) aplicadas de baixo e de cima para garantir uma dispersão regular do sal. Após a exposição à condição de estresse, as plantas são, frequentemente, monitoradas até que os efeitos fisiológicos e/ou morfológicos apareçam nas plantas do tipo selvagem. Dessa forma, a aparência fenotípica externa, o grau de emurchecimento e o sucesso geral para atingir a maturidade e a progênie da produção são comparados entre as plantas de controle e as transgênicas.

[00297] Os parâmetros quantitativos de tolerância medidos incluem, mas não estão limitados ao peso úmido e seco médio, à taxa de crescimento, ao tamanho da folha, à cobertura foliar (área foliar geral), ao peso das sementes geradas, ao tamanho médio das sementes e ao número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem maior biomassa do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

[00298] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios com cloreto de sódio e manitol) são realizados para determinar se um fenótipo de estresse osmótico era específico do cloreto de sódio ou se era um fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. As plantas tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou congelamento. Para experimentos de germinação sob estresse salino e osmótico, o meio é suplementado, p.ex., com 50 mM, 100 mM, 200 mM de NaCl ou com 100 mM, 200 mM NaCl, 400 mM de manitol.

[00299] Ensaio de tolerância à seca/Ensaio osmótico - A tolerância à seca é realizada para identificar os genes que conferem melhor sobrevida à planta depois de privação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico produzido pelo osmólito sorbitol não-iônico no meio pode ser realizado. Plantas de controle e transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de ágar em plantas por 4 dias, depois do que elas são transferidas para placas contendo 50 mM de sorbitol. O tratamento causa retardamento do crescimento, então, tanto as plantas de controle quanto as transgênicas são comparadas, medindo o peso da planta (úmida e seca), a produção e pelas taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração.

[00300] Inversamente, telas secas com base no solo são realizadas com plantas superexpressando os polinucleotídeos detalhados acima. Sementes de plantas Arabdopsis de controle, ou de outras plantas transgênicas que superexpressam o polipeptídeo da invenção, são germinadas e transferidas para vasos. O estresse à seca é obtido depois que a irrigação é interrompida, acompanhada pela colocação dos vasos em papel absorvente para melhorar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controle são comparadas umas com as outras quando a maioria das plantas de controle desenvolvem emurchecimento grave. As plantas recebem água novamente depois de obter uma fração significativa das plantas de controle exigindo emurchecimento grave. As plantas são classificadas em comparação com os controles em relação a cada um dos dois critérios: tolerância às condições de seca e recuperação (sobrevida) após a reirrigação.

[00301] Tolerância ao estresse por frio - Para analisar o estresse por frio, plantas maduras (25 dias de idade) são transferidas para câmaras a 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Posteriormente, as plantas são devolvidas à estufa. Duas semanas depois, os danos causados pelo período de resfriamento, resultando no retardamento do crescimento e em outros fenótipos, são comparados entre as plantas tanto de controle quanto transgênicas, medindo o peso da planta (úmida e seca) e comparando as taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração, o tamanho da planta, a produção e parâmetros semelhantes.

[00302] Tolerância ao estresse por calor - A tolerância ao estresse por calor é alcançada expondo as plantas a temperaturas acima de 34°C por um determinado período. A tolerância da planta é examinada depois de transferir as plantas de volta para 22°C para recuperação e avaliação depois de 5 dias em relação aos controles internos (plantas não-transgênicas) ou plantas não expostas nem ao estresse por frio nem ao estresse por calor.

[00303] Eficiência no uso da água - pode ser determinada como a biomassa produzida por transpiração unitária. Para analisar a WUE, o teor de água relativo da folha pode ser medido em plantas de controle e transgênicas. O peso fresco (FW | fresh weight) é registrado imediatamente; então, as folhas são colocadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TW | turgid weight) é registrado. O peso seco (DW | dry weight) total é registrado depois da secagem das folhas a 60°C a um peso constante. O teor relativo de água (RWC | relative water content) é calculado de acordo com a seguinte Fórmula I: Fórmula I RWC = [(FW - DW) / (TW - DW)] x 100

[00304] Eficiência no uso de fertilizantes - Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas foram cultivadas em placas de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante, conforme descrito, por exemplo, nos Exemplos 15-17 abaixo e em Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci EUA. 2004; 101:7833-8. As plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteína do broto e/ou grão. Os parâmetros verificados são o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos, o teor de óleo, etc. Semelhantemente, ao invés de fornecer nitrogênio em quantidades limitantes, fosfato ou potássio podem ser adicionados em concentrações crescentes. Novamente os mesmos parâmetros medidos são os mesmos listados acima. Dessa forma, a eficiência no uso de nitrogênio (NUE), a eficiência da utilização do fosfato (PUE | phosphate use efficiency) e a eficiência da utilização de potássio (KUE | potassium use efficiency) são avaliadas, verificando a capacidade das plantas transgênicas de se desenvolverem sob condições de restrição de nutrientes.

[00305] Eficiência no uso de nitrogênio - Para analisar se as plantas transgênicas (p.ex., plantas Arabidopsis) são mais responsivas ao nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75-3 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou 6-10 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permite-se que as plantas cresçam por 25 dias adicionais ou até a produção de semente. Então, as plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteína do broto e/ou do grão/semente. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos o teor de óleo. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem níveis maiores dos parâmetros medidos do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas eficientes na utilização do nitrogênio.

[00306] Ensaio de eficiência no uso de nitrogênio utilizando plântulas - O ensaio é realizado de acordo com Yanagisawa-S. et al. com pequenas modificações (“Metabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation e growth under low- nitrogen conditions” Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101, 7833- 7838). Brevemente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7-10 dias em 0,5 x MS [Murashige- Skoog] suplementadas com um agente de seleção são transferidas para duas condições limitantes de nitrogênio: O meio MS no qual a concentração de nitrogênio combinada (NH4NO3 e KNO3) era de 0,75 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou de 6-15 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permitiu-se que as plantas crescessem por 30-40 dias adicionais e, então, foram fotografadas, removidas individualmente do Ágar (o broto sem as raízes) e pesadas imediatamente (peso fresco) para análise estatística posterior. Estruturas para as quais somente sementes T1 estão disponíveis são semeadas em meio seletivo e pelo menos 20 mudas (cada uma representando um evento de transformação independente) são cuidadosamente transferidas para o meio limitante de nitrogênio. Para estruturas nas quais sementes T2 estão disponíveis, eventos de transformação diferentes são analisados. Geralmente, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para o meio limitante de nitrogênio e permite- se que elas cresçam por 3-4 semanas adicionais e são pesadas individualmente no final daquele período. As plantas transgênicas são comparadas às plantas de controle cultivadas paralelamente sob as mesmas condições. Plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor, ou plantas transgênicas carregando o mesmo promotor mas sem um gene repórter, são utilizadas como controle.

[00307] Determinação do nitrogênio - O procedimento para a determinação da concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolve o método de digestão de persulfato de potássio para converter o N orgânico em NO3- (Purcell e King 1996 Argon. J. 88:111- 113), a redução mediada de Cd- modificada de NO3- a NO2- (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrito pelo ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorvência são medidos a 550 nm em relação a uma curva padrão de NaNO2. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.

[00308] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes de plantas transgênicas que poderiam completar o processo de germinação ao percentual de sementes das plantas de controle que são tratadas da mesma maneira. Condições normais são consideradas, por exemplo, incubações a 22°C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação da germinação e do vigor da muda é realizada entre 4 e 14 dias após o plantio. O meio basal é o meio MS a 50% (Murashige e Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).

[00309] A germinação também é verificada em condições desfavoráveis como o frio (incubação a temperaturas inferiores a 10°C ao invés de 22°C) ou utilizando soluções para inibição da semente que contenham concentrações elevadas de um osmólito como o sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM e até 1000 mM) ou aplicando concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM de NaCl).

[00310] O efeito do transgene sobre o vigor, a taxa de crescimento, a biomassa, a produção e/ou o teor de óleo da planta pode ser determinado utilizando métodos conhecidos.

[00311] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento dos parâmetros de crescimento como a área de folha, o comprimento das fibras, o diâmetro da roseta, o peso fresco da planta e parâmetros semelhantes por período.

[00312] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida utilizando a análise digital de plantas cultivadas. Por exemplo, as imagens das plantas cultivadas em estufa com base no terreno podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área da roseta é calculado utilizando a diferença da área da roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.

[00313] A avaliação da taxa de crescimento pode ser realizada medindo a biomassa produzida da planta, o tamanho da folha ou o comprimento da raiz por período (pode ser medido em cm2 por dia de área de folha). A Área de Crescimento Relativo pode ser calculada utilizando a Fórmula II. Fórmula II: Área da Taxa de Crescimento Relativo = Coeficiente de regressão da área ao longo do tempo.

[00314] Desse modo, a taxa da área de crescimento relativo está nas unidades das unidades da área (p.ex., mm2/dia ou cm2/dia) e a taxa de crescimento relativo do comprimento está nas unidades das unidades de comprimento (p. ex., cm/dia ou mm/dia).

[00315] Por exemplo, a RGR pode ser determinada para altura da planta (Fórmula III), SPAD (Fórmula IV), Número de perfilhos (Fórmula V), comprimento da raiz (Fórmula VI), crescimento vegetal (Fórmula VII), número de folhas (Fórmula VIII), área da roseta (Fórmula IX), diâmetro da roseta (Fórmula X), cobertura de lote (Fórmula XI), área de lâmina foliar (Fórmula XII) e área da folha (Fórmula XIII). Fórmula III: Taxa de crescimento relativo da Altura da planta = Coeficiente de regressão da Altura da planta ao longo do curso de tempo (medido em cm/dia). Fórmula IV: Taxa de crescimento relativo de SPAD = Coeficiente de regressão de medições SPAD ao longo do curso de tempo. Fórmula V: Taxa de crescimento relativo do Números de perfilhos = Coeficiente de regressão do Número de perfilhos ao longo do curso de tempo (medido em unidades de “número de perfilhos/dia”). Fórmula VI: Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz = Coeficiente de regressão do comprimento da raiz ao longo do curso de tempo (medido em cm por dia).

[00316] Análise da taxa de crescimento vegetal - foi calculada de acordo com a Fórmula VII, abaixo. Fórmula VII: Taxa de crescimento relativo do crescimento vegetal = Coeficiente de regressão do peso vegetal ao longo do curso de tempo (medido em gramas por dia). Fórmula VIII: Taxa de crescimento relativo do número de folhas = Coeficiente de regressão do número de folhas ao longo do curso de tempo (medido em número por dia). Fórmula IX: Taxa de crescimento relativo das áreas de roseta = Coeficiente de regressão da área de roseta ao longo do curso de tempo (medido em cm2 por dia). Fórmula X: Taxa de crescimento relativo do diâmetro da roseta = Coeficiente de regressão do diâmetro da roseta ao longo do curso de tempo (medido em cm por dia). Fórmula XI: Taxa de crescimento relativo da cobertura de lote = Coeficiente de regressão de lote ao longo do curso de tempo (medido em cm2 por dia). Fórmula XII: Taxa de crescimento relativo da área de lâmina foliar = Coeficiente de regressão da área da folha ao longo do curso de tempo (medido em cm2 por dia). Fórmula XIII: Taxa de crescimento relativo da área da folha = Coeficiente de regressão da área da folha ao longo do curso de tempo (medido em cm2 por dia). Fórmula XIV: Peso de 1000 Sementes = número de sementes na amostra/peso da amostra X 1000.

[00317] O Índice de Colheita pode ser calculado utilizando as Fórmulas XV, XVI, XVII, XVIII e XXXVII abaixo. Fórmula XV: Índice de Colheita (semente) = Produção média de sementes por planta/peso seco médio. Fórmula XVI: Índice de Colheita (Sorgo) = Peso seco médio do grão por Cabeça/(peso seco médio vegetal por Cabeça + peso seco médio por cabeça) Fórmula XVII: Índice de Colheita (Milho) = Peso médio do grão por planta/(peso seco médio vegetal por planta mais peso médio do grão por planta)

[00318] Índice de Colheita (para cevada) - O índice de colheita é calculado usando a Fórmula XVIII. Fórmula XVIII: Índice de Colheita (para cevada e trigo) = Peso seco médio da espiga por planta / (peso seco médio vegetal por planta + peso médio da espiga por planta)

[00319] A seguir encontra-se uma lista não limitada de parâmetros adicionais que podem ser detectados, a fim de mostrar o efeito da transgenia sobre os tratos das plantas desejados. Fórmula XIX: Circularidade do grão = 4 x 3,14 (área de grão / perímetro 2) Fórmula XX: volume entrenó = 3,14 x (d/2) 2 x l. Fórmula XXI: Peso de espigas normalizado por planta + peso seco vegetal. Fórmula XXII: Razão Raiz/Broto = peso total da raiz na colheita / peso total da parte vegetal acima do solo no momento da colheita. (=RBiH/BiH) Fórmula XXIII: Razão entre o número de vagens por nó na haste principal em conjunto vagens = Número total de vagens na haste principal / número total de nós na haste principal. Fórmula XXIV: Razão do número total de sementes na haste principal para o número de sementes em ramos laterais = Número total de sementes na haste principal no conjunto de vagens / Número total de sementes em ramos laterais em conjunto de vagens. Fórmula XXV: Área Relativa do Pecíolo = (Área do pecíolo) / Área de roseta (medida em %). Fórmula XXVI: porcentagem (%) de perfilhos reprodutivos = Número de perfilhos reprodutivos / número de perfilhos) X 100. Fórmula XXVII: Índice de Espigas = Peso médio da espiga por planta / (peso seco médio vegetal por planta mais Peso médio da Espiga por planta) Fórmula XXVIII: Taxa de crescimento relativo da cobertura da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz ao longo do curso de tempo. Fórmula XXIX: Produção de Óleo da Semente = Produção de sementes por planta (g.) * % de Óleo na semente. Fórmula XXX: Razão broto/raiz = peso total da parte vegetal acima do solo no momento da colheita / peso total da raiz na colheita. (=RBiH/BiH) Fórmula XXXI: Índice de Espiguetas = Peso médio da espigueta por planta / (peso seco médio vegetal por planta mais peso médio da espigueta por planta) Fórmula XXXII: % Cobertura da Copa = (1-(PAR_ABAIXO/PAR_ACIMA))x100. Fórmula XXXIII: fração de massa foliar = Área da folha / do broto. Fórmula XXXIV: Taxa de crescimento relativo com base no peso seco = Coeficiente de regressão do peso seco ao longo do curso de tempo. Fórmula XXXV: Matéria seca total (para Milho) = Peso de espigas normalizado por planta + peso seco vegetal. Fórmula XXXVI: NUE 4grcfiãnrico = Frcducác &:■' pa'ia (Ka.l - Pirducàa por planta :Kc.j =g= =** *' Ferí Eante1 Fórmula XXXVII: Índice de Colheita (Brachypodium) = Peso médio dos grãos/peso seco vegetal (vegetal + espigueta) por planta. Fórmula XXXVIII: Índice de Colheita por Sorgo* (* quando as plantas não estão secas) = FW (fresh weight|peso fresco) das Cabeças/(FW das Cabeças + FW das Plantas)

[00320] Taxa de preenchimento do grão [mg/dia] - Taxa de cúmulo de matéria seca no grão. A taxa de preenchimento do grão é calculada utilizando a Fórmula XXXIX. Fórmula XXXIX: Taxa de preenchimento do grão [mg/dia] = [Peso do grão*espiga-1 x 1000] / [Número de grão*espiga-1] x Duração do preenchimento do grão].

[00321] Concentração de proteína no grão - O teor de proteína no grão (g de proteína no grão m-2) é estimado como o produto da massa do grão N (g de N do m-2) multiplicado pela taxa de conversão de N/proteína de k-5,13 (Mosse 1990, supra). A concentração de proteína no grão é estimada como a relação do teor de proteína no grão por massa unitária do grão (g de proteína no grão kg-1 do grão).

[00322] Comprimento da fibra - O comprimento das fibras pode ser medido utilizando um fibrógrafo. O sistema de fibrógrafo foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento “Médio da Metade Superior”. A média da metade superior (UHM | upper half mean) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição das fibras. O fibrógrafo mede o comprimento em comprimentos de envergadura em um determinado ponto percentual (cottoninc (ponto) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).

[00323] De acordo com algumas aplicações da invenção, o aumento da produção de milho pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes itens: aumento do número de plantas por área de cultivo, aumento do número de espigas por planta, aumento do número de fileiras por espiga, número de grãos por fileira da espiga, o peso do grão, o peso de mil grãos (peso por 1000), comprimento/diâmetro da espiga, aumento do teor de óleo por grão e aumento do teor de amido por grão.

[00324] Conforme mencionado, o aumento da produção da planta pode ser determinado por vários parâmetros. Por exemplo, o aumento da produção de arroz pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento do peso por mil grãos (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de amido por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00325] De modo semelhante, o aumento da produção da soja pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de proteínas pro semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00326] O aumento da produção da canola pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00327] O aumento da produção do algodão pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de cápsulas por planta, número de sementes por cápsula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de mil sementes (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, melhora do comprimento das fibras, resistência das fibras, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00328] Teor de óleo - O teor de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da porção vegetal da planta. Brevemente, os lipídeos (óleo) podem ser removidos da planta (p.ex., semente) moendo o tecido da planta na presença de solventes específicos (p.ex., hexano ou éter de petróleo) e extraindo o óleo em um extrator contínuo. A análise indireta do teor de óleo pode ser realizada utilizando vários métodos conhecidos como a Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR | nuclear magnetic resonance), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, p.ex., Conway TF. e Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists’ Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Impresso) 1558-9331 (Online)]; a Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NI | near infrared), que utiliza a absorção de energia infravermelha próxima (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito no W0/2001/023884, que é com base na extração de óleo com solvente, evaporando o solvente em uma corrente gasosa que forma partículas de óleo e direcionando uma luz para a corrente de gás e nas partículas de óleo, que forma uma luz refletida detectável.

[00329] Dessa forma, a presente invenção é de alto valor agrícola para promover a produção de culturas comercialmente desejadas (p.ex., biomassa de um órgão vegetal como a madeira do choupo, ou de um órgão reprodutor como o número de sementes ou a biomassa da semente).

[00330] Quaisquer das plantas transgênicas descritas acima ou partes delas podem ser processadas para produzir um alimento, uma ração, proteína ou preparação de óleo, como para animais ruminantes.

[00331] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um aumento do teor de óleo, podem ser utilizadas para produzir óleo vegetal (extraindo o óleo da planta).

[00332] O óleo vegetal (incluindo o óleo da semente e/ou o óleo da porção vegetal) produzido de acordo com o método da invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com a utilização pretendido. Produtos exemplares incluem ração animal, matéria- prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício misturado, óleo edível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos e matéria- prima para processo de fermentação. Produtos exemplares a serem incorporados no óleo vegetal incluem rações animais, produtos alimentícios humanos como salgadinhos extrudados, pães, como um agente de ligação aos alimentos, rações para aquacultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas desportivas, barras alimentícias nutricionais, suplementos multivitamínicos, bebidas dietéticas e cereais.

[00333] De acordo com algumas aplicações da invenção, o óleo compreende um óleo de semente.

[00334] De acordo com algumas aplicações da invenção, o óleo compreende um óleo da porção vegetal (o óleo da porção vegetal da planta).

[00335] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula de planta forma uma parte da planta.

[00336] De acordo com outra aplicação da presente invenção, é fornecido um alimento ou ração, compreendendo as plantas ou uma parte respectiva da presente invenção.

[00337] Conforme utilizado aqui, o termo “cerca de” refere-se a ± 10%.

[00338] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “apresentando” e suas conjugações significam “incluindo, mas não se limitando a”.

[00339] O termo “consistindo de” significa “incluindo e limitado(a) a”.

[00340] O termo “consistindo essencialmente de” ignifica que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas somente se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicado.

[00341] Conforme utilizada aqui, a forma singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências no plural, exceto se o contexto claramente especificar o contrário. P.ex., o termo “um composto” ou “pelo menos um composto” pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas deles.

[00342] Ao longo do presente pedido, várias aplicações dessa invenção podem ser apresentadas em formato variado. Deve-se compreender que a descrição em formato variado é meramente para conveniência e brevidade e não deverá ser considerada como uma limitação inflexível do escopo da invenção. Portanto, a descrição de uma variedade deve ser considerada como tendo especificamente revelado todas as subvariações possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro daquela variação. Por exemplo, a descrição de uma variação como a de 1 a 6 deve ser considerada como tendo especificamente revelado subvariações como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro daquela variação, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independente da amplitude da variação.

[00343] Sempre que uma variação numérica for indicada no presente documento, isso significa incluir qualquer numeral citado (fracional ou integral) dentro da variação indicada. As frases “variando/varia entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “variando/varia de” um primeiro número indicado “a” a um segundo número indicado são utilizadas aqui intercambiavelmente e significam incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionais e integrais entre eles.

[00344] Conforme utilizado aqui, o termo “método” refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa incluindo, mas não se limitando àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos sejam conhecidas, ou prontamente desenvolvidas a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.

[00345] Quando for feita referência à listagens de sequências específicas, tal referência deverá ser entendida como abrangendo também sequências que correspondem substancialmente à sua sequência complementar, como se incluindo variações de sequências menores, resultantes de, p.ex., erros de sequenciação, erros de clonagens ou outras alterações que resultem na substituição base, na eliminação base ou na adição base, desde que a frequência de tais variações seja menor que 1 em 50 nucleotídeos, de forma alternativa, menor que 1 em 100 nucleotídeos, de forma alternativa, menor que 1 em 200 nucleotídeos, de forma alternativa, menor que 1 em 500 nucleotídeos, de forma alternativa, menor que 1 em 1.000 nucleotídeos, de forma alternativa, menor que 1 em 5.000 nucleotídeos, de forma alternativa, menor que 1 em 10.000 nucleotídeos.

[00346] Deve-se observar que determinadas características da invenção, que são, para fins de esclarecimento, descritas no contexto de aplicações separadas, também podem ser apresentadas em combinação em uma única aplicação. Inversamente, várias características da invenção, que são, para propósitos de brevidade, descritas no contexto de uma única aplicação, também podem ser apresentadas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou da forma apropriada em qualquer outra aplicação descrita da invenção. Determinadas características descritas no contexto de várias aplicações não devem ser consideradas características essenciais dessas aplicações, a menos que a aplicação seja inoperante sem esses elementos.

[00347] Várias aplicações e aspectos da presente invenção são delineados acima e, conforme reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[00348] Referência agora é feita aos exemplos a seguir que, juntamente com as descrições acima, ilustram algumas aplicações da invenção de forma não limitante.

[00349] Geralmente, a nomenclatura utilizada no presente documento e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA ecombinante. Essas técnicas são explicadas minuciosamente na literatura. Vide, p.ex., “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley e Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias, conforme definidas nas Patentes Norte- Americanas N° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I- III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic e Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman e Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura científica e de patentes, vide, p.ex., as Patentes Norte- Americanas N° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription e Translation” Hames, B. D., e Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells e Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) e “Methods in Enzymology” Vol. 1317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods e Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Proteína Purification e Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todos os quais são incorporados por referência como se totalmente estabelecidos no presente documento. Outras referências gerais são apresentadas ao longo do presente documento. Acredita-se que os procedimentos descritos nessas obras sejam bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas nelas são incorporadas aqui por referência. MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA EM GERAL.

[00350] Extração de RNA - Tecidos cultivados em diversas condições de cultivo (conforme descrito abaixo) foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando Reagente TRIzol da Invitrogen [http://www (ponto) invitrogen (ponto) com/content (ponto)cfm?pageid=469]. Aproximadamente 30-50 mg de tecido foram coletados das amostradas. Os tecidos pesados foram triturados utilizando pilão e almofariz em nitrogênio líquido e ressuspensos em 500 μl de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100 μl de clorofórmio foram adicionados seguidos por precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol a 75%. O RNA foi eluído em 30 μl de água livre de RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza como minikit RNeasy da Qiagen de acordo com o protocolo do fabricante (QIAGEN Inc., CA EUA). Para conveniência, cada tipo de tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu uma Identificação do conjunto da expressão.

[00351] Análise de correlação - foi realizada para genes selecionados, de acordo com algumas aplicações da invenção, nos quais os parâmetros caracterizados (parâmetros medidos de acordo com as Identidades de correlação) foram utilizados como “eixo X” para a correlação com o transcriptoma do tecido que foi utilizado como “eixo Y”. Para cada gene e parâmetro medido, foi calculado um coeficiente de correlação “R”, utilizando a correlação de Ervilharson junto de um valor-p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (R) entre os níveis de uma expressão de gene em um determinado tecido e um desempenho fenotípico através de ecotipos/variedade/híbrido é alto em valor absoluto (entre 0,5-1), há uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão desse gene) e a característica fenotípica (p.ex., aumento na produção, taxa de crescimento, eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico e semelhantes).

EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAM A EFICIÊNCIA NO USO DE NITROGÊNIO (NUE), EFICIÊNCIA NO USO DE FERTILIZANTE (FUE), PRODUÇÃO, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, BIOMASSA, TEOR DE ÓELO, TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO (ABST) E/OU EFICIÊNCIA NO USO DA ÁGUA (WUE) EM PLANTAS.

[00352] Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos cuja regulação ascendente de expressão respectiva em plantas aumenta a eficiência no uso do nitrogênio (NUE), eficiência no uso de fertilizantes (FUE), produção (p.ex., produção de sementes, produção de óleo, biomassa, qualidade e/ou quantidade de grãos), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico (ABST) e/ou eficiência no uso da água (WUE) de uma planta.

[00353] Todos os conjuntos de dados da sequência de nucleotídeos utilizados aqui foram originados a partir das bases de dados disponíveis publicamente ou de sequências obtidas utilizando a tecnologia Solexa (p.ex., Cevada e Sorgo). Os dados da sequência de 100 espécies diferentes de planta foram introduzidos em uma base de dados abrangente, única. Outras informações na expressão de gene, anotação de proteína, enzimas e caminhos também foram incorporadas. As principais bases de dados utilizadas incluem: Genomas:

[00354] Genoma de Arabidopsis [Genoma TAIR, versão 6 (Arabidopsis (ponto) org/)]; Genoma de arroz [estrutura IRGSP 4.0 (rgp (ponto) dna (ponto) affrc (ponto) go (ponto) jp/IRGSP/)]; Choupo [Populus trichocarpa, liberação 1.1 de JGI (liberação conjunta vl.0) (genome (ponto) jgi-psf (ponto) org/)]; Brachypodium [conjunto 4x JGI, brachpodium (ponto) org)]; Soja [DOE-JGI SCP, versões Glyma0 ou Glyma1 (phytozome (ponto) net/)]; Uva [Consórcio Público Franco-Italiano para Caracterização do Genoma de Videiras (genoscope (ponto) ens (ponto) fir /)]; Mamona [TIGR/J, Instituto Craig Venter, conjunto 4x [(msc (ponto) jevi (ponto) org/r_communis]; Sorgo [DOE-JGI SCP, versão Sbil [phytozome (ponto) net/)]; Milho [milhosequence (ponto) org/]; Pepino [cucumber (ponto) genomics (ponto) org (ponto) cn/page/cucumber/index (ponto) jsp] Tomate [solgenomics (ponto) net/tomato/] Mandioca [phytozome (ponto) net/cassava (ponto) php] Sequências expressas de EST e mRNA foram extraídas das seguintes bases de dados: GenBank (ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/ Genbank/); RefSeq (ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/RefSeq/); TAIR (Arabidopsis (ponto) org/); Bases de dados de proteínas e caminhos: Uniprot [uniprot (ponto) org/].

[00355] AraCyc [Arabidopsis (ponto) org/biocyc/index (ponto) jsp].

[00356] ENZYME [expasy (ponto) org/enzyme/]. Os conjuntos de dados de microarranjos foram baixados de:

[00357] GEO (ncbi.nlm.nih.gov/geo/) TAIR (Arabidopsis.org/).

[00358] Dados de microarranjos de propriedade exclusiva (Vide WO2008/122980 e Exemplos 3-13 abaixo).

Informações de QTL e SNPs:

[00359] Gramene [gramene (ponto) org/qtl/].

[00360] Panzea [panzea (ponto) org/index (ponto) html].

[00361] Soja QTL: [soybeanbreederstoolbox(ponto) com/].

[00362] Conjunto da Base de Dados - foi elaborado para constituir uma base de dados ampla, rica, detalhada, confiável e fácil, compreendendo sequências genômicas de mRNA, ESTs, DNA, publicamente disponíveis, dados de várias culturas, bemcomo dados de expressão genética, anotação e caminho de proteínas, dados de QTLs e outras informações relevantes.

[00363] O conjunto de bases de dados compreende uma caixa de ferramentas de aprimoramento, estruturação, anotação genético e ferramentas de análise que permitem construir uma base de dados sob medida para cada projeto de descoberta genética. As ferramentas de aprimoramento e estruturação genético(a) permitem detectar confiavelmente variantes reunidas e transcritos antissentido, gerando a compreensão de vários resultados fenotípicos potenciais de um único gene. As capacidades da plataforma “LEADS” da Compugen LTD de analisar o genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade científica [vide, p.ex., “Widespread Antisense Transcription”, Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 37985; “Splicing of Alu Sequences”, Lev- Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; “Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information”, Xie H et al. Genomics 2002] e comprovaram ser mais eficientes na genômica vegetal, também.

[00364] Conjunto genético e agrupamento EST - Para o agrupamento genético e o agrupamento de organismos com dados disponíveis da sequência genômica (Arabidopsis, arroz, mamona, uva, brachypodium, choupo, soja, sorgo), foi utilizada a versão genômica (GANG) do LEADS. Essa ferramenta permite o agrupamento mais preciso de sequências de ESTs e mRNA no genoma e prevê a estrutura genética, bem como, eventos alternativos de agrupamento e transcrição antissentido.

[00365] Para organismos sem dados completos de sequência genômica disponíveis, o software de agrupamento “expressed LEADS” foi aplicado.

[00366] Anotação genética - Genes e proteínas previstos foram anotados conforme segue: A busca de comparação de sequências [blast (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] contra todos os UniProt da planta [uniprot (ponto) org/] foi realizada. Estruturas de leitura abertas de cada transcrito putativo foram analisadas e o ORF mais longo com o número maior de homólogos foi selecionado como a proteína prevista do transcrito. As proteínas previstas foram analisadas pelo InterPro [ebi (ponto) ac (ponto) uk/interpro/].

[00367] A comparação contra proteínas das bases de dados AraCyc e ENZYME foi utilizada para mapear os transcritos previstos com os caminhos da AraCyc.

[00368] As proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas utilizando o algoritmo de comparação [ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] para validar a exatidão da sequência de proteínas prevista e para a detecção eficiente de ortólogos.

[00369] Perfil da expressão genética - Diversas fontes de dados foram exploradas quanto ao perfil da expressão genética, a saber, dados de microarranjo e perfil de expressão digital (veja abaixo). De acordo com o perfil da expressão genética, uma análise de correlação foi realizada para identificar genes que são corregulados sob diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e associados com diferentes fenótipos.

[00370] Conjuntos de dados de microarranjos disponíveis publicamente foram baixados dos sites TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados na base de dados. O perfil de expressão é um dos mais importantes dados de recursos para identificar genes importantes para a produção.

[00371] Um resumo digital do perfil de expressão foi compilado para cada agrupamento de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros da sequência compreendendo o agrupamento. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe o perfil virtual da expressão com base nas sequências EST que formam o agrupamento genético. A ferramenta apresenta o perfil da expressão de um agrupamento em termos de anatomia da planta (p.ex., o tecido/órgão no qual o gene é expresso), o estágio de desenvolvimento (os estágios de desenvolvimento nos quais um gene pode ser encontrado) e o perfil de tratamento (apresenta as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso, como seca, frio, infecção por patógeno, etc.). Dada a distribuição aleatória de ESTs nos diferentes agrupamentos, a expressão digital apresenta um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um agrupamento apresentar um total de N ESTs para conter X ESTs de uma determinada coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, leva-se em consideração o seguinte: a) o número de ESTs no agrupamento, b) o número de ESTs das bibliotecas envolvidas e relacionadas, c) o número geral de ESTs disponíveis representando a espécie. Desse modo, agrupamentos com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse indicando uma expressão especializada.

[00372] Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosaquencing) em: XVII Conferência de Genomas Vegetais e Animais, San Diego, CA. A análise transcriptômica com base na abundância relativa de ESTs nos dados foi realizada pelo pirosequenciamento 454 de cDNA representando o mRNA do melão. Quatorze amostras de cDNA de fita dupla obtidas de dois genótipos, dois tecidos de frutas (polpa e casca) e quatro estágios de desenvolvimento foram sequenciados. O pirosaquenciamento por GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não normalizadas e purificadas renderam 1.150.657 etiquetas de sequências expressas (ESTs) que se agruparam em 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 cóntigos). A análise dos dados obtidos contra a Base de Dados Genômica de Cucurbitáceas [icugi (ponto) org/] confirmou a exatidão do sequenciamento e do agrupamento. Padrões de expressão de genes selecionados encaixaram bem seus dados de qRT-PCR (reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa).

[00373] No geral, 215 genes foram identificados como tendo um grande impacto na eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção (p.ex., produção de sementes, produção de óleo, qualidade e/ou quantidade de grãos), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água quando sua expressão respectiva é aumentada em plantas. Os genes idênticos, seus polinucleotídeos curados e sequências de polipeptídeos, bem como suas sequências atualizadas, de acordo com a base de dados GenBank, são resumidos na Tabela 1, abaixo.

Tabela 1: São fornecidos os nomes dos genes, nomes dos agrupamentos, organismos a partir dos quais eles são derivados e os identificadores de sequências das sequências de polipeptídeos e polinuclotídeos. “Polip.” = polipeptídeo; “Polin.” = polinucleotídeo.

EXEMPLO 2 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS (P.EX., ORTÓLOGAS) QUE AUMENTAM A EFICIÊNCIA NO USO DO NITROGÊNIO, EFICIÊNCIA NO USO DE FERTILIZANTES, PRODUÇÃO, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, BIOMASSA, TEOR DE ÓLEO, TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO E/OU EFICIÊNCIA NO USO DA ÁGUA EM PLANTAS.

[00374] Os conceitos de ortologia e paralogia foram recentemente aplicados às caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações do genoma completo. Os ortólogos e parálogos constituem dois principais tipos de homólogos: O primeiro evoluiu de um ancestral comum por especialização e os últimos são relacionados por eventos de duplicação. Supõe-se que parálogos decorrentes de eventos de duplicação antiga tendem a ter divergido na função enquanto verdadeiros ortólogos são mais propensos a reter a função idêntica ao longo do tempo evolutivo.

[00375] Para investigação e identificação adicionais de ortólogos putativos dos genes que afetam a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção (p.ex., produção de sementes, produção de óleo, biomassa, qualidade e/ou quantidade de grãos), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água, todas as sequências foram alinhadas utilizando a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básica [BLAST Basic Local Alignment Search Tool]. Sequências suficientemente semelhantes foram agrupadas por tentativa. Estes ortólogos putativos foram ainda organizados sob um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) assumido como uma representação das relações evolutivas entre os táxons biológicos. Grupos ortólogos putativos foram analisados quanto a sua concordância com o filograma e, em casos de divergências, esses grupos ortólogos foram divididos adequadamente. Dados de expressão foram analisados e as bibliotecas EST foram classificadas utilizando um vocabulário fixo de termos personalizadas, tais como estágios de desenvolvimento (por exemplo, genes que mostram o perfil de expressão semelhante, através do desenvolvimento com regulação ascendente na fase específica, como na fase de estocagem de grãos) e/ou órgão da planta (por exemplo, genes que mostram o perfil de expressão similar em seus órgãos com regulação ascendente em órgãos específicos, como a semente). As anotações de todos os ESTs agrupadas a um gene foram analisadas estatisticamente por comparação da sua frequência no conjunto em relação a sua abundância na base de dados, permitindo a estrutura de um perfil de expressão numérica e gráfica de tal gene, o que é denominado “digital expression”. A lógica de utilizar estes dois métodos complementares com métodos de estudos de associação fenotípica de QTLs, SNPs e expressão fenotípica baseia-se na suposição de que os verdadeiros ortólogos tendem a reter a função idêntica ao longo do tempo evolutivo. Estes métodos proporcionam diferentes conjuntos de indicações sobre as semelhanças funcionais entre dois genes homólogos, semelhanças no nível da sequência de aminoácidos - idênticos nos domínios proteicos e similaridade em perfis de expressão.

[00376] A pesquisa e identificação de genes homólogos envolve o rastreio de informação de sequência disponível, por exemplo, em bases de dados públicas que incluem, mas não se limitam à Base de Dados de DNA do Japão (DDBJ | DNA Database of Japan), Genbank e a Base de Dados de Sequência de Ácido Nucleico do Laboratório de Biologia Nuclear (EMBL | European Molecular Biology Laboratory) ou suas versões ou a base de dados MIPS. Um número de diferentes algoritmos de pesquisa tem sido desenvolvido, incluindo, mas não se limitando ao conjunto de programas referidos como programas de BLAST. Há cinco implementações de BLAST, três projetadas para consultas de sequência de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e duas projetadas para consultas de sequência de proteína (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Tais métodos envolvem o alinhamento e a comparação das sequências. O algoritmo BLAST calcula a percentagem de identidade de sequência e executa uma análise estatística de similaridade entre as duas sequências. O software para a realização de análise BLAST está disponível ao público através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia. Outros destes tipos de software ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. A GAP usa o algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimizam o número de lacunas.

[00377] Os genes homólogos podem pertencer à mesma família genética. A análise de uma família genética pode ser realizada utilizando a análise de similaridade de sequência. Para realizar esta análise pode- se utilizar programas padrões para alinhamentos múltiplos, por exemplo, o Clustal W. Uma árvore de Agrupamento de Vizinhos [Neighbor Joining] das proteínas homólogas dos genes de algumas aplicações da invenção pode ser utilizada para fornecer uma visão geral das relações estruturais e ancestrais. A identidade da sequência pode ser calculada usando um programa de alinhamento conforme descrito abaixo. Espera-se que outras plantas tenham um gene funcional semelhante (ortólogo) ou de uma família de genes semelhantes e tais genes fornecerão o mesmo fenótipo preferido como os genes aqui apresentados. Vantajosamente, estes membros da família podem ser úteis nos métodos de algumas aplicações da invenção. Exemplos de outras plantas incluem, mas não se limitando a cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Milho (Zea mays), Algodão (Gossypium), Canola (Brassica napus), Arroz (Oryza sativa), Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), Sorgo (Sorgo bicolor), Soja (Glycine max), Girassol (Helianthus annuus), Tomate (Lycopersicon esculentum) e Trigo (Triticum aestivum).

[00378] As análises acima mencionadas para uma homologia de sequência são preferivelmente realizadas em uma sequência de comprimento total, mas podem também basear-se em uma comparação de certas regiões, tais como os domínios conservados. A identificação de tais domínios também seria boa dentro do âmbito de conhecimento de um especialista na técnica e envolveria, por exemplo, um formato legível para computador dos ácidos nucleicos de algumas aplicações da invenção, o uso de programas de software de alinhamento e o uso de informações publicamente disponíveis sobre os domínios de proteínas, motivos conservados e caixas Esta informação está disponível na base de dados PRODOM (biochem (ponto) ucl (ponto) ac (ponto) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (ponto) html), PIR (pir (ponto) Georgetown (ponto) edu/) ou Pfam (sanger (ponto) ac (ponto) uk/Software/Pfam/). Programas de análise de sequências desenvolvidos para pesquisa de motivo podem ser utilizados para a identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados conforme mencionados acima. Programas de computador preferidos incluem, mas não estão limitados a, MEME,

SIGNALSCAN e GENESCAN.

[00379] Um especialista na técnica pode utilizar as sequências homólogas fornecidas aqui para encontrar sequências similares em outras espécies e outros organismos. Os homólogos de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídios, proteínas e enzimas que têm substituições de aminoácidos, deleções e/ou inserções em relação à proteína não modificada em questão e que têm atividade biológica e funcional semelhante à proteína não modificada a partir da qual são derivadas. Para produzir tais homólogos, os aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos que possuem propriedades semelhantes (modificações conservadoras, tais como hidrofobicidade semelhante, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar uma estrutura ou quebrar estruturas helicoidais ou estruturas de 3 folhas). Tabelas de substituição conservativa são bem conhecidas na técnica (vide, p.ex., Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Os homólogos de um aminoácido englobam ácidos nucleicos com substituição de nucleotídeo, deleções e/ou inserções em relação ao ácido nucleico não modificado em questão e que têm atividade biológica e funcional semelhante ao ácido nucleico não modificado a partir da qual são derivadas.

[00380] Os polinucleotídeos e polipeptídeos com uma homologia significativa aos genes identificados descritos na Tabela 1 (Exemplo 1, acima) foram identificados a partir das bases de dados, utilizando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn como filtros para a primeira fase e a agulha (pacote EMBOSS) ou alinhamento FRAME+ algoritmo para a segunda fase. A identidade local (alinhamentos Blast) foi definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências porque utiliza tão somente um filtro para a fase de alinhamento global. A filtragem padrão do pacote Blast não foi usada (estabelecendo o parâmetro “-F F”).

[00381] No segundo estágio, os homólogos foram definidos com base na identidade global de, pelo menos, 80% para a sequência polipeptídica genética principal.

[00382] Duas formas distintas para encontrar o alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou de nucleotídeos foram utilizadas neste pedido.

[00383] 1. Entre duas proteínas (após o filtro blastp): Algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. O restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.

[00384] 2. Entre uma sequência de proteína e uma sequência nucleotídica (após o filtro rblastn):

Aplicativo GenCore 6.0 OneModel, utilizando o algoritmo Frame+ com os seguintes parâmetros: model=frame+_p2n.model mode=qglobal - q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. O restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.

[00385] As sequências de polipeptídeos da consulta foram as ID SEQ. N° 496-794 e os polinucleotídeos da consulta foram as ID SEQ. N° 1-495 e as sequências ortólogas e homólogas identificadas tendo, pelo menos, 80% da identidade da sequência global são fornecidas na Tabela 2, abaixo. Espera-se que estes genes homólogos aumentem a produção, produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo, taxa de crescimento, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, capacidade fotossintética, biomassa, vigor, ABST e/ou NUE de uma planta. Tabela 2 Homólogos (p.ex., ortólogos) dos genes/polipeptídeos identificados para aumento da eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, produção de sementes, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.

Tabela 2: São fornecidos polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos (p.ex., ortólogos) dos genes identificados na Tabela 1 e seus genes clonados, os quais podem aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, produção de sementes, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta. A homologia foi calculada como % de identidade sobre as sequências de alinhamento. As sequências de consultas foram as sequências de polipeptídeos das ID SEQ. N° 496-794 e as sequências de polinucleotídeos das ID SEQ. N° 1-495 e as sequências em questão são sequências de polipeptídeos ou sequências de polinucleotídeos que foram dinamicamente transpostas em todos os seis quadros de leitura identificados no banco de dados com base em identidade maior que 80% com relação às sequências de polipeptídeos da consulta. “Polip.” = polipeptídeo; “Polin” - polinucleotídeo; “Algor.” = Algoritmo; “globlastp” - homologia global utilizando blastp; “glotblastn” - homologia global utilizando tblastn. “Hom.” - homólogo, “Id.” = identidade.

[00386] O resultado da abordagem genômica funcional descrita aqui é um conjunto de genes com estimativas elevadas de melhoria da eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, produção de sementes, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta, aumentando sua expressão.

[00387] Embora estime-se que cada gene tenha seu próprio impacto, espera-se que a modificação do modo de expressão de mais de um gene ou produto de gene (RNA, polipeptídeo) forneça um efeito aditivo ou sinérgico sobre uma característica desejada (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta). Ao alterar a expressão de cada gene descrito aqui, o gene sozinho ou o conjunto de genes aumenta a produção global e/ou outros traços agrícolas importantes e, deste modo, espera-se aumentar a produtividade agrícola.

EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE CEVADA 44K

[00388] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de cevada, produzido pela Agilent Technologies [chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 47.500 genes e transcrições de cevada. Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, várias características de plantas de 25 diferentes acessos de cevada foram analisadas. Dentre elas, 13 acessos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos Experimentais:

[00389] Tecidos de cevada analisados - Cinco tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento [meristema, flor, espigueta, caule e folha] que representam diferentes características da planta foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 3 abaixo. Tabela 3 Conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada

[00390] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Cevada - 25 acessos de cevada em 4 blocos repetitivos (chamados A, B, C e D), cada um contendo 4 plantas por lote foram cultivados em estufa com rede. As plantas foram fenotipadas em uma base diária, seguindo o descritor padrão de cevada (Tabela 4, abaixo). A colheita foi conduzida enquanto 50% das espigas foram secados para evitar liberação espontânea das sementes. As plantas foram separadas para a parte vegetativa e espigas, delas, 5 espigas foram debulhadas (grãos foram separados das glumas) para análise adicional de grão tal como medição do tamanho, contagem do grão por espigão e produção de grão por espigão. Todo o material foi secado no forno e as sementes foram debulhadas manualmente a partir das espigas antes da medição das características de semente (peso e tamanho) utilizando varredura e análise da imagem. O sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal (processador Intel P43.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido no Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (Instituto SAS). Tabela 4 Descritores padrões da cevada

[00391] Grãos por espiga - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. O número total de grãos das 5 espigas que foram manualmente debulhadas foi contado. O grão médio por espiga foi calculado dividindo o número total do grão pelo número de espigas.

[00392] Tamanho médio do grão (cm) - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. Os grãos totais de 5 espigas que foram manualmente debulhadas foram digitalizados e as imagens foram analisadas utilizando o sistema de formação de imagem digital. A digitalização do grão foi feita utilizando o digitalizador Brother (modelo DCP-135), na resolução de 200 dpi e analisada com o software Imagem J. O tamanho médio do grão foi calculado dividindo o tamanho total do grão pelo número total do grão.

[00393] Peso médio do grão (mg) - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. Os grãos totais das 5 espigas que foram manualmente debulhadas foram contados e pesados. O peso médio foi calculado dividindo o peso total pelo número total do grão.

[00394] Produção de grão por espiga (g) - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. Os grãos totais de 5 espigas que foram manualmente debulhadas foram pesados. A produção de grão foi calculada dividindo o peso total pelo número da espiga.

[00395] Análise do comprimento da espiga - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. As cinco espigas escolhidas por planta foram medidas utilizando fita métrica excluindo as arestas.

[00396] Análise do número de espigas - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. As espigas por planta foram contadas.

[00397] Pontuação do hábito de cultivo - No estágio de cultivo 10 (inicialização), cada uma das plantas foi pontuada para sua natureza de hábito de cultivo. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostrada até para ereta.

[00398] Pilosidade de folhas basais - No estágio de cultivo 5 (revestimento da folha fortemente ereta; fim de perfilhamento), cada uma das plantas foi pontuada para sua natureza de pilosidade da folha antes da última. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostrada até 9 para ereta.

[00399] Altura da planta - No estágio da colheita (50% das espigas foram secados), cada uma das plantas foi medida por sua altura utilizando fita métrica. A altura foi medida do nível do solo para o topo da espiga mais longa excluindo as arestas.

[00400] Dias para floração - Cada uma das plantas foi monitorada para data de floração. Dias de floração foram calculados a partir da data da semeadura até a data da floração.

[00401] Pigmentação do caule - No estágio de cultivo 10 (inicialização), cada uma das plantas foi pontuada por sua cor do caule. A escala que foi utilizada foi 1 para verde até 5 para roxo total.

[00402] Peso seco vegetal e produção de espiga - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas e material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletados. O peso da biomassa e espigas de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de plantas.

[00403] Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (excluindo raízes) após secar a 70 ^C no forno por 48 horas.

[00404] Produção de espiga por planta = peso total da espiga por planta (g) após secar a 30^C no forno por 48 horas.

[00405] Índice de colheita (para cevada) - o índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XVIII acima. Tabela 5

Resultados Experimentais:

[00406] 13 diferentes acessos de cevada foram cultivados e caracterizados com relação a 13 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 6 e 7 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de expressão de transcriptoma (Tabela 3) e os parâmetros médios foi conduzida. Em seguida, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 6 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de cevada

Tabela 6. São fornecidos os valores para cada um dos parâmetros medidos em acessos de Cevada, de acordo com as identificações de correlação (IDs de Correlação da Tabela 5 acima).

Tabela 7. São fornecidos os valores para cada um dos parâmetros medidos em acessos de Cevada, de acordo com as identificações de correlação (IDs de Correlação da Tabela 5 acima). Tabela 8 Correlação entre o nível de expressão de polinucleotídeos selecionados da invenção e seus homólogos em estágios de desenvolvimento ou tecidos específicos e o desempenho fenotípico em acessos de Cevada

Tabela 8. São fornecidas as correlações (R) e os valores-p entre os níveis de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários estágios de desenvolvimento ou tecidos (Conjuntos de expressão) e o desempenho fenotípico em vários componentes de vigor, produção (produção de semente, produção de óleo, teor de óleo), biomassa e/ou taxa de crescimento [Correlação (Cor.), Vector (Vet.), Expressão (Exp.)] Vetor de Corr. = vetor de correlação especificado na Tabela 5; Conj. de Exp. = conjunto de expressão especificado na Tabela 3.

EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE CEVADA 60K

[00407] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Cevada, produzido pela Agilent Technologies [chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcrições de Cevada. Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados à produção ou vigor, várias características de planta de 15 diferentes acessos de Cevada foram analisadas. Dentre elas, acessos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisando utilizando o teste de correlação Pearson [davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos Experimentais:

[00408] Tecidos de cevada analisados - Tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento, representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido nas Tabelas 9-11 abaixo. Tabela 9 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada sob condições normais e de baixo N (no estágio vegetal)

Tabela 9. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada sob condições normais e de baixo N (baixo nitrogênio) (no estágio vegetal). Tabela 10 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada sob condições normais e de baixo N (no estágio reprodutivo)

Tabela 10. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada sob condições normais e de baixo N (no estágio reprodutivo). Tabela 11 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada sob condições de seca (no estágio vegetal)

Tabela 11. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada sob condições de seca (no estágio vegetal).

[00409] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Cevada - 15 acessos de Cevada em 5 blocos repetitivos, cada um contendo 5 plantas por lote, foram cultivadas na estufa de rede. Três tratamentos diferentes foram aplicados: as plantas foram fertilizadas e regadas regularmente durante o crescimento da planta até a colheita (conforme recomendado para o crescimento comercial, as plantas foram irrigadas de 2 a 3 vezes por semana, e a fertilização foi dada nos primeiros 1,5 meses do período de crescimento) ou com baixo Nitrogênio (80% por cento menos Nitrogênio) ou sob estresse devido à seca (ciclos de seca e re-irrigação foram conduzidos ao longo de todo o experimento, total de 40% menos de água dadas no tratamento a seco). As plantas foram fenotipadas diariamente de acordo com parâmetros listados na Tabela 12 abaixo. A colheita foi realizada enquanto todas as espigas eram secas. Todo o material foi seco em estufa e as sementes foram debulhadas manualmente a partir das espigas antes da medição das características da semente (peso e tamanho) utilizando varredura e análise de imagem. O sistema de análise de imagem inclui um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Java com base no programa de processamento de imagem, que foi desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde Dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, dados de análise foram salvos para arquivos de textos e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00410] Produção de Grão (g.) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes foram coletadas. O total de grãos a partir de todas as espigas que foram debulhadas manualmente foi pesado. A produção de grão foi calculada por lote ou por planta.

[00411] Análise do comprimento e largura da espiga - No final do experimento, o comprimento e largura das cinco espigas escolhidas por planta foram medida utilizando fita métrica, excluindo as aristas.

[00412] Análise do número de espigas - As espigas por planta foram contadas.

[00413] Altura da planta - Cada uma das plantas foi medida quando a sua altura, utilizando fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo mais distante da espiga excluindo as aristas em dois pontos de tempo no crescimento Vegetal (30 dias após semeadura) e na colheita.

[00414] Peso da espiga - O peso da biomassa e espigas de cada unidade foi separado, medido e divido pelo número de plantas.

[00415] Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 70^C na estufa por 48 horas em dois pontos de tempo no crescimento Vegetal (30 dias após semeadura) e na colheita.

[00416] Espigueta por espiga = número de espiguetas por espiga foi contado.

[00417] Proporção Raiz/Broto - A proporção Raiz/Broto é calculada utilizando a Fórmula XXII acima.

[00418] N° Total de Perfilhos - todos os perfilhos foram contados por unidade em dois pontos de tempo no crescimento Vegetal (30 dias após semeadura) e na colheita.

[00419] Porcentagem de perfilhos reprodutivos - o número de perfilhos reprodutivos excluindo uma espiga na colheita foi divido pelo número total de perfilhos.

[00420] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras de medição de SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram tiradas por lote.

[00421] FW da raiz (g.), comprimento da raiz (cm) e N° de raízes laterais - 3 plantas por unidade foram selecionadas para medição do peso da raiz, comprimento da raiz e para contagem do número de raízes laterais formadas.

[00422] FW do Broto (peso fresco) - peso de 3 plantas por vaso foi registrado em diferentes pontos de tempo.

[00423] Área Média de Grão (cm2) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotOgrafada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00424] Comprimento e Largura Média do Grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotOgrafada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento e largura dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00425] Perímetro Médio do Grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotOgrafada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do perímetro do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00426] Data de descrição - o dia no qual o estágio de inicialização foi observado foi registrado e o número de dias a partir da semeadura até a descrição foi calculado.

[00427] Teor relativo de água - o peso fresco (FWIfresh weight) de três folhas de três plantas de cada um dos diferentes IDs das sementes foi registrado de imediato; em seguida, as folhas foram embebidas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TW|turgid weight) foi registrado. O peso seco total (DW|dry weight) foi registrado após secagem das folhas a 60^C a um peso constante. O teor relativo da água (RWC|relative water content) foi calculado de acordo com a Fórmula I acima.

[00428] Índice de Colheita (para cevada) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XVIII acima.

[00429] Taxa de crescimento relativo: as taxas de crescimento relativo (RGR | relative growth rate) da Altura da Planta (Fórmula III acima), SPAD (Fórmula IV acima) e Número de perfilhos (Fórmula V acima) foram calculadas utilizando as Fórmulas indicadas.

[00430] Proporção Seca/Normal: Representa a proporção para o parâmetro específico dos resultados de condição de Seca divididos pelos resultados das condições Normais (manutenção do fenótipo sob Seca em comparação às condições normais). Tabela 12 Parâmetros correlacionados à Cevada (vetores) sob condições normais e de baixo N (no estágio vegetal)

Tabela 12. São fornecidos os parâmetros correlacionados à Cevada. “TP [time point]” = ponto no tempo; “DW” = peso seco; “FW” = peso fresco; “Baixo N” = Baixo nitrogênio. Tabela 13 Parâmetros correlacionados à Cevada (vetores) sob condições normais e de baixo N (no estágio reprodutivo)

Tabela 13. São fornecidos os parâmetros correlacionados à Cevada sob condições normais e de baixo N (no estágio reprodutivo). “TP” = ponto no tempo; “DW” = peso seco; “FW” = peso fresco; “Baixo N” = Baixo nitrogênio; “Teor relativo de água [porcentagem], Proporção Seca/Normal - manutenção do fenótipo sob seca em comparação com as condições normais. Tabela 14 Parâmetros correlacionados à Cevada (vetores) sob condições de seca (no estágio vegetal)

Tabela 14. São fornecidos os parâmetros correlacionados à cevada sob condições de seca (no estágio vegetal). “RBiH/BiH” = proporção raiz-broto.

Resultados experimentais:

[00431] 15 acessos diferentes de Cevada foram cultivados e caracterizados com relação à diferentes parâmetros, conforme descrito acima. As Tabelas 12-14 descrevem os parâmetros correlacionados à Cevada. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 15- 24 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida. A seguir, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 15 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada sob condições de baixo N (no estágio vegtal)

Tabela 15. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições de baixo N. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 16 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos adicionais de Cevada sob condições de baixo N (no estágio vegtal)

Tabela 16. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições de baixo N. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 17 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada sob condições normais (no estágio vegtal)

Tabela 17. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições normais. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 18 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessosadicionais de Cevada s ob condições normais (no estágiovegtal)

Tabela 18. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições normais. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 19 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada sob condições de baixo N (no estágio reprodutivo)

Tabela 19. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições de baixo N (no estágio reprodutivo). As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 20 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos adicionais de Cevada sob condições de baixo N (no estágio reprodutivo)

Tabela 20. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições de baixo N (no estágio reprodutivo). As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 21 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada sob condições normais (no estágio reprodutivo)

Tabela 21. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições normais (no estágio reprodutivo). As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 22 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos adicionais de Cevada sob condições normais (no estágio reprodutivo)

Tabela 22. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições normais (no estágio reprodutivo). As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 23 Parâmetros adicionais medidos de IDs de correlação em acessos de Cevada sob condições de Seca

Tabela 23. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições de cultivo de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 24 Parâmetros adicionais medidos de IDs de correlação em acessos adicionais de Cevada sob condições de Seca

Tabela 24. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Cevada (linha) sob condições de cultivo de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 25 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais e de baixo nitrogênio (no estágio vegetal) em acessos de cevada

Tabela 25. São fornecidas as correlações (R) entre a produção dos níveis de expressão que melhoram os genes e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de Expressão (Exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de vigor, produção, biomassa e/ou taxa de crescimento (Vetor de correlação (Cor.))] sob condições normais e de baixo nitrogênio em acessos de cevada. P = valor-p. Tabela 26 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais e de baixo nitrogênio (no estágio reprodutivo) em acessos de cevada.

Tabela 26. São fornecidas as correlações (R) entre a produção dos níveis de expressão que melhoram os genes e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de Expressão (Exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de vigor, produção, biomassa e/ou taxa de crescimento (Vetor de correlação (Cor.))] sob condições normais e de baixo nitrogênio em acessos de cevada. P = valor-p. Tabela 27 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições de seca em acessos de cevada.

Tabela 27. São fornecidas as correlações (R) entre a produção dos níveis de expressão que melhoram os genes e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de Expressão (Exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de vigor, produção, biomassa e/ou taxa de crescimento (Vetor de correlação (Cor.))] sob condições normais e de baixo nitrogênio em acessos de cevada. P = valor-p.

EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO, NUE E ABST MEDIDOS EM CAMPOS UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO 44K

[00432] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo de planta e o nível de expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de sorgo, produzido pela Agilent Technologies [chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de sorgo. A fim de definir as correlações entre os níveis of expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de produção, ABST e NUE, várias características de planta de 17 diferentes híbridos de sorgo foram analisadas. Dentre elas, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

[00433] Correlação de variedades de Sorgo em ecotipos cultivados sob condições de cultivo regular, condições graves de seca e condições de baixo nitrogênio.

Procedimentos Experimentais:

[00434] 17 variedades de Sorgo foram cultivadas em 3 lotes repetitivos, em campo. Resumidamente, o protocolo de cultivo foi o seguinte: 1. Condições de cultivo regular: as plantas de sorgo foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação (370 litros por m2, fertilização de 14 unidades de 21% de ureia por período de cultivo inteiro).

[00435] 2. Condições de Seca: sementes de sorgo foram semeadas no solo e cultivadas em condição normal até cerca de 35 dias a partir da semeadura, por volta do estágio V8 (oito folhas verdes são totalmente expandidas, inicialização não iniciada ainda). Nesse ponto, a irrigação foi interrompida, e estresse de seca severa foi desenvolvido.

[00436] 3. Condições de fertilização de baixo nitrogênio: as plantas de sorgo foram fertilizadas com 50% menos quantidade de nitrogênio no campo do que a quantidade de nitrogênio aplicada no tratamento de cultivo regular. Todos os fertilizantes foram aplicados antes da floração.

[00437] Tecidos de Sorgo analisados - Todos os 10 híbridos de sorgo selecionados foram amostrados para cada tratamento. Os tecidos [folha, meristema da flor e flor] das plantas cultivados em condições normais, grave estresse de seca e condições de baixo nitrogênio foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 28 abaixo. Tabela 28 Conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo em experimentos de campo

Tabela 28: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo. Folha bandeira = a folha abaixo da flor; Meristema de flor = meristema apical após iniciação da panícula; Flor = a flor no dia da antese.

[00438] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de imagem digital: Área Média do Grão (cm2) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da ‘Cabeça’ da Planta. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00439] Comprimento Médio do Grão (cm) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da ‘Cabeça’ da Planta. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00440] Área Média da Cabeça (cm2) - No final do período de cultivo, 5 ‘Cabeças’ foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da ‘cabeça’ foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de ‘Cabeças’. Comprimento Médio da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo, 5 ‘Cabeças’ foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento da ‘Cabeça’ (eixo mais longo) foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de ‘Cabeças’.

[00441] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido no Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard | padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área de semente e comprimento de semente foram salvos para arquivos de texto e analisados utilizando o software JMP de análise estatística (Instituto SAS).

[00442] Os parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 5 plantas por lote ou pela medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.

[00443] Peso Total da Semente por Cabeça (g.) - No final do experimento (‘Cabeças’ da planta), as cabeças dos lotes dentro dos blocos AC foram coletadas. 5 cabeças foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as cabeças adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de cabeças por lote (com base no lote). No caso das 5 cabeças, o peso total dos grãos de 5 cabeças foi dividido por 5.

[00444] FW da Cabeça por grama da Planta - No final do experimento (quando as cabeças foram colhidas), o total de cabeças e 5 cabeças selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As cabeças (total e 5) foram pesadas (g.) separadamente e o peso fresco médio por planta foi calculado para o total de cabeças (FW da Cabeça /g. da Planta com base no lote) e para 5 cabeças (FW da Cabeça /g. da Planta com base em 5 plantas).

[00445] Altura da Planta - As plantas foram caracterizadas com relação à altura durante o período de cultivo em 5 pontos no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação à sua altura utilizando uma fita de medição. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da folha mais longa.

[00446] Número de folhas da planta - As plantas foram caracterizadas com relação ao número de folhas durante o período de cultivo em 5 pontos no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação ao seu número de folhas contando todas as folhas de 03 plantas selecionadas por lote.

[00447] Taxa de Crescimento Relativo - foi calculada utilizando as Fórmulas III (acima) e VIII (acima).

[00448] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote.

[00449] Peso seco vegetal e Cabeças - No final do experimento (quando a inflorescências estava seca), toda a inflorescência e material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados. O peso da biomassa e cabeças de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de cabeças.

[00450] Peso seco = peso total da porção vegetal acima do solo (excluindo as raízes) após secagem a 70°C em forno por 48 horas.

[00451] Índice de Colheita (HI) (Sorgo) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmulas XVI acima.

[00452] FW das Cabeças / (FW das Cabeças + FW das Plantas) - O peso fresco total das cabeças e suas respectivas biomassas de planta foram medidos no dia da colheita. O peso das cabeças foi dividido pela soma dos pesos das cabeças e plantas.

Resultados Experimentais:

[00453] 17 diferentes híbridos de sorgo foram cultivados e caracterizados com relação a diferentes parâmetros (Tabela 29). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 30- 35) e uma análise de correlação subsequente foi conduzida (Tabela 36). Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 29 Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)

Tabela 29. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores). “g.” = gramas; “SPAD” = níveis de clorofila; “FW” = Peso fresco da Planta; “DW” = Peso seco da Planta; “normal” = condições de cultivo padrão; “DPS” = dias após a semeadura; “Baixo N” = Baixo Nitrogênio. Cabeça - FW /Planta g. (com base em 5 plantas) = o peso fresco das cabeças colhidas foi divido pelo número de cabeças que foram fenotipadas; “Baixo N” = condições de baixo nitrogênio; “Área Média do Grão de Taxa Inferior” = área do grão da fração inferior dos grãos. Tabela 30 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo sob condições normais

Tabela 30: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições normais. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 31 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo sob condições normais

Tabela 31: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições normais. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. VINICIUS Tabela 32 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo sob condições de baixo nitrogênio

Tabela 32: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 33 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo sob condições de cultivo baixo nitrogênio

Tabela 33: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 34 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo sob condições de seca

Tabela 34: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 35 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo sob condições de seca

Tabela 35: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 36 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições de estresse abiótico ou normal em acessos de sorgo

Tabela 36. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Folha bandeira, meristema da flor, caule e flor; Conjuntos de Expressão (Exp.)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de vigor, produção, biomassa e/ou taxa de crescimento [Vetor de correlação (Cor.)] sob condições normais e de estresse em acessos de sorgo. P = valor-p.

EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À BIOMASSA, NUE E ABST MEDIDOS EM CONDIÇÕES SEMI-HIDROPÔNICAS UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO 44K.

[00454] Parâmetros relacionados ao vigor do Sorgo sob condições de baixo nitrogênio, 100 mM NaCl, baixa temperatura (10 ± 2°C) e condições normais de cultivo - Dez híbridos de Sorgo foram cultivados em 3 lotes repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa de rede em condições semi-hidropônicas. Em suma, o protocolo de cultivo deu-se conforme segue: as sementes de Sorgo foram semeadas em tabuleiros cheios com uma mistura de vermiculite e turfa na proporção de 1:1. Após a germinação, os tabuleiros foram transferidos para a solução de alta salinidade (100 mM NaCl, além da solução Completa de Hogland) em baixa temperatura (10 ± 2°C, na presença da solução Completa de Hogland), solução de baixo nitrogênio (a quantia de nitrogênio total foi reduzida em 90% a partir da solução Completa de Hogland (ou seja, a uma concentração final de 10% a partir da solução Completa de Hogland, quantia final de 1,2 mM N) ou em solução de cultivo Normal [solução Completa de Hogland contendo 16 mM N, a 28 ± 2°C]. As plantas foram cultivadas a 28 ± 2°C.

[00455] A solução Completa de Hogland consiste de: KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2PO4 - 0,172 gramas/litro e 0,01% (volume/volume) dos microelementos de “Super coratina” (Ferro- EDDHA [etilenodiamina-N,N’-bis(ácido 2-hidroxifenilacético)] - 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro, e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deverá ser 6,5-6,8].

[00456] Tecidos de Sorgo analisados - Todos os 10 híbridos de Sorgo selecionados foram amostrados para cada tratamento. Três tecidos [folhas, meristemas e raízes] cultivados em 100 mM NaCl, em baixa temperatura (10 ± 2°C), baixo nitrogênio (1,2 mM N) ou sob condições Normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 37 abaixo. Tabela 37 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Sorgo sob condições semi- hidropônicas

Tabela 37: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma do Sorgo. Condições de frio = 10 ± 2°C; NaCl = 100 mM NaCl; baixo nitrogênio = 1,2 mM de Nitrogênio; condições Normais = 16 mM de Nitrogênio.

Resultados Experimentais:

[00457] 10 diferentes híbridos de Sorgo foram cultivados e caracterizados com relação aos seguintes parâmetros: “Número de folhas” = número de folhas por planta (média de cinco plantas), “Altura da Planta” = altura da planta [cm] (média de cinco plantas), “Raiz DW/Planta” - peso seco da raiz por planta (média de cinco plantas); “Broto DW/Planta” - peso seco do broto por planta (média de cinco plantas) (Tabela 38); A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos na Tabelas 39-45 abaixo. Uma análise de correlação subsequente foi conduzida (Tabela 46). Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 38 Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)

Tabela 38: São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo. Condições de frio = 10 ± 2°C; NaCl = 100 mM NaCl; baixo nitrogênio = 1,2 mM de Nitrogênio; Condições normais = 16 mM de Nitrogênio; * TP1-2-3 referem-se aos períodos de tempos 1, 2 e 3. Tabela 39 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de cultivo de baixo nitrogênio

Tabela 39: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 40 Acessos adicionais de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de cultivo de baixo nitrogênio

Tabela 40: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 41 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de salinidade (100 mM NaC

Tabela 41: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de cultivo a 100 mM NaCl. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 42 Acessos adicionais de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de salinidade (100 mM NaCl)

Tabela 42: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de cultivo a 100 mM NaCl. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 43 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de frio

Tabela 44 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de cultivo regular

Tabela 44: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de cultivo regular. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 45 Acessos adicionais de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de cultivo

Tabela 44: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de linha) sob condições de cultivo regular. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 46 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em raízes e o desempenho fenotípico sob condições de estresse abiótico ou normal em acessos de sorgo

Tabela 46. São fornecidas as correlações (R) entre a produção dos níveis de expressão que melhoram os genes e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de Expressão (Exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de vigor, produção, biomassa e/ou taxa de crescimento (Vetor de correlação (Cor.))] sob condições de estresse abiótico (salinidade) ou condições normais em acessos de sorgo. Cor. - vetor de correlação, conforme descrito acima (Tabela 38). P = valor-p. EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO E NUE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO DE 60K

[00458] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho, produzido pela Agilent Technologies [chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O arranjo do oligonucleotídeo representa cerca de 60.000 genes e transcrições de milho. Correlação dos híbridos de Milho em ecotipos cultivados sob condições de cultivo regular Procedimentos Experimentais:

[00459] 12 híbridos de Milho foram cultivados em 3 lotes repetitivos, em campo. As sementes de Milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas em campo, utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação (485 metros cúbicos de água por dunam, 30 unidades de uran, 21% de fertilização por período de cultivo completo). A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de estresse e produção, os 12 diferentes híbridos de milho foram analisados. Entre eles, 10 híbridos, englobando a variação observada, foram selecionados para análise de expressão do RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

[00460] Tecidos de Milho Analisados- Todos os 10 híbridos de milho foram amostrados com relação a 3 pontos de tempo (TP2 = V6-V8, TP5 = R1-R2, TP6=R3-R4). Quatro tipos de tecidos de planta [Espiga, folha bandeira indicada na Tabela 47 como “folha”, parte distal do grão, e entrenó] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 47 abaixo. Tabela 47 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho

Tabela 47: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho. Folha = a folha abaixo da espiga principal Meristema da flor = meristema apical após a iniciação da folha-macho; Espiga = a flor- fêmea no dia de antese. Grão Distal = milho desenvolvendo grãos a partir da área externa do sabugo, Grão Basal - milho desenvolvendo grãos a partir da área basal do sabugo; Entrenós = Entrenós localizados acima e abaixo da espiga principal na planta. TP= ponto de tempo.

[00461] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de imagem digital: Área do Grão (cm2) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00462] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento /ou largura dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00463] Área da Espiga (cm2) - No final do período de crescimento, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.

[00464] Comprimento e Largura da Espiga (cm) - No final do período de crescimento, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento e largura da espiga (eixo mais longo) foram medidos a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.

[00465] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido no Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos para arquivos de textos e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00466] Parâmetros adicionais foram coletados por amostragem de 6 plantas por lote ou por medição do parâmetro em todas as plantas dentro do lote.

[00467] Peso Normalizado do Grão por planta (gr.) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes dentro dos blocos de A a C foram colhidas. Seis espigas foram separadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e pesadas da mesma forma. O peso médio de grãos por espiga foi calculado dividindo-se o peso total dos grãos pelo número total de espigas por lote (com base no lote). No caso de 6 espigas, o peso total dos grãos de 6 espigas foi dividido por 6.

[00468] FW da Espiga (g.) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas), o total e 6 espigas selecionadas por lote dentro dos blocos de A a C foram colhidos separadamente. As plantas com o total e 6 foram pesadas (g.) separadamente e a média de espigas por planta foi calculada para o total [FW da Espiga (peso fresco) por lote] e para 6 (FW da Espiga por planta).

[00469] Peso da planta e altura da espiga - As plantas foram caracterizadas com relação à altura no momento da colheita. Em cada medida, 6 plantas foram medidas com relação à altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo da borla. A altura das espigas foi medida do nível do chão até o local onde estava localizada a espiga principal.

[00470] Número de folhas por planta - As plantas foram caracterizadas com relação ao número de folhas durante o período de cultivo em 5 pontos de tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação ao seu número de folhas, contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.

[00471] Taxa de Crescimento Relativo - foi calculada utilizando as Fórmulas II a XIII (descritas acima).

[00472] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila do tipo Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. Leituras do medidor SPAD foram feitas em folha jovem completamente desenvolvida. Três medidas por folha foram tomadas por espiga. Os dados foram coletados depois de 46 e 54 dias após a semeadura (DPS|days after sowing).

[00473] Peso seco por planta - No final do experimento (quando a inflorescência estava seca), todo o material vegetal dos lotes dentro dos blocos de A a C foi colhido.

[00474] Peso seco - peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo raízes) após a secagem a 70^C em forno por 48 horas.

[00475] Índice de Colheita (HI) (Milho) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XVII descrita acima.

[00476] Porcentagem de Espigas Preenchidas [%] - foi calculada como a porcentagem da área da Espiga com grãos fora da espiga total.

[00477] Diâmetro do Sabugo [cm] - O diâmetro do sabugo sem os grãos foi medido utilizando uma régua.

[00478] Número de fileiras do núcleo por espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado. Resultados Experimentais:

[00479] 12 diferentes híbridos de milho foram cultivados e caracterizados com relação a diferentes parâmetros. Os parâmetros correlacionados são descritos na Tabela 48 abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 49- 50) e uma análise de correlação subsequente foi realizada. Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 48 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)

Tabela 48. SPAD 46DPS e SPAD 54DPS: Níveis de clorofila depois de 46 e 54 dias após a semeadura (DPS). “FW” = peso fresco; “DW” = peso seco. Tabela 49 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais

Tabela 49. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de milho (ID da linha), sob condições de cultivo regular. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 50 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Milho sob condições normais de cultivo

Tabela 50. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de milho (ID da linha), sob condições de cultivo regular. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 51 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob

Tabela 51. São fornecidas as corelações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [conjuntos de Expressão (exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (Correlação vetor (corr))] sob condições normais em variedades de milho. P = Valor p. EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO E NUE QUANDO CULTIVADO SOB FERTILIZAÇÃO COM NITROGÊNIO REDUZIDO UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE 60K DE MILHO

[00480] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho, produzido pela Agilent Technologies [chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeo representa cerca de 44.000 de genes e transcrições de milho. Correlação de híbridos de Milho em ecotipos cultivados sob condições de baixo nitrogênio. Procedimentos experimentais:

[00481] 12 híbridos de Milho foram cultivados em 3 lotes repetitivos, em campo. As sementes de Milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas em campo, utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação (485 metros cúbicos de água por dunam, 30 unidades de uran, 21% de fertilização por período de cultivo completo). A fim de definir a correlação entre os níveis de expressão do RNA com parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de NUE e produção, 12 híbridos de milho diferentes foram analisados. Entre eles, 11 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão do RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

[00482] Tecidos de Milho Analisados- Todos os 10 híbridos de milho foram amostrados para cada tratamento (condições de baixo N e condições normais), em três pontos de tempo: TP2 = V6-V8 (seis a oito folhas do colar são visíveis, a fase de crescimento rápido e a determinação de fileiras do núcleo são iniciadas), TP5 = R1-R2 (acetinação - bolha), TP6 = R3-R4 (leite - pasta). Quatro tipos de tecidos de planta [Espigas, folha bandeira indicada nas Tabelas 52 a 53 como folha, parte distal do grão e entrenó] foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido nas Tabelas 52 a 53 abaixo. Tabela 52 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho sob condições de baixo N

Tabela 52: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho. Folha = a folha abaixo da espiga principal; Meristema da Flor = meristema apical após iniciação da folha-macho; Espiga = a flor-fêmea no dia de antese. Grão Distal = milho desenvolvendo grãos a partir da área externa do sabugo, Grão Basal = milho desenvolvendo grãos a partir da área basal do sabugo; Entrenó = Entrenós localizados acima e abaixo da espiga principal na planta. Tabela 53 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho sob condições normais

Tabela 53: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho. Folha = a folha abaixo da espiga principal; Meristema da Flor = meristema apical após iniciação da folha-macho; Espiga = a flor- fêmea no dia de antese. Grão Distal = milho desenvolvendo grãos a partir da área externa do sabugo, Grão Basal = milho desenvolvendo grãos a partir da área basal do sabugo; Entrenó = Entrenós localizados acima e abaixo da espiga principal na planta.

[00483] Os parâmetros a seguir foram coletados ou por amostragem de 6 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.

[00484] Produção de Semente por planta (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 6 espigas foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso médio do grão por espiga foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de espigas por lote (com base na unidade). No caso das 6 espigas, o peso total dos grãos de 6 espigas foi dividido por 6.

[00485] Peso da Espiga por lote (g.) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e 6 espigas selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas com (total e 6) foram pesadas (g.) separadamente e a espiga média por planta foi calculada para Peso da Espiga por lote (total de 42 plantas por lote).

[00486] Altura da planta e altura da espiga - As plantas foram caracterizadas pela altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas por sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo do cabelo do milho. A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo até o local onde a espiga principal está localizada.

[00487] Número de folha por planta - As plantas foram caracterizadas pelo número de folha durante o período de cultivo em 5 vezes no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas por seu número de folha contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.

[00488] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras de medição de SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Sete medições por folha foram tiradas por lote. Os dados foram tirados após uma vez por semanas após a semeadura.

[00489] Peso Seco por planta - No final do experimento (quando a inflorescência for seca) todo material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado.

[00490] Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 70^C em uma câmara de secagem por 48 horas; Comprimento da Espiga da Espiga Preenchida [cm] - foi calculado como o comprimento da Espiga com grãos fora da espiga total.

[00491] Comprimento e largura da Espiga [cm] - foi calculado como o comprimento e largura da Espiga no preenchido. A medição foi realizada em 6 plantas por cada lote.

[00492] Número de Fileira do Núcleo por Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado.

[00493] Largura do caule [cm] - O diâmetro do caule foi medido no entrenó localizado abaixo da espiga principal. A medição foi realizada em 6 plantas por cada lote.

[00494] Índice de área da folha [LAI | folha area index] = área total de folha de todas as plantas em um lote. A medição foi realizada utilizando um medidor da área foliar.

[00495] NUE [kg/kg]- é a proporção entre a produção total de grão por N total aplicado no solo.

[00496] NUpE [kg/kg]- é a proporção entre a biomassa de planta total por N total aplicado no solo.

[00497] Produção/largura do caule [kg/cm] - é a proporção entre as produções de grão totais e a largura do caule.

[00498] Produção/LAI [kg] - é a proporção entre as produções de grão totais e o índice da área de folha total. Resultados Experimentais:

[00499] 11 diferentes híbridos de milho foram cultivados e caracterizados com relação a diferentes parâmetros. As Tabelas 54-55 descrevem os parâmetros correlacionados ao Milho. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 5659) e uma análise de correção subsequente foi realizada (Tabelas 60-61). Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 54 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores) sob condições de Baixo N

Tabela 54. “cm” = centímetros’ “mm” = milímetros; “kg” = quilogramas ; SPAD em R1-R2 e SPAD R3-R4: Nível de clorofila depois dos estágios iniciais e tardios de preenchimento de grãos, “NUE” = eficiência no uso do nitrogênio; “NUpE” = Eficiência na captação de nitrogênio; “LAI” = Área da folha; “N” = nitrogênio; Baixo N - sob condições de baixo Nitrogênio; “Normal” = sob condições normais, “dunam” = 1000 m2. Tabela 55 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores) sob condições normais

Tabela 55. “cm” = centímetros’ “mm” = milímetros; “kg” = quilogramas ; SPAD em R1-R2 e SPAD R3-R4: Nível de clorofila depois dos estágios iniciais e tardios de preenchimento de grãos, “NUE” = eficiência no uso do nitrogênio; “NUpE” = Eficiência na captação de nitrogênio; “LAI” = Área da folha; “N” = nitrogênio; Baixo N - sob condições de baixo Nitrogênio; “Normal” = sob condições normais, “dunam” = 1000 m2. Tabela 56 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais

Tabela 56: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de milho (ID da linha) sob condições normais. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 57 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Milho sob condições normais

Tabela 57: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de milho (ID da linha) sob condições normais. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 58 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições de Baixo nitrogênio

Tabela 58: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de milho (ID de linha) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 59 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Milho sob condições de Baixo nitrogênio

Tabela 59. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de milho (ID de linha) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 60 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob

Tabela 60: São fornecidas as corelações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [conjuntos de Expressão (exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (Correlação vetor (corr))] sob condições normais em variedades de milho. P = Valor p . Tabela 61 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições de baixo N em variedades de milho

Tabela 61. São fornecidas as corelações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [conjuntos de Expressão (exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (Correlação vetor (corr))] sob condições de baixo nitrogênio em variedades de milho. P = Valor p. EXEMPLO 9 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE TOMATE E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE TOMATE DE 44K

[00500] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo relacionado à NUE e a expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Tomate, produzido pela Agilent Technologies [chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeo representa cerca de 44.000 de genes e transcrições de Tomate. A fim de definir a correlação entre os níveis de expressão do RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou aos componentes de produção NUE, e ABST, várias características da planta de 18 diferentes variedades de Tomate foram analisadas. Entre elas, 10 variedades englobando a variação observada foram selecionadas para análise de expressão do RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Correlação das variedades de Tomate em ecotipos cultivados sob condições de baixo nitrogênio, condições de seca e condições de cultivo regular Procedimentos Experimentais:

[00501] 10 variedades de Tomates foram cultivadas em 3 blocos repetitivos, cada um contendo 6 plantas por lote, em estufa com rede. Em suma, o protocolo de cultivo se deu conforme segue: 1. Condições de cultivo regular: As variedades de Tomate foram cultivadas sob condições normais (4 a 6 Litros/m2 de água por dia e fertilizadas com NPK, conforme recomendado nos protocolos para produção comercial de tomates).

[00502] 2. Condições de fertilização de Baixo Nitrogênio: As variedades de Tomate foram cultivadas sob condições normais (4 a 6 Litros/m2 por dia e fertilizadas com NPK, conforme recomendado nos protocolos para produção comercial de tomates) até o estágio de floração. Neste momento, a fertilização com Nitrogênio foi interrompida.

[00503] 3. Estresse de seca: A variedade de Tomate foi cultivada sob condições normais (4 a 6 Litros/m2 por dia) até o estágio de floração. Neste momento, a irrigação foi reduzida para 50% comparado às condições normais.

[00504] As plantas foram fenotipadas diariamente, seguindo os descritores padrão do tomate (Tabela 63). A colheita foi conduzida enquanto 50% dos frutos estavam vermelhos (maduros). As plantas foram separadas em parte vegetal e frutos; destes, 2 nós foram analisados com relação aos parâmetros de inflorescência adicionais, tais como tamanho, número de flores e peso de inflorescência. O peso fresco de todo o material vegetal foi medido. Os frutos foram separados por cores (vermelhos vs. verde) e em conformidade com o tamanho do fruto (pequeno, médio e grande). Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS). Os parâmetros de dados coletados são resumidos nas Tabelas 64 a 70 abaixo.

[00505] Tecidos de Tomate analisados- Dois tecidos em diferentes fases de desenvolvimento [flore folha], representando diferentes características das plantas, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Para conveniência, cada tipo de informação de expressão de microarranjo recebeu Conjunto, conforme resumido na Tabela 62 abaixo. Tabela 62 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Tomate

Tabela 62: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada conjunto de expressão de tomate.

[00506] A Tabela 63 fornece os parâmetros correlacionados ao tomate (Vetores). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 64 a 70 abaixo. Uma análise de correlação subsequente foi conduzida (Tabela 71). Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 63 Parâmetros correlacionados de Tomate (vetores)

Tabela 63. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao tomate. “g.” = gramas, “FW” = peso fresco; “NUE” = eficiência no uso do nitrogênio; “RWC” = teor relativo de água; “NUpE” = eficiência na captação de nitrogênio, “SPAD” = níveis de clorofila; “HI” = índice de colheita (peso vegetal dividido na produção); “SLA” = área específica da folha (área da folha dividida por peso seco da folha).

[00507] Produção do Fruto (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], todos os frutos dos lotes dentro dos blocos de A a C foram colhidos. O total de frutos foi contado e pesado. O peso médio do fruto foi calculado dividindo o peso total do fruto pelo número de frutos.

[00508] Produção/SLA e Produção/Área total da folha - A produção de frutos dividida pela área específica da folha ou a área total da folha fornece uma medida de um balanço entre os processos reprodutivos e vegetais.

[00509] Peso Fresco do Fruto (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], todas as plantas dos lotes dentro dos blocos de A a C foram colhidas. O peso fresco foi medido (gramas).

[00510] Peso de inflorescência (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], duas inflorescências dos lotes dentro dos blocos de A a C foram colhidas. O peso de inflorescência (gr.) e o número de flores por inflorescência foram contados.

[00511] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila do tipo Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. Leituras do medidor SPAD foram feitas em folha jovem completamente desenvolvida. Três medidas foram tomadas por folha por espiga.

[00512] Eficiência no uso da água (WUE) - pode ser determinada como a biomassa produzida por transpiração de unidade. Para analisar a WUE, o teor de água relativo à folha foi medido em plantas de controle e transgênicas. O peso fresco (FW) foi imediatamente registrado; então, as folhas foram encharcadas por 8 horas em água destilada à temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TW | turgid weight) foi registrado. O peso seco total (DW) foi registrado após secar as folhas a 60^C em um peso constante. O teor de água relativo (RWC) foi calculado, de acordo com a Fórmula I a seguir [(FW - DW/TW - DW) x 100], conforme descrito acima.

[00513] As plantas que mantiveram um teor de água relativo (RWC) alto comparado às linhas de controle foram consideradas mais tolerantes à seca do que aquelas que exibiram um teor de água relativo reduzido. Resultados Experimentais: Tabela 64 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de seca

Tabela 64: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID da linha), sob condições de cultivo de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 65 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições de seca

Tabela 65: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID da linha), sob condições de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 66 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo nitrogênio

Tabela 66: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente), sob condições de cultivo com baixo Nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 67 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições de Baixo nitrogênio

Tabela 67: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente), sob condições de cultivo com baixo Nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 68 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições de Baixo

Tabela 68: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID da Semente) sob condições de cultivo com baixo Nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 69 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições normais

Tabela 69: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID da linha), sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 70

Tabela 70: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID da linha), sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 71 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob

Tabela 71. São fornecidas as corelações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [conjuntos de Expressão (exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (Correlação vetor (corr))] sob condições normais e sob condições de baixo nitrogênio em todos os ecotipos de tomate. P = Valor p.

[00514] Correlação dos traços do vigor em coletas de ecotipos de Tomate sob condições de Baixo nitrogênio, de 300 mM NaCl e condições normais de cultivo - Dez híbridos de tomate foram cultivados em 3 lotes repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa com rede sob condições semi-hidropônicas. Em suma, o protocolo de cultivo se deu conforme segue: As sementes de tomate foram semeadas em bandejas preenchidas com uma mistura de vermiculite e turfa em uma proporção de 1:1, Após a germinação, as bandejas foram transferidas para a solução de alta salinidade (300 mM NaCl, além da solução completa de Hoagland), solução de baixo nitrogênio (“baixo N”) (a quantidade do nitrogênio total foi reduzida em 90% da solução completa de Hoagland, quantidade final de 0,8 nM N), ou em solução de cultivo Normal (Completa de Hoagland, contendo solução de 8 mM N, cultivo em 28 ± 2^C). As plantas foram cultivadas a 28 ± 2 ^C.

[00515] A solução completa de Hoagland consiste em: KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2PO4 - 0.172 gramas/litro e 0,01 % (volume/volume) de microelementos de ‘Super coratina’ (Ferro-EDDHA [etilenodiamina-N,N’-bis(ácido 2-hidroxifenilacetico)]- 40,5 gramas/Litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro; e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deve ser de 6,5 - 6,8].

[00516] Tecidos de Tomates Analisados - Todas as 10 variedades de Tomate selecionadas foram amostradas para cada tratamento. Três tecidos [folhas, meristemas e flores] foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito abaixo. Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 72 abaixo. Tabela 72 Conjuntos experimentais de transcriptoma de Tomate

Tabela 72. São fornecidos os conjuntos experimentais de transcriptoma de tomate.

[00517] Parâmetros relacionados ao vigor do Tomate - Após 5 semanas de cultivo, as plantas foram colhidas e analisadas com relação ao número de folhas, altura da planta, níveis de clorofila (unidades SPAD), índices diferentes de eficiência no uso do nitrogênio (NUE) e biomassa da planta. A seguir, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (Instituto SAS). Os parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 73 abaixo. Tabela 73 Parâmetros correlacionados ao Tomate (vetores)

Tabela 73. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao tomate. “FW” = peso fresco; “cm” = centímetro. “Folha N°.” = número de folhas. Resultados Experimentais:

[00518] 10 diferentes variedades de Tomate foram cultivadas e caracterizadas com relação aos parâmetros, conforme descrito abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 74 a 77 abaixo. Uma análise de correlação subsequente foi conduzida (Tabela 78). Na sequência, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 74 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo nitrogênio

Tabela 74. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (Linha), sob condições de cultivo de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 75 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições de Baixo

Tabela 75. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (Linha), sob condições de cultivo de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 76 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições normais

Tabela 76. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (Linha), sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 77 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de salinidade

Tabela 77. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (Linha), sob condições de cultivo de salinidade. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 78 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais e de estresse em ecotipos de tomate

Tabela 78. São fornecidas as corelações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [conjuntos de Expressão (exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (Correlação vetor (Corr))] sob condições normais e sob condições de baixo nitrogênio em todos os ecotipos de tomate. P = Valor p. EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE QUANDO CULTIVADO SOB CONDIÇÕES NORMAIS E CONDIÇÕES DE DESFOLHAMENTO UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO DE 60K

[00519] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho, produzido pela Agilent Technologies [chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeo representa cerca de 60K de genes e transcrições de Milho, projetado com base nos dados das bases de dados públicos (Exemplo 1). A fim de definir a correlação entre os níveis de expressão do RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de biomassa e produção, várias características da planta de 13 diferentes variedades de Milho foram analisadas sob condições normais e tratamento de desfolhamento. Algumas variedades foram sujeitas à análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos Experimentais:

[00520] 13 linhas de variedades de milho foram cultivadas em 6 lotes repetitivos, em campo. As sementes de Milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas em campo, utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação. Após a acetinação, 3 lotes em todas as linhas de variedades forma submetidos ao tratamento de desfolhamento. Neste tratamento, todas as folhas acima da espiga foram removidas. Depois do tratamento, todas as plantas foram cultivadas de acordo com os mesmos protocolos de fertilização comercial e irrigação.

[00521] Três tecidos em estágio de desenvolvimento de floração (R1), incluindo folha (floração - R1), caule (floração - R1), e meristema de floração (floração - R1), representando diferentes características da planta, foram amostrados de plantas tratadas e não tratadas. O RNA foi extraído, conforme descrito em “MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA”. Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido nas Tabelas 79 a 80 abaixo. Tabela 79 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho (sob condições normais)

Tabela 79: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada conjunto de expressão de Milho. Tabela 80 Tecidos usados para conjuntos de expressão de transcriptoma de Milho (sob condições de desfolhamento)

Tabela 80: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada conjunto de expressão de Milho.

[00522] Os parâmetros a seguir foram coletados por formação de imagem.

[00523] O sistema de processamento de imagem utilizado consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java), desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e está livremente disponível na internet em rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de 5 Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00524] Peso de 1000 Grãos - No final do experimento, todas as sementes de todos os lotes foram colhidas e pesadas e o peso de 1000 foi calculado.

[00525] Área da Espiga (cm2)- No final do período de cultivo, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da Espiga foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de espigas.

[00526] Comprimento da Espiga e Largura da Espiga (cm) - No final do período de cultivo, foram fotografadas 6 espigas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento e a largura das espigas (eixo mais longo) foram medidos a partir dessas imagens e divididos pelo número de espigas.

[00527] Área do Grão (cm2) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00528] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos /ou a largura dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00529] Perímetro do Grão (cm) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do perímetro dos grãos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00530] Área preenchida por grãos da espiga (cm2)

[00531] -No final do período de cultivo, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga preenchida com núcleos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.

[00532] Preenchido por Toda a Espiga [%] - foi calculado como o comprimento da espiga com grãos fora da espiga total.

[00533] Parâmetros adicionais foram coletados por amostragem de 6 plantas por lote ou medindo o parâmetro em todas as plantas dentro do lote.

[00534] Largura do Sabugo [cm] - O diâmetro do sabugo sem os grãos foi medido utilizando uma régua.

[00535] Peso médio da Espiga (Kg.) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas), o total e 6 espigas selecionadas por lote foram colhidos. As espigas foram pesadas e a média de espigas por planta foi calculada. O peso médio da espiga foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo de 0%.

[00536] Peso da planta e altura da espiga - As plantas foram caracterizadas com relação à altura no momento da colheita. Em cada medida, 6 plantas foram medidas com relação à altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo da borla. A altura das espigas foi medida do nível do chão até o local onde estava localizada a espiga principal.

[00537] Num de fileiras da espiga - O número de fileiras por espiga foi contado.

[00538] Peso fresco da espiga por planta (GF) - Durante o período de preenchimento do grão (GF | grain filling), o total e 6 espigas selecionadas por lote foram colhidos. As espigas foram pesadas e o peso médio da espiga por planta foi calculado.

[00539] Peso seco da Espiga - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas), o total e 6 espigas selecionadas por lote foram colhidos e pesados. O peso médio da espiga foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo de 0%.

[00540] Peso fresco da Espiga - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas), o total e 6 espigas selecionadas por lote foram colhidos e pesados.

[00541] Espigas por planta - o número de espigas por planta foi contado.

[00542] Peso dos Grãos (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas foram colhidas. Espigas de 6 plantas de cada lote foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados.

[00543] Peso seco dos grãos (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas foram colhidas. Espigas de 6 plantas de cada lote foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados. O peso do grão foi normalizado utilizando a umidade relativa como sendo de 0%.

[00544] Peso do Grão por espiga (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas foram colhidas. 5 espigas de cada lote foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados. O peso médio de grãos por espiga foi calculado dividindo-se o peso total de grãos pelo número de espigas.

[00545] Área das folhas por planta (GF) e (HD) [LAI] = Área total da folha de 6 plantas em um lote; seu parâmetro foi medido em dois pontos de tempo durante o curso do experimento; no estágio de florescimento (HD | heading) e durante o período de preenchimento do grão (GF). A medição foi realizada utilizando um medidor de área da folha em dois pontos de tempo no curso do experimento; durante o período de preenchimento dos grãos e no estágio de florescimento (VT).

[00546] Peso fresco das folhas (GF) e (HD) - Este parâmetro foi medido em dois pontos de tempo durante o curso do experimento; no estágio de florescimento (HD) e durante o período de preenchimento dos grãos (GF). As folhas utilizadas para a medição do LAI foram pesadas.

[00547] Peso fresco do caule inferior (GF) (HD) e (H) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento: no estágio de florescimento (HD), durante o período de preenchimento dos grãos (GF) e na colheita (H). Os entrenós inferiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e pesados. O peso médio do entrenó por planta foi calculado dividindo-se o peso total do grão pelo número de plantas.

[00548] Comprimento do caule inferior (GF) (HD) e (H) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento; no estágio de florescimento (HD), durante o período de preenchimento dos grãos (GF) e na colheita (H). Os entrenós inferiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e seus comprimentos foram medidos utilizando uma regra. O comprimento médio dos entrenós por planta foi calculado dividindo-se o peso total do grão pelo número de plantas.

[00549] Largura do caule inferior (GF) (HD) e (H)- Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento; no estágio de florescimento (HD), durante o período de preenchimento dos grãos (GF) e na colheita (H). Os entrenós inferiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e seus diâmetros forma medidos utilizando um calibre. A largura média dos entrenós por planta foi calculada dividindo-se o peso total do grão pelo número de plantas.

[00550] Crescimento da altura da planta: a taxa de crescimento relativa (RGR) da Altura da Planta foi calculada utilizando a Fórmula III acima.

[00551] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila do tipo Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. Leituras do medidor SPAD foram feitas em folha jovem completamente desenvolvida. Três medidas foram tomadas por folha por espiga. Os dados foram coletados depois de 46 e 54 dias depois da semeadura (DPS|dias after sowing)

[00552] Peso fresco do caule (GF) e (HD) - Este parâmetro foi medido em dois pontos de tempo durante o curso do experimento; no estágio de florescimento (HD) e durante o período de preenchimento dos grãos (GF). Os caules das plantas usados para a medição do LAI foram pesados.

[00553] A matéria seca total foi calculada utilizando a Fórmula XXXV.

[00554] Peso fresco do caule superior (GF) (HD) e (H) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento; no estágio de florescimento (HD), durante o período de preenchimento dos grãos (GF) e na colheita (H). Os entrenós superiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e pesados. O peso médio dos entrenós por planta foi calculado dividindo-se o peso total do grão pelo número de plantas.

[00555] Altura do caule superior (GF) (HD) e (H)

[00556] - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento; no estágio de florescimento (HD), durante o período de preenchimento dos grãos (GF) e na colheita (H). Os entrenós superiores de pelo menos 4 plantas por lote foram separados da planta e seus comprimentos foram medidos por uma régua. O comprimento médio dos entrenós por planta foi calculado dividindo-se o peso total do grão pelo número de plantas.

[00557] Largura do caule superior (GF) (HD) e (H) (mm) - Este parâmetro foi medido em três pontos de tempo durante o curso do experimento; no estágio de florescimento (HD), durante o período de preenchimento dos grãos (GF) e na colheita (H). Os entrenós superiores de, pelo menos, 4 plantas por lote foram separados da planta e seus diâmetros forma medidos utilizando um calibre. A largura média dos entrenós por planta foi calculada dividindo-se o peso total do grão pelo número de plantas.

[00558] Peso seco vegetal (Kg.)- Peso total da parte vegetal acima do solo (excluindo raízes) após secagem a 70^C no forno por 48 horas; peso por número de plantas.

[00559] Peso fresco vegetal (Kg.)- Peso total da parte vegetal de 6 plantas (acima do solo, excluindo as raízes).

[00560] Número de nós - Os nós no caule foram contados no estágio de florescimento do desenvolvimento da planta. Tabela 81 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores) sob condições normais e sob

Tabela 81. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao milho. “NUE” = eficiência no uso do nitrogênio; “DW” = peso seco; “cm” = centímetro, “GF” = preenchimento do grão, “PP” = por planta, “h”= colheita, “méd.” = média, “N°” = número. “mm” = milímetro; “g” = gramas; “kg” = quilogramas; “cm” = centímetros.

[00561] Treze variedades de milho foram cultivadas e caracterizadas com relação aos parâmetros, conforme descrito abaixo. A média para cada um dos parâmetros foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 82 a 85 abaixo. Uma correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma para todos os conjuntos ou subconjuntos de linhas foi feita pela unidade de bioinformática e os resultados foram integrados à base de dados (Tabelas 86 a 87 abaixo). Tabela 82 Parâmetros medidos em variedades de Milho sob condições normais

Tabela 82. Tabela 83 Parâmetros medidos em variedades de Milho sob condições normais, linhas adicionais de milho.

Tabela 83. Tabela 84 Parâmetros medidos em variedades de Milho sob desfolhamento

Tabela 84. Tabela 85 Parâmetros medidos em variedades de Milho sob desfolhamento, linhas adicionais de milho

Tabela 85.

[00562] As Tabelas 86 e 87 abaixo fornecem as corelações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [conjuntos de Expressão (exp.)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (Correlação vetor (corr))] sob condições normais e condições de desfolhamento em variedades de milho. P = Valor p . Tabela 86 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob

Tabela 86. Tabela 87 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob desfolhamento em variedades de milho

Tabela 87. EXEMPLO 11 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO-PAINÇO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO-PAINÇO DE 60K

[00563] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho-painço, produzido pela Agilent Technologies [chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O arranjo de oligonucleotídeo representa cerca de 60K de genes e transcrições de milho- painço. A fim de definir a correlação entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados à produção ou o vigor, várias características da planta de 14 diferentes acessos de milho- painço foram analisadas. Entre eles, 11 acessos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão do RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos Experimentais:

[00564] 14 variedades de milho-painço foram cultivadas em 5 lotes repetitivos, em campo. Em suma, o protocolo de cultivo se deu conforme segue: 1. Condições de cultivo regular - As plantas de milho-painço foram cultivadas em campo, utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação, que incluem 283 m3 de água por dunam (100 metros quadrados) por período completo de cultivo e fertilização de 16 unidades de URAN® 32% (Solução Fertilizante de Nitrogênio; PCS Sales, Northbrook, IL, USA) (condições normais de cultivo).

[00565] 2. Condições de seca: sementes de milho-painço foram semeadas em solo e cultivadas sob condições normais até o estágio de florescimento (22 dias a partir da semeadura); um tratamento de seca foi imposto por irrigação das plantas com 50% de água relativo ao tratamento normal a partir deste estágio (171 m3 por dunam (100 metros quadrados) por período completo de cultivo).

[00566] Tecidos de milho-painço Analisados - Todas as 14 linhas de milho-painço foram amostradas com relação a cada tratamento. Três tecidos [folha, flor, e caule], em 2 estágios de desenvolvimento diferentes [floração e preenchimento de grãos], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido nas Tabelas 88 a 89 abaixo. Tabela 88 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho-painço sob condições de seca

Tabela 88. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho-painço sob condições de seca. Tabela 89 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho-painço sob condições normais

Tabela 89. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho-painço sob condições normais

[00567] Avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção do milho-painço - As plantas foram continuamente fenotipadas durante o período de cultivo e na colheita. (Tabela 102, abaixo). O sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java), desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00568] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando o sistema de imagem digital: No final do período de cultivo, os grãos foram separados da “Cabeça” da Planta e os seguintes parâmetros foram medidos e coletados: Área Média do Grão (cm2) - Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00569] Comprimento e Largura Médios do Grão (cm) - Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento e largura dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos. [00554] No final do período de cultivo, 14 “Cabeças” foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo.

[00570] Perímetro Médio do Grão (cm) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da “Cabeça” da Planta. Uma amostra de ~200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do perímetro dos grãos foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00571] Área Média da Cabeça (cm2) - A área da “Cabeça” foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de “Cabeças”.

[00572] Comprimento e Largura Médios da Cabeça (mm) - O comprimento e a largura das “Cabeças” (eixo mais longo) foram medidos a partir dessas imagens e foram divididos pelo número de “Cabeças”.

[00573] O sistema de processamento de imagem utilizado consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java), desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de 5 Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00574] Parâmetros adicionais foram coletados por amostragem de 5 plantas por lote ou medindo o parâmetro em todas as plantas dentro do lote.

[00575] Peso da Cabeça (g.) e número de Cabeças (n°)- No final do experimento, as cabeças foram colhidas de cada espiga e foram contadas e pesadas.

[00576] Produção Total do Grão (g.) - No final do experimento (“Cabeças” das Plantas), as cabeças das espigas foram coletadas, debulhadas e os grãos foram pesados. Além disso, o peso médio dos grãos por cabeça foi calculado dividindo-se o peso total dos grãos pelo número total de cabeças por lote (com base no lote).

[00577] Peso de 1000 Sementes [g.] - O peso de 1000 sementes por lote.

[00578] Biomassa na Colheita - No final do experimento, a parte vegetal acima do solo (excluindo as raízes) dos lotes foi pesada.

[00579] Matéria seca total por lote - Calculada como a parte vegetal acima do solo mais todo o peso seco das cabeças por lote.

[00580] N° de dias até a antese - Calculado como o número de dias desde a semeadura até que 50% do lote chegue à antese.

[00581] Manutenção do desempenho sob condições de seca: Representa a proporção para o parâmetro especificado dos resultados de condições de Seca dividido pelo resultados de condições normais (manutenção do fenótipo sob condições de seca em comparação com as condições normais).

[00582] Os parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 90, abaixo. Tabela 90 Parâmetros correlacionados ao Milho-Painço (vetores)

Tabela 90. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao milho-painço. Resultados Experimentais:

[00583] 14 diferentes acessos de milho-painço foram cultivados e caracterizados com relação a diferentes parâmetros, conforme descrito acima (Tabela 90). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 91- 96 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios (Tabelas 91-96) foi conduzida (Tabelas 97-99). Na sequência, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 91 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de milho- painço sob condições de seca

Tabela 91: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho-Painço (linha) sob condições de cultivo de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 92 Parâmetros adicionais medidos de IDs de correlação em acessos de milho- painço sob condições de seca

Tabela 92: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho-Painço (linha) sob condições de cultivo de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 93 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de milho- painço para a Manutenção . do desempenho sob condições de seca

Tabela 93: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho-painço (linha) para manutenção do desempenho sob condições de seca (calculado como % de mudança sob condições de cultivo de seca vs. normais). As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 94 Parâmetros adicionais medidos de IDs de correlação em acessos de milho- painço para Manutenção de desempenho sob condições de seca

Tabela 94: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho-painço (linha) para manutenção do desempenho sob condições de seca (calculado como % de mudança sob condições de cultivo de seca vs. normais). As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 95 Parâmetros medidos de IDs de correlação em acessos de milho- painço sob condições normais

Tabela 95: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho-painço (linha) sob condições de cultivo normal. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 96 Parâmetros adicionais medidos de IDs de correlação em acessos de milho-

Tabela 96: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho-painço (linha) sob condições de cultivo normal. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 97 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob

Tabela 97. Correlações (R) entre os níveis de expressão de genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Cor.” - ID do conjunto de correlação, de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela acima. “Conj. de Exp.” - Conjunto de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor p. Tabela 98 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico da manutenção do desempenho sob condições de seca em variedades de milho- painço

Tabela 98. Correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Cor.” - ID do conjunto de correlação, de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela acima. “Conj. de Exp.” - Conjunto de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor p. Tabela 99 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações da invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob

Tabela 99. Correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes em vários tecidos e o desempenho fenotípico. “ID de Cor.” - ID do conjunto de correlação, de acordo com os parâmetros correlacionados na Tabela acima. “Conj. de Exp.” - Conjunto de expressão. “R” = Coeficiente de correlação de Pearson; “P” = valor p.

EXEMPLO 12 CLONAGEM DE GENE E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO DA PLANTA

[00584] Para validar seu papel no aumento da produção, os genes selecionados foram superexpressos nas plantas, conforme segue.

Estratégia de Clonagem

[00585] Os genes selecionados a partir daqueles apresentados nos Exemplos 1-13 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, os quadros de leitura aberta de comprimento total (ORF’s | open reading frame) foram identificados. Os grupos EST e, em alguns casos, as sequências de mRNA, foram analisados para identificar o quadro de leitura aberta total comparando os resultados de diversos algoritmos de tradução para proteínas conhecidas de outras espécies de planta.

[00586] A fim de clonar os cDNA’s de comprimento total, uma transcrição reversa (RT|reverse transcription) seguida pela reação de cadeia polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído das folhas, raízes ou outros tecidos da planta, cultivados sob condições de estresse ou normais/limitantes. A extração total de RNA, produção de cDNA e amplificação de PCR foram realizadas utilizando protocolos padrões descritos em outro lugar (Sambrook J., E.F. Fritsch e T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a Ed. Frio Spring Harbor Laboratory Press, New York.) que são bem conhecidos dos especialista na técnica. Os produtos de PCR foram purificados utilizando um kit de purificação de PCR (Qiagen).

[00587] Geralmente, 2 conjuntos de iniciadores foram preparados para a amplificação de cada gene, via PCR aninhados (se necessário). Ambos os conjuntos de iniciadores foram utilizados para amplificção no cDNA. No caso de nenhum produto ser obtido, uma reação de PCR aninhada foi realizada. O PCR aninhado foi realizado pela amplificação do gene utilizando iniciadores externos e, em seguida, utilizando o produto de PCR produzido como um modelo para uma segunda reação de PCR, onde o conjunto interno de iniciadores foi utilizado. De modo alternativo, um ou dois dos iniciadores internos foi(ram) utilizado(s) para amplificação de 25 genes, ambos na primeira e segunda reações de PCR (significando que apenas 2-3 iniciadores foram designados para um gene). Para facilitar a clonagem adicional de cDNA’s, uma extensão de 8-12 pares de base (bp | base pairs) foi adicionada ao 5’ de cada iniciador interno. A extensão do iniciador inclui um local de restrição de endonuclease. Os locais de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a) o local de restrição não existe na sequência de cDNA; e (b) os locais de restrição nos iniciadores direto e reversos foram projetados de modo que o cDNA digerido seja inserido na direção do sentido no vetor binário utilizado para transformação.

[00588] Os produtos de PCR foram digeridos com endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc.), de acordo com os locais designados nos iniciadores. Cada produto de PCR digerido/não digerido foi inserido em um vetor de cópia alta pUC19 (New England BioLabs Inc.) ou em plasmídeos originados desse vetor. Em alguns casos, o produto de PCR não digerido foi inserido no pCR-Blunt II- TOPO (Invitrogen) ou no pJET1.2 (Kit de Clonagem CloneJET PCR, Thermo Scientific) ou diretamente no vetor binário. Os produtos digeridos/não digeridos e o vetor de plasmídeo linearizado foram ligados utilizando uma enzina de ligase T4 DNA (Roche, Suíça, ou outros fabricantes). Nos casos em que o pCR-Blunt II-TOPO foi utilizado, nenhuma ligase T4 foi necessária.

[00589] O sequenciamento dos genes inseridos foi realizado utilizando o sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Em alguns casos, após confirmar as sequências dos genes clonados, o cDNA clonado foi introduzido em um vetor binário pGI modificado contendo o promotor At6669 (p.ex., pQFNc) e o terminador NOS (ID SEQ. N°: 4891) através de digestão com endonucleases de restrição apropriados.

[00590] Nos casos de transformação de Brachypodium, após confirmar as sequências dos genes clonados, os cDNAs clonados foram introduzidos no pEBbVNi (Figura 9A), contendo o promotor 35S (ID SEQ. N°: 4892) e o terminador NOS (ID SEQ. N°: 4891) via digestão com endonucleases de restrição adequadas. Estes genes foram clonados à jusante do promotor 35S e à montante do terminador NOS.

[00591] Diversas sequências de DNA dos genes selecionados foram sintetizadas via GeneArt (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). O DNA sintético foi projetado em sílica. Os locais de enzimas de restrição adequados foram adicionados às sequências clonadas na extremidade 5’ e na extremidade 3’ para permitir clonagem posterior no vetor binário desejado.

[00592] Vetores binários - O vetor plasmídeo pPI foi construído inserindo uma sequência de sinal poli-(A) sintético originado do vetor de plasmídeo básico pGL3 (Promega, Acesso GenBank N° U47295; nucleotídeos 4658-4811) no local de restrição HindIII do vetor binário pBI101.3 (Clontech, Acesso GenBank N° U12640). O pGI é similar ao pPI, mas o gene original na coluna vertebral é o gene GUS- Intron e não o GUS.

[00593] O vetor pGI modificado [p.ex., pQFN, pQFNc, pQYN_6669, pQNa_RP, pQFYN 25 ou pQXNc] é uma versão modificada do vetor pGI, no qual o cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita, de modo que o gene e seu promotor correspondente estejam próximos à borda direita e o gene NPTII esteja próximo à borda esquerda.

[00594] At6669, a nova sequência do promotor Arabidopsis thaliana (ID SEQ. N°: 4880) foi inserida no vetor binário pGI modificado, a montante dos genes clonados, seguido pela ligação do DNA e extração do plasmídeo binário das colônias E. coli positivas, conforme descrito acima. As colônias foram analisadas por PCR, utilizando os iniciadores que cobrem a inserção, que são projetados para abranger o promotor e o gene introduzido. Os plasmídeos positivos foram identificados, isolados e sequenciados.

[00595] O pEBbVNi (Figura 9A) é uma versão modificada do pJJ2LB, no qual o gene de resistência Higromicina foi substituído por um gene BAR que confere resistência ao herbicida BASTA [a sequência de codificação de gene BAR é fornecida no Acesso GenBank N° JQ293091.1 (ID SEQ. N°: 5436); uma descrição adicional é fornecida em Akama K, et al. “Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the bar gene as selectable marker”, Plant Cell Rep. 1995, 14(7):450-4; Christiansen P, et al. “A rapid and efficient transformation protocol for the grass Brachypodium distachyon”, Plant Cell Rep. 2005 Mar; 23(10-11):751-8. Epub 2004 Oct 19; e Pacurar DI, et al. “A high-throughput Agrobacterium- mediated transformation system for the grass model species Brachypodium distachyon L”, Transgenic Res. 2008 17(5):965-75; cada um dos quais é totalmente incorporado aqui por referência em sua totalidade]. A estrutura pEBbVNi contém o promotor 35S (ID SEQ. N°: 4892). O pJJ2LB é uma versão modificada do pCambia0305.2 (Cambia).

[00596] Nos casos em que DNA genômico foi clonado, os genes foram amplificados por PCR direto no DNA genômico extraído do tecido foliar, utilizando o kit DNAeasy (Qiagen Cat. N° 69104).

[00597] Os genes selecionados clonados pelos presentes inventores são fornecidos na Tabela 100 abaixo. Tabela 100

Tabela 100. São fornecidos os nomes dos genes clonados, os plasmídeos com alto números de cópias, o organismo a partir do qual o gene foi clonado, os iniciadores utilizados para clonagem e os identificadores de sequência dos polinucleotídeos e polipeptídeos dos genes clonados.

EXEMPLO 13 TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS AGROBACTERIUM TUMEFACIENS COM VETORES BINÁRIOS ABRIGANDO OS POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

[00598] Os vetores binários descritos acima foram utilizados para transformar as células Agrobacterium. Duas estruturas binárias adicionais, tendo apenas o promotor At6669 ou o promotor 35S ou sem promotor adicional, foram utilizadas como controles negativos.

[00599] Os vetores binários foram introduzidos em células competentes Agrobacterium tumefaciens GV301 ou LB4404 (para Arabidopsis) ou AGL1 (para Brachypodium) (cerca de 109 células/mL), por eletroporação. A eletroporação foi realizada utilizando um eletroporador MicroPulser (Biorad), 0,2 cm de cadinhos (Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad). As células tratadas foram cultivadas em meio líquido LB a 28^C por 3 horas, então colocadas sobre ágar LB suplementado com gentamicina (para Arabidopsis; 50 mg/L; para cepas Agrobacterium GV301) ou estreptomicina (para Arabidopsis; 300 mg/L; para cepa Agrobacterium LB4404); ou com Carbenicilina (para Brachypodium; 50 mg/L) e canamicina (para Arabidopsis e Brachypodium; 50 mg/L) a 28^C por 48 horas. As colônias Abrobacterium, que são desenvolvidas nos meios seletivos, foram ainda analisadas por PCR, utilizando os iniciadores projetados para abranger a sequência inserida no plasmídeo pPI. Os produtos de PCR resultantes foram isolados e sequenciados para verificar que as sequências de polinucleotídeo corretas da invenção são devidamente introduzidas às células Agrobacterium.

EXEMPLO 14 TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS ARABIDOPSIS THALIANA COM OS POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

[00600] Plantas Arabidopsis thaliana Columbia (plantas T0) foram transformadas, utilizando o procedimento de Imersão Floral descrito por Clough e Bent, 1998 (Floral dip: a simplified method for Agrobacterium- mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 735- 43) e por Desfeux et al., 2000 (Female Reproductive Tissues Are the Primary Target of Agrobacterium-Mediated Transformation by the Arabidopsis FloralDip Method. Plant Physiol, Julho 2000, Vol. 123, pp. 895-904), com pequenas modificações. Em resumo, as plantas T0 foram semeadas em vasos de 250 ml, preenchidas com mistura de cultivo com base em turfa úmida. Os vasos foram cobertos com folhas de alumínio e uma redoma de plástico, mantidos a 4°C por 3-4 dias, então, descobertos e incubados em uma câmara de cultivo a 18-24°C em 16/8 horas de ciclos claro/escuro. As plantas T0 estavam prontas para transformação seis dias antes da antese.

[00601] Colônias únicas de Agrobacterium carregando as estruturas binárias foram geradas, conforme descrito nos Exemplos 12-13 acima. As colônias foram cultivadas em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas a 28^C por 48 horas sob agitação vigorosa e, depois, centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. Os peletes compreendendo as células Agrobacterium foram ressuspensos em um meio de transformação contendo meio de cultura de concentração média (2,15 g/L) Murashige-Skoog (Duchefa); 0,044 μM de benzilamino purina (Sigma); 112 μg/L de vitaminas B5 Gambourg (Sigma); 5% de sacarose e 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) em água duplamente destilada com pH de 5,7.

[00602] A transformação de plantas T0 foi realizada invertendo cada planta em uma suspensão de Agrobacterium, de modo que o tecido de planta acima do solo foi submerso por 3-5 segundos. Cada planta T0 inoculada foi imediatamente colocada em uma bandeja de plástico, então coberta com redoma plástica limpa para manter umidade e foi mantida no escuro à temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e transformação. As plantas transformadas (transgênicas) foram então cobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas T0 transgênicas foram cultivadas na estufa por 3- 5 semanas até as síliquas ficarem marrons e secas. As sementes foram colhidas a partir das plantas e mantidas à temperatura ambiente até a semeadura.

[00603] Para geração de plantas transgênicas T1 e T2 abrigando os genes, as sementes coletadas das plantas T0 transgênicas foram esterilizadas na superfície por imersão em 70% de etanol por 1 minuto, seguido por imersão em 5% de hipoclorito de sódio e 0,05% de triton por 5 minutos. As sementes esterilizadas na superfície foram totalmente lavadas em água estéril destilada e, então, colocadas nas placas de cultura contendo meio de cultura de concentração média Murashige-Skoog (Duchefa); 2% de sacarose; 0,8% de ágar de planta; 50 mM de canamicina e 200 mM de carbenicilina (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4^C por 48 horas, então, transferidas a uma sala de cultivo a 25^C por uma semana adicional de incubação. As plantas T1 Arabidopsis vitais foram transferidas para as placas de cultura fresca por outra semana de incubação. Seguindo a incubação, as plantas T1 foram removidas das placas de cultura e das placas de cultura e plantadas na mistura de cultivo contida em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram deixadas crescer em uma estufa para maturidade. As sementes colhidas das plantas T1 foram cultivadas e crescidas para maturidade como as plantas T2 nas mesmas condições conforme utilizadas para cultura e crescimento das plantas T1.

EXEMPLO 15 TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS BRACHYPODIUM DISTACHYON COM OS POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

[00604] Semelhante ao modelo da planta Arabidopsis, o Brachypodium distachyon tem várias características que o torna recomendado como uma planta modelo para estudos de genômica funcional, especialmente nas gramíneas. Traços que o tornam um modelo ideal incluem seu genoma pequeno (~160 Mbp por um genoma diploide e 355 Mbp por um genoma poliploide), pequena estatura física, um curto ciclo de vida e poucos requisitos de cultivo. O Brachypodium está relacionado às principais espécies de grãos de cereal, mas entende-se que esteja mais estreitamente relacionado ao Triticeae (trigo, cevada), do que aos outros cereais. O Brachypodium, com seus acessos de poliploide, pode servir como um modelo ideal para esses grãos (cujo tamanho e complexidade genômica são uma grande barreira para a melhoria da biotecnologia).

[00605] Os calos embriogênicos do Brachypodium distachyon foram transformados utilizando o procedimento descrito por Vogel e Hill (2008) [High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Brachypodium distachyon inbred line Bd21-3. Plant Cell Rep 27:471-478], Vain et al (2008) [Agrobacterium-mediated transformation of the temperate grass Brachypodium distachyon (genotypeBd21) for T-DNA insertional mutagenesis. Plant Biotechnology J 6: 236-245] e Vogel J, et al. (2006) [Agrobacterium mediated transformation and inbred line development in the model grass Brachypodium distachyon. Plant Cell Tiss Org. Cult. 85:199211], cada um dos quais é totalmente incorporado aqui por referência, com algumas pequenas modificações, que são brevemente resumidas abaixo.

[00606] Inicio dos calos - Espigas imaturas (cerca de 2 meses após a semeadura) foram colhidas no início do preenchimento das sementes. As espigas foram, em seguida, descascadas e esterilizadas à superfície com 3% de NaClO contendo 0,1% de Tween 20, agitadas com um agitador rotativo a baixa velocidade, durante 20 minutos. Após três lavagens com água destilada estéril, os embriões foram extraídos sob um microscópio de dissecação em uma câmara de fluxo laminar utilizando uma pinça fina.

[00607] Os embriões extraídos (tamanho ~0,3 mm, em forma de sino) foram colocados em meio de indução de calos (CIM|callus induction medium) [sais LS (Linsmaier, EM & Skoog, F. 1965. Physiol. Plantarum 18, 100) e vitaminas mais 3% de sacarose, 6mg/L de CuSO4, 2,5mg/l de 2,4-ácido diclorofenoxiacético, pH 5,8 e 0,25% de Phytagel (Sigma)] escutelar com o lado para baixo, 100 embriões em uma placa, e incubados a 28^C no escuro. Uma semana depois, os calos embrionários foram limpos de raízes emergentes, brotos e calos somáticos e foram subcultivados em meio CIM fresco. Durante a cultura, apareceram calos embriogênicos (EC | embryogenic callus) amarelados e foram, ainda, selecionados (p. ex., colhidos e transferidos) para uma incubação adicional nas mesmas condições durante mais 2 semanas. Vinte e cinco pedaços de calos subcultivados foram, então, colocados separadamente em placas de Petri de 90 X 15 mm e incubados, tal como anteriormente, por mais três semanas.

[00608] Transformação - Conforme descrito em Vogel e Hill (2008, Supra), o Agrobacterium foi raspado com placas MGL de 2 dias de idade (placas com o meio MGL que contém: Triptona 5 g/l, Extrato de Levedura 2,5 g/l, NaCl 5 g/l, D-manitol 5 g/l, MgSO4*7H2O 0,204 g/l, K2HPO4 0,25 g/l, Ácido Glutâmico 1,2 g/l, Agar Planta 7,5 g) e ressuspendido em meio líquido MS suplementado com 200 μM de acetossiringona a uma densidade ótica (OD | optic density) a 600 nm (OD600) de 0,6. Uma vez que a densidade ótica desejada foi atingida, adicionou-se 1 ml de 10% de Synperonic PE/F68 (Sigma) por 100 mL de meio de inoculação.

[00609] Para começar a inoculação, 300 pedaços de calo foram colocados em cerca de 12 placas (25 pedaços de calo em cada placa) e cobertos com a suspensão de Agrobacterium (8-8,5 ml). O calo foi incubado na suspensão de Agrobacterium durante 15 minutos com agitação suave ocasional. Após a incubação, a suspensão de Agrobacterium foi removida por aspiração e os calos foram, então, transferidos para placas de cocultura, preparadas colocando um papel de filtro estéril de 7 cm de diâmetro em uma placa de Petri de 90 X 15 mm vazia. Os pedaços de calos foram, então, suavemente distribuídos sobre o papel filtro. Uma placa de cocultura foi usada para duas placas de calos iniciais (50 pedaços de calos iniciais). As placas de cocultura foram, então, seladas com parafilme e incubadas a 22°C, no escuro, durante 3 dias.

[00610] Os pedaços de calo foram, então, transferidos individualmente em meio de CIM, conforme descrito acima, o qual foi ainda suplementado com 200 mg/l de ticarcilina (para matar o Agrobacterium) e Bialaphos (5 mg/L) (para seleção de uma das seções de calos embriogênicos resistentes transformados) e incubados a 28°C, no escuro, durante 14 dias.

[00611] Os pedaços de calos foram, então, transferidos para meio de indução de brotos (SIM | shoot induction media; sais LS e vitaminas mais 3% de maltose mono-hidratada) suplementados com 200 mg/l de ticarcilina, Bialaphos (5 mg/L), ácido indol-3-acético (IAA | indol-3- acetic acid) (0,25 mg/L) e 6-benzilaminopurina (BAP | Benzylaminopurine) (1 mg/L), e foram subcultivados à luz para o mesmo meio, após 10 dias (total de 20 dias). Em cada subcultura, todas as partes de um único calo foram mantidas juntas para manter a sua independência e foram incubadas sob as seguintes condições: a um nível de iluminação de 60 lE m- 2 s-1, uma luz de 16 horas, 8 horas de fotoperíodo escuro e uma temperatura constante de 24°C. As mudas emergiram dos calos transformados.

[00612] Quando as mudas estavam grandes o suficiente para serem manuseadas sem danos, elas foram transferidas para placas contendo os meios de indução de brotações (SIM) acima indicados, sem Bialaphos. Cada plântula foi considerada como um evento diferente. As mudas brotaram perfilhos axilares e, eventualmente, tornaram-se espessas. Cada ramo da mesma planta (ID do evento) foi, em seguida, dividido em caixas de cultura de tecidos (“Húmus”) contendo sais basais de “meio de enraizamento” [sais basais MS, 3% de sacarose, 3 g/L de Phytagel, 2 mg/l de ácido acético cx- naftaleno (NAA|naphthalene Acetic Acid) e 1 mg/l de IAA e Ticarcilina 200mg/L, pH 5,8). Todas as plantas em uma “caixa de Húmus” eram plantas diferentes do mesmo evento de transformação.

[00613] Quando as plantas estabeleceram raízes, elas foram transplantadas para o solo e transferidas para uma estufa. Para verificar o estado de plantas transgênicas contendo as outras estruturas, as plantas T0 foram sujeitas a PCR, conforme previamente descrito por Vogel et al. 2006 [Agrobacterium mediated transformation and inbred line development in the model grass Brachypodium distachyon. Plant Cell Tiss Org. Cult. 85:199211].

EXEMPLO 16 AVALIAÇÃO DE NUE DE ARABIDOSIS TRANSGÊNICA SOB CONDIÇÕES DE BAIXO NITROGÊNIO OU NORMAL UTILIZANDO ENSAIOS DE MUDAS. Ensaio 1: Cultivo de planta sob níveis de concentração de nitrogênio baixo e favorável

[00614] Sementes esterilizadas de superfície foram semeadas em meio basal [50% de meio Murashige-Skoog (MS) suplementado com 0,8% de ágar de planta como agente de solidificação] na presença de Canamicina (utilizada como agente de seleção). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4^C e, então, cultivadas a 25^C em ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão por 7 a 10 dias. Nesse ponto de tempo, as mudas aleatoriamente escolhidas foram cuidadosamente transferidas para placas contendo ^ meio de MS (15 mM N) para tratamento de concentração de nitrogênio normal e 0,30 mM de nitrogênio para tratamento de concentração de baixo nitrogênio. Para experimentos realizados em linhas T2, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (replicas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo de cada invenção, pelo menos, quatro a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura. Para experimentos realizados em linhas T1, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (replicas) foram plantadas. No total, para linhas T1, 20 eventos independentes foram avaliados. As plantas que expressam polinucleotídeos da invenção foram comparadas à medição média das plantas de controle (vetor vazio ou gene repórter GUS no mesmo promotor) utilizada no mesmo experimento.

[00615] Formação de Imagem Digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada a uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpada de iluminação de 4 x 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi utilizada para capturar imagens de mudas vistas em placas de ágar.

[00616] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias, começando no dia 1 até o dia 10 (vide, p. ex. as imagens nas Figuras 3A- B). Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizado na internet em rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão. Em seguida, os dados de análise foram salvos em arquivos de textos e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00617] Análise de mudas - Utilizando a análise digital, os dados das mudas foram calculados, incluindo área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz.

[00618] A taxa de crescimento relativo para os vários parâmetros de muda foi calculada de acordo com as seguintes fórmulas, Fórmulas XIII (taxa de crescimento relativo da área da folha) e VI (taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz).

[00619] No final do experimento, as mudas foram removidas do meio e pesadas para a determinação do peso fresco da planta. As mudas foram então secadas por 24 horas a 60°C, e pesadas novamente para medir o peso seco da planta para análise estatística posterior. A taxa de crescimento foi determinada comparando a cobertura da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz, entre cada par de fotos sequenciais, e os resultados foram utilizados para resolver o efeito do gene introduzido no vigor da planta sob condições ideais. Semelhantemente, o efeito do gene introduzido em acúmulo de biomassa, sob condições ideais, foi determinado comparando o peso seco e fresco das plantas e daquele das plantas de controle (contendo um vetor vazio ou gene repórter GUS no mesmo promotor). A partir de cada estrutura criada, 3 a 5 eventos de transformação independentes foram examinados em replicados.

[00620] Análises estatísticas - Para identificar os genes que conferem vigor melhorado à planta ou arquitetura melhorada à raiz, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos das plantas de controle. Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento de gene sobre um controle, os dados foram analisados pelo teste t de Student e o valor-p foi calculado. Os resultados foram considerados significativos se p ^ 0,1. O pacote de software JMP estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados Experimentais:

[00621] Os genes apresentados nas Tabelas a seguir foram clonados na regulação de um promotor constitutivo (At6669). A avaliação do efeito de transformação em uma planta de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de número diferente de eventos de transformação. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de muda. Os resultados obtidos nesses segundos experimentos também foram significativamente positivos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo.

[00622] Os genes apresentados nas Tabelas 101- 104 mostraram uma melhora significativa no NUE da planta visto que produziram biomassa de planta maior (peso fresco e seco da planta; área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz) em geração T2 (Tabelas 101-102) ou geração T1 (Tabelas 103-104) quando cultivadas sob condições de cultivo de nitrogênio limitantes, comparadas às plantas de controle que foram cultivadas sob condições de cultivo idênticas. As plantas que produzem biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades de absorver maior quantidade de nitrogênio do solo. Tabela 101 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração T2)

Tabela 101: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor-p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 102 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração T2)

Tabela 102: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor-p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 103 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições

Tabela 103: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor-p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 104 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração T1)

Tabela 104: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor-p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.

[00623] Os genes listados nas Tabelas 105-106 melhoraram a taxa de crescimento relativo da planta (taxa de crescimento relativo da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz) quando cultivados sob condições de cultivo de nitrogênio limitantes, comparados às plantas de controle (gerações T2 e T1) que foram cultivadas sob condições de cultivo idênticas. As plantas que apresentam taxa de crescimento rápido mostram um estabelecimento melhor da planta em solo sob condições de nitrogênio deficientes. O crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz foi medida, Tabela 105 Genes mostrando a taxa de crescimento melhorada da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração T2)

Tabela 105: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 106 Genes mostrando a taxa de crescimento melhorada da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração T2)

Tabela 106: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.

[00624] Os genes listados nas Tabelas 107-110 melhoraram a NUE da planta quando cultivadas em níveis de concentração de nitrogênio padrão. Esses genes produziram biomassa de planta maior (peso fresco e seco da planta; área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz) quando cultivadas sob condições de cultivo de nitrogênio padrão, comparado àquelas plantas de controle que foram cultivadas sob condições de cultivo idênticas em geração T2 (Tabelas 107-108) ou geração T1 (Tabelas 109-110). A biomassa maior da planta nessas condições de cultivo indica a alta capacidade da planta de melhor metabolizar o nitrogênio presente no meio. As plantas que produzem biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades de absorver maior quantidade de nitrogênio do solo. Tabela 107 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T2)

Tabela 107: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 108 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T2)

Tabela 108: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 109 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T1)

Tabela 109: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 110 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T1)

Tabela 110: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.

[00625] Os genes listados nas Tabelas 111-112 melhoraram a taxa de crescimento relativo da planta (RGR da área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando cultivadas em níveis de concentração de nitrogênio padrão. Esses genes produziram plantas que cresceram mais rápido que as plantas de controle quando cultivadas sob condições de cultivo de nitrogênio padrão. O crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz foi medida. Tabela 111 Genes mostrando a taxa de crescimento melhorada sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T2)

Tabela 111: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 112 Genes mostrando a taxa de crescimento melhorada sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T1)

Tabela 112: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.

EXEMPLO 17 AVALIAÇÃO DE NUE, PRODUÇÃO E TAXA DE CRESCIMENTO DE PLANTA DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA EM FERTILIZAÇÃO DE BAIXO NITROGÊNIO OU NORMAL EM ENSAIO DE ESTUFA

[00626] Ensaio 1: Eficiência no uso do nitrogênio: Produção de semente, biomassa de planta e taxa de crescimento de planta em concentração de nitrogênio ideal e limitada em condições de estufa - Esse ensaio acompanha a produção de semente, a formação de biomassa e o crescimento de área da roseta de plantas cultivadas na estufa em condições de crescimento de nitrogênio não limitantes e limitantes. As sementes de Arabidopsis Transgênica foram semeadas em meios de ágar suplementados com ^ meio de MS e agente de seleção (Canamicina), As sementes transgênicas T2 foram, então, transplantadas para 1,7 bandejas preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo condições limitantes de nitrogênio, as quais foram atingidas pela irrigação das plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3, suplementado com 1mM de KH2PO4, 1mM de MgSO4, 3,6 mM de KCl, 2 mM de CaCl2 e microelementos, enquanto níveis normais de nitrogênio foram alcançadas aplicando uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3, com 1mM de KH2PO4, 1mM de MgSO4, CaCl2 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até as sementes ficarem maduras. As sementes foram colhidas, extraídas e pesadas. A biomassa de planta restante (o tecido acima do solo) também foi colhida, e pesada imediatamente ou seguindo a secagem no forno a 50^C por 24 horas.

[00627] Cada estrutura foi validada em sua geração T2, As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformada por um vetor vazio carregando o promotor 35S e o marcador selecionável foram utilizadas como controle.

[00628] As plantas foram analisadas por seu tamanho total, taxa de crescimento, tempo de floração, produção de semente, peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita (HI - produção de semente/matéria seca). O desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle cultivadas em paralelo nas mesmas condições. As plantas transgênicas falsas que expressam o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou sem nenhum gene, no mesmo promotor, foram utilizadas como controle.

[00629] O experimento foi planejado na distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene da invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados de cada estrutura.

[00630] Formação de imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada com uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpada de 4 x 150 Watts) foi utilizada para capturar imagens das amostras de plantas.

[00631] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias, começando do dia 1 após o transplante até o dia 15. A mesma câmara, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi usada para capturar as imagens de plantas maiores vistas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas são de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litros. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição de sombras.

[00632] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizados na internet em rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group padrão). Em seguida, dados de análise foram salvos para arquivos de textos e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00633] Análise de folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, a área da roseta, o diâmetro de roseta e a área da lâmina foliar.

[00634] Taxa de crescimento vegetal: a taxa de crescimento relativo (RGR) do número da folha [Fórmula VIII (descrita acima)], área da roseta [Fórmula IX, descrita acima], cobertura do lote [Fórmula XI, descrita acima] e índice de colheita [Fórmula XV] foram calculadas conforme segue: Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes foram coletadas. As sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00635] Peso seco e produção de semente - Por volta do 80° dia, as plantas foram colhidas e deixadas para secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso da semente de cada lote foram medidos e divididos pelo número de plantas em cada lote. Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 30°C em uma câmara de secagem;^ Produção de semente por planta = peso total da semente por planta (gr.), peso de 1000 sementes (o peso de 1000 sementes) (gr.).

[00636] O índice de colheita (HI) foi calculado utilizando a Fórmula XV, conforme descrito acima.

[00637] Porcentagem de óleo em sementes - No final do experimento, todas as sementes de cada lote foram coletadas. As sementes de 3 lotes foram misturadas à terra e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n- Hexano (Cat N° 080951 Biolab Ltd.) foram utilizadas como solvente. A extração foi realizada por 30 horas em fogo médio a 50°C. Uma vez finalizada a extração, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35°C ^e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. A informação obtida do extrator Soxhlet (Soxhlet, F, Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J, (Dingler's) 1879, 232, 461) foi utilizado para criar uma curva de calibração para RMN de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras foi determinado utilizando o RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra - Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00638] Análise de comprimento de Síliqua - No dia 50 da semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada lote foram amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas foram de cor verde-amarela e foram coletadas a partir das partes inferiores de um caule de planta cultivado. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua.

[00639] Análise estatística - Para identificar os genes que conferem tolerância significativamente melhorada aos estresses abióticos, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos das plantas de controle. Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados pelo teste t de Student e os resultados foram considerados significativos se o valor-p fosse menor que 0.1. O pacote de software JMP estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA).

[00640] As Tabelas 113-122 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas que expressam de forma exógena as estruturas de gene utilizando ensaios de maturação da semente na estufa (GH-SM) em condições de baixo nitrogênio (Tabelas 113-117) ou de nitrogênio normal (Tabelas 118122). A avaliação de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de diferentes números de eventos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 113 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo

Tabela 113: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). Deve-se observar que um aumento negativo (em porcentagem) quando encontrado na floração ou surgimento de inflorescência indica evasão hídrica da planta. Tabela 114 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo de baixo nitrogênio sob regulação do promotor At6669

Tabela 114: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). Tabela 115 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo

Tabela 115: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). Tabela 116 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo de baixo nitrogênio sob regulação do promotor At6669

Tabela 116: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). Tabela 117 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo de baixo nitrogênio sob regulação do promotor At6669

Tabela 117: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). Tabela 118 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais

Tabela 118: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). Deve-se observar que um aumento negativo (em porcentagem) quando encontrado na floração ou surgimento de inflorescência indica evasão hídrica da planta. Tabela 119 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 119: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). Tabela 120 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 120: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). Tabela 121 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 121: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). Tabela 122 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 122: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ. N°: 4880). EXEMPLO 18 AVALIAÇÃO DE NUE, PRODUÇÃO E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB FERTILIZAÇÃO NORMAL E DE BAIXO NITROGÊNIO EM ENSAIOS DE ESTUFA

[00641] Ensaio 2: Eficiência no Uso de Nitrogênio medida até o estágio de peneiração: biomassa da planta e taxa de crescimento da planta em concetração de nitrogênio ideal e limitada sob condições da estufa - Esse ensaio segue a formação da biomassa da planta e o crescimento da área de roseta de plantas cultivadas em estufa sob condições de cultivo limitantes e não limitantes de nitrogênio. As sementes transgênicas de Arabidopsis foram semeadas em meio de ágar suplementado com Yz de meio MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram, então, transplantadas para bandejas de 1,7 litro preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com um a solução contendo condições limitantes de nitrogênio que foram obtidas irrigando as plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3, suplementadas com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 3,6 mM de KCl, 2 mM de CaCl2 e microelementos, enquanto níveis normais de nitrogênio foram obtidos aplicando uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas em estufa até o estágio de peneiração. A biomassa da planta (o tecido acima da terra) foi pesada indiretamente após colher a roseta (peso fresco da planta [FW]). Em seguida, as plantas foram secadas em um forno a 50°C por 48 horas e pesadas (peso seco da planta [DW]).

[00642] Cada estrutura foi validada em sua

[00643] geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformada por um vetor vazio carregando o promotor 35S e o marcador selecionável foram utilizadas como controle.

[00644] As plantas foram analisadas com relação ao seu tamanho total, taxa de crescimento, peso fresco e matéria seca. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado para controlar as plantas cultivadas em paralelo nas mesmas condições. As plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou sem nenhum gene, no mesmo promotor foram utilizadas como controle.

[00645] O experimento foi planejado na distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene da invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura.

[00646] Formação de imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo de um câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), o qual inclui 4 unidades de luz (lâmpadas 4 x 150 Watts) foi utilizado para capturar imagens de amostras de planta.

[00647] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias, começando no dia 1 após transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores encerradas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas eram de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição das sombras.

[00648] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizado na internet em rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group standard). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00649] Análise da Folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, área de roseta, diâmetro da roseta e área da lâmina foliar.

[00650] Taxa de crescimento vegetal: a taxa de crescimento relativo (RGR) do número de folha (Fórmula VIII, descrita acima), área da roseta (Fórmula IX descrita acima) e cobertura de lote (Fórmula XI, descrita abaixo) foram calculados utilizando as fórmulas indicadas.

[00651] Peso seco e fresco da planta - Por volta do dia 80 a partir da semeadura, as plantas foram colhidas e diretamente pesadas para determinação do peso fresco da planta (FW) e deixadas secar a 50^C em uma câmara de secagem por cerca de 48 horas antes da prensagem para determinar o peso seco da planta (DW).

[00652] Análises Estatísticas - Para identificar os genes que conferem uma significativa melhoria na tolerância ao estresse abiótico, os resultados obtidos a partir de plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos a partir de plantas de controle. Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos testados de transformação independentes foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando teste t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p for menor que 0,1. O pacote de software JMP estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA).

[00653] Os genes listados nas Tabelas 123-124 melhoraram a NUE da planta quando cultivada em níveis de concentração limitantes de nitrogênio. Esses genes produziram plantas maiores com uma área fotossintética e biomassa maiores (peso fresco, peso seco, número de folhas, diâmetro da roseta, área de roseta e cobertura de lote) quando cultivadas sob condições limitantes de nitrogênio (estresse por deficiência de nutriente), comparado às plantas de controle cultivadas em condições de cultivo idênticas. Tabela 123 Genes mostrando a produção de biomassa melhorada da planta em condições de cultivo limitantes de nitrogênio

Tabela 123: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 124 Genes mostrando a produção de biomassa melhorada da planta em condições de cultivo limitantes de nitrogênio

Tabela 124: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.

[00654] Os genes listados na Tabela 125 melhoraram a NUE da planta quando cultivada em níveis de concentração limitantes de nitrogênio. Estes genes produziram plantas com desenvolvimento mais rápido quando cultivadas sob condições de cultivo limitantes de nitrogênio, em comparação com plantas de controle cultivadas sob condições idênticas, conforme medido pela taxa de crescimento do número de folhas, diâmetro da roseta e cobertura do lote. Tabela 125 Genes mostrando o desempenho melhorado de crescimento da roseta em condições de cultivo limitantes de nitrogênio

Tabela 125: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.

[00655] Os genes listados nas Tabelas 126-127 melhoraram a NUE da planta quando cultivada em níveis de concentração de nitrogênio padrão. Esses genes produziram plantas maiores com uma área fotossintética maior e biomassa melhorada (peso fresco, peso seco, número de folhas, diâmetro da roseta, área de roseta e cobertura de lote) quando cultivadas sob condições de nitrogênio padrão, comparado às plantas de controle cultivadas em condições de cultivo idênticas. Tabela 126 Genes mostrando a produção de biomassa melhorada da planta em condições

Tabela 126: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 127 Genes mostrando a produção de biomassa melhorada da planta em condições

Tabela 127: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.

[00656] Os genes listados na Tabela 128 melhoraram a NUE da planta quando cultivada em níveis de concentração de nitrogênio padrão. Estes genes produziram plantas com desenvolvimento mais rápido quando cultivadas sob condições de cultivo limitantes de nitrogênio, em comparação com plantas de controle cultivadas sob condições idênticas, conforme medido pela taxa de crescimento do número de folhas, diâmetro da roseta e cobertura do lote. Tabela 128 Genes mostrando o desempenho melhorado de crescimento da roseta em condições de cultivo de nitrogênio padrão

Tabela 128: “CONT” - Controle; “Méd.” - Média; “% Aum.” = % de aumento; “Val-p” - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. EXEMPLO 19 AVALIAÇÃO DA NUE E PRODUÇÃO DE BRACHYPODIUM TRANSGÊNICA SOB FERTILIZAÇÃO NORMAL E DE BAIXO NITROGÊNIO EM ENSAIOS DE ESTUFA

[00657] Ensaio 1: Eficiência no Uso de Nitrogênio medida da biomassa e da produção da planta em concentração de nitrogênio limitada e ideal sob condições de estufa até o florescimento - Este ensaio segue a formação da biomassa e o crescimento da planta (medido por altura) das plantas que são cultivadas na estufa em condições limitantes e não limitantes (p.ex, normais) de nitrogênio. Sementes transgênicas de Brachypodium foram semeadas em plugues de turfa. As mudas transgênicas T1 foram, então, transplantadas para bandejas de 27,8 X 11,8 X 8,5 cm cheias com turfa e perlite na proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo condições limitantes de nitrogênio, as quais foram alcançadas irrigando as plantas com uma solução contendo 3 mM de nitrogênio inorgânico sob a forma de NH4NO3, suplementado com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 3,6 mM de KCl, 2 mM de CaCl2 e microelementos, enquanto que os níveis normais de nitrogênio foram alcançados por meio da aplicação de uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico, também sob a forma de NH4NO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2, 3,6de mM KCl e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até brotarem. A biomassa da planta (o tecido acima do solo) foi pesada logo após a colheita dos brotos (peso fresco [FW] da planta). Em seguida, as plantas foram secadas em um forno a 70°C durante 48 horas e pesadas (peso seco [DW] da planta).

[00658] Cada estrutura foi validada em sua geração T1. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura formada por um vetor vazio que transporta o marcador selecionável BASTA foram utilizadas como controle (Figura 9B).

[00659] As plantas foram analisadas quanto à sua dimensão total, ao seu peso fresco e à sua matéria seca. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle cultivadas em paralelo sob mesmas condições. Plantas transgênicas falsas sem gene e nenhum promotor foram utilizadas como controle (Figura 9B).

[00660] O experimento foi planejado em blocos e com distribuição de lotes aninhados randomizados dentro deles. Para cada gene da invenção, cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura.

Fenotipagem

[00661] Peso Fresco e Seco da Planta e do Broto - Em ensaios de florescimento, quando o estágio de florescimento foi concluído (cerca de 30 dias após a semeadura), as plantas foram colhidas e pesadas diretamente para a determinação do peso fresco da planta em escalas semianalíticas (0,01 g.) (FW) e deixadas secar a 70°C em uma câmara de secagem por cerca de 48 horas antes do peso para determinar o peso seco da planta (DW).

[00662] Tempo até o Florescimento - Em ambos os ensaios, Maturação de Semente e Florescimento, o florescimento foi definido como a aparência total da primeira espigueta na planta. O tempo até a ocorrência do florescimento é definido pela data em que o florescimento é completamente visível. O tempo para a data de ocorrência do florescimento foi documentado para todas as plantas e, então, o tempo a partir do plantio até o florescimento foi calculado.

[00663] Espessura da folha - Em ensaios de Florescimento, quando um mínimo de 5 plantas por lote em, pelo menos, 90% dos lotes em um experimento foi documentado no florescimento, a medição da espessura da folha foi realizada utilizando um micrômetro na segunda folha abaixo da folha bandeira.

[00664] Altura da Planta - Em ambos os ensaios, Maturação da Semente e Florescimento, uma vez que o florescimento estava completamente visível, a altura da primeira espigueta foi medida a partir do nível do solo até a parte inferior da espigueta.

[00665] Número de perfilhos - Em ensaios de Florescimento, a contagem manual de perfilhos foi realizada por planta após a colheita, antes da ponderação.

EXEMPLO 20 AVALIAÇÃO DA NUE E PRODUÇÃO DE BRACHYPODIUM TRANSGÊNICA SOB FERTILIZAÇÃO NORMAL E DE BAIXO NITROGÊNIO EM ENSAIOS DE ESTUFA

[00666] Ensaio 2: Eficiência no Uso de Nitrogênio medida da biomassa e da produção da planta em concentração de nitrogênio limitada e ideal sob condições de estufa até a Maturação de Sementes - Este ensaio segue a produção da biomassa e produção das plantas que foram cultivadas em estufa sob condições de cultivo limitantes e não limitantes de nitrogênio. Sementes de Brachypodium transgênicas foram semeadas em plugues de turfa. As mudas transgênicas T1 foram, então, transplantadas para bandejas de 27,8 X 11,8 X 8,5 cm cheias com turfa e perlite na proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo condições limitantes de nitrogênio, as quais foram alcançadas pela irrigação das plantas com uma solução contendo 3 mM de nitrogênio inorgânico sob a forma de NH4NO3, suplementado com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 3,6 mM de KCl, 2 mM de CaCl2 e microelementos, enquanto que os níveis normais de nitrogênio foram alcançados por meio da aplicação de uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico, também sob a forma de NH4NO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2, 3,6 mM de KCl e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até a maturação da semente. Cada estrutura foi validada em sua geração T1. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura formada por um vetor vazio que transporta o marcador selecionável BASTA foram utilizadas como controle (Figura 9B).

[00667] As plantas foram analisadas quanto à sua biomassa total, ao seu peso fresco e à sua matéria seca, assim como a um grande número de parâmetros relacionados aos componentes de produção e produção. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado para controlar plantas cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Plantas transgênicas falsas sem gene e nenhum promotor (Figura 9B). O experimento foi planejado em blocos com distribuição de lotes aninhados randomizados dentro deles. Para cada gene da invenção, cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura. Fenotipagem.

[00668] Peso Fresco e Seco da Planta e Vegetal - Em ensaios de Maturação de Sementes, quando o estágio de maturidade foi concluído (cerca de 80 dias após a semeadura), as plantas foram colhidas e pesadas diretamente para a determinação do peso fresco da planta (FW) e deixadas secar a 70°C em uma câmara de secagem por cerca de 48 horas antes do peso para determinar o peso seco (DW) da planta.

[00669] Peso Seco da Espigueta (SDWISpikelets Dry weight) - Em ensaios de Maturação de Sementes, quando o estágio de maturidade foi concluído (cerca de 80 dias após semeadura), as espiguetas foram separadas da biomassa, deixadas secar a 70°C em uma câmara de secagem por cerca de

[00670] 48 horas antes da ponderação para determinar o peso seco das espiguetas (SDW).

[00671] Produção de Grão por Planta - Em ensaios de Maturação de Semente, após a secagem das espiguetas para SDW, as espiguetas foram espalhadas por meio de uma máquina de produção, em seguida, por meio de uma máquina de limpeza, até que as sementes fossem produzidas por lote, em seguida, foram pesadas e a Produção de Grãos por planta foi calculada.

[00672] Número de Grãos - Em ensaios de Maturação de Sementes, depois que as sementes por lote foram produzidas e limpas, as sementes foram espalhadas por meio de uma máquina de contagem e contadas.

[00673] Peso de 1000 Sementes - Em ensaios de Maturação de Sementes, após a produção de sementes, uma fração foi colhida em cada amostra (sementes por lote; ~0,5 g.), contada e fotografada. O peso de 1000 sementes foi calculado.

[00674] Índice de Colheita - Em ensaios de Maturação de Sementes, após a produção de sementes, o índice de colheita foi calculado, dividindo-se a produção de grãos e o peso seco vegetal.

[00675] Tempo até o Florescimento - Em ambos os ensaios, Maturação de Sementes e Florescimento, o florescimento foi definido como a aparição total da primeira espigueta na planta. O tempo para a ocorrência do florescimento é definido pela data em que o florescimento está completamente visível. O tempo para a data de ocorrência do florescimento foi documentado para todas as plantas e, então, o tempo a partir do plantio até o florescimento foi calculado.

[00676] Espessura da folha - Em ensaios de Florescimento, quando, no mínimo, 5 plantas por lote em, pelo menos, 90% dos lotes em um experimento foram documentadas no florescimento, a medição da espessura da folha foi realizada utilizando um micrômetro na segunda folha abaixo da folha bandeira.

[00677] Período de preenchimento do grão - Em ensaios de Maturação da Sementes, a maturação foi definida pela primeira mudança de cor da espigueta + caule na planta de verde a amarelo/marrom.

[00678] Altura da Planta - Em ambos os ensaios, Maturação de Sementes e Florescimento, uma vez que o florescimento estava completamente visível, a altura da primeira espigueta foi medida a partir do nível do solo até a parte inferior da espigueta.

[00679] Número de perfilhos - Em ensaios de Florescimento, a contagem manual dos perfilhos foi realizada por planta após a colheita, antes da pesagem.

[00680] Número de cabeças reprodutivas por planta - Em ensaios de Florescimento, a contagem manual das cabeças por planta foi realizada.

[00681] Análises estatísticas - Para identificar genes que conferem tolerância ao estresse abiótico significativamente melhorada, os resultados obtidos a partir das plantas transgênicas foram comparados com os obtidos a partir de plantas de controle. Para identificar genes e estruturas acima do desempenho, os resultados dos eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o teste t de Student e os resultados foram considerados significativos, se o valor p foi inferior a 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

[00682] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com aplicações específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes aos especialistas na técnica. Consequentemente, ela destina-se a abranger todas essas alternativas, modificações e variações que recaiam no espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.

[00683] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no presente relatório descritivo estão incorporados em sua totalidade por referência no referido relatório descritivo, na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado aqui por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência no presente pedido de patente não deverá ser interpretada como uma admissão de que tal referência esteja disponível como técnica anterior à presente invenção. Na medida em que os títulos da seção são utilizados, eles não deverão ser interpretados como necessariamente limitantes.

Claims

1. Método para aumentar o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento de sementes, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico, e/ou redução do tempo de floração ou tempo de emergência da inflorescência de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula vegetal com um polinucleotídeo tendo uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida por: (i) SEQ ID NO: 118 ou 400, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 613, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 613, (ii) SEQ ID NO: 1782, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3785, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3785, (iii) SEQ ID NO: 1783, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3786, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3786, (iv) SEQ ID NO: 1784 ou 1787, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3787, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3787, (v) SEQ ID NO: 1785, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3788, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3788, (vi) SEQ ID NO: 1786, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3789, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3789, (vii) SEQ ID NO: 1788, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3790, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3790, (viii) SEQ ID NO: 1789, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3791, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3791, (ix) SEQ ID NO: 1790, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3792, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3792, (x) SEQ ID NO: 1791, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3793, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3793, (xi) SEQ ID NO: 1792, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3794, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3794, (xii) SEQ ID NO: 1793, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3795, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3795, (xiii) SEQ ID NO: 1794, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3796, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3796, (xiv) SEQ ID NO: 1795, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3797, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3797, (xv) SEQ ID NO: 1796, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3798, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3798, ou (xvi) SEQ ID NO: 1797, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3799, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3799, em que o referido polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor constitutivo para dirigir a expressão da referida sequência de ácido nucleico em uma célula vegetal, em que a célula vegetal é uma célula vegetal monocotiledônea ou dicotiledônea, e (b) gerar uma planta madura a partir da referida célula vegetal, assim aumentando o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento de sementes, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico, e/ou reduzindo o tempo para a floração ou o tempo para a emergência da inflorescência da planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 118 ou 400, codificando o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 613, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO : 613.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 118, 400 e 1782-1797.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 118 e 400.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de selecionar a referida planta madura para um aumento da eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento de sementes, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é caracterizado ainda por selecionar a referida planta madura por um tempo reduzido para a floração e/ou tempo reduzido para a emergência da inflorescência.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de crescer a referida planta madura sob estresse abiótico.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 7, caracterizado pelo fato de que o estresse abiótico é selecionado do grupo que consiste em: baixa temperatura e deficiência de nitrogênio.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que adicionalmente cresce a referida planta madura sob condições de limitação de nitrogênio.

10. Construto de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que um polinucleotídeo isolado tendo uma sequência de ácidos nucleicos conforme estabelecido por: (i) SEQ ID NO: 118 ou 400, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 613, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 613, (ii) SEQ ID NO: 1782, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3785, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3785, (iii) SEQ ID NO: 1783, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3786, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3786, (iv) SEQ ID NO: 1784 ou 1787, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3787, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3787, (v) SEQ ID NO: 1785, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3788, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3788, (vi) SEQ ID NO: 1786, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3789, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3789, (vii) SEQ ID NO: 1788, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3790, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3790, (viii) SEQ ID NO: 1789, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3791, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3791, (ix) SEQ ID NO: 1790, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3792, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3792, (x) SEQ ID NO: 1791, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3793, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3793, (xi) SEQ ID NO: 1792, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3794, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3794, (xii) SEQ ID NO: 1793, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3795, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3795, (xiii) SEQ ID NO: 1794, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3796, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3796, (xiv) SEQ ID NO: 1795, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3797, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3797, (xv) SEQ ID NO: 1796, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3798, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3798, ou (xvi) SEQ ID NO: 1797, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3799, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3799, e um promotor constitutivo para direcionar a transcrição da referida sequência de ácidos nucleicos em uma célula vegetal, em que o referido promotor constitutivo é heterólogo ao dito polinucleotídeo isolado, em que a célula vegetal é uma célula vegetal monocotiledônea ou dicotiledônea.

11. Construto de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 118 ou 400, codificando o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 613, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 613.

12. Construto de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 118, 400 e 17821797.

13. Construto de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 118 e 400.