BR122019028246B1

BR122019028246B1 - Método para aumentar o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o rendimento das sementes, a eficiência no uso de nitrogênio e/ou a tolerância ao estresse abiótico de uma planta em comparação com uma planta de controle da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de crescimento, e, construção de ácido nucleico

Info

Publication number: BR122019028246B1
Application number: BR122019028246-3A
Authority: BR
Inventors: Noa MATARASSO; Hagai Karchi
Original assignee: Evogene Ltd
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2022-04-26
Also published as: AR091312A1; AU2018204225B2; BR122019028229B1; BR112014021561B1; US9920330B2; BR122019028217B1; MX2014010438A; US11326179B2; WO2013128448A1; BR122019028208B1; AU2020273339A1; US20220282270A1; BR122019028216B1; CA3156374A1; AU2020273339B2; AU2013227247A1; AU2018204225A1; MX355387B; BR122020018472B1; CA2865483C

Abstract

Fornece polinucleotídeos isolados e construção de ácidos nucleicos que compreendem uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1219, 367-5628, 9688-9700, e 9709-9752; e polipeptídeos isolados que compreendem uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80 % homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 220-366, 5629-9400, 97019708, e 9753-9796; ainda fornecidas são as células transgênicas e plantas que expressam as mesmas e metodos para utilizar as mesmas para a produção elevada, taxa de crescimento, biomassa, energia, conteúdo de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade de fibra, eficiência do uso de nitrogênio, e/ou força abiótica de uma planta.

Description

CAMPO DE APLICAÇÃO E HISTÓRICO

[001] A presente invenção, em algumas aplicações respectivas, refere- se aos polipeptídeos e polinucleotídeos isolados, estruturas do ácido nucleico compreendendo os mesmos, células transgênicas compreendendo os mesmos, plantas transgênicas que expressam de forma exógena os mesmos e, mais particularmente, porém não exclusivamente, aos métodos de uso dos mesmos para aumento da produção (p.ex., produção de semente, produção de óleo), biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[002] A produção é afetada por vários fatores, tais como o número e tamanho dos órgãos da planta, arquitetura da planta (p.ex., o número de ramificações), comprimento definido dos grãos, número de grãos cheios, vigor (p.ex., a muda), taxa de crescimento, desenvolvimento da raiz, utilização de água, nutrientes (p.ex., nitrogênio) e fertilizantes e tolerância ao estresse.

[003] Culturas tais como as do milho, arroz, trigo, canola e soja respondem por mais da metade da ingestão calórica total humana, seja através do consumo direto das próprias sementes ou através do consumo de produtos de carne de animais criados com sementes processadas ou forragem. As sementes também são uma fonte de açucares, proteínas e óleos e metabólitos utilizados em processos industriais. A habilidade de aumentar a produção de planta, seja através do aumento da taxa de acúmulo de matéria seca, modificando a celulose ou a composição da lignina, aumento da resistência do caule, aumento do tamanho do meristema, mudança do padrão de ramificação da planta, firmeza das folhas, aumento na eficiência da fertilização, aumento da taxa de acúmulo de matéria seca, modificação do desenvolvimento da semente, melhora do enchimento da semente ou o aumento do teor de óleo, amido ou proteína nas sementes teria muitas aplicações na utilização agrícola e não-agrícola tais como na produção biotecnológica de produtos farmacêuticos, anticorpos ou vacinas.

[004] Os óleos de semente ou vegetais são a fonte principal de energia e nutrição na dieta humana e animal. Eles também são utilizados para a produção de produtos industriais, tais como pinturas, tintas e lubrificantes. Além disso, os óleos da planta representam fontes renováveis de hidrocarbonetos de cadeia longa, os quais podem ser utilizados como combustível. Uma vez que os combustíveis fósseis utilizados atualmente são fontes limitadas e estão sendo esgotadas gradualmente, as safras de biomassa de crescimento rápido podem ser utilizadas como combustíveis alternativos ou para matérias-primas de energia e podem reduzir a dependência dos fornecimentos de energia fóssil. No entanto, o obstáculo principal para o aumento do consumo de óleos de planta como biocombustível é o preço do óleo, o qual ainda é mais alto que o combustível fóssil. Além disso, a taxa de produção do óleo da planta é limitada através da disponibilidade de território agrícola e água. Desse modo, o aumento nas produções de óleo de planta da mesma área de crescimento pode superar efetivamente a escassez no espaço de produção e pode diminuir os preços do óleo vegetal ao mesmo tempo.

[005] Estudos que visam o aumento das produções de óleo de planta focam-se na identificação dos genes envolvidos no metabolismo do óleo, bem como em genes capazes de aumentar as produções de semente e planta nas plantas transgênicas. Genes conhecidos por estar envolvidos no aumento das produções de óleo de planta incluem aqueles que participam na síntese ou captura do ácido graxo, tal como desaturase [por exemplo, DELTA6, DELTA12 ou acil-ACP (Ssi2; Fonte de Informação de Arabidopsis (TAIR; http://www (ponto) arabidopsis (ponto) org/), TAIR N° AT2G43710)], OleosinA (TAIR N°. AT3G01570) ou FAD3 (TAIR N°. AT2G29980) e vários fatores de transcrição e ativadores, tal como Lecl [TAIR N°. AT1G21970, Lotan et al. 1998. Cell. 26;93(7):1195-205], Lec2 [TAIR N°. AT1G28300, Santos Mendoza et al. 2005, FEBS Lett. 579(21):4666-70], Fus3 (TAIR No. AT3G26790), ABI3 [TAIR N°. AT3G24650, Lara et al. 2003. J Biol Chem. 278(23): 21003-11] e Wril [TAIR N°. AT3G54320, Cernac and Benning, 2004. Plant J. 40(4): 575-85].

[006] Esforços da engenharia genética que visam o aumento no teor de óleo nas plantas (por exemplo, em sementes) incluem a regulação ascendente do retículo endoplasmático (FAD3) e plasitidal (FAD7), ácido graxo desaturase em batata (Zabrouskov V., et al., 2002; Physiol Plant. 116:172-185); superexpressando os fatores de transcrição GmDof4 e GmDofll (Wang HW et al., 2007; Plant J. 52:716-29); superexpressando glicerol-3-fosfato desidrogenase em leveduras sob o controle de um promotor específico de planta (Vigeolas H, et al. 2007, Plant Biotechnol J. 5:431-41; Pedido de Patente Norte- Americana N° 20060168684); utilizando genes FAE1 de Arabidopsis e SLC1-1 de leveduras para melhorias no ácido erúcico e teor de óleo em colza (Katavic V, et al., 2000, Biochem Soc Trans. 28:935-7).

[007] Diversos pedidos de patente revelam genes e proteínas que podem aumentar o teor de óleo em plantas. Estes incluem, por exemplo, o Pedido de Patente Norte-Americana N° 20080076179 (proteína de metabolismo lipidico); o Pedido de Patente Norte-Americana N° 20060206961 (polipeptídeo Ypr140w); o Pedido de Patente Norte-Americana N° 20060174373 [síntese de triacilgliceróis que reforçam a proteína (TEP)]; os Pedidos de Patente Norte- Americana N° 20070169219, 20070006345, 20070006346 e 20060195943 (que revelam plantas transgênicas com aumento da eficiência no uso de nitrogênio que podem ser utilizadas para conversão em combustível ou matérias-primas químicas) e o W02008/122980 (polinucleotídeos para aumento do teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, produção e/ou vigor de uma planta).

[008] Uma abordagem comum para promover o crescimento da planta era e continua sendo, o uso dos nutrientes naturais, bem como de nutrientes sintéticos (fertilizantes). Deste modo, os fertilizantes são o combustível por trás da "revolução verde", diretamente responsáveis pelo aumento excepcional do rendimento das culturas nos últimos 40 anos e considerados como a despesa geral número um da agricultura. Por exemplo, fertilizantes inorgânicos a base de nitrogênio, tais como o nitrato de amônio, nitrato de potássio ou ureia, tipicamente correspondem a 40% dos custos associados às culturas, tais como o milho e o trigo. Dos três macronutrientes fornecidos como fertilizantes principais [Nitrogênio (N), Fosfato (P) e Potássio (K)], o nitrogênio frequentemente atua como elemento limitador da taxa no crescimento da planta e todas as áreas de cultura têm uma dependência fundamental dos fertilizantes inorgânicos a base de nitrogênio. 0 nitrogênio é responsável pela biossíntese do amido e ácidos nucleicos, grupos protéticos, hormônios da planta, defesas químicas da planta, etc., e normalmente precisa ser reposto todo ano, particularmente para os cereais, que compreendem mais da metade das áreas cultivadas em todo o mundo. Deste modo, o nitrogênio é translocado para o broto, onde é armazenado nas folhas e no caule durante a etapa rápida de desenvolvimento da planta, e, por conseguinte, até que floresça. No milho, por exemplo, as plantas acumulam o volume de seu nitrogênio orgânico durante o período da germinação do grão e até que floresça. Uma vez que a fertilização da planta ocorre, os grãos começam a se formarem e a se tornarem o receptáculo principal do nitrogênio da planta. 0 nitrogênio armazenado pode ser, então, redistribuído a partir das folhas e do caule que serviram como compartimentos de armazenagem até a formação do grão.

[009] Como o fertilizante se esgota rapidamente na maioria dos tipos de solo, este deve ser fornecido às culturas em crescimento duas ou três vezes durante a época de crescimento. Além disso, a baixa eficiência no uso de nitrogênio (NUE 1 nitrogen use efficiency) das principais culturas (por exemplo, na faixa de somente 30-70%) afeta de modo negativo as despesas de investimento do fazendeiro por conta do excesso de fertilizante aplicado. Além disso, os usos excessivos e ineficientes de fertilizantes são os principais fatores responsáveis por problemas ambientais, tais como eutrofização das águas subterrâneas, de lagos, rios e mares e poluição por nitrato em água potável, o que pode causar metemoglobinemia, poluição por fosfato, poluição atmosférica e similares. Contudo, a despeito do impacto negativo dos fertilizantes no meio ambiente e dos limites de uso de fertilizantes que foram controlados por lei em vários países, espera-se que o uso de fertilizantes aumente, a fim de apoiar a produção de alimentos e de fibras devido ao rápido crescimento populacional e aos recursos limitados da terra. Por exemplo, estima-se que até 2050, mais de 150 milhões de toneladas de fertilizantes a base de nitrogênio sejam utilizadas em todo o mundo por ano.

[0010] O aumento da eficiência no uso de nitrogênio pelas plantas deve viabilizar o cultivo das culturas com um investimento mais baixo em fertilizantes, ou, alternativamente, o cultivo em solos de qualidade inferior e, assim, ter um impacto econômico significativo tanto nos sistemas desenvolvidos de agricultura quanto nos sistemas em desenvolvimento.

[0011] O aprimoramento genérico da eficiência no uso de fertilizantes (FUE 1 fertilizer use efficiency) nas plantas pode ser gerado ou através da reprodução tradicional ou por engenharia genética.

[0012] Tentativas de geração de plantas com FUE melhorada foram descritas no N° de Pedido de Patente Americano 20020046419, de Choo, et al.; N° de Pedido de Patente Americano 20050108791, de Edgerton et al.; N° de Pedido de Patente Americano 20060179511, de Chomet et al.; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); e Good AG et al. 2004 (Trends Plant Sci. 9:597-605).

[0013] Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004 101:78338) descreve plantas transgênicas Dofl que apresentam um crescimento melhorado sob condições de baixo nível de nitrogênio.

[0014] 0 N° de Patente Americano 6.084.153, de Good et al. divulga o uso de um promotor sensível ao estresse para controlar a expressão da Alanina Aminotransferase (AlaAT 1 Alanine Amine Transferase) e das plantas de canola transgênica com resistência à seca e deficiência de nitrogênio melhorada quando comparadas às plantas de controle.

[0015] Condições de estresse abiótico (ABS I Abiotic stress; também conhecido como "estresse ambiental") tais como salinidade, seca, inundação, temperatura subaproveitada e poluição química tóxica, causam danos substanciais às plantas agrícolas. A maioria das plantas desenvolveu estratégias para se proteger contra essas condições. No entanto, se a gravidade e a duração das condições do estresse forem grandes demais, os efeitos no desenvolvimento da planta, no crescimento e na produção da maioria das espécies vegetais são profundos. Além disso, a maioria das espécies vegetais é altamente suscetível ao estresse abiótico e, portanto, exigem condições de crescimento ideal para as safras da cultura comercial. A exposição contínua ao estresse causa alterações importantes no metabolismo vegetal que em última análise, leva à morte celular e, consequentemente, gera perdas.

[0016] A seca é um fenômeno gradual, que envolve períodos de tempo anormalmente secos que duram o suficiente para produzir desequilíbrios hidrológicos sérios, como danos à cultura, falta de abastecimento de água e aumento da suscetibilidade a várias doenças. Em casos graves, a seca pode durar muitos anos e resulta em efeitos devastadores na agricultura e abastecimento de água. Além disso, a seca está associada com o aumento da suscetibilidade a várias doenças.

[0017] Para a maioria das plantas de cultivo, as regiões de plantio do mundo são muito áridas. Além disso, o uso excessivo de água disponível resulta em maior perda de terra agricultural utilizável (desertificação), e aumento da acumulação de sal em solos adiciona à perda de água disponível em solos.

[0018] A salinidade, níveis elevados de sal, afeta um em cada cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco principais culturas alimentares, i.e. trigo, milho, arroz, batatas e soja, consegue tolerar o excesso de sal. Os efeitos prejudiciais do sal sobre as planta resulta tanto da deficiência de água, que leva ao estresse osmótico (semelhante ao estresse causado pela seca), quanto do efeito do excesso de ions de sódio sobre processos bioquímicos importantes. Assim como o congelamento e a seca, quantidades elevadas de sal causam déficit de água; e a presença de níveis elevados de sal torna difícil para as raízes das plantas extraírem água de seu ambiente. A salinidade do solo, portanto, é uma das variáveis mais importantes que determinam se uma planta pode prosperar. Em muitas partes do mundo, áreas de terra consideráveis são incultiváveis devido à salinidade do solo ser naturalmente alta. Assim, a salinização dos solos que são usados para a produção agrícola é um problema significativo e crescente nas regiões que dependem fortemente da agricultura e está a agravar-se pelo excesso de utilização, excesso de fertilização e escassez de água, geralmente causado por alterações climáticas e pelas demandas do aumento da população. A tolerância ao sal é de particular importância no início do ciclo de vida da planta, já que a evaporação da superfície do solo faz com que o movimento ascendente de água e sal se acumule na camada superior do solo, onde as sementes são colocadas. Por outro lado, a germinação normalmente ocorre em uma concentração de sal que é maior do que o nível médio de sal em todo o perfil do solo.

[0019] A transdução do sinal de estresse do sal e da seca consiste em caminhos de sinalização da homeostase iônica e osmótica. 0 aspecto iônico do estresse do sal é sinalizado através do caminho SOS, onde um complexo de quinase de proteína S0S3-S0S2 responsiva a cálcio controla a expressão e a atividade dos transportadores de íons, como o SOS1. 0 componente osmótico do estresse de sal envolve reações complexas da planta que se sobrepõem com respostas de estresse da seca e/ou do frio.

[0020] As temperaturas subótimas afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta durante todo o seu ciclo de vida. Dessa forma, baixas temperaturas reduzem a taxa de germinação e temperaturas elevadas resultam na necrosa da folha. Além disso, plantas maduras expostas ao excesso de calor podem experimentar o choque de calor, que pode surgir em vários órgãos, incluindo as folhas e, principalmente, os frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse causado pelo calor. 0 calor também danifica as estruturas celulares, incluindo as organelas e o citoesqueleto e prejudica a função da membrana. 0 choque de calor pode produzir uma diminuição na síntese geral das proteínas, acompanhada pela expressão de proteínas de choque de calor, por exemplo, as chaperonas, que estão envolvidas no rearranjo das proteínas desnaturadas pelo calor. 0 dano causado pela alta temperatura ao pólen quase sempre ocorre em conjunto com o estresse causado pela seca e, raramente, ocorre sob boas condições de irrigação. 0 estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta de novas maneiras. Condições de frio excessivo, por exemplo, temperaturas baixas, mas acima do ponto de congelamento, afetam as culturas de origem tropical, como a soja, o arroz, milho e o algodão. 0 dano típico causado pelo frio inclui emurchecimento, a necrose, a clorose ou perda de ions das membranas celulares. Os mecanismos subjacentes de sensibilidade ao frio não são completamente compreendidos ainda, mas provavelmente envolvem o nível de saturação de membrana e outras deficiências fisiológicas. Condições de luz excessiva, que ocorrem sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites frias do final do verão/outono, podem levar à fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese). Além disso, o frio pode levar a perdas de produção e à qualidade inferior do produto através do amadurecimento tardio do milho.

[0021] Aspectos comuns da seca, resposta ao estresse do frio e sal [Revisto em Xiong e Zhu (2002) Plant Cell Environ. 25:131-139] incluem: (a) alterações transitórias nos níveis de cálcio citoplasmático prévio no evento de sinalização; (b) sinal de transdução através de quinase de proteína dependente de cálcio (CDPK's 1 calcium dependent protein kinases) e/ou ativada por mitógeno e fosfatases da proteína; (c) aumentos nos níveis de ácido abscísico em resposta ao estresse, desencadeando um subconjunto das respostas; (d) fosfatos de inositol como moléculas de sinal (pelo menos para um subconjunto das alterações transitórias responsivas ao stress; (e) ativação de fosfolipases, que por sua vez, geram um leque diversificado de moléculas do segundo mensageiro, alguns dos quais podem regular a atividade das quinases responsivos ao stress; (f) a indução dos genes do tipo abundantes na embriogênese tardia (LEA 1 late embryogenesis abundant), incluindo os genes responsivos CR/RD CRT/DRE; (g) aumento dos níveis de antioxidantes e osmólitos compatíveis como prolina e açúcares solúveis; e (h) a acumulação de espécies reativas de oxigênio, como superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila. A biossíntese do ácido abscísico é regulada por estresse osmótico em várias etapas. A sinalização do estresse osmótico, tanto dependente da ABA quanto independente, modificam primeiramente os fatores de transcrição constitutivamente expressos, levando à expressão dos ativadores transcricionais de resposta prévia, que em seguida, ativam os genes efetores de tolerância ao estresse a jusante.

[0022] Vários genes que aumentam a tolerância ao estresse do frio ou sal também podem melhorar a proteção ao estresse de seca, incluindo, por exemplo, o fator de transcrição AtCBF/DREB1, OsCDPK7 (Saijo et al. 2000, Plant J. 23: 319-327) ou AVP1 (a vacuolar pyrophosphatase-proton pump, Gaxiola et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11444-11449).

[0023] Estudos demonstraram que adaptações da planta a condições ambientais adversas são traços genéticos complexos de natureza poligênica. Meios convencionais de cultura e melhoras de horticulturas utilizam técnicas de melhoramento seletivas para identificar plantas que apresentem características desejáveis. No entanto, o melhoramento seletivo é tedioso, consome tempo e apresenta resultado imprevisível. Além disso, recursos germoplasmáticos limitados para melhora da produção e a incompatibilidade nos cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionadas representam problemas significativos encontrados no melhoramento convencional. Avanços na engenharia genética permitiram que o homem modificasse o germoplasma das plantas pela expressão de genes de interesse nas plantas. Essa tecnologia tem a capacidade de gerar culturas ou plantas com traços econômicos, agronômicos ou horticulturais melhorados.

[0024] Os esforços da engenharia genética, focados em conferir tolerância ao estresse abiótico às culturas transgênicas, foram descritos em várias publicações [Apse e Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13:146-150, 2002), Quesada et al. (Plant Physiol. 130:951-963, 2002), Holmstrom et al. (Nature 379: 683-684, 1996), Xu et al. (Plant Physiol 110: 249-257, 1996), Pilon-Smits and Ebskamp (Plant Physiol 107: 125-130, 1995) e Tarczynski et al. (Science 259: 508510, 1993)].

[0025] Várias patentes e pedidos de patente divulgam os genes e as proteínas que podem ser utilizados para aumentar a tolerância das plantas ao estresse abiótico. Estas incluem, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas N° 5.296.462 e 5.356.816 (para aumentar a tolerância ao estresse ao frio); a Patente Norte-Americana N° 6.670.528 (para aumentar a ABST); a Patente Norte- Americana N° 6.720.477 (para aumentar a ABST); N° de Série de Pedido de Patente Norte-Americana 09/938842 e 10/342224 (para aumentar a ABST); N° de Série de Pedido de Patente Norte-Americana 10/231035 (para aumentar a ABST); W02004/104162 (para aumentar a ABST e biomassa); W02007/020638 (para aumentar a ABST, biomassa, vigor e/ou produção); W02007/049275 (para aumentar a ABST, biomassa, vigor e/ou produção); W02010/076756 (para aumentar a ABST, biomassa e/ou produção);. W02009/083958 (para aumentar a eficiência no uso da água, eficiência no uso de fertilizantes, tolerância ao estresse biótico-abiótico, produção e/ou biomassa); W02010/020941 (para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, produção e/ou biomassa); W02009/141824 (para aumentar a utilidade da planta); W02010/049897 (para aumentar a produção da planta).

[0026] A deficiência de nutrientes causa adaptações da arquitetura da raiz, particularmente notável, por exemplo, é a proliferação da raiz dentro de áreas ricas em nutrientes para aumentar a absorção dos nutrientes. A deficiência de nutrientes causa, também, a ativação de caminhos metabólicos da planta que maximizam os processos de absorção, assimilação e distribuição como pela ativação de mudanças da arquitetura. A engenharia da expressão dos genes desencadeados pode fazer com que a planta mostre as mudanças em sua arquitetura e o metabolismo melhorado, também, sob outras condições.

[0027] Além disso, é amplamente conhecido que as plantas geralmente respondem à deficiência de água criando um sistema de raízes mais profundas que permitem o acesso à umidade localizada em camadas mais profundas do solo. 0 desencadeamento desse efeito permitirá às plantas acessarem os nutrientes e a água localizados em horizontes mais profundos do solo, particularmente, aqueles prontamente dissolvidos na água, como os nitratos.

[0028] 0 algodão e subprodutos do algodão fornecem matérias-primas que são utilizadas para produzir uma grande variedade de produtos com base nos consumidores, além de têxteis, incluindo gêneros alimentícios do algodão, ração animal, fertilizante e papel. A produção, comercialização, consumo e comércio de produtos baseados em algodão geram um excesso de 100 bilhões de dólares anualmente apenas nos EUA, fazendo do algodão a cultura número um em termos de valor acrescentado.

[0029] Apesar de 90% do valor do algodão como uma cultura residir na fibra (fiapo) , a produção e qualidade da fibra diminuiu devido à erosão geral na diversidade genética de variedades de algodão e uma vulnerabilidade acrescida da cultura às condições ambientais.

[0030] Existem muitas variedades de algodoeiros, das quais fibras de algodão com uma gama de características podem ser obtidas e utilizadas para várias aplicações. As fibras de algodão podem ser caracterizadas de acordo com uma variedade de propriedades, algumas das quais são consideradas altamente desejáveis dentro da indústria têxtil para a produção de produtos de qualidade cada vez mais alta exploração otimizada de tecnologias de fiação modernas. Propriedades comercialmente desejáveis incluem comprimento, uniformidade do comprimento, finura, relação de maturidade, produção reduzida da fibra, micronário, resistência do feixe resistência da fibra única. Muito esforço tem sido posto na melhoria das características das fibras de algodão, principalmente focando o comprimento da fibra e a finura da fibra. Em particular, há uma grande demanda de fibras de algodão de comprimentos específicos.

[0031] Uma fibra de algodão é composta de uma única célula que se diferenciou de uma célula epidérmica da cobertura da semente, desenvolvendose através de quatro estágios, ou seja, iniciação, alongamento, estágios de espessamento e maturação de parede celular secundária. Mais especificamente, o alongamento de uma fibra de algodão começa na célula epidérmica do óvulo imediatamente após o florescimento, depois do qual a fibra de algodão rapidamente se alonga por cerca de 21 dias. 0 alongamento da fibra é então finalizado, e uma parede celular secundária é formada crescida através de maturação, tornando-se uma fibra de algodão madura.

[0032] Vários genes candidatos que estão associados ao alongamento, à formação, à qualidade e à produção das fibras de algodão foram divulgados em vários pedidos de patentes, tais como a Patente Norte-Americana N° 5.880.100 e N° de Série de Pedido de Patente Norte-Americana 08/580.545, 08/867.484 e 09/262.653 (que descrevem os genes envolvidos na fase de alongamento da fibra de algodão); W00245485 (que melhoram a qualidade da fibra, modulando a sintase de sacarose); Patentes Norte-Americanas N° 6.472.588 e W00117333 (que aumentam a qualidade da fibra por transformação com sintase de codificação de fosfato de sacarose do DNA); W09508914 (que utiliza um promotor específico da fibra e uma sequência de codificação que codifica a peroxidase de algodão); W09626639 (que utiliza uma sequência de promoção específica do ovário para expressar o crescimento da planta, modificando os hormônios no tecido do óvulo do algodão, alterando características de qualidade da fibra, tais como dimensão de fibra e força); Patente Norte-Americana N° 5.981.834, Patente Norte-Americana N° 5.597.718, Patente Norte-Americana N° 5.620.882, Patente Norte-Americana N° 5.521.708 e Patente Norte-Americana N° 5.495.070 (sequências de codificação para alterar as características das plantas que produzem fibras transgênicas); Pedido de Patente Norte-Americana N° 2002049999 e Patente Norte-Americana N° 2003074697 (que expressam um código genético para transferase endoxiloglucana, catalase ou peroxidase para melhorar as características da fibra de algodão); WO 01/40250 (que melhora a qualidade da fibra do algodão, modulando a expressão genética do fator de transcrição); WO 96/40924 (uma região reguladora da iniciação transcricional da fibra de algodão associada, a qual é expressa em fibra de algodão); EP0834566 (um gene que controla o mecanismo de formação da fibra no algodoeiro); W02005/121364 (que melhora a qualidade da fibra do algodão, modulando a expressão do gene); W02008/075364 (que melhora a tolerância de qualidade, produção/biomassa/vigor e/ou estresse abiótico da fibra das plantas).

[0033] A publicação WO N° 2004/104162 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas geradas deste modo.

[0034] A publicação WO N° 2004/111183 divulga sequências de nucleotídeos para regular a expressão do gene em tricomas e estruturas de plantas e métodos utilizando os mesmos.

[0035] A publicação WO N° 2004/081173 divulga novas sequências e estruturas regulatórias derivadas da planta e métodos de utilização de tais sequências para direcionar a expressão das sequências de polinucleotídeo exógeno nas plantas.

[0036] A publicação WO N° 2005/121364 revela polinucleotídeos e polipeptídeos envolvidos no desenvolvimento de fibras vegetais e método de uso dos mesmos, a fim de aumentar a qualidade das fibras, a produção e/ou biomassa de uma planta produtora de fibras.

[0037] A publicação WO N° 2007/049275 revela polipeptídeos isolados, polinucleotídeos que codificam os mesmos, plantas transgênicas que expressam os mesmos e método de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de fertilizantes, a tolerância ao estresse abiótico da planta e biomassa.

[0038] A publicação WO N° 2007/020638 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas e plantas geradas desse modo.

[0039] A publicação WO N° 2008/122980 revela estruturas de genes e métodos para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento e biomassa de plantas.

[0040] A publicação WO N° 2008/075364 revela polinucleotideos envolvidos no desenvolvimento da fibra da planta e métodos de uso dos mesmos.

[0041] A publicação WO N° 2009/083958 revela métodos para aumentar a eficiência no uso de água, eficiência no uso de fertilizantes, tolerância ao estresse biótico/abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.

[0042] A publicação WO N° 2009/141824 revela polinucleotídeos isolados e métodos para uso dos mesmos para aumentar a utilidade da planta.

[0043] A publicação WO N° 2009/013750 revela genes, estruturas e métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, biomassa e/ou produção em plantas geradas desse modo.

[0044] A publicação WO N° 2010/020941 revela métodos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.

[0045] A publicação WO N° 2010/076756 divulga polinucleotídeos isolados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

[0046] A publicação W02010/100595 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.

[0047] A publicação WO N° 2010/049897 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso de nitrogênio.

[0048] A publicação W02010/143138 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água.

[0049] A publicação WO N° 2011/080674 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso de nitrogênio.

[0050] A publicação W02011/015985 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos para aumentar as qualidades desejáveis da planta.

SUMÁRIO

[0051] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, 80% homólogo (por exemplo, idêntico) à ID SEQ. N° [Identificação de Sequência N°]: 362-601, 2429-4085 ou 4086, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.

[0052] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.

[0053] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para produzir uma colheita compreendendo o crescimento de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, 80% homólogo (por exemplo, idêntico) à sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086, caracterizado pela planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso do nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, desta forma, a colheita.

[0054] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica à ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 ou 2428, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.

[0055] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-361, 602-30 2427 e 2428, aumentando, desta forma, a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico da planta.

[0056] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para produzir uma colheita compreendendo o crescimento de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotfdeo exógeno, o qual compreende uma sequência de ácido nucleico, a qual é, pelo menos, 80% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 e 2428, caracterizado pela referida planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento de vigor, aumento do teor de óleo, aumento da produção de semente, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso do nitrogênio, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, desta forma, a colheita.

[0057] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, o qual compreende uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80% homóloga (por exemplo, idêntica) à sequência de aminoácido estabelecida na ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 ou 4086, caracterizado pela sequência de aminoácido ser capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta.

[0058] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, o qual compreende a sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086.

[0059] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica à ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 ou 2428, caracterizado pela sequência de ácido nucleico ser capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta.

[0060] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 e 2428.

[0061] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

[0062] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80% homóloga (por exemplo, idêntica) à ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 ou 4086, caracterizado pela sequência de aminoácido ser capaz de aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso do nitrogênio, e/ou estresse abiótico de uma planta.

[0063] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086.

[0064] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena polinucleotídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invençãoo, ou a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.

[0065] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena polipeptídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.

[0066] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086.

[0067] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico é selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 e 2428.

[0068] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo consiste da sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 e 2428.

[0069] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086.

[0070] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula da planta forma parte de uma planta.

[0071] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno em estresse abiótico.

[0072] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o estresse abiótico é selecionado de um grupo consistindo de salinidade, seca, estresse osmótico, privação de água, inundação, etiolação, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.

[0073] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a produção compreende a produção de semente ou produção de óleo.

[0074] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido uma planta transgênica, compreendendo a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, ou a célula de planta de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.

[0075] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno sob condições limitantes de nitrogênio.

[0076] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.

[0077] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de cultivo de uma cultura, o método compreendendo a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção ou a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas a partir de, pelo menos, uma característica selecionada a partir do grupo consistindo em: aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade da fibra e aumento do teor de óleo em comparação a uma planta não transformada, aumentando, desse modo, a colheita.

[0078] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem de base genética idêntica.

[0079] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem da mesma espécie.

[0080] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta não transformada é cultivada sob condições de cultivo idênticas.

[0081] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados aqui apresentam o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual o presente pedido de patente de invenção refere-se. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou no teste das aplicações do presente pedido de patente de invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflito, o quadro reivindicatório da patente, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0082] Algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção são descritas aqui, apenas como exemplos, com referência aos desenhos anexos. Agora, com referência específica aos desenhos em detalhes, enfatiza-se que as particularidades mostradas são exemplares e para os propósitos de discussão ilustrativa das aplicações do presente pedido de patente de invenção. Nesse sentido, a descrição que acompanha os desenhos torna aparente àqueles com habilidade na técnica como as aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser praticadas.

[0083] Nos desenhos: A Figura 1 é uma ilustração esquemática de um plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 4111) e o GUSintron (pQYN 6669) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; MCS - Sítio de clonagem múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron o gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron). As sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção foram clonadas no vetor enquanto substituíam o gene repórter GUSintron.

[0084] A Figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 4111) (pQFN ou pQFNc) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção. RB [right border] - borda direita do T- DNA; LB [left border] - borda esquerda do T-DNA; MCS [multiple cloning site]- Local de clonagem múltipla; RE [restriction enzyme] - qualquer enzima de restrição; NOS pro [nopalinha synthase promoter] = promotor da nopalina sintase; NPT-II [neomycin phosphotransferase] = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter [nopalinha synthase terminator] = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação). As sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção foram clonadas no MCS do vetor.

[0085] As Figuras 3A-F são imagens que descrevem a visualização do desenvolvimento da raiz de plantas transgênicas de forma exógena expressando o polinucleotídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção quando cultivadas em placas de ágar transparentes sob condições normais (Figuras 3A-B), estresse osmótico (15% de PEG. Figs. 3C-D) ou limitação de nitrogênio (Figuras 3E-F). Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de ágar transparente por 17 dias (7 dias de viveiro e 10 dias após a transplantação). As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias iniciando no dia 1 após a transplantação Fig. 3A - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar quando cultivadas sob condições normais (padrão). Fig. 3B - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3A na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Fig. 3C - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de Agar, cultivadas sob condições altamente osmóticas (PEG 15%). Fig. 3D - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3C na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Fig. 3E - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar, cultivadas sob condições de baixo teor de nitrogênio. Fig. 3F - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3E na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas.

[0086] A Figura 4 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o Promotor de Raiz (pQNa RP) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T- DNA; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação; as sequências do polinucleotídeo isolado, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, foram clonadas no MCS [Local de clonagem múltipla] do vetor.

[0087] A Figura 5 é uma ilustração esquemática do plasmideo pQYN.

[0088] A Figura 6 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFN.

[0089] A Figura 7 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFYN.

[0090] A Figura 8 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário modificado pGI (pQXNc) utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção. RB - T-DNA borda direita; LB - T-DNA borda esquerda; NOS pro = promotor de nopalina sintase; NPT-II = gene de neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador de nopalina sintase; RE = qualquer enzima de restrição; sinal de Poli-A (sinal de poliadenilação); 35S - o promotor 35S (pqfnc; ID SEQ. N° 4107). As sequências de polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção foram clonadas no MCS (local de clonagem múltipla) do vetor.

DESCRIÇÃO DAS APLICAÇÕES ESPECÍFICAS

[0091] O presente pedido de patente de invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se à polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, estruturas de ácido nucleico que codificam os mesmos, células que expressam os mesmos, plantas transgênicas que expressam os mesmos e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de nitrogênio e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0092] Antes de explicar, pelo menos, uma aplicação do presente pedido de patente de invenção em detalhes, deve ser entendido que o presente pedido de patente de invenção não é necessariamente limitado em sua aplicação aos detalhes estabelecidos a seguir, seja na descrição ou exemplificado pelos Exemplos. 0 presente pedido de patente de invenção é capaz de outras aplicações, ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras.

[0093] Os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser utilizados para gerar estruturas de ácido nucleico, plantas transgênicas e aumentar a produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.

[0094] Assim, conforme mostrado na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores utilizaram ferramentas de Bioinformática para identificar polinucleotídeos que melhoram a produção (por exemplo, produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta. Genes que afetam o traço de interesse foram identificados com base em perfis de expressão de genes de vários ecotipos de Arabidopsis, tomate, B. Juncea, Sorgo, Soja, algodão e Brachypodium, variedades e acessos em diversos tecidos e sob várias condições de cultivo, homologia com genes conhecidos por afetar o traço de interesse e uso do perfil de expressão digital em tecidos e condições específicos (Tabelas 153, Exemplos 1-12). Polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos (por exemplo, ortólogos) tendo a mesma função também foram identificados (Tabela 54, Exemplo 13). Plantas transgênicas superexpressando os polinucleotídeos identificados foram tidas como expoentes do aumento de produção da semente, produção do óleo, biomassa, vigor, área fotossintética, matéria seca, índice de colheita, taxa de crescimento, área da roseta, porcentagem de óleo na semente e peso de 1000 sementes (Tabelas 56-69; Exemplos de 15-17). Em conjunto, estes resultados sugerem o uso dos novos polinucleotídeos e polipeptideos do presente pedido de patente de invenção para aumentar a produção (incluindo a produção do óleo, produção de semente e conteúdo de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção e/ou qualidade da fibra, eficiência no uso de nitrogênio e/ou tolerância de estresse abiótico de uma planta.

[0095] Assim, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso do nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar na planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homólogo à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086, aumentado, desse modo, a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso do nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0096] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção da planta" refere-se ao montante (por exemplo, conforme determinado por peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por plantas ou por estação de crescimento. Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o benefício econômico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo.

[0097] E importante observar que a produção da planta pode ser afetada por vários parâmetros, incluindo, mas não se limitando à biomassa da planta; vigor da planta; taxa de crescimento; produção de sementes; quantidade de sementes ou grãos; qualidade da semente ou grão; produção de óleo; teor de óleo, amido e/ou proteína em órgãos colhidos (por exemplo, sementes ou partes vegetais da planta); número de flores (florzinhas) por panícula (expressado como uma proporção do número de sementes preenchidos sobre o número de panículas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área; número de plantas por área de crescimento (densidade); número de órgãos colhidos em campo; área total da folha; assimilação de carbono e particionamento de carbono (a distribuição/alocação de carbono dentro da planta); resistência à sombra; número de órgãos coletáveis (por exemplo, sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [como aumento do diâmetro do caule, espessura ou melhoria das propriedades físicas (por exemplo, elasticidade)].

[0098] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção de semente" refere-se ao número ou ao peso das sementes por planta, sementes por vagem ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, a produção de semente pode ser afetado pelas dimensões da semente (por exemplo, comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), pelo número de sementes (cheias) e pela taxa de enchimento da semente e pelo teor de óleo da semente. Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o benefício econômico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo; e o aumento da produção de semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando a produção de semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas cultivadas em uma determinada área.

[0099] O termo "semente" (também referido como "grão" ou "núcleo"), conforme utilizado aqui, refere-se a uma planta embriônica pequena confinada em uma cobertura chamada de revestimento de semente (normalmente com algum alimento armazenado), o produto do óvulo amadurecido de plantas gimnosperma e angiosperma que ocorre após a fertilização e algum crescimento dentro da planta mãe.

[00100] A expressão "teor de óleo", conforme utilizada aqui, refere-se à quantidade de lipídeos de um determinado órgão da planta, sejam as sementes (teor de óleo da semente) ou a porção vegetal da planta (teor de óleo vegetal) e é expressa como um percentual de peso seco (10% de umidade das sementes) ou peso úmido (para a porção vegetal).

[00101] Deve-se observar que o teor de óleo é afetado pela produção intrínseca de óleo de um tecido (por exemplo, semente, parte vegetal), bem como a massa ou tamanho do tecido de produção de óleo por planta ou por período de crescimento.

[00102] Em uma aplicação, o aumento do teor de óleo da planta pode ser atingido aumentando o tamanho/massa de tecido(s) de uma planta, que compreende o óleo por período de cultivo. Dessa forma, o aumento do teor de óleo de uma planta pode ser alcançado aumentando a produção, a taxa de crescimento, a biomassa e o vigor da planta.

[00103] Conforme utilizada aqui, a expressão "biomassa da planta" refere-se à quantidade (por exemplo, medida em gramas de tecido secado pelo ar) de um tecido produzido a partir da planta em um período de cultivo, que também pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por área de cultivo. Um aumento da biomassa da planta pode ocorrer em toda a planta ou em partes dela como partes acima do nível do solo (passível de colheita), biomassa vegetal, raízes e sementes.

[00104] Conforme utilizada aqui, a expressão "taxa de crescimento" refere-se ao aumento do tamanho do órgão/tecido da planta por período (pode ser medido em cm2 por dia).

[00105] Conforme utilizada aqui, a expressão "vigor da planta" refere-se à quantidade (medida pelo peso) ou tecido produzido pela planta em um determinado período. Portanto o aumento do vigor pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por período de cultivo ou por área de cultivo. Além disso, o vigor prematuro (semente e/ou muda) resulta em melhor posição no campo.

[00106] Melhorar o vigor precoce é um objetivo importante de modernos programas de reprodução de arroz em cultivares de arroz temperado e tropical. Raízes longas são importantes para fixação adequada do solo em arroz pré- germinado. Quando o arroz é diretamente semeado em campos alagados e onde as plantas devem emergir rapidamente através da água, brotos mais longos são associados com vigor. Onde a semeadura de perfuração é praticada, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para bom surgimento das mudas. A habilidade de projetar vigor precoce nas plantas seria de grande importância na agricultura. por exemplo, baixo vigor precoce tem sido uma limitação na introdução do milho (Zea mays L.) híbrido com base no germoplasma do Cinturão do Milho na Atlântica Europeia.

[00107] Deve-se observar que uma produção de planta pode ser determinada sob estresse (por exemplo, estresse abiótico, condições limitantes de nitrogênio) e/ou condições de não estresse (normal).

[00108] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições de não estresse" refere-se às condições de crescimento (por exemplo, água, temperatura, ciclos claro-escuro, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutriente tal como nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que não significativamente vão além das condições climáticas diárias e outras abióticas que as plantas podem encontrar e que permitem o crescimento ideal, metabolismo, reprodução e/ou viabilidade de uma planta em qualquer estágio em seu ciclo de vida (por exemplo, em uma planta de cultura da semente para uma planta madura e de volta para a semente novamente). Os técnicos no assunto estão cientes das condições normais do solo e climáticas para uma dada planta em uma dada localização geográfica. Deve ser notado que enquanto as condições de não estresse podem incluir algumas variações suaves das condições ideais (que variam de um tipo/espécie de uma planta para outra), tais variações não fazem com que a planta cesse o crescimento sem a capacidade de retomar o crescimento.

[00109] A expressão "estresse abiótico", conforme utilizada aqui, refere- se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, o crescimento, a reprodução e/ou a viabilidade da planta. Consequentemente, o estresse abiótico pode ser induzido por condições de crescimento ambiental subótimas como, por exemplo, salinidade, privação de água, inundação, congelamento, temperatura baixa ou elevada, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou irradiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção Histórico.

[00110] A expressão "tolerância ao estresse abiótico", conforme utilizada aqui, refere-se à capacidade de uma planta de resistir a um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.

[00111] As plantas são submetidas a uma gama de desafios ambientais. Diversos desses, incluindo estresse salino, estresse osmótico geral, estresse árido e estresse de congelamento, têm a habilidade de impactar a planta total e disponibilidade de água celular. Não é de surpreender, então, as respostas da planta a essa coleção de estresses são relacionados. Zhu (2002) Ann. Rev. Planta Biol. 53: 247273 et al. Observe que "a maioria dos estudos na sinalização de estresse hídrico focou no estresse salino primariamente porque as respostas da planta ao sal e estiagem estão intimamente relacionadas e os mecanismos se sobrepõem". Muitos exemplos de respostas similares e caminhos para esse conjunto de estresses foram documentados. For exemplo, os fatores de transcrição de CBF demonstraram condicionamento de resistência ao sal, congelamento e estiagem (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). O gene Arabidopsis rd29B é induzido em resposta ao estresse de sal e desidratação, um processo que é mediado amplamente através de um processo de transdução de sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97: 11632-11637), resultando em atividade alterada de fatores de transcrição que se ligam a um elemento a montante dentro do promotor rd29B. Em Mesembryanthemum crystallinum (planta de gelo), Patharker e Cushman mostraram que uma proteína cinase dependente do cálcio (McCDPK1) é induzida pela exposição aos estresses de estiagem e sal (Patharker e Cushman (2000) Plant J. 24: 679691). A cinase induzida por estresse também demonstraram fosforilar um fator de transcrição, provavelmente alterando sua atividade, embora os níveis transcrições do fator de transcrição alvo não sejam alterados em resposta ao estresse de sal ou estiagem. Similarmente, Saijo et al. demonstraram que uma proteína cinase dependente de calmodulina induzida por sal/estiagem de arroz (OsCDPK7) conferiu tolerância elevada ao sal e estiagem para o arroz quando superexpressa (Saijo et al. (2000) Planta J. 23: 319-327).

[00112] A exposição à desidratação evoca estratégias similares de sobrevivência em plantas, assim como o estresse de congelamento (vide, por exemplo, Yelenosky (1989) Planta Physiol 89: 444-451) e o estresse de estiagem induz tolerância de congelamento (vide, por exemplo, Siminovitch et al. (1982) Planta Physiol 69: 250255; e Guy et al. (1992) Plant 188: 265-270). Além da indução de proteínas de aclimatação fria, estratégias que permitem que as plantas sobrevivam em baixas condições de água podem incluir, por exemplo, área de superfície reduzida, ou produção de óleo ou cera da superfície. Em outro exemplo, o teor de soluto elevado da planta previne a evaporação e a perda de água devido ao calor, estiagem, salinidade, osmótico e similares, portanto provendo uma melhor tolerância aos estresses acima.

[00113] Será entendido que alguns caminhos envolvidos na resistência a um estresse (conforme descrito acima), também serão envolvidos em resistência a outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou homólogos. Certamente, aos caminhos de resistência estão relacionados, não idênticos e portanto, nem todos os genes que controlam a resistência a um estresse controlarão a resistência a outros estresses. Não obstante, se uma resistência de condições de gene a um desses estresses, estaria evidente ao especialista na técnica o teste para resistência a esses estresses relacionados. Os métodos de avaliação da resistência ao estresse também São fornecidos na seção de Exemplos a seguir.

[00114] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso da água (WUE I water use efficiency)" refere-se ao nível de matéria orgânica produzido por unidade de água consumida pela planta, isto é, o peso seco de uma planta em relação à utilização de água da planta, por exemplo, a biomassa produzida por transpiração unitária.

[00115] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso de fertilizante" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de fertilizante aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de um ou mais minerais e porções orgânicas absorvidas pela planta, tais como nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.

[00116] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições limitantes de fertilizante" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (por exemplo, concentração) de um fertilizante aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.

[00117] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso de nitrogênio (NUE)" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de nitrogênio aplicada. 0 processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de nitrogênio absorvido pela planta.

[00118] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições limitantes de nitrogênio" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (por exemplo, concentração) de nitrogênio (isto é, amônia ou nitrato) aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.

[00119] A NUE e FUE melhorada da planta são traduzidas no campo em quantidade semelhantes de colheita da produção, enquanto implementam menos fertilizantes, ou produções melhoradas adquiridas pela implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Assim, NUE ou FUE melhorada tem um efeito direto na produção de planta no campo. Assim, os polinucleotídeos e polipeptídeos de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção afetam positivamente a produção de planta, produção de semente e biomassa de planta. Além disso, o benefício da NUE melhorada de planta certamente melhorará a qualidade da cultura e constituintes bioquímicos da semente tais como produção de proteína e produção de óleo.

[00120] Deve-se observar que um ABST melhorado conferirá às plantas vigor melhorado também em condições de não estresse, resultando em culturas que possuem biomassa e/ou produção melhorada, por exemplo, fibras alongadas para a indústria de algodão, teor de óleo mais alto.

[00121] 0 termo "fibra" é normalmente inclusivo de células de condução de parede espessa, tais como vasos e traqueídeos e para fibrilar agregados de muitas células de fibra individual. Por isso, o termo "fibra" refere-se a (a) células de condução e não condução de parede espessa do xilema; (b) fibras de origem extraxylary, incluindo aquelas de floema, casca, tecido do solo e epiderme; e (c) fibras dos caules, folhas, raízes, sementes e flores ou inflorescências (tais como aquelas de Sorghum vulgare utilizadas na fabricação de escovas e vassouras).

[00122] Exemplos de planta que produz fibra, incluem, entre outros, culturas agrícolas tais como algodão, árvore de seda de algodão (Paina, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosoto, winterfat, balsa, quenafe, rosala, juta, sisal abaca, linho, milho, cana de açúcar, cânhamo, rami, paina, fibra de coco, bambu, musgo espanhol e Agave spp. (por exemplo, sisal).

[00123] Conforme utilizada aqui, a expressão "qualidade da fibra" refere- se a pelo menos um parâmetro de fibra que é agricolamente desejado, ou requerido na indústria de fibra (também descrito adiante). Exemplos de tais parâmetros incluem, entre outros, comprimento da fibra, resistência da fibra, adequação da fibra, peso da fibra por comprimento da unidade, proporção de maturidade e uniformidade (também descrito adiante).

[00124] A qualidade da fibra de algodão (gaze) é tipicamente medida de acordo com o comprimento, resistência e delicadeza da fibra. Consequentemente, a qualidade da gaze é considerada mais alta quando a fibra é mais longa, mais forte e mais fina.

[00125] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção da fibra" refere- se à quantidade ou qualidade das fibras produzidas da planta que produz fibra.

[00126] Conforme utilizado aqui, o termo "aumento" refere-se a, pelo menos, cerca de 2%, pelo menos, cerca de 3%, pelo menos, cerca de 4%, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80% de aumento na produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta comparada a uma planta nativa ou planta do tipo selvagem [isto é, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeo ou polipeptideos) do presente pedido de patente de invenção, por exemplo, um planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições (por exemplo, idênticas) de crescimento].

[00127] A expressão "expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno", conforme utilizada aqui, refere-se à regulação ascendente do nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro da planta, introduzindo o polinucleotídeo exógeno em uma planta ou célula da planta e expressando-o por meios recombinantes, conforme também descrito logo abaixo.

[00128] Conforme utilizado aqui, "expressar" refere-se à expressão no mRNA e, opcionalmente, no nível de polipeptídeo.

[00129] Conforme utilizada aqui, a expressão "polinucleotídeo exógeno" refere-se a uma sequência de ácido nucleico heterólogo que pode não ser naturalmente expressa dentro da planta (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de espécies diferentes) ou na qual a superexpressão na planta é desejada. 0 polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta em uma maneira estável ou transitória, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA ribonucleic acid) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve- se observar que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência de ácido nucleico endógena da planta.

[00130] 0 termo "endógeno", conforme utilizado aqui, refere-se a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo que está presente e/ou naturalmente expresso dentro de uma planta ou uma célula da mesma.

[00131] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consiste das ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086.

[00132] As sequências homólogas incluem ambas as sequências, ortólogas e parálogas. 0 termo "parálogo" refere-se às duplicações de gene dentro do genoma de uma espécie conduzindo aos genes parálogos. 0 termo "ortólogo" refere-se aos genes homólogos em diferentes organismos devido à relação ancestral.

[00133] Uma opção para identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledônias é a realização de uma pesquisa de explosão recíproca. Isso pode ser feito através de uma primeira explosão, envolvendo explodir a sequência de interesse contra qualquer base de dados da sequência, tal como a base de dados do NCBI publicamente disponível que pode ser encontrada em: http://www [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web I Protocolo de Transferência de Hipertexto: Rede Mundial de Computadores / Internet] (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Se forem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse seria detonada novamente, por exemplo, os 28.469 clones de cDNA de comprimento total de Oryza Sativa Nipponbare disponível em NCBI. Os resultados da explosão podem ser filtrados. As sequências de comprimento total dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são então detonadas de volta (segunda explosão) contra as sequências do organismo das quais a sequência de interesse é derivada. Os resultados das primeira e segunda explosões são então comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultando na maior pontuação (melhor acerto) na primeira explosão identifica na segunda explosão a sequência de consulta (a sequência de interesse original) como o melhor acerto. Utilizando o mesmo racional, um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de grandes famílias de sequência, o programa ClustalW pode ser utilizado [http://www (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido por uma árvore de união vizinha (http://en (ponto) wikipedia (ponto) org/wiki/Neighbor-joining) que ajuda na visualização do agrupamento.

[00134] A homologia (por exemplo, percentual de homologia, identidade + similaridade) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia que calcule o alinhamento de sequência em pares.

[00135] A identidade (por exemplo, percentual de homologia) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do National Center of Biotechnology Information [NCBIICentro Nacional de Informação de Biotecnologia], tal como utilizando parâmetros padrões.

[00136] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a identidade é uma identidade global, ou seja, uma identidade sobre toda a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção e não apenas sobre partes respectivas.

[00137] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o termo "homologia" ou "homólogo" refere-se à identidade de duas ou mais sequências de ácido nucleico; ou identidade de duas ou mais sequências de aminoácidos; ou a identidade de uma sequência de aminoácidos para uma ou mais sequências de ácido nucleico.

[00138] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a homologia é uma homologia global, ou seja, uma homologia sobre toda a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção e não apenas sobre partes respectivas.

[00139] 0 grau de homologia ou de identidade entre duas ou mais sequências pode ser determinado usando várias ferramentas de comparação de sequências conhecidas. Na sequência há uma descrição não limitante de tais ferramentas, que podem ser utilizadas juntamente com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.

[00140] O alinhamento global em pares foi definido por S. B. Needleman e C. D. Wunsch, "A general method applicable to the search of similarities in the amino acid sequence of two proteins" Journal of Molecular Biology, 1970, páginas 443-53, volume 48.

[00141] Por exemplo, ao começar com uma sequência

[00142] polipeptídica e comparar com outras sequências polipeptídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch (disponível em http://emboss(ponto)sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/ap ps/needle(ponto)html) pode ser utilizado para encontrar o alinhamento ideal (incluindo as lacunas) de duas sequências juntamente com seus comprimentos totais - um "Alinhamento global". Os parâmetros padrões para o algoritmo de Needleman-Wunsch (EMBOSS-6.0.1) incluem: gapopen=10; gapextend=0.5; datafile= EBLOSUM62; brief=YES.

[00143] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, os parâmetros utilizados com a ferramenta EMBOSS-6.0.1 (para a comparação proteína-proteína) incluem: gapopen=8; gapextend=2; datafile= EBLOSUM62; brief=YES.

[00144] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o limite utilizado para determinar a homologia utilizando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00145] Ao começar com uma sequência polipeptídica e comparar a sequências polinucleotídicas, o algoritmo OneModel FramePlus (Halperin, E., Faigler,S. e Gill-More,R. (1999) - FramePlus: aligning DNA to protein sequences. Bioinformatics, 15, 867-873) (disponível em http://www(ponto)biocceleratíon(ponto)com/Products(ponto)htm 1) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões: model=frame+_p2n.model mode=local.

[00146] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, os parâmetros usados com o algoritmo OneModel FramePlus são model=frame+ p2n.model, mode=qglobal.

[00147] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo OneModel FramePlus é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00148] Ao começar com uma sequência polinucleotídica e comparar com outras sequências polinucleotídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman- Wunsch (disponível em http://emboss(ponto)sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/ap ps/needle(ponto)html) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões. (EMBOSS-6.0.1) gapopen=l0; gapextend=0.5; datafile= EDNAFULL; brief=YES.

[00149] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, os parâmetros usados com o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch são gapopen=10; gapextend=0.2; datafile= EDNAFULL; brief=YES.

[00150] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch para a comparação de polinucleotídeos com polinucleotídeos é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00151] De acordo com algumas aplicações, as determinações do grau de homologia requerem adicionalmente o emprego do algoritmo de SmithWaterman (para a comparação proteína-proteína ou comparação nucleotídeo- nucleotideo).

[00152] Os parâmetros padrões para o algoritmo GenCore 6.0 SmithWaterman incluem: modelo =sw.model.

[00153] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo de Smith-Waterman é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[00154] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a homologia global é realizada sobre as sequências pré- selecionadas por homologia local para o polipeptídeo ou polinucleotideo de interesse (por exemplo, 60% de identidade sobre 60% do comprimento da sequência) antes da realização da homologia global para o polipeptídeo ou polinucleotídeo de interesse (por exemplo, 80% de homologia global sobre toda a sequência). Por exemplo, as sequências homólogas são selecionadas usando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn agindo como filtros para o primeiro estágio e a agulha (pacote EMBOSS) ou o alinhamento Estrutura+algorítmico para o segundo estágio. A identidade local (alinhamentos Blast) é definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências, porque é utilizada tão somente como um filtro para a fase de alinhamento global. Nesta aplicação específica (quando a identidade local é utilizada) a filtragem padrão do pacote Blast não é utilizada (estabelecendo o parâmetro "-F F").

[00155] No segundo estágio, os homólogos são definidos com base na identidade global de, pelo menos, 80% para a sequência polipeptídica principal.

[00156] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, duas formas distintas para a descoberta do alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou nucleotídica são utilizadas: 1. Entre duas proteínas (seguindo o filtro blastp): Algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. 0 restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões listadas aqui: Qualificadores padrões (Obrigatórios): [-asequence] [-asequence] Nome do arquivo da sequência e formato opcional, ou referência (entrada EUA).

[00157] [-bsequence] seqall Nome do arquivo da(s) sequência(s) e formato opcional, ou referência (entrada EUA).

[00158] -gapopen flutuante [10,0 para qualquer sequência] . A penalidade da lacuna aberta é uma classificação tomada quando uma lacuna é criada. 0 melhor valor depende da escolha do arranjo de comparação. 0 valor padrão pressupõe que você está usando o arranjo EBLOSUM62 para as sequências de proteína e a matriz EDNAFULL para as sequências nucleotídicas. (número de vírgula flutuante de 1,0 a 100,0)

[00159] -gapextend flutuante [0,5 para qualquer sequência] . A penalidade pela extensão da lacuna, é adicionada à penalidade da lacuna padrão para cada base ou resíduo na lacuna. Esta é o tempo pelo qual a lacuna é penalizada. Normalmente espera-se poucas lacunas grandes e não muitas lacunas pequenas, assim a penalidade sobre a extensão da lacuna deveria ser menor que a penalidade da lacuna. Uma exceção se dá quando uma ou mais sequências são lidas sozinhas com possíveis erros de sequência em cujo caso você esperaria muitas lacunas de base simples. Pode-se obter este resultado estabelecendo a penalidade por lacuna aberta para zero (ou muito baixa) e usando a penalidade de extensão da lacuna para controlar a classificação da lacuna. (número de vírgula flutuante de 0,0 a 10,0).

[00160] [-outfile] alinhamento [*.needle] Nome do arquivo de alinhamento de saída Qualificadores Adicionais (Opcional):

[00161] -datafile matrixf [EBLOSUM62 para proteína, EDNAFULL para DNA]. Este é um arquivo do arranjo de classificação utilizado ao comparar as sequências. Por padrão, este é o arquivo 'EBLOSUM62' (para proteínas) ou o arquivo 'EDNAFULL' (para sequências nucleicas) Estes arquivos são encontrados no diretório 'data' da instalação EMBOSS. Qualificadores Avançados (Espontâneos):

[00162] -[no] brief booleano [Y] Breve identidade e similaridade. Qualificadores Associados:

[00163] "-asequence" Qualificadores Associados.

[00164] -sbeginl inteiro Inicia a sequência a ser utilizada.

[00165] sendl inteiro Finaliza a sequência a ser utilizada.

[00166] -sreversel booleano Reverso (se DNA).

[00167] -saskl booleano Pede para iniciar/finalizar/reverter.

[00168] snucleotidel booleano A sequência é nucleotídica.

[00169] -sproteínal booleano A sequência é de proteína.

[00170] slowerl booleano Faz minúsculas.

[00171] -supperl booleano Faz maiúsculas.

[00172] -sformatl cadeia Formato de sequência de entrada.

[00173] -sdbnamel cadeia Nome da base de dados.

[00174] -sidl cadeia Nome da entrada.

[00175] ufol cadeia Recursos UFO.

[00176] fformatl cadeia Formato dos Recursos.

[00177] fopenfilel cadeia Nome do arquivo dos recursos. "-bsequence" Qualificadores Associados

[00178] -sbegin2 inteiro Inicia cada sequência a ser utilizada.

[00179] -send2 inteiro Finaliza cada sequência a ser utilizada.

[00180] sreverse2 booleano Reverso (se DNA).

[00181] -sask2 booleano Pede para iniciar/finalizar/reverter.

[00182] snucleotide2 booleano A sequência é nucleotidica.

[00183] sproteína2 booleano A sequência é de proteína.

[00184] -supper2 booleano Faz maiúsculas.

[00185] -sformat2 cadeia Formato de sequência dae entrada.

[00186] -sdbname2 cadeia Nome da base de dados.

[00187] -sid2 cadeia Nome da entrada.

[00188] ufo2 cadeia Recursos UFO.

[00189] -fformat2 cadeia Formato dos Recursos.

[00190] -fopenfile2 cadeia Nome do arquivo dos recursos.

[00191] "-outfile" Qualificadores Associados.

[00192] aformat3 cadeia Formato dos Alinhamentos.

[00193] -aextension3 cadeia Extensão do nome do arquivo.

[00194] -adirectory3 cadeia Diretório de Saída.

[00195] -aname3 cadeia Nome do arquivo de base.

[00196] awidth3 inteiro Largura do alinhamento.

[00197] aaccshow3 booleano Mostra o número de acesso no cabeçalho.

[00198] -adesshow3 booleano Mostra a descrição no cabeçalho.

[00199] -ausashow3 booleano Mostra o USA completo no alinhamento.

[00200] aglobal3 booleano Mostra a sequência completa no alinhamento.

[00201] Qualificadores Gerais: -auto booleano Desliga as solicitações.

[00202] -stdout booleano Escreve o primeiro arquivo para a saída padrãos.

[00203] filtro booleano Lê o primeiro arquivo a partir da entrada padrão, escreve o primeiro arquivo para a saída padrão.

[00204] Opções booleano Solicita os valores padrão e adicionais.

[00205] -debug booleano Escreve a saída de depuração do programa .dbg

[00206] verbose booleano Registra algumas/todas as opções de linha de comando.

[00207] help booleano Registra as opções de linha de comando.

[00208] help booleano Registra as opções de linha de comando. Maiores informações sobre os qualificadores associados e gerais podem ser encontradas com -help -verbose.

[00209] -warning booleano Registra as advertências.

[00210] error booleano Registra os erros.

[00211] -fatal booleano Registra os erros fatais.

[00212] -die booleano Registra as mensagens de expiração do programa. 2. Entre uma sequência de proteína e uma sequência

[00213] nucleotídica (seguindo o filtro rblastn) Aplicação de GenCore 6.0 OneModel utilizando a estrutura+algoritmo com os seguintes parâmetros: model=frame+ p2n.model mode=qglobal - q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. 0 restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões: Uso: om -model=<model fname> [-q=]query [-db=]database [options].

[00214] -model=<model_fname> Especifica o modelo que quer executar. Todos os modelos fornecidos pela Compugen estão

[00215] localizados no diretório $CGNROOT/models/. Parâmetros válidos de linha de comando:

[00216] dev=<dev_name> Seleciona o dispositivo a ser utilizado pela aplicação. Os dispositivos válidos são: bic - Bioccelerator (válido para SW, XSW, FRAME N2P, e modelos FRAMEP2N).

[00217] xlg - BioXL/G (válido para todos os modelos, exceto XSW).

[00218] xlp - BioXL/P (válido para SW, FRAME+N2P, e modelos FRAME P2N).

[00219] xlh - BioXL/H (válido para SW, FRAME+N2P, e modelos FRAME P2N).

[00220] soft - Dispositivo do software (para todos os modelos).

[00221] -q=<query> Define o conjunto de consultas. As consultas podem ser um arquivo de sequência ou uma referência à base de dados. Você pode especificar uma consulta pelo nome ou por número de acesso.

[00222] O formato é detectado automaticamente.Entretanto, pode-se especificar um formato usando o parâmetro -qfmt Se uma consulta não for especificada, o programa solicita uma. Se o conjunto de consultas for uma referência à base de dados, um arquivo de saída é produzido para cada sequência na consulta.

[00223] -db=<database name> Escolha o conjunto de base de dados. 0 conjunto de base de dados pode ser um arquivo de sequência ou uma referência à base de dados. 0 formato da base de dados é detectado automaticamente. Entretanto, pode-se especificar um formato usando o parâmetro -dfmt.

[00224] -qacc Adiciona este parâmetro à linha de comando se uma consulta for especificada usando os números de acesso.

[00225] -dacc Adiciona este parâmetro à linha de comando se uma base de dados for especificada usando os números de acesso.

[00226] -dfmt/- Escolhe o tipo do formato da base qfmt=<format_type> de dados/consulta. Os formatos possíveis são: fasta - fasta com o tipo de sequência autodetectada. fastap - sequência de proteína fasta.

[00227] fastan - sequência nucleica fasta. gcg - formato gcg, o tipo é autodetectado.

[00228] gcg - formato gcg, o tipo é autodetectado.

[00229] gcg9seqp - sequência de proteína de formato gcg9.

[00230] gcg9seqn - sequência nucleica de formato

[00231] nbrf - sequência nbrf, o tipo é autodetectado.

[00232] nbrfp - sequência de proteína nbrf.

[00233] nbrfn - sequência nucleica nbrf. embl - formato embl e swissprot.

[00234] genbank - formato genbank (nucleico).

[00235] blast - formato blast

[00236] nbrf_gcg - sequência nbrf_gcg, o tipo é autodetectado.

[00237] nbrf_gcgp - sequência de proteína nbrf-gcg.

[00238] nbrf gcgn - sequência nucleica nbrf-gcg.

[00239] raw - sequência raw ascii, o tipo é autodetectado.

[00240] rawp - sequência de proteína raw ascii.

[00241] rawn - sequência nucleica raw ascii.

[00242] pir - formato pir codata, o tipo é autodetectado.

[00243] Profile - perfil gcg (válido somente para -qfmt em SW, XSW, FRAME P2N e FRAME+ P2N).

[00244] -out=<out_fname> 0 nome do arquivo de saída.

[00245] -suffix=<name> 0 sufixo do nome do arquivo de saída.

[00246] -gapop=<n> Penalidade sobre a abertura de lacuna. Este parâmetro não é válido para a FRAME+. Para a FrameSearch o padrão é 12,0. Para outras pesquisas o padrão é 10,0.

[00247] -gapext=<n> Penalidade por extensão de lacuna.

[00248] Este parâmetro não é válido para FRAME+. Para a FrameSearch o padrão é 4,0. Para outros modelos: o padrão para as pesquisas de proteína é 0,05 e o padrão para as pesquisas nucleicas é 1,0.

[00249] -qgapop=<n> A penalidade pela abertura de uma lacuna na sequência de consultas.

[00250] O padrão é 10,0. Válido para XSW.

[00251] qgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna na sequência de questões. 0 padrão é 0,05. Válido para XSW.

[00252] start=<n> A posição na sequência de consulta para iniciar a pesquisa.

[00253] -end=<n> A posição na sequência de consulta para interromper a pesquisa.

[00254] -qtrans Realiza uma pesquisa traduzida, relevante para uma consulta nucleica contra uma base de dados de proteína. A consulta nucleica é traduzida para seis estruturas de leitura e um resultado é fornecido para cada estrutura. Válido para o SW e XSW. Nota: as opções "-qtrans" e " -dt rans" são mutuamente exclusivas.

[00255] -matrix=<matrix_file> Especifica o arranjo de comparação a ser utilizada na pesquisa. 0 arranjo deve estar em formato BLAST. Se o arquivo do arranjo não for localizado em $CGNROOT/tables/matrix, especifique o caminho completo como o valor do -matrix parameter.

[00256] trans=<transtab name> Tabela de tradução. A localização padrão para a tabela é $CGNROOT/tables/trans.

[00257] -onestrand Restringe a pesquisa para somente a vertente superior da consulta/base de dados da sequência nucleica.

[00258] -list=<n> 0 tamanho máximo da lista de acertos de saída. 0 padrão é 50.

[00259] docalign=<n> 0 número das linhas de documentação precedente a cada alinhamento. 0 padrão é 10.

[00260] thr score=<score name> A classificação que coloca um limite à exibição dos resultados. Classificações menores que o valor mínimo de -thr min ou maiores que o valor -thr_max não são mostradas. As opções válidas são: qualidade.

[00261] Escore.

[00262] Escore.

[00263] -thr max=<n> 0 limite mais alto da classificação. Resultados maiores que o valor -thr_max não são mostrados.

[00264] thr min=<n> 0 menor limite da classificação. Resultados menores que o valor -thr min não são mostrados.

[00265] -align=<n> 0 número de alinhamentos registrados no arquivo de saída.

[00266] -noalign Não exibe o alinhamento.

[00267] Nota: os parâmetros "-align" e "-noalign" são mutuamente exclusivos.

[00268] -outfmt=<format name> Especifica o tipo de formato de saída.

[00269] O formato padrão é PFS. Os valores possíveis são: PFS - Formato de texto PFS FASTA - formato de texto FASTA BLAST - formato de texto BLAST

[00270] -norm=<norm name> Especifique o método de normalização. As opções válidas são: log - normalização do algoritmo. std - normalização padrão.

[00271] stat - Método estatístico de Ervilharson

[00272] Nota: os parâmetros "-nonorm" e "norm" não podem ser utilizados juntos.

[00273] Nota: Parâmetros -xgapop, -xgapext, -fgapop, -fgapext, -ygapop, -ygapext, -delop e -delext se aplicam somente a FRAME+.

[00274] -xgapop =<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao inserir um codão (triplo). 0 padrão é 12,0.

[00275] -xgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir um codão (triplo). 0 padrão é 4,0.

[00276] ygapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir um aminoácido. 0 padrão é 12,0.

[00277] -ygapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao excluir um aminoácido. 0 padrão é 4,0.

[00278] -fgapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao inserir uma base de DNA. 0 padrão é 6,0.

[00279] -fgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir uma base de DNA. 0 padrão é 7,0.

[00280] delop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir uma base de DNA. 0 padrão é 6,0.

[00281] -delext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao excluir uma base de DNA. 0 padrão é 7,0.

[00282] -silent Nenhuma saída para a tela é produzida.

[00283] host=<host name> O nome do organizador sobre o qual servidor funciona. Por padrão, a aplicação usa um organizador específico no arquivo $CGNROOT/cgnhosts.

[00284] wait Não acesse o segundo plano quando dispositivo estiver ocupado. Esta opção não é relevante para o pseudodispositivo Parseq ou Soft.

[00285] batch Execute o trabalho em segundo plano. Quando esta opção for específica, o arquivo "$CGNROOT/defaults/batch.defaults" é utilizado para escolher o comando batch. Se o arquivo não existir, o comando "at now" é utilizado para executar o trabalho. Nota: Os parâmetros "batch" e "-wait" são mutuamente exclusivos.

[00286] -version Imprime o número de versão do software.

[00287] -help Exibe esta mensagem de ajuda. Para ajuda mais específica digite: "om-model=<model fname> -help".

[00288] De acordo com algumas aplicações, a homologia é uma homologia local ou uma identidade local.

[00289] As ferramentas de algoritmo local incluem, mas não são limitadas ao software BlastP, BlastN, BlastX ou TBLASTN do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (NCBI), FASTA e o algoritmo de SmithWaterman.

[00290] Uma pesquisa tblastn permite a comparação entre uma sequência de proteína e as traduções de seis estruturas de uma base de dados de nucleotideos. Pode ser uma maneira bastante produtiva de encontrar regiões codificadas de proteína homóloga em sequências de nucleotídeos não anotadas, tais como as etiquetas de sequências expressas [EST'slexpressed sequence tags] e projetos de registros do genoma [HTG I draft genome records], localizados nas bases de dados BLAST est e htgs, respectivamente.

[00291] Os parâmetros padrões para o blastp incluem: Sequências de alvo máximo: 100; Limite esperado: e-5; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - BLOSUM62; filtros e camuflagem: Filtro - regiões de baixa complexidade.

[00292] Ferramentas de alinhamento local que podem ser utilizadas incluem, mas não são limitadas ao algoritmo tBLASTX, que compara os produtos de tradução conceitual de seis estruturas de uma sequência de consultas de nucleotídeos (ambas as vertentes) contra uma base de dados de sequência de proteína. Os parâmetros padrões incluem: Sequências de alvo máximo: 100; Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - BLOSUM62; filtros e camuflagem: Filtro - regiões de baixa complexidade.

[00293] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos de, pelo menos, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou, digamos, 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistente de ID SEQ N°: 362-601, 2429-4085 e 4086.

[00294] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método para aumentar a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta é efetuado ao expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086, aumentando, desta forma, a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[00295] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo de uma sequência de aminoácido estabelecida pela ID SEQ. N° 362601, 2429-4085 ou 4086.

[00296] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método para aumentar a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta é efetuado expressando dentro da planta de um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086, aumentando, desta forma, a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00297] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086, aumentando, desta forma, a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00298] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido estabelecida pela ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 ou 4086.

[00299] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste das ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 e 2428.

[00300] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica sequência de ácido nucleico selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-361, 6022427 e 2428, aumentando, desta forma, a a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00301] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 e 2428.

[00302] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pela ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 ou 2428.

[00303] Conforme utilizado aqui, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma sequência de ácido nucleico de fita simples ou dupla que é isolado e fornecido na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotídeo e/ou uma sequência polinucleotídeo composta (por exemplo, uma combinação das sequências acima).

[00304] 0 termo "isolado(a)" refere-se a pelo menos parcialmente separado(a) do ambiente natural, por exemplo, de uma célula da planta.

[00305] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência de polinucleotídeo complementar" refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa de RNA mensageiro utilizando a transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Essa sequência pode ser amplificada subsequentemente in vivo ou in vitro utilizando uma polimerase de DNA dependente de DNA.

[00306] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência genômica de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência derivada (isolada) de um cromossomo e, dessa forma, representa uma porção contígua de um cromossomo.

[00307] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência de polinucleotídeo composta" refere-se a uma sequência que seja pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. A sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção, bem como algumas sequências intrônicas interpostas entre si. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo outros genes e, tipicamente, incluirão sequências de sinais entrelaçados preservadas. Essas sequências intrônicas podem incluir, ainda, elementos reguladores da expressão cis-atuantes.

[00308] As sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos do presente pedido de patente de invenção podem ser otimizadas para expressão. Exemplos dessas modificações de sequências incluem, mas não se limitam a um teor de G/C alterado de uma abordagem mais cuidadosa do que aquela comumente encontrada nas espécies de plantas de interesse e à remoção de códons atipicamente encontrados nas espécies de plantas comumente chamada de otimização de códons.

[00309] A expressão "otimização de códons" refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para a utilização dentro de um gene estrutural ou fragmento dele que aborde a utilização do códon dentro da planta de interesse. Portanto, um gene otimizado ou sequência de ácido nucleico refere-se a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou que ocorra naturalmente tenha sido modificado a fim de utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro da planta. Tipicamente, a sequência de nucleotídeo é examinada no nível do DNA e na região de codificação otimizada para expressão na espécie vegetal determinada utilizando qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Nesse método, o desvio padrão de utilização do códon, uma medida da tendência de utilização do códon, pode ser calculado descobrindo primeiramente o quadrado do desvio proporcional de utilização de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de plantas altamente expressos, seguido por um cálculo do quadrado do desvio médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [(Xn - Yn) /Yn] 2/N, onde Xn refere-se à frequência de utilização do códon n em genes de plantas altamente expressos, onde Yn refere-se à frequência de utilização do códon n no gene e interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela de utilização de códons de genes altamente expressos de dicotiledôneas está compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc AcID's Res. 17:477498).

[00310] Um método para otimizar a sequência de ácido nucleico de acordo com a utilização preferido do códon para um tipo de célula de planta particular é com base na utilização direto, sem realizar quaisquer cálculos estatísticos extras, de Tabelas de otimização de códons como aquelas disponíveis onlinha na Base de Dados de utilização de Códons através do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciencesllnstituto Nacional de Ciências Agrobiológicas) no Japão (http://www (ponto) kazusa (ponto) ou (ponto) jp/codon/). A Base de Dados de utilização de Códons contém tabelas de utilização de códons para diversas espécies diferentes, com cada Tabela de utilização de códons tendo sido estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.

[00311] Utilizando as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos de cada aminoácido em uma espécie particular (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeo que ocorre naturalmente e que codifica uma proteína de interesse pode ter o códon otimizado para aquela espécie de planta particular. Isso é efetuado substituindo os códons que possam ter uma incidência estatística baixa no genoma da espécie particular com códons correspondentes, em relação a um aminoácido, que sejam estatisticamente mais favorecidos. No entanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir sítios de restrição existentes, para criar novos em uniões potencialmente úteis (terminais 5' e 3' para adicionar o peptídeo sinal ou cassetes de terminação, sítios internos que possam ser utilizados para cortar e reunir segmentos para produzir uma sequência de comprimento total correta), ou para eliminar sequências de nucleotídeo que possam afetar negativamente a estabilidade ou a expressão do mRNA.

[00312] A sequência de nucleotídeo codificador que ocorre naturalmente já pode, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponda a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta particular. Portanto, a otimização do códon da sequência de nucleotídeo nativa podem compreender a determinação quais códons, dentro da sequência de nucleotídeo nativo, não são estatisticamente favorecidos com relação a uma planta particular e modificar esses códons de acordo com uma tabela de utilização de códons da planta particular para produzir um derivado do códon otimizado. Uma sequência de nucleotídeo modificado pode ser total ou parcialmente otimizada para a utilização do códon da planta desde que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo modificado seja produzida em um nível maior do que a proteína codificada pelo gene correspondente que ocorre naturalmente ou nativo. A estrutura de genes sintéticos alterando a utilização do códon é descrita, por exemplo, no Pedido de Patente PCT (Patent Cooperation Treaty ( Tratado de Cooperação em Matéria de Patentes) 93/07278.

[00313] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno é um RNA não codificador.

[00314] Conforme utilizada aqui, a expressão "RNA não codificador" refere-se a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácidos (um polipeptídeo). Exemplos dessas moléculas de RNA não codificador incluem, mas não se limitam a um RNA antisenso, um pré-miRNA (precursor de um microRNA) ou um precursor de um RNA que interage com Piwi (piRNA).

[00315] Um exemplo não limitante de um polinucleotídeo de RNA não codificador é apresentado na ID SEQ. N° 731.

[00316] Dessa forma, o presente pedido de patente de invenção abrange as sequências de ácido nucleico descritas acima, fragmentos delas, sequências hibridizantes encontradas nelas, sequências homólogas delas, sequências codificando polipeptídeos semelhantes com diferentes utilizações de códons, sequências alteradas caracterizadas por mutações, como exclusão, introdução ou substituição de um ou mais nucleotídeos, ocorrendo naturalmente ou induzidos pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.

[00317] O presente pedido de patente de invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo das ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 e 2428.

[00318] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico é capaz de aumentar a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[00319] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste das ID SEQ. N° 1-361, 6022427 e 2428.

[00320] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado é estabelecido pela ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 ou 2428.

[00321] O presente pedido de patente de invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID SEQ. N° 362-601, 24294085 ou 4086.

[00322] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar a produção, teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso de nitrogênio) e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[00323] 0 presente pedido de patente de invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086.

[00324] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

[00325] 0 presente pedido de patente de invenção fornece um polipeptídeo isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 ou 4086.

[00326] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos é selecionado do grupo que consiste da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086.

[00327] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polipeptídeo é estabelecido pelas ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 ou 4086.

[00328] 0 presente pedido de patente de invenção também abrange fragmentos dos polipeptídeos descritos acima e de polipeptídeos apresentando mutações, como exclusões, introduções ou substituições de um ou mais aminoácidos, ocorrendo naturalmente ou induzido pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.

[00329] 0 termo "planta", conforme utilizado aqui, abrange plantas integrais, ancestrais e progênies das plantas e partes da planta, incluindo as sementes, os brotos, os caules, as raízes (incluindo os tubérculos) e células, tecidos e órgãos da planta. A planta pode estar em qualquer forma, incluindo culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. Plantas que são particularmente úteis nos métodos do presente pedido de patente de invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular as monocotiledõneas e as dicotiledôneas, incluindo uma forragem ou leguminosa forrageira, planta ornamental, cultura alimentar, árvore ou arbusto selecionado da lista que compreende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Buchá frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lótus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseupontosuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinífera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, couve, canola, cenouras, couve-flor, aipo, couve-manteiga, linho, couve crespa, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilhas, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma grama perene e uma cultura forrageira. Alternativamente, algas e outras nãoViridiplantae podem ser utilizadas para os métodos do presente pedido de patente de invenção.

[00330] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta utilizada pelo método do presente pedido de patente de invenção é uma planta de cultura como o arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana-de-açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, colza, tabaco, choupo e algodão.

[00331] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta é uma planta dicotiledônea.

[00332] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta é uma planta monocotiledônia.

[00333] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se uma célula vegetal expressando de forma exógena o polinucleotídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e/ou o polipeptídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.

[00334] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção dentro da planta é afetada pela transformação de uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguida pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivando a planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.

[00335] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a transformação é efetuada pela introdução de uma estrutura de ácido nucleico na célula da planta que inclua o polinucleotídeo exógeno de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e pelo menos um promotor para orientar a transcrição do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula vegetal). Detalhes adicionais de abordagens de transformação adequadas são apresentadas abaixo.

[00336] Conforme mencionado, a estrutura de ácido nucleico, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, compreende uma sequência promotora e o polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção.

[00337] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado está operacionalmente ligado à sequência promotora.

[00338] Uma sequência de ácido nucleico codificadora é "operacionalmente ligada" a uma sequência reguladora (por exemplo, o promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência codificadora ligada a ela.

[00339] Conforme utilizado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que fica a montante do sítio da inicial transcricional de um gene ao qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (por exemplo, qual porção de uma planta) e/ou quando (por exemplo, em que estágio ou condição no tempo de vida de um organismo) o gene é expresso.

[00340] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.

[00341] Conforme utilizado aqui, o termo "promotor heterólogo" refere- se a um promotor de uma espécie diferente ou da mesma espécie, mas de um lócus de gene diferente, a partir da sequência de plinucleotídeo isolado.

[00342] Qualquer sequência adequada de promotor pode ser utilizada pela estrutura de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico do tecido ou induzível ao estresse abiótico.

[00343] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o promotor é um promotor de planta que é adequado para expressão do polinucleotídeo exógeno em uma célula de planta.

[00344] Promotores adequados para expressão em trigo incluem, mas não se limitam a promotor SPA de trigo (ID SEQ. N° 4087; Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997, que é totalmente incorporado aqui por referência), trigo LMW [ID SEQ. N° 4088 (promotor mais longo LMW) e ID SEQ. N° 4089 (promotor LMW)] e glutenina-1 HMW [ID SEQ. N° 4090 (promotor mais longo glutenina-1 trigo LMW) e ID SEQ. N° 4091 (Promotor glutenina-1 trigo HMW); Thomas and Flavell, The Plant Cell 2:1171-1180; Furtado et al., 2009 Plant Biotechnology Journal 7:240-253, cada um é completamente incorporado aqui por referência] trigo alfa, beta e gama gliadinas [por exemplo, SEQ ID NO: 4092 (trigo alfa gliadina, genoma B, promotor); ID SEQ. N° 4093 (trigo gama gliadina promotor); EMBO 3:1490-15, 1984, que é totalmente incorporado aqui por referência] trigo TdPR60 [ID SEQ. N° 4094 (trigo TdPR60 promotor mais longo) ou ID SEQ. N° 4095 (promotor do trigo TdPR60); Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71:81-98, 2009, que é totalmente incorporado aqui por referência], promotor do milho Ubl [cultivares Nongda 105 (ID SEQ. N° 4096); GenBank: DQ141598.1; Taylor et al., Plant Cell Rep 1993 12: 491-495, que é totalmente incorporado aqui por referência), e cultivares B73 (ID SEQ. N° 4097); Christensen, AH, et al. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992), que é totalmente incorporado aqui por referência), arroz actina 1 (ID SEQ. N° 4098; Mc Elroy et al. 1990, The Plant Cell, Vol. 2, 163-171, que é totalmente incorporado aqui por referência), e arroz GOS2 [ID SEQ. N° 4099 (promotor mais longo do arroz GOS2) e ID SEQ. N° 4100 (Promotor do arroz GOS2); De Pater et al. Plant J. 1992 ; 2: 837-44, que é totalmente incorporado aqui por referência), Arabidopsis Phol [ID SEQ. N° 4101 (Arabidopsis Phol Promotor); Hamburger et al., Plant Cell. 2002 ; 14: 889-902, que é totalmente incorporado aqui por referência), promotores ExpansinB, por exemplo, arroz ExpB5 [ID SEQ. N° 4102 (promotor mais longo do arroz ExpB5) e SEQ ID NO: 4103 (promotor do arroz ExpB5) e Cevada ExpBl [ID SEQ. N° 4104 (promotor da cevada ExpBl), Won et al. Mol Cells. 2010; 30:369-76, que é totalmente incorporado aqui por referência), cevada SS2 (sacarose síntase 2) [(ID SEQ. N° 4105), Guerin and Carbonero, Plant Physiology May 1997 vol. 114 no. 1 55-62, que é totalmente incorporado aqui por referência], e arroz PG5a [ID SEQ. N° 4106, US 7.700.835, Nakase et al., Plant Mol Biol. 32:621-30, 1996, que é totalmente incorporado aqui por referência].

[00345] Promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, o promotor CaMV 35S [ID SEQ. N° 4107 (Promotor CaMV 35S (QFNC)); ID SEQ. N° 4108 (PJJ 35S de Brachypodium); ID SEQ. N° 4109 (Promtor CaMV 35S (OLD)) (Odell et al., Nature 313:810-812, 1985)], promotor Arabidopsis At6669 (ID SEQ. N° 4110 (Promotor Arabidopsis At6669 (OLD)); ver Publicação PCT N°. W004O81173A2 ou o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 4111 (Promotor Arabidopsis At6669 (NOVO)); Promotor do milho Ubl [cultivares Nongda 105 (ID SEQ. N° 4096); GenBank: DQ141598.1; Taylor et al., Plant Cell Rep 1993 12: 491-495, que é totalmente incorporado aqui por referência), e cultivares B73 (ID SEQ. N° 4097); Christensen, AH, et al. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992), que é totalmente incorporado aqui por referência), arroz activa 1 (ID SEQ. N° 4098, McElroy et al., Plant Cell 2:163171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997); arroz GOS2 [ID SEQ. N° 4099 (promotor mais longo do arroz GOS2) e ID SEQ. N° 4100 (Promotor do arroz GOS2); De Pater et al., Plant J Nov;2(6):837-44, 1992]; promotor RBCS (ID SEQ. N° 4112); Ciclofilina do arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); histone H3 de milho (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10(1);107-121, 1996) e Super MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes Americanas N°: 5,659,026, 5,608,149; 5.608,144; 5,604,121; 5.569,597: 5.466,785; 5,399,680; 5,268,463; e 5,608,142.

[00346] Promotores específicos de tecido adequados incluem, mas não se limitam a promotores específicos de folha [por exemplo, AT5G06690 (Thioredoxin) (expressão elevada, ID SEQ. N° 4113), AT5G61520 (AtSTP3) (expressão rebaixada, ID SEQ. N° 4114) descrito em Buttner et al 2000 Plant, Cell and Environment 23, 175-184, ou os promotores descritos em Yamamoto et al., Plant J. 12:255265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:9586-9590, 1993; bem como o promotor Arabidopsis STP3 (AT5G61520) (Buttner et al., Plant, Cell and Environment 23:175-184, 2000)], promotores preferidos de semente [por exemplo, Napin (originados da Brassica napus, sendo caracterizado por uma atividade promotora específica de semente; Stuitje A. R. et. al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309; ID SEQ. N°: 4115 (Promotor Brassica napus NAPIN) a partir dos genes específicos de semente (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), arroz PG5a (ID SEQ. N° 4106; US 7.700.835), desenvolvimento precoce de sementes Arabidopsis BAN (AT1G61720) (ID SEQ. N° 9414, US 2009/0031450 Al), desenvolvimento tardio de sementes Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) (ID SEQ. N° 4117 (Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) Promotor mais longo) ou 4118 (Arabidopsis ABI3 (AT3G24650) Promotor)) (Ng et al., Plant Molecular Biology 54: 25-38, 2004), Albumina de castanha do Brasil (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), leguminosas (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), SPA de trigo (ID SEQ. N° 4087; Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992)], promotores específicos de endosperma [por exemplo, trigo LMW (ID SEQ. N° 4088 (Trigo LMW Promotor mais longo), e ID SEQ. N° 4089 (promotor de trigo LMW)] e glutenina-1 HMW [ID SEQ. N° 4090 (promotor mais longo glutenina-1 de trigo LMW) e ID SEQ. N° 4091 (Promotor glutenina-1 de trigo HMW); Thomas and Flavell, The Plant Cell 2:1171-1180, 1990; Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), trigo alfa, beta e gama gliadinas (ID SEQ. N° 4092 (promotor alfa gliadina de trigo (genoma B)); ID SEQ. N° 4093 (promotor gama gliadina de trigo); EMBO 3:1409-15, 1984), promotor ltrl da cevada, cevada B1, C, D hordeína (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996), cevada DOF (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), Cevada SS2 (ID SEQ. N° 4105 (Promotor Cevada SS2); Guerin and Carbonero Plant Physiology 114: 1 55-62, 1997), trigo Tarp60 Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71:81-98, 2009, cevada D- hordeína (D-Hor) e B-hordeína (B-Hor) (Agnelo Furtado, Robert J. Henry and Alessandro Pellegrineschi (2009)], promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), arroz prolamina NRP33, arrozglobulina Glb-1 (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885889, 1998), arroz alfa-globulina REB/OHP-1 (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glicose de arroz PP (Trans Res 6:157-68, 1997), família do gene de milho ESR (Plant J 12:235-46, 1997), gama-kafirina de sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores específicos embrionários [por exemplo, arroz OSH1 (Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma of al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), arroz oleosina (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores de flor específicos [por exemplo, AtPRP4, chalene sintase (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen. Genet. 217:240-245; 1989), Arabidopsis apetala- 3 (Tilly et al., Development. 125:1647-57, 1998), Arabidopsis APETALA 1 (AT1G69120, AP1) (ID SEQ. N°: 4119 (Arabidopsis (AT1G69120) APETALA 1)) (Hempel et al., Development 124:3845-3853, 1997)], e promotor de raiz [por exemplo, o promotor ROOTP [ID SEQ. N°: 4120]; arroz ExpB5 (ID SEQ. N° 4103 (Promotor de arroz ExpB5); ou ID SEQ. N° 4102 (Promotor mais longo de arroz ExpB5)) e promotores de cevada ExpBl (ID SEQ. N° 4104) (Won et al. Mol. Cells 30: 369-376, 2010); promotor Arabidopsis ATTPS-CIN (AT3G25820) (ID SEQ. N° 4121; Chen et al., Plant Phys 135:1956-66, 2004); promotor Arabidopsis Phol (ID SEQ. N°: 4101, Hamburger et al., Plant Cell. 14: 889-902, 2002), que também é ligeiramente induzida por estresse].

[00347] Promotores induzíveis pelo estresse abiótico incluem, mas não se limitam a promotores induzíveis pelo sal, como o RD29A (Yamaguchi- Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induzíveis pela seca, como o gene promotor rabl7 (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), o gene promotor rab28 do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997 e o gene promotor Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373380, 1999); promotores induzíveis pelo calor como o promotor hsp80 do tomate (Patente Norte-Americana N° 5.187.267).

[00348] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode incluir, ainda, um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a estrutura de ácido nucleico utilizada é um vetor ponte, que pode se propagar tanto em E. coli (onde a estrutura compreenda um marcador selecionável apropriado e a origem da replicação) quanto pode ser compatível com a propagação nas células. A estrutura de acordo com o presente pedido de patente de invenção pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagemídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[00349] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode ser utilizado para transformar de maneira estável ou transitória as células da planta. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado ao genoma da planta e, como tal, representa um traço estável e herdado. Na transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrado no genoma e, como tal, representa um traço transitório.

[00350] Existem vários métodos para introduzir genes estranhos, tanto em monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol, Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

[00351] Os métodos do princípio de causa da integração estável de DNA exógeno em DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: A transferência genética mediada pelo Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, em Plant Biotechnology, eds. Kung, S. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.

[00352] (i) Absorção direta do DNA: Paszkowski et al., em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para a absorção direta de DNA nos protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Absorção de DNA induzida pelo breve choque elétrico de células vegetais: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células ou tecidos vegetais por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pela utilização de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; (ii) transformação de partículas de fibras de vidro ou carboneto de silício de culturas celulares, embriões ou tecido caloso, Patente Norte- Americana N° 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen germinante, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1986) 83:715- 719.

[00353] 0 sistema Agrobacterium inclui a utilização de vetores plasmidiais que contenham segmentos definidos de DNA que se integram no DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido vegetal variam dependendo da espécie da planta e do sistema de entrega do Agrobacterium. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante tecidual que oferece uma boa fonte para o início da diferenciação de toda a planta. Vide, por exemplo, Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de entrega do Agrobacterium em combinação com infiltração a vácuo. 0 sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de dicotiledôneas transgênicas.

[00354] Existem vários métodos de transferência direta de DNA para células vegetais. Na eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é injetado de forma mecânica diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento de micropartículas, o DNA é absorvido em microprojéteis como os cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio e os microprojéteis são fisicamente acelerados nas células ou tecidos vegetais.

[00355] Após a transformação estável, a propagação vegetal é realizada. 0 método mais comum de propagação vegetal é pela semente. A regeneração pela propagação de sementes, no entanto, apresenta a deficiência de que devido à heterozigosidade há uma falta de uniformidade na cultura, uma vez que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas normas Mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma irá crescer com seus próprios traços específicos. Portanto, é preferível que a planta transformada seja produzida de forma que a planta regenerada tenha traços e características idênticos da planta transgênico arranjo. Portanto, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação que proporciona a reprodução rápida, consistente das plantas transformadas.

[00356] A micropropagação é um processo de cultivo de plantas de nova geração a partir de um pedaço de tecido que tenha sido retirado de uma planto arranjo selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas que tenham o tecido preferido expressando a proteína da fusão. As plantas da nova geração que forem produzidas são geneticamente idênticas à planta original e apresentam todas as suas características. A micropropagação permite a produção em massa de material vegetal de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta transgênica ou transformada original. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e a uniformidade das plantas produzidas.

[00357] A micropropagação é um procedimento de múltiplos estágios que requer a alteração do meio de cultura ou das condições de cultivo entre os estágios. Dessa forma, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura tecidual inicial; estágio dois, multiplicação da cultura tecidual; estágio três, diferenciação e formação da planta; e estágio quarto, cultura e fortalecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura tecidual inicial, a cultura tecidual é estabelecida e certificada como sendo livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura tecidual inicial é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atender aos objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas em plântulas individuais. No estágio quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para fortalecimento, onde a tolerância das plantas à luz é gradativamente aumentada de forma que ela possa ser cultivada no ambiente natural.

[00358] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, as plantas transgênicas são geradas pela transformação transitória de células de folhas, de células meristemáticas ou de toda a planta.

[00359] A transformação transitória pode ser efetuada por quaisquer dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus modificados de plantas.

[00360] Os vírus que demonstraram ser úteis para a transformação de hospedeiros de plantas incluem o CaMV, o vírus mosaico do tabaco (TMVltabaco mosaic virus), vírus mosaico do bromo (BMV 1 brome mosaic virus) e o vírus mosaico comum do feijoeiro (BV ou BCMVIbeam common mosaic virus). A transformação de plantas utilizando vírus de plantas é descrita na Patente Norte-Americana N° 4.855.237 (vírus mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67.553 (TMV), Pedido Japonês Publicado N° 63-14693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). As partículas pseudovirais para utilização na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas na WO 87/06261.

[00361] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o vírus utilizado para transformação transitória é avirulento e, dessa forma, é incapaz de causar sintomas graves como a taxa de crescimento reduzida, mosaico, manchas anelares, enrolamento da folha, amarelamento, estrias, formação de vesículas, formação de tumor e corrosão. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento que ocorra naturalmente ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação do vírus pode ser efetuada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando ao aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese dirigidas conforme descrito, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).

[00362] Cepas virais adequadas podem ser obtidas de fontes disponíveis, como, por exemplo, da Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC I American Type Culture Collection) ou pelo isolamento de plantas infectadas. 0 isolamento de vírus de tecidos vegetais infectados pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na técnica, conforme descrito, por exemplo, por Foster e Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Acredita-se que rapidamente, os tecidos de uma planta infectada contenham uma concentração elevada de um vírus adequado, preferivelmente folhas jovens e pétalas de flores, são trituradas em uma solução tampão (por exemplo, solução tampão fosfato) para produzir uma seiva infectada com vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.

[00363] A estrutura de vírus de RNA da planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleotídeo exógeno não-viral em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e Patente Norte-Americana N° 5.316.931.

[00364] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser feitas ao vírus propriamente dito. Alternativamente, o vírus pode primeiramente ser clonado em um plasmídeo bacteriano para facilitar a estrutura do vetor viral desejado com o DNA estranho. Então, o vírus pode ser extraído do plasmídeo. Se vírus for um vírus do DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral que é, então, replicado pela bactéria. A transcrição e a tradução desse DNA produzirá a proteína de revestimento que irá encapsular DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é, geralmente, clonado como um cDNA e introduzido em um plasmídeo. Então, o plasmídeo é utilizado para fazer todas as estruturas. Então, o vírus de RNA é produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídeo e tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsula o RNA viral.

[00365] Em uma aplicação, um polinucleotídeo viral de uma planta é fornecido, no qual a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência foi excluída de um polinucleotídeo viral, uma proteína de revestimento viral não nativa da planta codificando a sequência e um promotor não nativo, preferivelmente o promotor subgenômico da proteína de revestimento não nativa que codifica a sequência, capaz de se expressar no hospedeiro da planta, no envoltório do polinucleotídeo viral recombinante da planta e garantindo uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta, foi introduzido. Alternativamente o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela introdução da sequência de polinucleotídeo não nativo dentro dele, de forma que uma proteína seja produzida. 0 polinucleotídeo viral recombinante da planta pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos adicionais. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou de expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeos no hospedeiro da planta e incapaz de recombinar uns com ou outros e com os promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeo não nativas (estranhas) podem ser introduzidas adjacentes ao promotor subgenômico viral nativo da planta ou o promotor subgenômico viral nativo e o promotor subgenômico viral não nativo da planta, se houver mais de uma sequência de polinucleotídeo for incluída. As sequências de polinucleotídeo não nativas são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.

[00366] Em uma segunda aplicação, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido, como na primeira aplicação, exceto que a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência é colocada adjacente a um dos promotores genômicos da proteína de revestimento não nativa ao invés de uma sequência codificadora da proteína de revestimento não nativa.

[00367] Em uma terceira aplicação, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é fornecido, no qual o gene da proteína de revestimento nativa é adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foi(ram) inserido(s) no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos introduzidos são capazes de transcrever ou de expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de recombinar uns com ou outros e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativas podem ser introduzidas adjacentes aos promotores subgenômicos virais não nativos da planta de forma que as sequências são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir o produto desejado.

[00368] Em uma quarta aplicação, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido, como na terceira aplicação, de forma que a sequência codificadora da proteína de revestimento nativa seja substituída por uma sequência codificadora da proteína de revestimento não nativa.

[00369] Os vetores virais são encapsulados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta para produzir um vírus da planta recombinante. 0 polinucleotídeo viral recombinante da planta ou o vírus da planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras apropriadas. 0 polinucleotídeo viral recombinante da planta é capaz de replicação no hospedeiro, difusão sistêmica no hospedeiro e transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[00370] Técnicas para inoculação de vírus para plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado e Agrawa, eds. "Principles e Techniques in Plant Virology", Van NostrandReinhold, New York.

[00371] Além do exposto acima, o polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto permitindo, dessa forma, a expressão de cloroplasto.

[00372] Uma técnica para introduzir sequências de polinucleotídeo exógeno no genoma dos cloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os procedimentos a seguir. Primeiro, as células das plantas são tratadas quimicamente de forma a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente uma. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido através de bombardeamento de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula do polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos são selecionados de forma a serem integráveis no genoma do cloroplasto através de recombinação homóloga que é prontamente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Com essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos uma extensão do polinucleotídeo que é derivada do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável que serve, pelos procedimentos de seleção sequencial, para verificar se todas ou se substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto, após essa seleção, incluirão o polinucleotídeo exógeno. Detalhes adicionais relacionados a essa técnica são encontrados nas Patentes Norte-Americanas N° 4.945.050 e 5.693.507 que são incorporadas aqui por referência. Dessa forma, um polipeptídeo pode ser produzindo pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e se integra à membrana interna do cloroplasto.

[00373] Uma vez que os processos que aumentam a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de nitrogênio e/ou estresse abiótico de uma planta podem envolver múltiplos genes que agem aditivamente ou em sinergia (vide, por exemplo, em Quesda et al., Planta Physiol. 130:951-063, 2002), o presente pedido de patente de invenção também prevê a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma planta hospedeira única para, desta forma, alcançar efeito superior no teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[00374] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se múltiplas estruturas de ácido nucleico, cada uma incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma única célula vegetal. A célula transformada pode, então, ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.

[00375] De forma alternativa, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se, em uma única célula da planta, uma única estrutura de ácido nucleico incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotídeos exógenos. Essa estrutura pode ser desenhada com uma única sequência promotora que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico incluindo todas as sequências diferentes de polinucleotídeo exógeno. A fim de permitir a cotradução dos polipeptídeos diferentes codificados pelo RNA mensageiro policistrônica, as sequências de polinucleotídeos podem ser interligadas através de uma sequência do local interno de entrada do ribossomo (IRES I internal ribosome entry site) que facilita a tradução das sequências de polinucleotídeo posicionadas a jusante da sequência do IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita que codifica os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida tanto no terminal 5' que tem o cap quanto nas duas sequências internas do IRES da molécula de RNA policistrônico para, assim, produzir todos os diferentes polipeptídeos na célula. Alternativamente, a estrutura pode incluir diversas sequências promotoras, cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.

[00376] A célula da planta transformada com a estrutura, incluindo uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos diferentes, pode ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.

[00377] Alternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada introduzindo diferentes estruturas de ácido nucleico, incluindo polinucleotídeos exógenos diferentes, em uma pluralidade de plantas. As plantas transformadas regeneradas podem, então, ser cruzadas e a progênie resultante selecionada para obter traços superiores de tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso de fertilizante, crescimento, biomassa, produção e/ou vigor, utilizando técnicas convencionais de melhoramento de plantas.

[00378] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, o cultivo da planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob estresse abiótico.

[00379] Exemplos não limitantes de condições de estresse abiótico incluem salinidade, estresse osmótico, seca, privação de água, excesso de água (por exemplo, inundação, encharcamento), etiolação, baixa temperatura (por exemplo, estresse por frio), alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférico e irradiação UV.

[00380] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno em condições limitantes do fertilizante (por exemplo, condições limitantes de nitrogênio). Os exemplos não limitantes incluem o crescimento da planta nos solos com baixo teor de nitrogênio (4050% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais), ou mesmo em deficiência de nitrogênio severa (0 a 10% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais).

[00381] Dessa forma, o presente pedido de patente de invenção abrange plantas que expressam de forma exógena o(s) polinucleotídeo(s), as estruturas de ácido nucleico e/ou o(s) polipeptídeo(s) do presente pedido de patente de invenção.

[00382] Uma vez expresso dentro da célula da planta ou de toda a planta, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica, como ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de se ligarem especificamente ao polipeptídeo, Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA I enzyme-linked immuno sorbent assay), radioimunoensaios (RIAIradio-immuno-assays), imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e outros métodos semelhantes.

[00383] Métodos para determinar o nível do RNA transcrito do polinucleotídeo exógeno na planta são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise de Northern blot, análise de reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR I reverse transcription polymerase chain reaction) (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização in situ para RNA.

[00384] As informações e anotações da sequência não cobertas pelos presentes ensinamentos podem ser aproveitados em favor do melhoramento clássico. Assim, os dados da subsequência daqueles polinucleotídeos descritos acima podem ser utilizados como marcadores para seleção assistida pelo marcador (MASImarker assisted selection), na qual um marcador é utilizado para seleção indireta de um determinante ou determinantes genético(s) de um traço de interesse (por exemplo, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, produção, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso de nitrogênio e/ou eficiência no uso de fertilizantes). Os dados do ácido nucleico dos presentes ensinamentos (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou estar ligados a sítios polimórficos ou a marcadores genéticos no genoma como o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP I restriction fragment length polymorphism), microsatélites e polimorfismo de nucleotídeo único (SNP 1 single nucleotide polymorphism), impressão genética (DFP 1 DNA fingerprinting), polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP 1 amplified fragment length polymorphism), polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptídeo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou de RNA.

[00385] Exemplos de seleções assistidas do marcador incluem, mas não se limitam à seleção de um traço morfológico (por exemplo, um gene que afete a forma, a coloração, a esterilidade masculina ou a resistência como a presença ou a ausência de aresta, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma do arroz); seleção de um traço bioquímico (por exemplo, um gene que codifique uma proteína que possa ser extraída e observada; por exemplo, isozimas e proteínas de reserva); seleção de um traço biológico (por exemplo, (raças patogênicas ou biotipos de insetos com bases no patógeno hospedeiro ou a interação com o parasita hospedeiro pode ser utilizada como um marcador desde que a constituição genética de um organismo possa afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).

[00386] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos acima podem ser utilizados em uma ampla variedade de plantas econômicas, de forma segura e eficiente em termos de custo.

[00387] Linhagens vegetais que expressam de forma exógena o polinucleotídeo ou o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção são triadas para identificar aquelas que mostram o maior aumento do traço desejado da planta.

[00388] Portanto, de acordo com uma aplicação adicional do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de avaliação de um traço de uma planta, o método compreendendo: (a) expressar em uma planta ou em uma parte respectiva a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção; e (b) avaliar um traço de uma planta em comparação a uma planta do tipo selvagem do mesmo tipo (p.ex, não transformada com as biomoléculas reivindicadas); avaliando, deste modo, o traço da planta.

[00389] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de produção de uma colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, cerca de 80 %, pelo menos, cerca de 81 %, pelo menos, cerca de 82 %, pelo menos, cerca de 83 %, pelo menos, cerca de 84 %, pelo menos, cerca de 85 %, pelo menos, cerca de 86 %, pelo menos, cerca de 87 %, pelo menos, cerca de 88 %, pelo menos, cerca de 89 %, pelo menos, cerca de 90 %, pelo menos, cerca de 91 %, pelo menos, cerca de 92 %, pelo menos, cerca de 93 %, pelo menos, cerca de 94 %, pelo menos, cerca de 95 %, pelo menos, cerca de 96 %, pelo menos, cerca de 97 %, pelo menos, cerca de 98 %, pelo menos, cerca de 99 %, ou, digamos, 100 % homólogo à sequência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 e 4086, caracterizado pela planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso do nitrogênio), aumento do teor de óleo, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo, assim, a colheita.

[00390] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de produção de uma colheita, compreendendo o cultivo de uma colheita de uma planta expressando um polinucleotídeo exógeno que compreende uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-361, 602-2427 e 2428, caracterizado pela planta ser derivada de uma planta selecionada para aumento da produção, aumento da taxa de crescimento, aumento da biomassa, aumento do vigor, aumento da produção de fibra, aumento da qualidade da fibra, aumento da eficiência no uso de fertilizante (por exemplo, eficiência no uso do nitrogênio), aumento do teor de óleo, e/ou aumento da tolerância ao estresse abiótico, conforme comparado a uma planta de controle, produzindo assim a colheita.

[00391] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para cultivo de uma colheita, compreendendo a semeadura de sementes e/ou plantio de mudas de uma planta transformada com os polinucleotídeos exógenos do presente pedido de patente de invenção, por exemplo, os polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da produção, aumento da qualidade ou produção da fibra, aumento do teor de óleo, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da tolerância ao estresse abiótico e/ou aumento da eficiência no uso de nitrogênio, em comparação a uma planta não transformada.

[00392] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipetídeo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntico ao polipetídeo definido nas ID SEQ. N° 362-601, 2429-4085 ou 4086, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da produção, aumento da qualidade ou produção da fibra, aumento do teor de óleo, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da tolerância ao estresse abiótico e/ou aumento da eficiência no uso de nitrogênio em comparação a uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.

[00393] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucleico pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao polipetídeo definido nas ID SEQ. N° 1361, 602-2427 ou 2428, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, um traço selecionado do grupo constituído por aumento da produção, aumento da qualidade ou produção da fibra, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento do teor de óleo, aumento da tolerância ao estresse abiótico e/ou aumento da eficiência no uso de nitrogênio em comparação a uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.

[00394] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo) sobre a tolerância ao estresse abiótico pode ser determinado utilizando métodos conhecidos, conforme detalhado abaixo e na seção Exemplos a seguir.

[00395] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (isto é, expressando o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, como privação de água, temperatura subótima (baixa temperatura, temperatura elevada), deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, uma condição de estresse causada pelo sal, estresse osmótico, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00396] Ensaio de tolerância à salinidade - Espera-se que plantas transgênicas com tolerância a concentrações elevadas de sal apresentem melhor germinação, vigor da muda ou crescimento em condições com níveis elevados de sal. 0 estresse por sal pode ser efetuado de muitas maneiras como, por exemplo, irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando as plantas hidroponicamente em uma solução de cultivo hiperosmótica (por exemplo, solução de Hoagland), ou submetendo as plantas à cultura em meio de crescimento hiperosmótico [por exemplo, meio de Murashige-Skoog (meio MS) a 50%]. Como diferentes plantas variam consideravelmente em sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, na solução de crescimento ou no meio de crescimento pode ser ajustada de acordo com as características específicas do cultivar ou variedade específica da planta, de forma a infligir um efeito leve ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para conhecer as diretrizes com relação à concentração apropriada, consulte, Bernstein e Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A e Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., New York, 2002 e a referência lá contida).

[00397] Por exemplo, o teste de tolerância à salinidade pode ser realizado irrigando as plantas em diferentes estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (por exemplo, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM de NaCl) aplicadas de baixo e de cima para garantir uma dispersão regular do sal. Após a exposição à condição de estresse, as plantas são, frequentemente, monitoradas até que os efeitos fisiológicos e/ou morfológicos apareçam nas plantas do tipo selvagem. Dessa forma, a aparência fenotípica externa, o grau de emurchecimento e o sucesso geral para atingir a maturidade e a progênie da produção são comparados entre as plantas de controle e as transgênicas.

[00398] Os parâmetros quantitativos de tolerância medidos incluem, mas não estão limitados ao peso úmido e seco médio, à taxa de crescimento, ao tamanho da folha, à cobertura foliar (área foliar geral), ao peso das sementes geradas, ao tamanho médio das sementes e ao número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem maior biomassa do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

[00399] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios com cloreto de sódio e manitol) são realizados para determinar se um fenótipo de estresse osmótico era específico do cloreto de sódio ou se era um fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. As plantas tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou congelamento. Para experimentos de germinação sob estresse salino e osmótico, o meio é suplementado, por exemplo, com 50 mM, 100 mM, 200 mM de NaC1 ou com 100 mM, 200 mM NaC1, 400 mM de manitol.

[00400] Ensaio de tolerância à seca/Ensaio osmótico - A tolerância à seca é realizada para identificar os genes que conferem melhor sobreviria à planta depois de privação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico produzido pelo osmólito sorbitol não-iônico no meio pode ser realizado. Plantas de controle e transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de ágar em plantas por 4 dias, depois do que elas são transferidas para placas contendo 50 mM de sorbitol. 0 tratamento causa retardamento do crescimento, então, tanto as plantas de controle quanto as transgênicas são comparadas, medindo o peso da planta (úmida e seca), a produção e pelas taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração.

[00401] Inversamente, telas secas com base no solo são realizadas com plantas superexpressando os polinucleotídeos detalhados acima. Sementes de plantas Arabdopsis de controle, ou de outras plantas transgênicas superexpressando o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção são germinadas e transferidas para vasos. 0 estresse à seca é obtido depois que a irrigação é interrompida, acompanhada pela colocação dos vasos em papel absorvente para melhorar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controle são comparadas umas com as outras quando a maioria das plantas de controle desenvolvem emurchecimento grave. As plantas recebem água novamente depois de obter uma fração significativa das plantas de controle exigindo emurchecimento grave. As plantas são classificadas em comparação com os controles em relação a cada um dos dois critérios: tolerância às condições de seca e recuperação (sobrevida) após a reirrigação.

[00402] Tolerância ao estresse por frio - Para analisar o estresse por frio, plantas maduras (25 dias de idade) são transferidas para câmaras a 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Posteriormente, as plantas são devolvidas à estufa. Duas semanas depois, os danos causados pelo período de resfriamento, resultando no retardamento do crescimento e em outros fenótipos, são comparados entre as plantas tanto de controle quanto transgênicas, medindo o peso da planta (úmida e seca) e comparando as taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração, o tamanho da planta, a produção e parâmetros semelhantes.

[00403] Tolerância ao estresse por calor - A tolerância ao estresse por calor é alcançada expondo as plantas a temperaturas acima de 34 °C por um determinado período. A tolerância da planta é examinada depois de transferir as plantas de volta para 22 °C para recuperação e avaliação depois de 5 dias em relação aos controles internos (plantas não-transgênicas) ou plantas não expostas nem ao estresse por frio nem ao estresse por calor.

[00404] Eficiência no uso da água - pode ser determinada como a biomassa produzida por transpiração unitária. Para analisar a WUE, o teor de água relativo da folha pode ser medido em plantas de controle e transgênicas. 0 peso fresco (FWIfresh weight) é registrado imediatamente; então, as folhas são colocadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TWI turgid weight) é registrado. 0 peso seco (DW I dry weight) total é registrado depois da secagem das folhas a 60 °C a um peso constante. 0 teor relativo de água (RWC I relative water content) é calculado de acordo com a seguinte Fórmula I: Fórmula I RWC = [(FW - DW) / (TW - DW)] x 100

[00405] Eficiência no uso de fertilizante - Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas foram cultivadas em placas de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante, conforme descrito, por exemplo, em Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci EUA. 2004; 101:7833-8. As plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteína do broto e/ou grão. Os parâmetros verificados são o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos, o teor de óleo, etc. Semelhantemente, ao invés de fornecer nitrogênio em quantidades limitantes, fosfato ou potássio podem ser adicionados em concentrações crescentes. Novamente os mesmos parâmetros medidos são os mesmos listados acima. Dessa forma, a eficiência no uso de nitrogênio (NUE), a eficiência da utilização do fosfato (PUE phosphate use efficiency) e a eficiência da utilização de potássio (KUE I potassium use efficiency) são avaliadas, verificando a capacidade das plantas transgênicas de se desenvolverem sob condições de restrição de nutrientes.

[00406] Eficiência no uso de nitrogênio - Para analisar se as plantas transgênicas (por exemplo, plantas Arabidopsis) são mais responsivas ao nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75-3 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou 6-10 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permite-se que as plantas cresçam por 25 dias adicionais ou até a produção de semente. Então, as plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteína do broto e/ou do grão/semente. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos o teor de óleo. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem níveis maiores dos parâmetros medidos do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas eficientes na utilização do nitrogênio.

[00407] Ensaio de eficiência no uso de nitrogênio utilizando plântulas - 0 ensaio é realizado de acordo com Yanagisawa-S. et al. com pequenas modificações ("Metabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation e growth under low-nitrogen conditions" Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101, 7833-7838). Brevemente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7-10 dias em 0,5 x MS [Murashige-Skoog] suplementadas com um agente de seleção são transferidas para duas condições limitantes de nitrogênio: 0 meio MS no qual a concentração de nitrogênio combinada (NH4NO3 e KNO3) era de 0,75 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou de 6-15 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permitiu-se que as plantas crescessem por 30-40 dias adicionais e, então, foram fotografadas, removidas individualmente do Agar (o broto sem as raízes) e pesadas imediatamente (peso fresco) para análise estatística posterior. Estruturas para as quais somente sementes Ti estão disponíveis são semeadas em meio seletivo e pelo menos 20 mudas (cada uma representando um evento de transformação independente) são cuidadosamente transferidas para o meio limitante de nitrogênio. Para estruturas nas quais sementes T2 estão disponíveis, eventos de transformação diferentes são analisadas. Geralmente, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para o meio limitante de nitrogênio e permite-se que elas cresçam por 3-4 semanas adicionais e são pesadas individualmente no final daquele período. As plantas transgênicas são comparadas às plantas de controle cultivadas paralelamente sob as mesmas condições. Plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor ou plantas transgênicas carregando o mesmo promotor mas sem um gene repórter são utilizadas como controle.

[00408] Determinação do nitrogênio - O procedimento para a determinação da concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolve o método de digestão de persulfato de potássio para converter o N orgânico em NO3- (Purcell e King 1996 Argon. J. 88:111113), a redução mediada de Cd- modificada de NO3- a NO2(Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrito pelo ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorvência são medidos a 550 nm em relação a uma curva padrão de NaNO2. 0 procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.

[00409] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes de plantas transgênicas que poderiam completar o processo de germinação ao percentual de sementes das plantas de controle que são tratadas da mesma maneira. Condições normais são consideradas, por exemplo, incubações a 22 °C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação da germinação e do vigor da muda é realizada entre 4 e 14 dias após o plantio. 0 meio basal é o meio MS a 50% (Murashige e Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497). [0278] A germinação também é verificada em condições desfavoráveis como o frio (incubação a temperaturas inferiores a 10 °C ao invés de 22 °C) ou utilizando soluções para inibição da semente que contenham concentrações elevadas de um osmólito como o sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM e até 1000 mM) ou aplicando concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM de NaC1).

[00410] 0 efeito do transgene sobre o vigor, a taxa de crescimento, a biomassa, a produção e/ou o teor de óleo da planta pode ser determinado utilizando métodos conhecidos.

[00411] Vigor da planta - 0 vigor da planta pode ser calculado pelo aumento dos parâmetros de crescimento como a área de folha, o comprimento das fibras, o diâmetro da roseta, o peso fresco da planta e parâmetros semelhantes por período.

[00412] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida utilizando a análise digital de plantas cultivadas. Por exemplo, as imagens das plantas cultivadas em estufa com base no terreno podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. 0 crescimento da área da roseta é calculado utilizando a diferença da área da roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.

[00413] A avaliação da taxa de crescimento pode ser realizada medindo a biomassa produzida da planta, o tamanho da folha ou o comprimento da raiz por período (pode ser medido em cm2 por dia de área de folha).

[00414] A Área de Crescimento Relativo pode ser calculada utilizando a Fórmula II. Fórmula II: Área da Taxa de Crescimento = Coeficiente de regressão da área ao longo do tempo.

[00415] Assim, a área da taxa de crescimento é expressa em unidades de 1/dia e a taxa de crescimento do comprimento é expressa em unidades de 1/dia.

[00416] Produção de semente - A avaliação da produção de semente por planta pode ser realizada medindo a quantia (peso ou tamanho) ou quantidade (isto é, o número) de sementes secas produzidas e colhidas de 8-16 plantas e dividido pelo número de plantas.

[00417] Por exemplo, as sementes totais de 8-16 plantas podem ser coletadas e pesadas utilizando, por exemplo, uma balança analítica, e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. A produção de semente por área de cultivo pode ser calculado da mesma maneira levando em consideração a área de cultivo determinada para uma única planta. 0 aumento da produção de semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando a produção de semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas capazes de serem cultivadas em uma determinada área.

[00418] Além disso, a produção de semente pode ser determinado através do peso de 1000 sementes. 0 peso de 1000 sementes pode ser determinado como segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e uma fotografia é tirada. Cada amostra é pesada e, então, utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculado.

[00419] 0 Peso de 1000 Sementes pode ser calculado utilizando a Fórmula III: Fórmula III: Peso de 1000 Sementes = número de sementes na amostra / peso da amostra X 1000

[00420] O Índice de Colheita pode ser calculado utilizando a Fórmula IV.Fórmula IV: Índice de colheita = Produção médio da semente por planta / Peso seco médio.

[00421] Concentração de proteína no grão - O teor de proteína no grão (g de proteína no grão m-2) é estimado como o produto da massa do grão N (g de N do m-2) multiplicado pela taxa de conversão de N/proteína de k-5,13 (Mosse 1990, supra). A concentração de proteína no grão é estimada como a relação do teor de proteína no grão por massa unitária do grão (g de proteína no grão kg-1 do grão). [0290] Comprimento da fibra - 0 comprimento das fibras pode ser medido utilizando um fibrógrafo. O sistema de fibrógrafo foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento "Médio da Metade Superior". A média da metade superior (UHM 1 upper half mean) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição das fibras. 0 fibrógrafo mede o comprimento em comprimentos de envergadura em um determinado ponto percentual (http://www (ponto) cottoninc (ponto) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).

[00422] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o aumento da produção de milho pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes itens: aumento do número de plantas por área de cultivo, aumento do número de espigas por planta, aumento do número de fileiras por espiga, número de grãos por fileira da espiga, o peso do grão, o peso de mil grãos (peso por 1000), comprimento/diâmetro da espiga, aumento do teor de óleo por grão e aumento do teor de amido por grão

[00423] Conforme mencionado, o aumento da produção da planta pode ser determinado por vários parâmetros. Por exemplo, o aumento da produção de arroz pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento do peso por mil grãos (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de amido por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00424] De modo semelhante, o aumento da produção da soja pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de proteínas pro semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00425] 0 aumento da produção da canola pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00426] O aumento da produção do algodão pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de cápsulas por planta, número de sementes por cápsula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de mil sementes (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, melhora do comprimento das fibras, resistência das fibras, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

[00427] Teor de óleo - 0 teor de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da porção vegetal da planta. Brevemente, os lipídeos (óleo) podem ser removidos da planta (por exemplo, semente) moendo o tecido da planta na presença de solventes específicos (por exemplo, hexano ou éter de petróleo) e extraindo o óleo em um extrator contínuo. A análise indireta do teor de óleo pode ser realizada utilizando vários métodos conhecidos como a Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR I nuclear magnetic resonance), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, por exemplo, Conway TF. e Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Impresso) 1558-9331 (Onlinha)]; a Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NI 1 near infrared), que utiliza a absorção de energia infravermelha próxima (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito no W0/2001/023884, que é com base na extração de óleo com solvente, evaporando o solvente em uma corrente gasosa que forma partículas de óleo e direcionando uma luz para a corrente de gás e nas partículas de óleo, que forma uma luz refletida detectável.

[00428] Dessa forma, o presente pedido de patente de invenção é de alto valor agrícola para promover a produção de culturas comercialmente desejadas (por exemplo, biomassa de um órgão vegetal como a madeira do choupo, ou de um órgão reprodutor como o número de sementes ou a biomassa da semente).

[00429] Quaisquer das plantas transgênicas descritas acima ou partes delas podem ser processadas para produzir um alimento, uma ração, proteína ou preparação de óleo, como para animais ruminantes.

[00430] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um aumento do teor de óleo, podem ser utilizadas para produzir óleo vegetal (extraindo o óleo da planta).

[00431] 0 óleo vegetal (incluindo o óleo da semente e/ou o óleo da porção vegetal) produzido de acordo com o método do presente pedido de patente de invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com a utilização pretendido. Produtos exemplares incluem ração animal, matéria-prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício misturado, óleo edível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos e matéria-prima para processo de fermentação. Produtos exemplares a serem incorporados no óleo vegetal incluem rações animais, produtos alimentícios humanos como salgadinhos extrudados, pães, como um agente de ligação aos alimentos, rações para aquacultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas desportivas, barras alimentícias nutricionais, suplementos multivitamínicos, bebidas dietéticas e cereais.

[00432] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o óleo compreende um óleo de semente.

[00433] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o óleo compreende um óleo da porção vegetal (o óleo da porção vegetal da planta).

[00434] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula de planta forma uma parte da planta.

[00435] De acordo com outra aplicação do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um alimento ou ração, compreendendo as plantas ou uma parte respectiva do presente pedido de patente de invenção.

[00436] Conforme utilizado aqui, o termo "aproximadamente" refere-se a ± 10%.

[00437] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "apresentando" e suas conjugações significam "incluindo, mas não se limitando a".

[00438] O termo "consistindo de" significa "incluindo e limitado(a) a".

[00439] O termo "consistindo essencialmente de" significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas somente se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicado.

[00440] Conforme utilizada aqui, a forma singular "um", "uma" e "o/a" incluem referências no plural, exceto se contexto claramente especificar o contrário. por exemplo, termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas deles.

[00441] Ao longo do presente pedido, várias aplicações dessa invenção podem ser apresentadas em formato variado. Deve-se compreender que a descrição em formato variado é meramente para conveniência e brevidade e não deverá ser considerada como uma limitação inflexível do escopo do presente pedido de patente de invenção. Portanto, a descrição de uma variedade deve ser considerada como tendo especificamente revelado todas as subvariações possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro daquela variação. Ppor exemplo, a descrição de uma variação como a de 1 a 6 deve ser considerada como tendo especificamente revelado subvariações como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro daquela variação, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independente da amplitude da variação.

[00442] Sempre que uma variação numérica for indicada no presente documento, isso significa incluir qualquer numeral citado (fracional ou integral) dentro da variação indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indicado e um segundo número indicado e "variando/varia de" um primeiro número indicado "a" a um segundo número indicado são utilizadas aqui intercambiavelmente e significam incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionais e integrais entre eles.

[00443] Conforme utilizado aqui, o termo "método" refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa incluindo, mas não se limitando àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos sejam conhecidas, ou prontamente desenvolvidas a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.

[00444] Deve-se observar que determinadas características do presente pedido de patente de invenção, que são, para fins de esclarecimento, descritas no contexto de aplicações separadas, também podem ser apresentadas em combinação em uma única aplicação. Inversamente, várias características do presente pedido de patente de invenção, que são, para propósitos de brevidade, descritas no contexto de uma única aplicação, também podem ser apresentadas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou da forma apropriada em qualquer outra aplicação descrita do presente pedido de patente de invenção. Determinadas características descritas no contexto de várias aplicações não devem ser consideradas características essenciais dessas aplicações, a menos que a aplicação seja inoperante sem esses elementos.

[00445] Várias aplicações e aspectos do presente pedido de patente de invenção são delineados acima e, conforme reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontram suporte experimental nos exemplos a seguir. EXEMPLOS

[00446] Agora faz-se referência aos exemplos a seguir que, juntamente com as descrições acima, ilustram algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção de forma não limitante.

[00447] Geralmente, a nomenclatura utilizada no presente documento e os procedimentos laboratoriais utilizados no presente pedido de patente de invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Essas técnicas são explicadas minuciosamente na literatura. Vide, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias, conforme definidas nas Patentes Norte-Americanas N° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura científica e de patentes, vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas N° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Proteína Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos os quais são incorporados por referência como se totalmente estabelecidos no presente documento. Outras referências gerais são apresentadas ao longo do presente documento. Acredita-se que os procedimentos descritos nessas obras sejam bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas nelas são incorporadas aqui por referência.

MÉTODOS EXPERIMENTAIS GERAIS E BIOINFORMÁTICA

[00448] Extração de RNA - Tecidos cultivados em diversas condições de crescimento (conforme descrito abaixo) foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando Reagente TRIzol da Invitrogen [http://www (ponto) invitrogen (ponto) com/content (ponto)cfm?pageid=469]. Aproximadamente 30-50 mg de tecido foram coletados das amostradas. Os tecidos pesados foram triturados utilizando pilão e almofariz em nitrogênio líquido e ressuspensos em 500 pl de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100 pl de clorofórmio foram adicionados seguidos por precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol a 75%. 0 RNA foi eluído em 30 pl de água livre de RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza como minikit RNeasy da Qiagen de acordo com o protocolo do fabricante (QIAGEN Inc, CA EUA). Para conveniência, cada tipo de tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu uma Identificação do conjunto da expressão.

[00449] Análise de correlação - foi realizada para genes selecionados, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, nos quais os parâmetros caracterizados (parâmetros medidos de acordo com as Identidades de correlação) foram utilizados como 'eixo X" para a correlação com o transcriptoma do tecido que foi utilizado como "eixo Y". Para cada gene e parâmetro medido, foi calculado um coeficiente de correlação "R", utilizando a correlação de Ervilharson junto de um valor-p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (R) entre os níveis de uma expressão de gene em um determinado tecido e um desempenho fenotípico através de ecotipos/variedade/híbrido é alto em valor absoluto (entre 0,5-l), há uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão desse gene) e a característica fenotípica (por exemplo, aumento na produção, taxa de crescimento, eficiência no uso de nitrogénio, tolerância ao estresse abiótico e semelhantes).

EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE GENES E FUNÇÃO PREVISTA UTILIZANDO FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA

[00450] Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos que podem aumentar a produção de planta, produção de semente, produção de óleo, teor de óleo, biomassa, taxa de crescimento, produção e/ou qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio e/ou vigor de uma planta, como adiante.

[00451] Os conjuntos de dados da sequência de nucleotfdeos utilizados aqui foram das bases de dados disponíveis publicamente ou de sequências obtidas utilizando a tecnologia Solexa (por exemplo, cevada e sorgo). Os dados da sequência de 100 espécies diferentes de planta foram introduzidos em uma base de dados abrangente e única. Outras informações na expressão de gene, anotação de proteína, enzimas e caminhos também foram incorporadas. As principais bases de dados utilizadas incluem:

Genomas

[00452] Genoma de Arabidopsis [Genoma TAIR, versão 8 (http://www (ponto) arabidopsis (ponto) org/)]; Genoma de arroz [produção 6.0 (http://rgp (ponto) dna (ponto) affrc (ponto) go (ponto) jp/IRGSP/)]; Choupo [Populus trichocarpa, liberação 1.1 de JGI (liberação conjunta v1.0) (http://www (ponto) genome (ponto) jgi-psf (ponto) org/)]; Brachypodium [conjunto JGI 4x, http://www (ponto) brachypodium (ponto) org)]; Soja [DOE-JGI SCP, versão GlymaO (http://www (ponto) phytozome (ponto) net/)]; Uva [Consórcio Público Franco-Italiano para Caracterização do Genoma de Videiras (http://www (ponto) genoscope (ponto) ens (ponto) fir /)]; Mamona [TIGR/J, Instituto Craig Venter, conjunto 4x [(http://msc (ponto) jevi (ponto) org/r_communis]; Sorgo [DOE-JGI SCP, versão Sbil [http://www (ponto) phytozome (ponto) net/)]; Genoma parcialmente constituído do Milho [http://maizesequence (ponto) org/]; Sequências expressas de EST e mRNA foram extraídas das seguintes bases de dados: Sequências de EST e RNA do NCBI (http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/dbEST/); RefSeq (Http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/RefSeq/);

[00453] TAIR (Http://www (ponto) arabidopsis (ponto) org/); Bases de dados de proteínas e caminhos Uniprot [http://www (ponto) uniprot (ponto) org/].

[00454] AraCyc [http://www (ponto) arabidopsis (ponto) org/biocyc/index (ponto) jsp].

[00455] ENZYME [http://expasy (ponto) org/enzyme/].

[00456] Os conjuntos de dados de microarranjos foram baixados de: GEO (http: //www.ncbi .nlm. nih. qov/qeo/)

[00457] TAIR (http://www.arabidopsis.orq/).

[00458] Dados de microarranjos de propriedade exclusiva (Veja, W02008/122980) e Exemplos 2-9 abaixo.

[00459] Informações de QTL e SNP's Gramene [http://www (ponto) gramene (ponto) org/qtl/].

[00460] Panzea [http://www (ponto) panzea (ponto) org/index (ponto) html].

[00461] Montagem da Base de Dados - foi realizada para construir uma base de dados ampla, rica, anotada, confiável e fácil de analisar compreendendo sequências genômicas de mRNA, EST's, DNA, publicamente disponíveis, dados de várias culturas, bem como dados de expressão genética, anotação e caminho de proteínas, dados de QTLs e outras informações relevantes.

[00462] 0 conjunto de bases de dados compreende uma caixa de ferramentas de análise, aprimoramento, estruturação e anotação genética que permitem construir uma base de dados sob medida para cada projeto de descoberta genética. As ferramentas de aprimoramento e estruturação genética permitem detectar confiavelmente variantes reunidas e transcrições antisenso, gerando a compreensão de vários resultados fenotípicos potenciais de um único gene. As capacidades da plataforma "LEADS" da Compugen LTD de analisar o genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade científica [vide, por exemplo, "Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; "Splicing of Alu Sequences", LevMaor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; "Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information", Xie H et al. Genomics 2002] e comprovaram ser mais eficientes na genômica vegetal, também.

[00463] Agrupamento de EST e genético - Para o agrupamento genético e o agrupamento de organismos com dados disponíveis da sequência genômica (arabidopsis, arroz, mamona, uva, brachypodium, choupo, soja, sorgo), foi utilizada a versão genômica (GANG) do LEADS. Essa ferramenta permite o agrupamento mais preciso de sequências de EST's e mRNA no genoma, e prevê a estrutura genética, bem como, eventos alternativos de agrupamento e transcrição antisenso.

[00464] Para organismos sem dados completos de sequência genômica disponíveis, o software de agrupamento "expressed LEADS" foi aplicado.

[00465] Anotação genética - Genes e proteínas previstos foram anotados como segue: A busca de comparação de sequências [http://blast (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] contra todos os UniProt da planta [http://www (ponto) uniprot (ponto) org/] foi realizada. Estruturas de leitura abertas de cada transcrição putativa foram analisadas e o ORF mais longo com o número maior de homólogos foi selecionado como a proteína prevista da transcrição. As proteínas previstas foram analisadas pelo InterPro [http://www (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/interpro/].

[00466] A comparação contra proteínas das bases de dados AraCyc e ENZYME foi utilizada para mapear as transcrições previstas com os caminhos da AraCyc.

[00467] As proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas, utilizando o algoritmo de comparação [http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] para validar a exatidão da sequência de proteínas prevista e para a detecção eficiente de ortólogos.

[00468] Perfil da expressão genética - Diversas fontes de dados foram exploradas quanto ao perfil da expressão genética, a saber, dados de microarranjo e perfil de expressão digital (veja abaixo). De acordo com o perfil da expressão genética, uma análise de correlação foi realizada para identificar genes que são corregulados sob diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e associados com diferentes fenótipos.

[00469] Conjuntos de dados de microarranjos disponíveis publicamente foram baixados dos sites TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados na base de dados. 0 perfil de expressão é um dos mais importantes dados de recursos para identificar genes importantes para rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico das plantas e eficiência no uso de nitrogênio.

[00470] Um resumo digital do perfil de expressão foi compilado para cada agrupamento, de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros da sequência, compreendendo o agrupamento. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe o perfil virtual da expressão com base nas sequências EST que formam o agrupamento genético. A ferramenta apresenta o perfil da expressão de um agrupamento em termos de anatomia da planta (por exemplo, o tecido/órgão no qual o gene é expresso), o estágio de desenvolvimento (por exemplo, os estágios de desenvolvimento nos quais um gene pode ser encontrado/expressado) e o perfil de tratamento (apresenta as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso, como seca, frio, infecção por patógeno, etc.). Dada a distribuição aleatória de EST's nos diferentes agrupamentos, a expressão digital apresenta um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um agrupamento apresentar um total de N EST's para conter X EST's de uma determinada coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, leva-se em consideração o seguinte: a) o número de EST's no agrupamento, b) o número de EST's das bibliotecas envolvidas e relacionadas, c) o número geral de EST's disponíveis representando a espécie. Desse modo, agrupamentos com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com EST's do grupo de bibliotecas de interesse, indicando uma expressão especializada.

[00471] Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) em: XVII Conferência de Genomas Vegetais e Animais, San Diego, CA. A análise transcriptômica com base na abundância relativa de EST's nos dados foi realizada pelo pirosequenciamento 454 de cDNA representando o mRNA do melão. Quatorze amostras de cDNA de fita dupla obtidas de dois genótipos, dois tecidos de frutas (polpa e casca) e quatro estágios desenvolvimentais foram sequenciados. 0 pirosequenciamento por GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não-normalizadas e purificadas renderam 1.150.657 etiquetas de sequências expressas (EST's) que se agruparam em 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 contigs). A análise dos dados obtidos contra a Base de Dados Genômica de Cucurbitáceas [http://www (ponto) icugi (ponto) org/J confirmou a exatidão do sequenciamento e do agrupamento. Padrões de expressão de genes selecionados se encaixaram bem em seus dados de Qrt-per.

EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE DOS PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO, BIOMASSA E/OU VIGOR UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE GENOMA COMPLETO DE ARABIDOPSIS 44K

[00472] Para produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Arabidopsis thaliana, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp? 1Page=50879]. 0 oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 40.000 genes e transcrições de A. thaliana projetados com base nos dados da base de dados TIGR ATH1 v.5 e base de dados Arabidopsis MPSS (Universidade do Delaware). Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados aos componentes de biomassa, produção ou vigor, várias características da planta de 15 ecotipos diferentes Arabidopsis foram analisadas. Dentre elas, nove ecotipos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de corrrelação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos Experimentais

[00473] Tecidos Analisados de Arabidopsis - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento incluindo, raiz, folha, flor em antese, semente em 5 dias após a floração (DAFldays after flowering) e semente em 12 DAF, representando diferentes características de planta, foram provados e o RNA foi extraído, conforme descrito anteriormente em "MÉTODOS EXPERIMENTAIS GERAIS E BIOINFORMÁTICA". Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 Tecidos utilizados dos conjuntos de expressão de transcriptoma de Arabidopsis

Tabela 1: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Arabidopsis (1-5). DAF = dias após floração.

[00474] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor - Oito dos nove ecotipos de Arabidopsis foram utilizados em cada um dos 5 blocos repetitivos (nomeados A, B, C, D e E), cada um contendo 20 plantas por lote. As plantas foram cultivadas em uma estufa em condições controladas em 220C e fertilizante N:P:K (20:20:20; proporções em peso) [nitrogénio (N), fósforo (P) e potássio (K)] foi adicionado. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados através do estágio de semeadura das plantas cultivadas em uma cultura de tecido em placas de ágar transparente de cultivo vertical. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada pela formação de imagem digital.

[00475] Formação de Imagem Digital em Cultura de Tecido - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório foi utilizado para capturar imagens de brotos cortados em placas de ágar quadradas. 0 sistema de aquisição de imagem consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada a uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que incluiu 4 unidades de luz (lâmpadas de 4x150 Watts) e localizada em uma sala escura.

[00476] Formação de Imagem Digital em Estufa - 0 processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias começando no dia 7 até o dia 30. A mesma câmera anexada a uma lente de 24 mm de comprimento focal (Canon série EF), colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi utilizada para capturar as imagens de plantas cortadas maiores em banheiras brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As banheiras brancas eram de forma quadrada com medições de 36 x 26,2 cm e 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, as banheiras foram colocadas no pé da montagem de ferro, evitando a luz solar direta e fundição de sombras. Esse processo foi repetido a cada 3 a 4 dias por até 30 dias.

[00477] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos [U.S National Institutes of Health] livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 6 Mega Pixels (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia I Joint Photographic Experts Group standard) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00478] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, área, perímetro, comprimento e largura. No dia 30, 3 a 4 plantas representativas foram escolhidas de cada lote dos blocos A, e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada foi introduzida entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi tirada e os vários parâmetros (tais como área total da folha, comprimento laminar, etc.) foram calculados a partir das imagens. A circularidade da lâmina foi calculada como largura laminar dividida pelo comprimento laminar.

[00479] Análise da raiz - Durante 17 dias, os diferentes ecotipos foram cultivados em placas de ágar transparentes. As placas foram fotografadas a cada 3 dias começando no dia 7 na sala de fotografia e o desenvolvimento das raízes foi documentado (vide exemplos nas Figs. 3A-F). A taxa de crescimento das raízes foi calculada de acordo com a Fórmula V. Fórmula V: Taxa de crescimento da cobertura da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz ao longo do tempo.

[00480] Análise da taxa de crescimento vegetal - foi calculada de acordo com a Fórmula VI. A análise foi finalizada com a aparência de plantas sobrepostas. Fórmula VI: Área da taxa de crescimento vegetal = Coeficiente de regressão da área vegetativa ao longo do tempo.

[00481] Para comparação entre ecotipos, a taxa calculada foi normalizada utilizando o estágio de desenvolvimento da planta conforme representado pelo número de folhas verdadeiras. Nos casos onde as plantas com 8 folhas foram amostradas duas vezes (por exemplo, no dia 10 e no dia 13), apenas a maior amostra foi escolhida e adicionada à comparação de Anova.

[00482] Análise de sementes em síliquas - No dia 70, 15 a 17 síliquas foram coletados a partir de cada lote nos blocos D e E. Os síliquas escolhidos eram de cor marrom clara, mas ainda intacta. Os síliquas foram abertos na sala de fotografia e as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro, uma Fig. digital de alta resolução foi tirada para cada lote. Utilizando as imagens, o número de sementes por síliqua foi determinado.

[00483] Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes dos lotes dos blocos A-C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 grama foi medido para cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja d vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00484] Porcentagem de óleo nas sementes - No final do experimento, todas as sementes dos lotes dos blocos A-C foram coletadas. As sementes de Columbia de 3 lotes foram misturadas à terra e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat N° 080951 Biolab Ltd.) foram utilizados como o solvente. A extração foi realizada por 30 horas em calor médio de 50 °C. Uma vez que a extração tenha finalizado, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35°C e condições de vácuo. 0 processo foi repetido duas vezes. A informação obtida do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) foi utilizada para criar uma curva de calibração para a RMN de Baixa Ressonância. 0 teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinado utilizando a RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00485] Análise de comprimento de síliqua - No dia 50 após a semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada lote foram amostrados no bloco A. Os síliquas escolhidos eram da cor verde-amarelo e foram coletados a partir de partes inferiores de um caule da planta cultivada. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento do síliqua.

[00486] Peso seco e produção de semente - No dia 80 após a semeadura, as plantas dos blocos A-C foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. O peso da biomassa e semente de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (excluindo raízes) após secar a 30°C em uma câmara de secagem; Produção de semente por planta = peso total da semente por planta (g).

[00487] Produção de óleo - A produção de óleo foi calculada utilizando a Fórmula VII. Fórmula VII: Produção de óleo de semente = Produção de semente por planta (g.) * % de Óleo na semente.

[00488] Índice de colheita (semente) - 0 índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV (descrita acima): Índice de colheita = produção média de semente por planta/ Peso seco médio. Resultados Experimentais

[00489] Nove diferentes ecotipos de Arabidopsis foram cultivados e caracterizado com relação a 18 parâmetros (nomeados como vetores). Tabela 2 Parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores)

Tabela 2. São fornecidos os parâmetros correlacionados de Arabidopsis (ID de Correlação N° 1-18). Abreviações: Cm = centímetro(s); g = grama(s); mg = miligrama(s).

[00490] Os valores caracterizados são resumidos na Tabela 3 abaixo. Tabela 3 Parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis

Tabela 3: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: 3 = Produção de sementes por planta (grama); 7 = Produção de óleo por planta (mg); 6 = % de óleo por semente; 12 = Peso de 1000 sementes (g); 4 = Matéria seca por planta (g); 2 = Índice de colheita; 5 = Área total da folha por planta (cm); 1 = Sementes por síliqua; 18 = Comprimento da síliqua (cm) ; 13 = Taxa de crescimento vegetal (cm2/dia) até 8 folhas verdadeiras; 8 = Crescimento relativo da raiz (cm/dia) (dia 13); 9 = Comprimento da raiz no dia 7 (cm); 10 = Comprimento da raiz no dia 13 (cm) ; 11 = Peso fresco por planta (g) na fase de florescimento; 14. = Comprimento da lâmina (cm); 15 = Largura da lâmina (cm) ; 16 = Comprimento/largura da folha; 17 = Circularidade da lâmina. Tabela 4 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais em acessos de Arabidopsis

Tabela 4: São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [folha, flor, semente e raiz; Conjuntos de expressão (Exp.)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de vigor, produção, biomassa e/ou taxa de crescimento [Vetor de correlação (corr.)] sob condições de estresse ou condições normais em acessos de Arabidopsis. P = valor p.

EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE SOB CONDIÇÕES LIMITANTES DE NITROGÊNIO E NORMAIS UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE ARABIDOPSIS 44K

[00491] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Arabidopsis, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de Arabidopsis. Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados aos componentes de produção, NUE ou vigor, várias características de planta de 14 ecotipos diferentes de Arabidopsis foram analisadas. Dentre elas, dez ecotipos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos experimentais

[00492] Dois tecidos de plantas [folhas e caules] crescendo em dois diferentes níveis de fertilização de nitrogênio (Nitrogênio a 1,5 mM ou Nitrogênio a 6 mM) foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima em "MÉTODOS EXPERIMENTAIS GERAIS E BIOINFORMÁTICA". Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 5 abaixo. Tabela 5 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de transcriptoma de Arabidopsis

Tabela 5: São fornecidos os número de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Arabidopsis.

[00493] Avaliação de parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Arabidopsis sob diferentes níveis de fertilização de nitrogênio - 10 acessos de Arabidopsis em 2 lotes repetitivos, cada um contendo 8 plantas por lote, foram cultivados na estufa. 0 protocolo de cultivo utilizado foi o seguinte: sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em tubos Eppendorf contendo meio de sal basal Murashige-Skoog x 0,5 e cultivadas a 230C em ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas no escuto por 10 dias. Então, mudas de tamanhos similares foram cuidadosamente transferidas para potes preenchidos com uma mistura de perlita e turfa em uma proporção de 1:1. As condições limitantes de nitrogênio constantes foram alcançadas irrigando as plantas com uma solução contendo nitrogênio inorgânico a 1,5 mM na forma de KNO3, suplementado com CaCl2 a 2 mM, KH2PO4 a 1,25 mM, MgSO4 a1,50 mM, KC1 a 5 mM, H3BO3 a 0,01 mM e microelementos, enquanto condições normais de irrigação (condições normais de nitrogênio) foram alcançados aplicando uma solução de nitrogênio inorgânico a 6 mM também na forma de KNO3, suplementado com CaC12 a 2 mM, KH2PO4 a 1,25 mM, MgSO4 a 1,50 mM, H3BO3 a 0,01 mM e microelementos. Para seguir o crescimento da planta, bandejas foram fotografadas no dia que as condições limitantes de nitrogênio foram iniciadas e subsequentemente a cada 3 dias por cerca de mais 15 dias. A área de planta de roseta foi então determinada a partir das fotos digitais. 0 software ImageJ foi utilizado para quantificar o tamanho da planta das fotos digitais [http://rsb (ponto) info (ponto) nih (ponto) gov/ij/J utilizando scripts proprietários projetados para analisar o tamanho da área de roseta de plantas individuais como uma função de tempo. 0 sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos para arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00494] Os parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 6 aqui abaixo. Tabela 6 Parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores)

Tabela 6. São fornecidos os parâmetros correlacionados de Arabidopsis (vetores). "N" = Nitrogênio nas concentrações anotadas; "g" = gramas; "SPAD" = níveis de clorofila; "t50" = tempo onde 50% das plantas floresceram; "g/ unidade de SPAD" = biomassa da planta expressa em gramas por unidade de nitrogênio na planta medida por SPAD. "DW" = Peso Seco da Planta; "FW" = Peso Fresco da Planta; "nível N /DW" = nível de nitrogênio da planta medido na unidade SPAD por biomassa de planta [g]; "DW/ nível N" = biomassa da planta por planta [g]/ unidade SPAD; Área de roseta (medida utilizando análise digital); Cobertura de campo no dia indicado [](calculada dividindo a área de planta total pela área de lote total); área de lâmina foliar no dia indicado [cm2] (medida utilizando análise digital); RGR (taxa de crescimento relativa) da Área de roseta no dia indicado [cm2/dia]; t50 floração [dia] (o dia no qual 50% da planta floresceu); produção de semente/ área de roseta no dia 10 [g/cm2] (calculada); produção de semente/lâmina foliar [g/cm2] (calculada); produção de semente/ nível N [g/unidade SPAD] (calculada).

[00495] Avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção e NUE - Dez ecotipos de Arabidopsis foram cultivados em bandejas, cada contendo 8 plantas por lote, em uma estufa com condições de temperatura controladas por cerca de 12 semanas. As plantas foram irrigadas com concentração diferente de nitrogênio conforme descrito acima dependendo no tratamento aplicado. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada pela formação de imagem digital. Formação de Imagem Digital - Ensaio na Estufa

[00496] Um sistema de aquisição de imagem, consistindo em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 400D) anexada a uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon, série EF-S) colocada em uma montagem de alumínio personalizada, foi utilizado para capturar imagens de plantas plantadas em containers dentro de uma estufa controlada pelo ambiente. 0 processo de captura de imagem é repetido a cada 2 e 3 dias começando no dia 9 a 12 até o dia 16 a 19 (respectivamente) a partir do transplante.

[00497] O sistema de processamento de imagem que foi utilizado é descrito no Exemplo 2 acima. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem foram salvos para arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).

[00498] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, a área da lâmina foliar, cobertura de campo, diâmetro de roseta e área de roseta.

[00499] Área da taxa de crescimento relativa: A área da taxa de crescimento relativa da roseta e das folhas foi calculada de acordo com as Fórmulas VIII e IX, respectivamente. Fórmula VIII: Taxa de crescimento da área de roseta = Coeficiente de regressão da área de roseta ao longo do tempo. Fórmula IX: Taxa de crescimento do número da folha da planta = Coeficiente de regressão do número da folha da planta ao longo do tempo.

[00500] Produção de semente e peso de 1000 sementes - No final do experimento, todas as sementes de lotes foram coletadas e pesadas a fim de medir a produção de semente por planta em termos do peso de semente total por planta (g). Para o cálculo de peso de 1000 sementes, um peso médio de 0,02 grama foi medido de cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculada.

[00501] Peso seco e produção de semente - No final do experimento, a planta foi colhida e deixada secar a 30DC em uma câmara de secagem. A biomassa foi separada das sementes, pesadas e divididas pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 30 DC em uma câmara de secagem.

[00502] Índice de Colheita (semente) - 0 índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV, conforme descrito acima [Índice de colheita = produção média de semente por planta/ peso seco médio].

[00503] T50 dias para floração - Cada uma das repetições foi monitorada para a data da floração. Os dias de floração foram calculados a partir da data da semeadura até 50 % dos lotes floridos.

[00504] Nível de nitrogênio na planta - 0 teor de clorofila das folhas é um bom indicador do estado do nitrogênio na planta uma vez que o grau de verdor da folha está altamente correlacionado a esse parâmetro. 0 teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras de medição de SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram tiradas por lote. Com base nessa medição, os parâmetros tais como a proporção entre produção de semente por unidade de nitrogênio [produção de semente/ nível N = produção de semente por planta [g]/ unidade SPAD], planta DW por unidade de nitrogênio [DW/ nível N = biomassa da planta por planta [g]/ unidade SPAD], e nível de nitrogênio por grama de biomassa [N nível/DW= unidade SPAD/biomassa de planta por planta (g)] foram calculados.

[00505] Porcentagem de redução na produção de semente - mede a quantidade de sementes obtidas em plantas quando cultivadas em condições limitantes de nitrogênio comparado à produção de semente produzida em níveis normais de nitrogênio expressos em porcentagens (%). Resultados Experimentais

[00506] 10 diferentes acessos de Arabidopsis (ecotipos) foram cultivados e caracterizados com relação a 37 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabela 7 abaixo). A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma (Tabela 5) e os parâmetros médios foi conduzida. Tabela 7 Parâmetros medidos em acessos de Arabidopsis

[00507] Tabela 7: São fornecidos os parâmetros medidos sob vários tratamentos em vários ecotipos (acessos de Arabidopsis). Tabela 8 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais ou de estresse abiótico em acessos de Arabidopsis

Tabela 8. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou caules; conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de rendimento, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (Cor.)] em condições de estresse ou condições normais através em acessos de Arabidopsis. P = Valor P.

EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE TOMATE E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE TOMATE 44K

[00508] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre fenótipos relacionados à NUE e expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de tomate, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. 0 oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de tomate. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de produção, NUE e ABST, várias características de planta de 18 diferentes variedades de tomate foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades englobando a variação observada foram selecionadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [Http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

[00509] Correlação de variedades de tomate em ecotipos cultivados em condições de baixo nitrogênio, seca e cultivo regular. Procedimentos Experimentais:

[00510] 10 variedades de tomate foram cultivadas em 3 blocos repetitivos, cada um contendo 6 plantas por lote, em estufa com rede. Resumidamente, o protocolo de cultivo foi conforme segue: 1. Condições de cultivo regular: variedades de tomate foram cultivadas em condições normais (4-6 litros/m2 de água por dia e fertilizadas com NPK como recomendado nos protocolos para produção comercial de tomate).

[00511] Condições de fertilização de baixo nitrogênio: variedades de tomate foram cultivadas em condições normais (4-6 litros/m2 por dia e fertilizadas com NPK como recomendado nos protocolos para produção comercial de tomate) até o estágio de floração. Nesse momento, a fertilização com nitrogênio foi interrompida.

[00512] Estresse por Seca: uma variedade de tomate foi cultivada em condições normais (4-6 litros/m2 por dia) até o estágio de floração. Nesse momento, a irrigação foi reduzido para 50% comparado às condições normais. As plantas foram fenotipadas em uma base diária seguindo o descritor padrão de tomate (Tabela 10). A colheita foi conduzida enquanto 50 % dos frutos estavam vermelhos (maduros). As plantas foram separadas para a parte vegetal e frutos, deles, 2 nós foram analisados para parâmetros adicionais de inflorescencência tais como tamanho, número de flores, e preso de inflorescência. 0 peso fresco de todo material vegetal foi medido. Os frutos foram separados por cor (vermelho vs. verde) e de acordo com o tamanho do fruto (pequeno, médio e grande). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS). Os parâmetros de dados coletados são resumidos nas Tabelas 11-13 abaixo.

[00513] Tecidos de tomate analisados - Dois tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [flor e folha], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Por conveniência, cada tipo de tecido da informação da expressão do microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 9 abaixo. Tabela 9 Conjuntos de expressão de transcriptoma de tomate

Tabela 9: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão do tomate.

[00514] A Tabela 10 fornece os parâmetros correlacionados do tomate (Vetores). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores são resumidos nas Tabelas 11-13 abaixo. A análise de correlação subsequente foi conduzida. Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 10 Parâmetros correlacionados do tomate (vetores)

Tabela 10. São fornecidos os parâmetros correlacionados de tomate. "g" = gramas; "FW" = peso fresco; "NUE" = eficiência no uso de nitrogênio; "RWC" = teor relativo da água; "NUpE" = eficiência na absorção de nitrogênio; "SPAD" = níveis de clorofila (número); "HI" = índice de colheita (peso vegetal dividido na produção); "SLA" = área foliar específica (área foliar dividida pelo peso seco da folha), Tratamento no parêntese.Peso do fruto (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], todos os frutos dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados.

[00515] Os frutos totais foram contados e pesados. 0 peso médio dos frutos foi calculado dividindo o peso total do fruto pelo número de frutos.

[00516] Peso vegetal da planta (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], todas as plantas dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 0 peso fresco foi medido (gramas).

[00517] Peso de inflorescência (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelho)], duas inflorescências dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 0 peso da inflorescência (g) e número de flores por inflorescência foram contados.

[00518] SPAD - 0 teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram por lote.

[00519] Eficiência no uso da água (WUE) - pode ser terminada como a biomassa produzida por transpiração da unidade. Para analisar a WUE, o teor de água relativo à folha foi medido em plantas de controle e transgênicas. 0 peso fresco (FW) foi imediatamente gravado; então as folhas foram encharcadas por 8 horas em água destilada à temperatura ambiente no escuro, e o peso inchado (TW) foi gravado. 0 peso seco total (DW) foi gravado após secar as folhas a 60°C em um peso constante. 0 teor de água relativo (RWC) foi calculado de acordo com a Fórmula I a seguir [(FW - DW/TW - DW) x 100] conforme descrito acima.

[00520] As plantas que mantinham o teor de água relativo alto (RWC) comparado às linhas de controle foram consideradas mais tolerantes à estiagem do que aquelas que exibem teor de água relativo reduzido. Resultados Experimentais: Tabela 11 Parâmetros medidos em acessos de Tomate (linhas 1-6)

Tabela 11. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de tomate (ID de Semente) em todas as condições de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 12 Parâmetros medidos nos acessos de Tomate (linhas 7-12)

Tabela 12. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de tomate (ID de Semente) em todas as condições de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 13 Parâmetros medidos em acessos de Tomate (linhas 13-18)

Tabela 13: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de tomate (ID de Semente) em todas as condições de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 14 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais e de estresse em ecotipos de tomate

Tabela 14. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de Expressão (Exp)] e o desempenho fenotipico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor (vetor de correlação (Cor.))] sob condições normais em ecotipos de tomate. P = Valor P.

EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE TOMATE E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE TOMATE 44K

[00521] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotideo de tomate, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) Chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp? 1Page = 50879]. 0 oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de tomate. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de produção, ABST e NUE, várias características de planta de 18 diferentes variedades de tomate foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades englobando a variação observada foram selecionadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson. I. Correlação de variedades de Tomate em ecotipos cultivados sob condições de irrigação a 50%. Procedimentos Experimentais:

[00522] Processo de cultivo - Variedades de tomates foram cultivadas sob condições normais (4-6 litros/m2 por dia) até a fase de flor. Neste momento, a irrigação foi reduzida a 50% em comparação com as condições normais.

[00523] Extração do RNA - Dois tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento [flor e folha], representando as diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído como descrito acima.

[00524] Produção do Fruto (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)] todos os frutos dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados. Os frutos totais foram contados e pesados. 0 peso médio de frutos foi calculado dividindo-se o peso total do fruto pelo número de frutos.

[00525] Produção/SLA e Produção/área total da folha - A produção do fruto dividida pela área específica da folha ou a área total da folha fornece a medida de um equilíbrio entre processo produtivos e vegetais. os processos reprodutivos e vegetativos.

[00526] Peso fresco da planta (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], todas as plantas dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 0 peso fresco foi medido (gramas).

[00527] Peso de inflorescência (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelho)], duas inflorescências dos lotes 5 dentro dos blocos A-C foram coletadas. 0 peso da inflorescência (g) e número de flores por inflorescência foram contados.

[00528] SPAD - 0 teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente 10 desenvolvida. Três medições por folha foram por lote.

[00529] Eficiência no uso da água (WUE) - pode ser terminada como a biomassa produzida por transpiração da unidade. Para analisar a WUE, o teor de água relativo à folha foi medido em plantas de controle e transgênicas. 0 peso fresco (FW) foi imediatamente gravado; então as folhas foram encharcadas por 8 horas em 15 água destilada à temperatura ambiente no escuro, e o peso inchado (TW) foi gravado. 0 peso seco total (DW) foi gravado após secar as folhas a 600C em um peso constante. 0 teor de água relativo (RWC) foi calculado de acordo com a Fórmula I a seguir [(FW - DW/TW - DW) x 100], conforme descrito acima.

[00530] As plantas que mantiveram o teor de água relativo alto (RWC) 20 comparado às linhas de controle foram consideradas mais tolerantes à seca do que aquelas que exibiram teor de água relativo reduzido. Tabela 15 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de transcriptoma de tomate

Tabela 15: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão do tomate.

[00531] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de tomate sob irrigação de água a 50% - 10 variedades de tomate em 3 blocos repetitivos (chamado A, B e C), cada um contendo 6 plantas por lote, foram cultivados em estufa com rede. As plantas foram fenotipadas diariamente, seguindo o descritor padrão de tomate (Tabela 16, abaixo). A colheita foi conduzida enquanto 50% dos frutos estavam vermelhos (maduros). As plantas foram separadas em parte vegetal e frutos; deles, 2 nós foram analisados com relação aos parâmetros adicionais de inflorescencência, tais como tamanho, número de flores e peso de inflorescência. 0 peso fresco de todo o material vegetal foi medido. Os frutos foram separados por cor (vermelho versus verde) e de acordo com o tamanho do fruto (pequeno, médio e grande). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00532] Os parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 16 abaixo. Tabela 16 Parâmetros correlacionados ao Tomate (vetores)

Tabela 16: São fornecidos os parâmetros correlacionados ao tomate. "NUE" = eficiência no uso de nitrogênio; "DW" = peso seco; "cm" = centímetros. Resultados experimentais:

[00533] Extração de RNA - Todas as 10 variedades do tomate selecionadas foram amostradas com relação a cada tratamento. Dois tecidos [folhas e flores] cultivados em irrigação a 50% ou condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando o Reagente TRIzol, da Invitrogen [http://www (ponto) invitrogen (ponto) com/contente (ponto)cfm?pageid=469]. A extração do RNA de tecidos foi realizada, conforme descrito na seção "Métodos Experimentais Gerais e Bioinformática" acima.

[00534] 10 variedades diferentes de tomate (acessos) foram cultivadas e caracterizadas com relação a 20 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada parâmetro medido foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 17 e 18 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre a expressão de genes selecionados em vários conjuntos de expressão de transcriptoma e os parâmetros medidos em acessos de tomate (Tabelas 17 e 18) foi realizada e os resultados foram integrados ao banco de dados. Tabela 17 Parâmetros medidos em acessos de Tomate (linha 1-6)

Tabela 17. São fornecidos os parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção medidos sob parâmetros normais ou de eficiência no uso de nitrogênio para os acessos de tomate (Variedades), de acordo com os números do ID de Correlação (descritos na Tabela 16 acima). Tabela 18 Parâmetros medidos em acessos de Tomate (linha 7-12)

Tabela 18: São fornecidos os parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção medidos sob parâmetros normais ou de eficiência no uso de nitrogênio para os acessos de tomate (Variedades), de acordo com os números do ID de Correlação (descritos na Tabela 16 acima). Tabela 19 Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições de uso de nitrogênio baixa ou normal em acessos de tomate

Tabela 19. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas ou raízes; Conjuntos de expressão (Exp)] e a desempenho fenotipico em vários componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (corr.)] sob condições de estresse ou condições normais em acessos de tomate. P = valor de p.

EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE B. JUNCEA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS DE PRODUÇÃO UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE B. JUNCEA 60K

[00535] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de B. juncea, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp? 1Page=50879]. 0 oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcrições de B. juncea. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, várias características de planta de 11 variedades diferentes de B. juncea foram analisadas e utilizadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.

[00536] Correlação dos níveis de expressão dos genes de B. juncea com características fenotípicas em ecotipos Procedimentos Experimentais:

[00537] Onze variedades de B. juncea foram cultivadas em três lotes repetitivos, em campo. Em suma, o protocolo de cultivo foi como segue: as sementes de B. juncea foram semeadas em solo e cultivadas em condições normais até a colheita. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, as onze variedades diferentes B. juncea foram analisadas e utilizadas para análise de expressão de gene. Tabela 20 Tecidos utilizados para os conjuntos de expressão de transcriptoma de B. Juncea

Tabela 20: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de B. Juncea.

[00538] Extração de RNA- Todas as 1l variedades de B. juncea selecionadas foram amostradas para cada tratamento. Os tecidos da planta [folha, vagem, meristema lateral e flor] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima.

[00539] Os parâmetros de dados coletados foram conforme segue: - Peso fresco (lote-colheita) [g/planta] - o peso fresco total por lote no momento da colheita foi normalizado para o número de plantas por lote; - Peso da Semente [miligramas /planta] - as sementes totais de cada lote foram extraídas, pesadas e normalizadas para o número de planta em cada lote; - Índice de colheita - 0 índice de colheita foi calculado: peso da semente/peso fresco; - Dias até florescimento/floração - número de dias até 50% de florescimento/floração para cada lote; - SPAD - 0 teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por cada lote; - Ramo principal - comprimento médio do nó - comprimento total/número total de nós no ramo principal; - Ramo lateral - comprimento médio do nó - comprimento total/ número total de nós no ramo lateral; - Ramo principal - 20° comprimento - o comprimento da vagem no 20° nó do ápice do ramo principal; Ramo lateral - 20° comprimento - o comprimento da vagem no 20° nó do ápice do ramo lateral; - Ramo principal - número da 20a semente- número de sementes na vagem no 20° nó do ápice do ramo principal; - Ramo lateral - número da 20a semente - número de sementes na vagem no 20° nó do ápice do ramo lateral; - Número de ramos laterais - número total dos ramos laterais, média de três plantas por lote; Altura do ramo principal [cm] - comprimento total do ramo principal; Posição mínima do ramo lateral- o menor nó no ramo principal que desenvolveu o ramo lateral; - Posição máxima do ramo lateral [número do nó do ramo principal] - o maior nó no ramo principal que desenvolveu o ramo lateral; - Número máximo de nós no ramo lateral - o maior número de nós que um ramo lateral tinha por planta; - Comprimento máximo do ramo lateral [cm] - o maior comprimento de ramo lateral por planta; - Diâmetro máximo do ramo lateral [mm] - o maior diâmetro base que um ramo lateral tinha por planta; - Teor de óleo - uma análise indireta do teor de óleo foi realizada utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMNINuclear Magnetic Resonance), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, por exemplo, Conway TF. e Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin /Heidelberg, ISSN: 0003021X (Print) 1558-9331 (Online)]; - Peso fresco (planta única) (g/planta) - peso fresco médio de três plantas por lote tirado na metade da estação; - Diâmetro base do ramo principal [mm] - o diâmetro com base do ramo principal, média de três plantas por lote; - 1000 Sementes [g] - peso de 1000 sementes por lote. Resultados Experimentais: Onze diferentes variedades de B. juncea (isto é, ID's de Semente 646, 648, 650, 657, 661, 662, 663, 664, 669, 670, 671) foram cultivadas e caracterizadas com relação a 23 parâmetros, conforme especificado acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores são resumidos nas Tabelas 22-23 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de expressão de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida. Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 21 Parâmetros medidos em acessos de B. Juncea

Tabela 21. São fornecidos os parâmetros correlacionados a B. juncea. "g" = gramas; mm = milímetros; "cm" = centímetros; "mg" = miligramas; "SPAD" = níveis de clorofila. Tabela 22

Tabela 22: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de B. juncea (ID de Semente) em condições normais. Tabela 23 Parâmetros medidos em acessos de B. juncea (linhas 7-11)

Tabela 23: São fornecidos os valores de cada dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de B. juncea (ID de Semente) em condições normais. Tabela 24 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais ou de estresse em acessos de B.

Tabela 24. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folhas, meristema, flor e vagens; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (cor.)] sob condições normais ou condições de estresse em acessos de B. juncea. P = Valor p.

EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE B. JUNCEA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS DE PRODUÇÃO DE JUNCEA CULTIVADA SOB VÁRIAS DENSIDADES DE POPULAÇÃO UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE B. JUNCEA 60K

[00540] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de B. juncea, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp? 1Page=50879]. 0 oliqonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcrições de B. juncea. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, várias características de planta de duas variedades diferentes de B. juncea cultivadas em sete diferentes densidades de população foram analisadas e utilizadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.

[00541] Correlação dos níveis de expressão dos genes de B. juncea com características fenotípicas em sete densidades de população para dois ecotipos Procedimentos experimentais:

[00542] Duas variedades de B. juncea foram cultivadas em campo em sete densidades de população (10, 60, 120, 160, 200, 250 e 300 plantas por m2) em dois lotes repetitivos. Em suma, o protocolo de cultivo foi como segue: as sementes de B. juncea foram semeadas no solo e cultivadas em condição normal até a colheita. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, as duas variedades diferentes de B. juncea cultivadas em várias densidades de população foram analisadas e utilizadas para análise de expressão de gene. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson para cada ecotipo independentemente. Tabela 25 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de transcriptoma de B. Juncea

Tabela 25: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de B. Juncea.

[00543] Extração de RNA - as duas variedades de B. juncea cultivadas em sete densidades de população foram amostradas para cada tratamento. Os tecidos de planta [flor e meristema lateral] crescendo em condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto.

[00544] Os parâmetros de dados coletados foram conforme segue: Peso fresco (lote-colheita) [g/planta] - peso fresco total por lote no momento da colheita normalizado para o número de plantas por lote.

[00545] Peso da semente [g/planta] - sementes totais de cada lote foram extraídas, pesadas e normalizadas para o número da planta em cada lote.

[00546] índice de colheita - 0 índice de colheita foi calculado: peso da semente/peso fresco.

[00547] Dias até florescimento/floração - número de dias até 50% de florescimento/floração para cada lote.

[00548] SPAD - o teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por cada lote.

[00549] Ramo principal - comprimento médio do nó - comprimento total/número total de nós no ramo principal.

[00550] Ramo lateral - comprimento médio do nó - comprimento total/número total de nós no ramo lateral.

[00551] Ramo principal - 20° comprimento - o comprimento da vagem no 20° nó do ápice do ramo principal.

[00552] Ramo lateral - 20° comprimento - o comprimento da vagem no 20° nó do ápice do ramo lateral.

[00553] Ramo principal - número da 20a semente-número de sementes na vagem no 20° nó do ápice do ramo principal.

[00554] Ramo lateral - número da 20a semente - número de sementes na vagem no 20° nó do ápice do ramo lateral.

[00555] Número de ramos laterais - número total dos ramos laterais, média de três plantas por lote.

[00556] Altura do ramo principal [cm] - comprimento total do ramo principal.

[00557] Posição mínima do ramo lateral- o menor nó no ramo principal que desenvolveu o ramo lateral.

[00558] Posição máxima do ramo lateral [número do nó do ramo principal] - o maior nó no ramo principal que desenvolveu o ramo lateral.

[00559] Número máximo de nós no ramo lateral - o maior número de nó que um ramo lateral tinha por planta.

[00560] Comprimento máximo do ramo lateral [cm] o maior comprimento do ramo lateral por planta.

[00561] Diâmetro máximo do ramo lateral [mm] - o maior diâmetro de base que um ramo lateral tinha por planta.

[00562] Teor de óleo - análise indireta do teor de óleo foi realizada utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, por exemplo, Conway TF. e Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin/Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Print) 15589331 (Online)]; Peso fresco (planta única) (g/planta) - peso fresco médio de três plantas por lote tirado na metade da estação.

[00563] Diâmetro de base do ramo principal [mm] o diâmetro com base do ramo principal, média de três plantas por lote.

[00564] 1000 Sementes [g] - peso de 1000 sementes por lote.

[00565] Ramo principal- número total de vagens - número total de vagens no ramo principal, média de três plantas por lote.

[00566] Ramo principal-dist. 1-20 - o comprimento entre a vagem mais jovem e vagem número 20 no ramo principal, média de três plantas por lote.

[00567] Ramo lateral- número total de vagens - número total de vagens no menor ramo lateral, média de três plantas por lote.

[00568] Ramo lateral-dis. 1-20 - o comprimento entre a vagem mais jovem e vagem número 20 no menor ramo lateral, média de três plantas por lote.

[00569] Peso seco/planta - peso total das plantas por lote na colheita após três dias no forno a 600C normalizado para o número de plantas por lote.

[00570] Área foliar total - área foliar total por lote foi calculada com base nas três plantas aleatórias e normalizada para o número de plantas por lote.

[00571] Perímetro Total - perímetro total de folhas foi calculado com base nas três plantas aleatórias e normalizado para o número de plantas por lote. Resultados Experimentais:

[00572] Duas variedades de B. juncea foram cultivadas em sete diferentes densidades de população e caraterizadas com relação a 30 [parâmetros]. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 27-29 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre a expressão de genes selecionados em vários conjuntos expressão de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida. Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 26 Parâmetros de correlação em acessos de B. Juncea

Tabela 26. São fornecidos os parâmetros correlacionados de B. juncea. "g" = gramas; mm= milímetros; "cm" = centímetros; "mg" = miligramas; "SPAD" = níveis de clorofila; "Kg." = quilogramas. Tabela 27 Parâmetros medidos em acessos de B. juncea em várias densidades de população (linhas 1-6)

Tabela 27. Tabela 28 Parâmetros medidos em acessos de B. juncea em várias densidades de população (linhas 7-12)

Tabela 28. Tabela 29 Parâmetros medidos em acessos de B. juncea em várias densidades de população (linhas 13-14)

Tabela 29: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em B. juncea (cultivadas em sete densidades de população (Densidade de População)) sob condições normais. Parâm. = parâmetro. Tabela 30 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais em diferentes densidades em acessos de B. Juncea

Tabela 30. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [meristema e flor; Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em vários componentes da produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (cor.)] sob condições de estresse e condições normais em acessos de B. juncea. P = Valor p.

EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À ABST UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO 44K

[00573] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de sorgo, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp? 1Page=50879]. 0 oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de sorgo. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou aos componentes de produção, ABST e NUE, várias características de planta de 17 híbridos diferentes de sorgo foram analisadas. Dentre eles, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

[00574] Correlação de variedades de sorgo em ecotipos cultivados sob condições regulares de cultivo, condições graves de seca e condições de baixo nitrogênio Procedimentos experimentais: 17 variedades de sorgo foram cultivadas em 3 lotes repetitivos, em campo. Em suma, o protocolo de cultivo foi conforme segue: Condições regulares de cultivo: as plantas de sorgo foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação (370 litros por metro2, fertilização de 14 unidades de 21% de ureia por período de cultivo inteiro).

[00575] Condições de seca: sementes de sorgo foram semeadas no solo e cultivadas em condição normal até cerca de 35 dias a partir da semeadura, por volta do estágio V8 (oito folhas verdes são totalmente expandidas, inicialização não iniciada ainda). Nesse ponto, a irrigação foi interrompida, e estresse de estiagem severa foi desenvolvido.

[00576] Condições de fertilização de baixo nitrogênio: as plantas de sorgo foram fertilizadas com 50% menos quantidade de nitrogênio no campo do que a quantidade de nitrogênio aplicada no tratamento de cultivo regular. Todos os fertilizantes foram aplicados antes da floração.

[00577] Tecidos de Sorgo Analisados - todos os 10 híbridos de sorgo selecionados foram amostrados por cada tratamento. Os tecidos [folha bandeira, meristema da flor e flor] das plantas cultivadas sob condições normais, estresse grave de seca e condições de baixo nitrogênio foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 31 abaixo. Tabela 31 Conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo

Tabela 31: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo 1, 2, 3 e 4. Folha bandeira = a folha abaixo da flor; Meristema de flor = Meristema apical após a iniciação da panícula; Flor = a flor no dia da antese. Os conjuntos de expressão 1, 2 e 3 são de plantas cultivadas sob condições normais. Os conjuntos de expressão 4 a 6 são derivados de plantas cultivadas sob condições de baixo nitrogênio. Os conjuntos de expressão 7 a 9 são de plantas cultivadas sob condições de seca.

[00578] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de formação de imagem digital: No final do período de cultivo, os grãos foram separados da 'Cabeça' da Planta e os parâmetros a seguir foram medidos e coletados: Área Média do Grão (cm2) - Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir das imagens divididas pelo número de grãos.

[00579] (I) Proporção Média Superior e Inferior da Área do Grão, largura, diâmetro e perímetro - A projeção do grão da área, largura, diâmetro e perímetro foram extraídos das imagens digitais utilizando o pacote de fonte aberta imagej (nih). Os dados da semente foram analisados em níveis médios de lote como segue: Média de todas as sementes; Média de fração superior de 20% - continha fração superior de 20% das sementes; Média de fração inferior de 20% - continha fração inferior de 20% das sementes; Adicionalmente, a proporção entre cada fração e a média do lote foi calculada para cada um dos parâmetros de dados; No final do período de cultivo, 5 'cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo; Área Média da Cabeça (cm2) - No final do período de cultivo, 5 'cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da 'cabeça' foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de 'cabeças'.

[00580] Comprimento Médio da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo, 5 'cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. 0 comprimento da 'cabeça' (eixo mais longo) foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de 'cabeças'.

[00581] Largura Média da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo, 5 'cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A largura da 'cabeça' foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de 'cabeças'; Largura Média da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo, 5 'Cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. 0 perímetro da 'cabeça' foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de 'cabeças'.

[00582] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, consistindo em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, um software de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área de semente e comprimento de semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software JMP de análise estatística (Instituto SAS).

[00583] Parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 5 plantas por lote ou pela medição do parâmetro em todas as plantas dentro do lote.

[00584] Peso Total do Grão /Cabeça (g) (produção do grão) - No final do experimento ('Cabeças' da planta), as cabeças dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 5 cabeças foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as cabeças adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. 0 peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de cabeças por lote (com base no lote). No caso das 5 cabeças, o peso total dos grãos de 5 cabeças foi dividido por 5.

[00585] FW da Cabeça/Grama da Planta - No final do experimento (quando as cabeças foram colhidas) total e 5 cabeças selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As cabeças (total e 5) foram pesadas (gr.) separadamente e o peso fresco médio por planta foi calculado para total (Cabeça FW /Planta gr. com base no lote) e para 5 (Cabeça FW /Planta gr. com base nas 5 plantas).

[00586] Altura da Planta - As plantas foram caracterizadas para altura durante o período de cultivo em 5 pontos no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas para sua altura utilizando uma fita de medição. A altura foi medida a partir do nível do solo para o topo da folha mais longa.

[00587] SPAD - 0 teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote.

[00588] Peso fresco vegetal e Cabeças - No final do experimento (quando a inflorescências estava seca), toda a inflorescência e material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados. 0 peso da biomassa e Cabeças de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de Cabeças.

[00589] Biomassa da planta (Peso fresco) - No final do experimento (quando a inflorescências estava seca), o material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados. A biomassa das plantas sem a inflorescência foi medida e dividida pelo número das plantas.

[00590] FW das Cabeças / (FW das Cabeças + FW das Plantas) - 0 peso fresco total das cabeças e sua respectiva biomassa de planta foi medido no dia da colheita. 0 peso das cabeças foi dividido pela soma dos pesos das cabeças e das plantas. Resultados Experimentais:

[00591] 17 variedades diferentes de sorgo foram cultivadas e caracterizadas com relação a diferentes parâmetros. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 33-34) e uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de expressão de transcriptoma (Tabela 31) e os parâmetros médios (Tabelas 33-34) foi conduzida(Tabela 35). Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 32 Parâmetros correlacionados de Sorgo (vetores)

Tabela 32. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores). "g" = gramas; "SPAD" = níveis de clorofila; "FW" = Peso fresco da Planta; "normal" = condições de cultivo padrão. Tabela 33 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo

Tabela 33: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ecotipo) sob condições normais, de baixo na seção de procedimento experimental. Tabela 34 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo

Tabela 34: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ecotipo) sob condições normais, de baixo nitrogênio e de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 35 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotipico sob condições normais ou de estresse abiótico em acessos de Sorgo

Tabela 35. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes que melhoram a produção e seus homólogos em tecidos [Folha bandeira, Meristema de flor, caule e Flor; conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico em vários componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (cor.)] sob condições de estresse (por exemplo, seca ou baixo nitrogênio) ou condições normais em acessos de Sorgo. P = Valor p.

EXEMPLO 9 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SOJA (GLYCINE MAX) E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS DE PRODUÇÃO UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SOJA 44K B.

[00592] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotideo de soja, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp? lPage=50879]. 0 oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 42.000 genes e transcrições de soja. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou aos componentes de produção ou aos parâmetros relacionados à arquitetura da planta, várias características de planta de 29 variedades diferentes de Glycine max foram analisadas e 12 variedades foram, ainda, utilizadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.

[00593] Correlação dos níveis de expressão de genes de Glycine max com características fenotípicas em ecotipos Procedimentos experimentais:

[00594] 29 variedades de soja foram cultivadas em três lotes repetitivos, em campo. Em suma, o protocolo de cultivo foi conforme segue: as sementes de soja foram semeadas no solo e cultivadas sob condições normais até a colheita. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou aos componentes de produção ou aos parâmetros relacionados à arquitetura da planta, 12 variedades diferentes de soja (de 29 variedades) foram analisadas e utilizadas para análises de expressão de gene. A análise foi realizada em dois períodos de tempo predeterminados: no conjunto da vagem (quando as vagens da soja foram formadas) e no momento da colheita (quando as vagens da soja estavam prontas para colheita, com sementes maduras). Tabela 36 Conjuntos de expressão de transcriptoma de soja

Tabela 36.

[00595] Extração de RNA - Todas as 12 variedades de soja selecionadas foram amostradas por tratamento. Os tecidos da planta [folha, raiz, caule, vagem, meristema apical, botões de Flor] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima.

[00596] Os parâmetros de dados coletados foram conforme segue: Diâmetro da base do ramo principal [mm] no conjunto de vagem - o diâmetro da base do ramo principal (diâmetro com base), média de três plantas por lote.

[00597] Peso fresco [g/planta] no conjunto de vagem - peso total da parte vegetativa acima do solo (excluindo raízes) antes de secar no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00598] Peso seco [g/planta] no conjunto de vagem - peso total da parte vegetativa acima do solo (excluindo raízes) após secar a 70°C em forno por 48 horas no conjunto da vagem, média de três plantas por lote.

[00599] Número total de nós com vagens nos ramos laterais [valor/planta] - contagem dos nós que contêm vagens em ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00600] Número de ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00601] Peso total dos ramos laterais no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00602] Peso total das vagens no caule principal no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todas as vagens no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00603] Número total de nós no caule principal [valor/planta] - contagem do número de nós no caule principal começando do primeiro nó acima do solo, média de três plantas por lote.

[00604] Número total de vagens com 1 semente nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 1 semente em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00605] Número Total de vagens com 2 sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 2 sementes em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00606] Número total de vagens com 3 sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 3 sementes em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00607] Número total de vagens com 4 sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 4 sementes em todos os ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00608] Número total de vagens com 1 semente no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 1 semente no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00609] Número total de vagens com 2 sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 2 sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00610] Número total de vagens com 3 sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 3 sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00611] Número total de vagens com 4 sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de vagens contendo 4 sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00612] Número total de sementes por planta no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número de sementes nos ramos laterais e caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00613] Número total de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número total de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00614] Número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem [valor/planta] - contagem do número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00615] Altura da planta no conjunto de vagem [cm/planta] - comprimento total da parte de cima do solo até a ponta do caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00616] Altura da planta na colheita [cm/planta] - comprimento total da parte de cima do solo até a ponta do caule principal na colheita, média de três plantas por lote.

[00617] Peso total de vagens nos ramos laterais no conjunto de vagem [g/planta] - peso de todas as vagens nos ramos laterais no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00618] Número proporcional de vagens por nó no caule principal no conjunto de vagem - calculada na fórmula X, média de três plantas por lote.

[00619] Fórmula X: Número total de vagens no caule principal /Número total de nós no caule principal, média de três plantas por lote.

[00620] Proporção do número total de sementes no caule principal para o número de sementes nos ramos laterais - calculada na fórmula XI, média de três plantas por lote. Fórmula XI: Número total de sementes no caule principal no conjunto de vagem/ Número total de sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem.

[00621] Peso total das vagens por planta no conjunto de vagem [gr/planta] - peso de todas as vagens nos ramos laterais e caule principal no conjunto de vagem, média de três plantas por lote.

[00622] Dias até 50% da floração [dias] - número de dias até 50% da floração para cada lote.

[00623] Dias até 100% da floração [dias] - número de dias até 100% da floração para cada lote.

[00624] Maturidade [dias] - medida como 95% das vagens em um lote amadureceram (se tornaram 100% marrons). Queda atrasada da folha e caules verdes não são considerados na atribuição de maturidade. Os testes são observados 3 dias por semana, dia sim, dia não, para maturidade. A data da maturidade, isto é, a data que 95% das vagens alcançaram a cor final. A maturidade é expressa em dias após 31 de agosto [de acordo com a definição aceita de maturidade nos Estados Unidos, Lista de Descritores para SOJA, http://www (ponto) ars-grin (ponto) gov/cgi-bin/npgs/html/desclist (ponto) pl? 51].

[00625] Qualidade da Semente [classificada 1-5] - medida na colheita, uma estimativa visual com base em várias centenas de sementes. O parâmetro é classificado de acordo com as pontuações a seguir, considerando a quantidade e o grau de enrugamento, revestimento com defeito (rachaduras), sem esverdeado e mofado ou outro pigmento. Classificação é 1-muito bom, 2-bom, 3-razoável, 4-pobre, 5-muito pobre.

[00626] Alojamento [classificado de 1 a 5] - é classificado na maturidade por lote, de acordo com as pontuações a seguir: 1 - a maioria das plantas em um lote está ereta, 2 - todas as plantas inclinando-se ligeiramente ou algumas plantas para baixo, 3 - todas as plantas inclinando-se moderadamente, ou 25% a 50% para baixo, 4 - todas as plantas inclinando-se consideravelmente, ou 50% a 80% para baixo, 5 - a maioria das plantas está para baixo. Nota: uma pontuação intermediária, tal como 1,5, é aceitável.

[00627] Tamanho da Semente [g] - peso de 1000 sementes por lote normalizado para 13% de umidade, medido na colheita.

[00628] Peso total das sementes por planta [g/planta] - calculado na colheita (por 2 fileiras internas de um lote podado) como peso em gramas de sementes limpas ajustadas para 13% de umidade e divididas pelo número total de plantas em duas fileiras internas de um lote podado.

[00629] Produção na colheita [alqueire/hectare] - calculada na colheita (por 2 fileiras internas de um lote podado) como peso em gramas de sementes limpas, ajustadas para 13% de umidade, e então expressas como alqueires por acre.

[00630] Sementes médias do ramo lateral por vagem [número] - calcular o N° de Sementes nos ramos laterais em conjunto de vagem e dividir pelo Número de Número total de vagens com sementes nos ramos laterais no conjunto de vagem.

[00631] Sementes médias no caule principal por vagem [número] - calcular o Número total de Sementes no caule principal no conjunto de vagem e dividir pelo Número do Número total de vagens com sementes no caule principal na consolidação da vagem.

[00632] Comprimento do entrenó médio no caule principal [cm] - calcular a altura da planta no conjunto de vagem e dividir pelo Número total de nós no caule principal na consolidação da vagem.

[00633] Número total de vagens com sementes no caule principal [número] - contar todas as vagens contendo sementes no caule principal na consolidação da vagem.

[00634] Número total de vagens com sementes nos ramos laterais [número]- contar todas as vagens contendo sementes nos ramos laterais na consolidação da vagem.

[00635] Número total de vagens por planta no conjunto de vagem [número]- contar as vagens no caule principal e ramos laterais na consolidação da vagem. Resultados Experimentais:

[00636] Doze variedades diferentes de soja foram cultivadas e caracterizadas com relação a 40 parâmetros, conforme especificado acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 38-39 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de expressão de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida. Os resultados foram, então, integrados à base de dados (Tabela 40). Tabela 37 Parâmetros correlacionados à Soja (vetores)

Tabela 37. Tabela 38 Parâmetros medidos em variedades da soja (linhas 1-6)

Tabela 38. Tabela 39 Parâmetros medidos nas variedades da soja (linhas 7-12)

Tabela 39. Tabela 40 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais em variedades da soja

Tabela 40. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [conjuntos de Expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico [produção, biomassa, e arquitetura da planta (vetor de correlação (Cor.) )] sob condições normais em variedades da soja. P = Valor p.

EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE BRACHYPODIUM E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE BRACHYPODIUM 60K

[00637] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de brachypodium, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. 0 oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcrições de brachypodium. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA e os parâmetros relacionados à produção ou vigor, foram analisadas várias características das plantas de 24 acessos de brachypodium diferentes. Entre eles, 22 acessos abrangendo a variação observada foram selecionados para análise da expressão do RNA e análise de hibridização genômica comparativa (CGH I comparative genomic hybridization).

[00638] A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

[00639] Uma análise de correlação adicional foi realizada comparando o fenótipo da planta e o número de cópia do gene. A correlação entre os níveis de sinal de hibridização do número de cópia normalizado e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos experimentais:

[00640] Tecidos de Brachypodium analisados - dois tecidos [folha e espiga] foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Para cada tipo de tecido, as informações de expressão de microarranjo receberam um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 41 a seguir. Tabela 41 Conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada

Tabela 41: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de cevada.

[00641] Avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor e componentes de produção de brachypodium - 24 acessos de brachypodium foram cultivados em 4-6 unidades repetitivas (8 plantas por unidade), em uma estufa. O protocolo de cultivo se deu conforme segue: as sementes de brachypodium foram semeadas em unidades e plantadas sob condições normais. As plantas foram continuamente fenotipadas durante o período de crescimento e na colheita (Tabelas 43-48 abaixo). 0 sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido pelo Instituto Nacional da Saúde dos Estados Unidos e gratuitamente disponível na internet [Http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (Instituto SAS).

[00642] No final do período de cultivo, os grãos foram separados das espigas e os seguintes parâmetros foram medidos, utilizando o sistema de imagem digital e coletados.

[00643] Número de perfilhos - todos os perfilhos foram contados por planta na colheita (média por unidade).

[00644] Número de Cabeças - No final do estudo, as cabeças foram colhidas a partir de cada lote e foram contadas.

[00645] Peso Total dos Grãos por unidade (g) - No final do estudo ("Cabeças" da planta) as cabeças das unidades foram colhidas, debulhadas e os grãos foram pesados. Ademais, o peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de cabeças por unidade (com base na unidade).

[00646] Maior número de espiguetas - 0 maior número de espiguetas por cabeça foi calculado por planta (média por unidade).

[00647] Número médio de espiguetas - 0 número médio de espiguetas por cabeça foi calculado por planta (média por unidade).

[00648] Altura da planta - Cada uma das plantas foi medida quanto à altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até a base da espiga da maior espiga na colheita.

[00649] Peso das espiguetas (g)- 0 peso da biomassa e das espigas de cada unidade foi separado, medido pela unidade.

[00650] Peso médio da cabeça - calculado dividindo o peso da espigueta pelo número da cabeça (g)

[00651] Índice de Colheita - o índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XII.

[00652] Índice de Espiguetas - 0 índice de espiguetas é calculado utilizando a Fórmula XIII.

[00653] Fórmula XIII: Índice de Espiguetas = Peso médio das Espiguetas por planta/ (Peso seco médio vegetal por planta mais peso médio de espiguetas por planta).

[00654] Número percentual de cabeças com espiguetas - 0 número de cabeças com mais de uma espigueta por planta foi contado e o percentual a partir de todas as cabeças por planta foi calculado.

[00655] Matéria seca total por lote - Calculada como parte vegetal acima do solo, mais todo o peso seco de espiguetas por lote.

[00656] Peso de 1000 grãos - No final do estudo, todos os grãos de todos os lotes foram recolhidos e pesados e o peso de 1000 foram calculados.

[00657] Os parâmetros a seguir foram coletados por meio de sistema de imagem digital: No final do período de cultivo, os grãos foram separados das espigas e os seguintes parâmetros foram medidos e coletados.

[00658] Área Média de Grãos (cm2) - Uma amostra de -. 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir dessas imagens e foi dividida pelo número de grãos.

[00659] Perímetro, largura e comprimento Médio de Grãos (cm) - Uma amostra de - 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos do grão (eixo mais longo) foi medida a partir dessas imagens e dividida pelo número de grãos.

[00660] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3 . 0 GHz ) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido pelo Instituto Nacional da Saúde dos Estados Unidos e gratuitamente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas na resolução de 10 megapixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em baixa compressão em formato JPEG. Em seguida, os dados de saída do processamento de imagem para a área de semente e o comprimento de semente foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (Instituto SAS). Tabela 42 Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)

Tabela 42: São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Brachypodium. Resultados Experimentais:

[00661] 24 diferentes acessos de Brachypodium foram cultivados e caracterizados com relação a diferentes parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 43-48 abaixo. Uma análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios (Tabelas 43-48) foi conduzida. Na sequência, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 43 Parâmetros medidos dos ID's de Correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais (linhas 1-9)

Tabela 43. Os ID's de Correlação referem-se àqueles descritos na Tabela 42 acima [Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)]. Tabela 44 Parâmetros medidos dos ID' s de Correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais (linhas 10-18)

Tabela 44. Os ID's de Correlação referem-se àqueles descritos na Tabela 42 acima [Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)]. Tabela 45 Parâmetros medidos dos ID's de Correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais (linhas 19-22)

Tabela 45. Os ID's de Correlação referem-se àqueles descritos na Tabela 42 acima [Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)]. Tabela 46 Parâmetros medidos dos ID's de Correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais (linhas 23-30)

[00662] Tabela 46. Os ID's de Correlação referem-se àqueles descritos na Tabela 42 acima [Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)]. Tabela 47 Parâmetros medidos dos ID's de Correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais (linhas 31-40)

Tabela 47. Os ID's de Correlação referem-se àqueles descritos na Tabela 42 acima [Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)]. Tabela 48 Parâmetros medidos dos ID's de Correlação em acessos de Brachypodium sob condições normais (linhas 41-44)

Tabela 48. Os ID's de Correlação referem-se àqueles descritos na Tabela 42 acima [Parâmetros correlacionados ao Brachypodium (vetores)]. Tabela 49 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais em variedades de Brachypodium

Tabela 49. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em t vigor [Vetor de correlação (corr.)] sob condições normais em acessos de Brachypodium. P = valor p.

EXEMPLO 11 DESENVOLVIMENTO DA FIBRA DA PLANTA EM ALGODÃO. PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ALGODÃO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE ALGODÃO

[00663] A fim de conduzir uma análise de correlação de expressão de gene de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de algodão, projetado e produzido pela "Comparative Evolutionary Genomics of Cotton" [http://cottonevolution (ponto) info/). Esse Microarranjo de Oligonucleotídeo de Algodão é composto por 12.006 oligonucleotídeos de Tecnologias de DNA Integradas (IDT Integrated DNA Technologies) derivados de um conjunto de mais de 180.000 EST's de Gossypium sequenciados de 30 bibliotecas de cDNA. Para obter detalhes adicionais, vide PCT/IL2005/000627 e PCT/IL2007/001590, os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Tabela 50 Conjuntos experimentais de transcriptoma de algodão

Tabela 50. São fornecidos os conjuntos de expressões de transcriptoma de algodão.

[00664] A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e o comprimento da fibra, fibras de 8 diferentes linhas de algodão foram analisadas. Essas fibras foram selecionadas por mostrar uma qualidade muito boa da fibra e um alto índice de fibras de algodão (tipos Pima, originados de outros tipos de algodão, a saber, G. barbadense), diferentes níveis de qualidade e índices de fibras de algodão de várias linhas G. hirsutum: boa qualidade e alto índice de fibras de algodão (tipo Acala) e baixa qualidade e baixo índice de fibra de algodão (tipo Tamcot e variedades antigas). Um resumo do comprimento da fibra das diferentes linhas é fornecido na Tabela 51. Procedimentos Experimentais:

[00665] Extração de RNA - Os estágios de desenvolvimento da fibra, representando diferentes características da fibra em 5, 10 e 15 DPA's, foram apresentados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima.

[00666] Avaliação do comprimento da fibra - 0 comprimento da fibra das linhas de algodão selecionadas foi medido utilizando um fibrógrafo. 0 sistema de fibrógrafo foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento "Médio da Metade Superior". A média da metade superior (UHMIupper half mean) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição da fibra. 0 fibrógrafo mede o comprimento em vãos em uma dada porcentagem: www (ponto) cottoninc (ponto) com/ClassificationofCotton/? Pg=4#Length]. Resultados Experimentais:

[00667] Oito diferentes linhas de algodão foram cultivadas e seu comprimento de fibra foi medido. Os valores UHM das fibras foram resumidos na Tabela 51 aqui abaixo. 0 R quadrado foi calculado para cada um dos genes. Tabela 51 Resumo do comprimento da fibra das 8 diferentes linhas de algodão

Tabela 51. São apresentadas as médias das 8 diferentes linhas de algodão. Tabela 52 Correlação entre o nível de expressão de genes selecionados de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção em vários tecidos e o desempenho fenotípico sob condições normais em ecotipos de algodão

Tabela 52: São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão dos genes que melhoram a produção e seus homólogos em vários tecidos [Conjuntos de expressão (Exp)] e o desempenho fenotípico [componentes de produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor [Vetor de correlação (corr.)] sob condições normais em ecotipos de algodão. P = valor p. EXEMPLO 12 IDENTIFICAÇÃO DOS GENES QUE AUMENTAM A PRODUÇÃO, BIOMASSA, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, TEOR DE ÓLEO, TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO DE PLANTAS E EFICIÊNCIA NO USO DE NITROGÊNIO

[00668] Com base nas ferramentas experimentais e de bioinformática descritas acima, os presentes inventores identificaram 164 genes que têm um impacto maior na produção, produção de semente, produção de óleo, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio quando a expressão dos mesmos é aumentada nas plantas. Os genes identificados (incluindo genes identificados pelas ferramentas de bioinformática e sequências curadas respectivas) e as sequências de polipeptídeo codificadas relacionadas são resumidos na Tabela 53 abaixo. Tabela 53 Polinucleotídeos identificados que afetam a produção da planta, produção de semente, produção de óleo, teor de óleo, biomassa, taxa de crescimento, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.

Tabela 53: São fornecidos os genes identificados, sua anotação (etiqueta de agrupamento), organismo e identificadores de sequência de polinucleotídeo e polipeptídeo. "polin." = polinucleotídeo; "polip." = polipeptídeo.

EXEMPLO 13 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS QUE AUMENTAM A PRODUÇÃO DE SEMENTE, PRODUÇÃO DE ÓLEO, TAXA DE CRESCIMENTO, TEOR DE ÓLEO, PRODUÇÃO DA FIBRA, QUALIDADE DA FIBRA, BIOMASSA, VIGOR, ABST E/OU NUE DE UMA PLANTA

[00669] Os conceitos de ortologia e paralogia foram recentemente aplicados às caracterizações funcionais e classificações na escala de comparações de genoma total. Ortólogos e parálogos constituem dois principais tipos de homólogos: o primeiro evoluiu de um ancestral comum por especialização, e os últimos estão relacionados por eventos de duplicação. Supõe-se que parálogos resultantes de eventos de duplicação antigos sejam prováveis de ter divergido em função enquanto ortólogos verdadeiros são mais prováveis de reter função idêntica durante o tempo evolucionário.

[00670] Para identificar os ortólogos putativos dos genes que afetam a produção de planta, produção de óleo, teor de óleo, produção de semente, taxa de crescimento, vigor, biomassa, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio, todas as sequências foram alinhadas utilizandoa ferramenta BLAST (basic local alignment search tooliferramenta de busca de alinhamento de base local). As sequências suficientemente similares foram provisoriamente agrupadas. Esses ortólogos putativos foram ainda organizados em um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) assumido como uma representação da relação evolucionária dentre a taxa biológica. Os grupos ortólogos putativos foram analisados quanto a seu acordo com o filograma e em casos de desacordos, esses grupos de ortólogos foram consequentemente quebrados.

[00671] Os dados de expressão foram analisados e as bibliotecas EST foram classificadas utilizando um vocabulário fixo de termos personalizados, tais como estágios de desenvolvimento (por exemplo, genes mostrando o perfil de expressão similar através do desenvolvimento com uma regulação para cima em estágio específico, tal como no estágio de preenchimento da semente) e/ou órgão da planta (por exemplo, genes mostrando perfil de expressão similar através de seus órgãos com regulação para cima em órgãos específicos tais como semente). As anotações de todas as ESTs agrupadas em um foram analisadas estatisticamente comparando sua frequência no grupo versus sua abundância na base de dados, permitindo a construção de um perfil de expressão numérica e gráfica daquele gene, que é nomeado "expressão digital". A lógica de utilizar esses dois métodos complementares com métodos de estudos de associação fenotípica de QTLs, SNPs e correlação de expressão de fenótipo é com base no pressuposto que ortólogos verdadeiros são prováveis de reter função idêntica sobre o tempo evolucionário. Esses métodos proveem diferentes conjuntos de indicações nas similaridades da função entre dois genes homólogos, similaridades no nível da sequência - aminoácidos idênticos nos domínios da proteína e similaridade nos perfis de expressão.

[00672] A pesquisa e identificação de genes homólogos envolve a digitalização de informação da sequência disponível, por exemplo, em base de dados pública tais como a Base de Dados de DNA do Japão (DDBJIDNA Database of Japan), Genbank, e a Base de Dados da Sequência de Ácido Nucleico do Laboratório de Biologia Molecular Europeia (EMBL I European Molecular Biology Laboratory) ou versões do mesmo ou a base de dados do MIPS. Vários algoritmos diferentes de pesquisa foram desenvolvidos, incluindo, entre outros, o conjunto de programas referidos como programas de BLAST. Há cinco implementações de BLAST, três projetadas para consultas de sequência de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX, e TBLASTX) e duas projetadas para consultadas de sequência de proteína (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Análise, I: 543, 1997). Tais métodos envolvem o alinhamento e comparação das sequências. 0 algoritmo de BLAST calcula a identidade da sequência por cento e realizada uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. 0 software para realizar a análise de BLAST está publicamente disponível pelo Centro Nacional para Informação de Biotecnologia. Outro software ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximizam o número de resultados e minimizam o número de lacunas.

[00673] Os genes homólogos podem pertencer à mesma família de gene. A análise de uma família de gene pode ser realizada utilizando análise de similaridade de sequência. Para realizar essa análise, uma pode utilizar os programas padrão para múltiplos alinhamentos, por exemplo, Clustal W. Uma árvore de junção vizinha das proteínas homólogas para os genes nessa invenção pode ser utilizada para prover uma visão global das relações estruturais e ancestrais. A identidade da sequência pode ser calculada utilizando um programa de alinhamento conforme descrito acima. Espera-se que outras plantas levarão um gene funcional similar (ortólogos) ou uma família de genes similares e aqueles genes proverão o mesmo fenótipo preferido como os genes apresentados aqui. Vantajosamente, esses membros de família podem ser úteis nos métodos do presente pedido de patente de invenção. Exemplo de outras plantas estão incluídos aqui, entre outros, cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), milho (Zea mays), algodão (Gossypium), colza oleaginosa (Brassica napus), arroz (Oryza sativa), cana de açúcar (Saccharum officinarum), Sorgo (Sorgo bicolor), Soja (Glycine max), girassol (Helianthus annuus), Tomate (Lycopersicon esculentum), trigo (Triticum aestivum).

[00674] As análises mencionadas acima para homologia de sequência podem ser realizadas em uma sequência de comprimento total, mas também podem ser com base em uma comparação de certas regiões tais como domínios conservados. A identificação de tais domínios também estaria bem dentro do domínio do especialista na técnica e envolveria, por exemplo, um formato legível no computador dos ácidos nucleicos do presente pedido de patente de invenção, a utilização dos programas de software de alinhamento e a utilização de informação publicamente disponível nos domínios de proteína, motivos conservados e caixas. Essa informação está disponível na base de dados do PRODOM (http://www (ponto) biochem (ponto) ucl (ponto) ac (ponto) uk/bsm/dbbrowser/protocolo/prodomqry (ponto) html), PIR (http://pir (ponto) Georgetown (ponto) edu/) ou Pfam (http://www (ponto) sanger (ponto) ac (ponto) uk/Software/Pfam/). Os programas da análise de sequência projetados para pesquisa de motivo podem ser utilizados para identificação dos fragmentos, regiões e domínios conservados conforme mencionado acima. Os programas de computador preferidos incluem, entre outros, MEME, SIGNALSCAN, e GENESCAN.

[00675] Um especialista na técnica pode utilizar as sequências homólogas fornecidas aqui para encontrar sequências similares em outras espécies e outros organismos.

[00676] Homólogos de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que têm substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácido, relativos à proteína não modificada em questões e que têm atividade biológica e funcional similar como a proteína não modificada da qual eles são derivados. Para produzir tais homólogos, os aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm propriedades similares (mudanças conservadoras, tais como hidrofobicidade similar, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar ou quebrar as estruturas a-helicais ou estruturas de 3 folhas). As tabelas de substituição conservadora são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman e Company). Homólogos de um ácido nucleico englobam ácidos nucleicos que têm substituições, exclusões e/ou inserções de nucleotídeos relativas ao ácido nucleico não modificado em questão e que têm atividade biológica e funcional similar como o ácido nucleico não modificado do qual eles são derivados.

[00677] Os polinucleotídeos e polipeptídeos com uma homologia significativa aos genes identificados descritos na Tabela 53 (Exemplo 12, acima) foram identificados a partir das bases de dados, utilizando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn como filtros para a primeira fase, e a agulha (pacote EMBOSS) ou alinhamento FRAME+ algoritmo para a segunda fase. A identidade local (alinhamentos Blast) foi definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências porque utiliza tão somente um filtro para a fase de alinhamento global. A filtragem padrão do pacote Blast não foi usada (estabelecendo o parâmetro "-F F").

[00678] No segundo estágio, os homólogos foram definidos com base na identidade global de, pelo menos, 80% para a sequência polipeptídica genética principal.

[00679] Duas formas distintas para encontrar o alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou de nucleotídeos foram utilizadas neste pedido.

[00680] Entre duas proteínas (após o filtro blastp): Algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman- Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. 0 restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.

[00681] Entre uma sequência de proteína e uma sequência nucleotídica (após o filtro rblastn): Aplicativo GenCore 6.0 OneModel, utilizando o algoritmo Frame+ com os seguintes parâmetros: model=frame+ p2n.model mode=qglobal -q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. 0 restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.

[00682] As sequências de polipeptídeos de consulta foram as ID SEQ N° 362-601 (que são codificadas pelos polinucleotídeos da ID SEQ N° 1-361, apresentados na Tabela 53, acima), e as sequências ortólogas e homólogas identificadas tendo, pelo menos, 80% da identidade da sequência global são fornecidas na Tabela 54, abaixo. Espera-se que estes genes homólogos aumentem a produção da planta, produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo, taxa de crescimento, produção de fibra, qualidade da fibra, biomassa, vigor, ABST e/ ou NUE de uma planta. Tabela 54 Polinucleotídeos e polipeptídeos homólogos que podem aumentar a produção da planta, produção de semente, produção de óleo, teor de óleo, taxa de crescimento, produção da fibra, qualidade da fibra, biomassa, vigor, ABST e/ou NUE de uma planta.

Tabela 54: São fornecidos polinucleotídeos (P.N.) e polipeptídeos (P.P.) que são homólogos aos polinucleotídeos ou polipeptídeos identificados da Tabela 53. Hom. = homólogo; Algor. = Algoritmo.

EXEMPLO 14 CLONAGEM DE GENE E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO DA PLANTA

[00683] Para validar seu papel na melhoria da produção da planta, teor de óleo, produção da semente, biomassa, taxa de crescimento, produção da fibra, qualidade da fibra, ABST, NUE e/ou vigor, os genes selecionados foram superexpressos nas plantas, conforme segue. Estratégia de Clonagem

[00684] Os genes selecionados daqueles listados nos Exemplos 1 e 13 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, o quadro de leitura aberta (ORFlopen reading frame) de comprimento total foi primeiro identificado. No caso de grupos ORF- EST e em alguns casos já publicados, as sequências de mRNA foram analisadas para identificar o quadro de leitura aberta total comparando os resultados de diversos algoritmos de tradução para proteínas conhecidas de outras espécies de planta. Para clonar os cDNA's de comprimento total, uma transcrição reversa (RT I reverse transcription) seguida pela reação de cadeia polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído das folhas, flores, síliquas ou outros tecidos da planta, crescendo em condições normais e diferentes. 0 RNA total foi extraído, conforme descrito nos "MÉTODOS EXPERIMENTAIS GERAIS E BIOINFORMÁTICA" acima. A produção de cDNA e amplificação de PCR foi realizada utilizando protocolos padrão descritos em outro lugar (Sambrook J., E.F. Fritsch, e T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.) que são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Os produtos de PCR foram purificados utilizando um kit de purificação de PCR (Qiagen). No caso onde a sequência de codificação total não foi encontrada, o kit RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends I Amplificação Rápida de Finais de cDNA) da Invitrogen foi utilizado para acessar o transcrito de cDNA total do gene a partir das amostras de RNA descritas acima. Os produtos de RACE foram clonados em vetor de cópia alto seguido pelo sequenciamento ou diretamente sequenciado.

[00685] A informação do procedimento RACE foi utilizada para clonagem de ORF de comprimento total dos genes correspondentes.

[00686] No caso do DNA genômico ser clonado, os genes foram amplificados por PCR direto em DNA genômico extraído do tecido da folha utilizando o kit DNAeasy (Qiagen Cat. No. 69104).

[00687] Normalmente, 2 conjuntos de iniciadores foram sintetizados para a amplificação de cada gene de um cDNA ou uma sequência genômica; um conjunto externo dos iniciadores e um conjunto interno (iniciadores de PCR aninhados). Quando necessário (por exemplo, quando a primeira reação de PCR não resulta em um produto satisfatório para sequenciamento), um iniciador adicional (ou dois) dos iniciadores de PCR aninhados foi utilizado.

[00688] Para facilitar a clonagem das sequências genômicas de cDNA's, uma extensão de 8-12 bp foi adicionada ao 5' de cada iniciador. A extensão do iniciador inclui um local de restrição de endonuclease. Os locais de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a) o local não existe na sequência de cDNA; e (b) os locais de restrição nos iniciadores diretos e reversos são projetados de modo que o cDNA digerido seja inserido na formação do sentido no vetor binário utilizado para transformação.

[00689] Os produtos PCR foram digeridos com endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc.), de acordo com os locais designados nos iniciadores. Cada produto PCR digerido foi inserido em um vetor de cópia alta pUC19 (New England BioLabs Inc.) ou em plasmídeos originados desse vetor ou em CloneJet (Thermo Scientific). Em alguns casos, o produto PCR não digerido foi inserido no pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) ou diretamente no vetor binário.

[00690] O sequenciamento dos produtos PCR amplificados foi realizado utilizando um sequenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc). Em alguns casos, após confirmar as sequências dos genes clonados, o cDNA clonado foi introduzido em um vetor binário pGI modificado contendo o promotor At6669 através da digestão com endonucleases de restrição apropriados. Os produtos digeridos e o vetor de plasmídeo linearizado foram ligados utilizando enzima ligase T4 DNA (Roche, Suíça).

[00691] Os plasmídeos de cópia alta contendo os genes clonados foram digeridos com as endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc) de acordo com os locais projetados nos iniciadores e clonados em vetores binários.

[00692] Diversas sequências de DNA dos genes selecionados foram sintetizadas por um fornecedor comercial GeneArt (Life Technologies) [http://www (ponto) geneart (ponto) com/]. O DNA sintético foi projetado em sílica. Os locais de enzimas de restrição adequadas foram adicionados às sequências clonadas na extremidade 5' e na extremidade 3' para permitir clonagem posterior no vetor binário pQFNc ou outro vetor binário requerido a jusante do promotor At6669 (ID SEQ N°: 4111).

[00693] Vetores binários utilizados para clonagem: 0 plasmídeo pPI foi construído inserindo uma sequência de sinal poli-(A) sintético originada do vetor de plasmídeo básico pGL3 (Promega, Acc No U47295; bp 4658-4811) no local de restrição HindIII do vetor binário pBI101.3 (Clontech, n° de acesso U12640). 0 pGI (pBXYN) foi similar ao pPI, mas o gene original na coluna vertebral, o gene GUS, foi substituído pelo gene GUS-Intron seguido pelo terminador NOS (ID SEQ N°: 4122) (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990). 0 pGI foi utilizado no passado para clonar as sequências de polinucleotídeo, inicialmente no controle do promotor 35S [Odell, JT, et al. Nature 313, 810 - 812 (28 de fevereiro de 1985); ID SEQ N°: 4109].

[00694] Os vetores pGI modificados [pQXNc (Figura 8); ou pQFN (Figura 2), pQFNc (Figura 2) ou pQYN 6669 (Figura 1)] foram versões modificadas do vetor pGI, no qual o cassete foi invertido entre as bordas esquerda e direita, assim, o gene e seu promotor correspondente estavam próximos à borda direita e o gene NPTII estava próximo à borda esquerda.

[00695] At6669, a sequência do promotor Arabidopsis thaliana (ID SEQ N°:4111) foi inserida no vetor binário pGI modificado, a montante dos genes clonados, seguido pela ligação do DNA e extração do plasmídeo binário das colônias E. coli positivas, conforme descrito acima.

[00696] As colônias foram analisadas por PCR, utilizando os iniciadores que cobrem a inserção que são projetados para abranger o promotor e gene introduzido. Os plasmídeos positivos foram identificados, isolados e sequenciados.

[00697] Os genes selecionados clonados pelos presentes inventores são fornecidos na Tabela 55 abaixo. Tabela 55 Genes clonados em plasmídeos com alto número de cópia

Tabela 55. "Polin." - Polinucleotídeo; "Polip." - polipeptídeo. Para clonagem de cada gene, pelo menos 2 iniciadores foram usados: Diretos (Fwd) ou Reversos (Rev). Em alguns casos, 4 iniciadores foram usados: Diretos externos (EFlexternal forward), reversos externos (ER I external reverse), diretos aninhados (NF I nested forward) ou reversos aninhados (NRlnested reverse). As sequências dos iniciadores utilizadas para clonagem dos genes são fornecidas na listagem de sequência. Os genes foram clonados a partir do mesmo organismo, conforme identificado na lista de genes fornecida na Tabela 62 acima, exceto para os genes que foram sinteticamente produzidos pela GENEART (Life Technologies Corporation).

EXEMPLO 15 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA PARA PRODUÇÃO DE SEMENTE E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA SOB CONDIÇÕES NORMAIS EM ENSAIOS DE ESTUFA (Ensaios GH -SM)

[00698] Ensaio 1: Produção de semente, biomassa da planta e taxa de crescimento da planta em condições normais da estufa - Esse ensaio segue a produção de semente, a formação de biomassa e o cultivo das plantas da área de roseta cultivadas na estufa em condições de cultivo não limitantes de nitrogênio. As sementes transgênicas de Arabidopsis foram semeadas em meio ágar complementado com 11 de meio MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram, então, transplantadas para 1,7 bandejas preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo nitrogênio inorgânico a 6 mM na forma de KNO3 com KH2PO4 a 1 mM, MgSO4 a 1 mM, CaC12 a 2 mM e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até as sementes ficarem maduras. As sementes foram colhidas, extraídas e pesadas. A biomassa da planta restante (o tecido acima do solo) também foi colhida, e pesada imediatamente ou seguindo a secagem no forno a 50°C por 24 horas.

[00699] Cada estrutura foi validada em sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformada por um vetor vazio carregando o promotor At6669 e o marcador selecionável foi utilizada como controle.

[00700] As plantas foram analisadas com relação ao seu tamanho total, taxa de crescimento, floração, produção de semente, peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita (HI - produção de semente/matéria seca). 0 desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle cultivadas em paralelo nas mesmas condições. As plantas transgênicas falsas que expressam o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou sem gene nenhum, no mesmo promotor, foram utilizadas como controle.

[00701] 0 experimento foi planejado em distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene do presente pedido de patente de invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura.

[00702] Formação de Imagem Digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada a uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpadas de 4 x 150 Watts), foi utilizado para capturar as imagens das amostras de planta.

[00703] 0 processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias, começando do dia 1 após o transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi utilizada para capturar as imagens das plantas maiores encerradas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas são de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição das sombras.

[00704] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizado na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de estatística análise (instituto SAS).

[00705] Análise da Folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo número de folha, área da roseta, diâmetro da roseta e área foliar da lâmina.

[00706] Taxa de crescimento vegetal: a taxa de crescimento relativa (RGR) do número de folha [fórmula IX (descrita acima)], área da roseta [fórmula VIII (descrita acima)], cobertura do lote (fórmula XIV, abaixo) e índice de colheita [fórmula IV (descrita acima)] foi calculada com as fórmulas indicadas. Fórmula XIV Taxa de crescimento relativa da cobertura do lote = Coeficiente de regressão da cobertura do lote ao longo do tempo.

[00707] Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes foram coletadas. As sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00708] Peso seco e produção de semente - Por volta do dia 80 da semeadura, as plantas foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso da semente de cada lote foram medidos e divididos pelo número de plantas em cada lote. Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo raízes) após secar a 30°C em uma câmara de secagem; Produção de semente por planta = peso total da semente por planta (g) peso de 1000 sementes (o peso de 1000 sementes) (g).

[00709] O índice de colheita (HI) foi calculado utilizando a Fórmula IV conforme descrito acima.

[00710] Porcentagem de óleo nas sementes - No final do experimento, todas as sementes de cada lote foram coletadas. As sementes de 3 lotes foram misturadas à terra e, então, montadas na câmara de extração. 210 ml de n- Hexano (Cat N° 080951, Biolab Ltd.) foram utilizados como solvente.

[00711] A extração foi realizada por 30 horas em fogo médio a 50°C. Uma vez finalizada a extração, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35°C e condições de vácuo. 0 processo foi repetido duas vezes. A informação obtida do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) foi utilizada para criar uma curva de calibração para a RMN de Baixa Ressonância. 0 teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinado utilizando a RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.

[00712] Análise de comprimento de Síliqua - No dia 50 da semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada lote foram amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas foram de cor verde-amarela e foram coletadas a partir das partes inferiores de um caule de planta cultivado. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da siliqua.

[00713] Análises Estatísticas - Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos de transformação independente testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o Teste-t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p for menor que 0,1. O pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

[00714] As Tabelas 56 a 60 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas que expressam de forma exógena as estruturas do gene utilizando os ensaios de maturação da semente (GH-SM) sob condições normais. As plantas transgênicas que expressam esses genes exibiram uma biomassa (Tabelas 56, 57, 59), produção (Tabelas 59 e 60), vigor (Tabelas 58) e taxa de crescimento (Tabelas 58) maiores se comparadas às plantas de controle cultivadas sob condições de cultivo idênticas. A avaliação de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de diferentes números de eventos. Evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 56 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 56. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; Aum." = de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 57 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 57. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 58 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 58. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. RGR = taxa de crescimento relativa. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 59 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 59. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). "-" resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 60 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 60. "CONT." Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). ainda estão indisponíveis.

EXEMPLO 16 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA PARA PRODUÇÃO DE SEMENTE E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA SOB CONDIÇÕES NORMAIS EM ENSAIOS DE ESTUFA ATE FLORESCIMENTO (Ensaios GH - SB)

[00715] Ensaio 2: Melhoria do desempenho da planta medida até o estágio de florescimento: biomassa da planta e taxa de crescimento da planta em condições normais da estufa (Ensaios GH - SB) - Esse ensaio segue a formação da biomassa da planta e o crescimento da área de roseta de plantas cultivadas na estufa em condições normais de cultivo. As sementes transgênicas de Arabidopsis foram semeadas em meio de ágar suplementado com de meio MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram, então, transplantadas para bandejas de 1,7 litros preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com um a solução contendo nitrogénio inorgânico a 6 mM na forma de KNO3 com KH2PO4 a 1 mM, MgSO4 a 1 mM, CaC12 a 2 mM e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até o estágio de florescimento. A biomassa da planta (o tecido acima da terra) foi pesada indiretamente após colher a roseta (peso fresco da planta [FW]). Em seguida, as plantas foram secadas em um forno a 50°C por 48 horas e pesadas (peso seco daplanta [DW]).

[00716] Cada estrutura foi validada em sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformada por um vetor vazio carregando o promotor 35S e o marcador selecionável foi utilizada como controle.

[00717] As plantas foram analisadas com relação ao seu tamanho total, taxa de crescimento, peso fresco e matéria seca. 0 desempenho das plantas transgênicas foi comparado para controlar as plantas cultivadas em paralelo nas mesmas condições. As plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou sem nenhum gene, no mesmo promotor, foram utilizadas como controle.

[00718] 0 experimento foi planejado em distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene do presente pedido de patente de invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura.

[00719] Formação de Imagem Digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada a uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon, série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), o qual inclui 4 unidades de luz (lâmpadas 4 x 150 Watts), foi utilizado para capturar imagens de amostras de planta.

[00720] 0 processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias começando do dia 1 após transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores encerradas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas eram de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litros. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição das sombras.

[00721] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizado na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00722] Análise da Folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, área de roseta, diâmetro de roseta e área da lâmina foliar.

[00723] Taxa de crescimento vegetal: a taxa de crescimento relativa (RGR) do número de folha (Fórmula IX, descrita acima), área de roseta (Fórmula VIII descrita acima) e cobertura do lote (Fórmula XIV, descrita acima) foi calculada utilizando as fórmulas indicadas.

[00724] Peso seco e fresco da planta - Por volta do dia 80 a partir da semeadura, as plantas foram colhidas e pesadas diretamente para a determinação do peso fresco da planta (FW) e deixadas secar a 50 DC em uma câmara de secagem por cerca de 48 horas antes da prensagem para determinar o peso seco da planta (DW).

[00725] Análises Estatísticas - Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos testados de transformação independentes foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando Teste-t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p for menor que 0,1. 0 pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados Experimentais:

[00726] As Tabelas 61-63 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas que expressam as estruturas de genes utilizando os Ensaios GH - SB.

[00727] Os genes listados nas Tabelas 61-63 melhoraram o desempenho da planta quando cultivados em condições normais. Esses genes produziram plantas maiores com uma área fotossintética maior, biomassa (peso fresco, peso seco, diâmetro de roseta, área de roseta e cobertura do lote) e taxa de crescimento relativa (do número de folhas, cobertura do lote e diâmetro da roseta) quando comparados às plantas de controle cultivadas sob condições de cultivo idênticas. Os genes foram clonados sob regulação de um promotor At6669 constitutivo (ID SEQ N° 4111). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. 0 evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 61 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 61. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 62 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

[00728] Tabela 62. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; Aum." = de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<O,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 63 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 63. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis.

EXEMPLO 17 AVALIAÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB CONDIÇÕES NORMAIS UTILIZANDO ENSAIOS IN VITRO [PLANTAS Tl E T2 DE CULTURA DE TECIDO, ENSAIOS TC -T2 E TC-T1]

[00729] As sementes esterilizadas da superfície foram semeadas em meio basal [50% de meio Murashige-Skoog (MS) complementado com 0,8 % de planta ágar como agente de solidificação] na presença de Canamicina (utilizada como um agente de seleção). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4°C e, então, cultivadas a 25°C em ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuro por 7 a 10 dias. Nesse ponto do tempo, as mudas aleatoriamente escolhidas foram cuidadosamente transferidas para placas contendo de meio de MS (N a 15 mM). Para experimentos realizados nas linhas T2, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (replicadas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção pelo menos quatro a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura. Para experimentos realizados nas linhas Ti, cada placa continha 5 mudas de 5 eventos transgênicos independentes e 3 a 4 placas diferentes (replicadas) foram plantadas. No total, para linhas Ti, 20 eventos independentes foram avaliados. As plantas que expressam os polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção foram comparadas à medição média das plantas de controle (vetor vazio ou gene repórter GUS no mesmo promotor) utilizada no mesmo experimento.

[00730] Formação de Imagem Digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada a uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon, série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpada 4 x 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi utilizado para capturar imagens de brotos encerrados em placas de ágar.

[00731] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias começando no dia 1 até o dia 10 (vide, por exemplo, as imagens nas Figs. 3A- F). Um sistema de análise imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizado na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS).

[00732] Análise das mudas - Utilizando a análise digital, os dados das mudas foram calculados, incluindo área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz.

[00733] A taxa de crescimento relativa para os vários parâmetros de muda foi calculada de acordo com as fórmulas XV a seguir (RGR da área foliar), e XVI (RGR do comprimento da raiz). Fórmula XV: Taxa de crescimento relativa da área foliar = Coeficiente de regressão da área foliar ao longo do tempo. Fórmula XVI: Taxa de crescimento relativa do comprimento da raiz = Coeficiente de regressão do comprimento da raiz ao longo do tempo.

[00734] No final do experimento, os brotos foram removidos do meio e pesados para a determinação do peso fresco da planta. Os brotos foram, então, secados por 24 horas a 600C, e pesados novamente para medir o peso seco da planta para análise estatística posterior. Os pesos fresco e seco são fornecidos para cada planta Arabidopsis. A taxa de crescimento foi determinada comparando a cobertura da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz, entre cada par de fotos sequenciais, e os resultados foram utilizados para resolver o efeito do gene introduzido no vigor da planta em condições ideais. Similarmente, o efeito do gene introduzido em acúmulo de biomassa, em condições ideais, foi determinado comparando o peso seco e fresco das plantas e daquele das plantas de controle (contendo um vetor vazio ou o gene repórter GUS no mesmo promotor). A partir de cada estrutura criado, 3 a 5 eventos de transformação independentes foram examinados em replicados.

[00735] Análises Estatísticas - Para identificar os genes que conferem vigor significativamente melhorado à planta ou arquitetura de raiz ampliada, os resultados obtidos a partir das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos das plantas de controle. Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos testados de transformação independentes foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento do gene sobre um controle, os dados foram analisados através do teste t de Student e o valor p foi calculado. Os resultados foram considerados se p S 0,1. 0 pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA). Resultados Experimentais: Resultados de plantas T2:

[00736] As Tabelas 64-66 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas que expressam as estruturas de gene utilizando os Ensaios TC -T2.

[00737] Os genes apresentados na Tabela 64 mostraram uma melhora significativa, uma vez que produziram uma biomassa de planta maior (peso seco e fresco da planta) em geração T2 quando cultivados em condições normais de cultivo, se comparados às plantas de controle cultivadas sob condições de cultivo idênticas. Os genes foram clonados sob regulação de um promotor constitutivo (At6669, ID SEQ N° 4111) .

[00738] A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido. Os resultados obtidos desses experimentos secundários também foram significativamente positivos. Tabela 64 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 64. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis.

[00739] Os genes apresentados nas Tabelas 65 e 66 mostraram uma melhoria significativa no desempenho da planta, uma vez que produziram uma biomassa de folha (área foliar) e biomassa de raiz (comprimento de raiz e cobertura da raiz) (Tabela 65) maiores e uma taxa de crescimento relativa maior da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz (Tabela 66) quando cultivados sob condições normais de cultivo, se comparados às plantas de controle cultivadas sob condições de cultivo idênticas. As plantas que produzem biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades de absorver uma quantidade maior de nitrogênio do solo. As plantas que produzem biomassa de folha maior têm melhor habilidade de produzir assimilados. Os genes foram clonados sob regulação de um promotor constitutivo (At6669). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido. Esse segundo experimento confirmou o aumento significativo no desempenho da folha e raiz. 0 evento com valor p < 0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 65 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor Át6669

Tabela 65. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 66 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 66. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." _ % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis. Resultados das plantas Ti

[00740] Os genes apresentados nas Tabelas 67-69 mostraram uma melhora significativa na biomassa da planta e no desenvolvimento da raiz, uma vez que produziram uma biomassa maior (peso seco e fresco, Tabela 67), uma biomassa de raiz e folha mais larga (área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz) (Tabela 68) e uma taxa de crescimento relativa maior da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz (Tabela 69) quando cultivados em condições normais de cultivo, se comparados às plantas de controle cultivadas sob condições de cultivo idênticas. As plantas que produzem biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades de absorver uma quantidade maior de nitrogênio do solo. As plantas que produzem biomassa de folha maior têm melhor habilidade de produzir assimilados. Os genes foram clonados sob regulação de um promotor constitutivo (At6669; ID SEQ N° 4111). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho de diferentes números de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido. Esse segundo experimento confirmou o aumento significativo no desempenho da folha e raiz. 0 evento com valor p < 0,1 foi considerado estatisticamente significativo.

[00741] As Tabelas 67-69 resumem os fenótipos observados de plantas transgênicas que expressam as estruturas de gene utilizando os ensaios TC -Ti. Tabela 67 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 67. "CONT." - Controle; "Med." - Média; "% Aum." = de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis Tabela 68 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 68. "CONT." - Controle; "Med." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N° 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis. Tabela 69 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669

Tabela 69. "CONT." - Controle; "Med." - Média; Aum." = de aumento; "Val-p." - valor p, L- p<0,01. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 4111). "-" = resultados ainda estão indisponíveis.

[00742] Esses resultados demonstram que os polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção são capazes de melhorar a produção e traços agrícolas importantes, valiosos e adicionais, tais como aumento da biomassa, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de nitrogênio, produção, vigor, produção da fibra e/ou qualidade. Assim, as plantas transformadas que exibiram um peso fresco e seco melhorado demonstraram a capacidade do gene de melhorar a biomassa, um traço chave de culturas para forragem e produtividade da planta; as plantas transformadas que exibiram uma melhoria da produção de semente demonstraram a capacidade dos genes de melhorar a produtividade da planta; as plantas transformadas que exibiram uma melhoria de cobertura do lote e diâmetro de roseta demonstraram a capacidade dos genes de melhorar a resistência à seca da planta, uma vez que reduzem a perda de água do solo por simples evaporação e reduzem a competição com ervas daninhas; consequentemente, reduz a necessidade de utilizar herbicidas para controlar as ervas daninhas. As plantas transformadas que exibiram uma melhoria da taxa de crescimento relativa de vários órgãos (folha e raiz) demonstraram a capacidade do gene de promover o crescimento da planta e, consequentemente, encurtam o período de crescimento necessário e/ou alternativamente melhoram a utilização dos nutrientes disponíveis e água que levam ao aumento de produtividade da terra; as plantas transformadas que exibiram uma melhoria do número de órgão, conforme demonstrado pelo parâmetro do número da folha, demonstraram um potencial para melhorar a produção de biomassa, importante para culturas de forragem e melhoram a produtividade da planta; As plantas transformadas que exibiram comprimento de raiz e cobertura aumentados demonstraram a capacidade do gene de melhorar a resistência à seca e melhor utilização de fertilizantes, uma vez que as raízes podem alcançar um volume de solo maior; as plantas transformadas que exibiram uma melhoria da área relativa do pecíolo da folha e área da lâmina foliar demonstraram a capacidade dos genes de lidar com resultados de intensidades de luz limitadas a partir do aumento das densidades de população de planta e, consequentemente, uma melhoria na produtividade da terra.

[00743] Embora o presente pedido de patente de invenção tenha sido descrito em conjunto com aplicações específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes aos especialistas na técnica. Consequentemente, ele destina-se a abarcar todas essas respectivas alternativas, modificações e variações que recaem no espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.

[00744] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no presente relatório descritivo estão incorporados aqui em sua totalidade por referência no referido relatório descritivo, na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente foi específica e individualmente indicado como sendo incorporado aqui por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência no presente pedido de patente não deverá ser interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como técnica anterior ao presente pedido de patente de invenção. Na medida em que os títulos da seção são utilizados, eles não deverão ser interpretados como necessariamente limitantes. Legenda das Figuras

[00745] Figuras 1 e 2 Tl) Borda esquerda T2) Borda Direita T3) Promotor de nopalina sintase T4) Terminador da Nopalina sintase T5) Gene da neomicina fosfotransferase T6) Sinal de poliadenilação A T7) Local de clonagem múltipla T8) Enzima de restrição T9) Gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron) T10) pQYN-6669 T11) pQFN, pQFNc Figura 3A T12) Condições normais Figura 3C T13) Estresse osmótico (15% PEG) Figura 3E T14) Condições de limitação de nitrogênio Figura 4 Ti) Borda esquerda T2) Borda Direita T3) Promotor de nopalina sintase T4) Terminador da Nopalina sintase T5) Gene da neomicina fosfotransferase T6) Sinal de poliadenilação A T7) Local de clonagem múltipla T8) Enzima de restrição T15) Promotor Raiz T16) pQNa_RP Figura 5 Ti) Borda esquerda T2) Borda Direita T4) Terminador da Nopalina sintase T5) Gene da neomicina fosfotransferase T6) Sinal de poliadenilação A T9) Gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron) T17) DNA invertido T18) 2° INTRON (IV2) do gene ST-LS1 T19) Local invertido T20) Promotor NOS T21) Quadro de leitura aberta T22) pQYN tDNA rev comp 5714 bp Figura 6 Ti) Borda esquerda T2) Borda Direita T4) Terminador da Nopalina sintase T5) Gene da neomicina fosfotransferase T6) Sinal de poliadenilação A T17) DNA invertido T19) Local invertido T20) Promotor NOS T21) Quadro de leitura aberta T23) Promotor do cid506 6669 T24) Inserir cassete T25) pQFN 5967 bp Figura 7 Ti) Borda esquerda T2) Borda Direita T4) Terminador da Nopalina sintase T5) Gene da neomicina fosfotransferase T6) Sinal de poliadenilação A T9) Gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron) T17) DNA invertido T19) Local invertido T18) 2° INTRON (IV2) do gene ST-LS1 T20) Promotor NOS T21) Quadro de leitura aberta T23) Promotor do cid506 6669 T26) Inserir GUS+NOSTer T27) pQFY Figura 8 Ti) Borda esquerda T2) Borda Direita T3) Promotor de nopalina sintase T4) Terminador da Nopalina sintase T5) Gene da neomicina fosfotransferase T6) Sinal de poliadenilação A T7) Local de clonagem múltipla T8) Enzima de restrição T28) pQXNc.

Claims

1. Método para aumentar o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o rendimento das sementes, a eficiência no uso de nitrogênio e/ou a tolerância ao estresse abiótico de uma planta em comparação com uma planta de controle da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de crescimento, o método caracterizado por transformar uma célula de planta com uma construção de ácido nucleico tendo uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida por: (i) SEQ ID NO: 329 ou 132, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 493, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 493, (ii) SEQ ID NO: 1778, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 3472, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3472, (iii) SEQ ID NO: 1779, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 3473, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3473, (iv) SEQ ID NO: 1780, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 3474, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3474, ou (v) SEQ ID NO: 1781, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 3475, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3475, em que o referido estresse abiótico é deficiência de nitrogênio ou seca, aumentando, assim, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o rendimento das sementes, a eficiência no uso de nitrogênio e/ou a tolerância ao estresse abiótico da planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 329 ou 132, codificando um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 493, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 493.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida por SEQ ID NO: 329, 132, 1778, 1779, 1780 ou 1781.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida por SEQ ID NO: 329 ou 132.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 329.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida construção de ácido nucleico está operacionalmente ligada a um promotor para direcionar a expressão da referida sequência de ácido nucleico na referida célula vegetal.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é heterólogo à referida sequência de ácido nucleico.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ainda cultivar a planta transformada com a referida construção de ácido nucleico sob a dita seca ou deficiência de nitrogênio.

10. Construção de ácido nucleico isolado, caracterizada por um polinucleotídeo isolado tendo uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida por: (i) SEQ ID NO: 329 ou 132, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 493, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 493, (ii) SEQ ID NO: 1778, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 3472, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3472, (iii) SEQ ID NO: 1779, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 3473, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3473, (iv) SEQ ID NO: 1780, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 3474, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3474, ou (v) SEQ ID NO: 1781, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 3475, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 3475, e um promotor heterólogo para direcionar transcrição da referida sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

11. Construção de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 329 ou 132, que codifica um polipeptídeo conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 493, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido por SEQ ID NO: 493.

12. Construção de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida por SEQ ID NO: 329, 132, 1778, 1779, 1780 ou 1781.

13. Construção de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é estabelecida por SEQ ID NO: 329 ou 132.