BRPI0914522B1 - Método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, oteor de óleo, e/ou a eficiência da utilização do nitrogênio de uma planta - Google Patents

Abstract

método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, e/ou a eficiência da utilização do nitrogênio de uma planta, onde são fornecidos métodos 5 de aumento de produtividade, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta por expressar na planta polinucleotídeos exógenos que compreendam uma sequência de ácidos nucléicos, pelo menos 80% idêntico a seq id n°: 905, 882, 1-12, 15-105, 203-297, 299-523, 845-881, 883-904, 906-925 ou 933; ou um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo exógeno, pelo menos, 80 % idêntico a seq id n°: 172, 146, 106-117, 120-145, 147-171, 173-202, 524-616, 621-844, 926-931 ou 932; também fornecido polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico selecionado do grupo constituído por seq id n°s: 905, 882, 1-13, 15-105, 203-523, 845-881, 883-904, 906-925 e 933, que pode ser utilizado para aumentar o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta.

Description

“MÉTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO, A BIOMASSA, A TAXA DE CRESCIMENTO, O VIGOR, O TEOR DE ÓLEO, E/OU A EFICIÊNCIA DA UTILIZAÇÃO DO NITROGÊNIO DE UMA PLANTA

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A presente invenção, em algumas de suas configurações apresentadas, refere-se a polipeptídeos, polinucleotídeos codificando os mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e os métodos de produção e uso dos mesmos, e, mais particularmente, mas não exclusivamente, aos métodos de aumentar a produtividade por planta, a produção de óleo, a produção de sementes, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, o teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou a eficiência de utilização do nitrogênio.

Condições de estresses abióticos, como salinidade, seca, inundações, temperaturas subótimas e poluição química tóxica causam danos consideráveis às plantas agrícolas. A maioria das plantas desenvolveu estratégias para se proteger contra essas condições. No entanto, se a gravidade e a duração das condições de estresse são muito grandes, os efeitos sobre o desenvolvimento da planta, o crescimento e a produção na maioria das plantas de cultura são profundos. Além disso, a maioria das plantas cultivadas é altamente suscetível a estresse abiótico (ABS) e, portanto, necessitam de condições ideais para o crescimento das colheitas comerciais. A

Petição 870190006437, de 21/01/2019, pág. 19/24

2/218 contínua ao estresse provoca alterações importantes no metabolismo das plantas que conduz finalmente à morte celular e, consequentemente, as perdas de rendimento.

escassez global de abastecimento agrícolas que culturas nocivos aráveis tentam os da do de água afetam o esforços é um dos mais graves problemas crescimento e a produtividade das são feitos para mitigar os efeitos mundo. Assim, as empresas de agrobiotecnologia criar tolerantes a principalmente novas variedades de diferentes estresses no possam resistir à desenvolvimento de plantas que sejam abióticos, focando novas variedades que falta de água por períodos mais longos.

Quantidades subótimas de e micro nutrientes) afetam o crescimento e õ de s e η vo ΓνΊ me n to dãs plantas por todo õ ciclo de “Vida? vegetal. Um dos macronutrientes essenciais para a planta é nitrogênio. O nitrogênio é responsável pela biossíntese de 20 aminoácidos e ácidos nucléicos, grupos prostéticos, hormônios vegetais, defesas químicas da planta, e assim por diante. O nitrogênio é frequentemente o elemento limitante no crescimento das plantas e todas as culturas têm uma dependência fundamental em fertilizantes nitrogenados 25 inorgânicos. Como o fertilizante se esgota rapidamente na maioria dos tipos de solo, ele deve ser fornecido ao longo do cultivo de duas ou três vezes durante a estação de crescimento. Macronutrientes adicionais importantes são o

3/218 fósforo (P) e o potássio (K) , que tem uma correlação direta com a produtividade e tolerância das plantas em geral.

Os óleos vegetais ou sementes e nutrição na alimentação humana e animal. Eles também são de produtos industriais, tais como pinturas, tintas e lubrificantes. Além disso, os óleos vegetais representam fontes renováveis de hidrocarbonetos de cadeia longa que podem ser utilizados como combustível . Uma vez que os combustíveis fósseis utilizados atualmente são recursos finitos e estão sendo gradualmente esgotados, culturas de rápido crescimento de biomassa podem utilizadas como combustíveis- alternativos ou de matérias-primas para energia e podem reduzir a dependência em fontes de energia fóssil.

No entanto, o grande gargalo para aumentar o consumo de óleos vegetais como biocombustível é o preço do óleo, que é ainda superior ao dos combustíveis fósseis [Hypertéxt

Transfer

Protocol://World Wide Web (ponto) eia (ponto) doe (ponto) gov/oiaf/analysispaper/biodiesel/ ;

Hypertext

Transfer

Protocol://World Wide

Web (ponto) njbiz (ponto)com/weekly article.asp?aID=19755147 (ponto)

6122555 (ponto) 957931 (ponto) 7393254 (ponto)

4337383 (ponto)

561&aID2=73678].

de óleo vegetal é limitada pela disponibilidade de terras agrícolas e água. Assim, aumentando o rendimento de óleo vegetal a partir da mesma área de crescimento pode-se efetivamente superar a escassez de espaço de produção e diminuir o preço do óleo vegetal, ao mesmo tempo.

4/218

Estudos com o objetivo de aumentar a produção de óleo focam na identificação de genes envolvidos no metabolismo do óleo, bem como em genes capazes de aumentar a produtividade das plantas e das sementes de 5 plantas transgênicas.

Os genes conhecidos que estão envolvidos no aumento do rendimento de óleo vegetal incluem os que participam na síntese de ácidos graxos ou desencalantes, como desaturase [por exemplo, DELTA6, DELTA12 10 ou acil-ACP (Ssi2; Arabidopsis Information Resource - Fonte de Informação da Arabidopsis (TAIR; Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (ponto) org/), TAIR N° AT2G43710) ] , -Oleosina A- (TAIR N° AT3G01570) ou FAD3 (TAIR N° AT2G29980) , e vários fatores de transcrição e 15 ativadores como Lecl [TAIR N° AT1G21970, Lotan et al. 1998.

Cell. 26; 93(7):1195-205], Lec2 [TAIR N° AT1G28300, Santos Mendoza et al . 2005, FEBS Lett. 579(21):4666-701, Fus3 (TAIR

N° AT3G26790) , ABI3 [TAIR N° AT3G24650, Lara et al. 2003. J

Biol Chem. 278(23): 21003-11] e Wril [TAIR N° AT3G54320,

Cernac e Benning, 2004. Plant J. 40(4) : 575-85] .

Zabrouskov V., et al., 2002 (Physiol Plant. 116:172-185) descreve um aumento a fração total lipídica por sobreregulação do retículo endoplasmático (FAD3) e plastidal (FAD7) desaturases de ácido graxos na 25 batata.

Wang HW et al . , 2007 (Plant J.

52:716-29. Epub 20 07 Sep 18) descreve um aumento no conteúdo de ácidos graxos totais e lipídios nas sementes das plantas

5/218 pela sobrexpressão dos fatores de transcrição GmDof4 e GmDof11.

Vigeolas H, et al. [Plant Biotechnol J. 2007, 5 (3) :431-41] e Depósito de Patente EUA

N° 20060168684 divulga um aumento no teor de óleo da semente de canola (Brassica napus L.) pela sobrexpressão de leveduras de diidrogenase de glicerol trifosfato sob o controle de um promotor específico da semente.

Katavic V, et al., 2000 (Biochem Soc Trans. 28:935-7) descreve a utilização de

Arabidopsis FAE1 e dos genes da levedura SLC1-1 para melhorias do ácido erúcico e conteúdo oleaginoso na semente de_canola... . _________ ___________ _

Depósito de Patente EUA N°

20080076179 divulga um ácido nucléico de um musgo isolado codificando uma proteína metabólica de lipídio (LMP) e plantas transgênicas exprimindo o mesmo aumento de níveis lipídicos.

Depósito de Patente EUA N°

20060206961 oleaginoso divulga um método de aumentar o conteúdo nas plantas (por exemplo, nas sementes das plantas), por exprimir na planta o polipeptídeo

Yprl40w.

20060174373 oleaginoso

Depósito de

Patente divulga um método de aumentar o nas plantas por exprimir um ácido

EUA N° conteúdo nucléico codificando uma síntese de proteína potencializadora (TEP) codificando um triglicerol (TAG) na planta.

6/218

Depósito de Patente EUA N°s. 20070169219, 20070006345, 20070006346 e 20060195943, divulgam plantas transgênicas com eficiência de utilização de Nitrogênio que pode ser utilizado para a conversão em 5 matérias-primas para produtos químicos ou combustíveis.

W02004/104162 mostra sequências de polinucleotídeo e métodos de utilizar o mesmo para aumentar a tolerância de uma planta a estresses abióticos e/ou aumentar a biomassa de uma planta.

W02007/020638 mostra sequências de polinucleotídeo e métodos de utilizar o mesmo para aumentar a tolerância de uma planta a estresses — - ------abióticos e/ou aumentar a biomassa·,· - vigor e/ou produção de uma planta.

W02008/122890 mostra sequências de polinucleotídeo e métodos de utilizar o mesmo para aumentar o teor de óleo, a taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou o vigor de uma planta.

RESUMO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecido um método de aumento de produtividade, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntico ao SEQ ID N° : 905, 882, 112, 15-105, 203-297, 299-523, 845-881, 883-904, 906-925 ou

7/218

933, aumentando assim produtividade, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio da planta.

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecido um método para aumento de produtividade, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta, compreendendo A expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionado do grupo consistindo de SEQ ID N°s: 905, 882, 1-13, 15_-105, 2 03 - 52 3 , 84 5 - 8 81, 883-9.04, 906-925 e. 93 3, aumentando assim a produtividade, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, o teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou a eficiência de utilização de nitrogênio da plantai ~ ~

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecido um método de aumento de produtividade, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta, compreendendo A expressão dentro da planta de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um idêntico ao SEQ ID N° : 172,

173-202, 524-616, 621-844, polipeptídeo pelo menos 80%

146, 106-117, 120-145, 147-171,

926 - 931 ou 932, aumentando assim a produtividade, a biomassa, a taxa de crescimento, o

8/218 vigor, o teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou a eficiência de utilização de nitrogênio da planta.

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecido um método de aumento de produtividade, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressão dentro da planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID N°s: 172, 146, 106117, 120-145, 147-171, 173-202, 524-844 e 926-932, para, assim aumentar a produtividade, a biomassa,- a taxa de, crescimento, o vigor, o teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos .e/ou_a ^eficiência de utilização de nitrogên-io—da— planta,._______

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecido um polinucleotideo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntico ao SEQ ID N° : 905, 882, 112, 15-105, 203-297, 299 -523, 845-881, 883-904, 906-925 e

933, caracterizada pelo fato de que a dita sequência de ácido nucléico é capaz de aumentar a produção, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou a eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta.

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecido um

9/218 polinucleotideo isolado compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°s: 905, 882, 1-13, 15-105, 203-523, 845-881, 883-904, 906-925 e 933 .

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecido um polinucleotideo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de homologia com a sequência de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID N° : 172, 146, 106-117, 120-145, 147-171, 173-202, 524-616, 621844, 926-931 e 932, caracterizada pelo fato de que a dita sequência .de__ amínoácídos„s_ej a capaz de aumentar a__produção , a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou a eficiência da utilização de nitrogênio da planta.

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de codificação de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N°s: 172, 146, 106-117, 120-145, 147-171, 173-202, 524-844 e 926-932.

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecida uma construção de ácido nucléico compreendendo polinucleotídeos isolados da invenção, e um promotor de direcionar a transcrição da referida sequência de ácido nucléico em uma

10/2-18 célula hospedeira.

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de homologia com SEQ ID N° : 172, 146, 106-117, 120-145, 147-171, 173 -202, 524-616, 621844, 926-931 e 932, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de aminoácidos seja capaz de aumentar a produção, a biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta.

De acordo com um aspecto de algumas configurações_. da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N°s: 172, 146, 106-117, 120-145, 147-171, 173-202, 524-844 e 926932 .

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecida uma célula vegetal exógena expressando a polinucleotídeos da invenção, ou o construção de ácido nucléico da invenção.

De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é fornecida uma célula vegetal exogenamente expressando polipeptídeos da invenção.

De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácidos nucléicos é

11/218 definida conforme a SEQ ID N° : 905, 882, 1-13, 15-105, 203

523, 845-881, 883-904, 906-925 ou 933.

De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo consiste da sequência de ácido nucléico selecionado do grupo que

consiste	de SEQ	ID N°s: 905, 882, 1-13,	15-105,	203-523,
845-881,	883-904,	906-925 e 933.
		De acordo	com	algumas
configurações da	invenção, a sequência de	ácidos	nucléicos

codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 8 0% de homologia com SEQ ID N° : 172, 146, 106-117, 120-145, 147171, 173-202, 524 - 616, 621-844, 926-931 e 932.

--------- ---,,..De acordo- com -algumas configurações da invenção, a sequência de ácidos nucléicos codifica a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N°s: 172, 146, 106-117, 120-145, 147171, 173-202,

524 -844 e 926-932.

De acordo com algumas vegetal faz parte de uma planta.

De acordo com algumas da invenção, o método que compreende ainda o crescimento da planta expressando os ditos polinucleotídeos exógenos sob estresse abiótico.

De acordo com algumas configurações da invenção, o estresse abiótico é selecionado do grupo consistindo de salinidade, seca, privação de água, inundações, estiolamento, baixa temperatura, alta

I

12/218 temperatura, toxicidade do metal pesado, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e radiação UV.

De acordo com algumas 5 configurações da invenção, o rendimento inclui o rendimento de grãos ou produção de óleo.

Salvo indicação em contrário, todas as técnicas e/ou termos científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como geralmente compreendido por um 10 especialista na arte a qual a invenção pertence. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou ensaio de configurações da invenção, métodos de - exemplares e/ou materiais estão descritos abaixo. Em caso de conflito, a 15 especificação da patente, incluindo definições, deve ser determinante. Além disso, os materiais, métodos e exemplos meramente ilustrativos pretendem ser necessariamente

1imitados.

DOS

DESENHOS

Algumas da invenção são aqui como referência referência salienta-se exemplo e descritas, a aos planos específica agora que os elementos para fins de com título de exemplo, apenas de acompanhamento.

Como os desenhos em detalhe, indicados são, a título de ilustrativa, de com os desenhos torna evidente para aqueles hábeis na arte como configurações da invenção podem ser praticadas.

13/218

Nos desenhos:

a figura 1 é uma ilustração esquemática do plasmídio pGI binário utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeos isolados de algumas

T-DNA borda direita; LB

T-DNA borda esquerda; H-enzima de restrição HindIII; X enzimas de restrição

S -enzima

Sm enzima de

Smal; RI enzima

Sacl/Sstl/Ecll36II;

(números)

Comprimento em pares de bases; NOS pro = promotor da nopalina;

NPT-II = gene .neomicina fosfotransferase; NOS-ter terminador da nopalina; sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron gene relator GUS (sequência de codificação e intron)

As sequências de polinucleotídeos isolados da invenção foram clonados no vetor ao substituir o gene relator GUSintron;

a figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmídio modificado pGI binários utilizados para expressar as sequências de polinucleotídeos isolados da invenção. RB - T-DNA borda direita;

LB - T-DNA borda esquerda; MCS - Local de Clonagem Múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; (números) - Comprimento em pares de bases; NOS pro = promotor da nopalina; NPT-II = gene neomicina fosfotransferase; NOS ter

14/218 terminador da nopalina; ; sinal Poli-A (sinal de poliadenilação) ; GUSintron - o gene relator GUS (sequência de codificação e intron)

As sequências de polinucleotídeos isolados da invenção foram clonados no vetor ao substituir o gene relator GUSintron; e as figuras 3A-F são as imagens que descrevem a visualização do desenvolvimento das raízes das plantas transgênicas expressando exogenamente o polinucleotídeo de algumas configurações da invenção, quando cultivadas em placas de ágar transparente, em condições normais (Figuras 3A_ e_stresse_osmót ico (PEG=>15%; Figuras 3C-D) ou condições de limitação de nitrogênio (Figuras 3E-F). Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de ágar transparente por 17 dias (7 berçário e 10 dias após o transplante) . As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias, com início no dia 1 após o transplante. Figura 3A Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas em sequência de 10 dias após o transplante em placas de ágar, quando cultivadas em condições normais (padrão) . Figura 3B - Uma imagem de análise das raízes das plantas mostrada na Figura 3A em que os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Figura 3C Uma imagem de uma fotografia das plantas tiradas em sequência de 10 dias após o transplante em

15/218 placas de ágar, cultivadas sob condições de alta osmose (PEG 15%) . Figura

3D

Uma imagem de análise das raízes das plantas mostrada na

Figura

3C em que os comprimentos das raízes medidos são representados por setas.

Figura 3E

Uma imagem de uma fotografia das plantas tomadas na sequência de 10 dias após o transplante em placas de ágar, cultivadas sob condições de baixo teor de nitrogênio. Figura 3F - Uma imagem de análise das raízes das plantas mostrada na

Figura 3E em que os comprimentos das raízes medidos são representados por setas.

DE CONFIGURAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO presente em algumas presentes, refere-se a polipeptídeos, polinucleotídeos codificando os mesmos, construções de ácido nucléico compreendendo o transgênicas expressando o mesmo e os métodos uso do mesmo para aumentar o rendimento mesmo, plantas da planta, a produção de óleo, a produção de sementes, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou a eficiência de utilização de nitrogênio.

Antes de explicar, pelo menos, uma configuração da invenção em detalhes, é preciso entender que a invenção não é necessariamente limitada na sua aplicação para os detalhes estipulados na seguinte descrição ou exemplificada pelo contexto. A invenção é capaz de outras

16/218 configurações ou de ser praticada ou realizada de várias formas.

Reduzindo a presente invenção a sua prática, os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser utilizados para aumentar a produtividade, a taxa de crescimento, a biomassa, o teor de óleo, o vigor, a tolerância a estresses abióticos e/ou a eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta.

Assim, como mostrado na seção de exemplos que seguem, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática e análise de microarranjos . para ..identificar -polinucleotídeos— que - aumentassem · a produtividade (por exemplo, a produção de sementes, a produção de óleo, o teor de óleo) , taxa de crescimento, biomassa, vigor, tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta. Os genes que afetam o traço-de-interesse [Tabela 15; Exemplo 5 da seção de exemplos que se segue; SEQ ID N°s: 1-105 (polinucleotídeos) e SEQ ID N°s: 106-202 (polipeptídeos)] foram identificados com base em análises de correlação entre os perfis de expressão de vários genes em tecidos, estágios de desenvolvimento, condições limitantes de fertilizantes, condições de estresse abiótico ou condições normais em vários ecótipos de Arabidopsis, variedades de Sorgo ede

Tomate e diversos parâmetros de rendimento, biomassa, vigor, taxa de crescimento e/ou teor de óleo (exemplos 1, 2, 3,4, e 11 da seção de exemplos que se segue; Tabelas 1, 2,3,

17/218

4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 28 e 29). Polipeptídeos homólogos e polinucleotídeos com a mesma função (atividade) também foram identificados [Tabela 16, Exemplo 6 da seção de exemplos que se segue; SEQ ID N°s:

203-523 (polinucleotídeos), e SEQ ID N°s: 524-844 (polipeptídeos)]. Os genes identificados foram clonados em vetores binários (ver, por exemplo, Tabelas 17, 18, 19 e 20;

exemplo 7 da seção de exemplos que se segue; SEQ ID N°s: 47, 845-925 e 933) e plantas transgênicas superexpressando os 10 genes identificados da invenção foram gerados (ver, por exemplo, o exemplo 8 da seção de exemplos a seguir) . Estas plantas que se transformam com os polinucleotídeos identificados acabaram por exibir aumento de produtividade, biomassa, taxa de crescimento, vigor, produtividade de 15 grãos, teor de óleo, rendimento de óleo, florescimento, índice de colheita e área de rosácea (Tabelas 21-27; Exemplo 9 do contexto seção que segue). Estes resultados sugerem a utilização dos novos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção para aumento de produtividade (incluindo a produção 20 de óleo, produção de sementes e teor de óleo) , taxa de crescimento, biomassa, vigor, tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta.

aspecto de algumas método de aumento crescimento, vigor,

Assim, de acordo de produtividade, biomassa, teor de óleo, a tolerância a com um fornecido taxa de estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma

18/218 planta. O método consiste de expressar dentro da planta uma sequência de polinucleotídeos exógenos que compreende uma sequência de ácidos nucléicos pelo menos 80% idêntico ao SEQ ID N°: 905, 882, 1-12, 15-105, 203-297, 299-523, 845 - 881,

883-904, 906-925 ou	933,	aumentando	assim a produtividade,	a
biomassa, a taxa de	crescimento, o	vigor, o teor de óleo,	a
tolerância a	estresses	abióticos	e/ou a eficiência	de
utilização de	nitrogênio	da planta.
			Conforme utilizada aqui	a

expressão produção da planta refere-se à quantidade (conforme determinado pelo peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por planta ou por estação de crescimento’. *D’aí“ õ maior ~ rendimento podería afetar o benefício econômico pode-se obter a partir da planta ..em.uma determinada área em crescimento e/ou tempo de çrescimento .

Note-se que uma produção da planta pode ser afetada por vários parâmetros, incluindo, mas não limitado a, biomassa da planta; vigor das plantas;

taxa de crescimento; produção de sementes; quantidade de sementes ou grãos; sementes e qualidade de grãos; produção de óleo; teor de óleo, amido e/ou proteína em órgãos retirados (por exemplo, sementes ou partes vegetativas da planta); número de flores (florzinhas) por panícula (expresso como proporção do número de sementes cheias sobre o número de panícuias primário); índice de colheita; o número de plantas por área; a área de número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por número de plantas por área

19/218 de cultivo (densidade); o número de órgãos colhidos em campo; a área foliar total; assimilação do carbono e partição de carbono (distribuição/alocação de carbono dentro da planta); resistência à sombra; número de órgãos passíveis de colheita (sementes, por exemplo), sementes por silíqua;

peso por semente; e arquitetura modificada [como o aumento da espessura do colmo; diâmetro ou a melhoria das propriedades físicas (por exemplo, a elasticidade)].

Conforme utilizada aqui a expressão produção de sementes se refere ao número ou em peso das sementes por planta e de sementes por silíqua, ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou o óleo extraído por semente. Daí a produção de' sementes pode ser afetada pelas dimensões das sementes (por exemplo, comprimento) largura, -perímetro,, área e/ou volume) , o número de (cheia)““de sement-es—e—taxa__de___enchimento de grãos e teor de óleo. Daí o aumento de rendimento de grãos por planta pode afetar o benefício econômico que pode ser obtido a partir da planta em uma determinada área em crescimento e/ou tempo de crescimento e aumentar o área de crescimento poderia ser rendimento de sementes por alcançado por aumentar o rendimento de sementes por planta e/ou aumentando número de plantas cultivadas na mesma área determinada.

semente prazo (também conhecido como grão ou miolo) como aqui utilizado refere-se a uma pequena planta embrionária incluído em uma cobertura alimento denominada tegumento (geralmente com algum armazenado) , o produto do óvulo amadurecido de

20/218 gimnospermas e angiospermas, plantas que ocorrem após a fertilização e algum crescimento dentro da planta mãe.

O termo teor de óleo, utilizada aqui se refere à quantidade de lipídios em um

5	órgão de	determinada planta, ou as	sementes	(teor	de	óleo
	das sementes) ou a parte vegetativa	da	planta	(teor	de	óleo
	vegetal)	e é normalmente expressa	em	porcentagem	do	peso

seco (10% de umidade das sementes) ou de peso fresco (para a parte vegetativa).

Note-se que o teor de óleo é afetado pela produção de petróleo intrínseca de um tecido (por exemplo, a semente, parte vegetativa) , bem como a massa ou o tamanho do tecido produtor—de petróleo por _planta ou por período de crescimento.

Em uma configuração, o aumento do teor de óleo das plantas pode ser conseguido por meio do aumento do tamanho/massa de tecido(s) de uma planta que compreendem óleo por período de crescimento. Assim, o aumento do teor de óleo de uma planta pode ser obtido por 20 meio do aumento da produtividade, a taxa de crescimento, biomassa e vigor das plantas.

Conforme utilizado aqui o termo biomassa vegetal se refere à quantidade (por exemplo, medido em gramas de tecido de ar seco) de um tecido 25 produzido a partir da planta em uma estação de crescimento, o que também pode determinar ou afetar a produtividade das plantas ou o rendimento por área crescente. Um aumento na biomassa da planta pode ser na planta inteira ou em partes,

21/218 como da parte aérea (explorável) partes, biomassa vegetal,

	raízes	e	sementes.
				Conforme	utilizado	aqui	o
	termo	taxa de crescimento	refere-se ao	aumento do órgão	da
5	planta	e	tamanho do tecido	por unidade	de tempo	(pode	ser
	medido	em	cm2 por dia).
				Conforme	utilizado	aqui	o
	termo	o	vigor da planta	refere-se ao	montante	(medido	em
	peso)	de	tecido produzido	pela planta	em um determinado

momento. Daí o vigor aumentado poderia determinar ou afetar a produtividade das plantas ou o rendimento por tempo de cultivo ou área de crescimento. Além disso, os resultados do - vigor -inicial- (semente e/ou mudas) em _campo melhorado manteve-se.

Note-se que uma produção da planta pode ser determinada sob condições de estresse (por exemplo, estresse abiótico, nitrogênio condições limitantes) e/ou sem estresse (normal) condições.

Conforme utilizado aqui, o termo condições de não-estresse refere-se às condições de crescimento (por exemplo, água, temperatura, ciclos claroescuro, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, o fornecimento de nutrientes como nitrogênio, fósforo e/ou de potássio), que não excedem significativamente o cotidiano climático e outras condições abióticas que as plantas podem enfrentar, e que permitem um crescimento ótimo, metabolismo, reprodução e/ou a viabilidade de uma planta em qualquer fase do seu ciclo de

22/218 vida (por exemplo, em uma planta de colheita a partir de sementes de uma planta madura e de volta à semente de novo). Pessoas hábeis na arte estão cientes das condições do solo e condições climáticas normais para uma determinada planta em um determinado local geográfico. Deve-se notar que, embora o estresse não possa incluir algumas variações suaves das condições ideais (que variam de um tipo ou espécie de uma planta para outra), essas variações não causam a planta para parar de crescer sem a capacidade de retomar crescimento.

O termo estresses abióticos, como aqui utilizada, refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou a viabilidade de .uma._plan.ta. Assim, estresse abiótico, pode.ser induzido por condições ambientais subótimas de crescimento como, por exemplo, salinidade, privação de água, inundações, frio, baixa ou alta temperatura, a toxicidade de metal pesado, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica e radiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção de fundo.

O termo tolerância a estresses abióticos, utilizado aqui se refere à capacidade de uma planta para suportar um estresse abiótico, sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.

Conforme utilizado aqui o termo a eficiência da utilização da água (WUE) se refere ao nível de matéria orgânica produzida por unidade de água consumida pela planta, ou seja, o peso seco de uma planta em

23/218 relação aa utilização de água da planta, por exemplo, a biomassa produzida por unidade de transpiração.

Conforme utilizado aqui o termo a eficiência da utilização de fertilizantes referese aos processos metabólicos que levam a um aumento na produtividade da planta, biomassa, vigor, e a taxa de crescimento por unidade de fertilizante aplicado. O processo metabólico pode ser a captação, spread, acumulação, absorvente, transferência (na planta) e utilização de um ou mais dos minerais e das moléculas orgânicas absorvidas pela planta, como nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.

Conforme utilizado aqui as - condições limites_.de fertilizantes .. o termo se refere às condições de crescimento que inclui um nível (por exemplo, concentração) de um fertilizante aplicado que é abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.

Conforme utilizado aqui o termo eficiência da utilização do nitrogênio (NUE) refere-se ao(s) processo(s) metabólicos que levam a um aumento na produtividade da planta, biomassa, vigor, e a taxa de crescimento por unidade de nitrogênio aplicado. O processo metabólico pode ser a captação, spread, acumulação, absorvente, transferência (na planta) e utilização de nitrogênio absorvido pela planta.

Conforme utilizado aqui as condições limitantes de nitrogênio se refere às condições de crescimento que inclui um nível (por exemplo,

24/218 concentração) de nitrogênio (amônia, por exemplo, ou nitrato) que é aplicado abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.

Plantas melhoradas NUE e FUE são traduzidas no campo em qualquer uma das quantidades similares de rendimento de colheita, aplicando menos fertilizantes ou rendimentos aumentados adquirida por meio da aplicação dos mesmos níveis de fertilizantes. Assim, a melhoria NUE ou FUE tem um efeito direto sobre a produtividade das plantas no campo. Assim, os polinucleotídeos e polipeptídeos de algumas configurações da invenção afetam positivamente a produtividade das plantas, produção de sementes e biomassa da planta. Além disso, o benefício da NUE plantas melhoradas com certeza vai melhorar a qualidade da colheita e bioquímicos constituintes das sementes, tais como produção de proteína e rendimento de óleo.

Conforme utilizado aqui o termo aumento refere-se a pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20 %, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80%, aumento da produtividade, a taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou nitrogênio eficiência da utilização de uma

25/218 planta em comparação com uma planta nativa, [ou seja, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeo ou polipeptídeos) da invenção, por exemplo, uma planta nãotransformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas 5 condições de crescimento.]

O termo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno, como aqui utilizado, refere-se a regulação alta do nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro da planta por meio da 10 introdução do polinucleotídeo exógeno em uma célula de planta ou vegetal e expressando por meio de recombinação, como descrito aqui abaixo.

expressando refere-se ao nível de polipeptídeos.

CnnformA ut i 1 i zado......aqui termo no mRNA e, opcionalmente,

Conforme utilizado aqui, o termo polinucleotídeo exógeno se refere a uma sequência de ácido nucléico heterólogo que não pode ser expressa naturalmente na planta ou que a superexpressão da usina é a 20 desejada. Os polinucleotídeos exógenos podem ser introduzidos na planta de uma forma estável ou transitória, de modo a produzir um ácido ribonucléico (RNA) e/ou uma molécula polipeptídica. Note-se que o polinucleotídeo exógeno pode incluir uma sequência de ácido nucléico que é 25 idêntico ou parcialmente homólogo a uma sequência de ácido nucléico endógeno da planta.

O termo endógeno, como aqui utilizado, refere-se a qualquer polinucleotídeo e

26/218 polipeptídeo que está presente e/ou expresso naturalmente dentro de uma planta ou uma célula da mesma.

De acordo com algumas configurações da invenção os polinucleotídeos exógenos 5 compreendem uma sequência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, 10 cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%,%, pelo menos, cerca de 93, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%,__pelo menos, __cerca de 96%, _ pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 15 99%, por exemplo, 100% idêntico ao sequência de ácido nucléico selecionado do grupo consistindo de SEQ ID N°s: 9Õ5; 882j 1-12 , 15-105,' 203-297~, 299-523', 845-881, 883-904,

906-925 e 933.

Identidade (por exemplo, por 20 cento de homologia) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI), por exemplo, utilizando os parâmetros padrão.

De acordo com algumas configurações da invenção do polinucleotídeos exógenos, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de

27/218

84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%,%, pelo menos, cerca de 93, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntico ao polinucleotideo selecionada do grupo consistindo da SEQ ID N°s: 905, 882, 112, 15-105, 203-297, 299-523, 845-881, 883-904, 906-925 e 933 .

De acordo com algumas configurações da invenção do polinucleotídeos exógenos é estabelecida por SEQ ID N°: 905, 882, 1-12, 15-105, 203-297, 299-523, 845-881, 883-904, 906-925 ou 933.

De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é fornecido um método de aumento de produtividade, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta. O método é efetuado por expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionado do grupo consistindo de SEQ ID N°s: 905, 882, 1-13, 15-105, 203-523, 845-881, 883 -904, 906-925 è 933, aumentando assim a produtividade, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio da planta.

28/218

De acordo com algumas configurações da invenção os polinucleotídeos exógenos são selecionados do grupo consistindo de SEQ ID N°s: 905, 882, 1-13, 15-105, 203-523, 845-881, 883-904, 906-925 e 933.

Conforme utilizado aqui o polinucleotídeo refere-se a uma única sequência de ácido nucléico ou dupla fita que é isolada e que, sob a forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência de polinucleotídeo genômica e/ou sequências de polinucleotídeo composto (por exemplo, uma combinação das opções acima).

O termo isolado refere-se a, pelo menos parcialmente separada_ do₌ ambiente natural., por exemplo, a partir de uma célula vegetal.

Conforme utilizado aqui o termo sequência de polinucleotídeo complementar refere-se a ümã sequência/, qüé resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro com uma transcriptase reversa ou qualquer outro

RNA	polimerase DNA dependente. Tal	sequência	pode	ser
ampliada posteriormente in vivo ou in	vitro, utilizando	um
DNA	polimerase DNA dependente.
	Conforme	utilizado	aqui	o

termo sequência de polinucleotídeos genômica se refere a uma sequência derivada (isolada) a partir de um cromossomo e, portanto, representa uma parcela contígua de um cromossomo.

Conforme utilizado aqui o termo sequência de polinucleotídeo composto refere-se a

29/218 uma sequência, que é pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídeo da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas de interposição entre eles. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo o de outros genes, e normalmente vai incluir conservadas as sequências de sinais de splicing. Tais sequências intrônicas poderão igualmente incluir elementos de ação cis expressão regulamentar.

De acordo com algumas configurações da invenção, os polinucleotídeos exógenos da invenção codificam um polipeptideo tendo uma sequência de. aminoácidos, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 15 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos cerca de 84 %, pelo menos, cerca de 85%, pelo

---menrrsç cerca dê 8Έ%\ pêlo menos, cerca de 8 7%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de

	90%,	pelo menos, cerca de	91%,	pelo menos,' cerca de	92%,
20	pelo	menos cerca de	93%,	pelo	menos,	cerca de 94%,	pelo
	menos	, cerca de 95%,	pelo	menos,	cerca	de 96%, pelo menos,

cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou mais, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N°s:

172, 146, 106-117, 120-145, 147-171, 173-202, 524-616, 621844, 926-931 e 932.

Homologia (por exemplo, porcentagem de homologia) pode ser determinada utilizando

30/218 qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o BlastP ou TBLASTN software do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI), tais como usando os parâmetros padrão, quando a partir de uma sequência polipeptídica; ou o algoritmo tBLASTX (disponível por meio do NCBI) , por exemplo, utilizando os parâmetros padrão, o que compara os seis-quadros produtos de tradução conceituai de uma sequência de nucleotídeos de consulta (ambas as vertentes) contra um banco de dados de sequências de proteínas.

Sequências homólogas incluem ambas as sequências ortólogas e parálogas. O termo parálogos “refere -se a -duplicação de genes- dentro- do. genoma de uma espécie com genes parálogos. O termo ortólogos refere-se a genes homólogos em diferentes organismos, devido à relação ancestral.

Uma opção para identificar ortólogos em plantas monocotíledôneas está realizando uma pesquisa de explosão recíproca. Isso pode ser feito por uma primeira explosão envolvendo explodir a sequência de interesse contra qualquer banco de dados de sequência, como a base de dados do NCBI publicamente disponíveis que podem ser encontradas em: Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) NCBI (ponto) NLM gov (ponto) nih (ponto) . Se ortólogos de arroz forem procurados, a sequência de interesse explodido seria contra, por exemplo, a 28.469 clones de longa-metragem de cDNA de Oryza sativa Nipponbare disponíveis no NCBI. Os resultados da explosão podem ser

31/218 filtrados. As sequências de longa-metragem, quer do resultado filtrado ou os resultados não filtrados são então tiradas de volta (segunda explosão) contra as sequências do organismo a partir da qual a sequência de interesse é derivada. Os resultados das explosões primeira e segunda são então comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultando na maior pontuação (melhor acerto) na primeira explosão identifica na segunda explosão a sequência de consulta (o original sequência de interesse) como o 10 melhor acerto. Utilizando o mesmo raciocínio um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de famílias de grande sequência, o programa ClustalW _ pode ser utilizado [Hypertext Transfer Protocol :// World..

Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido por uma árvore vizinho-ligado (Hypertext Transfer Protocol:// pt org (ponto) wikipedia (ponto)/wiki/Neighbor-joining) que ajuda a visualizar o agrupamento.

De acordo com algumas configurações da invenção, os polinucleotídeos exógenos codificam um polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos estabelecida pelo SEQ ID N° : 172, 146, 106-117,

120-145, 147-171, 173-202, 524 - 616, 621-844, 926-931 e

932 .

De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, o método de aumento de produtividade, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de

32/218 utilização de Nitrogênio de uma usina é efetuado por expressar dentro da planta compreendendo um polinucleotídeo exógeno a codificação de sequência de ácido nucléico um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo de

SEQ

932, aumentando

524

produti

biomassa, taxa

teor

tolerância a estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio da planta.

O ácido nucléico que codifica os polipeptídeos da presente invenção pode ser otimizado para a expressão. Exemplos de sequência de modificações incluem,__mas„não estão limitados, a,uma G alteradas/conteúdo _ de C para melhor abordagem que tipicamente encontradas nas espécies vegetais de interesse, e a remoção de códons atípica encontrada em espécies vegetais comumente referido como códon de otimização.

O termo otimização do códon refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA adequado para uso dentro de um gene estrutural ou fragmento dele que se aproxima de uso dos códons dentro da planta de interesse. Portanto, um gene otimizado ou sequência de ácido nucléico se refere a um gene em que a sequência de nucleotídeos de um gene nativo ou natural ocorrendo que foi modificado a fim de utilizar estatisticamente códons preferenciais ou estatisticamente favorecido dentro da planta. A sequência de nucleotídeos geralmente é analisada ao nível do DNA e da região de codificação otimizado para a expressão em

33/218 determinadas espécies de procedimento adequado, por Sardana et al. (1996, Plant plantas utilizando qualquer exemplo, conforme descrito no Cell Reports 15:677-681) . Neste método, o desvio-padrão de uso de códon, uma medida de viés de utilização de códons, pode ser calculado pelo primeiro encontrar o desvio quadrado proporcional de utilização de cada códon do gene nativo em relação àquela de genes de plantas altamente expressos, seguido por um cálculo do desvio médio quadrado. A fórmula utilizada é: 1 SDCU η = 1 N [ (Xn - Yn) /Yn] 2/N, onde Xn refere-se à frequência da utilização de n códon em genes de plantas altamente expressos, onde Yn à frequência de uso de n códon no gene de _ interesse-e-N^se .refere ao número-- total _de códons no gene de_ interesse. A Tabela de utilização de códons dos genes altamente expressos de dicotiledôneas é compilado utilizando os dados de Murray et al . (1989, Nuc Res Ácidos. 17:477

498) .

Um método para otimizar a sequência de ácido nucléico de acordo com a utilização de códons preferenciais para um determinado tipo celular vegetal é baseado na utilização direto, sem realizar quaisquer cálculos extra estatística, Tabelas de otimização de códon tais como os fornecidos on-line no Banco de Dados de Utilização de Códons por meio do NIAS [National Institute of Agrobiological Sciences] (Instituto Nacional de Ciências agroecológicos) Banco de DNA no Japão (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) Kazusa (ponto) ou (ponto) jp/códon /) . O Banco de Dados de Utilização de Códons contém

34/218 tabelas de utilização de códons para um número de espécies diferentes, com cada Tabela de utilização do códon ter sido estatisticamente determinada com base nos dados presentes no GenBank.

Ao utilizar as Tabelas acima para determinar os códons preferenciais ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma determinada espécie (para o arroz, por exemplo), uma sequência de codificação de ocorrência natural de nucleotídeos de uma proteína de interesse pode ser códon otimizado para aquela determinada espécie de planta. Esta é efetuada por meio da substituição de códons que pode ter uma baixa incidência estatística na espécie particular dó “genõmã^ com códocs correspondentes, -em. relação a um aminoácido, que são estatisticamente mais favorecidas. No entanto, jjm ou mais códons menos favorecidos podem_ser selecionado para eliminar sítios de restrição existentes, criar novas nos cruzamentos potencialmente úteis (5' e 3' finais para acrescentar peptídeo sinal ou cassetes de terminação, sítios internos que podem ser utilizados para cortar e unir segmentos juntos para produzir uma sequência de longa-metragem correta), ou para eliminar as sequências de nucleótidos que podem afetar negativamente a estabilidade ou expressão do mRNA.

A sequência de nucleotídeos de ocorrência natural de codificação já pode, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que correspondem a um códon estatisticamente favorecido em uma determinada planta. Portanto, otimizando o códon da sequência de

35/218 nucleotídeos nativos podem incluir determinando quais códons, dentro da sequência de nucleotídeos nativos, não são estatisticamente mais favorecidos no que diz respeito a uma unidade especial, e de modificar estes códons de acordo com uma tabela de utilização de códons da planta em particular para produzir um códon otimizado derivador. A sequência de nucleotídeos modificados pode ser total ou parcialmente otimizada para a utilização de plantas códon desde que a proteína codificada pela sequência modificados é produzida a um nível mais de nucleotídeos elevado do que a proteína codificada pelo correspondente natural ou gene nativo. Construção de genes sintéticos, alterando a utílizaçãÕ”ÓÕ C”Ódon~é* descrito; por-exemplo na aplicação _de patente PCT 93/07278.

De acordo com algumas configurações da invenção, polinucleotídeos exógenos consistem de um RNA não-codificante.

Conforme utilizado aqui o termo ' não-codif icante do RNA refere-se a uma molécula de

RNA que não codifica uma polipeptídeo). Exemplos não-codificante incluem,

RNA antisenso, um pr

sequência	de aminoâcidos	(um
de tais	mo1é cula s	de	RNA
mas não	1 imitados	a,	uma
-mi RNA	(precursor	de	um

microRNA) , ou um precursor de RNA Piwi-interagindo (piRNA).

Um exemplo de não-limitação de um polinucleotideo RNA não-codificante é fornecido em SEQ ID N°: 72 (BDL90).

36/218

Assim, a invenção compreende sequências de ácidos nucléicos descritos acima; fragmentos, cumprimento de sequências hibridizáveis, sequências homólogas aos mesmos, sequências de polipeptídeos de codificação semelhante com utilização de códons diferentes, como inserção, remoção de um ou mais nucleotídeos, seja natural ou induzida pelo homem, se j a aleatoriamente ou de forma orientada.

fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de

90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%,%, pelo menos, cerca de 93, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo da SEQ ID N°s: 905, 882, 1-12, 15-105, 203-297, 299-523, 845-881, 883904, 906-925 e 933.

De acordo com algumas configurações da invenção da sequência de ácidos nucléicos é capaz de aumentar a produção, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, teor de óleo, a tolerância a estresses

37/218 abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta.

De acordo com algumas do polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionado do grupo consistindo de SEQ

ID

905, 882,

1-13 ,

15-105,

203-523, 845-881,

883-904,

906-925

De acordo com algumas do polinucleotídeo isolado é estabelecida por

SEQ ID N°:

882, 1-13, 15-105, 203-523,

845-881, 883-904,

906-925 e fornece um polinuc 1 eotídeo_ isolado__compreendendo _uma.. _sequência. de codificação de ácidos nucléicos um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou mais, digamos, 100 % de homologia com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N°s: 172, 146, 106-117, 120-145, 147-171, 173-202, 524-616, 621844, 926-931 e 932.

38/218

De acordo com algumas configurações da invenção da sequência de aminoácidos é capaz de aumentar a produção, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, teor de óleo, a tolerância a estresses

abióticos e/ou	eficiência	de utilização de nitrogênio de	uma
planta.
		A invenção	fornece	um
polinucleotídeo	isolado	compreendendo uma	sequência	de
codificação de	! ácidos	nucléicos, um polipeptídeo	que
compreende a sequência de	aminoácidos selecionada do grupo
consistindo de	SEQ ID N°s	: 172, 146, 106-117,	120-145,	147-
171, 173 - 202,	524-844 e	926-932.
		A invenção.	.fornece	. um
polinucleotídeo	isolado	compreendendo uma	sequência	de

codificação de ácidos nucléicos, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID N°s: 172, 146, 106-

117,	120-145, 147-171, 173-202, A	524-844 e 926-932.
invenção	fornece	um
polipeptídeo	isolado	compreendendo	uma	sequência		de
aminoácidos,	pelo menos,	cerca	de 80%,	pelo	menos, cerca	de
81%,	pelo menos, cerca	de 82%	, pelo menos,	cerca de	83	%,
pelo	menos,	cerca de 84	%, pelo menos,	cerca de 85%,	pelo
menos	cerca	de 86%, pelo menos	cerca	de 87%, pelo menos,
cerca	de 88%	, pelo menos,	cerca	de 89%,	pelo	menos, cerca	de

90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%,%, pelo menos, cerca de 93, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de

39/21898%, pelo menos, cerca de 99%, ou mais, digamos, 10 0% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N°s:

172, 146,

106-117, 120-145,

147-171, 173-202,

524-616, 621-844, 926-931

De acordo com algumas invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de

SEQ ID N°s: 172, 146, 106-117, 120-145, 147-171, 173-202,

524-844 e 926-932.

De acordo com algumas configurações da invenção, o polipeptídeo é estabelecido por SEQ ID N° : 172, 146, 106-117, 120-145, 147-171, 173-202, ________524.-844, 926-931...e...932 ...... ... ______ ______________ ______.

A invenção também engloba fragmentos de polipeptídeos acima descritos e polipeptídeos tendo mutações, tais como deleções, inserções ou substituições de um ou mais aminoácidos, seja natural ou induzidas pelo homem, seja aleatoriamente ou de forma orientada.

utilizado aqui abrange as descendentes das plantas sementes, brotos, caules, células vegetais, tecidos 25 qualquer forma, incluindo regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos, que são particularmente

O termo planta como plantas inteiras, antepassados e > partes da planta, incluindo as raízes (tubérculos inclusive), e e órgãos. A planta pode ser de culturas em suspensão, embriões, tecidos de calo, folhas, pólen e microsporos. As plantas úteis nos métodos da invenção

40/218 incluem todas as instalações que pertencem à superfamília Viridiplantae, em especial monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo uma leguminosa forrageira ou forragem, plantas ornamentais, culturas alimentares, árvore ou arbusto selecionado da lista compreendendo Acacia spp. , Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Bétula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp, , Cinnamomum cassia,,— Cof fe.a_ _,arab-i r.a ,---Gol ophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia

41/218 dissolute, índigo incamata, íris spp., Leptarrhena pyrolifolia,

Lespediza spp.,

Lettuca spp.,

Leucaena leucocephala,

Loudetia simplex,

Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta,

Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratíssima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea 10 glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseupontosuga menziesii, Pterolobium —- - stellatum,-· - Pyrus - communis , Quercus........spp.,--- Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp.,

Rubus spp. ,

Salix spp.,

Schyzachyrium sanguineum,

Sciadopitys vefficillata,

Sequoia sempervirens,

Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp.,

Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra,

Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, aspargos, alcachofra, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve, linhaça, canola, lentilha, oleaginosas, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba sacarina, cana de açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim,

42/218 ervilha, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, eucalipto, berinjela, uma árvore, uma planta ornamental, uma gramínea perene e uma colheita de forragem. Alternativamente, algas e outras não-viridiplantas podem ser utilizadas para os métodos da presente invenção.

De acordo com algumas configurações da invenção, a planta utilizada pelo método da invenção é uma planta de colheita como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, azeitona, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola cana, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, tremoço, colza, tabaco, álamo e algodão.

. _______-----------------— .De acordo ______ com. ... algumas configurações da invenção, é fornecida uma célula vegetal exógena expressando o polinucleotídeo de algumas configurações da invenção, uma construção de ácido nucléico de algumas configurações da invenção e/ou do polipeptídeo de algumas configurações da invenção.

De acordo com algumas configurações da invenção, a expessão de polinucleotídeos exógenos da invenção dentro da planta realiza-se por meio da transformação de uma ou mais células da planta com os polinucleotídeos exógenos, seguidos pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e o cultivo da planta madura em condições adequadas para expressar esses polinucleotídeos exógenos na planta madura.

De acordo com algumas configurações da invenção, a transformação é efetuada por

43/218 meio da introdução na célula da planta de ácido nucléico, que inclui uma construção de polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção e de pelo menos um promotor para direcionar a transcrição do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula vegetal) . Mais detalhes sobre a transformação e abordagens adequadas são fornecidos abaixo.

De acordo com algumas configurações da invenção, e compreendendo a construção de invenção, e um promotor para sequência de ácidos nucléicos uma célula hospedeira.—- — -fornecido um acido nucléico polinucleotídeos isolados da direcionar a transcrição da do polinucleotídeo isolado em acordo com algumas conf igurações da invenção, o polinucleotídeo isolado é operavelmente ligado à sequência promotora.

Uma sequência de nucléicos de codificação é operavelmente ligado a uma sequência de regulamentação (por exemplo, promotor) se a sequência de regulamentação é capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência de codificação com ela relacionada.

Como utilizado aqui, o termo promotor refere-se a uma região do DNA que fica a montante do sítio de iniciação transcricional de um gene para o qual se liga a RNA polimerase para iniciar a transcrição do RNA. O promotor que controla (por exemplo, que parte de uma planta) e/ou quando (por exemplo, em que fase ou condição na

44/218 vida de um organismo) o gene é expresso.

Qualquer sequência promotora adequada pode ser utilizada pela construção de ácido nucléico da presente invenção. De preferência, o promotor é um promotor constitutivo, um tecido específico, ou um promotor induzível estresse abiótico.

Promotores constitutivos apropriados incluem, por exemplo, promotor CaMV 3 5S (SEQ ID N°:1184; Odell et al . , Nature 313 :810-812, 1985); promotor

Arabidopsis At6669 (SEQ ID N°:1183; vide PCT Publication N° W004081173A2) ; Ubi 1 de milho (Christensen et al . , Plant Sol. Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et alT, Plant Cell 2:163 -171/ 1990) ; pEMU (Last et.al., Theor. Appl . Genet . 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al . ,

PhysiolPlant 100:456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al,

Plant J Nov;2(6):837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); ciclofilina de arroz (Bucholz et al, Plant Mol

Biol. 25 (5):837-43, 1994);

H3 histona de milho (Lepetit et

Gen. Genet. 231:

276-285,

1992) ; Actina 2 (An et al, Plant

J. 10(1);107-121,

1996) e

Super MAS Sintético (Ni et al . , The Plant Journal 7:

661-76,

1995) .

Outros promotores constitutivos incluem aqueles em

Patentes dos EUA. N°s.

5.659.026,

5.608.149,

5.608.144,

5.604.121,

5.569.597,

5.466.785,

5.399.680,

5.268.463 e

5.608.142 .

Promotores específicos para certos tecidos incluem, mas não estão limitados a, promotores específicos para folhas [conforme descrito, por

45/218 exemplo, por Yamamoto et al. , Plant J. 12:255-265, 1997;

Kwon et al. , Plant Physiol . 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al . ,

Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al . , Plant Mol. Biol.

23:1129-1138, 1993 ; e Matsuoka et al . , Proc. Natl . Acad.

Sei. USA 90:9586-9590, 1993]; promotores preferenciais de raiz [por exemplo, de genes específicos da raiz (Simon, et al. , Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al . , J.

Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al . , Plant

Mol. Biol. 14: 633, 1990) , Albumina da Castanha do Pará (Pearson¹ et al . , Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), ____Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al . , Mol. Gen. Genet. 208:

15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987),

Zeína (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996) , SPÃ de Trigo (AlbanietalÇ Plant CélT, 9: 171- 184, õleosirra de~ girassol (Cummins, etal., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876,

1992)], promotores específicos de endospermas [e.g., wheat 20 LMW e HMW, glutenin-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR

17:461-2), gliadinas a, b e g do trigo (EMBO3:1409-15, 1984) , promotor ltrl da cevada, hordeína da cevada BI, C, D (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Planta J 4:343-55, 1993;

Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), DOF da cevada (Mena et al,

The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7) , promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al ., Plant J. 13: 629-640, 1998) , prolamina de arroz NRP33, globulina de arroz Glb-1 (Wu et al, Plant Cell Physiology

46/218 (8) 885- 889, 1998), globulina alfa de arroz REB/OHP-1 (Nakase et al. Plant Mol. Biol . 33: 513-S22, 1997) , ADPglicose PP de arroz (Trans Res 6:157-68, 1997) , família de genes ESR do milho (Plant J 12:235-46, 1997), sorghum gammakafirina (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores embrionários específicos [e.g., rice OSH1 (Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma ef al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999) , oleosina de arroz (Wu et at, J. Biochem. , 123:386, 1998)], e promotores específicos de floração [e.g., AtPRP4, chalene synthase (chsA) (Van der Meer, et al. , Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LA.T52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apetalaPromotores indutores de estress abiótico apropriados incluem, mas não se limitam a, promotores como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al. , Mol Γ Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores dê seca-induzida como o gene promotor rabl7 do milho (Pia et. al . , Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), gene promotor rab28 do milho (Busk et. al . , Plant J. 11:12 85-1295, 1997) e gene promotor Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores de calor induzido incluem o promotor hsp80 do tomate (Patente EUA. N° 5,187,267) .

A construção de ácido nucléico de algumas modalidades da invenção pode incluir ainda um marco adequado de seleção e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas modalidades da invenção, a construção de ácido nucléico utilizada é um vetor de transporte, que pode

47/218 propagar-se tanto em E. coli (onde a construção é composta por um marcador selecionável e origem de replicação adequados) e será compatível com a propagação das células. A construção de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmid, uma fagemida, uma cosmida, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

A construção de ácido nucléico de algumas modalidades da invenção pode ser utilizada de forma estabilizar ou transformar transitoriamente as células vegetais.

Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado no genoma da planta e, como tal, representa um traço estável e herdado.

Na transformação transitória, os polinucleotídeos exógenos são expressos pelas células transformadas, mas não são integrados no genoma e, como tal, representam uma característica transitória. “

Há Vctri o s' métodos de introdução de genes estranhos em ambas as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

Os métodos de princípio que causam a integração estável do DNA exógeno no DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais:

(i) Gene de Transferência de Agro-bactéria mediadora: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers in Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,

48/218 eds. Schell, J., e Vasil, L.

K., Academic Publishers, San

Diego, Calif.

(1989) p.

2-25;

Gatenby, in Plant

Biotechnology, eds. Kung,

Arntzen, C. J., Butterworth

Publishers, Boston, Mass.

(1989) p. 93-112.

DNA: Paszkowski et al . , in Cell

Culture e Somatic Cell

Molecular Biology

Vasil, L.

(1989) p. 52-68;

into protoplasts,

6:1072-1074 .

plant

Fromm plant

DNA cells:

et al.

of Plant

Academic

Genetics of

Plants, Vol.

6,

Nuclear Genes eds. Schell, including

Toriyama,

Publishers,

San Diego,

Calif.

methods for

K. et al.

direct uptake of DNA (1988) Bio/Technology uptake induced by brief electric shock of

Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384.

Nature (1986) 319:791-793. DNA injection into cells ou

Bio/Technology

Bio/Technology tissues by particle bombardment, Klein et al.

(1988)

6:559-563;

McCabe et (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol.

(19’9’0) 7’9:206-20’9; by the use of micropipette systems:

Neuhaus

Neuhaus fibras et al . , Theor. Appl . Genet . (1987) 75:30-36;

e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217;

de vidro ou de carboneto de silício suiço tecido caloso, Patente EUA. N° 5,464,765 ou by the direct incubation of DNA with germinating pollen,

DeWe t et al .

in Experimental

Manipulation of Ovule

Tissue

Chapman, G.

e Mante11, S.

Dani eis, W.

Longman, London, (1985) p.

197-209; e

Ohta, Proc.

Acad .

Sei.

USA (1986) 83 : 715719 .

49/218

O sistema de Agrobacteriums inclui a utilização de vetores de plasmídios que contêm segmentos definidos de DNA que se integram ao DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo da espécie da planta e do sistema de entrega de Agrobacterium. Uma abordagem comumente utilizada é o procedimento de disco de folhas que pode ser realizada com qualquer explante de tecido que proporciona uma boa fonte para o início da diferenciação da planta inteira. Veja, por exemplo, Horsch et al. em Biologia Molecular Vegetal Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem complementar emprega o sistema de entrega de Agrobacterium, em combinação com infiltração a vácucxj O sistema Agrobacterium é especialmente viável a criação de plantas transgênicas de dicotiledôneas.

“ ' Existem vários métodos de

-bransferência--direta de DNA em cêlülãs vegetais. Nãt eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um campo elétrico forte. Em microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente as células utilizando micropipetas muito pequenas. Durante o bombardeamento de micropartículas, o DNA é adsorvido em microprojéteis como cristais do sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e as microprojéteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos vegetais.

Após a propagação de plantas de transformação estável é exercida. O método mais comum de propagação da planta é pela semente. Regeneração de propagação por sementes, entretanto, tem a deficiência de

50/218 que, devido à heterozigosidade há uma falta de uniformidade na cultura, pois as sementes são produzidas por plantas de acordo com as variações genéticas regida por regras mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada um vai crescer com suas próprias características específicas. Portanto, é preferível que a planta transformada seja produzida de tal forma que a planta regenerada tenha características idênticas e as características da planta-mãe transgênica. Portanto, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação, que prevê uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

A micropropagação é _um processo de crescimento de plantas da nova geração a partir de uma única peça de tecido que tenha sido retirada de uma planta-mãe selecionada ou cultivada. Este processo permite a reprodução em massa dê plantas que õ tecido pref e r i do expressando a proteína de fusão. As novas instalações de geração que são produzidos são geneticamente idênticas, e tem todas as características, a planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material vegetal de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação das cultivadas selecionadas para a da planta original transgênica ou transformada.

As vantagens da clonagem de plantas ve1oc i dade de muitiplicação das plantas e da qualidade uniformidade das plantas produzidas.

51/218

A micropropagação é um processo multi-estágio que requer alteração do meio de cultura ou as condições de crescimento entre as fases. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro etapas 5 fundamentais: Fase um, cultura de tecidos inicial, fase dois, multiplicação da cultura de tecidos; terceira fase, diferenciação e formação das plantas, e fase quatro, isolamento de estufa e endurecimento. Durante a primeira fase, cultura de tecidos inicial, a cultura de tecidos é 10 estabelecido e certificado sem contaminantes. Durante a fase dois, a cultura de tecidos inicial é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecidos seja produzido para atender as metas de produção. Durante a terceira fase, as amostras de tecido cultivado em dois estágios são divididas 15 em plantas cultivadas e individual. Na quarta fase, as pTântulas transformadãs sãõ^- transferidas para uma estufa ------para o endurecimenüõ onde ã tõTerânciã das plantas a luz e aumentada gradualmente de modo que podem ser cultivadas em ambiente natural.

De acordo com algumas configurações da invenção, as plantas transgênicas são geradas por transientes de transformação de células da folha, as células me r i s t emá t i ca s ou a planta inteira.

A transformação transiente pode ser efetuada por qualquer dos métodos de transferência direta de DNA descrito acima ou por uma infecção viral, utilizando vírus de planta modificada.

52/218

Vírus que se mostraram úteis na transformação de plantas hospedeiras incluem CaMV, Vírus Mosaico do Tabaco [Tobacco mosaic virus] (TMV), Vírus Bromo do Tabaco [brome mosaic virus] (BMV) e e Vírus Comum Mosaico do Feijão [Bean Common Mosaic Virus] (BV ou BCMV). A transformação de plantas utilizando vírus é descrita na Patente EUA. N° 4.855.237 (virus dourado mosaico do feijão; BGV) , EP-A 67,553 (TMV), Japanese Published Application N° 63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV) , EPA 278,667 (BV) ; e Gluzman, Y. et al . , Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988) . Partículas de Pseudovírus para uso na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas estão descritas em WO 87/06261.

De acordo com algumas configurações da invenção, o vírus utilizado para transforma'çõe^_s trartsientes é avirulento~e assim é incapaz de causar sintomas severos, tais como taxa de crescimento reduzida, mosaico, pontos do anel, rolo de folhas, amarelecimento, estrias, formação formação de varíola, formação de tumor e corrosão. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus de ocorrência natural avirulento ou um vírus artificialmente atenuado. Atenuação do vírus pode ser feita utilizando métodos conhecidos na arte, incluindo mas não limitados a, aquecimento sub-letal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese dirigida, como descrito, por exemplo, Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259 -269, 2003), Gal-On et al . (1992), et al Atreya.

53/218 (1992) e Huet et al. (1994).

Estirpes de vírus adequadas podem ser obtidas de fontes disponíveis, como, por exemplo, a Coleção de Cultura Tipo .Americana [American Type Culture

Collection] (ATCC) ou por isolamento de plantas infectadas.

Isolamento do vírus a partir de tecidos vegetais infectados pode ser efetuado por meio de técnicas bem conhecidas na arte, como descrito, por exemplo, Foster and Tatlor, Eds. Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to

Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana

Pr), Vol 81), Humana Press, 1998. Resumidamente, os tecidos de uma planta infectada acreditados para conter uma alta concentração de um vírus adequado, de preferência folhas jovens e pétalas de flores, são trituradas em solução tampão 15 (por exemplo, solução tampão fosfato) para produzir uma infectadas pelo vírus da seiva que pode ser utilizado em ----pôster fores—inOcuTaçõest

A construção do RNA dos vírus para introdução e expressão de sequências de 20 polinucleotídeos exógenos não-virais é demonstrada pelas referências acima bem como por Dawson, W. O. et al. , Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J.

(1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:12941297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e

Patente EUA. N° 5.316.931.

Quando o vírus é um vírus DNA, modificações adequadas podem ser feitas para o próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode ser primeiramente

54/218 clonado em um plasmídeo bacteriano, para facilitar a construção do vetor desejado viral com o DNA estrangeiro. O vírus pode, então, ser extirpado do plasmídeo. Se o vírus é um vírus de DNA, uma origem de replicação bacteriana pode ser ligado ao DNA viral, que é replicada pelas bactérias. A transcrição e tradução do DNA irá produzir as proteínas que revestirão o DNA viral . Se o vírus é um vírus RNA, o vírus é geralmente como um cDNA clonado e inserido em um plasmídeo. O plasmídeo é então utilizado para fazer todas as construções. O RNA do vírus é então produzido por transcrever a sequência viral do plasmídeo e tradução dos genes virais para a produção da proteína capsidial (s) que revestirá o RNA viral . _________

Em uma configuração, um polinucleot ideo de planta viral é fornecido em que a sequência de codificação da proteína capsidial nativa foi suprimrda^a partirdeumpõrinucleotídeo viralj uma proteína capsidial viral de uma planta não-nativa da sequência de codificação e um promotor não-nativo, de preferência o promotor subgenômico de sequência de codificação da proteína capsidial, com capacidade de expressão na planta hospedeira, a embalagem da planta polinucleotídio recombinante viral, e garantir uma infecção sistêmica do hospedeiro pela planta polinucleotídeo recombinante viral, foi inserido. Alternativamente, o gene da capa protéica pode ser inativado por inserção da sequência de polinucleotídeo não-nativo dentro dela, como que uma proteína é produzida. A planta polinucleotídeo recombinante viral pode conter uma ou mais

55/218 adicionais promotores subgenômicos não-nativos. Cada promotor não-nativos subgenômico ê capaz de transcrever ou expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeos na planta hospedeira e incapaz de recombinação entre si e 5 com os promotores nativos subgenômicos. Sequências nãonativas (estrangeiros) de polinucleotídeos podem ser inseridas ao lado de uma planta nativa do promotor viral subgenômico ou a um promotor subgenômico viral de planta nativa e não-nativa se mais de uma sequência de 10 polinucleotídeo for incluída. As sequências de polinucleotídeo não-nativos são transcritos ou expressos na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados. _________ _________

Em uma segunda configuração, um polinucleotídeo recombinante viral de planta ê fornecido como na primeira configuração, exceto que sequência de proteínas nativas é colocada uma ao lado dos promotores subgenômico em vez de uma sequência de codificação de proteína de revestimento não-nativa .

Em uma terceira configuração, um polinucleotídeo viral de plantas recombinante é fornecido em que o gene da proteína de revestimento nativa é adjacente subgenômico a seu promotor e um ou mais promotores subgenômico que foram inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos nãonativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar genes adjacentes em uma planta hospedeira e são incapazes de

56/218 recombinação entre si e com os promotores nativos subgenômicos. As sequências de polinucleotídeos não-nativos podem ser inseridas ao lado dos promotores subgenômicos virais nao-nãtivos da planta de tal forma que as sequências 5 são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle dos promotores subgenômicos para produzir o produto dese j ado.

Em uma quarta configuração, um polinucleotídeo recombinante viral da planta é fornecido 10 como na terceira configuração, exceto que sequência de codificação das proteínas nativas é substituída por uma sequência de codificação de proteínas de revestimento não—— -nativas·.- _----„___ _ _... ____ _ ___

Os vetores virais são revestidos pelas proteínas codificadas pelo revestimento vegetal de polinucleotídeos recombinantes virais para a produção de um vírus de planta recombinante. 0 polinucleotídeo recombinante viral da planta ou vírus recombinanteda planta é utilizado para infectar plantas 20 hospedeiras adequadas. O polinucleotídeo recombinante viral da planta é capaz de replicação no hospedeiro, disseminação sistêmica no hospedeiro, e a transcrição ou expressão do(s) gene(s) exógeno(s) (polinucleotídeos exógenos) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

Técnicas de inoculação de vírus para as plantas podem ser encontrada em Foster and Taylor, eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology

57/218 (Humana Pr), Vol 81), Humana Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. Methods in Virology 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. Methods in Plant Virology, Blackwell, Oxford, 1984; Walkey/ D.G.A. Applied

Plant Virology, Wiley, New York, 1985;

e Kado and Agrawa,

eds. Principies	and	Techniques	in Plant Virology,	Van
Nostrand-Reinhold,	New	York.
		Além	do	exposto,	os
polinucleotídeos	da	presente invenção	também podem	ser

introduzidos no genoma do cloroplasto permitindo a expressão do cloroplasto.

Uma técnica para a introdução de - sequências- de polinucleotídeos exógenos ao genoma dos cloroplastos é conhecida. Esta técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, as células vegetais são tratadas quimicamente, de modo a reduzir o número de cloroplastos por célula a cerca de um. Em seguida, o polinucleotídeo exógeno é introduzido por meio do bombardeamento de partículas para dentro das células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeos exógenos nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos selecionados tais que são integráveis no genoma do cloroplasto via recombinação homóloga, que é facilmente realizada por enzimas inerentes ao cloroplasto. Para este efeito, os polinucleotídeos exógenos incluem, além de um gene de interesse, pelo menos uma extensão de polinucleotídeo que é derivada do genoma do cloroplasto. Além disso, os polinucleotídeos exógenos incluem um marcador de seleção, que serve de procedimentos

58/218 de seleção sequencial para verificar se todas ou quase todas as cópias do genoma do cloroplasto após a seleção incluirão os polinucleotídeos exógenos. Mais detalhes relativos a esta técnica são encontrados na Pat. EUA N°s 4945050 e 5693507, que são incorporados por referência. Um polipeptídeo pode

assim ser produzido	pelo sistema	de	expressão	de proteínas
do cloroplasto e	a integrar	a	membrana	interna dos
cloroplastos.
	Como	os	processos	que aumentam

a produtividade, a taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos.> e/ou eficiência de utilização de nitrogênio de uma planta pode envolver vários genes ~ agindo aditivamente- ou em. sinergia (ver, por exemplo, em Quesda et al. Plant Physiol. 130:95115 063 > 2002) , a presente invenção prevê ainda A expressão de

--uma—nhural idade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira para, assim, alcançar efeito superior sobre a produtividade, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, a tolerância a 20 estresses abióticos e/ou eficiência de utilização de nitrogênio da planta.

Expressando uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada por co-introdução de múltiplas construções 25 de ácido nucléico, cada uma incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma única célula de planta. A célula transformada que pode ser regenerada em uma planta adulta utilizando os métodos descritos acima.

59/218

Alternativamente, expressando uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuado por co-introdução de um único ácido nucléico construtor incluindo uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única célula de planta.

promotora única pode ser projetada que pode transcrever com uma sequência um RNA mensageiro policistrônico incluindo todas as diferentes sequências de polinucleotídeos exógenos. Para habilitar o co-tradução dos diferentes polipeptídeos codificados pelo RNA mensageiro policistrônico, as sequências de polinucleotídeo podem ser interligadas por meio do sítio de entrada de um ribossomo interno [internai ribosomè entry''site Τ'”’('IRES)'^-sequência*-que facilita a tradução de sequências de polinucleotídeos -posicionada a jusante _ da sequência IRES. Neste caso, uma molécula de RNA policistrônica transcrita codificando os polipeptídeos diferentes descritos acima será traduzida tanto da extremidade 5 ¹ nivelado e as duas sequências IRES internas da molécula de RNA policistrônica para assim produzir na célula todos os polipeptídeos diferentes. Como alternativa, a construção pode incluir várias sequências promotoras cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeos exógenos diferentes.

A célula de planta transformada com a construção incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotídeos exógenos pode ser regenerada em uma planta adulta, utilizando os métodos descritos acima.

60/218

Alternativamente, expressando uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada por meio da introdução de diferentes construções de ácido nucléico, incluindo os diferentes polinucleotídeos exógenos, em uma pluralidade de plantas. As plantas regeneradas transformadas podem ser cruzadas e progênie resultante selecionada para rendimento superior, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, a tolerância a estresses abióticos e/ou traços de eficiência na utilização de nitrogênio, utilizando técnicas de melhoramento convencional de plantas.

De acordo com algumas configurações da invenção, o método que compreende ^ainda - ocrescimento da planta expressando a polinucleotídeos exógenos sob estresse abiótico.^

--------Não___1 i mi t ando exemp 1 o s de condições de estresses abióticos incluem, salinidade, seca, água, excesso de água (por exemplo, inundação, alagamento), estiolamento, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade de metal pesado, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e radiação UV.

Assim, invenção inclui plantas exogenamente expressando o polinucleotídeo(s), as construções de ácido nucléico e/ou polipeptídeo (s) da invenção. Uma vez expresso dentro da célula vegetal ou a planta inteira, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos

61/218 conhecidos na arte, tais como, ensaios de atividade,

Western blots utilizando anticorpos capazes de se ligar especificamente a polipeptídeos, EnzymeLinked

Immuno

Sorbent Assay (ELISA), rádio-imuno-ensaio (RIA) , imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e afins.

Métodos de determinação do nível na planta do RNA transcrito exógenos dos polinucleotídeos incluem, por exemplo, análise reversa da polimerase (RT-PCR) (incluindo a quantitativa, semi-quantitativa ou em tempo real de RT-PCR) e hibridação de RNA-in situ .

Além disso, oanálogo~endógeno dos polinucleotídeos exógenos ou polipeptídeos da invenção, ou um fragmento do homólogo -endógeno (por exemplo, íntrons ou regiões~não~tradttz-idas)—na.qlanta pode ser utilizado como um marcador para a seleção assistida por marcadores (MAS), em que um marcador é utilizado para a seleção indireta de um determinante genético ou determinantes de uma característica de interesse (por exemplo, a biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, produtividade, tolerância a estresses abióticos) . Estes genes (DNA ou sequência de RNA) podem incluir ou ser ligados a sítios polimórficos ou marcadores genéticos no genoma, tais como polimorfismo de comprimento 25 dos fragmentos de restrição [restriction fragment length polymorphism] (RFLP) , microssatélites e polimorfismos de nucleotídeo único [single nucleotide polymorphism] (SNP), as impressões digitais de DNA [DNA fingerprinting] (DFP),

62/218 polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados [amplified fragment length polymorphism] (AFLP), expressão de nível de polimorfismo, polimorfismo do polipeptídeo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou RNA.

Exemplos de seleções assistidas por marcadores incluem, mas não estão limitadas a, a seleção para uma característica morfológica (por exemplo, um gene que afeta a forma, esterilidade masculina ou de resistência como a presença ou ausência de arista, cor do grão de coloração da bainha foliar, altura, aroma de arroz), a seleção para uma característica bioquímica (por exemplo, um gene’ quê codifica uma proteína que pode ser extraído e observado, por exemplo, isoenzimas e proteínas - -de- - reserva).;. _ seleção para uma caracteríshIca^hiOiógica—(-pox—exemplo, raças de patógenos ou biótipos de insetos com base sobre patógeno-hospedeiro ou a interação parasito-hospedeiro pode ser utilizada como um marcador desde a constituição genética de um organismo que pode afetar sua suscetibilidade a patógenos ou parasitas).

Os polinucleotídeos e polipeptídeos acima descritos podem ser utilizados em uma ampla variedade de plantas econômicas, de uma forma segura e rentável.

Linhas vegetais exogenamente expressando o polinucleotídeo ou o polipeptídeo da invenção são rastreados para identificar aqueles que apresentam o maior aumento da característica de plantas desejada.

63/218

O efeito do transgene (polinucleotídeo exógeno codificando o polipeptideo) sobre a tolerância a estresses abióticos pode ser determinado por

	meio de métodos	conhecidos, como detalhado	abaixo e	na seção
5	de exemplos que	se segue.
		Tolerância a	estresse	abiótico
	- Transformada	(ou seja, expressando o	transgene)	e não-

transformada (tipo silíqua), as plantas são expostas a uma condição de estresse abiótico, como a privação de água, 10 temperatura subótima (baixa temperatura, alta temperatura), a deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, uma condição de estresse salino, estresse osmótico, toxicidade d metal pesado, anaerobiose, a poluição atmosférica e radiaçãoUV.

* - Ensaio de tolerância de ' sabinidade---As—plantas^ t r a n s qêndc a s com tolerância a altas concentrações de sal são esperados apresentarem melhor germinação, vigor e crescimento elevado de sal. O estresse salino pode ser feito de várias maneiras, como, por exemplo, 20 irrigar as plantas com uma solução equimolar, cultivando as plantas em sistema hidropônico em uma solução equimolar de crescimento (por exemplo, a solução de Hoagland) , ou por meio da cultura de plantas em um meio de crescimento hiperosmótico [por exemplo, 50% a meio-Murashige Skoog (meio 25 MS)]. Como as plantas diferentes variam consideravelmente em sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, solução de crescimento, ou meio de crescimento pode ser ajustado de acordo com as características

64/218 específicas da cultivar específica da planta ou variedade, de modo a provocar um efeito leve ou moderada sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para orientações quanto à concentração adequada ver, Bernstein and Kafkafi,

5	Root Growth	Under Salinity	Stress In: Plant	Roots,	The
	Hidden Half	3rd ed. Waisel	Y,	Eshel A and	Kafkafi	U.
	(editors) Marcei Dekker	Inc . ,	New	York, 2002, e	referência
	neles) .
				Por	exemplo, um	teste	de
10	tolerância à	salinidade	pode	ser	realizado por	irrigar	as
	plantas em	diferentes	estágios	de desenvolvimento	com

_ _- concentrações crescentes de cloreto de sódio (por exemplo, mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM NaCl) aplicadas 'a partir de baixo e de cima para assegurar a mesma dispersão de sal .

Após’ a exposição à condição , de, .estresse as plantas são frequentemente---moni-to radas__até e f e i t o s subs t anc i a i s fisiológicos e/ou morfológicos aparecerem em plantas do tipo selsilíqua. Assim, a aparência externa fenotípica, grau de murchamento e sucesso global para atingir a maturidade e a 20 produção de progênie são comparadas entre plantas controle e transgênicas.

Os parâmetros quantitativos de tolerância medidos incluem, mas não estão limitados a, o peso médio úmida e seca, taxa de crescimento, o tamanho da 25 folha, a cobertura foliar (área foliar total), o peso das sementes rendido, o tamanho médio das sementes e o número de sementes produzidos por planta. Plantas transformadas não apresentando importantes efeitos fisiológicos e/ou

65/218 morfológicos, nem apresentando maior biomassa do que plantas do tipo selsilíqua, são identificadas como plantas tolerantes a estresse abiótico.

Teste de tolerância osmótica

Ensaios de estresse osmótico (incluindo o cloreto de sódio e ensaios manitol) são realizados para determinar se um fenótipo de estresse osmótico foi de cloreto de sódio específico ou se foi um fenótipo de estresse osmótico geral relacionado.

As plantas que osmótico podem ter maior tolerância à seca e/ou congelamento. Para experimentos . sal e osmótica, o meio é suplementado por exemplo, com 50 mM, 100 mM, 200 mM ou 100 mM de NaCl, 200 mM dè NáCl', 4 00' mM de manitol.

‘Teste - - - de . .

tolerância seca/ens aiõ õsmó t fc σ

-Tofe-rância_à_seca é realizada para identificar os genes que conferem melhor sobrevivência das plantas após a privação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico sorbitol produzido pelo não-iônico osmólito no meio pode ser realizado. Controle e plantas transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de ágar-planta durante 4 dias, após o qual são transferidos para placas contendo 500 mM de sorbitol. O tratamento provoca retardo de crescimento, em seguida, tanto o controle e plantas transgênicas são comparadas, por meio da medição do peso da planta (úmida e seca) , rendimento, e por taxas de crescimento medidas como o período de floração.

66/218

Por outro lado, telas de seca do solo baseado são realizadas com plantas que superexpressam a polinucleotídeos detalhados acima. Sementes de plantas controle de Arabidopsis, ou outras plantas transgênicas com superexpressão do polipeptídeo da invenção são germinadas e transferidas para vasos. O estresse hídrico é obtido após a irrigação e é deixado acompanhado por colocar os vasos sobre papel absorvente para aumentar a taxa de secagem do solo. Transgênicas e plantas controle são 10 comparadas umas com as outras quando a maioria das plantas controle desenvolver murcha severa. As plantas são reirrigadas após a obtenção de uma fração significativa das plantas controle exibirem uma murcha severa. Às plantas são classificados em relação aos controles para cada um 15 dos dois critérios: a tolerância _ às .condições de seca e dê recupera-ç-ã-o--(de—sobrevivência) , após regar novamente.

Tolerância de estresse a frio

Para analisar o estresse de frio, maduros (25 dias de idade) as plantas são transferidas para câmaras de 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Posteriormente, as plantas são movidas de volta para estufa. Duas semanas do crescimento os dois controle e do peso da planta (seca e úmida), e comparando as taxas de crescimento medido em tempo para o florescimento, porte da planta, rendimento e assim por diante.

67/218

Tolerância de estresse a calor

- Tolerância de estresse a calor é conseguida por meio da exposição de plantas a temperaturas acima de 34 °C durante um determinado período. Tolerância das plantas ê examinada após a transferência das plantas de volta a 22 °C para a recuperação e avaliação após cinco dias em relação aos controles internos (plantas não-transgênicas) ou plantas não expostas ao estress nem de frio, nem de calor.

Eficiência de utilização da água - pode ser determinada como a biomassa produzida por unidade de transpiração. Para analisar a WUE, o conteúdo relativo de água foliar pode ser medido em plantas controle _.. - e transgênicas-. O peso fresco - (FW) é registrado de—imediato, em seguida, as folhas são embebidas em água por oito horas em água destilada a temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (TW) é registrado.

registrada constante.

acordo com

Fórmula I

Conteúdo relativo a seguinte Fórmula apos a secagem

0	peso seco	total (DW)	é
das	folhas em	60°C até peso
de	água (RWC)	é calculado	de
I :

100

DW)/(TW - DW)] x

RWC = [(FW

		Eficiência de utilização	de
fertilizante -	Para	analisar se as plantas transgênicas	são
mais sensíveis	aos	adubos, as plantas são cultivadas	em
placas de ágar ou	vasos com uma quantidade limitada	de
fertilizantes,	como	descrito, por exemplo, em Yanagisawa	et

al (Proc Natl Acad Sei EUA A. 2004; 101:7833 -8) . As plantas são analisadas em sua dimensão global, tempo para o

68/218 florescimento, produtividade, teor de proteína na parte aérea e/ou grãos. Os parâmetros verificados são o tamanho total da planta madura, o seu peso úmido e seco, o peso das sementes rendido, o tamanho médio das sementes e o número de 5 sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status de nitrogênio na planta e do grau de verdura de folha é altamente correlacionado), aminoácidos e teor de proteína total de sementes ou outras partes das plantas, como folhas 10 ou ramos, teor de óleo, etc. Da mesma forma, em vez de fornecer nitrogênio a quantidades limitadas, fosfato e potássio podem ser adicionados em concentrações crescentes. Novamente, os mesmos parâmetros ~medidos são ’ os mesmos listados acima. Desta forma, a eficiência de utilização de 15 nitrogênio_ (NUE) eficiência de utilização de fosfato (PUE) ______e eficiência de utilização de potássio (KUE) são avaliados, verificando a capacidade das plantas transgênicas a prosperar sob condições de restrição de nutrientes.

Eficiência de utilização de 20 Nitrogênio - Para analisar se as plantas de Arabidopsis transgênicas são mais sensíveis à aplicação de nitrogênio, plantas são cultivadas em 0,75-1,5 mM (condições deficientes de nitrogênio) ou 6-10 mM (concentração ideal de nitrogênio) . As plantas podem crescer por mais 20 dias ou 25 até a produção de sementes. As plantas são então analisadas por sua dimensão global, tempo de produção, floração, teor de proteína do gomo e/ou de grãos/produção de sementes. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho total da planta,

69/218 peso úmido e seco, o peso das sementes rendido, tamanho médio das sementes e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor

	de clorofila das folhas (como	o	status	de nitrogênio	na
5	planta e do grau de verdura	de	folha	que é	altamente
	correlacionado), aminoácidos e	teor de	proteína	total	de

sementes ou outras partes das plantas, como folhas ou brotos e teor de óleo. Plantas transformadas não apresentando importantes efeitos fisiológicos e/ou morfológicas, ou 10 exibindo níveis de parâmetros mais altos medidos em relação às plantas do tipo selsilíqua, são identificados como de uso de nitrogênio plantas eficientes.

Ensaio clè Eficiência~ dé~ utilização de Nitrogênio utilizando plântulas - O ensaio é 15 feito - de acordo com Yanagisawa-S . et al . com pequenas __mo-di.£icações (Metabolic engineering with Dof 1 transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation and growth under low-nitrogen conditions Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101, 7833-7838). Resumidamente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7-10 dias em 0,5 x MS [Murashige Skoog-] complementada com um agente de seleção são transferidos para duas condições limitantes de nitrogênio: meio MS em que a concentração de nitrogênio combinado (NH₄NO₃ e KNO₃) foi de 0,2 mM ou 0,05 mM. As plantas podem crescer por mais 30-40 dias e, em seguida, fotografadas, individualmente removidas da ágar (parte aérea sem as raízes) e imediatamente pesados (peso fresco) para posterior análise estatística. Construções para as quais só estão disponíveis sementes TI

70/218 em meios seletivos e pelo menos 25 plântulas (cada uma representando um evento de transformação independente) são cuidadosamente transferidas para os meios de nitrogênio limitante. Para construções para as quais as sementes T2 estão disponíveis, eventos de transformação diferentes são analisados. Normalmente, 25 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para a mídia de nitrogênio limitante permitido crescer por

3-4 semanas adicionais e pesados individualmente, no final desse período. Plantas transgênicas são comparadas com o controle de plantas cultivadas em paralelo, nas mesmas condições. Plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA . (GÜS) , _ sob o -mesmo promotor são utilizados ^_,= como controle.

Determinação de Nitrogênio O procedimento para a determinação da concentração de N (nitrogênio) na parte estrutural das plantas envolve o método de digestão de persulfato de potássio para converter N orgânico para NO₃ (Purcell and King 1996 Argon. J. 88:111-113, the modified Cd mediated reduction of NO₃‘ to NO₂ (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medida do nitrito pela metodologia de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorvância medidos em 550 nm contra curva padrão de NaNO₂. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.

Testes de Germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes de plantas transgênicas, que poderíam completar o processo de

71/218 controle que são tratados da normais são consideradas, por sob 22 horas de luz e duas entre 4 e 14 de sementes de plantas de horas escuras e vigor das dias após o plantio. O meio em ciclos diários.

mudas é realizada basal é de 50% de meio MS (Murashige e Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473497) .

A germinação é verificada também em condições desfavoráveis como o frio (incubação em temperaturas inferiores a 10°C em vez de 22°C) ou utilizando soluções de inibição de sementes que contêm altas .concentrações- de um osmólito- tais- como o sorbitol ' (nas concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, e até 1000 mM) ou requerer o aumento das concentrações de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM NaCl) .

O efeito do transgene no vigor das plantas, a taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou teor de óleo pode ser determinado utilizando métodos conhecidos.

Vigor da Planta - O vigor das plantas pode ser calculado pelo aumento nos parâmetros de crescimento, tais como área foliar, comprimento das fibras, diâmetro da rosácea, massa de plantas frescas e similares por vez.

Taxa de Crescimento - A taxa de crescimento pode ser medido por meio da análise digital de crescimento das plantas. Por exemplo, imagens de plantas

72/218 que crescem em estufa com base na trama podem ser capturados a cada 3 dias e a área rosácea pode ser calculada por meio da análise digital. A área rosácea de crescimento é calculada utilizando a diferença de área rosácea entre os 5 dias de amostragem divididos pela diferença de dias entre as amostras.

Avaliação da taxa de crescimento pode ser feito por meio de biomassa vegetal produzida medição, área rosácea, o tamanho da folha ou comprimento de raízes por unidade de tempo (pode ser medido em cm² por dia de área foliar).

Taxa da área de crescimento relativo pode ser calculado utilizando a Fórmula’ II.' ~ ~

Fórmula II:

Taxa de crescimento relativo da área = coeficiente de regressão da área ao longo do curso dõ tempcü Assim, a taxa de crescimento relativo da área está em unidades de 1/dia e a taxa de crescimento do comprimento está em unidades de 1/dia.

Produção de sementes

Avaliação do rendimento de sementes por planta pode ser feito por meio da medição da quantidade (peso ou tamanho) ou quantidade (ou seja, número) de sementes secas produzidas e colhidas 8-16 plantas e dividido pelo número de plantas.

Por exemplo, o total de sementes 8-16 plantas podem ser coletados, pesados utilizando, por exemplo, uma balança analítica e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. A produção

73/218 de sementes por área de cultivo pode ser calculada da mesma forma, tendo em conta a área de crescimento dada a uma única planta. O aumento do rendimento de sementes por área de crescimento'podería ser alcançado por aumentar o rendimento 5 de sementes por planta e/ou aumentando o número de plantas capazes de crescer em uma determinada área.

Além disso, a produção de sementes pode ser determinada por meio do peso de 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado como 10 segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto é tirada. Cada amostra é pesada e, em seguida, por meio da análise digital, o número de sementes em cada ; ..amostra.é^calculado-.— ——- —- —- —=

O peso de 1000 sementes pode ser calculado pela Fórmula III:

Fórmula III:

1000 Peso das Sementes número de sementes na amostra o peso da amostra/X 1000 O índice de colheita pode ser calculado pela Fórmula IV:

Fórmula IV:

índice de colheita = rendimento médio em sementes por planta/peso seco

Concentração de proteína no grão - Teor de proteína no grão (g de proteína de grãos m^-2) é estimada como o produto da massa de grãos N (em grão g N rrf²) , multiplicado pela taxa de conversão N/proteína de k5.13 (Mosse 1990, supra). A concentração de proteína no grão é estimada como a razão do teor de proteína no grão por

74/218 unidade de massa do grão (g de proteína de grãos kg'¹ de grãos) .

Comprimento de Fibra comprimento da fibra pode ser medida utilizando fibrógrafo.

0 sistema fibrógrafo foi utilizado para calcular comprimento em termos de metade superior média de comprimento. A metade superior médio (UHM) é a duração média de mais metade da distribuição de fibras. O comprimento fibrógrafo mede em vãos em um ponto percentual (Hypertext Transfer 10 Protocol ://World Wide Web (ponto) cottoninc (ponto) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length.

De acordo com algumas configurações da invenção, o .aumento da produtividade ' dó milho pode ser manifestada como uma ou mais das seguintes 15 características: aumento do número de plantas por área jde cultivo, aumento do número de espigas por planta, aumento no número de fileiras por espGIa, número de grãos por fileira da espiga, peso do grão, peso de mil grãos (1000 de peso) , comprimento da espiga e diâmetro, teor de óleo por aumento 20 do miolo e aumento do conteúdo de amido por miolo.

Como mencionado, o aumento da produtividade das plantas pode ser determinado por vários parâmetros. Por exemplo, o aumento do rendimento de arroz pode ser manifestado por um aumento de uma ou mais das 25 seguintes características: número de plantas por área cultivada, número de panícuias por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento na taxa de enchimento da semente, aumento do peso de

75/218 mil grãos (peso de 1000) aumento do teor de oleo por semente, teor de amido por aumento de sementes, entre outros. Um aumento no rendimento pode também resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

Da mesma forma, o aumento da produção de soja pode ser manifestado por um aumento de uma ou mais das seguintes características: número de plantas por área cultivada, número de vagens por planta, número de sementes por silíqua, aumento da taxa de enchimento de grãos, aumento de mil sementes peso (peso de 1000), redução da quebra da vagem, aumento do teor de óleo por semente, teor..de proteína por- aumento- de sementes, 'entre outros. Um aumento no rendimento pode também resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

Aumento da produtividade de canola pode ser manifestado por um aumento de uma ou mais das seguintes características: número de plantas por área cultivada, número de vagens por planta, número de sementes por silíqua, o aumento da taxa de enchimento de grãos, o aumento do peso de mil sementes (peso de 1000) , redução da quebra da vagem, aumento do teor de óleo por semente, entre outros. Um aumento no rendimento pode também resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

O aumento da produtividade de algodão pode ser manifestado por um aumento de uma ou mais

76/218 das seguintes características: número de plantas por área cultivada, número de capulhos por planta, número de sementes por cápsulas, aumento da taxa de enchimento de grãos, o aumento do peso de mil sementes ( peso de 100 0) aumento do teor de óleo por semente, melhora do comprimento da fibra, resistência da fibra, entre outros. Um aumento no rendimento pode também resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.

Conteúdo oleaginoso - O teor 10 de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou a parte vegetativa da planta. Resumidamente, lipídios (óleo) podem ser removidos da planta _ (por _exemplo, sementes) por- moagem do tecido da' planta]7 na presença de solventes específicos (por exemplo, hexano ou 15 éter de petróleo) e extração de petróleo em um extrator contínuo. A análise indireta de teor de óleo pode ser efetuada por meio de vários métodos conhecidos, tais como espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear [Nuclear Magnetic Resonance] (NMR), que mede a energia de ressonância 20 absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Ver, por exemplo, Conway TF. and Earle FR. , 1963,

Journal of the American Oil Chemists¹ Society; Springer Berlin/Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Print) 1558-9331 (Online) ] ; Espectroscopia do Infravermelho Próximo [Near

25	Infrared]	(NI) , que utiliza	a	absorção	de energia
	infravermelha próxima (1100-2500	nm)	da amostra,	e um método
	descrito	no WO/2001/023884 , que	se	baseia na	extração de

óleo por solvente, evapora o solvente numa corrente de gás

77/218 que forma as partículas de óleo, e direciona uma luz em o fluxo de gás e partículas de óleo que formam uma luz refletida detectável.

Assim, a presente invenção é de alto valor agrícola para promover o rendimento de culturas comercialmente desejadas (por exemplo, a biomassa de órgãos vegetativos, como a madeira de álamo, ou dos órgãos reprodutivos, tais como número de sementes ou de biomassa de sementes).

Qualquer uma das plantas transgênicas descritas acima ou partes do mesmo pode ser processada para produzir um alimento, farinha de proteína, ---- ou preparação de óleo, como para os animais ruminantes.

As plantas transgênicas descritas acima, que apresentam um maior teor de óleo podem ser utilizadas para produzir o óleo vegetal (da extração do óleo da planta).

O óleo vegetal (incluindo o óleo de semente e/ou o óleo da porção vegetativa) produzido de acordo com o método da invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com a utilização pretendida. Exemplar incluir produtos de alimentação animal, matéria-prima para a 25 modificação química, plástico biodegradável, produto de alimento misturado, óleo lubrificantes, biodiesel, comestível, biocombustível, óleo, alimento de petisco, cosméticos e de matéria-prima. Exemplares de

78/218 produtos a serem incorporados ao óleo vegetal incluem a alimentação animal, produtos de alimentação humana, tais como, salgadinhos extrusados, pães, como um agente de ligação de alimentos, alimentos para aquicultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas esportivas, barras nutricionais dos alimentos, suplementos vitamínicos, bebidas dietéticas, alimentos e cereais.

De acordo com algumas configurações da invenção, o óleo compreende um óleo de semente.

De acordo ' com algumas -configurações da invenção, o petróleo compreende uma parte de óleo vegetal. ^_ ~ .....

De acordo com algumas configurações da invenção, a célula vegetal faz parte jde uma -p±antav_______________________________________

Conforme utilizado aqui o termo sobre refere-se a ± 10%.

Os termos compreende, com, inclui, incluindo, ter e seus conjugados significam incluindo, mas não limitado a.

O termo que consiste de meios, inclusive e limitado.

O termo que consiste essencialmente de significa que o método de composição ou estrutura que pode incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou peças, mas apenas se os ingredientes adicionais, etapas e/ou peças que não alterem materialmente as características

79/218 básicas e novas do

OU estrutura.

Conforme utilizado aqui, forma singular um, uma e o -- inclui ref-erências no plural a menos que o contexto claramente indique contrário.

Por exemplo, o termo um composto ou pelo menos um composto poderá incluir uma pluralidade de compostos, incluindo as respectivas misturas.

Ao longo deste pedido, várias apresentadas em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição no formato faixa é simplesmente por conveniência e concisão . e não deve - ser interpretado -como uma limitação inflexível sobre o alcance da invenção. Assim, a descrição de um 15 intervalo deve ser considerado, especificamente, divulgadas 'todas” as possíveis sub-escalas, bem como os valores numéricos individuais dentro desse intervalo! Por exemplo, ã descrição de um intervalo como 1-6 devem ser considerados, especificamente divulgadas sub-intervalos, tais como 1-3, 120 4, 1-5, 2-4, 2-6, 3-6, etc, bem como números individuais dentro desse intervalo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5e6. Isto aplica-se independentemente da largura do intervalo.

Sempre que um intervalo numérico é indicado aqui, que se destina a incluir qualquer numeral citado (fracionado ou integral) dentro do intervalo indicado. As frases variando/varia entre um primeiro indica o número e um segundo, indica o número e que vão de séries de um primeiro indicar o número a um segundo

80/218 número indicam são aqui destinam-se a incluir os utilizados indistintamente e números de primeiro e segundo método refere-se aos e integral

- Conforme costumes, entre numerais.

ut i1izado aqui meios, técnicas procedimentos para realizar uma determinada tarefa, incluindo mas não limitado a, as boas maneiras, métodos, técnicas e procedimentos, quer conhecidas, ou facilmente desenvolvidas a partir de formas conhecidas, quer dizer, técnicas e procedimentos por profissionais das indústrias químicas, farmacológicas, bioquímicas, biológicas e artes médicas.

Reconhece-se que_ certas clareza, descritas no contexto das configurações separadas, também podem sér fornecidas em combinação em uma única encarnação

Por ctrt t o 1 ã/dcT, várias brevidade, descrito no contexto de uma i ndivi dua1, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou como adequado em descrita da

Certos recursos descritos no contexto de vári as consideradas características essenciais dessas configurações a menos que inoperante, sem esses elementos.

Várias aspectos da presente invenção como acima delineadas e, tal

81/218 como alegadas na seção de créditos inferiores a encontrar o suporte experimental nos exemplos a seguir.

Salvo indicação em contrário, todas as técnicas e/ou termos científicos utilizados- aqui têm o mesmo significado como geralmente compreendido por um especialista na arte de que a invenção pertence. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento podem ser utilizados na prática ou ensaio de configurações da invenção, métodos de exemplares e/ou materiais estão descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são meramente _____ ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitados.

EXEMPLOS

Passa a referir os exemplos a seguir, que, juntamente com as descrições acima ilustram ------algumas cen^figurações dã invenção de uma forma não limitante.

Geralmente, a nomenclatura utilizada aqui e os procedimentos laboratoriais utilizados no presente invenção incluem moleculares, bioquímicos, microbiológicos e de técnicas de DNA recombinante. Tais técnicas são minuciosamente explicados na literatura. Veja, por exemplo, Molecular Cloning: A laboratory Manual

Sambrook et al., (1989); Current Protocols in Molecular

Biology Volumes I-III Ausubel, R. M. , ed. (1994); Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical

82/218

Guide to	Molecular Cloning	, John Wiley &	Sons,	New York
(1988) ;	Watson	et al. ,	Recombinant DNA, Scientific
American	Books,	New York;	Birren et al.	(eds)	Genome
Analysis:	A Laboratory Manual Series, Vols. 1	-4, Cold
Spring	Harbor	Laboratory	Press, New	York	(1998);
methodologies as	set forth	in Patente EUA.	Nos. 4	,666,828;
4,683,202	; 4,801,	531; 5,192,	659 e 5,272,057;	Cell	Biology:
A Laboratory Handbook, Volumes I-III Cell	is, J.	E . , ed.
(1994) ;	Current	Protocols	in Immunology	Volumes I-III
Coligan J. E., ed. (1994);	Stites et al .	(eds),	Basic e
Clinicai	Immunology (8th	Edition), Appleton í	i Lange,

Selected

Norwalk,

CT (1994); Mishell e Shiigi (eds),

Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman

Co. , New amplamente descritos na literatura científica e patentes, ver, por exemplo, Patente EUA. Nos. 3,791,932; 3,839,153;

3,850,752;

3,879,262; 3,901,654;

3,935,074 ;

3,984,533 ;

3,996,345;

4,034,074; 4,098,876;

4,879,219;

5,011,771

5,281

521;

OIigonucleotide

Synthesis

Gait, M.

J. , (1984) ;

Nucleic Acid

Hybridization

Hames, B.

D.

e Higgins S.

J. , eds. (1985);

Transcription e Translation e Higgins S.

Eds. (1984);

Animal Cell Culture

Freshney, R. I . , (1986); Immobilized Cells e Enzymes

IRL Press, (1986)

A

Practical Guide to Molecular Cloning

Methods in Enzymology Vol . 1-317,

Perbal, B., (1984) e

Academic Press; PCR

Protocols: A Guide To Methods e Applications, Academic

Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al . , Strategies for

83/218

Protein Purification e Characterization - A Laboratory Course Manual CSHL Press (1996) ; que são incorporados por referência, como se fossem totalmente nele previstos. Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. Os procedimentos nele se acreditam ser conhecidos na arte e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações nele contidas aqui incorporados por referência. EXEMPLO 1

IDENTIFICAÇÃO DE GENE E PREDIÇÃO DE PAPEL GENÉTICO UTILIZANDO FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA

Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos que podem aumentar a produtividade das plantas, produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo, biomassa, taxa de crescimento, tolerância ao estresse abiótico, eficiência de utilização de Nitrogênio e/ou o vigor de uma planta, como se segue.

Os conjuntos de dados de sequência de nucleotídeos utilizados foram a partir de bases de dados publicamente disponíveis ou de sequências obtidas utilizando a tecnologia Solexa (por exemplo, cevada e sorgo). Os dados da sequência de 100 espécies diferentes de plantas foram introduzidas em um única base de dados abrangente. Outras informações sobre a expressão gênica, a anotação de proteínas, enzimas e vias também foram incorporados. Grandes bancos de dados utilizados incluem: Genomas

Genoma da Arabidopsis [TAIR versão de genoma 6 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide

84/218

Web (ponto) arabidopsis (ponto) org/)];

Genoma do Arroz [IRGSP estrutura 4.0 (Hypertext Transfer Protocol://rgp (ponto) dna (ponto) affrc (ponto) go (ponto) jp/IRGSP/)];

Álamo [Populus trichocarpa divulgação 1.1 da JGI (assembly release vl.O) (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) genome (ponto) jgi-psf (ponto) org/)];

Brachypodium [JGI disposição

4x, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) brachpodium (ponto) org)];

Soja [DOE-JGI SCP, versão GlymaO (Hypertext Transfer Protocol://World Wide_Web_ (ponto) phytozome (ponto) net/)];

Uva [genoma da videira do “Consórcio Publico Franco-ítaliano para Caracterização do ------&enairra da Videira (Hypertext T r a n s f e r Protocol:// World Wide Web (ponto) genoscope (ponto) cns (ponto) fr/)];

¹ Mamona [TIGR/J Craig Venter

Institute disposição 4x [(Hypertext Transfer Protocol://msc (ponto) jcvi (ponto) org/r communis];

Sorgo [DOE-JGI SCP, versão Sbil [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) 25 phytozome (ponto) net/)];

Genoma do milho parcialmente disposto [Hypertext Transfer Protocol://maizesequence (ponto) org/];

85/218

As sequências expressas EST e mRNA foram extraídas das seguintes bases de dados:

GenBank versões 154, 157, 160,

161, 164, 165, 166

Protocol://World Wide Web nih (ponto) gov/dbEST/);

Protocol://World Wide Web nih (ponto) gov/RefSeq/);

e 168 (Hypertext Transfer (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto)

RefSeq (Hypertext Transfer (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto)

TAIR (Hypertext Transfer

Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (ponto) org/);

Bases de dados sobre proteínas e caminhos _ ___ Uniprot ___[Hypertext Transfer

Protocol://World Wide Web (ponto) uniprot (ponto) org/].

AraCyc [Hypertext Transfer

Protocol://World Wide Web (ponto) arabidopsis (ponto) õrg/biocyc/1 ndex ~(pontoT jj sp] 1

ΕΝΖΥΜΕ [Hypertext Transfer

Protocol://expasy (ponto) org/enzyme/].

Conjunto de dados Microarranjo foram baixados de:

GEO (Hypertext Transfer

Protocol://World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)

TAIR (Hypertext Transfer

Protocol://World Wide Web.arabidopsis.org/).

Dado do proprietário de microarranjo (See W02008/122980 e Exemple 3 abaixo).

Informações QTL e SNPs

86/218

Gramene [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) gramene (ponto) org/qtl/J .

Panzea [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) panzea (ponto) org/index (ponto) html].

Montagem da Base de Dados foi realizada para construir um banco de dados amplo, rico, de confiança anotada e fácil de analisar composto de mRNA genômico publicamente disponível, sequências de ESTs DNA, dados com as diferentes culturas, bem como a expressão do gene, a anotação de proteínas e via dados QTLs e outras informações relevantes.

Montagem de banco de dadosé composta de uma caixa de ferramentas de refino de gene, a estruturação de anotação e ferramentas de análise que permitam construir uma base de dados personalizados para ca/da projeto dê descoberta do gene. Refinação de gene e ferramentas de estruturação permitem detectar de forma viável as variantes da tala e transcritos antisenso, gerando o entendimento de vários potenciais resultados fenotípicos de um único gene. Os recursos do LEADS plataforma da

Compugen LTD para a análise do genoma humano foi confirmada e aceita pela comunidade científica [ver, por exemplo,

Widespread Antisense

Transcríption,

Yelin, et al. (2003)

Nature Biotechnology

21, 379-85;

Splicing of Alu

Sequences, Lev-Maor, et al. (2003)

Science 300 (5623) ,

1288-91; Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information, Xie H et al. Genomics 2002],

87/218 e as plantas genômicas foram provadas maior eficiência também.

Agrupamento de EST e montagem de genes - Para o agrupamento de genes e montagem de organismos com os dados disponíveis da sequência do genoma (Arabidopsis, arroz, mamona, uva, Brachypodium, choupo, sorgo, soja), a versão genômica LEADS (GANG) foi empregada. Esta ferramenta permite agrupamento mais preciso de ESTs e sequências de mRNA no genoma, e prevê estrutura do gene, assim como eventos de união alternativa e transcrição antisenso.

Para os organismos sem dados completos sequência do genoma disponíveis LEADS expressos o software de aglomeração foi aplicado.

Anotação de Gene- Genes previstos e proteínas foran anotadas .como se segue: Pesquisa de expTosao ['Hypertext Transfêr Protocol: / /b 1 ast (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] against all plant UniProt [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) uniprot (ponto) org/J sequências foram realizadas. Quadros de leitura abertos de cada transcrição putativa foram analisados e maior ORF com maior número de homólogos foi selecionado como proteína prevista da transcrição. As proteínas previstas foram analisadas por InterPro [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/interpro/] .

Explosão contra proteínas de AraCyc e bancos de dados da ΕΝΖΥΜΕ foram utilizados para

88/218 mapear os caminhos previstos para transcrições AraCyc.

Previsão de proteínas de diferentes espécies foram comparadas utilizando o algoritmo de explosão [Hypertext Transfer Protocol ://World- Wide Web 5 (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] para validar a precisão da sequência de proteína prevista, e para a detecção eficaz de ortólogos.

Perfil de Expressão Gênica

Diversas fontes de dados foram exploradas para criação de 10 perfis de expressão gêniça que combinou dados de microarranjos e perfil de expressão digital (veja abaixo). De acordo com o perfil de expressão gênica, uma análise de . correlação foi realizada para identificar genes___que são coregulados por diferentes estágios de desenvolvimento e 15 condições ambientais e que estão associadas com fenótipos diferentes.

Conjuntos de dados de microarranjos publicamente disponíveis foram baixados de sites TAIR e NCBI GEO, renormalizedos, e integrados na base 20 de dados. Perfil de expressão é um dos dados dos recursos mais importantes para identificar genes importantes para a produção de biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência de utilização de nitrogênio.

			Um	resumo do perfil	de
expressão	digital	foi	compilada	para cada	agrupamento	de
acordo com	todas as	pal	avras-chave	incluídas	na sequência	de
registros	que compõem	o grupo.	Expressão	digital, também

89/218 conhecida como eletrônica do Northern-Blot, é uma ferramenta que exibe o perfil de expressão virtual baseado nas sequências EST formadoras dos genes. A ferramenta fornece o -------------------p_erf i 1—de—expressão de um grupo em termos—de anatomia-----------5 vegetal (por exemplo, o tecido/órgão em que o gene é expresso) , estágio de desenvolvimento (os estágios de desenvolvimento em que um gene pode ser encontrado) e perfil de tratamento (fornece as condições fisiológicas em que um gene é expresso como seca, frio, infecção patógena etc.)

Dada uma distribuição aleatória de ESTs em diferentes agrupamentos, a expressão digital fornece um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um grupo com ____um total de _ N ESTs para conter X ESTs__a partir de um determinado conjunto de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, o seguinte ê levado em consideração: a) o número de ESTs do grupo, b) o número de ESTs das bibliotecas envolvidas e afins, c) número total de ESTs cTi sponí ve ís representando a espécie. grupos, assim, com valores de probabilidade baixa são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse, indicando uma expressão especializada.

Recentemente, a precisão deste sistema foi demonstrada por Portnoy et al. , 2009 (Analysis

Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454

Pyrosequencing) em: Plant & Animal Genomes XVII Conference,

San Diego, CA. Análise transcriptômica, com base na abundância relativa de EST em dados foi realizada por 454 sequenciamento pyro de cDNA representando mRNA do fruto.

90/218

Quatorze amostras de cordão duplo cDNA obtidas a partir de dois genótipos, dois tecidos de frutos (polpa e casca) e quatro fases de desenvolvimento foram sequenciadas. Sequenciamento pyro GS FLX (Roche/454 Ciências Biológicas) das amostras de cDNA não-normalizada e purificadas geraram 1.150.657 sequências de etiquetas expressas, que reuniu em unigenes 67.477 (32.357 singletons e 35.120 contigs). A análise dos dados obtidos contra ao Base de Dados Genômicos Cucurbit [Cucurbit Genomics Database] [Hypertext Transfer

Protocol:// World Wide Web (ponto) icugi org (ponto) /] confirmou a exatidão do seqeenciamento e montagem. Padrões de expressão de genes selecionados ajustou-se bem os seus

.. dados qRT-PCR. ~ ____________&_______ _______ _ _\ ___

EXEMPLO 2

PRODUÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSCRIPTOM E ANALISE DE CORRELAÇÃO

DA ALTA DE TRANSFERÊNCIA DE YIRLD, COM PARÂMETROS RELACIONADOS ÃT BIOMASSA Ê/OU VIGOR UTILIZANDO 44K DE” ARABIDOPSIS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE GENOMA DE MICROARRANJO COMPLETO

Para produzir uma análise de correlação alta taxa de transferência, os presentes inventores trabalho utilizaram uma Arabidopsis thaliana de microarranjo de oligonucleotideo, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web chem (ponto) . (ponto) com (ponto) Agilent/Scripts/ASP PDS (ponto)? lPage = 50879]. O arranjo de oligonucleotídeo representa cerca de 40.000 genes de A. thaliana e transcrições concebidas com base em dados do banco de dados

91/218

TIGR ATH1 v.5 e banco de dados de Arabidopsis MPSS (Universidade de Delaware). Para definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA e rendimento, componentes da -biomassa ou parâmetros relacionados com vigor, diversas características da planta de 15 diferentes ecótipos de Arabidopsis foram analisados. Entre eles, nove ecótipos englobando a variação observada foi selecionada para a análise da expressão do RNA.

níveis do RNA e os parâmetros caracterizados foram analisados utilizando o teste de

Transfer Protocol://World

Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

Extração de RNA

Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento incluindo a raiz, folha, flor em antese, as sementes de 5 dias após o ^florescimento [days after flowering] (DAF) e das sementes aos 12

DAF, representando características diferentes da planta, foram amostrados e RNA foi extraído utilizando reagente

Trizol da Invitrogen [Hypertext

Transfer

Protocol:// World Wide Web (ponto) invitrogen com (ponto) conteúdo/cfm (ponto) pageid =] 469.

Para maior comodidade, informação de tipo de tecido recebeu um ID do Conjunto como resumido na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Tecidos utilizados para os conjuntos de expressão de

Arabidopsis transcriptom

92/218

Conjuntos de Expressão	ID do conjunto
Raiz	A
Folha	B
Flor	C
Semente 5 DAF	D
Semente 12 DAF	E

Tabela 1: São fornecidas as letras de identificações (ID) de cada conjunto de expressão da Arabidopsis (A-E) . DAF = dias após a floração.

Cerca de 30-50 mg de tecido foram tomados a partir de amostras. Os tecidos pesados foram moídos utilizando almofariz e pilão em nitrogênio líquido e ressuspenso em 500 μΐ de reagente TRIzol Reagent. Para homogeneizar o lisado, 100 μΐ de clorofórmio foi adicionado seguido de precipitação com isopropanol e duas lavagens com ______10. etanol 75% . __.O___RNA foi eluído em 30 μΐ de água livre.de

RNase. Amostras de RNA foram limpos usando minikit da Qiagen RNeasy protocolo de limpeza, conforme o protocolo do fabricante. - —. .._

-------------------------------------------Componentes—de—produt-i-v-idade—e vigor relacionados com parâmetros de avaliação - oito dos nove ecótipos de Arabidopsis foram utilizados em cada um dos cinco blocos repetitivos (denominados A, B, C, D e E) , cada uma contendo 20 plantas por parcela. As plantas foram cultivadas em estufa em condições controladas de 22°C, e o

N: P: K fertilizante (20:20:20; relações de peso) [nitrogênio (N) , fósforo (P) e potássio (K) ] foram acrescentados. Durante este tempo, foram coletados dados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados por meio de mudas de plantas cultivadas em cultura de tecidos cultivados em placas de ágar vertical transparente.

93/218

A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada por imagens digitais.

Imagem digital da cultura de Tecido - Um laboratório de sistema de aquisição de imagens foi utilizado para capturar imagens de plântulas serradas em placas de ágar quadrados. O sistema de aquisição de imagem consiste de uma câmera digital reflex (Canon EOS 300D) ligado a uma lente de 55 milímetros de comprimento focal (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução 10 (Kaiser RS) , que incluiu quatro unidades de luz (lâmpada de

4x150 Watts) e localizado em uma câmara escura.

Imagem digital em Estufa - O ----processo de captação de imagem foi repetida a cada 3-4 dias, com início no dia 7 até dia 30. A mesma câmera conectada a 15 uma lente de 24 milímetros de comprimento focal (Canon série EF)fcolocada em um suporte· de ferro montado, foi utilizada --para capturar imagens dê mãíõr serrada dê plantas em vasos brancos em uma estufa com ambiente controlado. As banheiras eram brancas de forma quadrada com medidas de 3 6 x 2 6,2 cm e 20 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, as banheiras foram colocados sob o suporte de ferro, evitando a luz direta do sol e fundição de sombras. Este processo foi repetido a cada 3-4 dias até 30 dias.

Um sistema de análise de imagem foi utilizado, que consiste de um computador pessoal (Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, Java programa de processamento de imagem com base, que foi desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e

94/218 está disponível gratuitamente na Internet, no protocolo HTTP:// rsbweb (ponto) nih gov (ponto)/. As imagens foram capturadas na resolução de 6 megapixels (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em uma baixa compressão de formato JPEG (Joint

Photographic Experts Group padrão). Em seguida, analisou os dados que foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (SAS Institute).

Análise da Folha - Através da análise digital de folhas de dados foi calculado, incluindo o número de folhas, área, perímetro, comprimento e largura.

No dia 30, 3-4 plantas representativas foram escolhidas de —cada -parcela-dos blocos A, B_e C. As plantas foram dissecadas, cada folha era separada e foram introduzidas 15 entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi retirada e os vários parâmetros (tais como a área foliar total, comprimento laminar, etc) foram calculados a partir das imagens. A circularidade da lâmina foi calculada como a largura laminar dividido pelo comprimento de lâmina.

Análise da Raiz - Durante 17 dias, os diferentes ecótipos foram cultivados em placas de ágar transparente. As placas foram fotografadas a cada 3

	dias, com início	no dia 7	na sala de	fotografia e	do
	desenvolvimento das	raízes foi	document ada	(ver	exemplos	nas
25	figuras F-3A). A	taxa de	crescimento	das	raízes	foi
	calculada de acordo	com a Fórmula V.

Fórmula V:

Taxa de crescimento relativo da cobertura da raiz de regressão:

95/218 coeficiente de cobertura da raiz ao longo do curso do tempo.

Análise da taxa de crescimento vegetativo - foi calculada segundo a fórmula VI . A análise foi encerrado com a aparência de sobreposição de plantas.

Fórmula VI

Taxa da área relativa de crescimento vegetativo coeficiente de regressão da curso do tempo.

ecótipos a taxa calculada estágio de desenvolvimento área de vegetação ao longo do

Para a comparação entre foi normalizada utilizando o da planta, representado pelo número de folhas verdadeiras. Nos casos em que as plantas com 8 - folhas- foram amosLraàas duas . vezes -(por. -exemplo, no dia 10 e dia 13) , apenas uma amostra maior foi escolhida e adicionada a comparação Anova.

•Análise de sementes em silíquas - No dia 70, 15-17 silíquas foram coletadas de cada parcela, em blocos D e E. As silíquas escolhidas foram a de cor marrom claro, mas ainda intacta. As silíquas foram 20 abertas na sala de fotografia e as sementes foram dispersas em uma bandeja de vidro, uma alta resolução de imagem digital foi feita para cada parcela. Utilizando as imagens do número de sementes por síliqua foi determinada.

Peso médio das sementes - Ao 25 final do experimento, todos os lotes de sementes dos blocos

A-C foram	recolhidos.	Um peso médio	de	0,02 gramas	3 foi
medido a	partir de	cada amostra,	as	sementes	foram

espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada.

96/218

Através da análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculada.

Porcentagem de óleo nas sementes - Ao final do experimento, todos os lotes de sementes de AC blocos foram recolhidos. Sementes de Columbia a partir de 3 parcelas foram misturados à terra e, em seguida, montado na câmara de extração. 210 ml de n-hexano (Cat n°080951 Biolab Ltd.) foi utilizado como solvente. A extração foi realizada por 30 horas em fogo médio 50 °C. Após a extração encerrou a n-hexano foi evaporado utilizando o evaporador, a 35 °C e condições de vácuo. O processo foi — repetido .duas vezes. As informações obtidas por meio do extrator de Soxhlet (Soxhlet, F.Die gewichtsanalytische

Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's)

1879,” ‘232, 461) -foi- -utilizado, para criar uma curva de cafibração - par-a--a_ _baixa ressonância RMN. O teor de óleo das sementes de todas as amostras foi determinada por meio do Baixo Ressonância NMR (Maran Ultra-Instrumento de Oxford) e sua embalagem sowftware MultiQuant.

Análise de comprimento da

Silíqua - No dia 50 de semeadura, 3 0 silíquas de diferentes plantas em cada parcela foram amostradas no bloco A. As silíquas escolhidas foram o verde-amarelo e foram coletados a partir das partes inferiores do tronco de uma planta cultivada. A fotografia digital foi levada para determinar o comprimento de silíqua.

Peso seco e produção de semente

No dia 80 de semeadura, as plantas dos blocos A-C

97/218 foram colhidas e deixadas para secar a 3 0°C em uma câmara de secagem. A biomassa e peso de sementes de cada parcela foi separada, medida e dividida pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (raízes 5 exclusive) , após secagem a 30°C em uma câmara de secagem, rendimento de grãos por planta = peso total de sementes por planta (gr).

Produção de Óleo - O rendimento do óleo foi calculado pela Fórmula VII.

Fórmula VII:

Produção de Óleo da Semente = Produção de sementes por planta (gr) * % de Óleo na semente _ — índice de Colheita - O índice de colheita foi calculado pela Fórmula IV, conforme descrito acima [índice de colheita de sementes de rendimento = média por unidade/peso seco médio].

Resultados Experimentais

Nove diferentes ecótipos de

Arabidopsis foram cultivados e caracterizados para 18 20 parâmetros (chamados de vetores). Parâmetros dados estão resumidos na Tabela 2, abaixo.

Tabela 2

Parâmetros correlatos de Arabidopsis (vetores)

Parâmetro correlacionado com	ID de Correlação
Comprimento da raiz no dia 13 (cm)	1
Comprimento da raiz no dia 7 (cm)	2
Crescimento relative da raiz (cm /dia) dia 13	3
Peso fresco por planta (gr) em estágio de cavilha	4
Matéria seca por planta (gr)	5
Taxa de crescimento vegetativo (cm2/day) até 8 folhas verdadeiras	6
Circularidade da Lâmina	7
Largura da lâmina(cm)	8

98/218

Continuação da Tabela 2
Comprimento da lâmina (cm)	9
Área total da lamina por folha (cm)	10
Peso de 1000 sementes (gr)	11
% de oleo por semente	12
Sementes por silíqua	13
Comprimento da silíqua (cm)	14
Produção de sementes por planta (gr)	15
Produção de oleo por planta (mg)	16
índice de Colheita	17
Largura/Comprimento da folha	18

Tabela 2. São fornecidos os parâmetros correlatos da Arabidopsis (Números das IDs de correlação 1-18). Abreviações: Cm = centímetro(s); gr = grama(s); mg = miligrama(s).

Os valores caracterizados são resumidos nas Tabelas 3 e 4 abaixo.

Tabela 3

Parâmetros medidos nos ecótipos da Arabidopsis

Ecotipo	Produção de sementes por planta (gr)	Produção de Óleo por planta (mg)	% de oleo por semente	Peso de 1ÕÕ0 semente s (gr)	Matéria seca por planta (gr)	índice de Colheita	Área de folha total por planta (cm)	Sementes por silíqua	Comprimento de silíqua (cm)
An-1	0,34	118,63	34,42	0,0203	0,64	0,53	46,86	45,44	1,06
Col-0	0,44	138,73	31,19	0,0230	1,27	0,35	109,89	53,47	1,26
Ct-1	0,59	224,06	38,05	0,0252	1,05	0,56	58,36	58,47	1,31
Cvi N8580)	0,42	116,26	27,76	0,0344	1,28	0,33	56,80	35,27	1,47
Gr-6	0,61	218,27	35,49	0,0202	1,69	0,37	114,66	48,56	1,24
Kondara	0,43	142,11	32,91	0,0263	1,34	0,32	110,82	37,00	1,09
Ler-1	0,36	114,15	31,56	0,0205	0,81	0,45	88,49	39,38	1,18
Mt-0	0,62	190,06	30,79	0,0226	1,21	0,51	121,79	40,53	1,18
Shakdara	0,55	187,62	34,02	0,0235	1,35	0,41	93,04	25,53	1,00

Tabela 3.

São fornecidos os valores para cada um dos parâmetros medidos nos ecótipos da

Arabidopsis

Produção de semente por planta (gram); produção

de óleo por planta (mg);	% de	óleo	por semente;	Peso de 1000
sementes (gr) ; matéria	seca	por	planta (gr)	; índice de
colheita; área total de	flha	por	planta (cm);	sementes por

silíqua; comprimento da silíqua (cm).

Tabela 4

99/218

Parâmetros adicionais medidos nos ecótipos da Arabidopsis

Ecótipo	Cresc. Veg.	Cresc. veg. relat.	Comprim. da Raiz dia 7	Comprim. da Raiz dia 13	Peso fresco por planta	Lam. Comp.	Lam. Larg.	Larg. da folha/comp	Circularidade da Lâmina
An-1	0,313	0,631	0,937	4,419	1,510	2,767	1,385	0,353	0,509
Col-0	0,378	0,664	1,759	8,530	3,607	3,544	1,697	0,288	0,481
Ct-1	0,484-	1,176	0,701	5,621	1,935	3,274	1,460	0,316	0,450
Cvi (N8580)	0,474	1,089	0,728	4,834	2,082	3,785	1,374	0,258	0,370
Gr-6	0,425	0,907	0,991	5,957	3,556	3,690	1,828	0,356	0,501
Kondara	0,645	0,774	1,163	6,372	4,338	4,597	1,650	0,273	0,376
Ler-1	0,430	0,606	1,284	5,649	3,467	3,877	1,510	0,305	0,394
Mt-0	0,384	0,701	1,414	7,060	3,479	3,717	1,817	0,335	0,491
Shakdara	0,471	0,782	1,251	7,041	3,710	4,149	1,668	0,307	0,409

Tabela 4. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em Ecótipos da Arabdopsis: Cresc. Veg. = taxa de crescimento vegetativo (cm²/dia) até 8 folhas verdadeiras; Cresc. veg. relat. = crescimento relativo da raiz (cm/dia) ; Comprim. da Raiz ------ dia 7 - (cm) ;Comprim. da Raiz - dia 13 _(cm) ; Peso fresco por planta (gr) no estágio de cavilha; Lam. Comp. comprimento da Lâmina (cm) ; Lam. Larg. = Largura da lâmina (cm); Lãrg/Cõmp da Folha; Circularidade da Lâmina.

Tabelas 5-7, abaixo, fornecem os genes selecionados, os parâmetros caracterizados (que são tecidos transcriptom correlacionados com o valor de correlação (R,

Quando o expressão de um gene em um determinado tecido fenotípica por meio Ecótipos

0,5-1), há uma e uma desempenho é elevado em valor absoluto entre gene (especificamente o nível de deste gene) caráter fenotípico. Uma correlação positiva indica que expressão do gene em um determinado tecido ou estágio de

100/218 desenvolvimento e o vetor de correlação (desempenho fenótipo) estão positivamente associados (ambos, expressão fenotípica e aumento do desempenho ou diminuição ao mesmo tempo), enquanto que uma correlação negativa indica uma 5 associação negativa (enquanto um está aumentando o outro está diminuindo e vice-versa).

Tabela 5

Correlação entre o nível expresso dos genes selecionados nos tecidos específicos e os estágios de desenvolvimento e desempenho fenotípico nos Ecôtipos de Arabidopsis___________

Nome do Gene	Vetor Correi.	Conj. Exp.	R	Vetor Correi.	Conj. Exp.	R	Vetor Correi.	Conj. Exp.	R
BDL117	1	C	-0,907	1	A	-0,809	13	D	0,961
BDL118	13	A	0,817	6	A	0,805	5	D	-0,821
BDL118	17 -	D—	0,958	17 -	D _	.0,834	8	-D.	-0,833
BDL118	8	D	-0,845	10	D	-0,912	10	D	-0,975
BDL118	4	D	-0,904
BDL126	5	B	0,942
BOL138	16	-C-	0,841	15	C---	.0,813 =	16.	B	.0,878
BDL138	15	B	0,896	13	A	0,94
BDET40	14	C	0,841	3	c	0/821	11	C	0;855----
BDL140	14	B	0,836	11	B	0,855	7	E	-0,812
BDL140	6	E	0,889	13	D	0,826	14	D	0,862
BDL147	16	B	0,948	15	B	0,898
BDL149	14	B	0,83	3	B	0,891	14	A	0,951
BDL152	16	D	0,969	3	D	0,855	15	D	0,987
BDL153	14	C	0,836	11	C	0,823	14	A	-0,862
BDL153	11	A	0,88	8	D	-0,81
BDL154	11	C	0,874
BDL155	16	B	0,829	16	A	0,86
BDL156	3	C	0,923	14	B	0,901
BDL157	3	B	0,854	2	B	-0,825	5	D	-0,803
BDL157	17	D	0,923	9	D	-0,809	8	D	-0,834
BDL157	10	D	-0,915	4	D	-0,89
BDL158	8	B	0,953	10	B	0,945	4	B	0,899
BDL158	11	A	-0,833
BDL160	7	C	0,82	18	C	0,972	8	A	0,918
BDL160	8	A	0,839	8	A	0,834	10	A	0,93
BDL160	10	A	0,93	4	A	0,862	1	E	0,864
BDL160	1	E	0,841	2	E	0,861	2	E	0,839

101/218

Continuação da Tabela 5
BDL160	8	D	0,867	8	D	0,811	10	D	0,824.
BDL162	5	B	0,89
BDL163	16	B	0,925	15	B	0,884	18	E	0,828
BDL165	8	B	0,952	10	B	0,902	4	B	0,821
BDL165	8	E	0,807	15	E	0,816	11	D	0,846
BDL167	16	B	0,899	15	B	0,946	17	D	0,859
BDL167	2	D	-0,806
BDL168	16	C	0,97	15	C	0,929	8	B	0,931
BDL168	10	B	0,88	13	A	-0,835	5	D	-0,911
BDL168	8	D	-0,946	10	D	-0,849
BDL169	14	B	-0,82	11	B	-0,848	12	A	0,901
BDL171	14	C	-0,842	2	B	-0,844	5	A	0,803
BDL171	1	A	-0,851	2	A	-0,821	5	D	-0,827
BDL171	17	D	0,958	17	D	0,853	17	D	0,825
BDL171	9	D	-0,82	8	D	-0,87	16	D	0,857
BDL171	10	D	-0,901	10	D	-0,948	4	D	-0,808
BDL171	4	D	-0,932	15	D	0,838
BDL173	7	B	0,892	9	B	-0,874	18	B	0,816
BDL173	17	D	0,948	8	D	-0,888	10	D	-0,974
BDL173	4“ .	D	.-0,871		· -	- - - - --=		..	... . -
BDL174	17	C	0,901	5	D	-0,917	8	D	-0,879
BDL174	10	D	-0,85
BDL176	5	D	-0,907	8	D	-0,913	13	D	0,93
J3DL177	17 .	C	0,919	. 17 -	B—	0,91 -	-17 -	D—	0,82
BDL181	16	c	0,893	15	C	0,838	8	B	0,816
BDL181	-1-2--------	-A-------	0;931-----	16--------	A	0,823	1'8	E	0,819
BDL181	16	D	0,865	15	D	0,856
BDL182	12	A	0,913	12	D	0,825
BDL183	16	B	0,915	15	B	0,898
BDL186	12	B	0,944	11	B	0,833	8	D	-0,807
BDL187	16	B	0,908	15	B	0,835	5	D	-0,803
BDL187	8	D	-0,892
BDL188	14	B	0,904	12	D	0,964	3	D	0,857
BDL188	2	D	-0,886
BDL189	16	B	0,951	15	B	0,907	6	E	-0,854
BDL189	8	D	-0,821	1	D	-0,938
BDL190	16	B	0,857	15	B	0,91	7	E	-0,865
BDL192	7	B	0,907	9	B	-0,806	17	D	0,91
BDL192	10	D	-0,907	4	D	-0,94	2	D	-0,82
BDL193	8	C	0,846	12	B	0,904	11	B	0,876
BDL193	11	A	0,885	11	E	0,923	5	D	-0,801
BDL193	8	D	-0,802	8	D	-0,844	10	D	-0,806
BDL194	12	B	0,933	18	D	0,877
BDL196	16	D	0,917	15	D	0,937
BDL197	13	A	0,91	8	D	0,837

102/218

Continuação da Tabela 5
BDL200	2	C	0,818	16	B ‘	0,864	15	B	0,832
BDL200	14	A	0,917	1	E	0,815	3	D	0,851
BDL201	9	C	0,846	5	D	0,916	17	D	-0,906
BDL201	8	D	0,954	10	D	0,947	4	D	0,865
BDL203	10	B	0,926	4	B	0,893	14	A	-0,828
BDL219	1	A	0,879	2	A	0,821	9	E	-0,801
BDL220	8	B	0,822	10	B	0,844	4	B	0,839
BDL221	12	C	0,897	16	C	0,917	15	C	0,814
BDL221	3	B	0,936	9	D	-0,936	6	D	-0,897
BDL221	4	D	-0,808
BDL222	1	B	0,829	2	B	0,887	1	A	0,875
BDL222	2	A	0,849	2	D	0,925
BDL223	14	C	0,93	14	B	0,835	3	B	0,851
BDL223	14	A	0,831
BDL224	5	E	-0,826	9	E	-0,872
BDL225	7	C	0,833	15	B	-0,806	13	A	-0,836
BDL227	2	A	-0,931
BDL229	-10—-	B	0,858	2	D	0,832
BDL231	16	B	0,911	15	B	0,869	11	D	0,88
BDL233	14	C	-0,885
BDL235	11	E	0,808	12	D	0,818	2	D	-0,887
BDL240	1	D	-0,808
BDL241	13	A	-0,88
BDL242	11	B	0,889
BDL243	11	B	0,929
BDL245	3	A	-0,863	11	A	-0,832	16	D	-0,806
BDL247	16	B	0,816
BDL248	13	A	-0,829
BDL249	8	C	-0,84	16	E	-0,808	15	E	-0,892
BDL250	9	A	-0,805	2	E	-0,85	17	D	0,815
BDL250	10	D	-0,809	4	D	-0,804	1	D	-0,9
BDL251	18	C	0,802	7	D	-0,861
BDL47	8	B	0,845
BDL49	7	E	0,805	9	E	-0,883	6	E	-0,809
BDL62	18	A	0,862	6	E	-0,869	13	D	0,829
BDL75	11	C	0,816	5	B	0,945	8	B	0,823
BDL79	7	B	0,876	18	B	0,841	12	D	0,884
BDL79	2	D	-0,938
BDL81	8	C	0,897	12	B	0,803	1	D	-0,81
BDL81	2	D	-0,86
BDL83	3	C	-0,861	2	C	0,905
BDL85	8	D	0,82

Tabela 5.

São fornecidas as

103/218 selecionados em tecidos desenvolvimento (conjuntos específicos fenotípico (vetor correlacionado) entre

Arabidopsis. As características (produção de sementes, taxa de crescimento e/ou , 3 e 4. Conj .Exp.

a Tabela 1 supracitada.

os fenotípicas incluem de óleo, componentes estágios de o desempenho ecótipos de [correlação de produção teor de óleo) , biomassa, vigor conforme descrito nas Tabelas conjunto de expressão, de acordo com

Tabela 6 aqui contida abaixo fornece ..dados sobre a homóloga de genes selecionados, os correlação) e os tecidos transcriptom correlacionados com o valor'de“correlação (Rcalculada por .meio da correlação de

Tabela 6 selecionados em tecidos específicos ou estágios de desenvolvimento e do desempenho fenotípico em ecótipos da

Arabidopsis

Gene Name	Exp. Set	Corr. Vec.	R
BDL155H1	folha	Crescimento relative da raiz	0,814
BDL155H1	sementeõdaf	Comprimento da silíqua	-0,855
BDL171 HO	folha	Larg/Comp da Folha	0,835
BDL171 HO	sementeõdaf	Matéria seca por planta	-0,82 .
BDL171 HO	sementeõdaf	Largura da lâmina	-0,813
8DL183 HO	semente12daf	Circularidade da Lâmina	-0,878
BDL231 HO	flor	Peso da semente	0,825
BDL231 HO	folha	Largura da Siliqua	0,816
BDL231 HO	folha	Crescimento relative da raiz	0,854
BDL231 HO	raiz	Peso da semente	0,92
BDL248 HO	sementeõdaf	Crescimento relative da raiz	0,851
BDL70 HO	semente12daf	Comprimento da lâmina	-0,816
BDL70 HO	sementeõdaf	Produção de semente por planta	-0,82

104/218

Tabela 6. São fornecidas as coorrelações entre os níveis de expressão de homólogos dos genes selecionados da Arabidopsis em vários tecidos ou estágios de desenvolvimento (Conjuntos de Expressão) e o 5 desempenho fenotípico em várias produções (produção de semente, de óleo, teor de óleo) , biomassa, taxa de crescimento e/ou componentes de vigor [Correlação (Corr.) Vetor (Vec.)] Corr. Vec. = Vetores Correlatos especificados nas Tabelas 2, 3 e 4; Exp. Set = conjunto de expressão especificado na Tabela 1.

EXEMPLO 3

PRODUÇÃO DE ARABIDOPSIS TRANSCRIPTOM E ANÁLISE DA ALTA ______.... CORRELAÇÃO DE _ TRANSFERÊNCIA NORMAL E CONDIÇÕES LIMITANTES DE

NITROGÊNIO UTILIZANDO 44K DE OLIGONUCLEOTÍDEOS

MICROARRANJADOS DA ARABIDOPSIS

A fim de produzir uma análise de correlação da alta taxa de transferência, õs presentes inventores utilizaram um oligonucleotídeo Arabidopsis microarranjado, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext 20 Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879] . O oligonucleotídeo arranjado representa cerca de 44.000 genes de Arabidopsis e transcrições. Para definir as correlações entre os níveis de expressão do RNA com NUE, componentes de 25 produção ou parâmetros relacionados com o vigor das plantas de características diferentes, de 14 de Arabidopsis Ecótipos foram analisados. Entre eles, dez Ecótipos englobando a variação observada foi selecionada para a análise dA

105/218 expressão do RNA. A correlação entre os níveis do RNA e os parâmetros caracterizados foram analisados utilizando o teste de correlação [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 5 (ponto) html].

Procedimentos Experimentais

Extração de RNA - Dois tecidos de plantas [folhas e caules] crescendo a dois níveis diferentes de adubação nitrogenada (1,5 mM de nitrogênio ou 10 6 mm de nitrogênio) foram amostradas e RNA foi extraído utilizando reagente Trizol da Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) invitrogen (ponto) ___--com/content (ponto)cfm?pageid=4 6 9] Para maior _ comodidade, cada informação expressão micro-arranjada de tipo de tecido 15 recebeu um Conjunto ID como resumido na Tabela 7 abaixo.

Tabela 7

------Texridos utilizãSõs pelos conjuntos dê expressão dã

Arabidopsis transcriptom

Conjunto de Expressão	IDdo Conjunto
Folhas a 1,5 mM de fertilização nitrogenada	A
Folhas at 6 mM de fertilização nitrogenada	B
Hastes a 1,5 mM de fertilização nitrogenada	C
Hastes a 6 mM de fertilização nitrogenada	D

Tabela 7: São fornecidas as letras de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão da Arabidopsis.

Cerca de 30-50 mg de tecido foram tomados a partir de amostras. Os tecidos pesados foram moídos utilizando almofariz e pilão em nitrogênio líquido e ressuspendidos em 500 μΐ de reagente Trizol. Para o lisado

106/218 homogeneizado, 100 μΐ de clorofórmio foi adicionado seguido com isopropanol e duas lavagens com etanol

75%. O RNA foi eluído em 3 0 μΐ de água livre de RNase.

Amostras de RNA foram limpas ut-ilizaando minikit da Qiagen

RNeasy protocolo de limpeza, conforme o protocolo do fabricante (QIAGEN Inc,

CA EUA) .

do rendimento de Arabidopsis e parâmetros relacionados com vigor sob diferentes níveis acessosde

Arabidopsis em 2 parcelas repetitivas cada uma contendo oito plantas por parcela foram cultivadas em estufa. O protocolo de cultivo utilizado foi o seguinte:

.-superfície das sementes -esterilizadas foram semeadas _em tubos Eppendorf contendo 0,5 x Murashige Skoog-sal basal e cultivadas a 23 °C, sob 12 horas de luz e 12 horas de escuro “em ciclos diários por 10 dias. Em seguida, as plântulas de tamanho símíTar foram cufdadosamente transferidas para vasos com uma mistura de perlite e turfa na proporção de 1:1. Condições limitantes de nitrogênio constante foram obtidas por irrigar as plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico em forma de KNO₃, suplementado com 2 mM CaCl₂, 1,25 mM de KH₂PO₄, MgSO₄ 1,50 mM, 5 mM KC1, 0,01 mM H3BO3 e microelementos, enquanto a normal condição de irrigação (condições normais de Nitrogênio) foi conseguida pela aplicação de uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO₃, suplementado com 2 mM CaCl₂, 1,25 mM de KH₂PO₄, MgSO₄ 1,50 mM, 0,01 mM H3BO3 e microelementos. Para acompanhar o crescimento das plantas,

107/218 as bandejas foram fotografadas no dia das condições limitantes de nitrogênio iniciadas e, posteriormente, a cada 3 dias por cerca de 15 dias adicionais. A área rosácea da . planta foi determinada a partir das imagens digitais.

Software ImageJ foi utilizado para quantificar o tamanho da planta a partir das imagens digitais [Hypertext Transfer Protocol:// RSB (ponto) info nih (ponto) gov (ponto)/ij /] , utilizando scripts proprietários projetados para analisar o

	tamanho da área de	rosácea	de plantas individuais como uma
10	função	do tempo. O	sistema	de	análise de imagem incluído	um
	computador pessoal	(Intel	P4	3.0 GHz) e um programa	de
	domínio	público	ImageJ	1,37 (Java programa	de

__-processamento de imagem com base, que foi desenvolvido _no

National Institutes of Health dos EUA e estão disponíveis gratuitamente na internet [Hypertext Transfer

Protocolo:./rsbweb (ponto) nih gov (ponto) /] Em seguida, os

------dados a na i is ado s foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (SAS Institute).

Os dados coletados parâmetros estão resumidos na Tabela 8, abaixo:

Tabela 8

Parâmetros correlatos da Arabidopsis (vetores)

Parâmetros correlatos com	ID de Correlação
N 1,5 mM; Área de Rosácea no dia 8 [cm2]	1
N 1,5 mM; Área de Rosácea no dia 10 [cm2]	2
N 1,5 mM; Cobertura de lote no dia 8 [%]	3
N 1,5 mM; Cobertura de lote no dia 10 [%]	4
N 1,5 mM; Número de Folhas no dia 10	5
N 1,5 mM; Área Laminar da Folha no dia 10 [cm2]	6
N 1,5 mM; RGR of Área de Rosácea no dia 3 [cm2/dia]	7
N 1,5 mM; t50 Floração [dia]	8
N 1,5 mM; Peso Seco [gr/plant]	9
N 1,5 mM; Produção da Semente [gr/plant]	10

108/218

Continuação da Tabela 8
N 1,5 mM; índice de Colheita	11
N 1,5 mM; Peso de 1000 sementes [gr]	12
N 1,5 mM; produção de sementes/ rosette area no dia 10 [gr/cm2]	13
N 1,5 mM; produção de sementes/lâmina da folha (gr/cm2]	14
N 1,5 mM; % Redução na produção de sementes comparado a N 6 mM	15
N 1,5 mM; % Redução na biomassa comparado a N 6 mM	16
N 1,5 mM; Nível N/DW [SPAD unid/gr]	.17
N 1,5 mM; Nível DW/N [gr/ SPAD unid]	18
N 1,5 mM; produção de sementes/ Nível N [gr/ SPAD unid]	19
N 6 mM; Área de Rosácea no dia 8 [cm2]	20
N 6 mM; Área de Rosácea no dia 10 [cm2]	21
N 6 mM; Cobertura de lote no dia 8 [%]	22
N 6 mM; Cobertura de lote no dia 10 [%]	23
N 6 mM; Número de Folhas no dia 10	24
N 6 mM; Área Laminar da Folha no dia 10	25
N 6 mM; RGR of Área de Rosácea no dia 3 [cm2/gr]	26
N 6 mM; t50 Floração [dia]	27
N 6 mM; Peso Seco [gr/plant]	28
N 6 mM; Produção da Semente [gr/plant]	29
N 6 mM; índice de Colheita	30
N 6 mM; Peso de 1000 sementes [gr]	31
N 6 mM; produção de sementes/ rosette area dia no dia 10 [gr/cm2]	32
N 6 mM; produção de sementes/lâmina da folha [gr/cm2]	33
N 6 mM; Nível N/FW	34
N 6 mM; Nível DW/N [gr/ SPAD unid]	35
N 6 mM; Nível N/DW (SPAD unid/gr plant)	36
N 6 mM;.produção de sementes/N unit [gr/SPAD unid)—-— —-=- ———™---— =	37 -

Tabela 8. São fornecidos os parâmetros correlatos da Arabidopsis (vetores) N = indica nitrogênio nas concentrações indicadas; gr. = gramas;

	SPAD =	níveis de clorofila;	t50 =	momento em	que	50% das
5	plantas	floriram; gr/ SPAD	unid	= biomassa	da	planta
	expressa	em gramas por unidade de	nitrogênio	na	planta
	medida por SPAD. DW = Peso	seco da planta;	’FW	= peso

fresco da planta; Nível N /DW = nível de nitrogênio da planta medido em unidade SPAD por biomassa da planta [gr] ;

Nível DW/N = biomassa da planta por planta [gr]/unidade

SPAD; Área de Rosácea (medida usando análise digital);

Cobertura de lote no dia indicado [%] (calculado por meio da divisão da área total de planta com a área total de lote) ;

Área Laminar da Folha no dia indicado [cm²] (medida utilizando análise digital); RGR (taxa de crescimento

109/218 relativo) da Área de Rosácea no dia indicado [cm²/dia] (calculado utilizando a Fórmula II); t50 Floração [dia] (o dia em que

50% das de sementes/ área de Rosácea no produção de sementes/lâmina da folha [gr/cm²] (calculado);

produção de sementes/ N levei [gr/ SPAD unit] (calculado).

Avaliação de

NUE, componentes ao vigor

Dez ecótipos de Arabidopsis foram produzidas uma contendo oito plantas por parcela, em bandejas, cada em uma estufa com temperatura controlada por cerca de 12 semanas. As plantas foram irrigadas com a concentração de nitrogênio, conforme descrito acima, dependendo do- tratamento aplicado. Durante este tempo, foram coletados dados documentados e analisados. A maioria dos parâmetros escolhidos foram analisados por imagens digitais^-.

Tmagerrr Diglta 1 - Ensaio da Estufa

Um sistema de aquisição de imagem, que consiste de uma câmera digital reflex (Canon EOS 400D) ligado com uma lente de 55 milímetros de comprimento focal (série Canon EF-S) colocados em um suporte de alumínio montado, foi utilizado para captar imagens de plantas plantadas em recipientes dentro de uma estufa com ambiente controlado. O processo de captura de imagens é repetida a cada 2-3 dias, com início no dia 9-12 até dia 16-19 (respectivamente) após o transplante.

Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, que consiste de um computador pessoal

110/218 (Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ

1.37, Java software de processamento de imagem com base, que foi desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e está disponível gratuitamente na Internet, no protocolo

HTTP:// rsbweb (ponto) nih gov (ponto) /. As imagens foram capturadas em resolução de 10 megapixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em uma baixa compressão de formato JPEG (Joint Photographic Experts Group padrão). Em seguida, os dados de imagem de saída de transformação foram salvos em arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (SAS Institute).

Análise da Folha - Utilizando a análise digital-- de -folhas de- dados—foi calculado, incluindo o número de folhas, área da lâmina foliar, 15 cobertura de parcela, diâmetro e área de Rosácea.

Área de taxa de crescimento relativo: A taxa de crescimento relativo da rosácea e as folhas foram calculada de acordo com a Fórmula II, como descrito acima.

Produção de Sementes e peso de

1000 sementes - No final do experimento todas as sementes de todas as parcelas foram coletadas e pesadas a fim de medir o rendimento de sementes por planta em termos de peso total de sementes por planta (gr) . Para o cálculo do peso de 1000 25 sementes, peso médio de 0,02 gramas foi medido a partir de cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculada.

111/218

Peso seco e produção de sementes - No final do experimento, plantas foram colhidas e deixadas para secar a 3 0°C em uma câmara de secagem. A biomassa foi separada das sementes, pesada e dividida pelo 5 número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (raízes exclusive), após secagem a 30°C em uma câmara de secagem.

índice de Colheita - O índice de colheita foi calculado pela Fórmula IV, conforme descrito 10 acima [índice de colheita de sementes de rendimento = média por unidade/peso seco médio].

T₅₀ dias para a floração - Cada uma ' das'repetições foi monitorada para a data de floração. Dias de florescimento foram calculados a partir da data de 15 semeadura até 50% das parcelas de flor.

Nível de Nitrogênio da Planta

- O teor de clorofila das folhas é um bom indicador do estado de nitrogênio de plantas uma vez que o grau de verdura da folha é altamente correlacionada com este parâmetro. O conteúdo de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi medidor SPAD desenvolvidas parcela. Com realizada na foram feitos época da floração. Leituras do em folhas jovens completamente

Três medidas foram tomadas base nessa medida, parâmetros por folha por entre o rendimento de sementes por unidade de nitrogênio [rendimento de sementes/N = nível de rendimento de grãos por planta [gr]/unidade SPAD], DW plantas por unidade de

112/218 nitrogênio [DW N da biomassa/nível = planta por planta [g] /] unidade SPAD, e nível de nitrogênio por grama de biomassa de N [/ DW = unidade SPAD biomassa/planta por planta (g) ] foram calculados.

Redução percentual de produção de sementes - mede a quantidade de sementes obtidas de plantas quando cultivadas sob condições limitantes de

	nitrogênio produzidas	em comparação com em níveis normais de	0 rendimento de sementes
nitrogênio,	expresso em %.
10	Resultados	Experimentais
		10	acessos	diferentes de

Arabidopsis (ecótipos) foram cultivadas e caracterizadas por

37.parâmetros, -como-descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e 15 os valores estão resumidos na Tabela 9 abaixo. A análise subsequente de correlação entre os conjuntos transcriptom diversos (Tabela 7) foi realizada. A seguir estão os resultados integrados a base de dados.

Tabela 9

Correlação entre o nível de expressão dos genes selecionados nos tecidos sob fertilização nitrogenada limitante ou normal e o desempenho fenotípico entre ecótipos de Arabidopsis

Nome do Gene	Vetor Correi.	Conj. Exp.	R	Vetor Correi.	Conj. Exp.	R	Vetor Correi.	Conj. Exp.	R
BDL117	D	31	-0,748	A	12	-0,784
BDL118	C	11	-0,914	C	10	-0,723	C	14	-0,75
BDL118	C	8	0,74
BDL118	D	31	-0,766	B	30	-0,752	D	30	-0,794
BDL118	D	29	-0,715	B	27	0,791	A	11	-0,747
BDL126	A	1	-0,719
BDL126	D	25	0,801	A	6	-0,715	A	2	-0,711
BDL138	B	28	-0,797	B	27	-0,786	C	9	-0,754

113/218

Continuação da Tabela 9
BDL140	D	28	-0,761
BDL147	D	30	-0,703	C	11	-0,7
BDL149	C	9	-0,744	A	1	0,703
BDL152	A	14	-0,705
BDL154	B	26	0,896	B	32	0,76	B	33	0,861
BDL155	C	9	-0,719
BDL155_H0	B	28	0,768	D	28	0,757	D	29	0,751
BDL155_H0	C	7	0,743
BDL156	D	24	0,725	D	21	0,734
BDL157	B	29	0,714
BDL158	B	30	-0,722	B	27	0,708
BDL160	A	12	-0,807	C	9	-0,771	C	5	-0,797
BDL160	C	2	-0,816
BDL162	B	31	-0,792
BDL165	C	11	-0,755	C	8	0,748
BDL167	C	10	-0,898	C	14	-0,894	C	13	-0,874
BDL167	C	15	0,737
BDL167	D	30	-0,75	C	11	-0,709	C	7	-0,821
BDL168	A	9	0,703	_A	11 -	-0,786
BDL168 “ -··	'B .......	30	-0,73	D	21	0,721	B	27	0,738
BDL169	A	11	-0,804	A	10	-0,746	A	14	-0,714
BDL169	A	13	-0,708	A	8	0,707
BDL171	B	33	0,865	A	9	-0,735			=-
BDL171	D	25	0,879	B	26	0,891	D	21	0,765
BDL171	D	20	n 711	B	29	0 735	B-------	32-------	-0741--
BDL171_H0	C	15	0,719	C	8	0,78
BDL173	B	26	0,723	B	33	0,72	A	15	0,751
BDL174	C	16	0,7	C	9	-0,73
BDL176	D	25	0,713	D	24	-0,713	D	26	0,765
BDL176	D	21	0,702	D	20	-0,719	D	32	0,806
BDL176	D	33	0,759	A	7	0,746
BDL177	B	27	-0,713	A	11	0,792
BDL181	C	10	-0,75	C	14	-0,795	C	13	-0,805
BDL181	C	15	0,72	A	8	0,794
BDL181	D	31	-0,704	B	27	0,723	C	11	-0,725
BDL182	A	6	0,728	A	2	0,717	A	1	0,763
BDL183	A	12	-0,764
BDL183_H0	A	2	-0,725
BDL186	A	10	-0,754	A	13	-0,713	A	15	0,805
BDL186	A	8	0,865
BDL186	B	31	-0,714	B	27	0,722	A	11	-0,816
BDL187	A	2	0,711	A	1	0,801	A	10	-0,775

114/218

Continuação da Tabela 9
BDL187	A	14	-0,843	A	13	-0,89	A	15	0,721
BDL189	A	13	-0,859	A	15	0,748	A	8	0,759
BDL189	B	30	-0,702	B	27	0,832	A	11	-0,71
BDL189	C	7	-0,714	A	10	-0,825	A	14	-0,82
BDL192	B	24	-0,788	B	21	-0,863	B .	20	-0,857
BDL192	B	29	-0,701	B	32	0,769
BDL192	D	28	-0,764	B	30	-0,785	B	25	-0,802
BDL193	A	6	-0,754	A	2	-0,781	A	1	-0,875
BDL193	A	14	-0,732
BDL193	D	30	-0,721	D	29	-0,819	C	11	-0,7
BDL194	B	25	0,786	B	21	0,707
BDL196	D	25	-0,715	D	21	-0,71	D	20	-0,715
BDL197	A	6	-0,701	A	5	-0,843	A	2	-0,89
BDL197	A	1	-0,827
BDL201	A	10	-0,768	A	14	-0,84	A	13	-0,872
BDL201	A	15	0,746
BDL201	B	29	-0,815	A	2	0,747	A	1	0,784
BDL220	C	11	-0,81
BDL220	D	30	-0,707	B	29	-0,785	C	9	0,752
BDL221	A - ’	2	0768 “	C	2	0,763	A	1	0,817
BDL221	B	31	-0,81	D	25	-0,743	D	24	-0,896
BDL221	C	1	0,74
BDL221	, D	21	-0,826	D	20	-0,776_	A_	5. _	0,825 _
BDL222	D	27	-0,716	A	11	0,77	A	14	0,731
BDL223	C	11	AZ57—		1 R	Ô 7RP	r	Q	H-R71--
BDL223_H0	C	11	-0,736
BDL223_H1	C	8	0,784
BDL223_H1	D	24	0,823	A	12	0,815	c	15	0,793
BDL229	C	11	-0,798	C	10	-0,723	c	14	-0,771
BDL229	C	13	-0,769	A	8	0,753	c	8	0,828
BDL229	D	30	-0,787	B	27	0,793	D	27	0,873
BDL231	A	11	-0,798	C	6	-0,704	A	10	-0,826
BDL231	A	14	-0,836	A	13	-0,843	A	15	0,823
BDL231	A	8	0,768
BDL231_H0	A	11	-0,779	A	10	-0,799	A	14	-0,841
BDL231_H0	A	13	-0,835	A	15	0,706	A	8	0,721
BDL233	C	8	0,835
BDL233	D	28	0,755	C	11	-0,768	C	15	0,725
BDL235	C	11	-0,87	C	10	-0,749	A	14	-0,741
BDL235	C	14	-0,726	A	13	-0,702	C	8	0,802
BDL240	A	8	0,742
BDL240	D	24	0,794	B	27	0,737	A	11	-0,787

115/218

Continuação da Tabela 9
BDL241	B	27	0,752
BDL242	A	5	-0,719	A	15	-0,722
BDL245	D	31	-0,875
BDL247	D	31	0,851
BDL249	A	8	-0,707
BDL249	C	12	0,707	A	11	0,82	A	10	0,727
BDL250	A	10	0,717	A	14	0,797	A	13	0,81
BDL252	C	9	-0,707	C	7	-0,714
BDL49	B	30	0,866	B	26	0,85	B	29	0,933
BDL49	B	33	0,762
BDL58	B	26	0,763	D	26	0,755	B	29	0,897
BDL58	C	14	0,816	C	13	0,855	C	15	-0,784
BDL58	C	8	-0,843
BDL58	D	32	0,758	D	33	0,778	C	10	0,8
BDL62	C	11	-0,858	C	10	-0,739	C	14	-0,77
BDL62	C	13	-0,747	C	8	0,819
BDL63	C	16	-0,704
BDL64	B	31	-0,793	C	5	-0,739
BDL70_H0	ç	8	0,757.	-		-			_____
BDL75 -	'C ” ~	”11	-0,716	C	8	0,713
BDL75	D	31	-0,776	D	28	0,75	D	30	-0,832
BDL79	B	31	-0,77
BDL85	C .	10	0,824	C	14	0,754_	Ç	13 _ .	.0,721-
BDL85	C	15	-0,705

Tabela 9. São fornecidas as correlações (R) entre os níveis de expressão de genes selecionados em tecidos (folhas e hastes), sob limitação (1,5 mM de nitrogênio) ou normal (6 mM de nitrogênio) As 5 condições conjuntos de expressão) e do desempenho fenotípico na produção de diversas (produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo), a biomassa, a taxa de crescimento e/ou vigor dos componentes [Correlação (Corr.) vetor (Vec.)] sob condições normais ou de limitação de nitrogênio. Vetor 10 Correi. . = vetor de correlação de acordo com a Tabela 8 supracitada; Conj. Exp. = conjunto de expressão de acordo com a Tabela 7 supracitada.

116/218

EXEMPLO 4

PRODUÇÃO DE SORGO TRANSCRIPTOM E ANÁLISE DA ALTA CORRELAÇÃO DE TRANSFERÊNCIA COM PARÂMETROS RELACIONADOS DE ABST 44K DE OLIGONUCLEOTÍDEO MICRO-ARRANJADO DE SORGO

A fim de produzir uma análise de correlação da alta taxa de transferência, os inventores presentes utilizaram um oligonucleotídeo Sorgo microarranjado, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) chem. (ponto) 10 agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?lPage=50879]. O oligonucleotídeo arranjado representa cerca de 44.000 genes Sorgo e transcritos e. A fim de definir as correlações entre os níveis de__expressão do___RNA.com ABST _ e produção de componentes ou parâmetros relacionados com vigor, as 15 características das plantas de 17 variedades de sorgo foram analisados diferentes. Entre eles, 10 variedades que englobam a variação observada foram selecionadas para a análise da expressão do RNA. A correlação entre os níveis do

RNA e os parâmetros caracterizados foram analisados utilizando o teste [Hypertext Transfer

Protocol://World Wide

Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].

Sorgo em Ecótipo cultivadas sob

Procedimentos Experimentais variedades de Sorgo foram cultivadas em três parcelas repetitivos, no campo. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: as

117/218 sementes de sorgo foram semeadas em solo e cultivadas sob condições normais até cerca de 35 dias da semeadura, em torno de V8 (última folha visível, mas ainda enrolada, espiga começando a inchar). Neste ponto, a irrigação foi interrompida, e estresse hídrico severo foi desenvolvido. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com a seca, os componentes do rendimento ou parâmetros relacionados com vigor, as variedades diferentes de sorgo foram analisadas.

Entre eles, 10 variedades que englobam a observada foram selecionadas para a análise da expressão do RNA. A correlação entre os níveis do RNA e os parâmetros caracterizados foram analisados__utilizando—o teste, de.

correlação [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html] .

Extração de RNA - Todas as 10 variedades de Sorgo foram selecionadas por amostra de cada tratamento. Tecidos vegetais [folha bandeira e meristema da Flor] crescendo sob estresse hídrico severo e as plantas cultivadas em condições normais, foram amostradas e RNA foi extraído utilizando reagente Trizol da Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) invitrogen com (ponto)/conteúdo (ponto) pageid cfm? = 469] . Para maior comodidade, cada informação de expressão micro-arranjada do tipo de tecido recebeu um ID do Conjunto como resumido na Tabela 10 abaixo.

Tabela 10

118/218

Conjuntos de Expressão Sorgo transcriptom

Conjunto de Expressão	ID do Conjunto
Estresse de Seca: folha pendante	U
Condições normais: folha pendante	X
Condições normais: meristema da flor	Y

Tabela 10: São fornecidos os conjuntos de expressão do sorgo transcriptom U, X e Y. Folha pendente = a folha abaixo da flor; meristema da flor = 5 meristema apical que segue o início do panículo.

Os parâmetros dos dados coletados são os que seguem:

Grão por planta (gr.) - No final do experimento (inflorescência estava seca) todos os 10 pontos dentro das parcelas entre os blocos A-C foram ' recolhidos.- 5 -inflorescências foram trilhadas separadamente e os grãos foram pesados, todas as inflorescência adicionais foram trilhadas juntas e pesadas também. O peso médio por inflorescência foi calculado dividindo o peso total de grãos 15 pelo número total de inflorescências por parcela, ou em caso de 5 de inflorescência, em peso, pelo número total de grãos em 5 .

Altura da planta - As plantas foram caracterizadas quanto à altura durante o período de 20 crescimento de 6 pontos no tempo. Em cada medida, as plantas foram medidas para a sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida ao nível do chão ao topo da maior folha.

Peso na Inflorescência (gr.)

No final do experimento (quando inflorescência estava seca), cinco inflorescências das parcelas dentro dos blocos A-C foram recolhidas. As inflorescências foram pesadas (gr).

o soquouios) sogoiduioo SEiDuaosaioiguT oouxo op ooos osad nlBuutoN 370U3ds3j:o75ui S-MCI -'^euuou saoínpuoo uio pqueqd srod 73505

O5uouios

3p ossd ,i13uij:ou oquBid/soquouios„ : soJ5oui3U3d jod sopezpsrpejeo soppATqqno

O6ios

3p sapBpapBA s τ e qu 3ui τ jc 3 dxg sopeq-[ns3H (eTpsui epusossjotjuT 3p ooos osod +

ΕΛ-μΕ^βθΛ

303S

ET0UaDS3JO-[JUT aod οτρρω ossd) /ETouaDsajoyuT pxpsui

EiTaqioo op ooipui ^:IIIA Binmucoa ‘ΙΙΙΛ epuuoj nqsd opepops p pçTsqfoo sp 3οτριιτ o (oBjos

O 3J3d) 3570^703 op OOIPUI .' seioq

8t xod oujoj ou ΟοΟΔ

UIOSbOOS sod3 ' (SSZJBJ tuos) 070S op 3U17D3 3Λ74Ε5963Λ OÇJtBd

3p 73505 osod

OO3S osoa •ETOuaosajOfjut

3p__ou3uinu ojod_ ορτρτΑτρ ο„ορτροαι JopejBdas 705 E^sojed -Epsa

3p 37 DU30S3J:017U7 3p 3 3SS3UlOTq 3p ossd 0 _ ‘S-OXíE-lSJOO_Ul-3JC0-5

O-V ΘΡ SOOOiq op Ojquap S3pOJ3d Op SOAT5E59Ê9A STBTJtOÇBUl o S3touoosoj:oi5U5 sb

S3poq (EO9S 3A34SS 37DU9DS9UO15U7 opupnb) oquouiTj:odx8 op

TSutj on

PTDUSDSSJO^JUI

SAxqeqsBsA

OOOS ossa çpDjed jod 317705 jod S3p3uio5 uiestoj sepTpsui

SOJTJ, · S3P7A1OAU8SOP 3qU3U13qOldlUO0 suoaoÇ soqioj uia

S35705 uresro 5

CTVdS JOP7P9U1 op S3jmqToq •03Ô3U075 3p eooda eu upEZipaj

505 OEÓTpaiu 3 o SOS QVdS

EipuiH 35750.1010 op aiopipoui uin opuEzyxTdn opEuyuuaqap toj

37750^:070 op opnoquoo q

QVdS

817/611 (puitdp scqpossp ouioo) sojtqsuipj:pd sop uin epeo op sosco^pa so soppsuiog ops : n pgoqpj,

000‘lfr	000'11	££8'61	£93'0	189'91	£90'0	310'0	2£
093’81	033'91	££8'81	663'0	900'31	310'0	8£0'0	9£
929'11	928'11	929'05	023'0	693'01	8£0'0	9£0'0	9£
929‘0fr	939'01	009'91	1S£'O	£82'8	090'0	390'0	1£
£18‘6£	918‘6£	211'31	£9£'O	091'01	610'0	££0'0	££
gzc‘ct	92£.'£1	££8'09	223'0	131'01	6£0‘0	££0'0	3£
928'11	928' 11	£89'£1	233'0	619'6	£30'0	3£0'0	1£
£90'31	009'31	291. '09	009'0	6£1‘6	8£0‘0	8£0‘0	0£
000' 11	000' 11	931.‘91	£83'0	£63'01	810'0	010'0	63
931'31	931·'31	21.6' 11	333'0	910'6	££0'0	ιεο'ο	83
928'11	928'11	928'91	219'0	903'11	910'0	810'0	23
8£1‘H	8£1‘H	092'61	3££'O	989'13	610'0	910'0	93
896'31	8£6‘91	£89'61	191'0	009'03	120'0	230'0	93
£80'01	£80'01	££8'31	39£'O	63£'9	οεο'ο	8£0‘0	13
092'21	092'21	££8'0 11	311'0	118'13	££0'0	610'0	33
		££8'0£	933'0	16O'£	390'0	930'0	13
£18'29	£1£‘2£	000'8£	2£Z‘O	801'9	6£0'0	ιεο'ο	03
IBLUJON 9 ejueid ep ejnjiv	IBLUJON 1 eiueid ερ Bjnjiv	BP9S 1 Bjueid ep eossd	IBLUJON j6 (soluo6 g) saiuaiuss sep osad	(leioi) IBLUJON MO	leiujON Bi ouaosaj0|ju| 9-MQ	leujjoN e )UB|d/aiU3W9S	ajuaLuas ep oeó eoijiiuapi

o6j:os ap SBpsouie seu sopepom soa/gouiea/ed

TT ETeqej, çi •sopep op oseq e sopej6oquT oequa urezrog sopeqpsoj so ' (ST sPTeqej,) ορτζηριιοο rog 'eTppui op soa/qouiej/ed so o (OT e.Toqej,) _ sesuoAxp uioqdTa/osuej/q soqunCuoo — so -oztguo — ______ogòepuOD op asngtre spdy ‘ox-pege TT-gxaoBi.__sop-pim-soj--opqsa saiopA so o dWP 9Jpm;jos o opuezpTqn opeqnopo το; qj ορτροιπ ojgouiesied eppo ejed eypauí v STeiuj/ou saoóTpuoo qos oduioq. op oquod _og ou epeqd ep pjnqp = „ tpuuton 9 equegd ep

Ej/nqxvn .'STeui.xou sagóipuoo qos oduioq op oquod _o ou equegd ep pj/nq-pe = ,,χριιυοΝ & equeid ep einpv,, i eoos op sooóepuoo qos oduiog op oquod _o ou equeqd ep ejnqge = ,,εοδδ equegd ç pp pj/nqiv,! fsxpiujou saoófpuoo qos seTouoosoj/oiguT oouto op soquotuos spp ooos osod = _lt-[pueion u6 (spóoqpo g) soquouios spp OSOdii 'STBIUJOU SOOÓTpUOO U1O 'PLODJted epeo op ooos osod = hXpuiscon sopoq. MQu ·' stpulzou soob-çpuoo uio '(soòeBuo

813/021 eseo pu 'sepepiun opuaquoo euin epeo ' sPAppscbi sepsojed θζ sai; uia seppATppo uiejiog: oBjzos θρ sapepapPA zaa - (D_o0T-08) eanqpstaduiaq pxpq a TD^N ^ΘΡ wui 00T θρ οχτρςρ soppuopp-pj oBuos ioBta ap sojpaiueaed •oBjcos θρ sejqsouip sp 9j;u9 stpiujiou ssgóipuoo no no (pops) οοτροτςρ psssiqss ap spodTpuoo qos [(·doa) jopa çj '(•jiod) opóppjjoj] jcoBta ap saquauodmoo no/o oquaiUTossio ap pxp; 'esseuiOTq 'saoónpoid sotjcpa ui a ooTdjqouaj oquaduiasap o o (opsspidxg ep soquntuoo ·ιοχ^ pp euioqsTJzow a spuppusd nq^oj) sop-çoaq sou soppuoyopps spup6 sop soBopotuoq sop opsssjdxs ap stsaju so sipus (y) ssoóPijpjjoo θ[ sp spppauiog ops · ZT efaqej,

εζ'ο	Ibwjon ejueid/eiuaiuas	aiuepuad Bqioj	£UH 88708
Z£8‘0	eoas £ B)ue|d ep ejnj| y	aiuepuad eqioj	£W 88708
96ΖΌ-	eoss 2 ejuBid ep Bjnqy	ajuepuad eqioj	£1H 88708
626'0-	eoesi ΗΓθΡΙΟΒ	ojuepuod eqiod.	- £LH 88708
£68'0-	— — ~ - - —— —^eoaseoN-emoj-	=- . gjuepuad eqiog	; £I.H· 88708
208'0	leuiJON Z on eqioj	JO|d ep BW9lSIJ0|/\|	89H £8708
ζοζ'ο-	Ipwjon JB (sowo6 g) sojuawes sep osod	JO|J	89H £8708
69ΖΌ	N-oxieg ejueid/eiueuias	JO|J	89H £8708
£9Z'O	eoas p ejueid ep ejnjiy	ajuepuad eqioj	89H £8708
£98'0	ibwjon g e)ueid ep ejrniy	JQ|d,	Z9H-£8708
898'0	leiuJON p eiueid ep bjn)|y	JO|d	Z9H £8708
80Z'0-	leuiJON ejueid/aiusuras	ajuBpuad eqpg	Z9H £8708
----2+Z'õ-	—·----------------------ibwjon epuoossjo|ju| g-wa	aiuepwd eqpj	Z9H £8708
8Ι-ΖΌ-	Ibwjon 9 E)UB|d ep ejnqy	JO|J	ZVH 201708
22ΖΌ-	Ibwjon P e)UB|d Bp ejnjiy	JO|J	ZfrH 20(708
ZfZ‘0	ibwjon - e}UB|d/Md eiouaosajoijui	JOU	ZfrH 201.708
ιζζ'ο-	SIBWJOU MO so sopoi	JO|J	ZfrH 201708
8	pjJOQ JOJOA	dxg [uoo	ausg op owon

oBios θρ sejcqsouin sp pjqua ooTpoTqp ssspjpsp ap no speuiscou spoóipuoo qos ODTdpousj oquadtuasap o a sopiosq sosscaATp tua soppuoppps sauaS sop soBo^ouioq sop osssasrdxa ap pAju o ajpus opóepuoo ς ζτ e-[aqni •-[equeuiTJcadxa opuauiTpaooáid ap opdss -eu spppoxjppdsp ops oqupuipsajo ap saoôypuoo sv ^-pdps ap o spunou saoÓTpuoo qos (aquamas ep opópdtjyguapi) oBios ap spjqsouip spu sopxpauí

8IZ/IZI saquTnSas so ej:ed SBpezTJsqoeieo a sepeAiqpo rnejoj o6ros saquarajTp sapeparjreA OT

STequauiTjadxa sopeqpsay ‘ [69fr=pTs6edcUigo (oquod) quaquoo/iuoo g£ (oquod) uafiojqTAUT (oquod) qaM ορτΜ ppjroM//’ pooqojd jaqsuejrj, qxeqjcadÂH] uebojrqTAUí ep γοζτιιι, aquaBeai οριίΒζτρμη opjejiqxa toj VNH a sopeiqsome mesroq '(DofrS -QZ arqua ejtnqejadmaq emn uia pue^Bon ap oqeqdmoo) stbujjou saoóipuoo tua no (D_o0T-8) ejnqejadmaq pxTeq e 'ID^N ap wui OZ

00T opuaosaao [sazjei a seq^oq] sopxoeq syoa •oquameqescq epeo ep sepeiqsome mesroq o6j:os sepeuofoaps sapepapeA OT se sepoj, - VNH ap oeóejqxa ' [8'9 - S'9 ^θθ θΑθρ oeónps ep Hd ' (οιρτ-[/semeiB q'T °W a 'o:xqTT/semej:6 g'i 03 'oscqTT/semejrS τ'ΟΤ uz .'oiqyi/semeJiÊ g{

Z‘oF - un 'ojqiq/seuiejB S'Ofr - [ (oopaDenuajTxojpTq

-Z oppe) siq-.N 'N- euTuie-fpouanp] VHaaa-o^^^d) qupjoz jsdng, ep soquamaça ojdtui. ap -(amnpA/amnpA)- — ___________%T0'0 a ojtqTT/semejg ΕΔΤ'Ο __lOd__ΕΗΉ__Loxqjrp/.S-euiexJ5—E-V-0-- ^OSbW ^zojqn/semei6 808'0 - ^εΟΝΜ = ma aqsxsuoo ριΐργβοΗ ap 01 eqaxdmoo oeônps v * [OotZ-OZ ap eqaqdmoo ριΐρχβοΗ ap oebnps]

TPurtON oquampsajo ap oeónps eu no (oqaxdmoo pueq6on ap oeónyos ap eóuasajd eu D_o0T-8) emqejadmaq exyeq e ' (pueqÊOH ap eqaxdmoo ap oeónqos ep maqe ' TD^N Wm O0T) epeAap apepTUTfes ap oeónps e eaed sep-çstaqsue^rq tueaoj seÇepueq se g 'oeóeuTUiaaS e sodv ’T^:T θρ oeinodoid eu eqxnq a eqTTnoTUkiaA ap einqsim emn uioo seoTqseyd seÇapueq ma sepeamas mejroq o6ros saquamas se : aquqnSas e xoq oquampsajo ap opooqojd o ' aquamepTuinsaTi ’ seDTugdojpxq-tuiss saoÓTpuoo ma ορτη&τγ mn ap

8ΙΖ7ΖΖΙ saua6 ap soSoqouioq ap opsssjdxa ap qaAju o asqua oeóeiauoD hT ejoqpj, • epuapadxa ap oeÓTjosap ap oaóas eu 'euiToe sepeqxeqap ogs seqexa saoóypuoo sy • (eyp ouTauipad o sode sexp gi) 9T + T.L · (θτρ oacrauiTad o sode seip oqTO) 8 TI> · (saoÔTpauí ap eyp ouTauiTud) tj, -opeo-rpuT oduiaq ap sojuod sou qes ap sepeAap sagóypuoo no sieiiuou saoínpuoo uia OSaros ap seuqsouie sep sopxpam soagauiuscud ei so soppaujog oes = ET e[aq-ej,

92299901'0	299>	290'0	299'02	292'91	009'2	20
29916^91^0	009>	000'0	092'02	099'01	000'2	n
W9W60O	006>	292'0	009'92	006'91-	290'01	1-0
2V9609CI-O	009'fr	290'0	29É22	29fr‘9l	006'9	00
9V021920'0	296'fr	290'0	000'02	009'91-	009'9	62
W299920O	009ϊ	000'0	002'02	006'91-	002'6	92
61-909990'0	009'V	290'0	009'22	000'01-	006'2	22
90902021'0	009>	OOfrO	290'00	290'02	006'01	92
62V2W0	009'V	eei‘0	291-'02	292'91-	009'6	22
90'0	29L>	000'0	009'1-2	002¼	006'2	02
- oeN-ejueid/ziej ep - -MO	|Blujon&*U -seqjojap ojaiunN’	IOBN 11 _ seqioj. ap ojaiunN	- lOBNQim ejuBid ep ejnnv	-mi 9+;x BlUBId Bp BJnilV	- IOBN - U BJUBId Bp Bjnnv	^ajuaiuas 01

o6j:os θρ seuqsouin seu sopTpeui sojzqauieuud sq

- ET- epaqei “ • sopap ap aseq e_ s.opejSanuT- og-;ua uieaoj sopeqpnsaj so ‘ (frl θ-paqej,) epezipeai toj sojqauipjced qj sop uTparn e a sosscaATp uioqdyjasuejq soqunÇuoa so auqua oeiepajjoo ap asipeue sodv •oxpeqe ετ e-paquj, eu sopiurnsau ogqsa sauopA so a dNT aareMqjos o opuezTpiqn opepapea toj opiparn ouqaureued epea eued expauí v · (sequepd oouto ap expeui) nTDPN WUi 00T MCI ZT^Hu uia equeqd srod zjeu (seque^d oouto ap ap eaas esseui ρτρριπ) STeuuou saoòppuoa uia eque-pd ap exnqp = ,,-ρριπ-τοΝ equepa θρ eunjfVn ·. (sequupd oouto ap ητρρω) stpultou sagóipuoa uia equeqd iod seqpoj ap oaauinu = _N STeuriojsi seqqoj ap o^auinu_H : soagauieied

8IZ/02I op otusBoi^tu ap ο^όηζτγτ^η ap exouaTojga no/a soDiqojqe ςζ sass3j;sa e BTDuejap; Oapo ap aoaq 'jcoSta 'oquaurpsaio ap üxp; 'esseuiOTq 'oapo ap oeónpoad 'saquauias ap oquauiTpuaj: ou 'apepxATqnpojcd eu ogonduiT apuejB um tuaq anb ' (soqupsip sauab ap sep^Tuinj 68) sauab goT ωηζιηοτ^τ quapT sa^oquaAUT saquasa^d so ' STequauiT^adxa sequaiunauaj a seqposap euiToe 03 aoTqpuirojuTOTq eu aseq uioj

0ΙΝ3Θ0Η3ΙΝ OVÒVZIOI30 VN VIDN3I0I33 3 SV3NVOd 30 ODI3OI3V 3SS333S3 V VI0NV33303 '0330 30 3033 Ή0ΘΙΛ '03N3WI0S330 30 vxv3 'vssvwoia 'ovónaoaa wv3Nawnv anõ sbnbo aa ovóvoiai3N3ai

S OOdWBXBSI • (^TP osrrauixjd op ue^uoo η sexp ST) ST + T3 · (exp o^xauiTud o sode sexp 0410) 8 13 · (saoôxpauí ap ετρ oaxauiTjzd) T3 ' (ET 6ΤθΡ^3) oqxuosap. puitdb ouioo cede^exioa—ap -jo^sa = --p^oj χορΟΛ ' •obuos ap seuqsoure sep sieuuou saoóipuoa tua no (epep-ruppes)oj sooxqorqe sassaj^sa ap saoóxpuoo qos sopeoipuj soquaiuotu sou__ [o-eóepajuoo op (το;θλ) ioBta saquauoduioo no/a oquauiTOsaao ap exe; 'esseuioxq 'apepTApnpoid] ooTdjqouej oquaduiasap o a [oqunÇuoo · (-dxg) oessaadxg] sazjej tua sopeuoioaps sauaB ap sobopouioq ap oessajcdxa ap syaAju so ajgua (ή) saoóepjjoa ς se seppaujoj oes ' eiaqej,

6ZZ‘O	Iblujon n seqioj ap ojawnN	ZIBJ	8GH 88709
zz‘o-	IOBN9l.+He)UB|d ΕρΒ-ίπην	ziej	8GH £8709
6'0-	I0BN8H1 ejuBid epejnw	ZIBJ	8GH 88709
38'0-	I3BN H B)UB|d BP Bjn)iv	ZIBJ	8GH 88709
sz‘o-	IQBN U seqioj ap ojatunN	ZIBJ	8GH 88709
Z68'0	I9BN B)UB|d/ZIBJ BP MO	ZIBJ	8GH~887Q9
8	lajjog jo)8a	dxg luoo	auag op atuoN

obuos ap sejzqsoune tua no peuutou oapoiqe assajqsa ap saoóipuoa qos eoTdjqouag oquaduiasap ep o sazrej tua sopeuoxoapas

8IE/Í7ZI

681	fr£	sisdopiqBJB	0fr9319MVI99196|S!Sdop!qeJB	181109	98
βει	εε	sisdopiqBJB	0l9819ClVl99iq6|s!Sdop!qejB	221109	*£
zeu	3£	sisdopiqejB	09101 OCl VlG 9 L q 6| sisdo piqeje	92110a	εε
9ε i	ιε	sisdopiqBJB	08968931 Vl99iq6|SisdopiqBJB	wnoa	38
ςε ι	οε	sisdopiqBJB	03298931 Vl 9 9 L q 6| sisdo piqeje	82iiaa	18
νει	63	sisdopiqBJB	03838931Vl99iq6|sisdopiqBJB	121108	οε
εει	83	sisdopiqBJB	05161931Vl99N6|sisdop!qeje	691109	63
3ε ι	23	sisdopiqBJB	01610931VI991 q 6| sisdo piqeje	89iiaa	83
ιει	93	sisdopiqBJB	089629 UVl99 tq 6| sisdo piqeje	29 noa	23
οει	93	sisdopiqBJB	010999 UVl99 iq6|sisdopiqBJB	991ΊΟ8	93
631.	Κ	sisdopiqBJB	08^l99llVl99iq6|S!SdopiqBJB	891109	93
831·	£3	sisdopiqBJB	0986^9 llVl99iq6|S!SdopiqBJB	391109
231	33	sisdopiqBJB	096839 l· 1 Vl 991 q 6[sisdopiq bjb	091109	£3
931·	13	sisdopiqBJB	080339 llvl99iq6|S!Sdop!qBJB	891109	33
931	03	sisdopiqBJB	099frl9UVl99iq6|s!sdopiqBJB	291109	13
ΚΙ.	61	sisdopiqBJB	029109 HVl9919 6|sisdopiqBJB	991109	03
£31	81	sisdopiqBJB	089119frlVl99 iqSIsisdopiqBJB	99 noa	61
331	21	sisdopiqBJB	0V6399 UVl99 iq 6|sisdopiqBJB	*91109	81
131	91	sisdppiqBJB	0692^991 Vl99 iq 6|sisdopiqBJB	£91108	21
031	91	sisdopiqBJB	03W2911Vl99iq6|s!SdopiqBJB	39 noa	91
611	frl	sisdopiqBJB	09291991VI99 iq 6| si sdopiqBJB	6tinoa	91
811	ει	sisdopiqBJB	0862t?931Vl99iq6|s!sdopiqBJB	2*1109	*1
211	31	sisdopiqBJB	0t'930991Vl99iq6|s!SdopiqejB	otmaa	ει
911	11	sisdopiqBJB	08131981Vl99iq6|s!sdopiqeJB	881109	31
911	01	sisdopiqBJB	00169081 Vl 9919 6| SisdopiqBJB	931109	11
ΗΙ	6	sisdopiqBJB	931ΖΖ0Ζ1 Vl 991 q 61 sisdo piqeje	811109	01
ειι	8	sisdopiqBJB	0fr38G9tlVl99iq6|s!sdop!qBJB	211109	6
311	2	sisdopiqBJB	0298^9 H Vl 991 q 6| sisdo piqBJB	£8109	8
111	9	sisdopiqBJB	080819UVl99iq6|s!SdopiqBJB	18109	2
011	9	sisdopiqBJB	01003981Vl99tq6|s|sdop!qeje	62109	9
- -- 601	- V	- sisdopiqBJE	03t^99981Vl991 q6|srsdopiqBJB	92109	-9.
- - - - 801’	”---. — - Ç	- sisdopiqBJB	068^9911 Vl991 qOlsisdopiqeje	39108
201	3	sisdopiqBJB	02393931VI991. q B| sisdopiqBJ b	8*109	ε
fr61	1	sisdopiqBJB	099889tlVl99iq6|s!SdopiqBJB	2naa	3
901	1	sisdopiqBJB	099889N.Vl99iq6|S!Sdop!qBJB	217109	1
:.Ν 01 03S .oep!)cted!|Odt	:oNOI03S oepiioepnuiiod	owsiubôjq	odnjg op θωο|\|	BU90 -op oiuon*	ΟΝ IBIJBS

e.quepd -etun-sp-OT-uoBougT-u ap οξόΒζπρ⁰ ap ^puapyjs no/a oopçnqe assascpsa oi e PTauascafoq 'joBta 'ogusiupssjo ap exeq 'psseuioiq 'οθχο ap jos; Oago ap cgônpoj:d 'saguauies ap oquaurrpuaj: 'ç;ue-[d iod apepTATqnpojtd e uieqeje anb sopeoTjTpuapT sosppospnunod

ST e-[aqnjL •oxpqe 'st ç exaqej, eu sopTuinsau oeqse ifuequeo sopnp ap aseq t? uioo opscoon ap sepezypnqe sepusnbãs sens ouiod uiaq ' seorpjqdadTiod sepuanbas a sopejtno soapjpepnuTpd suas ' sopeoT jTquapT sauab sq ' sequefd uia epequauine a oessaidxa ens opuenb

813/531

ιει	96	sisdopiqeje	03838931Vl99 iq6|sisdop!qeje	iiiiaa	26
261	96	sisdopiqeje	03161931Vl99iq6|s!Sdop!qeje	691108	96
961.	16	sisdopiqejB	089629 UVl99 (.q6|s!sdopiqeje	291103	96
131	86	sisdopiqeje	029109 liVlS91 q 6|sisdopiqBj e	991ΊΟ9	16
961	36	sisdopiqBJB	0692199111991 q6|sisdopiqBJB	891109	86
911	16	sisdopiqeje	0016998111991 q 6|sisdopiqBJB	93ΠΟΘ	36
011	06	sisdopiqBJB	01003981Vl99iq6|s!SdopiqBJB	62109	16
£61	68	sisdopiqBJB	09981991119919 6|sisdo piqeje	3931G9	06
361	88	sisdopiqBJB	093809911199 iq 6| sisdo piqeje	193109	68
161	28	sisdopiqBJB	028289frlVl99iq6|S!Sdop!qBje	613109	88
061	98	sisdopiqBJB	0300398111991 q 6| si sdopiqeje	113109	28
691	98	sisdopiqBJB	0818198iVl99 iq6|s!sdopiqeJB	013109	98
881	19	sisdopiqBJB	0V9fr0981Vl99iq6|s!sdopiqejB	883109	98
281	88	sisdopiqBJB	019919311199 iq6|sisdopiqejB	283109	18
991	38	sisdopiqBJB	001909311199 iq6|s|sdopiqBJB	183109	88
981	18	sisdopiqBJB	0989991111991q 6| si sdopi q bj e	883109	38
181	08	sisdopiqBJB	001999 H Vl G 91 q 61 sisdo piqeje	383109	18
881	62	BUOIUBLU	10399333109 tq6|euoiueuj	833109	08
381	82	sisdopiqBJB	011999811199 iq6|sisdopiqeje	233109	62
181	22	sisdopiqBJB	02W9991Vl99iq6|s|Sdop!qejB	933109	82
081	92	sisdopiqBJB	02968991Vl99iq6|s!SdopiqBJB	933109	22
621	92	sisdopiqeje	082639t'lvl99iq6|s!SdopiqejB	133109	92
821	12	oq|iiu	88600911119 iq6|°MI!W	301109	92
221	82	ZOJJB	3t-38333gl3'29iq6|zoJJB	16109	12
	32	zojje	09630IX vlV9iq6|zojje	06109	82
921	12	ZOJJB	9m92Wl3’29tq6|z0JJB	88109	32
921	02	sisdopiqeje	0fr8909UVl99iq6|s!Sdop!qBJB	98109	12
121	69	oepob|e	08209UVlV9iq6|oepo6|B	02109	02
821	89	sisdopiqeje	030889911199 iq Blsisdopiqeje	19109	69
321	29	sisdopiqBJB	099019311199 iq6|sisdopiqeje	89109	89
121	99	sisdopiqBJB	091339 nvl99iq6|s!sdopiqBJB	89109	29
- ~ ~ 021	~ ’ .99	~ sisdopiqBJB.	„081909811199 iq6|sisdop!qBJB .	- 61109	- -99
691	19	sisdopiqBJB	001289111199 iq6|s|sdopiqejB	093109	99
891	89	sisdopiqBJB	099ZeDtlVlG9iq6|sisdop!qejB	813109	19
291	39	sisdopiqejB	0l9639flVl99iq6|s!SdopiqBJB	213109	89
991	19	sisdopiqBJB	069319nvl99iq6|s!sdopiqejB	913109	39
991	. 09	sisdopiqBJB	08t48981Vl99iq6|sisdopiqBJB	813109	19
- “ 191	~ - 6g	— sisdopiqBJB	Õ12Z3981Vl99iq6|s!sdop.iqeje	313109	09
891	89	sisdopiqBJB	02688931Vl99iq6|s!SdopiqeJB	983109	69
391	29	sisdopiqejB-	—098919HVl991-q6|s!sdop!qeJB	tesiaa	89 ”
191	99	sisdopiqBJB	ld 13d H11I1919 Blsisdopiqeje	083109	29
091	99	sisdopiqBJB	08889991VlG9iq6|S!SdopiqBJB	633109	99
691	19	sisdopiqBJB	92628931Vl99iq6|s!Sdop!qeje	833109	99
891	89	sisdopiqBJB	988229111199 tq6|sisdopiqBJB	333109	19
291	39	sisdopiqBJB	09892911V1G9 kq6|S!Sdopiqeje	133109	89
991	19	sisdopiqejB	021199 UVl99iq6|sisdop!qBJB	033109	39
991	09	sisdopiqBJB	960989UVl99iq6|s|sdop!qeje	613109	19
191	61	sisdopiqejB	0frfr999GlVl99tq6|s!SdopiqBJB	803109	09
891	81	sisdopiqBJB	09389991Vl99iq6|s!sdopiqBJB	103109	61
391	21	sisdopiqBJB	02f 19991vl99iq6|S!Sdop!qeje	003109	81
191	91	sisdopiqBJB	013689911199 iq 6| sisdopiqBJB	261109	21
091	Q7	sisdopiqBJB	08188991Vl99 iq6|sisdopiqeje	961109	91
611	77	sisdopiqBJB	019919G1VIG 9 ί q Blsisdo piqeje	161109	91
811	£7	sisdopiqBJB	096319G!Vl G 91 q Blsisdopiqeje	861109	11
211	17	sisdopiqBJB	08860991Vl99iq6|s|sdopiqeje	361109	81
911	\7	sisdopiqBJB	06990991Vl99iq6|s!Sdop!qejB	061109	31
911	01	sisdopiqBJB	09990991119919 θΙ sisdopiqBJB	681109	11
UI	68	sisdopiqBJB	099989111199 iq B| sisdo piq bjb	881109	01
811	88	sisdopiqBJB	08198911 VlG9 iq 6| sisdopiqeje	281109	68
311	28	sisdopiqBJB	0993891!Vl99 iq6|S!sdopiqeje	981109	88
ui	98	sisdopiqBJB	03991911VI99 iqBIsisdopiqeje	881109	28
011	98	sisdopiqBJB	90911911VI99 iq6|s!Sdopiqeje	381109	98
gf Biaqej. ep oeóenuijuog

8U/9ZI exeq 'saquauias ap oeónpojd Oapo ap jos; 'oaqo ap oquauiTpuajt 'pqueqd iod apEpxAxqnpojid e uieqajE anb saua6 sop soApi^nd soSo^oqsco JCEOxjxquapx puced •OAxqnqoAa oduiaq op oÊucq OB Βοριίθρτ OEóunj e scagazc e sosusdoxd sxeuj obs sojfBpçpiBA soBopçqio o^upnbus ogóun; eu opx6scaAxp isq ap ST9Aj;90sns ogs so6i;ue OEÓEOxqdnp ap soquaAa ap saquascuooap soBofEUEd anb as-aodns ’ OEÓEOxjdnp e rnoo sopBuopDPpj soquauixoaqxiooE souixqqn so opuas 'oeóezTpepgdsg xod uinuioo çj

TEuqsaoxiE uin ap ηχηχοΑθ ojxamxjzd o : soSopomoq ap sxEdxouxud sodxq sxop uiarpxqsuoo soSope-xed a soSoxoqjio ‘ euiouaS-ojrxequx op saqóE-XEduioo ap E^EOsa eu saoôEox jpssep a puopunj OEÔEzxjcaqoEUEO e sopEOXjdE aquauiaquaoaj: uiejeoj epSopued a exBoppo ap soqxaouoo so 01 . . . .. VJ,NV3d vwn 3d 3ΠΝ Ω0/3

1S3V VIDN3JLSIS3H 'HODIA 'VSSVWOIS '0330 30 3O3JL 'OINBWIDSBHD 3d. VXV1 '0330 3d OiN3WIdN3£L O- '33N3H3S Vd -O3N3WIdN3H ’ ’ _____0 WVI.N3WnV 3Í1Õ SVOO3OWOH__S_VIDN3n03S--3d--0-VÔVDJ-33-ÍN3G-I-9 O3dW3X3 ç •Eoxpxqdadxfod

Exouanbas ap sescopEox jxquepx a soepxqoaTonuxfod a 'ouisxueSuo op oedepue ens ' sopeox jxquapx saua6 so sopxoauaoj oeg :gi EqaqEj,

SOS	901	sisdopiqBJB	079fr0981VlG9 |.q 6|sisdoptqeje	sesnaa	901
10S	M)1	ogpo6|B	oezosidvIwiqfiloBpoeiB	02Ί09	901
891.	801	sisdopiqBJB	09£Z£9frlVl991 q 6|s|SdopiqBJB	8frsnaa	frOl
S91	SOL	sisdopiqBJB	098919 UVl991 q 6| si sdoptqeje	issnaa	801
S91	101	sisdopiqBJB	0Z.fr 19991VIG9 q 6| si sdoptqeje	oosiaa	S01
OOS	001	sisdopiqBJB	07S68991Vl99iq6|S!SdopiqBJB	Z6naa	101
661	66	sisdopiqBJB	09G90991VI99 iq6|sisdopiqBJB	68iiaa	001
8frl	86	sisdopiqBJB	08 t989f !Vl99 iqBIsisdopiqBJB	zenaa	66
861	26	sisdopiqBJB	08G689S1VI99 tq6|sisdopiqBJB	frz naa	86
ς 1, ejsqei ep OBÓBnuiiuoQ

81Ζ/Δ31 sp sopoqsui uioo ' ssjtequsuistduioo sopoqsui

ST°p ssqssp ep eApçoT gxqsn Ç op •„τρμτ6τρ pdtjpj:6 s opuTqTuiusd oqimÇuoo ou sopesTpue sp saoóç^ouB sp opeureqo s anb eopauinu oessaudxa sp ppad um ./sopep sp

Epusnbaij uisutoj susB 'susB ouissui aseq eu eTouepunqB ens snsuaA ens opuejceduioo 'aiuauieopspepa um uís sopednJcBe sj,sa so sopoq sy · (ssqusuiss ouioo 'sooxjjosdss sosBuco uia piutdp oeónqusuieqnBsj: e rnoo soeBjo snss so sopoq uia squsqTsmss

SZ

OZ o uieuqsoui anb ssusB 'oqduisxs jod) asag eu ouioo 'Eoijpadsa asej e pe osóequsuiçfnBsj: 12 uioo opauiTApAuasap op otsui lod 'squeqqsuiss oessaudxa sp fTjscsd o mnjzqsoui anb ' sopezpeuosjad soxrj souiusq sp opepqeooA um opuezppn sepeoTjxssep uieuoq j,s3 sp seosgoTxqTq se s epesipue

T°3 sopep sp soseo uís s puipjBottj o rnoo epuepioouoo ens e oquenb sopesipue ureuoj soAppnd so6op;uo sp sodrurBo ·soorBoqoTq suoxp so num ias s auinsse (socoascp) oeóeoppiej sp ηωροτΒρτρ um uiPuBoxÁqa um sp oqxqum ou sopezTuebjo stpui uieucoj soApç^nd soBoqoquo ssqsa • sepedmbe aquauisAT^e^ua; uiecroj sapeqpuias s qusuis qus τ d t jns

SEiouanbas ’ (TO°<L qo^cess qusuiuBytv fsooq

OTSPg) J.SVUS o opuezTH^n sepequife uipoloj sepuanbas se ssssuqss uin epueiap^ 'sssnuiOTq 'joBta 'oqusuipss-το sp

8IZ/8ZI

129/218 fenotípica de QTLs, SNPs e correlação expressão fenotípica é baseada na suposição de que ortólogos verdadeiros deverão manter a função idêntica ao longo do tempo evolutivo. Esses métodos fornecem diferentes conjuntos de indicações sobre as 5 semelhanças de função entre dois genes homólogos, as semelhanças no nível de sequência - aminoácidos idênticos

	nos domínios	da	proteína e	a	similaridade	nos perfis	de
	expressão.
				Métodos para	a pesquisa	e
10	identificação	de	homólogos	de	rendimento	e melhora	das

características agronômicas, tais como tolerância ABS e polipeptídeos NUE relacionados ou polinucleotídeos estão bem

------- _ dentro—da es fera dogartesão hábil. A busca e identificação de genes homólogos envolve a análise das informações de sequência disponíveis, por exemplo, em bancos de dados públicos, como a base de dados de DNA do Japão (DDBJ) ,

Genbank, e o European Molecular Biology Laboratory Nucleic

Acid Sequence Database (EMBL) ou versões do mesmo ou a base de dados do MIPS. Uma série de algoritmos de busca 20 diferentes foram desenvolvidos, incluindo mas não limitados ao conjunto de programas chamados de programas BLAST. Há cinco implementações do BLAST, três projetadas para consultas de sequência de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX, e TBLASTX) e duas destinadas para consultas de sequência de 25 proteína (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in

Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al . , Genome Analysis,

I: 543, 1997). Tais métodos envolvem o alinhamento e comparação das sequências. O algoritmo BLAST calcula

130/218 identidade de sequência por cento e realiza uma análise estatística da semelhança entre as duas sequências. O software para análise de desempenho do BLAST está disponível ao público por meio do Centro Nacional de Informações sobre 5 Biotecnologia. Outros software ou algoritmos são GAP,

BESTFIT,	FASTA e TFASTA.	GAP	utiliza o algoritmo	de
Needleman	e	Wunsch (J.	Mol.	Biol .	48: 443-453, 1970)	para
encontrar	o	alinhamento	de	duas	sequências completas	que
maximi za	o	número de	partidas	e minimiza o número	de
lacunas.
				Os	genes homólogos podem
pertencer	à	família de	um	mesmo	gene. A análise de	uma

f amí 1 ia _de genes pode ser realizada por meio de análise de similaridade de sequência. Para executar esta análise podem15 se usar os programas padrão para alinhamentos múltiplos, por exemplo Clustal W. Uma árvore de vizinho-junto das proteínas homólogas aos genes na presente invenção pode ser utilizada/ para fornecer uma visão geral das relações estruturais e ancestrais. A identidade de sequência pode ser calculada 20 utilizando um programa de alinhamento como descrito acima.

Espera-se que outras plantas tenham um gene semelhante funcional (ortólogo) ou uma família de genes similares e os genes fornecem o mesmo fenótipo preferido como os genes aqui apresentados. Vantajosamente, estes membros da família podem 25 ser úteis nos métodos da invenção. Exemplo de outras plantas estão incluídas aqui, mas não limitado a, cevada (Hordeum vulgare) , Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) , milho (Zea mays), algodão (Gossypium), óleo de colza (Brassica napus),

131/218 arroz (Oryza sativa), cana-de-Açúcar (Saccharum officinarum) , Sorgo (Sorgo bicolor) , soja (Glycine max) , girassol (Helianthus annuus), tomate (Lycopersicon esculentum) , trigo (Triticum aestivum) .

As análises acima mencionadas para homologia de sequência podem ser realizadas em uma sequência de longa-metragem, mas também podem ser baseadas em uma comparação de determinadas regiões, tais como domínios conservados. A identificação de tais domínios, também seria bem dentro do domínio da pessoa hábil na arte e que envolvem, por exemplo, um formato legível em computador dos ácidos nucléicos da invenção, a utilização de programas de software de alinhamento e utilização de _informações publicamente disponíveis sobre os domínios da proteína, motivos conservados e caixas. Esta informação está disponível no Prodom (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) bioquímica (ponto) UCL (ponto) uk (ponto) ac/BSM/dbbrowser/protocolo/html (ponto) prodomqry), PIR (Hypertext Transfer Protocol:// PIR (ponto) Georgetown edu (ponto)/) ou Pfam (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (ponto) Sanger (ponto) (ponto) ac uk/Software/Pfam/banco de dados). Programas de análise de sequência projetados para pesquisar o motivo podem ser utilizados para identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados como mencionado acima. Programas de computador preferidos incluem, mas não limitados a, MEME, SIGNALSCAN e GENESCAN.

Uma pessoa hábil na arte pode utilizar as sequências homólogas aqui fornecidas encontrar

132/218 sequências similares em outras espécies e outros organismos.

Homólogos de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas com aminoácidos, com atividade análoga biológica e funcional como a proteína a partir dos quais são derivados. Para produzir tais homólogos, aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outro aminoácido com propriedades semelhantes (mudanças conservadoras, como hidrofobicidade semelhante, quebrar uma estrutura helicoidal ou estruturas de três conhecidas na arte (ver, por exemplo Creighton (1984)

Proteínas. WH Freeman e Company) . Homólogos de um ácido nucléico abrangem ácidos nucléicos com substituições de nucleotídeos, deleções e/ou inserções em relação ao ácido nucléico em questão não modificado e com atividade biológica e funcionais semelhantes, como o ácido nucléico não modificada a partir dos quais são derivados.

Polinucleotídeos polipeptídeos identificados identificados software BLAST com homologia significativa para os descritos na Tabela a partir das bases de utilizando os algoritmos sequências de nucleotídeos de consulta dados

Blastp genes acima foram utilizando e tBlastn.

As foram SEQ ID N°s:

1106 e os homólogos identificados são fornecidos no Tabela

16, abaixo. Estes genes são esperados para aumentar o

133/218 rendimento da planta, rendimento de sementes, produção de óleo, teor de óleo, a taxa de crescimento, biomassa, vigor, ABST e/ou NUE de uma planta.

Tabela 16

Polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos

Polinuc. SEQIDN’:	Nome do Gene	Organismo/nome do grupo	Polipep. SEQIDN’:	Homol. a SEQIDN’:	% Identidade Global	Algor.
203	BDL47 H0	rabanete|gb164|EW717854	524	194	85,15	tblastn
204	BDL48 H0	rabanete|gb164|EW735131	525	107	82,7	blastp
205	BDL62 H0	canola|qb161|CD835773	526	108	94,5	blastp
206	BDL62 H1	rabanete|gb164|EV543949	527	108	94,36	tblastn
207	BDL75 H0	canola|gb1611EE485008	528	109	84,1	blastp
208	BDL83 H0	maçã|gb171 [CN494551	529	112	86,8	blastp
209	BDL83 H1	aquiteqia|qb157.3|DR916286	530	112	85,9	blastp
210	BDL83 H2	artem í s i a|gb 164|EY037407	531	112	86,2	blastp
211	BDL83_H3	b mostarda|gb164|EVGN00808 312601672	532	112	91,7	blastp
212	BDL83 H4	b oleracea|qb161|AM387331	533	112	94,7	blastp
213	BDL83 H5	b rapa|gb162|AY161288	534	112	94,4	blastp
214	BDL83 H6	banana|gb167|AF130251	535	112	85	blastp
215	BDL83 H7	cevada|gb157.31B E420760	536	112	83,4	blastp
216	BDL83 H8	cevada|gb157.3|BG365169	537......	112 ......	82,1 -	blastp-
217	BDL83 H9	bean|gb167|CA896765	538	112	87,1	blastp
218	BDL83 H10	bean|gb167|CB539815	539	112	87,4	blastp
219	BDL83 H11	beterraba|gb162|BE590341	540	112	85,9	blastp
220	BDL83 H12	brachypodium|gb169|BE213261	541	112	85,4	blastp
221	BDL83 H13	brachypodium|gb169IBE419504	542	112	82,7	blastp
222	BDL83 H14	canola|gb161|BNU20179	543	112	94,13	tblastn
223	BDL83 H15	canola|qb161 ICD818253	544	112	94,4	blastp
-224--------	-BDE83-H-16---	-cassava|gb464|DV445-162------	-545-------	-1-1-2------------	-88--------	blastp----
225	BDL83 H17	mamona|gb160|EE256791	546	112	87,4	blastp
226	BDL83 H18	centaurea|gb1661EH734375	547	112	87,7	blastp
227	BDL83 H19	chicória|gb171|EH680019	548	112	88	blastp
228	BDL83 H20	citrus|gb166|CV885954	549	112	89,15	tblastn
229	BDL83 H21	café|gb157.2|DV685589	550	112	87,1	tblastn
230	BDL83 H22	algodão|gb164|AI725778	551	112	86,8	blastp
231	BDL83 H23	algodão|g b 164ICA993334	552	112	88,3	blastp
232	BDL83 H24	fava|gb166|FF537383	553	112	87,7	blastp
233	BDL83 H25	cynara|gb167|GE584395	554	112	84,16	tblastn
234	BDL83 H26	dente-de-leão|gb161 |DY806919	555	112	87,1	blastp
235	BDL83 H27	eucalípto|qb166|CB967649	556	112	88	blastp
236	BDL83 H28	festuca|gb1611DT696580	557	112	82,8	blastp
237	BDL83 H29	genqibre|qb164|DY345757	558	112	86,5	blastp
238	BDL83 H30	uva|gb160|CD008185	559	112	86,8	blastp
239	BDL83 H31	iceplant|gb164|CA833792	560	112	87,1	blastp
240	BDL83 H32	i poméi a |gb 157.2 |C J755528	561	112	86,8	blastp
241	BDL83 H33	alface|qb157.2|AF162206	562	112	87,7	blastp
242	BDL83 H34	leymus|gb166|EG375854	563	112	84	blastp
243	BDL83 H35	eraqrostis|qb167|DN481848	564	112	82,8	blastp
244	BDL83 H36	milho|gb170|BG355384	565	112	83	blastp
245	BDL83 H37	milho|gb170|LLAI603703	566	112	83,5	blastp
246	BDL83 H38	medicago|gb157.2|AL386990	567	112	80,5	blastp
247	BDL83 H39	medicago|gb157.2|AW695293	568	112	84,8	blastp
248	BDL83 H40	mamão|gb165|EX248440	569	112	84,5	blastp
249	BDL83 H41	amendoim|gb171 |EE126296	570	112	86,8	blastp

134/218

Continuação da Tabela 16

250	BDL83 H42	amendoim|gb171 IES752783	571	112	85,9	blastp
251	BDL83.H43	pimenta|gb1711C0907209	572	112	86,8	blastp
252	BDL83 H44	pimenta|gb171IGD064098	573	112	87,4	blastp
253	BDL83 H45	physcomitrella|gb157|BJ157670	574	112	82,4	blastp
254	BDL83 H46	ph yscomi trel I a |g b157|BJ 171093	575	112	83,63	tblastn
255	BDL83 H47	pinho|gb157.2|AW010114	576	112	82,7	blastp
256 . .	BDL83 H48 ..	pinho|qb157.2|CO169305	577	112	86,2	blastp
257	BDL83 H49	álamo|gb170|BI068614	578	112	88	blastp
258	BDL83 H50	álamo|gb170|BU878945	579	112	86,05	tblastn
259	BDL83 H51	batata|qb157.2|BF053889	580	112	86,2	blastp
260	BDL83 H52	prunus|gb167|DW341878	581	112	88,9	blastp
261	BDL83 H53	rabanete|gb164|EV537348	582	112	95	blastp
262	BDL83 H54	rabanete|gb164|EV565372	583	112	94,7	blastp
263	BDL83 H55	arroz|qb170|OS01G64660	584	112	84,5	blastp
264	BDL83 H56	arroz|gb170|OS05G36270	585	112	83,3	blastp
265	BDL83 H57	sorqo|qb161 ,crp|AW566083	586	112	84,8	blastp
266	BDL83 H58	sorqo|qb161.crp|AW671091	587	112	83,6	blastp
267	BDL83 H59	soja|gb168|AL388391	588	112	81,3	blastp
268	BDL83 H60	soja|gb168|BE941320	589	112	86,5	blastp
269	BDL83 H61	soja|gb168|BF636881	590	112	87,1	blastp
270	BDL83 H62	soja|gb168|CD394856	591	112	86,2	blastp
271	BDL83 H63	selaginella|gb165|FE443631	592	112	83,9	blastp
272	BDL83 H64	pícea|gb162|CO227794	593	112	87,4	blastp
273	BDL83 H65	pícea|gb162|CO238226	594	112	83,3	blastp
274	BDL83 H66	spurge|gb161|DV121804	595	112	87,4	blastp
275	BDL83 H67	moranqo|qb164| DY671211	596	112	87,4	blastp
276____;	BDL83_H68	cana-de. açúcar|gb157.3|BQ533620-^— -	597 -j	112_	85,4	blastp
277	BDL83 H69	girassol|gb162|BU672090	598	112	84,2	blastp
278	BDL83 H70	girassol|gb162|CD847711	599	112	87,7	blastp
279	BDL83 H71	panicum|gb167|DN143181	600	112	84,8	blastp
280	BDL83 H72	panicum|gb167|DN148413	601	112	82,4	tblastn
281	BDL83 H73	tomate|qb164|AI486777	602	112	88,3	blastp
282	BDL83 H74	tomate|gb164|BG123415	603	112	85,9	blastp
283	BDL83 H75	triphysaria|gb164|EY166297	604	112	85,9	blastp
284	BDt83 H76---
lllpliybdndiyUIO4|tϊ ΙΟσ/ 1/	uUJ	I IZ		Diasip----
285	BDL83 H77	trigo|gb164|BE213261	606	112	82,8	blastp
286	BDL83..H78	trigo|gb164|BE418868	607	112	82,8	blastp
287	BDL83 H79	trigo|gb164|BE500460	608	112	82,8	blastp
288	BDL118_H0	mamona|gb160|MDL29877M00 0477	609	114	81,4	blastp
289	BDL118 H1	álamo|gb170|A1164922	610	114	81,3	blastp
290	BDL118 H2	álamo|gb170|BI138300	611	114	82	blastp
291	BDL118 H3	soja|gb168|BE658051	612	114	80,1	blastp
292	BDL118 H4	soja|qb168|CB540069	613	114	80	blastp
293	BDL138 H0	canola|gb161|CD817345	614	116	92,5	blastp
294	BDL138 H1	rabanete|qb1641E V536083	615	116	91,8	blastp
295	BDL138 H2	rabanete|qb164|EW725583	616	116	91,1	blastp
296	BDL147 H0	thellungiella|qb167|BY818222	617	118	81,6	blastp
297	BDL149 H0	b rapa|gb162|DY009670	618	119	87,9	blastp
298	BDL149 H1	cano!a|gb161 |CD818601	619	119	88,5	blastp
299	BDL149 H2	fava|gb166|FF400239	620	119	82,4	blastp
300	BDL154 HO	b rapa|qb162|EX046206	621	122	90,77	tblastn
301	BDL154 H1	canola|gb161|CD841052	622	122	92,25	tblastn
302	BDL155 H0	arabidopsis |g b 1651 AT 1G24240	623	123	92,9	blastp
303	BDL155 H1	arabidopsis |g b 165|AT5G11750	624	123	91,7	blastp
304	BDL155 H2	canola|gb161 [EE462449	625	123	81,3	blastp
305	BDL155 H3	rabanete|gb164|EV545009	626	123	80,34	tblastn
306	BDL155 H4	rabanete|gb164|EV569478	627	123	80,4	blastp
307	BDL158 H0	rabanete|gb164|EW715818	628	126	88,46	tblastn
308	BDL160 H0	canola|gb161|EE418738	629	127	83,9	blastp

135/218

Continuação da Tabela 16
309	BDL160 H1	rabanete|qb164|EV545765	630	127	85,1	blastp
310	BDL167 H0	rabanete|qb164|EV535056	631	196	82,7	tblastn
311	BDL168 H0	rabanete|gb164|EV525399	632	132	90,5	blastp
312	BDL171 HO	arabidopsis |qb165|AT2G31580	633	134	84	blastp
313	BDL182 H0	canola|qb161 |CX188804	634	140	87,5	blastp
314	BDL183 H0	arabidopsis|qb165|AT4G15630	635	141	81,6	blastp
315	J3DL183 H1	b rapa|qb162|EE526726	636	141	83,7	blastp
316	BDL183 H2	canola|gb161 |CD811977	637	141	80	blastp
317	BDL183 H3	canola|gb161ICN735162	638	141	83,7	blastp
318	BDL183 H4	canola|gb161 |CN828640	639	141	83,7	blastp
319	BDL183 H5	rabanete|qb164|EW722612	640	141	83,2	blastp
320	BDL183 H6	rabanete|qb164|EX753993	641	141	81,6	blastp
321	BDL183 H7	thellungiella|gb167|BY824379	642	141	80	blastp
322	BDL190 H0	b oleracea|gb161 IAM395197	643	146	84,49	tblastn
323	BDL190 H1	canola|qb161|EE407003	644	146	87,2	blastp
324	BDL190 H2	rabanete|gb164|EV547395	645	146	86,6	blastp
325	BDL190 H3	thellungiella|gb167|BY827749	646	146	89,8	blastp
326	BDL192 H0	canola|qb161 ICD827541	647	147	80,37	tblastn
327	BDL201_H0	b mostarda|gb164|EVGN00584 109703185	648	153	81,8	blastp
328	BDL201 H1	b oleracea|gb161|DY014784	649	153	80,4	blastp
329	BDL201 H2	b oleracea|qb161 |DY015288	650	153	82,2	blastp
330	BDL201 H3	b rapa|gb162|BQ791239	651	153	83,2	blastp
331	BDL201 H4	canola|gb161 IBQ704590	652	153	81,7	blastp
332	BDL201 H5	canola|gb161 |CD822183	653	153	80,8	blastp
333	BDL201 H6	canola|qb161|CD838597	654	153	81,8	blastp
-334	BDL201 H7	.rabanete|qb164|EV527287	655	153	81,6	blastp
-335 ----'	BDL201 H8 —	-rabanete|gb164|EV534907	-656 —--	153 ·-	-81,8 —	blastp
336	BDL201 H9	rabanete|gb164|EV543313	657	153	81,3	blastp
337	BDL201 H10	rabanete|qb164|E V565783	658	153	81,9	blastp
338	BDL201 H11	thellungiella|gb167|BY814893	659	153	83,89	tblastn
339	BDL223 H0	arabidopsis|gb165|AT3G54080	660	159	82,05	tblastn
340	BDL223 H1,	. arabidopsis|qb165|AT3G54085	661	159	82,1	blastp
341	BDL223_H2	b mostarda|gb164|EVGN01441 114591370	662	159	96,15	tblastn
342	BDL223_H3	b mostarda|gb164|EVGN05602 102561055	663	159	85	blastp
343	BDL223 H4	b oleracea|qb161|EE534959	664	159	96,2	blastp
344	BDL223 H5	b oleracea|gb161|ES947677	665	159	94,9	blastp
345	BDL223 H6	b rapa|gb162|EE527700	666	159	96,2	blastp
346	BDL223 H7	canola|gb161 [CD812251	667	159	96,2	blastp
347	BDL223 H8	canola|gb161 [CN734091	668	159	96,15	tblastn
348	BDL223 H9	canola|gb1611DY007214	669	159	96,15	tblastn
349	BDL223 H10	canola|qb161|EG019597	670	159	97,4	blastp
350	BDL223 H11	canola|qb1611ES992154	671	159	97,4	blastp
351	BDL223 H12	canola|qb1611E V087632	672	159	97,4	blastp
352	BDL223 H13	rabanete|qb164|EV524950	673	159	96,15	tblastn
353	BDL223 H14	rabanete|gb164|EY899056	674	159	96,2	blastp
354	BDL229 HO	b rapa|qb162|EX066757	675	160	83,5	blastp
355	BDL229 H1	rabanete|gb164|EW725388	676	160	82,59	tblastn
356	BDL231 HO	arabidopsis | q b1651 AT 1G79470	677	162	84,5	blastp
357	BDL231 H1	canola|gb161|CD826885	678	162	84,7	blastp
358	BDL231 H2	canola|gb161|CD827559	679	162	95,42	tblastn
359	BDL242 H0	rabanete|gb164|EV539529	680	164	85,9	blastp
360	BDL247 H0	b oleracea|qb1611DY026136	681	167	90,82	tblastn
361	BDL247 H1	b rapa|gb162|AY185359	682	167	91,1	blastp
362	BDL247.H2	cano!a|gb161 |CD838112	683	167	89,1	blastp
363	BDL247 H3	canola|gb161|EE455228	684	167	91,1	blastp
364	BDL247 H4	milho|gb170|LLEU940833	685	167	92,8	blastp
365	BDL247 H5	rabanetelqbi 64[E V566311	686	167	92,6	blastp
366	BDL247 H6	thellungiella|gb167|DN773706	687	167	93,08	tblastn

136/218

Continuação da Tabela 16
367	BDL248 H0	arabidopsis|gb165|AT4G37340	688	168	80,6	blastp
368	BDL70 H0	arabidopsis |g b1651 AT 4G25960	689	201	80,6	blastp
369	BDL70 H1	álamo|gb170|CN 192983	690	201	82,8	blastp
370	BDL70 H2	soja|gb168|BE822547	691	201	81,9	blastp
371	BDL70 H3	soja|gb168|CD415929	692	201	81,8	blastp
372	BDL85 H0	b oleracea|gb161 |AM385973	693	175	83,3	blastp
373	BDL85 H1	b rapa|gb162|CV544456	694	175	-83,3.	blastp
374	BDL85 H2	b rapa|gb162|EE523194	695	175	84,7	blastp
375	BDL85 H3	canola|gb161ICD813661	696	175	83,3	blastp
376	BDL85 H4	canola|gb161ICD822271	697	175	84,7	blastp
377	BDL85 H5	canola|gb161|CX280350	698	175	83,3	blastp
378	BDL85 H6	rabanete|gb164|EV527759	699	175	82,2	blastp
379	BDL85 H7	thellungiella|gb167|DN779034	700	175	83,6	blastp
380	BDL88 H0	cevada|gb157.3|BI950587	701	176	82,3	blastp
381	BDL88 H1	cevada|gb157.3|BI955547	702	176	88,6	blastp
382	BDL88 H2	brachypodium|gb169|BE425841	703	176	82,7	blastp
383	BDL88_H3	brachypodiumjgbl 69| BM81709 4	704	176	90	blastp
384	BDL88 H4	festuca|gb161|CK802755	705	176	88,7	blastp
385	BDL88 H5	leymus|gb166|EG378145	706	176	83,2	blastp
386	BDL88 H6	milho|gb170|AI622555	707	176	89,9	blastp
387	BDL88 H7	milho|gb170|AI712236	708	176	89,2	blastp
388	BDL88JH8	milho|gb170|AI855432	709	176	80,7	blastp
389	BDL88_H9	pseudoroegneria|gb167|FF3423 52	710	176	88	blastp
390- - -	BDL88-H10	pseudoroegneria|gb167| FF3424 44 -	711	176	82,3	blastp
391	BDL88 H11	arroz|gb170|OS08G43320	-712 - .	176- — -	-84,5 — -	blastp .
392	BDL88 H12	sorgo|gb161.crp|AW562977	713	176	81,4	blastp
393	BDL88 H13	sorgo|gb161 ,crp| B E129901	714	176	91,1	blastp
394	BDL88_H14	cana-de- açúcar|gb157.3|SCFMEMPRO	715	176	91,4	blastp
395 ~ ~	BDL88’.H15	‘panicum|gb167|DN144780 - -	716 . .	176	91,7	blastp
396	BDL88 H16	panicum|gb167|FE629824	717	176	92	blastp
-397---------	-BDL88-H1-7	trigo|gbl64|BE406463	718	176	88	blastp
398	BDL88 H18	trigo|gb164|BE425841	719	176	82--------	blastp----
399	BDL88 H19	trigo|gb164|BF474328	720	176	81,2	blastp
400	BDL88 H20	trigo|gb164|BQ484144	721	176	87,7	blastp
401	BDL88 H21	trigo|gb164|CA599299	722	176	88	blastp
402	BDL94 H0	arroz|gb170|OS01G09220	723	177	96,7	blastp
403	BDL102 H0	avocado|gb164|CK767108	724	178	80,69	tblastn
404	BDL102 H1	banana|gb167| FL650176	725	178	82,8	blastp
405	BDL102 H2	banana|gb167|FL657720	726	178	80,4	blastp
406	BDL102 H3	banana|gb167| FL658383	727	178	83,4	blastp
407	BDL102 H4	cevada|gb157.3|BE215743	728	178	84,83	tblastn
408	BDL102 H5	cevada|gb157.3|BE411917	729	178	85,2	blastp
409	BDL102 H6	cevada|gb157.3|BF627967	730	178	82,76	tblastn
410	BDL102 H7	brachypodium|gb169|BE398478	731	178	83,7	blastp
411	BDL102 H8	brachypodiumjgbl 69 [ BE399017	732	178	87,6	blastp
412	BDL102 H9	brachypodium|gb169|BE423566	733	178	85,5	blastp
413	BDL102 H10	cenchrus|gb1661E B655509	734	178	89	blastp
414	BDL102 H11	chicória|gb171 |DT211967	735	178	80,1	blastp
415	BDL102 H12	chicória|gb171|EH700664	736	178	80	blastp
416	BDL102 H13	citrus|gb166|BE208879	737	178	80	blastp
417	BDL102 H14	trevo|gb162|BB906663	738	178	80	blastp
418	BDL102 H15	fava|gb166|FC462243	739	178	80,7	blastp
419	BDL102 H16	dente-de-leão|gb161 |DY813750	740	178	80,7	blastp
420	BDL102 H17	festuca|gb161|DT685902	741	178	85,6	blastp
421	BDL102 H18	gengibre|gb164|DY369602	742	178	80,7	blastp
422	BDL102 H19	ipoméia |gb 157.21B J557023	743	178	80	tblastn
423	BDL102 H20	ipoméia|gb157.2|BU690707	744	178	80	tblastn

137/218

Continuação da Tabela 16
424	BDL102 H21	alface|gb157.2|DW044786	745	178	80	blastp
425	BDL102 H22	alface|gb157.2|DW050757	746	178	80	tblastn
426	BDL102 H23	alface|gb157.2|DW108809	747	178	81,38	tblastn
427	BDL102 H24	alface|gb157.2|DW108810	748	178	80	tblastn
428	BDL102 H25	alcaçuz|gb171|FS238664	749	178	80,7	blastp
429	BDL102 H26	alcaçuz|gb171|FS241892	750	178	80	tblastn
430	BDL102 H27	liriodendron|gb166|CK766596	751	178	83,4	blastp
431	BDL102 H28	lótus|gb157.2|AW720301	752	178	82,1	blastp
432	BDL102 H29	lótus|gb157.2|CN825142	753	178	81,5	blastp
433	BDL102 H30	eragros tis |gb 167|EH 188388	754	178	88,97	tblastn
434	BDL102 H31	milho|gb170|AI391795	755	178	95,2	blastp
435	BDL102 H32	milho|gb170|LLBE510254	756	178	95,2	blastp
436	BDL102 H33	melão|gb165|DV632852	757	178	80	tblastn
437	BDL102 H34	pa i nço |gb 1611C D725312	758	178	85,7	blastp
438	BDL102 H35	nuphar|gb166|CV003178	759	178	81,4	blastp
439	BDL102 H36	oat|gb164|CN815719	760	178	91,03	tblastn
440	BDL102 H37	oil palm|gb166|EL681098	761	178	86,21	tblastn
441	BDL102 H38	oil palm|gb166|EL682630	762	178	84,1	blastp
442	BDL102 H39	oil palm|gb166|EL684119	763	178	82,1	blastp
443	BDL102 H40	cebola|gb162|CF446214	764	178	80,4	blastp
444	BDL102 H41	mamão|gb165|EX258155	765	178	80,7	blastp
445	BDL102 H42	abacaxi|gb157.2|DT336701	766	178	84,8	blastp
446	BDL102 H43	abacaxi|gb157.2|DT338401	767	178	84,8	blastp
447	BDL102 H44	papaveralis |gb166|FE964559	768	178	80	tblastn
448	BDL102 H45	arroz[gb170|OS03G31090	769	178	93,8	blastp
449	BDL102 H46	centeio|gb164|BE637001	770	178	85,2	blastp
. 450	BDL102.H47	sõrgo|gb161 .crp|AI673920	77T	178 -	96,6	-blastp
451	BDL102 H48	sorgo|gb161.crp|AW747023	772	178 —' '	83,3 —··	blastp—
452	BDL102 H49	soja|gb168|AA661036	773	178	80	blastp
453	BDL102 H50	soja|gb168|AW720301	774	178	80	tblastn
454	BDL102_H51	cana-de- açúcar|gb157.3|CA076952	775	178	96,6	blastp
455	BDL102_H52	cana-de- - — -- açúcar|gb157.3|CA087422	776	178 “ -	96;6 *	blastp
“455	ΚΠΓίΐϊ7~ΙΨΗ--	cana-de-	Ύ77	17Λ	Q7 9
		açúcar|gb157.3|CA103720
457	BDL102_H54	cana-de- açúcar|gb157.31C A113942	778	178	84,25	tblastn
458	BDL102_H55	cana-de- açúcar|gb157.3|CA114406	779	178	97,2	blastp
459	BDL102_H56	cana-de- açúcar|gb157.3|CA116867	780	178	87,6	blastp
460	BDL102_H57	cana-de- açúcar|gb157.3 [CA119956	781	178	90,34	tblastn
461	BDL102_H58	cana-de- açúcar|gb157.3|CA128680	782	178	86,9	blastp
462	BDL102_H59	cana-de- açúcar|gb157.3|CA139681	783	178	84,3	blastp
463	BDL102_H60	cana-de- açúcar|gb157.3|CA151882	784	178	93,1	tblastn
464	BDL102_H61	cana-de- açúcar|gb157.3|CA153401	785	178	96,6	blastp
465	BDL102_H62	cana-de- açúcar|gb157.31C A193794	786	178	97,2	blastp
466	BDL102_H63	cana-de- açúcar|gb157.31C A215946	787	178	80	blastp
467	BDL102_H64	cana-de- açúcar|gb157.3|CA235573	788	178	80,3	blastp
468	BDL102_H65	cana-dè- açúcar|gb157.3|CA241742	789	178	82,76	tblastn
469	BDL102_H66	cana-de- açúcar|gb157.3|CA289186	790	178	95,2	blastp

138/218

Continuação da Tabela 16
470	BDL102_H67	cana-de- açúcar|gb157.3|CF571967	791	178	93,79	tblastn
471	BDL102 H68	cana-de-açúcar|gb157.3|CF574520	792	178	97,2	blastp
472	BDL102 H69	girassol|gb162|CD848588	793	178	80	blastp
473	BDL102 H70	girassol|gb162|CD850971	794	178	80,7	blastp
474	BDL102 H71	panicum|gb1671DN142384	795	178	95,9	blastp
475	BDL102 H72	panicum|gb167|FE598349	796	178	96,6	blastp
476	BDL102 H73	panicum|gb167|FE608943	797	178	96,6	blastp
477	BDL102 H74	panicum|gb167|FE642870	798	178	96,6	blastp
478	BDL102.H75	panicum|gb1671FL710664	799	178	95,2	blastp
479	BDL102 H76	chá|qb171|FE861343	800	178	80,14	tblastn
480	BDL102 H77	nozes|gb166|CV195103	801	178	80,7	blastp
481	BDL102 H78	nozes|gb166|CV196374	802	178	80,7	blastp
482	BDL102 H79	trigo|gb164|BE398202	803	178	85,2	blastp
483	BDL102 H80	trigo|gb164|BE406254	804	178	85,2	blastp
484	BDL102 H81	trigo|gb164|BE414893	805	178	85,2	blastp
485	BDL102 H82	trigo|gb164|CA485952	806	178	96,6	blastp
486	BDL102 H83	trigo|gb164|CA486424	807	178	93,8	blastp
487	BDL226 H0	canola|gb161|CD835072	808	181	89,5	blastp
488	BDL226 H1	rabanete|gb164|EV568139	809	181	91,7	blastp
489	BDL233.H0	rabanete|gb164|EV549343	810	185	84,5	blastp
490	BDL237 H0	arabidopsis|gb165|AT2G44890	811	187	86,3	blastp
491	BDL238 H0	arabidopsis jgb 1651 AT 1G32763	812	202	81,5	blastp
492	BDL240 H0	mamona|gb160|MDL30174M008707	813	189	82,4	blastp
493	BDL240 H1	algodão|gb164|BG446934	814	189	81,4	blastp
494	BDL240 H2	soja|gb168|AW329693	815	189	80,7	blastp
495- =	- BDL240..H3 . ?	: so(ã|gb168|BE329627	816	189	80,1	blastp
496	BDL241 H0	canola|gb161|CN825973 “	817 — ’	190 ——	85,3 — -	blastp - -
497	BDL249 H0	rabanete|gb164|EW735252	818	191	86,7	blastp
498	BDL251 H0	arabidopsis|gb165| AT5G23190	819	192	80,07	tblastn
499	BDL252 H0	maçã|gb171|CN489978	820	193	80,9	blastp
500	BDL252 H1	maçã|gb171|CN883406	821	193	80,9	blastp
501	’B'DL252 H2 ‘	bjapa|gb162|EX036871 - -	822 - ,	193	91	blastp
502	BDL252 H3	cacao|gb167|CU476642	823	193	84,3	blastp
503---------	-BDL-252 H4---	-canola|gbl61|CN732395	824	193	90,6	blastp
504	BDL252 H5	canola|gb161|ES900668	825	193	86,2	blastp
505	BDL252 H6	mamona|gb160|MDL29726M003996	826	193	81,4	blastp
506	BDL252 H7	citrus|gb166|CB417408	827	'193	82,8	blastp
507	BDL252 H8	algodão|gb164|AI725830	828	193	82,8	blastp
508	BDL252 H9	algodão|gb164|CO094656	829	193	82,5	blastp
509	BDL252 H10	fava|gb166|FC458375	830	193	80,5	blastp
510	BDL252 H11	uva|gb160|CB920145	831	193	80,5	blastp
511	BDL252 H12	ipoméia|gb157.2|AU223826	832	193	80,2	blastp
512	BDL252 H13	alface|gb157.2|DW116753	833	193	80,22	tblastn
513	BDL252 H14	medicago|gb157.2|AL371996	834	193	80,9	blastp
514	BDL252 H15	pêssego|gb157.2|BU039377	835	193	82,4	blastp
515	BDL252 H16	álamo|gb170|BU816161	836	193	80,7	blastp
516	BDL252 H17	prunus|gb167|BU039377	837	193	82,4	blastp
517	BDL252 H18	rabanete|gb164|EV535608	838	193	92,1	blastp
518	BDL252.H19	rabanete|gb164|EW723334	839	193	91,8	blastp
519	BDL252 H20	soja|gb168|BF636462	840	193	80,1	blastp
520	BDL252 H21	soja|gb168|BU546186	841	193	82,4	blastp
521	BDL252 H22	soja|gb168|CD390334	842	193	82,4	blastp
522	BDL252 H23	morango|gb164|CX661379	843	193	82	blastp
523	BDL252 H24	thellungiella|gb167|BY812142	844	193	92,1	blastp

Tabela 15: São fornecidos polinucleotídeos e polipeptídeos que são homólogos aos polinucleotídeos identificados ou polipeptídeos da Tabela 15. Homol. Homóloga =; Algor.=

139/218

Algoritmo;

EXEMPLO 7

GENE E GERAÇÃO DE CLONAGEM DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO EM PLANTAS

Para validar seu papel na melhoria do teor de óleo, produtividade por planta, rendimento de grãos, a biomassa, a taxa de crescimento, ABST, NUE e/ou o vigor, os genes selecionados foram mais expressos em plantas, como se segue.

Estratégia de Clonagem

Os genes listados nos Exemplos e 6 supracitados foram clonados em vetores binários para a ⁼ geração ~de plantas transçênicas.— Para a- clonagem,—o quadro de leitura aberto (ORF) de longa-metragem foi identificado 15 pela primeira vez. Em caso de grupos ORF-EST e em alguns casos já publicados de sequências de mRNA foram analisadas para identificar todo o quadro de leitura aberto, comparando os resultados dos algoritmos de tradução para várias proteínas conhecidas de outras espécies vegetais. Para 20 clonar os cDNAs completos, transcrição reversa (RT), seguida pela reação em cadeia da polimerase (PCR, RT-PCR) foi realizada ou outros

RNA total no RNA total extraído de folhas, flores, tecidos vegetais, foi extraído como descrito no Exemplo 2.

silíquas normais.

de amplificação do DNA e

PCR foi realizada utilizando protocolos padrões descritos em outras

E.F. Fritsch, e T. Maniatis. 1989.

Molecular Cloning. A

Laboratory Manual., 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory

140/218

Press, New York.) que são bem conhecidas por aqueles hábeis na arte. Os produtos da PCR foram purificados utilizando um kit PCR de purificação (Qiagen). Em caso dêem que toda a sequência de codificação não foi encontrada, o kit RACE da Ambion, Clontech ou Invitrogen [RACE = R apid A ccess to cDNA E nds] (Acesso Rápido aos Fins do cDNA) foi utilizado para acessar a transcrição completa do DNA do gene do RNA das amostras acima descritas. O procedimento RACE foi realizado para o BDL197 genes (SEQ ID N° : 46) , BDL156 (SEQ

ID N° : 19), BDL169 (SEQ ID N°: 28) , BDL189 (SEQ ID N°: 40),

BDL200 (SEQ ID N°: 47), BDL79 (SEQ ID N°: 5), BDL231 (SEQ ID

N° : 57), BDL238 (SEQ ID N° : 84) e BDL248 (SEQ ID N° : 103) “utilizando as sequências iniciadoras -listadas -na Tabela 17., abaixo. Produtos RACE foram clonados em vetor de cópia de 15 alta, seguida de sequenciação ou diretamente sequenciado. Produtos RACE foram sequenciados na forma abaixo descrita para os genes especificados na Tabela 17.

As informações do processo

RACE foram utilizadas para a clonagem do comprimento total

ORF dos genes correspondentes.

Tabela 17

Iniciadores RACE utilizados para o sequenciamento dos genes

identificac	os da invenção
Nome do Gene	Primers utilizados para amplificação	Cópia de alta plasmídeo utilizado para clonagem de produtos RACE
BDL197_5'Race	BDL197 NGSP1 R2 (SEQ ID N°:934) (CGCCTGAAGCTTCTCCGAGAAC)	TopoTA
BDL156_5'Race	BDL156 NGSPí R (SEQ ID N°:937) (ACGGTGTTTCCAGAATTTCGCAG)

141/218

Continuação da Tabela 17
BDL156_3'Race	BDL156 NGSP2 F (SEQ ID N°:938) (CTGAATGTGACTGGGATATGTCGG)	TopoTA
BDL169_5’Race	BDL169 NGSP1 R (SEQ ID N°:939) (TGCACTGGAGCGTGTAGGGACAG)
BDL169_3'Race	BDL169 NGSP1 F (SEQ ID N°:940) (GGCAGAAACTGTTTTATGGAAATGG)
BDL189_5'Race	BDL189 NGSP1 R (SEQ ID N°:941) (TTCTGTCCCTCGACCAAGGTTG)	TopoTA
BDL189_3'Race	BDL189 GSP2 F (SEQ ID N°:942) (CAGTCAATCTTCTTAGCATCGCTGAG)
BDL200_5'Race	BDL200 NGSP Rb (SEQ ID N°:943) (CCAATGCCAATACGATGGTCGG)	TopoTA
BDL200_3’Race	BDL200 NGSP2 F (SEQ ID N°:944) (GAGCTTTGGAGATAAGATTGGTGCAG)
BDL79_5'Race	BDL79 GSP1 R (SEQ ID N°:945) (GTATCACTCGAGGCACCATTGGG)	TopoTA
BDL231_3'Race	BDL231 NGSP R (SEQ ID N°:946) (ATGTGGGATTCCGAGACAGTGTCC)	TopoTA
BDL238_5'Race	BDL238 NGSP R (SEQ ID N°:947) (TTTACCGTCCCCAAACGTTGCCG)
BDL238_3'Race	BDL238 NGSP F (SEQ ID N°:948) (CTCATCCGGACGATGTCTTACTTCTTCTCC)
BDL248_5'Race	BDL248 NGSP R (SEQ ID N°:949) (GAGGTGACCGATCACTGGTAACGC)
BDL215-5'Race	BDL215 NGSP1 R (SEQ ID N°:950) (TGGCTTTGAAAACGTAACATGCC) ~
BDL215_3'Race	BDL215 NGSP2 F (SEQ ID ~ N°:951) (TATTGGGATTTTCGGATCGATGG)	TopoTA

Tabela 17. São fornecidos os iniciadores PRC utilizados para sequenciamento RACE. Fwd = iniciador avançado; Rev = iniciador reverso;

No caso o DNA genômico foi 5 clonado, como no caso de BDL90 e BDL94 os genes foram amplificados por PCR direto sobre o DNA genômico extraído de tecido foliar com o kit DNAeasy (Cat Qiagen. N°69.104).

Geralmente, dois conjuntos de iniciadores foram sintetizados para a amplificação de cada 10 gene do DNA de um ou de uma sequência genômica; um conjunto de iniciadores externos e um conjunto interno (iniciadores aninhados). Quando necessário (por exemplo, quando a primeira reação de PCR não resultar em um produto satisfatório para o sequenciamento), um iniciador adicional

142/218 (ou dois) dos iniciadores PCR aninhados foram utilizados.

Tabela 18 abaixo apresenta os iniciadores utilizados para clonagem de genes selecionados.

Tabela 18

Os iniciadores PCR utilizados para a clonagem dos genes da invenção

Nome do Gene	Enzimas de Restrição utilizadas para clonagem	Primers utilizados para amplificação
BDL102	Sall, Xbal	BDL102 NF Sall(SEQ ID N°:952) AATGTCGACTACCTGCCTTTCTCTCGTCC
BDL102 EF Sall(SEQ ID N°:953) AAAGTCGACACTCTACCTGCCTTTCTCTCG
BDL102 NR Xbal(SEQ ID N°:954) ATTCTAGACTATGTAGCCATCTCAACAATCAAAC
BDL102_ER_Xbal(SEQ ID N°:955) ATTCTAGAGGTTTTGATAAATAGGTACTCAGG
BDL117		BDL117 EF Smal(SEQ ID N°:956) CCCCGGGTCTCGGAGGTATCTTATTCCAG
BDL117 ER Smal(SEQ ID N°:957) CCCCGGGATGCCACACTTAAGGCCAAG
BDL118 '	Smal, Smal ~ ~	. BDLH8LNFiSmal(SEQ ID N°:958) TCCCGGGTCTGGGTCTACTTTTGATTTGAG
BDL118 NR Smal(SEQ ID N°:959) TCCCGGGTGAAGCAGAAGTTTCGATTTAAG - (
BDL138	Sall, Xbal	BDL138 NF Sall(SEQ ID N°:960) AAAGTCGACCGAATCGTAATTGTTGAAGAGAG .
BDL138 EF Sall(SEQ ID N°:961) ATTGTCGACTTTAAGGAGAAGAGTCGCAGTC
BDL138 NR Xbal(SEQ ID N°:962) ATTCTAGATTAGAGAGTGGTTGATAACGCAGAG
BDL138lER Xbal(SEQID N°:963) ACTCTAGACTACCTGTCACAATTTTCTAAAACAC
		BDL140 NF Xbal(SEQ ID N°:964) TATCTAGATTGAGAATGAACTCAGTGTGTATC
BDL140	Xbal, Saci	BDLi40“EFh(bal(SEQ-tD-Nh965)-AATGTAGAAACIAAACATTGAGAATGAACTCAG
BDL140 NR Sacl(SEQ ID N°:966) TGAGCTCTTAAGTCATTTAGTTTGGATCAACAAC
BDL140 ER Sacl(SEQ ID N°:967) CGAGCTCAGACCATGCATTTAAGGATCAC
BDL147	Sall, Xbal	BDL147 NF Sall(SEQ ID N°:968) TTAGTCGACCACAGTAACCATGTCCGTCTC
BDL147 NR Xbal(SEQ ID N°:969) TATCTAGAGTGCTGCTTACTCGCTGTTTC
BDL149	Sall, Xbal	BDL149 NF Sall(SEQ ID N°:970) AAAGTCGACCTCAAACCCAAGAACCTCATC
BDL149 NR Xbal(SEQ ID N°:971) ATTCTAGATGCAATAGTAGTAGCAGTGAACC
BDL152	Xbal, Saci	BDL152 NF Xbal(SEQ ID N°:972) TATCTAGATTCAGACAAAAACAGAGAGAAACT
BDL152 NR Sacl(SEQ ID N°:973) TGAGCTCCTAAGATCGGTTTAATCAATAGGG
BDL153	Sall, Smal	BDL153 NF Sall(SEQ ID N°:974) AAAGTCGACAACAGCTTCGGTTTAAGAGTTC
BDL153 NR Smal(SEQ ID N°:975) TCCCGGGTCTACATTACGGCATACGGC
BDL154	Sall, Saci	BDL154 NF Sall(SEQ ID N°:976) TTAGTCGACTTAAAAATGGAGAGTCAAAAGC
BDL154 NR Sacl(SEQ ID N°:977) TGAGCTCCTACTACTTCTTGTTGATGCTGAGG
BDL155	Sall, Xbal	BDL155 NF Sall(SEQ ID N°:978) AATGTCGACTCCTCTTGCGGAGAGATGC
BDL155 NR Xbal(SEQ ID N°:979) ATTCTAGATCTCCTTTTGAGAGAGTGCAAC
BDL156	Sall, Xbal	BDL156 NF Sall(SEQ ID N°:980) AATGTCGACTCGTCGTCTTCCTCATTTCG
BDL156 ER Xbal(SEQ ID N°:981) ATTCTAGACTAATACGATTGGTAACAAGAAAACG
BDL157	Sall, Xbal	BDL157 NF Sall(SEQ ID N°:982) ATTGTCGACTTTCAATAAGAAATCTGCGTCC
BDL157 EF Sall(SEQ ID N°:983) AAAGTCGACGAATCTGCTTTTAAGCTTCTCG
BDL157 NR Xbal(SEQ ID N°:984) ATTCTAGACTAAAGAGAGTGAAGGAACAAAGACC
BDL157 ER Xbal(SEQ ID N°:985) ATTCTAGACTATTTTCTTCTGTCTTCTGTGTCTTC

143/218

Continuação da Tabela 18
BDL158		BDL158 EF Xbal(SEQ ID N°:986) AATCTAGACCTCACTTCTCTCTCTCTCTCTTC
BDL158 ER Smal(SEQ ID N°:987) CCCCGGGAGCCTAAAGCCTAACCCAAC
BDL160	Sall, Xbal	BDL160 NF Sall(SEQ ID N°:988) AAAGTCGACTGATCTACACAGAATCCATTTCC
BDL160 NR Xbal(SEQ ID N°:989) AATCTAGATCATTCAGCCATTCACATTTTAGG
BDL162	Sall, Xbal	BDL162 NF Sall(SEQ ID N°;990) TTAGTCGACCCTAATAATGGCTTGCAGAGC
BDL162 NR Xbal(SEQ ID N°:991) TATCTAGAAAATCTTGAGACTAAATCAAGCTG
BDL167	Sall, Xbal	BDL167 NF Sall(SEQ ID N°:992) AAAGTCGACGCAAGAAAGGGACTAACCAAG
BDL167 NR Xbal(SEQ ID N°:993) ACTCTAGACTATGTCGGCATTAACTTAGAATCAC
BDL168	Xbal, Smal	BDL168 NF Xbal(SEQ ID N°:994) AATCTAGACTTGCTTCAAGATTCGAGTGAG
BDL168 EF Xbal(SEQ ID N°:995) AATCTAGAATTAACCACCATTTCTGTGAAG
BDL168 NR Smal(SEQ ID N’:996) TCCCGGGCTACCTTCCTTCTTCTTCACTTCC
BDL168 ER Smal(SEQ ID N°:997) TCCCGGGTCCTAAAAGTCAGTCACCTTCTG
BDL169	Sall, Xbal	BDL169 NF Sall(SEQ ID N°:998) AAAGTCGACGAAGGTGAAGTGATGGATTCTG
BDL169 EF Sall(SEQ ID N°:999) AATGTCGACTGTTACCGATAAGAAGGTGAAG
BDL169 NR Xbal(SEQ ID N°:1000) ATTCTAGACTAACAGCTTCAACGTAATTTGGTG
BDL169 ER Xbal(SEQ ID N°:1001) ATTCTAGATCAACGTCATTTTGTGCATATC
BDL173	Xbal, Smal	BDL173 EF Xbal(SEQ ID N°:1002) ATTCTAGATTTTCCCGAATCTATTCATCAC
BDL173 ER Smal(SEQ ID N°:1003) CCCCGGGAACGCTTCACCCTTTAATCC
BDL174	Sall, Saci	BDL174 NF Sall(SEQ ID N°:1004) AAAGTCGACCCGAGGAAGATGACGACAC
BDL174 NR Sacl(SEQ ID N°:1005) TGAGCTCCTAGTTTCAAGCAAGAGTGATTCC
BDL176	Smal, Smal	BDL176 NF Smal(SEQ ID N°:1006) TCCCGGGTATTGAGCAGCCGTGAAATC
BDL176 NR Smal(SEQ ID N°:1007) TCCCGGGTGGACCAAAGAATCAAATAGTAAC
BDL177	Sall, Saci	BDL1772NF2Sall(SEQ ID N°:1008) AÃTGTCGÁCTCAGGATCTATGGGCAAGTC
BDL177 EF Sall(SEQ ID N°:1009) AAAGTCGACGCTTGTGATCAGGATCTATGG
BDL177 NR Sacl(SEQ ID N°:1010) TGAGCTCCTAAACAGCTTTCTTCTACTCTTCATC
BDL177 ER Sacl(SEQ ID N°:1011) CGAGCTCACAGAAAACAAAAGAAACTAGGC
BDL181	Sall, Saci	BDL181_NF_Sall(SEQ ID Ν’: 1012) AAAGTCGACGCGATAGATCTGACGAATGC = -
BDL181 NR Sacl(SEQ ID N°:1013) TGAGCTCCTAGATTTCATACTCAGGAAGCCAC
BDL182	Sall, Saci
BDL182 NR Sacl new(SEQ ID N°:1015) TGAGCTCCTACATTCACAACAAACCACCACTAC
BDL183	Sall, Xbal	BDL183 NF Sall(SEQ ID N°:1016) AATGTCGACTTATTTTGATCTTCCTCACTTCTG
BDL183 EF Sall(SEQ ID N°:1017) AAAGTCGACGATCAATCTTTGTTATCTCTCACTC
BDL183 NR Xbal(SEQ ID N°:1018) ATTCTAGACTAATCACACAAAACGACAAGAACAG
BDL183 ER Xbal(SEQ ID N°:1019) ACTCTAGAACGATGTGATAAAACATTAGAAGC
BDL186	Sall, Xbal	BDL186 NF Sall(SEQ ID N°:1020) AAAGTCGACCGAAGTGAAAGTCGTGATGG
BDL186 EF Sall(SEQ ID N’:1021) AAAGTCGACACGCAAACGTGATCCTAAAC
BDL186 NR Xbal(SEQ ID N°:1022) ATTCTAGACTCAAGGGGACGAGATATCAG
BDL186 ER Xbal(SEQ ID N°:1023) ACTCTAGAAGGTAGAGAGCATCAAGGAAGC
BDL187	Sall, Smal	BDL187 NF Sall(SEQ ID N°:1024) ATAGTCGACATTCTTTCAGTTTTCCGGTG
BDL187 EF Sall(SEQ ID N°:1025) AAAGTCGACGCTTGAATTCTTTCAGTTTTCC
BDL187 NR Smal(SEQ ID N°:1026) TCCCGGGCTATTTTCACCAGTAATTTCCACAC
BDL187 ER Smal(SEQ ID N°:1027) TCCCGGGTTACTTTAGCCACAATCTGTGTTTTC
BDL188	Xbal, Smal	BDL188 NF Xbal(SEQ ID N°:1028) AATCTAGAATTTTCATTTGTTCGCTTCG
BDL188 NR Smal(SEQ ID N°:1029) TCCCGGGCTAACAGTAGGTAATTTTGACATCCAG
BDL189		BDL189 NF Smal(SEQ ID N°:1030) ACCCGGGCATTGCCTGTTGGCTTCG
BDL189 NR Smal(SEQ ID N°:1031) ACCCGGGTTACAATACAATTGTTTAATTCGAGG
BDL190	Sall, Xbal	BDL190 NF Sall(SEQ ID N°:1032) TTAGTCGACAAAATAATGGCAGCTTTGGC
BDL190 EF Sall(SEQ ID N°:1033) TTAGTCGACTCTCGTCACATATCTTCATCGAC
BDL190 NR Xbal(SEQ ID N’:1034) TATCTAGACTACTAGACAAATTTGTTGATCAATTC
BDL190 ER Xbal(SEQ ID N°:1035) TATCTAGACTAAAGAGAGAACTAGACAAATTTGTTG

144/218

Continuação da Tabela 18
BDL192	Sall, Xbal	BDL192 NF Sall(SEQ ID N°:1036) ATTGTCGACTTTACGAAATACGCCGAATC
BDL192 EF Sall(SEQ ID N°:1037) AATGTCGACTTCGAAACCCTAACAAAAGC
BDL192 NR Xbal(SEQ ID N°:1038) ACTCTAGAATCTGCATAGCAGTTAGAACAAG
BDL192 ER Xbal(SEQ ID N°:1039) ATTCTAGAGAAAGGTCCTCATTCATAATCC
BDL193	Xbal, Saci	BDL193 EF Xbal(SEQ ID N°:1040) AATCTAGACTTCATATTCAAATCTCCTCTCC
BDL193 ER Sacl (SEQ ID N°:1041) CGAGCTCATCACAAACAAACCTAAGAGGC---------------
BDL194	EcoRV, EcoRV	BDL194 NF EcoRV(SEQ ID N°:1042) AAGATATCAGCCATTGTTCTTCATCATCTC
BDL194 NR EcoRV(SEQ ID N°:1043) ACGATATCCTAACAGGGTTTTCAGTGCTGTG
BDL196	Sall, Xbal	BDL196 NF sall(SEQ ID N°:1044) TTAGTCGACAAGACATGAAGTTCATGACACTAATG
BDL196 EF Sall(SEQ ID N°:1045) TTAGTCGACAACTGAAACAAAAGAAGAGTCATC
BDL196_NR_Xbal(SEQ ID N°:1046) TATCTAGATTATGAGCTTTAACAACTAGTATAAGGAAC
BDL196 ER Xbal(SEQ ID N°:1047) TATCTAGACACCACAATTTTAAGCTTCAAC
BDL197	Sall, Xbal	BDL197 NF Sall(SEQ ID N°:1048) AAAGTCGACTGTTCTTGTTCTTCACGATGAG
BDL197 EF Sall(SEQ ID N°:1049) AAAGTCGACTCTAAATCCTATGTTCTTGTTCTTC
BDL197 NR Xbal(SEQ ID N°:1050) AATTCTAGAGGTTCAAAATACGTAACACATTG
BDL197 ER Xbal(SEQ ID N°:1051) AACTCTAGAACCATATTAGGTTCAAAATACGTAAC
BDL201	Sall, Xbal	BDL201 NF Sall(SEQ ID N°:1052) AAAGTCGACCGATCAACAGACTCTAATCAGC
BDL201 NR Xbal(SEQ ID N°:1053) ATTCTAGATTAGTTCTATACTGCAGATTCTTGGG
BDL203	Sall, Xbal	BDL203 NF Sall(SEQ ID N°:1054) AATGTCGACTTCTCTCTGTTCTTGCACTCG
BDL203 EF Sall(SEQ ID N°:1055) AAAGTCGACCTTCTTCTTCTTTTCTCAATCTTTC
BDL203 NR Xbal(SEQ ID N°:1056) ATTCTAGATCTGTATCATTAAAACTGAGGAAG
BDL203 ER Xbal(SEQ ID N°: 1057) ATTCTAGAGTGGCGAGACAACATTTCTAC
BDL220	Sall, Xbal	BDL220 NF Sall(SEQ ID N°:1058) AAAGTCGACCTCTCTCTCTCTAATGGGTAATTG
BDL220 EF Sall(SEQ ID N°:1059) AATGTCGACTCACCACACAACACAACCAAG
BDL220 NR Xbal(SEQ ID N°:1060) ACTCTAGAAATCCAACGTCAAATGAGAAG
BDL220 NF Sall(SEQ ID N°:1061) AAAGTCGACCTCTCTCTCTCTAATGGGTAATTG
BDL221	Sall Xbal	' BDL221 NF Sall(SEQ ID N°: 1062) AATGTCGACTTGGATCAGAGAAAATATGTCG
BDL221 EF Sall(SEQ ID N°:1063) ATAGTCGACCTTGAATCTGAAGCTAATCTTGG
		BDt221_I^Xbat(SE(rtO1^t064)A1TCTAGATrAGCATTAGAACGGGAQAGTATAAG----
BDL221 ER Xbal(SEQ ID N°:1065) ACTCTAGATCAAAGAATCGAGCATTAGAACGG
BDL222	Sall, Xbal	BDL222 NF Sall(SEQ ID N°:1066) AAAGTCGACCTAAACCGGTAAAAGATGTCG
BDL222 EF Sall(SEQ ID N°:1067) AACGTCGACACTTTTGTTTTGCCTTTCCTC
BDL222 NR Xbal(SEQ ID N°:1068) ATTCTAGATCTTCTTCATCACTCAATCGC
BDL222 ER Xbal(SEQ ID N°:1069) ATTCTAGACTGTGGTATTTAGGGAATACATCC
BDL223	Sall, Xbal	BDL223 NF Sall(SEQ ID N°:1070) AAAGTCGACCACAGAGAAATCATGGGGTTC
BDL223 EF Sall(SEQ ID N°:1071) AACGTCGACAGATATCGTTGGCTTCGTCTC
BDL223 NR Xbal(SEQ ID N°:1072) ATTCTAGATTAGGTTTGATCATTTTAACCAGAG
BDL223 ER Xbal(SEQ ID N°:1073) ATTCTAGACTATGCAGAAATGTTTGGATTGAG
BDL224	Xbal, Smal	BDL224 NF Xbal(SEQ ID N°:1074) AATCTAGACCACAAAATTCGTCAAAGCTC
BDL224 EF Xbal(SEQ ID N°:1075) ATTCTAGATTTTCAAACCACAAAATTCGTC
BDL224 NR Smal(SEQ ID N°:1076) CCCCGGGATCCAACCAATCCCTAAAATG
BDL224 ER Smal(SEQ ID N°:1077) CCCCGGGATCAGCCACTTCTACTCTCAATTC
BDL225	Sall, Xbal	BDL225 NF Sall(SEQ ID N°:1078) AATGTCGACTCCTTGTGATTCATTATTTTGC
BDL225 EF Sall(SEQ ID N°:1079) AAAGTCGACCAACATCTCCTCCAAAACATTC
BDL225 NR Xbal(SEQ ID N°:1080) ACTCTAGATTAGCAAGAAGAAAAGAAGTGCAG
BDL225 ER Xbal(SEQ ID N°:1081) ATTCTAGATTAGTAGTTTATACAAGGTGCGGAGAC
BDL226	EcoRV, EcoRV	BDL226 NF EcoRV(SEQ ID N°:1082) AAGATATCGAAACTGGATCTGGGTTTATCC
BDL226 NR EcoRV(SEQ ID N°:1083) ATGATATCCTAAACTAATCAAACATGGCACATAC
BDL227		BDL227 NF Sall(SEQ ID N° :1084) AAAGTCGACAGAGTTAAGTCAATCACCAAACC
BDL227 NR Smal(SEQ ID N°:1085) TCCCGGGTTACCATCAAGTTTTCTTGCTGAAG

145/218

Continuação da Tabela 18
BDL228	Sall, Xbal	BDL228 NF Sall(SEQ ID N°:1086) AAAGTCGACCCAACACTATATCATGGCTACTATC
BDL228 NR Xbal(SEQ ID N°:1087) ATTCTAGACTAACCTCACTTGATGCTCTTGC
BDL229	Sall, Xbal	BDL229 NR Xbal(SEQ ID N°:1088) TATCTAGAGCTAAACAAAATCCGGAGATAG
BDL229 ER Xbal(SEQ ID N°:1089) TATCTAGACAGTCACTCCATAACTATGATCAAAC
BDL229 F Sall(SEQ ID N°:1090) TTAGTCGACCTCATTAATGGAAGTTTCAACATC
BDL229 F Sall(SEQ ID N°:1091) TTAGTCGACCTCATTAATGGAAGTTTCAACATC
BDL230	Smal, Smal	BDL230 NF Smal(SEQ ID N°:1092) TCCCGGGTAAGTTTGTGAGATGGAATTAGTG
BDL230 NR Smal(SEQ ID Ν°.Ί093) TCCCGGGCTAATTGGTTGGTTACAAGATGC
BDL231	Sall, Xbal	BDL231 NF Sall(SEQ ID N°:1094) AATGTCGACTGGACTGAAGATGTCAGGATTC
BDL231 EF Sall(SEQ ID N°:1095) ATAGTCGACATTTCTCTCTATTGGCATCGAC
BDL231 NR Xbal(SEQ ID N°:1096) AATTCTAGACTAAACTGGGGAAAGCTAAAACG
BDL231 ER Xbal(SEQ ID N°:1097) AATTCTAGATCATAACATAAGAAAGTAAACTGGGG
BDL232	Xbal, Saci	BDL232 NF Xbal(SEQ ID N°:1098) AATCTAGACACACCCCTCAAAGAAATATAAC
BDL232 EF Xbal(SEQ ID N’:1099) AATCTAGAAAGAAATTCACACCCCTCAAAG
BDL232 NR Sacl(SEQ ID N’:1100) TGAGCTCCTAAAGGTGGAGTAATTAGAAGCG
BDL232 ER Sacl(SEQ ID N°:1101) TGAGCTCTGGTGAAGTGTTAAGTAATTGTCG
BDL233	Sall, Saci	BDL233 NF Sall(SEQ ID N°:1102) AAAGTCGACGAAAGAGAGAAAATGGAGAATATG
BDL233 EF Sall(SEQ ID N’:1103) AAAGTCGACCGATCTAAAGAAAGAGAGAAAATG
BDL233 NR Sacl(SEQ ID N°:1104) TGAGCTCCTAAGAGTCGATCTAGAAAGCAACATC
BDL233 ER Sacl(SEQ ID N°:1105) TGAGCTCGAATTAGTCCTTGTGGTTCTACTC
BDL234	SalL Smal	BDL234 NF Sall(SEQ ID N°:1106) AATGTCGACTGATAAGAATGCTCCTGACTGG
BDL234 EF Sall(SEQ ID N°: 1107) AATGTCGACTCTTTCTCTGTATCTCGACGTTC .
BDL234 NR Smal(SEQ ID N°:1108) TCCCGGGCTAAAATCCÃAGTGCCCAAGAAC
BDL234 ER Smal(SEQ ID N°:1109) TCCCGGGCTAGCAAAACATAAATCCAAGTGC
BDL235	Sall, Smal	BDL235 NF Sall(SEQ ID N°:1110) AATGTCGACTCTTACTCAATCCGAAGAATGG
BDL235 NR Smal(SEQ ID N°:1111) CCCCGGGACTTCGATTCACATTTCTCCTC
BDIZ237—		BDL237 NFZSall(SEQTD N°:1 H2rAAAGTCGACCGAAGTAAGAAAAGAAAATGGAG„
BDL237 EF Sall(SEQ ID N°:1113) AAAGTCGACCTTCGAAGTAAGAAAAGAAAATG
bairTADai-	BDL237 NR Xbal(SEQ ID N°:1114)~AATCTAGATCATACT6AAGTGGTTGTGGTCGG
BDL237 ER Xbal(SEQ ID N’:1115) ATTCTAGAGTTATTGGTGTCTTGTTCCACC
BDL238	Sall, Xbal	BDL238 NF Sall(SEQ ID N°:1116) AAAGTCGACCAACGAGCAAGAGAAAATGG
BDL238 EF Sall(SEQ ID N’:1117) AAAGTCGACGATACAACGAGCAAGAGAAAATG
BDL238 NR Xbal(SEQ ID N’:1118) AATTCTAGATGGTTCTAGCTATCACTAGGTGC
BDL238 ER Xbal(SEQ ID N°:1119) AATTCTAGAGGCAATACAACAAGAGAAAACTC
BDL240	Sall, Xbal	BDL240 NF Sall(SEQ ID N°:1120) AAAGTCGACCGAGTACAATGGAGGTTTCG
BDL240 NR Xbal(SEQ ID N°:1121) ATTCTAGATCAAGCTTAAAGACCGTGAGGAAG
BDL241	Xbal, Smal	BDL241 NF Xbal(SEQ ID N°:1122) AATCTAGAACAGTCGTCGTCGTCAAGC
BDL241 NR Smal(SEQ ID N°:1123) TCCCGGGCTAAAGGTAAGGATGAATTGTCAGAG
BDL242	Sall, Xbal	BDL242 NF Sall(SEQ ID N’:1124) AATGTCGACTCAAATCAATATGGGATCTTTC
BDL242 NR Xbal(SEQ ID N°:1125) ATTCTAGATTATTGACAAGTCTATTGCCCG
BDL245	Sall, Smal	BDL245 NF Sall(SEQ ID N’:1126) AATGTCGACTTCGTTAAATTATGTCTTTGAGG
BDL245 EF Sall(SEQ ID N°:1127) AAAGTCGACTGACTCAGAGATCAACAAAACC
BDL245 NR Smal(SEQ ID N“:1128) ACCCGGGTTAGACTTACTCCAATTTCCAAGC
BDL245 ER Smal(SEQ ID N’:1129) TCCCGGGTCAAGAGTCGGTCACACGC
BDL247	Smal, Saci	BDL247 NF Smal(SEQ ID N°:1130) TCCCGGGTCCTTCTTGTGTGAGACCGAG
BDL247 NR Sacl(SEQ ID N°:1131) TGAGCTCCTAAGAACTTTAACGCATTTTGTAGTG
BDL248	Sall, Xbal	BDL248 NF Sall(SEQ ID N°:1132) AAAGTCGACAACGTGATCAATATGGAAGCTC
BDL248 EF Sall(SEQ ID N°:1133) AAAGTCGACACTCACCAAAATCCAACGTG
BDL248 NR Xbal(SEQ ID N’:1134) AATTCTAGACTAAACTCAAGAGGAGTCGGGTAAG
BDL248 ER Xbal(SEQ ID N°:1135) AATTCTAGATTAATTCGTTACCGTTGCTAAG

146/218

Continuação da Tabela 18

BDL249	Sall, Xbal	BDL249 NF Sall(SEQ ID N:1136) AAAGTCGACACCAAAATAGATCTAAAACATGG
BDL249 EF Sall(SEQ ID N°:1137) AATGTCGACTTCACTCACCAAAATAGATCTAAAAC
BDL249 NR Xbal(SEQ ID N°:1138) AATCTAGATCAACGTCAAACGGACTCGTTG
BDL249 ER Xbal(SEQ ID N°:1139) AATCTAGATCACCAAAAGTCTAAACGTCAAACG
BDL250	Sall, Xbal	BDL250 NF Sall(SEQ ID N°:1140) TTAGTCGACCAAAGATGTTTTACTATGTGATTGTC
BDL250 EF Sall(SEQ ID N°:1141) TTAGTCGACAGGAAGAGAAAGGTCAAAGATG
BDL250 NR Xbal(SEQ ID N°:1142) TATCTAGATCAAAATCTCACATCTCCATGCATAG
BDL250 ER Xbal(SEQ ID N’:1143) TATCTAGATCATGTTCGCATTACACAAATATCC
BDL252	Xbal, Smal	BDL252 NF Xbal(SEQ ID N°:1144) ATTCTAGATTCTCTGTCTCTTTGGCTTTTC
BDL252 EF Xbal(SEQ ID N°:1145) ATTCTAGATAAAACTCTCAGCTTCCCATTC
BDL252 NR Smal(SEQ ID N':1146) TCCCGGGCTATTGTCATTGAGGAAGAACAGG
BDL252 ER Smal(SEQ ID N':1147) TCCCGGGCTAAAAGTTCTTGCTTGCTTTCTG
BDL48	Sall, Xbal	BDL48 NF Sall(SEQ ID N°:1148) AAAGTCGACAGATTGCGTCACTGTAGTAGTAGTAG
BDL48 EF Sall(SEQ ID N°:1149) AAAGTCGACCTGCAACTCTTTCTCACTTTCAC
BDL48 NR Xbal(SEQ ID N°:1150) AGTCTAGAAAACATTTTGCTTAAGATCTACAGAG
BDL48 ER Xbal(SEQ ID N°:1151) ACTCTAGAAGACATGAAAGCACAAATCAAG
BDL49	Smal, Saci	BDL49 NF Smal(SEQ ID N°:1152) ACCCGGGCTAACATGCTCCATCTCCTTC
BDL49 NR Sacl(SEQ ID N°:1153) TGAGCTCTCAACCTGATCAGCGATGGTCG
BDL58	Sall, Xbal	BDL58 NF Sall(SEQ ID N°:1154) AAAGTCGACCACACAAGACTAACGATGTTGC
BDL58 NR Xbal(SEQ ID N°:1155) ATTCTAGATTAAAAAGAGACCTACACGGCG
-BDL62- -	qa|| QqoI -	-BDL62 NF Sall(SEQ ID N°:1156) AATGTCGACTCTCTGGTCTCCCTATATCAGC
	BDL62 NR Sacl(SEQ ID N°:1157) TGAGCTCCTATTTGATGTTGTTGTTGTTGTCTG . .
BDL63	Sall, Xbal	BDL63 NF Sall(SEQ ID N°:1158) ATAGTCGACGTTTTGAGATATGGGAGGACC
BDL63 EF Sall(SEQ ID N’:1159) AAAGTCGACCTCTAGATTCTTGGCGATTCTC
BDL63 NR Xbal(SEQ ID N°:1160) ATTCTAGATTAGTGGTTTTACTTGAGCCTCTCC
-BDL63 ER Sacl(SEQ ID Nf:.1161) TGAGCTÇCTATTGTTCGTTACGGTGGTTTTAC
BDL64		BDL64 NF Sall(SEQ ID N°:1162) AATGTCGACGGACTTTAAACATGGGTGTTC ~ ~
		-BBt64-NR-Xbal(SEQ-ID-tst:l1.63).AIICTAGACTACTCATAGGTTTGTTACTTCCTTG
BDL75	Sall, Xbal	BDL75 NF Sall(SEQ ID N°:1164) AAAGTCGACAAGAAGAAAGAAACAGAGAATCG
BDL75 NR Xbal(SEQ ID N°:1165) ATTCTAGACTAATTGTTCAAAGTTCAGTGAGCC
BDL79	Xbal, Smal	BDL79 NF Xbal(SEQ ID N°:1166) ATTCTAGAGGAGATTTTGTAATGGATTCTGC
BDL79 EF Xbal(SEQ ID N’:1167) ATTCTAGAGAAGGAGATTTTGTAATGGATTC
BDL79 NR Sma(SEQ ID N’:1168) TCCCGGGTTACGCTTAGACCATACAACGAGTAG
BDL79 ER Sma(SEQ ID N°:1169) TCCCGGGGTTATTTACTTATGGCCTGTTTC
BDL81	Sall, Saci	BDL81 EF Sall(SEQ ID N’:1170) AAAGTCGACCAGGGGTTTAAGGATTTTCTC
BDL81 ER Sacl(SEQ ID N°:1171) CGAGCTCAAATGGCTTTCTCTACCCTTTG
BDL83	Sall, Xbal	BDL83 NF Sall(SEQ ID N’:1172) AATGTCGACTGGTAGGCTGAGAGAAAGAAAG
BDL83 NR Xbal(SEQ ID N°:1173) AGTCTAGATTAGAGAATAAAAGAAGAATGAGAAGC
BDL85	Xbal, Sall	BDL85 NF Sall(SEQ ID N°:1174) AATGTCGACTTAATCGTTAGAAGATGAGCCAG
BDL85 NR Xbal(SEQ ID N°:1175) ATTCTAGATCAGGCTTAGAAGCAAATGTCCAG
BDL88	Sall, Xbal	BDL88 NF Sall(SEQ ID N°:1176) AATGTCGACGAGGAGATGGCGAGCAAC
BDL88 NR Xbal(SEQ ID N°:1177) TATCTAGATTATTAGGTATTGCACTTCCACTTC
BDL90		BDL90 EF Sall(SEQ ID N°:1178) AAAGTCGACCACCAGAAACAAAGAGAGAGTG
BDL90 ER Xbal(SEQ ID N’:1179) ATTCTAGATATCATGCAACCACAAACAATAG
BDL94	Xbal, Smal	BDL94 EF Xbal new(SEQ ID N°:1180) AATCTAGAAAGTCCAAGTGACCAACCATC
BDL94 ER Smal new(SEQ ID N°:1181) TCCCGGGGGGATACAAGATTATGCAGGC

Tabela 18. São fornecidos os iniciadores utilizados para a clonagem dos genes de algumas configurações da invenção. Fwd

147/218 = iniciador avançado; Rev = iniciador reverso; Nested = iniciador aninhado para PCR (iniciador interno); Externai = iniciador externo para PCR.

Para facilitar a clonagem dos cDNAs/sequências genômicas, uma extensão 8-12 pb foi adicionada aos 5' de cada iniciador. A extensão do iniciador inclui um sítio de restrição de endonuclease. Os sítios de restrição foram selecionados a partir de dois parâmetros: (a) . O sítio não existia na sequência do DNA, e (b) . Os 10 sítios de restrição dos iniciadores para a frente e reverso foram projetados de tal forma que o cDNA digerido é inserido na formação do sentido para o vetor binário utilizado para a transformação. ~~ “ — —-· — —- — __.. __ __ __

Cada produto da PCR digerido foi inserido em um vetor de cópia alta pBlue-script KS do vetor do plasmídeo [ [pBlue-script KS do vetor do plasmídeo ,

Hypertext Transfer Protocol://World Wide (ponto) (ponto) ou proveniente cópia alta pGXN

Web

Stratagene utilizado, com/manuals/212205 (ponto) desse vetor. Nos casos em pdf que

Plasmídeos] o vetor de (originado a partir de pBlue-script KS) o produto da PCR era inserido a montante foi do terminador

NOS (SEQ ID N° : 1.182) originados do vetor binário pBI 101,3 (GenBank U12640 Adesão N°, nucleotídeos 4356-4693) e a jusante do promotor 35S (Tabela 20 abaixo).

Os produtos da digestão e do vetor plasmídeo linearizado foram ligados com enzima ligase T4 DNA (Roche, Suíça).

O sequenciamento dos produtos

PCR amplificados foi realizado, utilizando sequenciador ABI

148/218

377 (Amersham Biosciences Inc) . Em todos os casos, após a confirmação da sequência dos genes clonados, o cDNA clonado acompanhado ou não com o terminador NOS foi introduzido no vetor binário pGI [pBXYN ou pQXYN contendo o promotor CaMV

35S] de acordo com a Tabela 19 supracitada, por meio de digestão com adequadas endonucleases de restrição.

Em qualquer caso, foi seguida por cópia simples do terminador NOS (SEQ ID N°:

1182x).

Plasmídeos de cópia alta contendo os genes clonados foram digeridos com as endonucleases de acordo com os sítios projetados nos iniciadores (Tabela

18, acima) e clonado em vetores binários' de· acordo com a Tabela

19, abaixo.

Vetores binários utilizados —pa-ra—clonagem.:__0_plasmídeo pPI foi construído por meio da inserção de uma sequência sinal sintética poli-(A), proveniente do vetor plasmídeo básico pGL3 (Promega, Acc no

U47295;

pb 4658-4811) no sítio de restrição HindIII do vetor binário pBI101.3 (Clontech,

Acc. N°U12640). IGP (pBXYN) (Figura

1) é semelhante ao pPI, mas o gene original na coluna principal, o gene GUS foi substituído pelo gene GUSIntron seguido de terminador NOS (SEQ ID N° :

1.182) (G

Vancanneyt., et al MGG

220, 245-50,

1990) . pGI foi utilizado para clonar as sequênc ias de polinucleotídeo, inicialmente sob o controle do promotor 35S [Odell,

JT , et a 1 .

Nature

313, 810-812 (28 de fevereiro de

1985); SEQ ID N°: 1184.

149/218

A modificação do vetor pGI (pQXYN) é uma versão modificada do vetor pGI em que a cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita para o gene e seu promotor correspondentes estão perto da 5 borda direita e o gene NPTII está perto da borda esquerda.

Tabela 19

Sítios de restrição enzimática utilizados para clonar os

genes ic	entificados em vetor binário
Nome do Gene	Vetor Binário	Enzimas de Restrição utilizadas para clonar no vetor binário avançado - FWD	Enzimas de Restrição utilizadas para clonar no vetor binário reverso REV	Enzimas de Restrição utilizadas para digerir o vetor binário
BDL62	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL75	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL79	pQXYN- -	Xbal . . .	Smal	Xbal, Ecl136ll
BDL81	'pQXYN- *	Sall - . .	Saci	Sall, Saci
BDL83	pQXYN	Sall	EcoRI ~ '	Sall] EcoRI - - -' - - - -
BDL117	pQXYN	Smal	Smal	Smal, Ecl136ll
BDL118	pQXYN	Smal	Smal	Smal, Ecl136ll
BDL138	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL140	pQXYN. .	Xbal .	Saci	Xbal, Saci
BDL147	pQXYN	Sall ~	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL149	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL152	pQXYN	Xbal----------	Saci------------	Xbal, Saci
BDL153	pQXYN	Sall	Smal	Sall, ECÍ136II--
BDL154	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL155	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL156	pQXYN	Sall	Saci	Saci, Sall
BDL157	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL158	pQXYN	Xbal	Smal	Xbal, Ecl136ll
BDL160	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL162	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL167	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL168	pQXYN	Xbal	Smal	Xbal, Ecl136ll
BDL169	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL171	pQXYN	Xbal	Saci	Xbal, Saci
BDL173	pQXYN	Xbal	Smal	Xbal, Ecl136ll
BDL174	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL176	pQXYN	Smal	Smal	Smal, Ecl136ll
BDL177	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL181	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL182	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL183	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL186	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL187	pQXYN	Sall	Smal	Sall, ECI136II
BDL188	pQXYN	Xbal	Smal	Xbal, Ecl136ll
BDL189	pQXYN	Smal	BamHI	Smal, Ecl136ll
BDL190	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL192	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL193	pQXYN	Xbal	Saci	Xbal, Saci

-t

150/218

Continuação da Tabela 19
BDL194	pQXYN	EcoRV	EcoRV	Smal, Ecl136ll
BDL196	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL197	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL201	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL203	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL220	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL221	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL222	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL223	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL229	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL230	pQXYN	Smal	Smal	Smal, ECI136II
BDL231	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL235	pQXYN	Sall	Smal	Sall, ECI136II
BDL242	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL245	pQXYN	Sall	Smal	Sall, Ecl136ll
BDL247	pQXYN	Smal	Saci	Smal, Saci
BDL248	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL250	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL49	pQXYN	EcoRV	Saci	Smal, Saci
BDL58	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL63	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL64	pQXYN	Sall	Xbal	Sall, Ecl136ll
BDL85	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL88	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL90	pQXYN. ,	Xbal - ~ - ...	Sall	Sall, Ecl136ll
BDL94	pQXYN	Xbal ’ ' ' -	Smal . .	xbal, Ecl136ll - . . .
BDL102	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI ’ - '
BDL224	pQXYN	Xbal	EcoRI	Xbal, EcoRI
BDL225	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL226	pQXYN	EcoRV	EcoRV	Smal, Ecl136ll
BDL227	pQXYN	Sall	Smal	Sall, Ecl136ll
BDL228	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL232--	-pQXYN---	-Xbal	EcoRI	Xbal, EcoRI
BDL233	pQXYN	Sall	-EcoRI---------------	-Sall,.EcoRI
BDL234	pQXYN	Sall.	Smal	Sall, Ecl136II
BDL237	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL238	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL240	pQXYN	Sall	Saci	Sall, Saci
BDL241	pQXYN	Xbal	Smal	Xbal, Ecl136ll
BDL249	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI
BDL252	pQXYN	Xbal	Smal	Xbal, ECI136II
BDL47	pQXYN	Xbal	Smal	Xbal, ECI136II
BDL48	pQXYN	Sall	EcoRI	Sall, EcoRI

Tabela 19.

Tabela 20

Genes clonados a partir de bibliotecas de cDNA, ou DNA genômico em um número Elevado de cópias do plasmídeo

Nome do Gene	Plasmídeo de alta-cópia	Amplificado de	PloinucleotídeoSE QIDN°:	Polipeptídeo SEQ ID N°:
Organismo	Origem
BDL62	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	847	108
BDL75	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	848	109
BDL79	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	849	110
BDL81	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	850	111

151/218

Continuação da Tabela 20
BDL83	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	851	112
BDL117	Topo B	Arabidopsis thaliana ND	RNA	852	926
BDL118	TopoB	Arabidopsis thaliana ND	RNA	853	114
BDL138	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	854	116
BDL140	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	.RNA	855	117
BDL147	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	856	118 '
BDL149	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	857	119
BDL152	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	858	120
BDL153	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	859	121
BDL154	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	860	122
BDL155	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	861	123
BDL156	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	862	124
BDL157	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	863	125
BDL158	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	864	126
BDL160	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	865	127
BDL162	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	866	128
BDL167	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	867	196
BDL168	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	868	132
BDL169	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	869	133
BDL171	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	870	927
BDL173	pKS(Pks J) \ - -	Arabidopsis thaliana ND	RNA	871	135
BDL174	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidõpsifthãliana ND ~ - --	-rna :	872 . . L Ç	136 -
BDL176	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	873	137
BDL177	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	874	138
BDL181	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	875	139
BDL182	pGXN (pKG+Nos+35S) -	Arabidopsis thaliana ND	RNA	876	140
BDL183	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	877 ’ ' -	141 - ·
BDL186	pGXN/pKG+Nos+SSS)—	-Arabidopsisthaliana.ND	RNA	878	928
BDL187	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	879 ---	929—-----
BDL188	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	880	144
BDL189	Topo B	Arabidopsis thaliana ND	RNA	881	145
BDL190	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	882	146
BDL192	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	883	147
BDL193	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	884	148
BDL194	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	885	149
BDL196	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	886	150
BDL197	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	887	151
BDL201	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	888	153
BDL203	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	889	154
BDL220	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	890	156
BDL221	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	891	157
BDL222	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	892	158
BDL223	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	893	159
BDL229	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	894	160
BDL230	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	895	161
BDL231	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	896	162
BDL235	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	897	163
BDL242	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	898	164
BDL245	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	899	166
BDL247	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	900	167

152/218

Continuação da Tabela 20
BDL248	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	901	168
BDL250	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	902	169
8DL49	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	903	170
BDL58	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	904	171
BDL63	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	905	172
BDL64	Topo B	Arabidopsis thaliana ND	RNA	906	173
BDL85	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	907	175
BDL88	pGXN (pKG+Nos+35S)	ARROZ Oryza sativa L. Japonica ND	RNA	908	176
BDL90	TopoB	ARROZ Oryza sativa L.Japonica ND	gDNA	909	Polinucleotídeo não-codificado
BDL94	pGXN (pKG+Nos+35S)	ARROZ Japonica ND leaves	gDNA	910	930
BDL102	pGXN (pKG+Nos+35S)	MILHO Zea mays L. ND	RNA	911	178
BDL224	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	912	179
BDL225	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	913	180
BDL226	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	914	181
BDL227	Topo B	Arabidopsis thaliana ND	RNA	915	182
BDL228	pGXN (pKG+Nos+35S)	MAMONA Ricinus communis L. ND	RNA	916	931
BDL232	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	917	184
BDL233	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	918	932
BDL234	pKS(Pks-J) - .	Arabidopsis thaliana ND	RNA	919	186
BDL237	pGXN (pKG+Nos+35S) ’	Arabidopsis thaliana ND	.RNA :	920 —	187 -
BDL238	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	921	188 '
BDL240	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	922	189
BDL241	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	923	190
BDL249	pGXN (pKG+Nos+35S).	, Arabidopsis thaliana ND	RNA	924	191
BDL252	pKS(Pks J)	Arabidopsis thaliana ND	RNA ’ -	*925’	- 193 . . . . .
BDL47	Plasmidio-de-alta-cópia_ pMA	DNA Sintético		845	106
BDL48	pGXN (pKG+Nos+35S)	Arabidopsis thaliana ND	RNA	846	107
BDL200	Plasmidio de alta-cópia	DNA Sintético		47	152

Tabela 20: Genes clonados e sintéticos são fornecidos junto com os identificadores de sequência de seus polinucleotídeos e polipeptídeos. Também são fornecidos a fonte de tecidos do organismo, e os vetores de clonagem. ND = um ecótipo não determinado.

Sequências de DNA selecionados foram sintetizados por um fornecedor comercial GeneArt, GmbH [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) geneart com (ponto)/)]. DNA sintético é projetado in silico. Sítio de enzimas de restrição adequadas foram acrescentados às sequências clonadas na extremidade 5¹ e na extremidade 3'

153/218 para posterior clonagem habilitada no pBXYN/pQXYN binário a jusante do promotor CaMV 35S (SEQ ID N° : 1184) . Por exemplo

BDL47 (SEQ ID N° : 1 foi sintetizado e as enzimas de restrição Xbal e Smal foram adicionadas à sequência 5 sintética, a fim de facilitar a clonagem.

Para 7 genes, ou seja, BDL117,

BDL171, BDL186, BDL187, BDL94, BDL228 e BDL233, a tradução da proteína da sequência de DNA amplificado não corresponde à previsão inicial de bioinformática das sequências de 10 proteína. As sequências de polipeptídeos codificados por sequências clonadas foram previstos e são fornecidos em SEQ ID N° : 92 6-932----- . . _

EXEMPLO 8 ' ' ' ' ·

PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS DE ARABIDOPSIS TRADUZ 15 POLINUCLEOTÍDEOS^IDENTIFICADOS DA INVENÇÃO

Matéria ís~ê~Métodos—Experimenta_i s

Transformação da Planta - A

Arabidopsis thaliana var Columbia (plantas T_o) foram transformadas de acordo com o procedimento Floral Dip 20 [Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip: um método simplificado para a transformação mediada da Agrobactéria da

Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6) : 735-43; and Desfeux C,

Clough SJ, Bent AF. (2000) Tecidos reprodutivos femininos são os alvos principais de transformação mediada por 25 Agrobacterium pelo método de dip-floral de Arabidopsis.

Plant Physiol. 123 (3): 895-904], com pequenas modificações.

Resumidamente, as plantas de Arabidopsis thaliana Columbia (ColO) T_o foram semeadas em vasos de 250 ml preenchidos com

154/218 uma combinação de crescimento molhado de base turfa. Os potes foram cobertos com papel alumínio e uma redoma de plástico, mantidos a 4°C por 3-4 dias, então descoberto e incubados em câmara de crescimento a 18-24°C, sob 16/8 horas de ciclos de luz/escuro. As plantas T_o estavam prontas para a transformação de seis dias antes da antese.

Colônias individuais de Agrobacterium carregando os vetores binários contendo os genes de óleo de sementes foram cultivadas em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas a 28°C por 48 horas sob agitação vigorosa e centrifugação a 4000 rpm por 5 minutos. As pelotas compreendendo células Agrobacterium -foram ressuspendidas em meio de transformação, que continha a meia-força (2,15 g/L) Murashige-Skoog (Duchefa); 0,04 μΜ de purinã berTz^i-tami-no—CSigmaJu;--—112_l±g/L vitaminas Gambourg B5 (Sigma) ; 5% de sacarose e 0,2 ml/L Silwet L-77 (OSI

Especialistas, CT) em água bidestilada, a um pH de 5,7.

Transformação de plantas T_o foi realizada invertendo cada planta em uma suspensão de Agrobacterium de tal forma que o tecido vegetal acima do solo foi submerso por 3-5 segundos. Cada planta T_o inoculada foi imediatamente colocada em uma bandeja de plástico, em seguida, coberta com cúpula de plástico transparente para manter a umidade e foi mantida no escuro à temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e transformação. Plantas transformadas (transgênicas) foram descobertas e transferidas para uma estufa para a

155/218 recuperação e maturação. As plantas T_o transgênicas foram cultivadas na estufa por 3-5 semanas até as silíquas ficarem castanhas e secas, em seguida, foram colhidas plantas e mantidas em temperatura ambiente até sementes das a semeadura.

de plantas transgênicas Ti e T₂ abrigar os genes, sementes coletadas de plantas transgênicas T_o foram superfície esterilizadas por imersão em etanol 70% por 1 minuto, seguido hipoclorito de superfície lavadas em / placasç de das água sódio 5% e triton 0,05% por sementes esterilizadas foram minutos. A cuidadosamente destilada estéril, em seguida, colocados em cultura contendo a metade dos Murashig-Skoog canamicina e 200 carbenicilina mM (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas- a* 4°C -por. ,48 .horas, em seguida, transferidos para sala—de—ereacimento a 25°C por um semana transferidos para placas de cultura fresca por removidas das placas

Ti foram mais uma

Ti foram crescimento contida em 250 ml frascos. As plantas foram habilitadas a crescer em uma estufa para a maturidade. As sementes colhidas de plantas T_x foram cultivadas e cresceram para a maturidade como T₂ sob as mesmas condições utilizadas para o cultivo e crescimento das plantas Τχ.

EXEMPLO 9

DESEMPENHO DE PLANTA TRANSGÊNICA

MELHORADA

Para analisar o efeito da ex

156/218 pressão dos polinucleotídeos isolados de plantas, as plantas foram cultivadas em vasos, com uma quantidade adequada de nutrientes e água. As plantas foram analisadas quanto ã sua dimensão global, taxa de crescimento, tempo de aparecimento 5 da inflorescência (pendoamento) e rendimento de sementes de floração, peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita [rendimento de sementes (HI)/matéria seca]. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado com o controle de plantas cultivadas em paralelo, nas mesmas 10 condições. Plantas transgênicas falsas com um vetor vazio ou expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) , sob o mesmo promotor foram utilizados como controle.

~ - - - o_s - p_arâ_metros foram medidos como descrito nos Exemplos 2, 3 e 4.

Análises Estatísticas - Taxa de crescimento da planta, área de planta, o tempo de parafuso, tempo de flores, massa de 1000 sementes, produção de sementes, produção de petróleo, matéria seca e índice de área de colheita de dados foram analisados utilizando t20 teste. Para identificar genes superando e construindo, resultados da combinação de eventos de transformação ou eventos independentes foram analisadas. Para os genes versus análise de controle t-teste foi aplicado, utilizando-se de significância de p <0,1. O pacote JMP de software 25 estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc. , Cary, NC, EUA).

Resultados Experimentais

Plantas que expressam os polinucleotídeos da invenção foram

157/218

	analisadas	em	uma série	de características comercialmente
	desej ados.	Os	resultados	são apresentados nas Tabelas 21 e
	22 .
				Análise de	plantas no ensaio
5	da cultura	de	tecidos - Tabelas 21 e 22,	abaixo, apresentam
	análises	de	rendimento	de sementes	de plantas que

superexpressam os polinucleotídeos da invenção nos termos do regulamento do constitutivo 35S (SEQ ID N° : 1184) ou promotores At6669 (SEQ ID N°: 1183) . Nos casos em 10 que um determinado evento aparece mais de uma vez, o evento foi testado em vários experimentos independentes.

...... Tabela 21 ” ——— - - _ — —— —· —— Resultados obtidos em um ensaio de cultura de tecidos

Gene	, Ev.	Par.	Área de _ Folha TP1	Área de Folha TP2	Área de Folha TP3	Comp. das Raizes— TP1	Comp. das Raizes-- TP2	Comp. das Raízes TP3	Cobert. das Raizes TP1
BDUQ2	104.71,.1	P		0,24		0,01	0,02	0,13	0,05
BDL102	10471,1	Av		1,15		1,59	1,39	1,23	2,34
BDL102	10471,3	R..		0,6		0,03	0,01	0,09	0,01
BDL102	10471,3	Av		1,1		1,43	1,37	1,24	1,72
BDL102	10472,1	P				0,04	0,15		0,03
BDL102	10472,1	Av				1,27	1,1		1,54
BDL102	10474,2	P	<0,01	<0,01	<0,01		0,23	0,13
BDL102	10474,2	Av	2,02	1,61	1,51		1,1	1,13
BDL102	10474,6	P		0,13	0,29
BDL102	10474,6	Av		1,21	1,14
BDL118	10481,2	P	<0,01	0,01	0,01			0,46
BDL118	10481,2	Av	2,02	1,91	2			1,1
BDL118	10481,5	P		0,2	0,01
BDL118	10481,5	Av		1,15	1,29
BDL118	10484,3	P	<0,01	<0,01	<0,01
BDL118	10484,3	Av	1,51	1,41	1,58
BDL140	10421,3	P	0,03	0,01	0,05				0,39
BDL140	10421,3	Av	1,61	1,72	1,68				1,18
BDL140	10423,1	P	0,21	0,09	0,28	0,01	0,11		0,19
BDL140	10423,1	Av	1,24	1,31	1,21	1,38	1,21		1,28
BDL140	10424,4	P	<0,01	<0,01	0,01
BDL140	10424,4	Av	1,43	1,48	1,62
BDL152	10431,4	P	0,15	0,12	0,12
BDL152	10431,4	Av	1,17	1,18	1,18
BDL152	10432,5	P	0,37	0,01		0,07	0,14		0,35
BDL152	10432,5	Av	1,16	1,28		1,22	1,13		1,25
BDL152	10434,1	P		0,43

158/218

Continuação da Tabela 21

BDL152	10434,1	Av		1,12
BDL152	10434,4	P		0,08		0,04	0,01	<0,01	0,08
BDL152	10434,4	Av		1,18		1,52	1,48	1,31	2,33
BDL153	10142,2	P				<0,01	<0,01		0,03
BDL153	10142,2	Av				1,83	1,43		1,99
BDL153	10144,1	P	<0,01	0,02	0,07		0,31	0,15	0,7
BDL153	10144,1	Av	1,3----------	- 1,31	1,38		1,13	1,12	1,1
BDL153	10144,4	P							0,03
BDL153	10144,4	Av							1,28
BDL154	10703,1	P				0,09	0,14	0,05	0,09
BDL154	10703,1	Av				1,36	1,14	1,2	1,77
BDL154	10703,11	P				0,01	0,17	0,3	0,5
BDL154	10703,11	Av				1,37	1,21	1,16	1,18
BDL154	10703,6	P							0,42
BDL154	10703,6	Av							1,23
BDL154	10703,1	P	<0,01	<0,01	<0,01		0,11	0,02
BDL154	10703,1	Av	1,34	1,5	1,61		1,14	1,18
BDL154	10703,5	P		0,46	0,36		0,02	0,02	0,21
BDL154	10703,5	Av		1,1	1,16		1,47	1,39	1,52
BDL154	10703,6	P				0,24	0,06	0,07	0,15
BDL154	10703,6	Av				1,19	1,33	1,24	1,59
BDL155	9994,3	P	0,22
BDL155	9994,3	Av	1,15
BDL156	10853,6	P			0,08
BDL156	10853,6	Av			1,12
BDL156	10852,6	P			0,15
BDL156.....	10852,6	Av			1,15	—	—	..............
3DL156	10853,6	P '		0,07	0,01			0,24 ·-·	- - .....·-.....
BDL156	10853,6	Av		1,34	1,71			1,22
BDL156	10854,4	P	0,11	0,11	<0,01			0,01
BDL156	10854,4	Av	1,13	1,26	1,66			1,24
BDL156	10855,3	P			0,01			0,1
BDL156	10855,3	Av			1,35 -			1,2 ...
BDL158	9973,3	P				0,01	0,03	0,17	0,09
BDL158	9973,3	Av				1,21	1,27	1,1	1,21
BDL158	9971,3	P	0,42	0,32	0,27
BDL158	9971,3	Av	1,13	1,13	1,11
BDL158	9973,1	P				0,08	0,24	0,17	0,02
BDL158	9973,1	Av				1,27	1,16	1,13	1,37
BDL158	9973,3	P				<0,01	0,02	0,06	0,01
BDL158	9973,3	Av				1,66	1,39	1,17	2,06
BDL158	9974,2	P	<0,01	<0,01	0,09
BDL158	9974,2	Av	1,68	1,58	1,23
BDL158	9974,3	P	<0,01	<0,01	0,13
BDL158	9974,3	Av	1,76	1,62	1,58
BDL158	9971,3	P		0,07	0,15			0,02
BDL158	9971,3	Av		1,22	1,2			1,15
BDL158	9973,1	P	0,01	0,41	0,03	<0,01	<0,01	0,08	0,02
BDL158	9973,1	Av	1,28	1,11	1,35	1,49	1,35	1,26	1,8
BDL158	9973,3	P				<0,01	<0,01	<0,01	0,02
BDL158	9973,3	Av				1,36	1,52	1,39	1,51
BDL160	10011,5	P	0,01	0,22	0,15
BDL160	10011,5	Av	1,41	1,2	1,26
BDL160	10011,5	P							0,45
BDL160	10011,5	Av							1,25
BDL160	10011,7	P				0,04			0,01
BDL160	10011,7	Av				1,34			1,95
BDL160	10013,1	P			0,53
BDL160	10013,1	Av			1,11
BDL160	10014,9	P	0,2	0,39	0,61
BDL160	10014,9	Av	1,17	1,15	1,11

159/218

Continuação da Tabela 21
BDL160	10015,2	P		0,07	0,12
BDL160	10015,2	Av		1,19	1,22
BDL167	10042,3	P	<0,01
BDL167	10042,3	Av	1,3
BDL167	10043,1	P	<0,01	0,02	0,14
BDL167	10043,1	Av	1,37	1,18	1,2
BDL167	10043,2	p -	0,06 -	0,13	0,03		-	-	-
BDL167	10043,2	Av	1,61	1,29	1,23
BDL167	10043,3	P	0,01	0,01	<0,01			0,01
BDL167	10043,3	Av	1,93	1,58	1,61			1,25
BDL167	10044,2	P	<0,01	0,01	0,02	0,05	0,04	0,03
BDL167	10044,2	Av	1,63	1,43	1,43	1,28	1,23	1,23
BDL167	10043,1	P	<0,01	<0,01	0,15		<0,01	0,12	0,47
BDL167	10043,1	Av	1,56	1,53	1,43		1,22	1,1	1,1
BDL167	10044,2	P				<0,01	<0,01		<0,01
BDL167	10044,2	Av				1,45	1,18		2,16
BDL168	9881,3	P				0,15			0,04
BDL168	9881,3	Av				1,23			1,67
BDL168	9881,4	P				<0,01	<0,01	<0,01	0,02
BDL168	9881,4	Av				1,89	1,72	1,38	2,28
BDL168	9882,1	P				0,01	0,01	0,04	<0,01
BDL168	9882,1	Av				1,9	1,68	1,29	2,57
BDL168	9883,3	P							0,2
BDL168	9883,3	Av							1,38
BDL168	9884,1	P				<0,01	<0,01	0,02	0,02
BDL168	9884,1	Av				2,05	1,73	1,38	2,61
BDL169	10744,2 .	P	------- . _			0;08	0,02 -	0,08	0,29
BDL169	10744,2	Av				1,24	1,23	1,19	1,11 ”
BDL169	10747,1	P				0,03	0,09	0,13
BDL169	10747,1	Av				1,15	1,12	1,11
BDL169	10747,5	P				0,06	0,01	<0,01	0,12
BDL169	10747,5	Av				1,62	1,59	1,4	1,73
BDL171 ~	10661-,2	P	=	0,25 ~	0,28“	<0,01 -	<0,01 —	<0,01	-0,03 -
BDL171	10661,2	Av		1,19	1,23	1,62	1,65	1,39	1,8
BDL17-1	10661,5	p	n n?	0 04	0 12
BDL171	10661,5	Av	1,45	1,35	1,24
BDL171	10664,1	P	0,31	0,3	0,25	0,15	0,27	0,31	0,44
BDL171	10664,1	Av	1,17	1,18	1,23	1,23	1,15	1,14	1,17
BDL173	9951,2	P		0,18			0,42		0,3
BDL173	9951,2	Av		1,17			1,11		1,17
BDL173	9952,1	P				<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL173	9952,1	Av				2,17	1,99	1,45	3,32
BDL173	9952,2	P		0,35		<0,01	<0,01	0,01	0,02
BDL173	9952,2	Av		1,12		1,72	1,63	1,24	2,07
BDL174	11082,1	P					0,2	0,06	0,42
BDL174	11082,1	Av					1,14	1,17	1,18
BDL174	11083,1	P	<0,01	<0,01	0,07	<0,01	<0,01	0,01	0,01
BDL174	11083,1	Av	1,64	1,32	1,2	1,78	1,67	1,39	1,66
BDL174	11083,2	P	0,04	0,17	0,12		0,14	0,18
BDL174	11083,2	Av	1,2	1,16	1,25		1,34	1,32
BDL174	11084,1	P	<0,01	<0,01	<0,01		0,03	0,1	0,03
BDL174	11084,1	Av	2,56	2,29	2,1		1,31	1,31	1,68
BDL174	11085,1	P		0,41	0,07	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL174	11085,1	Av		1,11	1,24	1,95	2,33	1,98	1,71
BDL174	11083,2	P	<0,01	<0,01	0,01	0,3			0,31
BDL174	11083,2	Av	1,41	1,35	1,21	1,16			1,27
BDL174	11084,1	P				0,15			<0,01
BDL174	11084,1	Av				1,22			2,13
BDL174	11085,1	P				<0,01	0,01	0,04	0,01
BDL174	11085,1	Av				2,04	1,36	1,16	2,33
BDL176	9891,4	P	0,1	0,05	0,06

160/218

Continuação da Tabela 21
BDL176	9891,4	Av	1,1	1,17	1,36
8DL176	9893,2	P	0,04	<0,01	0,27
BDL176	9893,2	Av	1,28	1,26	1,22
BDL176	9893,3	P				0,38
BDL176	9893,3	Av				1,13
BDL176	9893,2	P				0,15
BDL176	9893,2	Av	______________			1,2
BDL176	9893,3	P	0,05	0,01		0,36			0,16
BDL176	9893,3	Av	1,42	1,34		1,16			1,42
BDL177	10521,3	P						0,23
BDL177	10521,3	Av						1,16
BDL177	10524,2	P				0,13
BDL177	10524,2	Av				1,16
BDL181	11293,6	P			0,32
BDL181	11293,6	Av			1,18
BDL181	11294,7	P			0,36
BDL181	11294,7	Av			1,13
BDL181	11293,1	P			0,6
BDL181	11293,1	Av			1,11
BDL181	11293,6	P		0,01	<0,01
BDL181	11293,6	Av		1,2	1,27
BDL181	11294,7	P					0,16	0,17
BDL181	11294,7	Av					1,1	1,1
BDL182	10691,8	P	0,03	0,07	0,16
BDL182	10691,8	Av	1,32	1,24	1,18
BDL182	10692,2	P	0,17	0,08	0,19
BDL182 -	10692,2	Av	1,19	1,27	1,2	--	—	—.....- -
BDL182	10693,3	' P “	0,01 ’	0,07	0,1	0,17-----	0,1 ~	0,11
BDL182	10693,3	Av	1,55	1,44	1,31	1,17	1,17	1,1
BDL182	10693,5	P	0,04	0,24	0,12	<0,01	<0,01	<0,01	0,48
BDL182	10693,5	Av	1,33	1,15	1,22	1,39	1,33	1,21	1,1
BDL183	9943,4	P				0,02	0,11		0,02
BDL183	9943,4	Av				1,26. —	1,17	.......r ττ	1,61
BDL183	9944,4	P				0,01	<0,01	0,02	0,36
BDL183	9944,4	Av				1,24	1,36	1,21	1,26
BDL189	11351,2	P	0,05
BDL189	11351,2	Av	1,17
BDL189	11353,3	P	0,22	0,04	0,11
BDL189	11353,3	Av	1,19	1,2	1,17
BDL189	11353,5	P	0,26
BDL189	11353,5	Av	1,1
BDL189	11355,4	P	0,12	0,12	0,1
BDL189	11355,4	Av	1,12	1,11	1,11
BDL189	11356,7	P	0,27
BDL189	11356,7	Av	1,11
BDL196	10242,2	P	0,02	0,09		0,05	0,03	0,09
BDL196	10242,2	Av	1,18	1,13		1,29	1,28	1,16
BDL196	10243,4	P	0,09	0,25	0,24	0,13	0,05	0,17	<0,01
BDL196	10243,4	Av	1,16	1,23	1,24	1,11	1,25	1,15	1,74
BDL196	10244,1	P	<0,01	0,07			0,23		0,21
BDL196	10244,1	Av	1,21 .	1,19			1,22		1,33
BDL196	10243,3	P				0,02			0,68
BDL196	10243,3	Av				1,16			1,1
BDL196	10243,4	P		0,01	<0,01			0,23
BDL196	10243,4	Av		1,24	1,49			1,12
BDL197	11362,2	P			0,14
BDL197	11362,2	Av			1,17
BDL197	11363,1	P						0,04
BDL197	11363,1	Av						1,17
BDL197	11363,6	P			0,15
BDL197	11363,6	Av			1,17

161/218

Continuação da Tabela 21
BDL197	11364,1	P		0,08	0,01			0,09
BDL197	11364,1	Av		1,14	1,42			1,15
BDL197	11364,5	P		0,09	0,04
BDL197	11364,5	Av		1,12	1,25
BDL197	11363,6	P		0,2	0,07
BDL197	11363,6	Av		1,11	1,19
BDL201	9961,2 -	P	0,02	0,18	0,39
BDL201	9961,2	Av	1,41	1,18	1,18
BDL201	9961,3	P	0,08	0,13
BDL201	9961,3	Av	1,21	1,28
BDL201	9961,4	P				0,06	0,15	0,43	0,02
BDL201	9961,4	Av				1,37	1,25	1,11	1,76
BDL201	9964,3	P				<0,01	0,01		0,02
BDL201	9964,3	Av				1,34	1,24		1,84
BDL220	10331,2	P	<0,01	<0,01	0,15
BDL220	10331,2	Av	1,75	1,37	1,15
BDL220	10331,5	P	0,01	0,02	0,05
BDL220	10331,5	Av	1,48	1,64	1,75
BDL220	10334,2	P	<0,01	<0,01	0,04
BDL220	10334,2	Av	1,58	1,37	1,21
BDL221	10341,3	P	0,13	0,13	0,06
BDL221	10341,3	Av	1,26	1,19	1,44
BDL221	10341,4	P	<0,01	0,01	<0,01
BDL221	10341,4	Av	1,57	1,3	1,35
BDL221	10343,3	P		0,11	0,06	0,01	<0,01	<0,01	0,13
BDL221	10343,3	Av		1,1	1,16	1,37	1,4	1,4	1,55
BDL22T '	10341,1	p—	0,26	0,45— ·	0,19	--	--	—	—
BDL221	10341,1	Av	1,18	1,15	1,26				—— -
BDL221	10342,1	P	<0,01	<0,01	0,02	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL221	10342,1	Av	1,9	1,46	1,32	2,02	2,08	1,68	4,31
BDL221	10343,1	P	0,18	0,05	0,07	0,26	<0,01	<0,01	<0,01
BDL221	10343,1	Av	1,3	.1,51	1,58	1,12	1,35	1,32	1,67
BDL221-	10343,3	P~	<0,01—	<0,01-	<0,01-	<0,01“	<0,0-1“	<0,01-	<0;01
BDL221	10343,3	Av	2,7	1,8	1,59	1,75	2,12	1,87	2,4
BDL221	10343,4	P	0,05.	0.11	0,19	0,01	<0,01	0,05	0,02
BDL221	10343,4	Av	1,88	1,56	1,57	1,46	1,65	1,49	2,07
BDL221	10344,3	P	0,02	0,01	0,05		0,1	0,18	<0,01
BDL221	10344,3	Av	1,9	1,61	1,56		1,14	1,12	1,63
BDL223	10793,5	P						0,11
BDL223	10793,5	Av						1,14
BDL223	10793,8	P				0,21	0,17	0,08
BDL223	10793,8	Av				1,18	1,17	1,18
BDL223	10796,2	P	<0,01	0,06
BDL223	10796,2	Av	1,22	1,14
BDL223	10791,1	P			0,07		0,12	0,03
BDL223	10791,1	Av			1,21		1,17	1,2
BDL223	10793,3	P	0,01	0,04	0,02			0,14
BDL223	10793,3	Av	1,33	1,3	1,55			1,18
BDL223	10793,5	P					0,07	0,04
BDL223	10793,5	Av					1,14	1,18
BDL223	10793,8	P		0,08	0,08	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL223	10793,8	Av		1,17	1,19	1,54	1,65	1,5	1,64
BDL223	10796,1	P			0,11
BDL223	10796,1	Av			1,15
BDL224	10451,3	P		0,29
BDL224	10451,3	Av		1,11
BDL224	10451,5	P			0,1
BDL224	10451,5	Av			1,15
BDL224	10451,7	P	<0,01	<0,01	0,01	0,03	0,07	0,23	0,16
BDL224	10451,7	Av	1,58	1,69	1,8	1,39	1,26	1,19	1,41
BDL226	10861,2	P						0,4

162/218

Continuação da Tabela 21
BDL226	10861,2	Av						1,1
BDL227	11491,1	P				<0,01	<0,01	0,03	0,01
BDL227	11491,1	Av				1,5	1,46	1,21	1,95
BDL227	11491,3	P	<0,01	<0,01	<0,01	0,01	<0,01	0,02	0,04
BDL227	11491,3	Av	2,12	1,6	1,42	1,64	1,65	1,56	2,26
BDL227	11491,5	P	<0,01	<0,01	0,02	<0,01	<0,01	0,01	<0,01
BDL227 -	11491,5	Av	1,84	1,53	1,42	1,78	1,85	1,64	. 2,73
BDL227	11492,5	P	<0,01	<0,01	0,01	0,26	0,03	0,04	0,01
BDL227	11492,5	Av	2,13	1,91	1,72	1,17	1,48	1,32	1,58
BDL227	11493,5	P	<0,01	<0,01	0,02	0,33	<0,01	<0,01	0,02
BDL227	11493,5	Av	1,55	1,63	1,74	1,1	1,47	1,47	1,53
BDL230	10671,3	P	<0,01	0,06	0,01
BDL230	10671,3	Av	1,36	1,44	1,81
BDL230	10671,5	P				0,33	0,49	0,46
BDL230	10671,5	Av				1,22	1,16	1,11
BDL231	11111,1	P	<0,01	<0,01	<0,01
BDL231	11111,1	Av	1,55	1,53	1,51
BDL231	11111,2	P	0,11	0,15	0,04	0,19		0,04
BDL231	11111,2	Av	1,12	1,12	1,28	1,15		1,19
BDL231	11111,3	P	<0,01	0,04	0,05
BDL231	11111,3	Av	1,35	1,26	1,37
BDL231	11112,2	P	<0,01	0,01	0,03	<0,01	<0,01	<0,01	0,01
BDL231	11112,2	Av	1,72	1,43	1,38	2,08	1,68	1,48	2,34
BDL231	11116,5	P	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,01	0,03	<0,01
BDL231	11116,5	Av	1,82	1,77	1,76	1,67	1,38	1,31	1,92
BDL231	11111,1	P	<0,01	<0,01	<0,01		0,36		0,07
BDL231	11111,1	”Av	T,88	1,78~	1,49	—	1,11	-----	1,43
BDL231	11111,2	P	0,01	0,03	0,01	0,’OT	0,1“ “	---	0,05
BDL231	11111,2	Av	1,66	1,6	1,45	1,28	1,15		1,51
BDL231	11111,3	P				0,01	0,26		0,53
BDL231	11111,3	Av				1,31	1,1		1,1
BDL231	11112,2 .	P	0,24	0,17		<0,01	<0,01		<0,01
BDL231	11112,2	-Av	1,12-	1,12-	-	1,51-	1T3-	-=	1,97
BDL231	11116,5	P				0,11			0,24
BDL23-1	14-1-16,5	Av				1,19			1,35
BDL232	10904,1	P		0,61	0,54		0,43	0,23
BDL232	10904,1	Av		1,17	1,2		1,1	1,14
BDL232	10905,1	P				0,02	<0,01	0,05	0,02
BDL232	10905,1	Av				1,5	1,46	1,25	1,4
BDL232	10906,3	P		0,25	0,14		0,59	0,25
BDL232	10906,3	Av		1,29	1,45		1,1	1,21
BDL232	10902,2	P				<0,01	<0,01	0,06	0,01
BDL232	10902,2	Av				1,7	1,47	1,24	2,1
BDL232	10905,1	P				<0,01	0,01	0,09	0,03
BDL232	10905,1	Av				1,59	1,42	1,2	2,17
BDL233	10825,4	P				<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL233	10825,4	Av				1,47	1,45	1,35	2,01
BDL233	10822,4	P			0,14
BDL233	10822,4	Av			1,23
BDL233	10824,2	P						0,05
BDL233	10824,2	Av						1,16
BDL233	10825,3	P							0,26
BDL233	10825,3	Av							1,27
BDL233	10825,4	P			0,24	<0,01	<0,01	<0,01	0,19
BDL233	10825,4	Av			1,17	1,56	1,59	1,51	1,3
BDL235	11413,2	P				<0,01	0,01	0,03	0,18
BDL235	11413,2	Av				1,63	1,3	1,19	1,43
BDL235	11413,2	P				<0,01	<0,01	0,05	0,01
BDL235	11413,2	Av				1,57	1,45	1,29	2,12
BDL237	10892,2	P	0,16				0,28	0,12	0,09
BDL237	10892,2	Av	1,21				1,1	1,12	1,4

163/218

Continuação da Tabela 21
BDL237	10893,1	P	<0,01	0,02	0,14		0,19	0,28
BDL237	10893,1	Av	1,96	1,39	1,24		1,13	1,14
BDL237	10895,3	P	<0,01	<0,01	0,01	0,01	<0,01	<0,01	0,02
BDL237	10895,3	Av	2,2	1,99	1,9	1,84	1,97	1,79	2,09
BDL237	10896,1	P	0,19		0,49
BDL237	10896,1	Av	1,29		1,1
BDL238	10951,4	P				0,08			0,01
BDL238	10951,4	Av				1,2			1,69
BDL238	10952,3	P	0,05
BDL238	10952,3	Av	1,2
BDL238	10953,3	P							0,32
BDL238	10953,3	Av							1,5
BDL238	10954,2	P				0,05			0,59
BDL238	10954,2	Av				1,24			1,13
BDL238	10954,3	P	0,09			0,03	0,17	0,26	0,17
BDL238	10954,3	Av	1,16			1,3	1,12	1,1	1,45
BDL238	10951,4	P				0,13	0,04	0,23	0,17
BDL238	10951,4	Av				1,22	1,24	1,11	1,39
BDL238	. 10952,3	P				0,02	0,01	0,02	0,11
BDL238	10952,3	Av				1,44	1,43	1,37	1,54
BDL238	10954,2	P				0,02	0,08	0,17	0,22
BDL238	10954,2	Av				1,26	1,2	1,17	1,2
BDL240	10802,2	P	<0,01	0,2	0,31		0,16	0,1	0,1
BDL240	10802,2	Av	1,57	1,23	1,17		1,17	1,19	1,25
BDL240	. 10803,5	P	0,11	0,4	0,31
BDL240 -	10803,5 -.	,Av	1,4 - -	1,11 - - -	1,16 -
BDL240	10806,4	P	<0,01	0,18' ' '	- --- —	— - - „	-	- - - '	- - - - -
BDL240	10806,4	Av	1,29	1,16
BDL240	10806,6	P	0,02	0,02	0,04	0,02	0,01	0,01	0,03
BDL240	10806,6	Av	2,29	1,87	1,52	1,59	1,63	1,49	3,75
.BDL241	10873,1	P							0,51
BDL241	10873,1	'Av '	-= -						1,2
BDL241	10874,3	P'						— - - -	0,32 - -
BDC2Í1----	1087473----	Av							1,42
BDL241	10875,1	P				0/04------	-0;01------	0,13	<£),01
BDL241	10875,1	Av				1,4	1,34	1,21	2,29
BDL241	10874,3	P	<0,01	<0,01	0,02			0,1
BDL241	10874,3	Av	1,34	1,34	1,43			1,15
BDL241	10875,1	P				<0,01	0,03	0,3	0,03
BDL241	10875,1	Av				1,32	1,29	1,16	1,52
BDL242	10731,3	P		0,03			0,06	0,18	0,11
BDL242	10731,3	Av		1,12			1,14	1,13	1,36
BDL242	10731,5	P				0,4	0,11	0,18	0,32
BDL242	10731,5	Av				1,13	1,16	1,1	1,23
BDL242	10731,2	P	0,36
BDL242	10731,2	Av	1,2
BDL242	10731,3	P	<0,01	<0,01	<0,01		0,02	<0,01	0,03
BDL242	10731,3	Av	3,13	2,79	2,3		1,26	1,27	1,65
BDL242	10731,5	P	0,06			0,05	0,05		<0,01
BDL242	10731,5	Av	1,45			1,21	1,16		1,77
BDL242	10731,7	P	<0,01	<0,01	<0,01	0,04	<0,01	<0,01	0,14
BDL242	10731,7	Av	2,48	1,8	1,61	1,36	1,41	1,3	1,72
BDL242	10737,2	P	0,03	0,04	<0,01			0,47
BDL242	10737,2	Av	2,07	1,86	1,9			1,1
BDL247	10911,1	P				<0,01	0,08	0,23
BDL247	10911,1	Av				1,29	1,2	1,13
BDL247	10912,1	P						0,24
BDL247	10912,1	Av						1,13
BDL247	10912,6	P							0,19
BDL247	10912,6	Av							1,19
BDL247	10915,1	P			0,54			0,42

164/218

Continuação da Tabela 21
BDL247	10915,1	Av			1,11			1,12
BDL247	10911,1	P	0,01	0,05	0,02	0,02	0,06	0,05	0,05
BDL247	10911,1	Av	2,19	1,85	1,68	1,46	1,53	1,46	2,05
BDL247	10912,1	P	<0,01	<0,01	0,15		0,21	0,22
BDL247	10912,1	Av	1,48	1,28	1,24		1,11	1,12
BDL247	10912,2	P	0,02	0,01	0,01		0,04.	<0,01
BDL247	10912,2	Av	1,66	1,57	1,41		1,28	1,38
BDL247	10912,6	P					0,45	0,38	0,37
BDL247	10912,6	Av					1,1	1,1	1,13
BDL247	10915,1	P	<0,01	0,01	<0,01			0,35	0,25
BDL247	10915,1	Av	2,22	2,04	1,88			1,15	1,29
BDL248	11051,2	P	0,15	0,1	0,01	0,01	0,01	<0,01	0,09
BDL248	11051,2	Av	1,21	1,26	1,34	1,29	1,44	1,38	1,66
BDL248	11052,2	P	<0,01	<0,01	<0,01		0,01	<0,01	0,01
BDL248	11052,2	Av	2,25	2,23	1,94		1,35	1,33	1,39
BDL248	11053,3	P	0,03	0,02	0,01	<0,01	0,01	0,02	<0,01
BDL248	11053,3	Av	1,56	1,5	1,33	1,38	1,44	1,35	2,29
BDL248	11054,3	P	0,38	0,4			0,21	0,09
BDL248	11054,3	Av	1,11	1,13			1,13	1,18
BDL248	11051,2	P					0,05
BDL248	11051,2	Av					1,1
BDL249	11401,2	P	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,01
BDL249	11401,2	Av	3,01	2,92	2,73	1,78	1,84	1,71	3,51
BDL249	11401,5	P	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL249	11401,5	Av	2,17	1,83	1,52	1,66	1,64	1,41	3,31
BDL249 -	11402,4		0,01	0;01~ -	0,03- -	-0,18 -	• <0,01	<0,0.1	0,04
BDL249	11402,4	Av	1,49	1,44	1,39	1,14 -	1,64 — -	1,49 - -	1,54
BDL249	11403,2	P			0,48		0,19	0,26
BDL249	11403,2	Av			1,12		1,2	1,16
BDL249	11404,3	P				0,09	0,07	0,02	0,12
BDL249	11404,3	Av				1,41	1,4	1,26	1,57
BDL249	11401,2	P ’ '				-0,29 - .	0,2		0,17
BDL249	11401,2	Av				1,11	1,1		1,21
BDL249	1-t40t5----	-P				0,17			0,46
BDL249	11401,5	Av				1,2		---------------	-1t21------
BDL249	11403,2	P				0,04	0,15		0,35
BDL249	11403,2	Av				1,3	1,13		1,23
BDL249	11404,3	P				0,21	0,04	0,12	0,35
BDL249	11404,3	Av				1,11	1,27	1,19	1,14
BDL250	10841,3	P				0,01	0,12	0,17
BDL250	10841,3	Av				1,26	1,23	1,12
BDL250	10842,3	P		0,05	0,23	<0,01	<0,01	<0,01	0,03
BDL250	10842,3	Av		1,16	1,12	1,55	1,5	1,38	1,39
BDL250	10846,2	P				<0,01	<0,01	<0,01
BDL250	10846,2	Av				1,36	1,37	1,29
BDL250	10846,3	P				0,09	<0,01	<0,01	0,12
BDL250	10846,3	Av				1,33	1,39	1,29	1,44
BDL250	10841,3	P	0,01	0,1	0,09	<0,01	<0,01	<0,01	0,01
BDL250	10841,3	Av	1,23	1,21	1,22	1,82	1,89	1,68	2,37
BDL250	10842,3	P	0,05	0,15	0,26	<0,01	0,23	0,48	0,02
BDL250	10842,3	Av	1,73	1,59	1,5	1,4	1,26	1,14	2,03
BDL250	10843,2	P	0,01	0,02	0,04	<0,01	0,01	0,01	<0,01
BDL250	10843,2	Av	1,97	1,67	1,61	1,37	1,44	1,37	2,33
BDL250	10846,2	P	<0,01	0,01	<0,01	0,11	0,02	<0,01	0,08
BDL250	10846,2	Av	2,3	1,59	1,69	1,21	1,33	1,36	1,39
BDL250	10846,3	P	<0,01	<0,01	<0,01	0,01	<0,01	<0,01	0,01
BDL250	10846,3	Av	1,92	1,69	1,78	1,66	1,98	1,79	2,83
BDL252	10881,1	P	<0,01	<0,01	<0,01	0,13	0,01	<0,01	0,04
BDL252	10881,1	Av	1,96	1,94	1,72	1,29	1,48	1,42	1,52
BDL252	10882,1	P	<0,01	<0,01	<0,01	0,05	0,01	0,01	0,02
BDL252	10882,1	Av	2,97	2,36	2,12	1,65	1,88	1,77	3,43

165/218

Continuação da Tabela 21
BDL252	10882,2	P	<0,01	<0,01	<0,01	0,03	0,04	<0,01	0,03
BDL252	10882,2	Av	1,89	1,48	1,43	1,47	1,54	1,45	2,04
BDL252	10882,4	P	0,03	<0,01	0,11	<0,01	0,01	0,03	0,01
BDL252	10882,4	Av	1,64	1,4	1,3	1,7	1,48	1,31	2,99
BDL252	10884,1	P	<0,01	0,02	0,13
BDL252	10884,1 -	Av	1,55	1,31 -	-1,17 .
BDL58	10281,5	P	0,23	0,48	0,16
BDL58	10281,5	Av	1,25	1,18	1,3
BDL58	10282,3	P	<0,01	<0,01	0,01	0,12	<0,01	<0,01	0,26
BDL58	10282,3	Av	1,79	1,72	1,77	1,27	1,62	1,62	1,43
BDL62	10682,1	P							0,53
BDL62	10682,1	Av							1,16
BDL62	10684,2	P				0,01			0,22
BDL62	10684,2	Av				1,43			1,3
BDL62	10682,1	P		0,37	0,56
BDL62	10682,1	Av		1,17	1,16
BDL62	10684,2	P						0,09
BDL62	10684,2	Av						1,13
BDL64	10651,5	P		0,08	0,27
BDL64	10651,5	Av		1,26	1,56
BDL64	10653,1	P	0,01	0,06	0,01
BDL64	10653,1	Av	1,24	1,23	1,53
BDL64	10654,3	P		0,32	0,3	0,2	0,04	0,09
BDL64	10654,3	Av		1,21	1,38	1,11	1,4	1,4
BDL64	10651,1	P		0,53
BDL64- =	10651,1 .	Av	-	1,11 -	— - _	—
BDL64	10653,1	P	0,11	0,02 -	0,05 '	0,01 -	<0,01 -	0,01	0,14 .
BDL64	10653,1	Av	1,34	1,57	1,61	1,34	1,42	1,28	1,34
BDL64	10654,3	P	0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,01	0,29
BDL64	10654,3	Av	1,41	1,49	1,46	1,28	1,29	1,23	1,27
BDL64	10651,1	P	<0,01	<0,01		0,02	0,15		0,2
BDL64	10651,1 “	Av ”	1;5 -	-1,31 -		. 1,41	1,13		1,44
BDL64	10651,3	P				<0,01	<0,01	0,13	<0,01 “
BDt64----	-W65473--	Av				1,96	1,41	1,15	3,02
BDL64	10653,1	P				0,03	o;3--------		0,08------
BDL64	10653,1	Av				1,64	1,18		1,64
BDL64	10654,3	P				<0,01	0,22		0,04
BDL64	10654,3	Av				1,82	1,23		2,34
BDL79	11041,1	P							0,62
BDL79	11041,1	Av							1,12
BDL79	11042,1	P							0,61
BDL79	11042,1	Av							1,13
BDL79	11043,1	P							0,08
BDL79	11043,1	Av							1,64
BDL79	11042,3	P						0,33
BDL79	11042,3	Av						1,12
BDL79	11043,1	P			0,04	0,17	<0,01	0,01	0,37
BDL79	11043,1	Av			1,23	1,19	1,36	1,29	1,19
BDL81	10372,2	P	<0,01	0,35	0,43
BDL81	10372,2	Av	1,25	1,11	1,13
BDL81	10374,1	P							0,3
BDL81	10374,1	Av							1,24
BDL85	10411,3	P					0,08	0,03
BDL85	10411,3	Av					1,15	1,12
BDL85	10414,1	P	0,2		0,04
BDL85	10414,1	Av	1,16		1,26
BDL85	10414,2	P	0,19	0,02	<0,01
BDL85	10414,2	Av	1,1	1,2	1,35
BDL88	10291,2	P	0,01	0,03	0,03			0,07
BDL88	10291,2	Av	1,88	1,59	1,52			1,13
BDL88	10291,4	P	0,02	<0,01	<0,01		0,03	<0,01

166/218

Continuação da Tabela 21
BDL88	10291,4	Av	1,45	1,43	1,53		1,21	1,28
BDL88	10291,5	P	0,12	0,15	0,37				0,67
BDL88	10291,5	Av	1,43	1,35	1,17				1,11
BDL88 -	10293,3	P	<0,01 .	<0,01	<0,01				0,57
BDL88	10293,3	Av	2,76	2,34	2,24			-	1,12
BDL88	10291,2	P	<0,01	<0,01	<0,01
BDL88	10291,2	Av	1,64	1,57	1,58
BDL88	10291,4	P	<0,01	<0,01	<0,01
BDL88	10291,4	Av	1,67	1,5	1,53
BDL88	10291,5	P	<0,01	<0,01	<0,01
BDL88	10291,5	Av	1,8	1,7	1,84
BDL88	10293,3	P	0,03	0,05	0,06
BDL88	10293,3	Av	1,19	1,16	1,22
BDL88	10294,2	P	<0,01	0,01	0,02
BDL88	10294,2	Av	1,82	1,66	1,78
BDL90	10924,2	P				0,05	0,01	<0,01	0,16
BDL90	10924,2	Av				1,43	1,55	1,48	1,9
BDL90	10925,4	P				<0,01	<0,01	<0,01	0,07
BDL90	10925,4	Av				1,95	1,91	1,62	2,22
BDL90	10924,2	P	0,12	0,2	0,09	0,02	0,01	0,01	0,04
BDL90	10924,2	Av	1,32	1,23	1,22	1,31	1,31	1,31	1,93
BDL90	10925,4	P	0,04	0,12		<0,01	<0,01	<0,01	0,02
BDL90	10925,4	Av	1,25	1,15		1,68	1,61	1,51	2,25
BDL90- ~	10921,6	P- -			0,1
BDL90	10921,6~‘	Av -	— ... —	- — -	1,19			' —	- -- -
BDL90	10924,2	P			0,38	<0,01	<0,01	<0,01	0,03 ’ ‘
BDL90	10924,2	Av			1,13	1,48	1,6	1,51	1,41
BDL90	10925,4	P	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL90	10925,4	Av	1,6	1,66	1,8	1,85	1,81	1,71	2,9
BDL94 *	-117-21Λ ’	-P- -	0,04 - .	0,03	0,07
BDL94	11721,4	Av	1,41	1,39	1,16	*	- - --r	— = - --	- - -
BDL94	11725,2	P	0,04
oULy4 BDL94	I I l ά-Ό,Ζ. 11725,3	P	0,04
BDL94	11725,3	Av	1,21
BDL94	11725,5	P	0,14
BDL94	11725,5	Av	1,1
BDL94	11725,3	P	0,01
BDL94	11725,3	Av	1,29

Tabela 21. P = valor de P; AV = relação entre as médias do evento e controle. Observe que quando a proporção média é superior a 1 o efeito da expressão do gene exógeno é um aumento da característica desejada; Par =

parâmetro de	acordo com	os parâmetros	medidos;
Evevento = .	TP1 - Momento	1 TP2 = Momento	2 ; TP3 =
Momento 3.
Tabela 22

Resultados obtidos em um ensaio de cultura de tecidos

167/218

Gene	Εν.	Par.	Cobertur a das Raízes TP2	Cobertur a das Raízes TP3	RGR da	RGR da Cobertura das Raizes	RGR do Comprim ento das Raízes	Peso Fresco	Peso Seco
Ml Cd Folha	uc
BDL102	10471,1	P	0,08	0,05		0,11	0,36
BDL102	10471,1	Av	1,58	1,35		1,26	1,11
BDL102	10471,3	P	0,08	0,15		0,02	0,15
BDL102	10471,3	Av	1,72	1,58		1,57	1,18
BDL102	10472,1	P	0,19	0,28		0,25		0,29
BDL102	10472,1	Av	1,28	1,22		1,19		1,18
BDL102	10474,2	P	0,33	0,16	0,01	0,02	0,07	0,21	0,26
BDL102	10474,2	Av	1,22	1,38	1,4	1,44	1,19	1,53	1,5
BDL102	10474,6	P		0,2	0,31	0,14
BDL102	10474,6	Av		1,19	1,15	1,22
BDL118	10481,2	P	0,13	0,24	<0,01	0,14	0,28	0,03	0,01
BDL118	10481,2	Av	1,2	1,19	1,99	1,23	1,15	2,14	1,99
BDL118	10481,5	P			0,01			0,02	0,01
BDL118	10481,5	Av			1,36			2,03	1,97
BDL118	10483,4	P						0,07	0,03
BDL118	10483,4	Av						1,93	1,65
BDL118	10484,3	P			<0,01			<0,01	<0,01
BDL118	10484,3	Av			1,6			1,98	2,01
BDL140	10421,3	P	0,14	0,06	<0,01	<0,01		0,03	0,13
BDL140	10421,3	Av	1,45	1,64	1,7	1,68		1,81	1,57
BDL140	10423,1	P	0,21	0,28	0,22	0,16		0,41	0,33
BDL140	10423,1	Av	1,31	1,25	1,21	1,25		1,17	1,16
BDL140 -	10424,4	P'	— . _	0,18- -	<0,01	-	0,2 - -	__	0,08	0,45
BDL140	10424,4	Av		1,13	1,66”	-	1718 ’ -		1,46· -	1,2 - ..
BDL152	10431,4	P		0,21	0,24	0,13		0,23	0,02
BDL152	10431,4	Av		1,23	1,18	1,27		1,18	1,27
BDL152	10432,5	P	0,1	0,04		0,03
BDL152	10432,5	Av	1,25	1,31		1,32
BDL152	10434,4 ’	’P -	0,02 -	<0,01 -	- -	--	<0,01. -.	0,03„
BDL152 -	10434,4 —1044-2 2	Av P	1,76 n 04	1,51 n w		1,44	1,23
BDL153	10142,2	Av	1,57	1,1
BDL153	10144,1	P	0,09	0,12	0,02	0,09	0,12	0,36
BDL153	10144,1	Av	1,51	1,32	1,42	1,35	1,18	1,18
BDL154	10703,1	P	0,38	0,47		0,52	0,44
BDL154	10703,1	Av	1,13	1,18		1,15	1,13
BDL154	10703,3	P					0,34
BDL154	10703,3	Av					1,17
BDL154	10703,5	P						0,38	0,16
BDL154	10703,5	Av						1,11	1,16
BDL154	10703,1	P	0,03	0,05	<0,01	0,01	0,01	0,01	0,01
BDL154	10703,1	Av	1,48	1,55	1,71	1,7	1,37	1,36	1,57
BDL154	10703,5	P	0,1	0,04	0,11	0,01	<0,01	0,34	0,11
BDL154	10703,5	Av	1,75	1,7	1,29	1,73	1,59	1,24	1,38
BDL154	10703,6	P	0,07	0,04		0,07	0,14
BDL154	10703,6	Av	1,63	1,47		1,45	1,28
BDL155	9991,2	P						0,22	0,45
BDL155	9991,2	Av						1,44	1,27
BDL155	9993,2	P						0,55
BDL155	9993,2	Av						1,45
BDL155	9994,4	P					0,19
BDL155	9994,4	Av					1,13
BDL156	10852,6	P	0,41	0,51		0,19	0,09
BDL156	10852,6	Av	1,1	1,12		1,21	1,22
BDL156	10852,7	P					0,35
BDL156	10852,7	Av					1,13
BDL156	10853,6	P	0,58	0,25	0,07	0,07	0,16	0,28	0,04
BDL156	10853,6	Av	1,13	1,24	1,21	1,33	1,19	1,2	1,26

168/218

Continuação da Tabela 22
BDL156	10852,6	P			0,05	0,59	0,33	0,35	0,21
BDL156	10852,6	Av			1,29	1,13	1,16	1,12	1,24
BDL156	10853,6	P	0,42	0,25	<0,01	0,05	0,06	<0,01	0,01
BDL156	10853,6	Av	1,29	1,69	1,97	1,83	1,43	1,78	2,26
BDL156	10854,4	P		0,03	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL156	10854,4	Av		1,59	1;87	1,76	1,53 -	1,61	1,94
BDL156	10855,3	P	0,32	<0,01	<0,01	<0,01	0,01	0,46	0,05
BDL156	10855,3	Av	1,17	1,78	1,49	1,99	1,44	1,18	1,42
BDL158	9973,3	P	0,26
BDL158	9973,3	Av	1,22
BDL158	9971,3	P		0,12	0,45	0,03	0,3
BDL158	9971,3	Av		1,27	1,11	1,34	1,11
BDL158	9973,1	P		0,04		0,1
BDL158	9973,1	Av		1,25		1,24
BDL158	9973,3	P	0,04	0,27		0,32
BDL158	9973,3	Av	1,43	1,23		1,16
BDL158	9974,2	P	0,01	0,03	0,34	<0,01			0,49
BDL158	9974,2	Av	1,48	1,41	1,14	1,45			1,1
BDL158	9974,3	P	0,08	0,05	0,02	<0,01		0,01	0,01
BDL158	9974,3	Av	1,5	1,49	1,54	1,54		1,5	1,54
BDL158	9971,3	P		0,33	0,06	0,13	<0,01
BDL158	9971,3	Av		1,13	1,25	1,24	1,46
BDL158	9973,1	P	0,09	0,25	0,02	0,45	0,29		0,16
BDL158	9973,1	Av	1,22	1,22	1,37	1,13	1,13		1,2
BDL158	9973,3	P	0,02	0,1		0,03	<0,01
BDL158 -	9973,3 -	-Av=-	„1,62 1.	.1743	—	1,42 - -	1,4 -	-
BDL158	9974,2	P	0,06	0,02		0,03			-- — ·
BDL158	9974,2	Av	1,21	1,24		1,32
BDL158	9974,3	P			0,51
BDL158	9974,3	Av			1,11
BDL160	10011,5	P			0,24			<0,01	0,53
BDL160	10011,5	Av	— - -		1,23 -	- - -	- . _	. 1,48	.1,33 .
BDL160	10011,6	P						0,51	0,66
BDL160	10011-,6-----	Av---						1,18	1,1
BDL160	10011,7	P						0,56
BDL160	10011,7	Av						1,28
BDL160	10015,1	P						0,03	0,12
BDL160	10015,1	Av						1,57	1,25
BDL160	10011,5	P	0,61	0,38		0,42
BDL160	10011,5	Av	1,11	1,14		1,14
BDL160	10013,1	P			0,32
BDL160	10013,1	Av			1,16
BDL160	10014,9	P		0,52		0,37
BDL160	10014,9	Av		1,16		1,18
BDL160	10015,2	P			0,05			0,1	0,11
BDL160	10015,2	Av			1,28			1,29	1,42
BDL167	10042,3	P					0,12
BDL167	10042,3	Av					1,17
BDL167	10043,1	P		0,58	0,13	0,21	0,23
BDL167	10043,1	Av		1,17	1,16	1,25	1,18
BDL167	10043,2	P			0,18	0,34	0,09
BDL167	10043,2	Av			1,14	1,1	1,19
BDL167	10043,3	P	0,1	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL167	10043,3	Av	1,27	1,67	1,54	1,79	1,46
BDL167	10044,2	P	0,05	<0,01	<0,01	<0,01	0,08		0,61
BDL167	10044,2	Av	1,26	1,48	1,38	1,55	1,2		1,12
BDL167	10043,1	P	<0,01	0,17	0,04	0,16	0,14	0,06
BDL167	10043,1	Av	1,63	1,27	1,4	1,3	1,17	1,6
BDL167	10044,2	P	0,01
BDL167	10044,2	Av	1,39
BDL168	9881,4	P	<0,01	0,14		0,08	0,05

169/218

Continuação da Tabela 22
BDL168	9881,4	Av	1,74	1,47		1,42	1,21
BDL168	9882,1	P	0,08	0,69
BDL168	9882,1	Av	1,85	1,11
BDL168	9884,1	P	<0,01	0,11		0,34	0,22
BDL168	9884,1	Av	1,84	1,29		1,2	1,15
BDL169	10744,2	P	0,02	0,17	-	0,13	0,24
BDL169	10744,2	Av	1,34	1,21		1,22	1,16
BDL169	10747,1	P	0,39			0,4
BDL169	10747,1	Av	1,1			1,11
BDL169	10747,5	P	0,04	0,02		0,02	0,07
BDL169	10747,5	Av	1,59	1,41		1,37	1,28
BDL171	10661,2	P	0,03	0,01	0,19	<0,01	0,01	0,06	0,02
BDL171	10661,2	Av	2,26	2,17	1,28	2,22	1,3	1,73	2,47
BDL171	10661,5	P		0,14	0,32	0,04		0,02	<0,01
BDL171	10661,5	Av		1,33	1,19	1,38		1,35	2,02
BDL171	10662,3	P		0,32		0,19			0,56
BDL171	10662,3	Av		1,12		1,18			1,13
BDL171	10663,3	P				0,45			0,39
BDL171	10663,3	Av				1,14			1,19
BDL171	10664,1	P		0,26	0,25	0,1	0,46	0,03	0,03
BDL171	10664,1	Av		1,33	1,24	1,35	1,1	1,39	1,89
BDL173	9951,2	P	0,37					0,27
BDL173	9951,2	Av	1,32					1,43
BDL173	9952,1	P	0,04	0,02		0,01	0,08
BDL17-3	9952,1	Av	2,68	1,72		1,61	1,21
BDL173 -	9952,2- - -	-P=-	^0,15-.	0,56 ’		-	- - -	- - ...
BDL173	9952,2	Av	1,44	1,11			.. . —	....... ;
BDL173	9954,3	P						0,14
BDL173	9954,3	Av						1,46
BDL174	11082,1	P	0,29	0,39		0,43	0,05
BDL174 „	11082,1	Av	1,24	1,15		1,14	1,26
BDL174	11083,1	P	0,07 ~	0,11 - -	0,41	0,05 - -	0Γ15 -	. 0,48.	0,37
BDL174 '	11083,1	Av	1,76	1,43	1,13	1,42	1,21	1,1	1,2
BDIZT74----					0,13	0,09	0,04	0,2	0,4
I ιυοϋ,ζ	Γ	tçT/	υ,ζο------
BDL174	11083,2	Av	1,27	1,36	1,26	1,38	1,44	1,21	r 1,19
BDL174	11084,1	P	0,04	0,06	<0,01	<0,01	0,01	0,06	0,05
BDL174	11084,1	Av	2,13	1,94	2,01	1,96	1,42	2,06	2,27
BDL174	11085,1	P	<0,01	<0,01	0,1	<0,01	<0,01	0,2	0,24
BDL174	11085,1	Av	2,66	2,13	1,27	2,17	2	1,24	1,37
BDL174	11083,2	P			0,19			0,12	0,29
BDL174	11083,2	Av			1,15			1,2	1,14
BDL174	11084,1	P	0,6
BDL174	11084,1	Av	1,1
BDL174	11085,1	P	0,05	0,32
BDL174	11085,1	Av	1,42	1,14
BDL176	9891,4	P		0,67	0,01	0,47		0,06
BDL176	9891,4	Av		1,11	1,45	1,17		2,02
BDL176	9893,2	P	0,21	0,4	0,22	0,26		0,15
BDL176	9893,2	Av	1,37	1,22	1,21	1,25		1,38
BDL176	9893,3	P	0,47	0,23		0,12		0,14	0,48
BDL176	9893,3	Av	1,17	1,31		1,3		1,29	1,22
BDL177	10521,3	P	0,66	0,34		0,28	0,06
BDL177	10521,3	Av	1,1	1,15		1,17	1,3
BDL181 -	11293,6	P		0,59	0,1	0,37	0,45	0,39	0,37
BDL181	11293,6	Av		1,15	1,3	1,24	1,15	1,17	1,26
BDL181	11294,7	P			0,04		0,12	0,11	0,1
BDL181	11294,7	Av			1,36		1,28	1,26	1,38
BDL181	11293,1	P			0,25	0,4	0,02	0,05	0,02
BDL181	11293,1	Av			1,19	1,11	1,22	1,59	1,58
BDL181	11293,6	P	0,23	0,15	<0,01	0,09	0,03	<0,01	<0,01
BDL181	11293,6	Av	1,23	1,22	1,34	1,25	1,18	1,48	1,45

170/218

Continuação da Tabela 22
BDL181	11294,7	P	0,02	0,21	0,3	0,05	0,01		0,57
BDL181	11294,7	Av	1,55	1,26	1,11	1,3	1,23		1,1
BDL182	10691,8	P			0,42			0,06	0,01
BDL182	10691,8	Av			1,15			1,53	2,11
BDL182	10692,2	P	0,53	0,2	0,28	0,07		0,28	0,15
BDL182	10692,2	Av	1,12	1,21- -	1,-21	1,28 -		-1,47	1,93
BDL182	10692,3	P		0,63		0,3	0,43
BDL182	10692,3	Av		1,13		1,21	1,1
BDL182	10693,3	P	0,02	0,03	0,22	<0,01		0,17	0,01
BDL182	10693,3	Av	1,37	1,55	1,25	1,62		1,41	1,88
BDL182	10693,5	P	0,02	<0,01	0,32	<0,01	0,13	0,06	0,01
BDL182	10693,5	Av	1,47	1,72	1,19	1,8	1,13	1,38	1,91
BDL183	9943,4	P	0,19	0,3		0,48
BDL183	9943,4	Av	1,3	1,16		1,13
BDL183	9944,4	P	0,02	0,52		0,46	0,06	0,44
BDL183	9944,4	Av	1,37	1,15		1,15	1,2	1,16
BDL189	11353,3	P		0,17	0,18	0,18			0,46
BDL189	11353,3	Av		1,18	1,16	1,2			1,1
BDL189	11351,2	P			0,43				0,4
BDL189	11351,2	Av			1,1				1,17
BDL189	11353,3	P		0,24	0,22	0,11			0,33
BDL189	11353,3	Av		1,15	1,11	1,22			1,1
BDL189	11353,5	P						0,65
BDL189	11353,5	Av						1,1
BDL189	11355,4	P			0,22			0,28	0,32
BDL189 -	-11355,4 „	_..		—- .—	-1,11 - .	- - -		1,36 -	1,13
BDL196	10242,2	P				— - —	0,28	0,49	- - — - - -
BDL196	10242,2	Av					1,13	1,15
BDL196	10243,4	P	<0,01	0,12	0,12	0,13	0,17	0,57
BDL196	10243,4	Av	1,45	1,36	1,27	1,34	1,17	1,11
BDL196	10244,1	P	0,16	0,43		0,28		0,02
BDL196	10244,1	Av	Ί,65~	1/27 - -	-	1,27 -	1 -=	: 1,45 .
BDL196	10242,2	P			0,47
BDCT96	10242r2----	-Av---			1.J
BDL196	10243,3	P			0,6			X43
0,23
BDL196	10243,3	Av			1,1			1,13	1,23
BDL196	10243,4	P	0,51	0,15	<o,oí	0,11	0,16	0,13	0,03
BDL196	10243,4	Av	1,12	1,23	1,65	1,27	1,18	1,42	1,69
BDL197	11362,2	P		0,33	0,03	0,18	0,14		0,38
BDL197	11362,2	Av		1,18	1,35	1,32	1,24		1,19
BDL197	11363,1	P		0,23		0,12	<0,01
BDL197	11363,1	Av		1,25		1,38	1,53
BDL197	11363,6	P	0,39	0,01	0,05	<0,01	0,04	0,02	0,04
BDL197	11363,6	Av	1,19	1,59	1,31	1,77	1,36	1,41	1,61
BDL197	11364,1	P		0,04	<0,01	<0,01	<0,01	0,08	<0,01
BDL197	11364,1	Av		1,67	1,63	1,85	1,48	1,44	1,91
BDL197	11364,5	P			0,02	0,47		0,11	0,04
BDL197	11364,5	Av			1,37	1,16		1,18	1,42
BDL197	11363,1	P					0,1	0,53	0,17
BDL197	11363,1	Av					1,12	1,1	1,23
BDL197	11363,6	P	0,11	0,03	0,01	<0,01	<0,01	0,06	0,04
BDL197	11363,6	Av	1,39	1,49	1,3	1,58	1,24	1,45	1,55
BDL197	11364,1	P	0,3			0,53		0,62	0,07
BDL197	11364,1	Av	1,18			1,11		1,16	1,75
BDL197	11364,5	P					0,12		0,49
BDL197	11364,5	Av					1,12		1,13
BDL201	9961,2	P			0,47			0,57	0,47
BDL201	9961,2	Av			1,13			1,1	1,15
BDL201	9961,3	P						0,13
BDL201	9961,3	Av						1,39
BDL201	9961,4	P	0,19	0,41

171/218

Continuação da Tabela 22
BDL201	9961,4	Av	1,3	1,14
BDL201	9964,3	P	0,17	0,05		0,27
BDL201	9964,3	Av	1,25	1,21		1,15
BDL203	9831,14	P						0,62	0,42
BDL203	9831,14	Av						1,13	1,27
BDL203	9831,7 .	P					0,11 -
BDL203	9831,7	Av					1,22
BDL203	9833,6	P						0,71
BDL203	9833,6	Av						1,14
BDL203	9835,2	P					0,33
BDL203	9835,2	Av					1,14
BDL220	10331,2	P						<0,01	0,06
BDL220	10331,2	Av						1,51	1,25
BDL220	10331,5	P		0,22	<0,01	0,1	0,27	0,05	0,11
BDL220	10331,5	Av		1,22	1,81	1,28	1,11	1,97	1,6
BDL220	10333,5	P						0,47	0,41
BDL220	10333,5	Av						1,16	1,18
BDL220	10334,2	P			0,34			0,35
BDL220	10334,2	Av			1,13			1,14
BDL221	10341,1	P						0,19
BDL221	10341,1	Av						1,3
BDL221	10341,3	P			0,01			0,01	<0,01
BDL221	10341,3	Av			1,5			1,92	2,18
BDL221	10341,4	P			0,02			<0,01	0,01
BDL221	10341,4	Av			1,29			1,98	2,04
BDL221 . -	—10343,3	P -	0,03	-0,0-1	0,07—	<0,01 - -	-<0,01	-------	..........
BDL221 - —	10343,3 ......	-Av=—	1,55—“	-1,6	1,21 —	1,6 —	1,41------		::
BDL221	10344,3	P						0,41
BDL221	10344,3	Av						1,11
BDL221	10341,1	P			0,15				0,59
BDL221	10341,1	Av			1,27				1,16
BDL221	10342,1 '	P —	<0,01........	^0,01	0,17	. <0,01 —.	—<0,01	0,25.	0,42 —
BDL221	10342,1	Av	3,03	2,06	1,22	1,88	1,52	1,24	1,24
BDL221	10343,1	P	0,01	<0,01	0,01	<0,01	<0,01	0,15	0,33
BDL221	T0343.1	Av	1,8	f,61	1,62	1,6	1,41	1,46	1,51
BDL221	10343,3	P	0,01	0,02	0,03	<0,01	<0,01 '
BDL221	10343,3	Av	3,03	2,69	1,4	2,71	1,92
BDL221	10343,4	P	0,03	0,08	0,07	<0,01	0,01	0,14	0,08
BDL221	10343,4	Av	2,15	2,07	1,51	2,07	1,49	1,44	1,53
BDL221	10344,3	P	0,01	0,07	0,02	0,02	0,09	0,17	0,12
BDL221	10344,3	Av	1,67	1,49	1,49	1,48	1,23	1,39	1,33
BDL223	10791,1	P					0,33
BDL223	10791,1	Av					1,13
BDL223	10793,5	P	0,1	0,01		0,01	0,02
BDL223	10793,5	Av	1,21	1,32		1,38	1,33
BDL223	10793,8	P					0,21
BDL223	10793,8	Av					1,18
BDL223	10796,1	P				0,58	0,41
BDL223	10796,1	Av				1,1	1,12
BDL223	10796,2	P	0,41				0,33	0,34	0,16
BDL223	10796,2	Av	1,11				1,13	1,14	1,4
BDL223	10791,1	P		0,03	0,02	0,05	0,06		0,3
BDL223	10791,1	Av		1,38	1,34	1,43	1,3		1,24
BDL223	10793,3	P		0,34	<0,01	0,08	0,01	0,24	0,16
BDL223	10793,3	Av		1,45	1,64	1,62	1,48	1,15	1,39
BDL223	10793,5	P	0,47	0,23	0,44	0,15	0,04
BDL223	10793,5	Av	1,13	1,29	1,11	1,34	1,31
BDL223	10793,8	P	<0,01	<0,01	0,07	<0,01	<0,01		0,21
BDL223	10793,8	Av	1,75	1,71	1,26	1,72	1,47		1,26
BDL223	10796,1	P		0,01	0,03	0,01	0,07		0,3
BDL223	10796,1	Av		1,47	1,31	1,61	1,29		1,2

172/218

Continuação da Tabela 22
BDL224	10451,5	P			0,17			0,21	0,2
BDL224	10451,5	Av			1,19			1,28	1,25
BDL224	10451,7	P	0,11	0,16	<0,01	0,01	0,35	0,11	0,19
BDL224	10451,7	Av	1,48	1,67	1,85	1,69	1,13	1,48	1,29
BDL224	10451,8	P				0,5
BDL224	10451,8—	Av .				1,13-	___	. -
BDL226	10861,2	P		0,41	0,41	0,15	0,08
BDL226	10861,2	Av		1,18	1,1	1,26	1,26
BDL226	10861,4	P		0,18		0,03	0,04		0,23
BDL226	10861,4	Av		1,27		1,37	1,28		1,2
BDL226	10862,2	P		0,56		0,23	0,19
BDL226	10862,2	Av		1,11		1,2	1,18
BDL227	1'1491,1	P	<0,01	0,12		0,25
BDL227	11491,1	Av	1,59	1,25		1,2
BDL227	11491,3	P	0,01	0,05	0,06	<0,01	<0,01	0,42	0,35
BDL227	11491,3	Av	1,87	1,71	1,29	1,66	1,52	1,12	1,23
BDL227	11491,5	P	0,01	0,03	0,04	<0,01	<0,01	0,36	0,15
BDL227	11491,5	Av	2,24	2	1,34	1,94	1,58	1,24	1,34
BDL227	11492,5	P	<0,01	0,03	<0,01	<0,01	0,02	0,13	0,12
BDL227	11492,5	Av	2,09	1,71	1,64	1,72	1,39	2,07	1,86
BDL227	11493,5	P	<0,01	0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,16	0,08
BDL227	11493,5	Av	2,13	2,02	1,78	2,05	1,64	1,55	1,73
BDL230	10671,3	P			<0,01			<0,01	<0,01
BDL230	10671,3	Av			1,95			1,84	2,02
BDL231	11111,1	P	0,58	0,12	<0,01	0,1	0,51	0,14	0,55
BDL231-	11111,1	-Av	1,-1-	1724	-175	-1,27 ·-	1,1 —	1,24 -	1,1—
BDL231 ~	11111,2	P -	0,24 -	0,09	<0,01	'0,09	0,16 '	.
BDL231	11111,2	Av	1,18	1,24	1,31	1,27	1,2
BDL231	11111,3	P	0,33	0,08	<0,01	0,03		0,31	0,35
BDL231	11111,3	Av	1,13	1,36	1,38	1,39		1,15	1,2
BDL231	11112,2	P	<0,01	0,01	0,01	<0,01	0,05		0,52
BDL231	11112,2 '	=Av	1,89	1,61	1,3	-1,55	-1,27 —	—	1,21 —
BDL231	11116,5	P	<0,01	<0,01.	<0,01.	<0,01	0,23	0,21	0,05
BDL231	11116,5	Av	1,97	1,79	1,74	1,78	1,18	1,28	1,45
BDL231	11111,1	P	0,09	0,31	<0,01	0,38	0,51	0,1	0,16
BDL231	11111,1	Av	1,25	1,18	1,41	1,16	1,1	1,23	1,2
BDL231	11111,2	P	0,02	0,2	0,01	0,32		0,07	0,28
BDL231	11111,2	Av	1,31	1,19	1,4	1,17		1,46	1,24
BDL231	11112,2	P	0,1
BDL231	11112,2	Av	1,42
BDL232	10904,1	P	0,6	0,26	0,33	0,16	0,11	0,71	0,5
BDL232	10904,1	Av	1,25	1,36	1,29	1,44	1,29	1,14	1,37
BDL232	10905,1	P	0,27	0,24		0,3
BDL232	10905,1	Av	1,18	1,26		1,23
BDL232	10906,3	P	0,48	0,24	0,02	0,07	0,06	0,14	0,13
BDL232	10906,3	Av	1,37	1,63	1,61	1,75	1,44	1,48	1,77
BDL232	10902,2	P	0,02	0,22		0,43
BDL232	10902,2	Av	1,65	1,24		1,12
BDL232	10905,1	P	0,18
BDL232	10905,1	Av	1,28
BDL232	10906,4	P					0,06
BDL232	10906,4	Av					1,15
BDL233	10822,4	P					0,28
BDL233	10822,4	Av					1,13
BDL233	10824,2	P					0,05
BDL233	10824,2	Av					1,25
BDL233	10825,3	P					0,1
BDL233	10825,3	Av					1,21
BDL233	10825,4	P	<0,01	0,01		<0,01	0,03
BDL233	10825,4	Av	1,78	1,49		1,43	1,29
BDL233	10822,4	P			0,04		0,19	0,26	0,37

173/218

Continuação da Tabela 22
BDL233	10822,4	Av			1,37		1,21	1,18	1,24
BDL233	10824,1	P			0,43		0,48
BDL233	10824,1	Av			1,11		1,1
BDL233	10824,2	P		0,38	0,3	0,19	<0,01
BDL233	10824,2	Av		1,16	1,16	1,29	1,5
BDL233	10825,4	P	0,22	0,02	0,18	0,04	0,01 .		0,42 -
BDL233-	10825,4	Av	Ί,23	1,44	1,23	1,46	1,47		1,14
BDL235	11412,2	P		0,34		0,33	0,4
BDL235	11412,2	Av		1,14		1,17	1,11
BDL235	11413,2	P	0,07	0,06		0,03
BDL235	11413,2	Av	1,43	1,39		1,38
BDL235	11413,3	P						0,51	0,3
BDL235	11413,3	Av						1,15	1,18
BDL235	11411,2	P					0,08		0,62
BDL235	11411,2	Av					1,16		1,15
BDL235	11413,2	P	<0,01	0,08		0,12	0,15
BDL235	11413,2	Av	1,61	1,33		1,22	1,15
BDL235	11413,3	P					0,09
BDL235	11413,3	Av					1,16
BDL237	10892,1	P						0,05	0,14
BDL237	10892,1	Av						1,43	1,33
BDL237	10892,2	P	0,18	0,19		0,4	0,18
BDL237	10892,2	Av	1,23	1,16		1,14	1,18
BDL237	10893,1	P	0,23	0,29	0,51	0,28	0,09
BDL237	10893,1	Av	1,2	1,17	1,11	1,19	1,25
BDL237	10895,3	P	0,01	0,01	<0,01	<0,01	-<0,01-	0,09 -	0,05 -
BDL237	10895,3	. Av	.2,68. —	2,3 -	1,85 -	2732 - -	1,77	1,59	1,71 “
BDL237	10896,1	P		0,71		0,57	0,27
BDL237	10896,1	Av		1,11		1,13	1,21
BDL238	10951,4	P	0,51
BDL238	10951,4	Av	1,13
BDL238	10952,3	P	0,12	0,12		0,25	.0,09	+ ==-
BDL238 -	10952,3	Av	1,3	1,29		1,25	1,32
BDL238	10953,1	P			0,37		0,37
oLzLZJo BDL238	l·—wyoo, Ί----- 10954,2	AV P		0,52	1,14	0,61	1,10 0,5	-
BDL238	10954,2	Av		1,13		1,11	1,12
BDL238	10954,3	P							0,67
BDL238	10954,3	Av							1,12
BDL240	10802,2	P					0,47
BDL240	10802,2	Av					1,1
BDL240	10806,6	P	0,33	0,43		0,27	0,19
BDL240	10806,6	Av	1,28	1,19		1,2	1,18
BDL240	10802,2	P	0,38				0,1
BDL240	10802,2	Av	1,17				1,24
BDL240	10803,5	P			0,48		0,17
BDL240	10803,5	Av			1,12		1,18
BDL240	10806,6	P	0,01	0,03	0,05	<0,01	0,01	0,15	0,26
BDL240	10806,6	Av	2,85	2,11	1,38	1,97	1,44	1,32	1,34
BDL241	10875,1	P	0,1				0,46
BDL241	10875,1	Av	1,25				1,13
BDL241	10873,1	P					0,22		0,61
BDL241	10873,1	Av					1,19		1,11
BDL241	10874,2	P					0,45
BDL241	10874,2	Av					1,11
BDL241	10874,3	P	0,54	0,05	0,01	0,03	0,05	0,08	0,01
BDL241	10874,3	Av	1,1	1,43	1,47	1,53	1,32	1,21	1,55
BDL241	10875,1	P	0,09	0,53
BDL241	10875,1	Av	1,36	1,13
BDL242	10731,3	P	<0,01	0,2		0,19	0,12		0,2
BDL242	10731,3	Av	1,38	1,21		1,19	1,21		1,22

174/218

Continuação da Tabela 22
BDL242	10731,5	P	0,1	0,31		0,32
BDL242	10731,5	Av	1,34	1,16		1,15
BDL242	10737,1	P					0,32
BDL242	10737,1	Av					1,14
BDL242	10731,3	P	<0,01	0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,05	0,04
BDL242	10731,3	Av	1,75	1,62	2,15	1,62	1,39	2,12	2,23
BDL242	10731,5	P	0,06
BDL242	10731,5	Av	1,29
BDL242	10731,7	P	<0,01	<0,01	0,01	0,01	0,03	0,01	0,04
BDL242	10731,7	Av	1,85	1,49	1,45	1,47	1,28	1,64	1,86
BDL242	10737,2	P	0,47	0,23	<0,01	0,07	0,05	<0,01	0,01
BDL242	10737,2	Av	1,26	1,38	1,86	1,43	1,32	1,91	2,05
BDL245	10811,2	P	0,54	0,17		0,08	0,21		0,3
BDL245	10811,2	Av	1,1	1,22		1,28	1,16		1,14
BDL245	10813,3	P					0,09
BDL245	10813,3	Av					1,22
BDL245	10816,3	P					0,14
BDL245	10816,3	Av					1,18
BDL247	10912,1	P		0,08		0,02	0,01
BDL247	10912,1	Av		1,31		1,4	1,37
BDL247	10912,2	P					0,08
BDL247	10912,2	Av					1,22
BDL247	10915,1	P		0,45	0,22	0,14	0,02		0,53
BDL247	10915,1	Av		1,19	1,2	1,28	1,4		1,12
BDL247	10911,1	P	0,15	0,1	0,01	0,01	0,02	0,3	0,23
BDL247-----	-10914,1	Av	1,96	1,8 -	1,6	1,79	1,45	1,38	1,5
BDL247 -	-10912,1	P	0,32 - =	0,4”	0,24	0,25 '	0,13’	0,32	0,14
BDL247	10912,1	Av	1,15	1,22	1,2	1,24	1,21	1,27	1,56
BDL247	10912,2	P	0,04	0,01	0,03	<0,01	<0,01	0,09	0,3
BDL247	10912,2	Av	1,73	1,74	1,36	1,81	1,62	1,41	1,35
BDL247	10912,6	P		0,61		0,57	0,39	0,21	0,48
BDL247 .	a0912,6	Av		1,11-		1,11	-.1,13—-----	1,37	1,3
BDL247	10915,1	P	0,23	0,14	<0,01	0,03	0,08	0,02	0,06
BDL247	10915,1	Av	1,47	1,52	1,81	1,54	1,3	1,74	1,58
BDL248	11051,2	P	<0,01	0,01	0,03	0,02	<0,01	0,21
BDL248	11051,2	Av	1,61	1,45	1,36	1,43	1,42	1,22
BDL248	11052,2	P	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,04	0,01
BDL248	11052,2	Av	1,89	1,68	1,89	1,7	1,44	1,74	1,81
BDL248	11053,3	P	<0,01	<0,01	0,07	<0,01	0,03	0,46	0,65
BDL248	11053,3	Av	2,04	1,62	1,29	1,57	1,34	1,13	1,14
BDL248	11054,3	P	0,15	0,15		0,24	0,04
BDL248	11054,3	Av	1,18	1,18		1,19	1,29
BDL248	11051,2	P					0,18
BDL248	11051,2	Av					1,1
BDL248	11054,2	P					0,18
BDL248	11054,2	Av					1,1
BDL249	11401,2	P	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL249	11401,2	Av	3,19	2,43	2,68	2,35	1,67	2,55	3,02
BDL249	11401,5	P	<0,01	0,01	0,02	<0,01	0,02	0,39	0,44
BDL249	11401,5	Av	2,63	1,94	1,4	1,83	1,3	1,19	1,23
BDL249	11402,4	P	<0,01	<0,01	0,03	<0,01	<0,01	0,03	0,1
BDL249	11402,4	Av	2,42	1,99	1,38	2,02	1,65	1,37	1,43
BDL249	11403,2	P		0,46	0,34	0,27	0,2	0,56
BDL249	11403,2	Av		1,22	1,17	1,25	1,21	1,11
BDL249	11404,3	P	0,01	0,07		0,23	0,22
BDL249	11404,3	Av	1,43	1,22		1,19	1,19
BDL249	11401,5	P		0,31		0,45
BDL249	11401,5	Av		1,1		1,11
BDL249	11404,3	P	0,03	0,22		0,2	0,04
BDL249	11404,3	Av	1,33	1,18		1,18	1,23
BDL250	10842,3	P	<0,01	0,01	0,21	<0,01	0,02		0,34

175/218

Continuação da Tabela 22
BDL250	10842,3	Av	1,69	1,54	1,15	1,56	1,29		1,24
BDL250	10846,2	P	0,01	<0,01	0,29	<0,01	0,05	0,4	0,21
BDL250	10846,2	Av	1,43	1,41	1,12	1,45	1,25	1,19	1,33
BDL250	10846,3	P	0,02	0,36			0,05
BDL250	10846,3	Av	1,37	1,11			1,26
BDL250	10841,3	P	0,01	0,02	0,17	<0,01	<0,01
BDL250	10841,3	Av	1,99	1,66	1,22	1,61	1,62
BDL250	10842,3	P	0,23	0,52	0,12	0,44		0,41	0,59
BDL250	10842,3	Av	1,57	1,28	1,45	1,22		1,6	1,27
BDL250	10843,2	P	0,03	0,07	0,01	0,01	0,01	0,02	0,1
BDL250	10843,2	Av	1,85	1,67	1,55	1,62	1,37	1,53	1,6
BDL250	10846,2	P	0,04	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,45	0,67
BDL250	10846,2	Av	1,46	1,68	1,58	1,7	1,43	1,22	1,15
BDL250	10846,3	P	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,05	0,03
BDL250	10846,3	Av	2,79	2,32	1,76	2,28	1,84	1,8	1,87
BDL252	10881,1	P	0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,09	0,19
BDL252	10881,1	Av	2,1	1,87	1,68	1,9	1,48	1,43	1,68
BDL252	10882,1	P	0,01	0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,18	0,18
BDL252	10882,1	Av	3,11	2,51	1,97	2,43	1,82	1,4	1,51
BDL252	10882,2	P	0,05	<0,01	0,04	<0,01	0,01		0,62
BDL252	10882,2	Av	1,87	1,74	1,35	1,72	1,44		1,11
BDL252	10882,4	P	0,01	0,01	0,17	0,01	0,38
BDL252	10882,4	Av	2,06	1,62	1,24	1,52	1,13
BDL252	10884,1	P			0,5			0,24	0,24
BDL252	10884,1	Av			1,1			1,22	1,3
BDL58	10281,5	P			0,07	0,46 -	0,15-----	0,55 —	0,02 -
BDL58 —-	-10281,5 —	Av - -			-1,32 -	1,15 —	118	1,14 “	1,37—
BDL58	10282,3	P	<0,01	0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL58	10282,3	Av	1,94	2,18	1,77	2,29	1,81	1,79	1,83
BDL58	10285,3	P					0,06
BDL58	10285,3	Av					1,21
BDL62	10682,1	P		0,31	-0,43 „	0,12			0,4 —
BDL62	10682,1	Av		1,35	1,19	1,46			1,33
BDL62	10684,2	P		0,43		0,33	0,08		0,58
BE)t62	10684,2----	Av		1717		1,23	1,26		1,11
BDL62	10684,5	P			0,41	0,64	0,31	0,67	0,64
BDL62	10684,5	Av			1,14	1,11	1,15	1,13	1,13
BDL64	10651,5	P			0,02	0,39	0,07	0,17	0,26
BDL64	10651,5	Av			1,77	1,14	1,19	1,54	1,52
BDL64	10653,1	P		0,14	<0,01	0,13		<0,01	0,03
BDL64	10653,1	Av		1,21	1,62	1,24		1,42	1,51
BDL64	10653,3	P					0,01
BDL64	10653,3	Av					1,25
BDL64	10654,3	P	0,15	0,23	0,06	0,02	<0,01	0,37	0,27
BDL64	10654,3	Av	1,53	1,6	1,5	1,71	1,55	1,45	1,44
BDL64	10651,1	P			0,5			0,31	0,16
BDL64	10651,1	Av			1,13			1,45	1,91
BDL64	10651,2	P							0,62
BDL64	10651,2	Av							1,13
BDL64	10651,5	P							0,48
BDL64	10651,5	Av							1,15
BDL64	10653,1	P	0,01	0,02	0,01	<0,01	0,02	0,05	0,03
BDL64	10653,1	Av	2,18	2,28	1,69	2,43	1,25	2,27	3,13
BDL64	10654,3	P	<0,01	<0,01	0,02	<0,01	0,03	0,01	<0,01
BDL64	10654,3	Av	1,78	1,9	1,46	1,97	1,2	1,7	2,53
BDL64	10651,1	P	0,11
BDL64	10651,1	Av	1,27
BDL64	10651,3	P	0,14	0,32		0,46
BDL64	10651,3	Av	1,43	1,22		1,14
BDL79	11042,3	P					0,5
BDL79	11042,3	Av					1,1

176/218

Continuação da Tabela 22
BDL79	11042,3	P		0,44		0,28	0,04
BDL79	11042,3	Av		1,18		1,26	1,36
BDL79	11042,7	P			0,4				0,55
BDL79	11042,7	Av			1,12				1,11
BDL79	11043,1.	P		0,27	0,03	0,25	0,03	0,29	0,22
BDL79	11043,1	Av		1,28	1,35	1,3	1,35	1,18	1,22
BDL85	10411,1	P	0,74	0,55		0,42
BDL85	10411,1	Av	1,1	1,14		1,16
BDL85	10411,3	P	0,14	0,01		0,03	0,17
BDL85	10411,3	Av	1,24	1,28		1,32	1,13
BDL85	10412,2	P			0,44			0,06	0,15
BDL85	10412,2	Av			1,1			1,22	1,24
BDL85	10414,1	P		0,01	0,05	0,02	0,08	0,38	0,47
BDL85	10414,1	Av		1,3	1,29	1,39	1,18	1,17	1,11
BDL85	10414,2	P		0,27	<0,01	0,07	0,07	<0,01	0,08
BDL85	10414,2	Av		1,15	1,42	1,28	1,17	1,55	1,5
BDL88	10291,2	P	0,31	0,15	0,02	0,08	0,08	0,06	0,11
BDL88	10291,2	Av	1,26	1,33	1,45	1,36	1,24	1,35	1,36
BDL88	10291,4	P	0,01	0,02	<0,01	<0,01	<0,01	0,23	0,25
BDL88	10291,4	Av	1,72	1,57	1,54	1,62	1,42	1,44	1,35
BDL88	10291,5	P	0,59	0,44	0,48	0,38
BDL88	10291,5	Av	1,13	1,17	1,13	1,17
BDL88	10293,3	P	0,14	0,28	<0,01	0,11	0,26	0,16	0,08
BDL88	10293,3	Av	1,34	1,35	2,15	1,36	1,19	1,58	1,97
BDL88	10291,2 -	P-	0,16	0,05	<0,01	0,01	0,21	0,33	0,47
BDL88 '	-10291,2 -	Av' *	1,32 -	1,45 —	-1,56	1,48 ...	1,18.	”1,17'	1,16 -
BDL88	10291,4	P			<0,01
BDL88	10291,4	Av			1,49
BDL88	10291,5	P			<0,01			0,15	0,38
BDL88	10291,5	Av			1,84			1,25	1,22
BDL88 .	-10293,3 =	P =			0,02				0,47
BDL88	10293,3	Av			1,23			- - -	1,15 -
BDL88	10294,2	P			<0,01			0,3	0,55
BDL88	10294,2	Av			4 76______			1,2.3	-116
BDL90	10921,3	P					0,22
BDL90	10921,3	Av					1,18
BDL90	10921,6	P					0,09
BDL90	10921,6	Av					1,28
BDL90	10924,2	P	0,06	0,04		<0,01	<0,01
BDL90	10924,2	Av	2	1,75		1,73	1,5
BDL90	10924,4	P					0,33
BDL90	10924,4	Av					1,12
BDL90	10925,4	P	0,02	0,03		<0,01	<0,01
BDL90	10925,4	Av	2,27	1,81		1,76	1,46
BDL90	10923,4	P					0,27
BDL90	10923,4	Av					1,17
BDL90	10924,2	P	0,06	0,28	0,22	0,33	0,06
BDL90	10924,2	Av	1,43	1,26	1,19	1,22	1,3
BDL90	10925,4	P	0,02	0,04		0,03	0,01
BDL90	10925,4	Av	1,7	1,58		1,54	1,43
BDL90	10921,6	P		0,75	0,04	0,42	0,02		0,13
BDL90	10921,6	Av		1,11	1,32	1,24	1,41		1,28
BDL90	10923,4	P				0,51	0,12		0,58
BDL90	10923,4	Av				1,15	1,25		1,15
BDL90	10924,2	P	0,16	0,01	0,28	0,01	<0,01
BDL90	10924,2	Av	1,4	1,65	1,18	1,7	1,54
BDL90	10925,4	P	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	0,05	0,03
BDL90	10925,4	Av	2,34	2,48	1,88	2,4	1,61	1,55	1,78
BDL94	11721,4	P			0,45			0,09	0,26
BDL94	11721,4	Av			1,11			1,29	1,16
BDL94	11725,3	P						0,17

177/218

Continuação da Tabela 22
BDL94	11725,3	Av						1,2
BDL94	11725,3	P						0,31
BDL94	11725,3	Av						1,29

Tabela 22. P = valor de P; AV = relação entre as médias do evento e controle. Observe que quando a proporção média é

	superior	a	II 1 II	o efeito da	expressão	do gene	exógeno é	um
	aumento	da	característica	desej ada;	Par =	parâmetro	de
5	acordo i	com	os	parâmetros	medidos;	Evevento =. TP1	=
	Momento	1;	TP2	= Momento 2;	TP3 = Momento 3;	RGR = taxa	de

crescimento relativo.

Ensaios de Estufa - Tabela 23 especifica os parâmetros que foram medidos nos ensaios de 10 estufa e que são apresentados nas Tabelas 24, 25, 26 e 27.

Nos casos em que um determinado evento_aparece mais de uma vez, o evento foi testado em vários experimentos independentes. Os parâmetros foram medidos como se segue:

— - — As plantas- foram analisadas

15-----quanto—à^sua— dimensão—g-l-obai₇—taxa de—crescimento-,—f-lo-ração-rprodução de sementes, peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita (produção de semente-HI/matéria seca).

Desempenho das plantas transgênicas foi comparado com o controle de plantas cultivadas em paralelo, nas mesmas 20 condições. Plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou com nenhum gene em tudo, sob o mesmo promotor foram utilizados como controle.

O experimento foi planejado na distribuição da parcela aninhada ao acaso. Para cada gene da 25 invenção três-cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construção.

178/218

Imagem Digital - Um laboratório de sistema de aquisição de imagem, que consiste de uma câmera digital reflex (Canon EOS 300D) ligado com uma lente de 55 milímetros de comprimento focal (Canon série EFS) , montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS) , que incluiu quatro unidades de luz (lâmpada 4 x 150 Watts) é utilizada para capturar imagens de amostras de plantas.

O processo de captação de imagem foi repetida a cada 2 dias a partir de 1 dia após o transplantio até o dia 16. A mesma câmera, colocada em uma suporte de ferro, foi utilizada para capturar imagens de plantas serradas maiores em vasos brancos em uma estufa com ambiente--controlado.-------As cubas eram de forma quadrada incluíam bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas sob o suporte de ferro, evitando a luz direta do sol e fundição de sombras.

Um sistema de análise dê imagem foi utilizado, que consiste de um computador pessoal (Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1,3 9 (Java programa de processamento de imagem com base em que foi desenvolvida no National Institutes of Health dos EUA e está disponível gratuitamente na Internet em Hypertext Transfer Protocol:// rsbweb (ponto) nih gov (ponto) /) . As imagens foram capturadas em resolução de 10 megapixels (3888 x 2592 pixels) e armazenados em uma baixa compressão de formato JPEG (Joint Photographic Experts Group padrão). Em seguida, analisou os dados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística

179/218

JMP (SAS Institute).

Análise de crescimento da folha - Utilizando a análise digital de dados de folhas foi calculado, incluindo o número de folhas, área rosácea,

5	diâmetro	da rosácea,	área de	lâmina	foliar, cobertura	de
	parcela,	comprimento	do pecíolo	da	folha.
			A		taxa	de crescimento
	vegetativo da planta	foi definida	por	fórmulas IX, X, XI	e
	XII .
10	Fórmula	IX:
	Taxa de	crescimento	relativo	da	área	de lâmina foliar

Coeficiente de regressão da área foliar ao longo do curso do

-----tempo. ------ ----- ----- — ------- -- ---- —

Fórmula X:

Taxa de crescimento relativo da área rosácea = Coeficiente de regressão da área de rosácea ao longo^-do curso do tempo. Fórmula XI

	Taxa de	crescimento	relativo do diâmetro	da	rosácea	de
	regressão	= Coeficiente de diâmetro da rosácea	ao	longo	do
20	curso do	tempo.
	Fórmula XII
	Taxa de	crescimento	relativo da cobertura	da	parcela	de
	regressão	= Coeficiente de cobertura de parcelas	ao	longo	do

curso do tempo.

Peso médio das sementes (Peso da semente ou peso de 1000 sementes) - Ao final do experimento, as sementes foram coletadas. As sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada.

180/218

Através da análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculada.

Peso seco da planta e produção de sementes - Em cerca de 80 dias da semeadura, as plantas foram colhidas e deixadas para secar a 30°C em uma câmara de secagem. O peso da biomassa e de sementes de cada parcela, foram medidos e divididos pelo número de plantas em cada parcela. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (raízes exclusive), após secagem a 30°C em uma câmara 10 de secagem;

Produção de grãos por planta = peso total de sementes por planta (gr.).

------Peso de 1000—sementes (peso de 1000 sementes) (gr—)-.

O índice de colheita foi calculado pela Fórmula IV (índice de colheita = Média de produção de sementes por” planta/pesõ seco) , como descrito ãclma.

Percetual de óleo nas sementes

- Ao final do experimento, todos os lotes de sementes de A-C foram coletados. Sementes de Columbia a partir de 3 parcelas foram misturados ã terra e, em seguida, montados na câmara de extração. 210 ml de n-hexano (Cat n°080951 Biolab Ltd.) foi utilizado como solvente. A extração foi realizada por 30 horas em fogo médio 50 °C. Após o fim da extração o n-hexano foi evaporado utilizando o evaporador, a 35 °C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. As informações obtidas por meio do extrator de Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes,

181/218

Polytechnisches J. (Dingler's). 1879, 232, 461) foi utilizado para criar uma curva de calibração para a baixa ressonância RMN. O teor de óleo das sementes de todas as amostras foi _ determinado por meio do Baixo Ressonância NMR (Maran Ultra5 Instrumento de Oxford) e sua embalagem sowftware MultiQuant.

Produção de óleo - O rendimento do óleo foi calculado pela Fórmula VII (descrito acima).

Análise de comprimento de 10 síliqua - No dia 50 de semeadura, 30 silíquas de diferentes plantas em cada parcela foram amostradas no bloco A. As silíquas escolhidas foram o verde-amarelo e foram coletados __ a_partir—das partes inferiores do tronco de -uma planta cultivada. Uma fotografia digital foi levada para determinar 15 o comprimento de síliqua.

“ ⁼“ Análises estãtisticas - Para

------rdentificar genes que conferem me 1“ hora signlffi cativa dã“ tolerância a estresses abióticos, os resultados obtidos com as plantas transgênicas foram comparados com aqueles obtidos 20 a partir de plantas controle. Para identificar genes superando e construções, os resultados dos eventos de transformação independentes testadas foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando teste-t de Student e os resultados foram considerados significativos 25 se o valor p for inferior a 0,1. O pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA) .

Tabela 23

182/218

Parâmetros Medidos nos Ensaios de Estufa

Parâmetro	Número
Diâmetro da Rosácea TP2	1
Diâmetro da Rosácea TP3	2
Diâmetro da Rosácea TP4	3
Área da Rosácea TP2	4
Área da Rosácea TP3	- - 5
Área da Rosácea TP4	6
Cobertura de Lote TP2	7
Cobertura de Lote TP3	8
Cobertura de Lote TP4	9
Número de FolhasTP2	10
Número de FolhasTP3	11
Número de FolhasTP4	12
Área da Lâmina da FolhaTP2	13
Área da Lâmina da FolhaTP3	14
Área da Lâmina da FolhaTP4	15
Comprimento do Peciolo da Folha TP2	16
Comprimento do Peciolo da Folha TP3	17
Comprimento do Peciolo da Folha TP4	18
Área Relativa da Lâmina TP2	19
Área Relativa da Lâmina TP3	20
Área Relativa da Lâmina TP4	21
Área Relativa do Peciolo TP2	22
Área Relativa do Peciolo TP3	23
Área Relativa do Peciolo TP4	24
— =- RGR da Área da Lâmina da Folha ~ ~	------ 25 - — - -
RGR Odo Número de Folhas	' 26 - - - - - -
RGR da Área da Rosácea	27
RGR do Diâmetro da Rosácea	28
RGR da Cobertura do Lote	29
Peso Seco	30
Peso Fresco ~	- - - - - - -31
Emergência da Inflorescência	32
Floração—-------------	_________ 33
Produção de Sementes	34 ------------
índice de Colheita	35
Peso das Sementes	36
Teor do Óleo	37

Tabela 23. São fornecidos os parâmetros medidos nos experimentos com efeito de estufa que são apresentados nas Tabelas abaixo 24-27. TP1 = Momento 1; TP2 = Momento 2; TP3 = Momento 3; RGR = taxa de crescimento relativo.

Tabela 24

Resultados dos Experimentos de Estufa

Gene	Ev.	Par:	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
BDL102	10471,1	P	<0,01	<0,01		0,13	0,34	0,03	0,13	0,34	0,03
BDL102	10471,1	Av	1,24	1,14		1,31	1,21	1,15	1,31	1,21	1,15
BDL102	10472,1	P	0,13	0,11	0,33	0,25	0,02	0,32	0,25	0,02	0,32
BDL102	10472,1	Av	1,26	1,19	1,14	1,37	1,26	1,26	1,37	1,26	1,26
BDL102	10474,1	P	0,22	0,23	0,26	0,19	0,2	0,23	0,19	0,2	0,23	0,19
BDL102	10474,1	Av	1,35	1,33	1,2	1,65	1,87	1,49	1,65	1,87	1,49	1,1

183/218

Continuação da Tabela 24
BDL102	10474,2	P	0,17	0,02	0,01	0,1	0,05	<0,01	0,1	0,05	<0,01	<0,01
BDL102	10474,2	Av	1,3	1,23	1,11	1,59	1,53	1,27	1,59	1,53	1,27	1,11
BDL102	10474,6	P	0,02			0,23			0,23
BDL102	10474,6	Av	1,11			1,15			1,15
BDL117	10071,2	P				0,62			0,59
BDL117	10071,2	Av				1,14			1,16
BDL117	10074,1	P	0,28	0,22	0,16	0,29	0,3	0,3	0,28	0,29	0,29	0,34
BDL117	10074,1	Av	1,26	1,23	1,24	1,58	1,47	1,44	1,6	1,49	1,46	1,15
BDL117	10074,4	P	0,35	0,34	0,41	0,38	0,39	0,41	0,38	0,37	0,39	0,28
BDL117	10074,4	Av	1,21	1,14	1,15	1,41	1,29	1,26	1,43	1,3	1,28	1,13
BDL117	10073,1	P				0,57	0,58	0,64
BDL117	10073,1	Av				1,13	1,17	1,14
BDL117	10073,2	P			0,45	0,7	0,55	0,48	0,7	0,55	0,48
BDL117	10073,2	Av			1,14	1,1	1,21	1,22	1,1	1,21	1,22
BDL117	10074,1	P	0,41	0,4	0,39	0,44	0,37	0,38	0,44	0,37	0,38	0,13
BDL117	10074,1	Av	1,1	1,15	1,15	1,17	1,32	1,29	1,17	1,32	1,29	1,15
BDL117	10074,4	P			0,1		0,4	0,34		0,4	0,34
BDL117	10074,4	Av			1,09		1,1	1,13		1,1	1,13
BDL138	9812,1	P	0,04
BDL138	9812,1	Av	1,06
BDL138	9812,3	P				0,06			0,04
BDL138	9812,3	Av				1,18			1,19
BDL140	10423,11U	P ,	0,02'Z		—....	0,01	0,22	------.	0,01	0,22^	-
BDL140	10423,1	Av	1,16			1,39	1,22		1,39	1,22
BDL140	10424,4	P				0,62			0,62			0,1
BDL140	10424,4	Av				1,18			1,18			1,08
BDL147	10301,5	P										0,1
BDL147	10301,5	'Àv										1,08
BDL147	10303,1	P	<0,01	0,01		0,06	0,04	0,08	0,06	0,04	0,08	0,05
BDL147	10303,1	Av	1,23	1,21		1,65	1,36	1,24	1,65	1,36	1,24	1,11
BDL147	10303,6	P				0,63	0,4		0,63	0,4
BDL147	10303,6	Av				1,14	1,11		1,14	1,11
BDL147	10304,2	P				0,33			0,33
BDL147	10304,2	Av				1,19			1,19
BDL147	10304,2	P					0,44	0,36		0,44	0,36
BDL147	10304,2	Av					1,17	1,11		1,17	1,11
BDL149	9823,3	P	0,22	0,08		0,33	0,13	0,29		0,03
BDL149	9823,3	Av	1,14	1,1		1,14	1,18	1,14		1,11
BDL149	9824,4	P	0,01	<0,01	<0,01	0,08	<0,01	0,04	0,09	<0,01	0,04	0,03
BDL149	9824,4	Av	1,16	1,13	1,13	1,35	1,26	1,29	1,37	1,28	1,31	1,05
BDL149	9823,3	P				0,65	0,67	0,63	0,65	0,67	0,63
BDL149	9823,3	Av				1,17	1,1	1,13	1,17	1,1	1,13
BDL152	10431,1	P				0,28			0,28
BDL152	10431,1	Av				1,13			1,13
BDL152	10431,4	P					0,2	0,45		0,2	0,45
BDL152	10431,4	Av					1,12	1,11		1,12	1,11
BDL152	10434,4	P			0,22	0,72		0,41	0,72		0,41	0,09
BDL152	10434,4	Av			1,12	1,12		1,2	1,12		1,2	1,07
BDL153	10141,3	P	<0,01	<0,01	<0,01	0,04	<0,01	<0,01	0,05	<0,01	<0,01
BDL153	10141,3	Av	1,21	1,17	1,17	1,41	1,33	1,34	1,43	1,34	1,36

184/218

Continuação da Tabela 24
BDL153	10142,2	P	0,21	0,41	0,38	0,33	0,38	0,38	0,32	0,37	0,38	0,49
BDL153	10142,2	Av	1,33	1,2	1,25	1,64	1,55	1,57	1,66	1,58	1,6	1,15
BDL153	10143,1	P	0,03			0,14	0,07	0,37	0,14	0,04	0,34
BDL153	10143,1	Av	1,07			1,22	1,12	1,14	1,23	1,13	1,16
BDL153	10144,1	P				0,08	0,08	0,1	0,03	0,03	0,04
BDL153	10144,1	Av				..1,11	1,1	1,11	1,13	1,11u	1,13
BDL153	10141,3	P	0,1	<0,01	0,01			0,01			0,01
BDL153	10141,3	Av	1,14	1,15	1,06			1,14			1,14
BDL153	10142,2	P	0,01	0,01	0,14	0,15	0,44	0,14	0,15	0,44	0,14
BDL153	10142,2	Av	1,17	1,16	1,16	1,18	1,19	1,31	1,18	1,19	1.31
BDL153	10142,3	P						0,4			0,4
BDL153	10142,3	Av						1,15			1,15
BDL153	10143,1	P										0,38
BDL153	10143,1	Av										1,12
BDL153	10143,2	P					0,25	0,11		0,25	0,11
BDL153	10143,2	Av					1,11	1,12		1,11	1,12
BDL153	10144,1	P		0,3	0,17		0,39	0,34		0,39	0,34
BDL153	10144,1	Av		1,23	1.1		1,44	1,13		1,44	1,13
BDL154	10703,8	P	<0,01	0,03		0,12	0,07	0,43	0,12	0,07	0,43
BDL154	10703,8	Av	1,29	1,2		1,53	1,37	1,13	1,53	1,37	1,13
BDL155	9991,5	P	0,22	0,07	0,1	0,31		0,31	0,31		0,31	0,03
BDL155	9991,5	Av	1,13	1,12	1,12	1,14		1,12	1,14		1,12	1,09
-BDL155-	-9994,3	P -	0,17-	0,02	0,08—	0,16	0,06	0,17	0,16	- 0,06—	0,17	0,09—
BDL155	9994,3	Av	1,15	1,17	1,12	1,17	1,27	1,21	1,17	1,27	1,21	1,07
BDL162	10492,2	P			0,32	0,16	0,25	0,11	0,16	0,25	0,11	0,59
BDL162	10492,2	Av			1,13	1,22	1,15	1,34	1,22	1,15	1,34	1,11
BDL167	10044,2	P					0,17			0,6
BDL167	10044,2	Av					1,17			1,1
BDL167	10043,3	P					0,39			0,39
BDL167	10043,3	Av					1,1			1,1
BDL167	10044,2	P				0,21	0,17	0,31	0,21	0,17	0,31	0,03
BDL167	10044,2	Av				1,14	1,15	1,2	1,14	1,15	1,2	1,09
BDL168	9881,3	P	0,1	0,11	0,09	0,18	0,14	0,09	0,18	0,14	0,1	0,22
BDL168	9881,3	Av	1,22	1,19	1,24	1,48	1,44	1,49	1,5	1,46	1,52	1,14
BDL168	9881,4	P	0,14	0,24	0,18	0,05	0,11	0,27	0,05	0,11	0,26	0,4
BDL168	9881,4	Av	1,23	1,17	1,19	1,43	1,38	1,34	1,45	1,4	1,35	1,1
BDL168	9882,1	P				0,04	0,05	0,12	0,01	0,02	0,05
BDL168	9882,1	Av				1,14	1,12	1,1	1,15	1,13	1,11
BDL168	9882,3	P	0,58	0,64	0,49	0,51	0,55	0,51	0,49	0,53	0,5	0,54
BDL168	9882,3	Av	1,1	1,11	1,17	1,3	1,24	1,33	1,32	1,26	1,35	1,1
BDL168	9884,4	P			0,72			0,76			0,74
BDL168	9884,4	Av			1,11			1,13			1,15
BDL168	9881,4	P		0,02				0,51			0,51
BDL168	9881,4	Av		1,09				1,15			1,15
BDL168	9882,1	P		0,04			0,15	0,22
BDL168	9882,1	Av		1,07			1,12	1,13
BDL168	9884,1	P			0,01
BDL168	9884,1	Av			1,1
BDL169	10743,4	P				0,43	0,55	0,56	0,54	0,7	0,72
BDL169	10743,4	Av				1,27	1,2	1,19	1,17	1,11	1,1

185/218

Continuação da Tabela 24
BDL169	10744,1	P	0,41			0,37	0,55		0,3	0,45	0,69	0,43
BDL169	10744,1	Av	1,1			1,27	1,18		1,35	1,25	1,1	1,13
BDL169	10747,1	P	0,29			0,47	0,64		0,42	0,54		<0,01
BDL169	10747,1	Av	1,15			1,34	1,15		1,42	1,22		1,17
BDL169	10747,5	P		0,08		0,01	0,02	0,24	0,01	0,01	0,13	<0,01
BDL169	1074775	Av		1;09	-	1,4	1,28	1,11	1,49	1,36	1,18	1,16-
BDL169	10741,3	P	0,58			0,43			0,43
BDL169	10741,3	Av	1,13			1,2			1,2
BDL169	10744,2	P	0,43	0,25	0,18	0,34	0,31	0,33	0,34	0,31	0,33	0,44
BDL169	10744,2	Av	1,24	1,26	1,21	1,6	1,61	1,42	1,6	1,61	1,42	1,12
BDL169	10747,1	P	0,01	0,14		0,33	0,09	0,53	0,33	0,09	0,53
BDL169	10747,1	Av	1,16	1,15		1,44	1,3	1,17	1,44	1,3	1,17
BDL169	10747,5	P	0,05	0,1	0,01	0,16	0,19	0,05	0,16	0,19	0,05
BDL169	10747,5	Av	1,13	1,08	1,09	1,28	1,24	1,12	1,28	1,24	1,12
BDL171	10661,2	P	0,7		0,44	0,59	0,7	0,56	0,59	0,7	0,56
BDL171	10661,2	Av	1,1		1,1	1,23	1,17	1,22	1,23	1,17	1,22
BDL171	10662,3	P	0,48	0,44		0,35	0,53		0,35	0,53
BDL171	10662,3	Av	1,12	1,13		1,26	1,19		1,26	1,19
BDL171	10664,1	P	0,01	<0,01	0,24	<0,01	0,01	0,42	<0,01	0,01	0,42	<0,01
BDL171	10664,1	Av	1,36	1,31	1,23	1,72	1,56	1,49	1,72	1,56	1,49	1,21
BDL171	10664,3	P	0,16	0,16	0,38	0,24	0,15	0,42	0,24	0,15	0,42	0,03
BDI171 ~	10664,3 -	-Av	1,26-	1,22 -	1,14	1,49--	1,44	.1,36	1,49	1,44	1,36	J.19
BDL171	10661,5	P				- ·			*0,29“	0,38=	-—	0,42
BDL171	10661,5	Av							1,15	1,1		1,12
BDL171	10662,2	P	0,01	0,07		0,18			0,11			0,15
BDL171	10662,2	Av	1,16	1,1		1,2			1,28			1,18
BDL171 '	= 10662,3	“P	0,02	<0,01-	.<0,01	<0,01	<0,0-1-	0,01	<0,01	<0,01	<0,0U	.<0,01
BDL171	10662,3	Av	1,28	1,29	1,2'	1,57	1,52	1,33	1,67	1,61	1,41	1,25
BDtt71—							0,04		<0,0.1-	0,02		0.03
lUuoó.o	r	<U,U 1	—
BDL171	10663,3	Av	1,26	1,18		1,32	1,21		1,4	1,28		1,18
BDL171	10664,1	P				0,76	0,81		0,69	0,75	0,85
BDL171	10664,1	Av				1,19	1,14		1,26	1,21	1,11
BDL171	10664,3	P	0,01	0,12		0,14	0,17	0,58	0,11	0,12	0,47	0,07
BDL171	10664,3	Av	1,23	1,15		1,44	1,3	1,16	1,52	1,37	1,23	1,25
BDL173	9952,1	P						0,67			0,64
BDL173	9952,1	Av						1,11			1,13
BDL177	10521,3	P				0,56			0,56
BDL177	10521,3	Av				1,15			1,15
BDL177	10524,2	P				0,09		0,44	0,09		0,44
BDL177	10524,2	Av				1,2		1,1	1,2		1,1
BDL182	10691,2	P					0,27			0,27		0,46
BDL182	10691,2	Av					1,12			1,12		1,11
BDL182	10692,3	P	0,44			0,43	0,37		0,43	0,37		0,05
BDL182	10692,3	Av	1,11			1,25	1,12		1,25	1,12		1,08
BDL182	10693,2	P					0,65			0,65
BDL182	10693,2	Av					1,1			1,1
BDL182	10693,3	P	0,03	0,08		0,16	0,06	0,38	0,16	0,06	0,38
BDL182	10693,3	Av	1,19	1,15		1,22	1,18	1,12	1,22	1,18	1,12
BDL182	10693,5	P				0,48			0,48
BDL182	10693,5	Av				1,1			1,1

186/218

Continuação da Tabela 24
BDL182	10691,4	P	0,51	0,43		0,39	0,44		0,47	0,6		0,32
BDL182	10691,4	Av	1,11	1,11		1,36	1,21		1,26	1,13		1,19
BDL182	10691,8	P							0,87
BDL182	10691,8	Av							1,1
BDL183	9941,1	P						0,21	0,16		0,16
BDL183	9941,1	Av						1,11	1,11		1,13
BDL183	9943,4	P						0,3
BDL183	9943,4	Av						1,1
BDL183	9944,1	P	0,09	0,03		0,1	0,15	0,22	0,1	0,15	0,21
BDL183	9944,1	Av	1,16	1,12		1,27	1,23	1,22	1,29	1,25	1,24
BDL183	9941,1	P						0,65			0,65
BDL183	9941,1	Av						1,11			1,11
BDL183	9942,1	P	0,02	0,02		0,16	0,33	0,38	0,16	0,33	0,38
BDL183	9942,1	Av	1,16	1,1		1,12	1,17	1,13	1,12	1,17	1,13
BDL186	10002,2	P			0,1		0,05	<0,01		0,02	<0,01
BDL186	10002,2	Av			1,07		1,13	1,25		1,14	1,27
BDL186	10004,3	P			0,6			0,69			0,66
BDL186	10004,3	Av			1,11			1,15			1,17
BDL186	10001,3	P										0,53
BDL186	10001,3	Av										1,11
BDL186	10004,6	P				0,43		___	0,43 -	- -	- -	0;1 -
BDL186	10004,6.	’Αν,Ζ			—	Tr2 —	—— -----	- -	1,2			1,08
BDL187	10502,2	P				0,29			0,6
BDL187	10502,2	Av				1,2			1,13
BDL187	10503,1	P				0,09	0,27		0,09	0,27
BDL187	10503,1	Av				1,26	1,-1 .	=- =-	1,26 -	1,1 ·	- -	„ -
BDL187	^10503,3-	P				0,66			0,66
BDL187	10503,3	Av				1,16			1,16
BDLT87	~TÕ503]5	'P	0,26
BDL187	10503,5	Av	1,1
BDL188	10462,4	P				0,14	0,07		0,14	0,07		0,32
BDL188	10462,4	Av				1,13	1,09		1,13	1,09		1,13
BDL188	10462,1	P	0,02	0,11		0,04	0,11	0,4	0,04	0,11	0,4
BDL188	10462,1	Av	1,2	1,14		1,3	1,27	1,21	1,3	1,27	1,21
BDL188	10462,4	P	0,03	0,03	0,14		0,09	0,1		0,09	0,1
BDL188	10462,4	Av	1,16	1,16	1,1		1,24	1,23		1,24	1,23
BDL190	10232,2	P	0,01	0,01	<0,01	0,43	0,09	0,14	0,43	0,09	0,14
BDL190	10232,2	Av	1,18	1,15	1,13	1,17	1,25	1,24	1,17	1,25	1,24
BDL190	10233,2	P	0,03	<0,01	0,09	0,03	0,01	<0,01	0,03	0,01	<0,01
BDL190	10233,2	Av	1,14	1,16	1,18	1,19	1,35	1,29	1,19	1,35	1,29
BDL190	10233,4	P			0,11	0,18		<0,01	0,18		<0,01
BDL190	10233,4	Av			1,11	1,11		1,17	1,11		1,17
BDL190	10234,2	P		0,09			0,05			0,05
BDL190	10234,2	Av		1,06			1,18			1,18
BDL192	9921,6	P				0,26	0,4	0,48	0,23	0,37	0,44
BDL192	9921,6	Av				1,14	1,14	1,13	1,16	1,15	1,14
BDL192	9922,1	P	0,11			0,35	0,33	0,28	0,33	0,3	0,22
BDL192	9922,1	Av	1,1			1,21	1,14	1,1	1,23	1,15	1,12
BDL192	9921,6	P				0,21	0,14	0,41	0,21	0,14	0,41
BDL192	9921,6	Av				1,12	1,14	1,14	1,12	1,14	1,14

187/218

Continuação da Tabela 24
BDL192	9922,5	P				0,35	0,33	0,3	0,65	0,62
BDL192	9922,5	Av				1,18	1,2	1,13	1,11	1,13
BDL193	10152,2	P				0,08			0,06	0,17		0,01
BDL193	10152,2	Av				1,15			1,16	1,1		1,06
BDL193	10153,2	P							0,6
BDL193	10153,2	A’v							1,11
BDL193	10153,4	P			0,04	0,4	0,37	0,21	0,38	0,34	0,18
BDL193	10153,4	Av			1,08	1,23	1,16	1,16	1,25	1,18	1.17
BDL193	10153,3	P	0,41	0,14		0,4	0,01	0,4	0,4	0,01	0,4	0,33
BDL193	10153,3	Av	1,12	1,15		1,21	1,31	1,14	1,21	1,31	1,14	1,13
BDL193	10153,4	P	0,33	0,25		0,51	0,27	0,17	0,51	0,27	0,17
BDL193	10153,4	Av	1,1	1,11		1,14	1,23	1,14	1,14	1,23	1,14
BDL196	10243,1	P	0,61	0,66		0,6	0,66	0,66	0,6	0,66	0,66
BDL196	10243,1	Av	1,14	1,1		1,2	1,16	1,15	1,2	1,16	1,15
BDL196	10243,1	P			0,02
BDL196	10243,1	Av			1,05
BDL201	9961,3	P	0,26	0,22	0,38	0,11	0,23	0,44	0,11	0,23	0,44	0,09
BDL201	9961,3	Av	1,13	1,11	1,16	1,33	1,23	1,35	1,33	1,23	1,35	1,07
BDL220	10333,5	P			0,48
BDL220	10333,5	Av			1,1
BDL223	10793,5	P	0,09	0,01	0,01	0,39	0,12	0,26	0,39. .	0,12	0,26 -	0,02
..BD.L223 -	10793,5	Av -	-I7I5-	1,12	1.1 .	1,12 .	-1,25	1,13 4	1,12	1,25 ~	1,13 '	1,06
BDL223	10793,8	P	<0,01	0,01		0,2	0,19		0,2	0,19
BDL223	10793,8	Av	1,17	1,1		1,31	1,18		1,31	1,18
BDL224	10451,7	P				0,59			0,59			0,05
BDL224	10451,7	Av				1,12			1,.12		= -- --	1,08 -
BDL226 .	-10861,2	. p .	-0,05	- 0,05		0,01	0,07		0,01	0,04		0,03
BDL226	10861,2	Av	1,12	1,12		1,26	1,17		1,34...	1,24	--------------------------------------------	-1τ21--
BDL226--	1086t;4—				_ — —				0,65			0,31
óp
BDL226	10861,4	Av							1,13			1,12
BDL226	10864,2	P	0,01	0,01	0,09	<0,01	<0,01	0,07	<0,01	<0,01	0,04	0,22
BDL226	10864,2	Av	1,2	1,15	1,09	1,49	1,34	1,21	1,59	1,42	1,29	1,13
BDL227	11491,3	P	0,21	0,01	0,08	0,27	0,07		0,27	0,07
BDL227	11491,3	Av	1,11	1,09	1,09	1,12	1,21		1,12	1,21
BDL227	11492,3	P	<0,01	<0,01			0,01	0,05		0,01	0,05
BDL227	11492,3	Av	1,17	1,12			1,23	1,12		1,23	1,12
BDL233	10822,1	P					0,63			0,63
BDL233	10822,1	Av					1,12			1,12
BDL233	10825,4	P	0,4	0,4	0,37	0,63	0,35	0,48	0,63	0,35	0,48
BDL233	10825,4	Av	1,16	1,16	1,16	1,14	1,39	1,25	1,14	1,39	1,25
BDL237	10893,1	P				0,09			0,09
BDL237	10893,1	Av				1,12			1,12
BDL237	10895,1	P	0,37	0,29		0,05	0,56	0,55	0,05	0,56	0,55
BDL237	10895,1	Av	1,13	1,1		1,13	1,15	1,11	1,13	1,15	1,11
BDL237	10895,2	P				0,29			0,29
BDL237	10895,2	Av				1,12			1,12
BDL237	10895,3	P	0,55			0,56			0,56
BDL237	10895,3	Av	1,13			1,12			1,12
BDL238	10951,4	P	0,35				0,1			0,1
BDL238	10951,4	Av	1,11				1,14			1,14

188/218

Continuação da Tabela 24
BDL238	10952,3	P					0,68			0,68
BDL238	10952,3	Av					1,1			1,1
BDL238	10954,2	P	0,04	<0,01	<0,01	0,08	<0,01	<0,01	0,08	<0,01	<0,01	<0,01
BDL238	10954,2	Av	1,33	1,28	1,23	1,73	1,76	1,52	1,73	1,76	1,52	1,13
BDL238	10954,3	P				0,74			0,74
BDL238	10954,3-	Av				1,13			1,13
BDL240	10802,2	P	0,02	0,03	0,12	0,1	0,02	0,04	0,1	0,02	0,04
BDL240	10802,2	Av	1,22	1,26	1,18	1,34	1,54	1,35	1,34	1,54	1,35
BDL241	10873,1	P	0,02	0,13	0,11	<0,01	0,38	0,02	<0,01	0,38	0,02
BDL241	10873,1	Av	1,19	1,18	1,15	1,41	1,3	1,34	1,41	1,3	1,34
BDL242	10731,2	P	0,4	0,52		0,14	0,46	0,58	0,14	0,46	0,58
BDL242	10731,2	Av	1,13	1,12		1,22	1,28	1,14	1,22	1,28	1,14
BDL242	10731,5	P				0,1			0,1
BDL242	10731,5	Av				1,11			1,11
BDL242	10731,6	P	<0,01	<0,01	0,18	0,03	0,25	0,08	0,03	0,25	0,08
BDL242	10731,6	Av	1,21	1,22	1,19	1,48	1,45	1,36	1,48	1,45	1,36
BDL242	10731,7	P				0,06			0,06
BDL242	10731,7	Av				1,12			1,12
BDL245	10813,3	P		0,03
BDL245	10813,3	Av		1,08
BDL250	10841,3	P	0,02	0,18	0,26	0,06	0,22	0,32	0,06	-0,22 .	0,32 -.	-0,05 -
BDL250	10841,3- -	Av- -	1,24 -	1;18	1,11	.1,36	1.41	1,17	1,36 ~	=--i,4r -	'1,17’	1]08 '
BDL250 -	' 10846,2	P ' '	0,48			0,64	0,41		0,64	0,41
BDL250	10846,2	Av	1,1			1,12	1,16		1,12	1,16
BDL250	10846,3	P	0,38	0,36	0,48	0,58	0,46	0,62	0,58	0,46	0,62
BDL250	10846,3	Av	1,11	1,17	1,11	1,17	1,34	1,19	1,17	-1,34.	1,19 -	. - -
BDL252.	10882,1	P	0,3- -	-0,4t *	0,44	Ό?32	0,26	0,34	0,32	0,26	0,34	<0,01
BDL252	10882,1	Av	1,19	1,19	1,17	1,38	1,42	1,24	1,38	1 42	1,24—	-vi--
BDL48....	.10274,4---	-P---	-0t23—	0,02	o;o2	0,81	0,09	0,08	0,81	0,09	0,08
BDL48	10274,4	Av	1,14	1,15	1,2	1,1	1,23	1,36	1,1	1,23	1,36
BDL48	10271,1	P		0,06	<0,01	0,27	0,03	<0,01	0,27	0,03	<0,01
BDL48	10271,1	Av		1,08	1,16	1,11	1,22	1,27	1,11	1,22	1,27
BDL48	10274,3	P	0,07	0,01	<0,01	0,02	0,01	<0,01	0,02	0,01	<0,01
BDL48	10274,3	Av	1,21	1,19	1,09	1,25	1,35	1,22	1,25	1,35	1,22
BDL48	10274,4	P	0,29	0,2	0,13	0,22	0,03	0,22	0,22	0,03	0,22
BDL48	10274,4	Av	1,14	1,15	1,14	1,14	1,21	1,26	1,14	1,21	1,26
BDL48	10274,5	P	0,04	0,28	0,45	0,26	0,49	0,44	0,26	0,49	0,44
BDL48	10274,5	Av	1,11	1,13	1,11	1,14	1,22	1,22	1,14	1,22	1,22
BDL63	10381,1	P	0,12	0,02	<0,01	0,11	0,21	<0,01	0,11	0,21	<0,01
BDL63	10381,1	Av	1,2	1,18	1,17	1,2	1,39	1,37	1,2	1,39	1,37
BDL63	10381,2	P	0,03	0,25	0,37	0,31	0,6	0,42	0,31	0,6	0,42
BDL63	10381,2	Av	1,13	1,15	1,19	1,19	1,26	1,32	1,19	1,26	1,32
BDL63	10384,8	P		0,02	<0,01		0,06	<0,01		0,06	<0,01
BDL63	10384,8	Av		1,09	1,14		1,2	1,24		1,2	1,24
BDL79	11042,1	P		0,08			0,04	0,52		0,04	0,52
BDL79	11042,1	Av		1,06			1,16	1,1		1,16	1,1
BDL79	11044,3	P	<0,01	0,03			0,14			0,14
BDL79	11044,3	Av	1,17	1,11			1,14			1,14
BDL81	10371,8	P				0,34			0,34
BDL81	10371,8	Av				1,12			1,12

189/218

Continuação da Tabela 24
BDL81	10374,1	P				0,22			0,22
8DL81	10374,1	Av				1,16			1,16
BDL81	10371,5	P		0,02	0,17			0,21			0,21
BDL81	10371,5	Av		1,08	1,11			1,13			1,13
BDL81	10371,8	P			0,6		0,8 . ..	0,57		0,8	0,57
BDL81	10371,8	Av			1,13		1,13	1,22		1,13	1,22
BDL81	10374,1	P	0,26	0,31	0,44	0,16	0,19	0,32	0,16	0,19	0,32	0,26
BDL81	10374,1	Av	1,23	1,22	1,19	1,44	1,45	1,49	1,44	1,45	1,49	1,12
BDL85	10411,1	P	0,25	0,34	0,15	0,13	0,39	0,33	0,13	0,39	0,33	0,12
BDL85	10411,1	Av	1,2	1,16	1,14	1,39	1,29	1,28	1,39	1,29	1,28	1,16

Tabela 24. Resultados dos experimentos de estufa. São fornecidos os valores medidos de cada parâmetro [parâmetros (Par.) 1-10 de acordo com os parâmetros descritos na Tabela 23 acima] em plantas expressando os polinucleotídeos indicados. Ev event =, P = valor de P; AV = relação entre as médias do evento e controle. Observe que quando _a

- ——; proporção, média é superior a 1 o efeito da expressão do gene exógeno é um aumento da característica desejada;

Tabela 25 _ . . . - - - - -· · - * ' *

Resultados dos experimentos de estufa

Gene	.Ev	-Par	-11—	12		’ 14	15	16	17	18	19	20
BDL102	10471,1	P			0,1	0,27	0,03	0,04	0,29
BDL102	10471,1	Av			1,35	1,23	1,18	1,27	1,1
BDL102	10472,1	P			0,17	0,35	0,25	0,21	0,22
BDL102	10472,1	Av			1,36	1,23	1,3	1,29	1,15
BDL102	10474,1	P			0,18	0,19	0,16	0,17	0,3			0,02
BDL102	10474,1	Av			1,56	1,82	1,54	1,4	1,3			1,03
BDL102	10474,2	P			0,04	<0,01	0,01	0,15	<0,01
BDL102	10474,2	Av			1,51	1,48	1,34	1,42	1,22
BDL102	10474,6	P			0,23			0,11
BDL102	10474,6	Av			1,19			1,12
BDL117	10071,2	P										0,1
BDL117	10071,2	Av										1,03
BDL117	10073,2	P						0,02	0,15
BDL117	10073,2	Av						1,1	1,1
BDL117	10074,1	P		0,21	0,27	0,29	0,26	0,18	0,12	0,04
BDL117	10074,1	Av		1,19	1,46	1,38	1,33	1,59	1,35	1,17
BDL117	10074,4	P	0,05	0,37	0,38	0,49	0,3	0,25	0,31			0,03
BDL117	10074,4	Av	1,06	1,12	1,28	1,16	1,19	1,43	1,28			1,02
BDL117	10073,1	P			0,62	0,52	0,63
BDL117	10073,1	Av			1,1	1,16	1,15
BDL117	10073,2	P				0,56	0,37	0,35	0,53	0,51
BDL117	10073,2	Av				1,19	1,25	1,14	1,13	1,15
BDL117	10074,1	P		0,01	0,53	0,37	0,36	0,33	0,42	0,43
BDL117	10074,1	Av		1,09	1,11	1,29	1,24	1,21	1,17	1,2
BDL117	10074,4	P				0,37	0,26		0,24	0,16
BDL117	10074,4	Av				1,1	1,12		1,13	1,11

190/218

Continuação	da Tabela 25
BDL138	9811,4	P						0,06
BDL138	9811,4	Av						1,09
BDL138	9812,1	P						<0,01	0,02
BDL138	9812,1	Av						1,16	1,11
BDL138	9812,3	P	0,05		0,11			0,37	0,52		0,01
BDL138	9812,3	Av	1,04		1,13			1,14	1,1		1,03
BDL138	9811,1 .	,P. -			-						0,02	<0,01
BDL138	9811,1	Av									1,04	1,04
BDL138	9813,4	P										<0,01
BDL138	9813,4	Av										1,04
BDL140	10423,1	P			0,01	0,22
BDL140	10423,1	Av			1,29	1,19
BDL140	10424,3	P										0,49
BDL140	10424,3	Av										1,27
BDL140	10424,4	P						0,64	0,68
BDL140	10424,4	Av						1,14	1,17
BDL140	10423,1	P									0,03
BDL140	10423,1	Av									1,04
BDL147	10303,1	P			0,11	0,07	0,11	0,12	0,01
BDL147	10303,1	Av			1,49	1,31	1,18	1,28	1,43
BDL147	10303,6	P						0,38	0,37
BDL147	10303,6	Av						1,11	1,12
BDL147	10304,2	P			0,33							0,05
BDL147	10304,2	Av			1,18							1,04
BDL147	10303,5	P				0,41
BDL147	10303,5	Av				1,1					- - -	- “ -
BDL147	.1030.4,2 - -	P- -	- - - -	- - -	- -	0,48			- -- --	.. .	-
BDL147	10304,2 '	Av	- - -			1,17
BDL149	9823,3	P			0,23			<0,01	0,01
BDL149	9823,3	Av			1,13			1,38	1,21
BDL149	9824,3	P		0,09
BDL149	9824,3	Av		1,04						= - *	. ~ - -	. . ..
BDL149	9824,4 . .	P		0,02 -	0,12’	0,03 “	“0,17	<0,01	<0,01	0,02
“BDL149	9824,4	Av		1,1	1,28	1,12	1,2	1,23	1,22	1,11
BDL149	9823,3	P			a,62—	0,47	-0,56
-BDLT49----	982373	Av			1,13	1,16	1,12
BDL152	10431,1	P			0,31
BDL152	10431,1	Av			1,1
BDL152	10431,4	P				0,16	0,47	0,27		0,09		0,03
BDL152	10431,4	Av				1,1	1,1	1,18		1,18		1,02
BDL152	10432,5	P				0,18	0,62
BDL152	10432,5	Av				1,1	1,16
BDL152	10434,1	P							0,76
BDL152	10434,1	Av							1,11
BDL152	10434,4	P					0,32	0,25	0,04	0,16
BDL152	10434,4	Av					1,2	1,13	1,37	1,12
BDL152	10434,1	P									0,03
BDL152	10434,1	Av									1,04
BDL152	10434,4	P									0,05
BDL152	10434,4	Av									1,04
BDL153	10141,3	P			<0,01	<0,01	<0,01	0,25	0,05	<0,01
BDL153	10141,3	Av			1,32	1,24	1,27	1,33	1,26	1,15
BDL153	10142,2	P	0,03	0,33	0,28	0,54	0,41	0,2	0,33	0,55		0,07
BDL153	10142,2	Av	1,15	1,16	1,44	1,28	1,41	1,54	1,34	1,12		1,02
BDL153	10143,1	P	0,01		0,21		0,32		0,05		0,01	<0,01
BDL153	10143,1	Av	1,12		1,2		1,14		1,11		1,02	1,02
BDL153	10144,1	P		<0,01	0,05	0,08	0,07
BDL153	10144,1	Av		1,09	1,13	1,1	1,1
BDL153	10141,3	P				0,06	0,02	0,02	0,24
BDL153	10141,3	Av				1,14	1,1	1,26	1,19
BDL153	10142,2	P		0,1	0,17	0,35	0,06	0,02	0,05	0,04

191/218

Continuação	da Tabela 25
BDL153	10142,2	Av		1,05	1,1	1,17	1,22	1,48	1,31	1,26
BDL153	10142,3	P					0,36	0,23
BDL153	10142,3	Av					1,14	1,1
BDL153	10143,1	P						0,15
BDL153	10143,1	Av						1,14
BDL153	10143,2 · —	P		0,04		0,15	-	0,07		<0,01
BDL153	10143,2	Av		1,06		1,11		1,2		1,15
BDL153	10144,1	P				0,4	0,48		0,24	0,08
BDL153	10144,1	Av				1,43	1,11		1,34	1,13
BDL153	10144,4	P							0,54
BDL153	10144,4	Av							1,1
BDL154	10703,6	P						0,66
BDL154	10703,6	Av						1.1
BDL154	10703,8	P			0,08	0,09	0,54	<0,01	0,09
BDL154	10703,8	Av			1,47	1,41	1,13	1,47	1,22
BDL155	9991,5	P			0,36		0,09	0,31	0,41
BDL155	9991,5	Av			1,11		1,18	1,29	1,35
BDL155	9991,9	P							0,27
BDL155	9991,9	Av							1,17
BDL155	9993,2	P							0,64
BDL155	9993,2	Av							1,12
BDL155	9994,3	P	0,16		0,31	0,08	0,12	0,12	0,09	0,41
BDL155	9994,3	Av	1,14		1,1	1,16	1,17	1,43	1,44	1,12
BDL155	9993,2	P									0,06
BDL155	9993,2	Av									1,03
ΒΒΗ55	9994,3	p—		. -----		—	. —	- '	—		Ό/03
BDL155	9994,3	Av “									1,04
BDL157	9911,4	P										0,09
BDL157	9911,4	Av										1,03
BDL157	9914,2	P							0,12	0,09
BDL157	9914,2	Av							1,11	1,06
BDÚ162 .	10492,2	p		— -		-	0,12 ’		0,44“
BDL162	10492,2	Av ·					1,39		1,15
BDL162	10492,4	P							0,82
BDL162	10492,4	Av							1,13
BDL162	10494,1	P						0,1.	0,13
BDL162	10494,1	Av						1,21	1,21
BDL167	10043,1	P									0,17
BDL167	10043,1	Av									1,21
BDL167	10043,2	P									<0,01	0,01
BDL167	10043,2	Av									1,04	1,03
BDL167	10044,2	P			0,05	0,07						0,03
BDL167	10044,2	Av			1,15	1,16						1,02
BDL167	10042,3	P		0,1						0,2
BDL167	10042,3	Av		1,05						1,12
BDL167	10043,3	P				0,35	0,19	0,38		0,41
BDL167	10043,3	Av				1,11	1,1	1,14		1,11
BDL167	10044,2	P			0,51	0,28	0,27	0,31	0,18
BDL167	10044,2	Av			1,1	1,14	1,15	1,17	1,17
BDL168	9881,3	P	0,08	<0,01	0,24	0,17	0,1	0,11	0,21	0,3		<0,01
BDL168	9881,3	Av	1,09	1,1	1,32	1,36	1,44	1,17	1,21	1,15		1,02
BDL168	9881,4	P		0,01	0,1	0,32	0,05	0,16	0,36	0,44
BDL168	9881,4	Av		1,15	1,3	1,23	1,32	1,45	1,25	1,14
BDL168	9882,3	P			0,61	0,54	0,49	0,66	0,71	0,66
BDL168	9882,3	Av			1,15	1,2	1,3	1,2	1,13	1,1
BDL168	9884,4	P					0,7
BDL168	9884,4	Av					1,15
BDL168 '	9881,4	P					0,57	0,57	0,37	0,4
BDL168	9881,4	Av					1,11	1,1	1,17	1,14
BDL168	9882,1	P				0,1	0,22	0,48		<0,01
BDL168	9882,1	Av				1,12	1.11	1,14		1,16	|

192/218

Continuação da Tabela 25
BDL168	9882,3	P						0,39	0,22
BDL168	9882,3	Av						1,12	1,11
BDL168	9884,1	P							0,11
BDL168	9884,1	Av							1,12
BDL169	10743,4	P			0,55	0,5	0,69	0,44
BDL169	10743,4	Av			1,16	1,19	1,12	1,17
BDL169	10744,1...	P	0,41.		0,38			-0,29	0,31	-		...
BDL169	10744,1	Av	1,15		1,19			1,4	1,24
BDL169	10747,1	P	0,09		0,58			0,01
BDL169	10747,1	Av	1,11		1,22			1,42
BDL169	10747,5	P	<0,01		0,14	0,06
BDL169	10747,5	Av	1,11		1,29	1,15
BDL169	10741,3	P			0,42	0,68		0,53
BDL169	10741,3	Av			1,17	1,11		1,16
BDL169	10744,2	P	0,02		0,26	0,31	0,32	0,37	0,24	0,02		0,02
BDL169	10744,2	Av	1,04		1,48	1,56	1,44	1,37	1,26	1,23		1,03
BDL169	10747,1	P			0,34	<0,01	0,36	0,02	0,02
BDL169	10747,1	Av			1,39	1,32	1,2	1,16	1,17
BDL169	10747,3	P										0,45
BDL169	10747,3	Av										1,1
BDL169	10747,5	P			0,11	0,14	<0,01	<0,01
BDL169	10747,5	Av			1,2	1,26	1,27	1,22
BDL171	10661,2	P	0,6		0,63	0,74	0,35	0,84	0,55
BDL171	10661,2	Av	1,11		1,17	1,1	1,19	1,1	1,33
BDL171	10662,3	P			0,4	0,67		0,5	0,15
BDL171	10662,3	Av			1,21	1,11		1,18	1,46
BDL171	10664,1	-P	0,09	____	<0,01	<0,01	0,48-	0,03—	<0,01-	0,01 -	-
BDL171 —	10664,1 —	Av “	1,15 '	··=—	1,56	1,44	' 1,42”	1,57”	1,6—	1,29“	-
BDL171	10664,3	P	0,34	0,47	0,24	0,04	0,46	0,08	0,38	0,48
BDL171	10664,3	Av	1,19	1,12	1,3	1,29	1,18	1,39	1,43	1,26
BDL171	10661,5	P	0,51					0,76	0,68
BDL171	10661,5	Av	1,1					1,11	1,12
BDL'171	10662,2	E,	. '		0,39-	»_	—	0,06—	0,42	—	-	-
BDL171	10662,2	Av			1,11 .			1,47	1,14
BDL171	10662,3	P	0,09		<0,01	0,02	<0,01	0,24	0,17	<0,01
~BDt17T	1066273	Av	1,3		1,39	1,5	1,33	1,46	1,37	1,23
BDL171	10663,3	P	<0,01		0,04	0,07		<0,01	0,08
BDL171	10663,3	Av	1,2		1,2	1,17		1,54	1,24
BDL171	10664,1	P			0,71	0,79						0,01
BDL171	10664,1	Av			1,18	1,13						1,03
BDL171	10664,3	P	0,08		0,18	0,22		0,01	0,33		0,09
BDL171	10664,3	Av	1,18		1,29	1,22		1,54	1,23		1,03
BDL173	9951,2	P									<0,01
BDL173	9951,2	Av									1,03
BDL173	9952,1	P					0,61
BDL173	9952,1	Av					1,13
BDL173	9954,3	P									<0,01	0,02
BDL173	9954,3	Av									1,05	1,04
BDL173	9953,4	P										<0,01
BDL173	9953,4	Av										1,03
BDL177	10521,3	P			0,37		0,2
BDL177	10521,3	Av			1,22		1,16
BDL177	10522,2	P										<0,01
BDL177	10522,2	Av										1,05
BDL177	10524,2	P			0,16			0,21	0,28
BDL177	10524,2	Av			1,14			1,14	1,17
BDL182	10691,2	P				0,14	0,59	0,08
BDL182	10691,2	Av				1,11	1,12	1,2
BDL182	10692,3	P			0,53	0,2			0,73
BDL182	10692,3	Av			1,16	1,15			1,13
BDL182	10693,2	P				0,34		0,18		0,67

193/218

Continuação da Tabela 25
BDL182	10693,2	Av				1,13		1,24		1,11
BDL182	10693,3	P			0,25	0,07		0,05	0,25
BDL182	10693,3	Av			1,18	1,14		1,42	1,35
BDL182	10693,5	P						0,15	0,05
BDL182	10693,5	Av						1,18	1,29
BDL182	10691,2	P									0,02	0,01
BDL182	10691,2	Av									1,06	1,04
BDL182	10691,4	P	<0,01	0,2	0,56	0,65		<0,01	0,13
BDL182	10691,4	Av	1,25	1,15	1,19	1,12		1,48	1,29
BDL182	10691,8	P			0,79			0,84
BDL182	10691,8	Av			1,14			1,14
BDL182	10693,2	P									0,02
BDL182	10693,2	Av									1,05
BDL182	10693,3	P						0,85
BDL182	10693,3	Av						1,13
BDL183	9941,1	P		<0,01			0,26
BDL183	9941,1	Av		1,09			1,13
BDL183	9942,4	P						0,02	<0,01
BDL183	9942,4	Av						1,17	1,16
BDL183	9943,4	P				0,21	0,15
BDL183	9943,4	Av				1,11	1,14
BDL183	9944,1	P	0,05	<0,01	0,09	0,01	0,3	<0,01	0,02
BDL183	9944,1	Av	1,04	1,1	1,19	1,15	1,13	1,31	1,21
BDL183	9941,1	P					0,64			0,56
BDL183	9941,1	Av					1,11			1,16
BDL183	9942,1	P			0,12	0,31	0,46	0,02
BDL183	9942,1	Av			1,13 .	1/19 -	.1,12-	1,26	.	-	—	-
BDL186 —	10002,2 —	P —		— - -	—	0,01	* <0,01	•	—»	O;1	— . —	.
BDL186	10002,2	Av				1,14	1,21			1,12
BDL186	10004,3	P				0,71	0,59				0,09	<0,01
BDL186	10004,3	Av				1,13	1,15				1,02	1,02
BDL186	10001,3	P						0,3
BDL186	10001,3	Av					__	1,25=			=-
BDLT86	10004,6	P			0,54
BDL186	10004,6	Av			1,16
-BDL48-7----	H0502;2	p—			o;38
BDL187	10502,2	Av			1,12
BDL187	10502,4	P						0,59
BDL187	10502,4	Av						1,1
BDL187	10503,1	P			0,05				0,26
BDL187	10503,1	Av			1,26				1,15
BDL187	10503,3	P			0,29				0,3
BDL187	10503,3	Av			1,25				1,14
BDL187	10503,5	P						0,2	0,08
BDL187	10503,5	Av						1,36	1,25
BDL188	10462,4	P				0,09
BDL188	10462,4	Av				1,06
BDL188	10462,1	P			0,02	0,11	0,44	0,25	0,29
BDL188	10462,1	Av			1,28	1,32	1,19	1,15	1,14
BDL188	10462,4	P				0,02	0,09	0,01	0,25
BDL188	10462,4	Av				1,19	1,22	1,36	1,24
BDL188	10464,5	P						0,33
BDL188	10464,5	Av						1,19
BDL190	10234,1	P				0,5
BDL190	10234,1	Av				1,11
BDL190	10234,2	P				0,57					0,01
BDL190	10234,2	Av				1,1					1,03
BDL190	1.0231,1	P						0,21
BDL190	10231,1	Av						1,13
BDL190	10231,2	P						0,02
BDL190	10231,2	Av						1,24

194/218

Continuação da Tabela 25
BDL190	10232,2	P			0,44	0,08	0,16	0,1	0,39	0,25
BDL190	10232,2	Av			1,18	1,23	1,18	1,29	1,16	1,16
BDL190	10233,2	P			0,05	0,02	<0,01	0,02	0,05	0,05		0,04
BDL190	10233,2	Av			1,18	1,31	1,21	1,25	1,15	1,31		1,02
BDL190	10233,4	P					0,02	0,45	0,5	<0,01
BDL190	10233,4	Av					1,2	1,16	1,12	1,16
BDL190	10234,2	P				0,07 .		0,05.
BDL190	10234,2	Av				1,17		1,19
BDL192	9921,3	P						0,38
BDL192	9921,3	Av						1,13
BDL192	9921,6	P			0,12	0,36	0,55
BDL192	9921,6	Av			1,15	1,13	1,11
BDL192	9922,1	P			0,11	0,12		0,57	0,56
BDL192	9922,1	Av			1,18	1,11		1,17	1,11
BDL192	9921,6	P		0,09	0,19		0,51
BDL192	9921,6	Av		1,07	1,1		1,13
BDL192	9922,5	P		0,01	0,35	0,29				0,5
BDL192	9922,5	Av		1,06	1,18	1,2				1,11
BDL193	10152,2	P	0,05	0,23				0,05	0,14
BDL193	10152,2	Av	1,04	1,1				1,17	1,11
BDL193	10152,3	P										0,02
BDL193	10152,3	Av										1,02
BDL193	10153,2	P						0,32
BDL193	10153,2	Av						1,1
BDL193	10153,4	P			0,37		0,29		0,46	0,09	<0,01
BDL193	10153,4	Av			1,14		1,15		1,1	1,09	1,02
BDL193	10153,2 ...	P			_________ ..	0,42	-- -	.— .	—	-	0,07-	<0,01
BDL193 -	· 10153,2 - -	i Av-“^	- —		— —'	1,12			-		1,02	1,03’
BDL193	10153,3	P	0,07		0,37	0,01		0,2	0,22	0,09
BDL193	10153,3	Av	1,1		1,15	1,27		1,2	1,18	1,16
BDL193	10153,4	P			0,41	0,24	0,16	0,63
BDL193	10153,4	Av			1,13	1,16	1,1	1,11
BDL196	10243,1	P			0,65,.	0,7.7.		0,63	0,71		—	—
BDL196	10243,1	Av			1,2	1,11		1,22	1,11
BDL201	9961,3	P	0,22	0,04	0,18	0,29	0,43		0,46	0,07		0,09
-BDL201	9961/3-----	Av	1,1	1,06	1,28 ”	1,16	1,33		1,12	1,25		1,02
BDL220	10331,5	P										<0,01
BDL220	10331,5	Av										1,05
BDL220	10331,7	P										0,39
BDL220	10331,7	Av										1,1
BDL220	10333,5	P					0,49
BDL220	10333,5	Av					1,18
BDL223	10793,3	P					0,1
BDL223	10793,3	Av					1,1
BDL223	10793,5	P	<0,01		0,47	0,01	0,02	0,1	0,21	0,12		0,08
BDL223	10793,5	Av	1,08		1,1	1,23	1,15	1,22	1,16	1,12		1,02
BDL223	10793,8	P	0,08		0,08	0,09	0,06	0,1	0,23
BDL223	10793,8	Av	1,03		1,28	1,2	1,11	1,21	1,1
BDL224	10451,7	P						0,57
BDL224	10451,7	Av						1,11
BDL224	10453,3	P										0,5
BDL224	10453,3	Av										1,12
BDL225	10401,4	P	0,07
BDL225	10401,4	Av	1,04
BDL226	10861,2	P	0,03		0,04	0,08		0,25	0,08	0,29	0,01
BDL226	10861,2	Av	1,19		1,17	1,14		1,37	1,31	1,12	1,06
BDL226	10864,2	P	<0,01	0,07	<0,01	0,01	0,11	0,06	<0,01
BDL226	10864,2	Av	1,17	1,08	1,38	1,24	1,13	1,43	1,36
BDL227	11491,3	P				<0,01		0,5	0,37
BDL227	11491,3	Av				1,23		1,12	1,12
BDL227	11492,3	P			0,04	<0,01	0,06	0,03	0,04	0,35

195/218

Continuação da Tabela 25
BDL227	11492,3	Av			1,16	1,25	1,14	1,21	1,19	1,14
BDL233	10822,1	P							<0,01
BDL233	10822,1	Av							1,21
BDL233	10825,4	P				0,39	0,47	0,32	0,5	0,02
BDL233	10825,4	Av				1,32	1,29	1,27	1,18	1,12
BDL237	10893,1	P			0,07
BDL237	10893,1	Av			.1,17 .			-			-	-
BDL237	10895,1	P			0,09	0,44		0,16	0,26
BDL237	10895,1	Av			1,11	1,18		1,22	1,1
BDL237	10895,2	P			0,2	0,66
BDL237	10895,2	Av			1,13	1,12
BDL237	10895,3	P			0,51			0,36	0,64
BDL237	10895,3	Av			1,12			1,26	1,11
BDL237	10896,1	P				0,11				0,52
BDL237	10896,1	Av				1,13				1,1
BDL238	10951,4	P				0,09		0,22	0,18
BDL238	10951,4	Av				1,11		1,13	1,12
BDL238	10952,3	P				0,69				0,7
BDL238	10952,3	Av				1,1				1,1
BDL238	10954,2	P			0,08	<0,01	<0,01	0,11	<0,01
BDL238	1.0954,2	Av			1,59	1,7	1,46	1,34	1,29
BDL238	10954,3	P			0,67			0,58
BDL238	10954,3	Av			1,15			1,1
BDL240	10802,2	P			0,05	0,04	<0,01	<0,01	0,08	0,05
BDL240	10802,2	Av			1,34	1,61	1,3	1,22	1,27	1,17
BDL240	10806,2	P				0,3
BDL24CL	10806,2	Av	___ —		.	1,-1-	—	—	—	—	—
BDL240- -	10806,6-	p -	0,01		—z—							0,09
BDL240	10806,6	Av	1,06									1,04
BDL241	10873,1	P			<0,01	0,52	0,1	0,09	0,06
BDL241	10873,1	Av			1,41	1,24	1,33	1,23	1,23
BDL242	10731,2	P			0,05	0,45	0,62	0,49	0,45
BDL242	10731,2 „	Av .			1,26-	1,27	1,11	-1,11 -	1,11—	—	—	--
BDL242	10731,5	P			0,05
BDL242	10731,5	Av			1,13
BDt242----	10731,6	P			0,01	0,19	0,02	<0,01	0,09		0,03
BDL242	10731,6	Av			1,46	1,43	1,37	1,29	1,21		1,02
BDL242	10731,7	P			0,04			0,25
BDL242	10731,7	Av			1,14			1,15
BDL245	10813,3	P	0,04	0,02				0,27	0,08	0,2
BDL245	10813,3	Av	1,07	1,08				1,14	1,2	1,15
BDL245	10816,3	P										0,02
BDL245	10816,3	Av										1,03
BDL245	10812,3	P								0,07
BDL245	10812,3	Av								1,09
BDL245	10813,3	P						0,12	0,03	0,01
BDL245	10813,3	Av						1,14	1,11	1,16
BDL247	10911,4	P										0,01
BDL247	10911,4	Av										1,03
BDL247	10912,6	P										0,02
BDL247	10912,6	Av										1,02
BDL248	11051,1	P									0,04
BDL248	11051,1	Av									1,03
BDL248	11054,1	P									0,06
BDL248	11054,1	Av									1,04
BDL250	10841,3	P			0,05	0,23	0,45	0,05	0,01	0,21
BDL250	10841,3	Av			1,31	1,31	1,12	1,38	1,32	1,1
BDL250	10842,3	P				0,17
BDL250	10842,3	Av				1,11
BDL250	10846,2	P				0,47		0,32	0,41
BDL250	10846,2	Av				1,13		1,2	1,11

196/218

Continuação da Tabela 25
BDL250	10846,3	P			0,54	0,46	0,51		0,14	0,26
BDL250	10846,3	Av			1,15	1,3	1,22		1,25	1,15
BDL252	10882,1	P			0,26	0,25	0,24	0,33	0,51	0,54	0,01
BDL252	10882,1	Av			1,35	1,36	1,22	1,35	1,28	1,21	1,02
BDL252	10882,4	P			0,49
BDL252	10882,4	Av			1,14
BDL48	10274,4	P	0,04				0,01	0,06	0,01	0,13	-	-·
BDL48	10274,4	Av	1,11				1,33	1,4	1,49	1,14
BDL48	10271,1	P			0,18	0,02	<0,01	0,29		0,18	0,02	0,06
BDL48	10271,1	Av			1,13	1,21	1,24	1,11		1,22	1,02	1,02
BDL48	10271,5	P						0,51
BDL48	10271,5	Av						1,1
BDL48	10274,3	P			0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
BDL48	10274,3	Av			1,24	1,33	1,16	1,44	1,32	1,17
BDL48	10274,4	P			0,11	0,02	0,15	0,53	0,15	0,3
BDL48	10274,4	Av			1,21	1,23	1,2	1,18	1,25	1,21
BDL48	10274,5	P			0,41	0,48	0,59	0,27	0,02	0,21
BDL48	10274,5	Av			1,12	1,23	1,12	1,24	1,2	1,23
BDL63	10381,2	P						0,48
BDL63	10381,2	Av						1,29
BDL63	10381,1	P	0,04	0,1	0,21	0,23	0,04	0,19	0,01	<0,01
BDL63	10381,1	Av	1,1	1,05	1,22	1,34	1,29	1,34	1,26	1,25
BDL63	10381,2	P			0,21	0,5	0,48	0,17	0,01	0,23
BDL63	10381,2	Av			1,21	1,28	1,25	1,26	1,22	1,21
BDL63	10384,8	P		0,1		0,04	<0,01	0,33	0,14	<0,01
BDL63	10384,8	Av		1,05		1,2	1,2	1,15	1,1	1,25
BDL79	11042,1	P	<0,01		_ _	0,-12 -	- —	-0,2 -	0,03	-
BDL79	11042,1	Av --	1,08 '		- —	1,1 —	- ... _ -	1,14	1,11 ~
BDL79	11044,3	P				0,12		<0,01	0,01	0,41
BDL79	11044,3	Av				1,12		1,24	1,15	1,18
BDL81	10371,8	P			0,18
BDL81	10371,8	Av			1,15
BDL81	10374,1	P			0,24	_____	e. =	—		- -	-
BDL81 ' ’	10374,1	Av			1,13
BDL81	10371,5	P				0,2	0,32	0,06		0,02
BDL81-----	-1037-15---	-Av---		—		1,15	1,15	1,18		1,1
BDL81	10371,8	P				0,72	0,62	0,68	0,57	0,49
BDL81	10371,8	Av				1,16	1,19	1,15	1,11	1,23
BDL81	10374,1	P			0,18	0,17	0,35	0,1	0,15	0,41
BDL81	10374,1	Av			1,41	1,41	1,35	1,3	1,35	1,26
BDL85	10411,1	P			0,16	0,34	0,26	0,23	0,62	<0,01
BDL85	10411,1	Av			1,29	1,3	1,28	1,32	1,12	1,1
BDL85	10414,1	P										0,07
BDL85	10414,1	Av										1,02
BDL85	10414,2	P			0,71
BDL85	10414,2	Av			1,1

Tabela 25. Resultados dos experimentos de estufa. São fornecidos os valores medidos de cada parâmetro [parâmetros (Par.) 11-20 de acordo com os parâmetros descritos na Tabela 23 acima] em plantas expressando os polinucleotídeos 5 indicados. Ev evento =, P = valor de P; AV = relação entre as médias do evento e controle. Observe que quando a proporção média é superior a 1 o efeito da expressão do

197/218 gene exógeno é um aumento da característica desejada;

Tabela 26

Resultados dos experimentos de estufa

Gene	Ev.	Par	21	22	23	24	25	26	27	28	29 .	30 -
BDL102 -	10471,1	P	-	0;18	0,42		0,39		0,46		0,46
BDL102	10471,1	Av		1,15	1,82		1,16		1,13		1,13
BDL102	10471,3	P			0,48
BDL102	10471,3	Av			1,38
BDL102	10472,1	P		0,01	0,54		0,17		0,22		0,22	0,43
BDL102	10472,1	Av		1,26	2,05		1,28		1,24		1,24	1,11
BDL102	10474,1	P		0,06		0,29	0,01		0,02	0,17	0,02	0,1
BDL102	10474,1	Av		1,15		1,43	1,54		1,48	1,14	1,48	1,29
BDL102	10474,2	P		0,03			0,1		0,18		0,18
BDL102	10474,2	Av		1,14			1,32		1,25		1,25
BDL102	10474,6	P	0,02		0,55
BDL102	10474,6	Av	1,02		1,76
BDL117	10071,2	P						0,24
BDL117	10071,2	Av						1,15
BDL117	10073,2	P		0,46	0,01	0,01
BDL117	10073,2	Av		1,19	1,2	1,14
BDL117	10074,1	P			0,53		0,08	0,08	0,03	0,11	0,02
BDL117	10074,1	Av			1,13		1,28	1,22	1,42	1,18	1,44
BDL117	10074,4	P					0,33		0,19		0,14
BDL117	10074,4	Av					1,16		1,24 .		1,26	-
BDL417 -	10071;2 -	p-	— —		_ ____	Λ . = - -		0,21 -	; = -		. - - =·-.	.· —· V
BDL117 ’	10071,2	Av						1,16
BDL117	10073,1	P					0,35		0,43			0,47
BDL117	10073,1	Av					1,17		1,14			1,16
BDL117	10073,2	P					0,09		0,16	0,08	0,16
BDL117	10073,2	Av					1,3		1,25	1,2	J,25- .
BDL117	10074,-1 -	P	-			— _	0,16	0,29	0,08	0,1	0,08
BDL117	10074,1	Av					1,24 1	1,12	1,31	1,17	1,31
BDL117	10074,4	P		0,71			0;54---		0,43---	CÇ27	Γ0.43
BDL117	10074,4	Av		1,14			1,1		1,13	1,1	1,13
BDL138	9811,1	P				0,15
BDL138	9811,1	Av				1,13
BDL138	9811,4	P		0,41	0,03	<0,01
BDL138	9811,4	Av		1,21	1,07	1,26
BDL138	9812,1	P		<0,01	0,42	<0,01
BDL138	9812,1	Av		1,14	1,16	1,2
BDL138	9812,3	P	0,07
BDL138	9812,3	Av	1,02
BDL138	9813,1	P						0,28
BDL138	9813,1	Av						1,13
BDL138	9813,3	P		0,06	0,55
BDL138	9813,3	Av		1,3	1,12
BDL138	9811,1	P	0,04
BDL138	9811,1	Av	1,02
BDL138	9813,1	P		0,56				0,1
BDL138	9813,1	Av		1,19				1,18
BDL138	9813,4	P		0,75
BDL138	9813,4	Av		1,14
BDL138	9811,4	P		0,29
BDL138	9811,4	Av		1,1
BDL138	9812,1	P		0,39
BDL138	9812,1	Av		1,61
BDL138	9813,1	P		0,14				0,29
BDL138	9813,1	Av		1,33				1,12
BDL138	9813,3	P		0,36	0,09

198/218

Continuação da Tabela 26
BDL138	9813,3	Av		1,87	1,07
BDL140	10421,3	P		0,84		0,37
BDL140	10421,3	Av		1,16		1,18
BDL140	10424,3	P			0,47
BDL140	10424,3	Av			1,18
BDL140	10421,2	P		0,02	0,22
BDL140	10421,2	Av		1,14	1,12
BDL140	10423,1	P	0,08
BDL140	10423,1	Av	1,03
BDL147	10301,3	P		0,54
BDL147	10301,3	Av		1,17
BDL147	10303,1	P	0,01				0,53		0,32		0,32
BDL147	10303,1	Av	1,02				1,11		1,18		1,18
BDL147	10303,6	P	0,07
BDL147	10303,6	Av	1,02
BDL147	10304,2	P	<0,01					0,55
BDL147	10304,2	Av	1,04					1,1
BDL147	10301,5	P		0,36
BDL147	10301,5	Av		1,15
BDL147	10301,6	P		0,02
BDL147	10301,6	Av		1,14
BDL147	10303,1	P		0,01
BDL147	10303,1	Av		1,29
BDL147	10303,5	P		0,02		0,43		0,31				0,08
BDL147	10303,5	Av		1,17		1,17		1,12				1,09
BDL147	10304,2	P						0,04	0,36		0,36
BDL147	10304,2	Av					_. __	1,23 -	1,44 -	- -	-1,14-	-
BDL149 “	9823,1	;P-=		0,04-	0,05- -	0,11— -	«	-	’ —
BDL149	9823,1	Av		1,17	1,19	1,17
BDL149	9823,3	P		<0,01	<0,01	0,23		0,34	0,42
BDL149	9823,3	Av		1,17	1,14	1,12		1,12	1,14
BDL149	9824,3	P						0,34
BDL149	9824,3	Av						1,1-1 -		=		— —
BDL149	9824,4	P					0,28		0,11		0,08	<0,01
BDL149	9824,4	Av					1,17		1,28		1,3	1,15
.BDL149	9823,3	-P----		—			0,48		0,48		0,48	0,1
BDL149	9823,3	Av					1,12		1,12		1,12	1,08
BDL149	9824,3	P						0,27
BDL149	9824,3	Av						1,14
BDL152	10431,1	P	0,01
BDL152	10431,1	Av	1,02
BDL152	10432,5	P					0,37
BDL152	10432,5	Av					1,17
BDL152	10434,1	P			0,05
BDL152	10434,1	Av			1,16
BDL152	10434,4	P		0,58	0,27		0,3		0,32	0,31	0,32	0,56
BDL152 '	10434,4	Av		1,14	1,17		1,19		1,19	1,15	1,19	1,1
BDL152	10431,1	P		0,43	0,58
BDL152	10431,1	Av		1,18	1,1
BDL152	10431,3	P				0,02
BDL152	10431,3	Av				1,18
BDL152	10434,1	P			0,42
BDL152	10434,1	Av			1,1
BDL152	10434,4	P	0,09
BDL152	10434,4	Av	1,03
BDL153	10141,3	P	0,09				0,12		0,07	0,23	0,05
BDL153	10141,3	Av	1,02				1,25		1,33	1,13	1,35
BDL153	10142,2	P					0,04	0,09	0,01	0,11	<0,01
BDL153	10142,2	Av					1,37	1,22	1,56	1,2	1,58
BDL153	10143,1	P					0,45		0,48		0,4
BDL153	10143,1	Av					1,12		1,12		1,14

199/218

Continuação da Tabela 26
BDL153	10144,1	P					0,52	0,25	0,53		0,45
BDL153	10144,1	Av					1,1	1,13	1,11		1,12
BDL153	10141,3	P		0,22	0,67		0,48		0,39		0,39
BDL153	10141,3	Av		1,28	1,12		1,11		1,14		1,14
BDL153	10142,2	P		0,05	<0,01	0,63	0,11		0,06	0,04	0,06
BDL153	10142,2	Av		1,36	1,2	1,1	1,26		1,33	1,18	1,33
BDL153	10142,3	P					0,26		0,29	0,2	0,29
BDL153	10142,3	Av					1,19		1,18	1,12	1,18
BDL153	10143,1	P		0,09								0,25
BDL153	10143,1	Av		1,09								1,11
BDL153	10143,2	P		0,05			0,47	0,22	0,36	0,23	0,36	0,23
BDL153	10143,2	Av		1,11			1,11	1,15	1,15	1,1	1,15	1,13
BDL153	10144,1	P					0,28		0,26	0,06	0,26
BDL153	10144,1	Av					1,17		1,18	1,17	1,18
BDL154	10703,1	P		0,11	0,64	0,67
BDL154	10703,1	Av		1,1	1,2	1,27
BDL154	10703,5	P		0,37	0,44	0,66
BDL154	10703,5	Av		1,18	1,26	1,13
BDL154	10703,6	P		0,25	0,59	0,59
BDL154	10703,6	Av		1,28	1,47	1,29
BDL154	10703,8	P		0,29			0,58		0,58		0,58
BDL154	10703,8	Av		1,17			1,1		1,1		1,1
BDL155	9991,3	P				0,65
BDL155	9991,3	Av				1,11
BDL155	9991,5	P			0,5		0,34		0,57	0,4	0,57	0,32
BDL155	9991,5	Av			1,23		1,17		1,11	1,12	1,11	1,22
BDL155	9991,9	P			.0,39 —	. _ -	—	—	-	—	—
BDL155 -	.9991-,9 —	Av-	—_	, —-	1,22-	=* ==^=.		-
BDL155	9994,3	P			0,49	0,56	0,4		0,31	0,49	0,31
BDL155	9994,3	Av			1,1	1,14	1,15		1,19	1,1	1,19
BDL155	9994,5	P						0,41
BDL155	9994,5	Av						1,14
BDL157	9911,3	P		0,25	0,14 „				=	-	— -	-
BDL157 '	9911,3	Av		1,54	1,11
BDL157	9911,4	P		<0,01
-BDL457—	-9911,4	rAv—		Ί;26—
BDL157	9914,2	P		0,37
BDL157	9914,2	Av		1,23
BDL157	9911,3	P		0,08	0,28
BDL157	9911,3	Av		1,15	1,25
BDL157	9911,4	P		0,46
BDL157	9911,4	Av		1,23
BDL157	9913,3	P		0,37
BDL157	9913,3	Av		1,21
BDL157	9914,2	P										0,45
BDL157	9914,2	Av										1,16
BDL160	10011,5	P		0,34		0,54		0,35
BDL160	10011,5	Av		1,59		1,26		1,15
BDL160	10011,6	P		0,03	0,61	0,67
BDL160	10011,6	Av		1,15	1,23	1,16
BDL160	10011,7	P		0,02
BDL160	10011,7	Av		1,16
BDL160	10013,1	P		0,01		0,41
BDL160	10013,1	Av		1,32		1,27
BDL160	10015,1	P		0,09		0,09
BDL160	10015,1	Av		1,1		1,14
BDL162	10491,1	P		0,42
BDL162	10491,1	Av		1,44
BDL162	10492,2	P					0,04		0,09	0,27	0,09	0,05
BDL162	10492,2	Av					1,4		1,34	1,17	1,34	1,44
BDL162	10492,4	P		0,37	0,39			0,55

200/218

Continuação da Tabela 26
BDL162	10492,4	Av		1,83	1,25			1,11
BDL162	10494,1	P			0,63
BDL162	10494,1	Av			1,13
BDL167	10042,3	P		0,19
BDL167	10042,3	Av		1,21
BDL167	10042,3	P						0,24
BDL167	10042,3	Av						1,15				-
BDL167 ’	10043,2	P		0,13								0,6
BDL167	10043,2	Av		1,13								1,14
BDL167	10043,3	P					0,44					0,27
BDL167	10043,3	Av					1,12					1,12
BDL167	10043,4	P		0,05		0,33						0,14
BDL167	10043,4	Av		1,16		1,12						1,46
BDL167	10044,2	P		0,2			0,27		0,2		0,2	0,24
BDL167	10044,2	Av		1,18			1,18		1,21		1,21	1,19
BDL168	9881,3	P					0,01		0,01	0,04	0,01
BDL168	9881,3	Av					1,44		1,48	1,23	1,5
BDL168	9881,4	P			0,36		0,06	0,05	0,07	0,11	0,05
BDL168	9881,4	Av			1,14		1,31	1,24	1,33	1,18	1,35
BDL168	9882,1	P									0,51
BDL168	9882,1	Av									1,11
BDL168	9882,3	P					0,08		0,09	0,16	0,07
BDL168	9882,3	Av					1,31		1,33	1,17	1,35
BDL168	9884,4	P	<0,01				0,32		0,46	0,2	0,39
BDL168	9884,4	Av	1,03				1,17		1,14	1,16	1,16
BDL168	9881,3	P			0,66							<0,01
BDL168	9881,3	Av			1,1 -		-	- —	- - -	-		1719 -
BDL168	.9881,4	p.=		0,12 -		--	0,44 -		0,34’	0,14	0,34
BDL168	9881,4	Av		1,17			1,13		1,16	1,13	1,16
BDL168	9882,1	P					0,53		0,39			0,58
BDL168	9882,1	Av					1,1		1,14			1,13
BDL168	9882,3	P		0,01	0,42			0,35				0,18
BDL168	9882,3	Av		1,19	1,1			1,12-	-	- _ -	- -	1,2
BDL168	9883,3 ’	P			0,06
BDL168	9883,3	Av			1,09
-BDL1-68---	-9881-1-----	-P--								0,07
BDL168	9884,1	Av								1,17
BDL169	10743,4	P					0,54		0,37		0,65
BDL169	10743,4	Av					1,11		1,18		1,1
BDL169	10744,1	P			0,28			0,3
BDL169	10744,1	Av			1,12			1,13
BDL169	10747,1	P		0,6	0,53
BDL169	10747,1	Av		1,12	1,17
BDL169	10747,5	P							0,61		0,44
BDL169	10747,5	Av							1,1		1,16
BDL169	10741,3	P		0,73
BDL169	10741,3	Av		1,1
BDL169	10744,2	P					0,04		0,05	0,07	0,05	0,84
BDL169	10744,2	Av					1,43		1,41	1,19	1,41	1,1
BDL169	10747,1	P			0,65	0,43	0,35		0,43		0,43
BDL169	10747,1	Av			1,21	1,24	1,18		1,15		1,15
BDL169	10747,3	P				0,4
BDL169	10747,3	Av				2,16
BDL169	10747,5	P					0,16		0,53		0,53
BDL169	10747,5	Av					1,27		1,11		1,11
BDL171	10661,2	P					0,3		0,31	0,54	0,31	0,34
BDL171	10661,2	Av					1,19		1,21	1,1	1,21	1,3
BDL171	10661,5	P			0,36
BDL171	10661,5	Av			1,13
BDL171	10664,1	P			0,02		0,07		0,03	0,28	0,03	0,67
BDL171	10664,1	Av			1,19	11,39		1,48	1,17	1,48	1,22

201/218

Continuação da Tabela 26
BDL171	10664,3	P					0,34		0,08	0,46	0,08	0,61
BDL171	10664,3	Av					1,17		1,36	1,11	1,36	1,25
BDL171	10662,2	P		0,09	0,07
BDL171	10662,2	Av		1,45	1,45
BDL171	10662,3	P			0,42		0,07		0,11	0,21	0,07	0,6
BDL171	10662,3	Av			1,2		1,33		1,32	1,16	1,4	1,15
BDL171	10663,3	P		0,22- .	0,01	0,56						-
BDL171	10663,3	Av		1,19	1,51	1,14
BDL171	10664,1	P									0,68
BDL171	10664,1	Av									1,1
BDL171	10664,3	P	0,09		0,07				0,48		0,34
BDL171	10664,3	Av	1,02		1,22				1,14		1,21
BDL173	9952,1	P			0,18		0,39	0,22	0,51		0,44
BDL173	9952,1	Av			1,13		1,14	1,15	1,12		1,13
BDL173	9954,2	P				0,09		0,35
BDL173	9954,2	Av				1,08		1,11
BDL173	9953,4	P	0,03									0,23
BDL173	9953,4	Av	1,02									1,3
BDL173	9954,2	P	0,02									0,1
BDL173	9954,2	Av	1,02									1,11
BDL176	9891,2	P		0,6	0,58
BDL176	9891,2	Av		1,24	1,19
BDL176	9892,3	P		0,38
BDL176	9892,3	Av		1,89
BDL176	9893,2	P		0,73
BDL176	9893,2	Av		1,11
BDL176	9893,,3	R.	0,01	.__	— —		—	— -	—	—	—	0,37-
BDL176 —	9893,3 -	Av	1,02 -		—			—				1,12
BDL177	10521,3	P					0,41			0,53
BDL177	10521,3	Av					1,15			1,1
BDL177	10522,2	P		0,44
BDL177	10522,2	Av		1,19
BDL182:	10691,2	P		-	0,45 .		0,35-		0;57	0,52 =	0,57 —	- —
BDL182	10691,2	Av			.1,11		1,17		1,11	1,1	1,11
BDL182	10693,2	P		0,12
BDL182—	10693;2—	Av		'1,28 ’
BDL182	10693,3	P							0,55		0,55
BDL182	10693,3	Av							1,11		1,11
BDL182	10693,5	P			0,01	0,07
BDL182	10693,5	Av			1,28	1,08
BDL182	10691,2	P				0,58
BDL182	10691,2	Av				1,12
BDL182	10691,4	P	0,09		0,29			0,11
BDL182	10691,4	Av	1,02		1,27			1,2
BDL182	10691,8	P			0,61
BDL182	10691,8	Av			1,11
BDL182	10693,2	P			0,38	0,57		0,37
BDL182	10693,2	Av			1,1	1,13		1,12
BDL182	10693,3	P		0,69	0,43	0,46
BDL182	10693,3	Av		1,25	1,59	1,25
BDL183	9941,1	P					0,37	0,25	0,5		0,42
BDL183	9941,1	Av					1,14	1,14	1,12		1,13
BDL183	9942,1	P										0,55
BDL183	9942,1	Av										1,12
BDL183	9942,4	P		0,22	0,09	0,01		0,07			0,53
BDL183	9942,4	Av		1,24	1,17	1,13		1,21			1,11
BDL183	9943,4	P					0,31		0,53	0,37
BDL183	9943,4	Av					1,16		1,11	1,1
BDL183	9944,1	P					0,46		0,23		0,18
BDL183	9944,1	Av					1,12		1,21		1,23
BDL183	9944,4	P	<0,01

202/218

Continuação da Tabela 26
BDL183	9944,4	Av	1,03
BDL183	9941,1	P					0,38		0,42	0,21	0,42
BDL183	9941,1	Av					1,15		1,13	1,13	1,13
BDL183	9942,1	P		0,17			0,48		0,42		0,42
BDL183	9942,1	Av		1,15			1,11		1,13		1,13
BDL183	9942,4	P		0,02	0,21
BDL183	9942,4	Av		1,16	1,13
BDC183	9943,4	P		0,35				0,33				0,12
BDL183	9943,4	Av		1,24				1,13				1,16
BDL183	9944,2	P		0,59	0,5
BDL183	9944,2	Av		1,12	1,14
BDL186	10002,2	P					0,15	0,23	0,14	0,24	0,1
BDL186	10002,2	Av					1,23	1,14	1,26	1,13	1,28
BDL186	10004,3	P					0,32		0,39	0,2	0,33
BDL186	10004,3	Av					1,16		1,16	1,16	1,18
BDL186	10001,3	P			0,46
BDL186	10001,3	Av			1,1
BDL186	10004,3	P		0,55
BDL186	10004,3	Av		1,15
BDL187	10502,2	P		0,43
BDL187	10502,2	Av		1,21
BDL187	10501,2	P	0,01	0,58
BDL187	10501,2	Av	1,02	1,38
BDL187	10502,4	P		0,66
BDL187	10502,4	Av		1,1
BDL187	10503,5	P		0,38	0,2	0,34
BDL187	10503,5	Av		1,13.	1,24-	-1,12- -	— -	— -	- -	— -	·-
BDL188	10462,1. -	-P-™	-=	0,46= -	-	1 —=	• -- -	; -- --
BDL188	10462,1	Av		1,41
BDL188	10464,5	P						0,33
BDL188	10464,5	Av						1,12
BDL188	10462,1	P					0,38		0,35		0,35
BDL188	10462,1	Av				=.	.1,16 =	- =.	1,18 -	- *	1;18 -
BDL188’	10462,4	P	0,02	0,41			0,26		0,24		0,24
BDL188	10462,4	Av	1,02	1,32			1,2		1,22		1,22
BDL188				Ό.66---
-11)404,3	r
BDL188	10464,3	Av		1,24
BDL188	10464,5	P		0,29	0,1
BDL188	10464,5	Av		1,38	1,12
BDL190	10232,2	P										0,6
BDL190	10232,2	Av										1,1
BDL190	10233,4	P										0,01
BDL190	10233,4	Av										1,2
BDL190	10234,1	P	0,01									0,4
BDL190	10234,1	Av	1,02									1,14
BDL190	10231,1	P		0,42	0,24
BDL190	10231,1	Av		1,18	1,21
BDL190	10231,2	P		0,64								0,5
BDL190	10231,2	Av		1,14								1,2
BDL190	10232,2	P		<0,01			0,26		0,14		0,14
BDL190	10232,2	Av		1,29			1,18		1,25		1,25
BDL190	10233,2	P					0,1	0,29	0,05	0,01	0,05
BDL190	10233,2	Av					1,25	1,13	1,32	1,24	1,32
BDL190	10233,4	P					0,16		0,29	0,29	0,29
BDL190	10233,4	Av					1,23		1,17	1,1	1,17
BDL190	10234,2	P		0,04								0,02
BDL190	10234,2	Av		1,11								1,09
BDL192	9921,3	P		0,54	0,56			0,16
BDL192	9921,3	Av		1,19	1,11			1,16
BDL192	9921,6	P					0,51		0,47		0,4
BDL192	9921,6	Av					1,1		1,12		1,14

203/218

Continuação da Tabela 26
BDL192	9922,1	P									0,52
BDL192	9922,1	Av									1,11
BDL192	9922,2	P	<0,01
BDL192	9922,2	Av	1,02
BDL192	9921,6	P					0,49	0,03	0,45		0,45
BDL192	9921,6	Av					1,15	1,25	1,16		1,16
BDL192	9922,5	P							0,54		-	0,51
BDL192	9922,5	Av							1,13			1,15
BDL193	10152,2	P						0,15
BDL193	10152,2	Av						1,17
BDL193	10152,3	P				0,3		0,1
BDL193	10152,3	Av				1,11		1,2
BDL193	10153,2	P						0,24
BDL193	10153,2	Av						1,14
BDL193	10153,4	P	0,04				0,39		0,4		0,33
BDL193	10153,4	Av	1,02				1,14		1,14		1,16
BDL193	10152,2	P			0,7
BDL193	10152,2	Av			1,12
BDL193	10152,3	P						0,14
BDL193	10152,3	Av						1,16
BDL193	10153,2	P	0,01
BDL193	10153,2	Av	1,02
BDL193	10153,3	P		0,35				0,4	0,48		0,48
BDL193	10153,3	Av		1,22				1,1	1,14		1,14
BDL193	10153,4	P					0,63		0,5		0,5
BDL193	10153,4 ~	Av -	- - -	- -	-	.— __	4,1-		1,14		1,14
BDL196	10241,3	P		0,5 ~	- - ·						.. .	—
BDL196	10241,3	Av		1,1
BDL196	10243,1	P			0,01				0,56		0,56
BDL196	10243,1	Av			1,08				1,14		1,14
BDL196	10243,2	P		0,37
BDL196	10243/2 “	Av	-	1,29 -
BDL196	10244,1	•p		0,02	0,22	0,82						0,02
-BDL496—	40244/1	Av		1,21	1,11	1,1						1,13
BDL201	9961,3	P					’0,T2		0/12---	0731----	0,1-2
BDL201	9961,3	Av					1,31		1,32	1,16	1,32
BDL201	9961,4	P			0,62
BDL201	9961,4	Av			1,14
BDL201	9961,6	P	0,01	0,01
BDL201	9961,6	Av	1,02	1,54
BDL201	9963,6	P		0,46	0,37	0,21
BDL201	9963,6	Av		1,29	1,13	1,15
BDL220	10331,5	P		0,76
BDL220	10331,5	Av		1,13
BDL220	10331,7	P			0,62	0,42		0,29
BDL220	10331,7	Av			1,21	1,17		1,18
BDL220	10333,2	P		0,62
BDL220	10333,2	Av		1,49
BDL220	10333,5	P				0,01	0,25			0,26		0,65
BDL220	10333,5	Av				1,13	1,22			1,18		1,14
BDL220	10334,1	P	<0,01		0,36	0,64
BDL220	10334,1	Av	1,04		1,31	1,11
BDL223	10791,1	P				0,51
BDL223	10791,1	Av				1,78
BDL223	10793,1	P		0,02	0,58
BDL223	10793,1	Av		1,16	1,34
BDL223	10793,3	P				0,7
BDL223	10793,3	Av				1,1
BDL223	10793,5	P		0,01		<0,01	0,42		0,48		0,48	0,18
BDL223	10793,5	Av		1,18		1,41	1,15		1,13		1,13	1,17
BDL223	10793,8	P			0,6

204/218

Continuação	da Tabela 26
BDL223	10793,8	Av			1,36
BDL224	10451,3	P							0,61	0,5	0,61
BDL224	10451,3	Av							1,1	1,11	1,1
BDL224	10451,7	P										0,78
BDL224	10451,7	Av										1,11
BDL224	10451,8 '	P	- -	0,03								0,54
BDL224	10451,8	Av		1,78								1,11
BDL224	10453,1	P										0,77
BDL224	10453,1	Av										1,11
BDL224	10453,3	P		0,62				0,39
BDL224	10453,3	Av		1,82				1,14
BDL225	10401,4	P						0,18
BDL225	10401,4	Av						1,17
BDL225	10402,2	P		0,29	0,74
BDL225	10402,2	Av		1,28	1,1
BDL225	10402,5	P				0,38
BDL225	10402,5	Av				1,13
BDL225	10401,4	P		0,5								0,65
BDL225	10401,4	Av		1,12								1,15
BDL225	10402,2	P				0,42						0,38
BDL225	10402,2	Av				1,1						1,15
BDL225	10402,6	P										0,38
BDL225	10402,6	Av										1,15
BDL225	10402,9	P			0,07	0,01
.BDL225	10402,9	Av			1,14	1,15
BDL226	10861,2	,P~’’		- - - -	0,53 - -	0,54 . .
BDL226	10861,2	Av		~ “·	1,22 -*'	1,12		_ __		- - - -	- - - -
BDL226	10862,2	P	0,03									- -=-·
BDL226	10862,2	Av	1,03
BDL226	10864,2	P			0,44		0,58		0,32		0,21
BDL226 ·	10864,2	Av			1,17		1,1		1,2		1,27
BDL226	10861,1 ’ ‘	P -		- ’ —	0,68 = .	0,72
BDL226 -	10861,1	Av			1,27	1,21					- - .
‘BDt226—	-10861-;4----	-P	____	0,04		0,41
BDL226	10861,4	Av		1,13		71744----	-------	---
BDL226	10862,2	P				0,21
BDL226	10862,2	Av				1,51
BDL226	10863,4	P			0,53
BDL226	10863,4	Av			2,04
BDL227	11491,1	P		0,08		0,45
BDL227	11491,1	Av		1,17		2,04
BDL227	11491,3	P		0,13		0,34						0,08
BDL227	11491,3	Av		1,1		1,78						1,15
BDL227	11491,5	P		0,66
BDL227	11491,5	Av		1,15
BDL227	11492,3	P		0,04		0,71	0,48		0,49		0,49	0,02
BDL227	11492,3	Av		1,13		1,15	1,13		1,12		1,12	1,2
BDL227	11492,5	P				0,66
BDL227	11492,5	Av				1,29
BDL227	11493,5	P			0,65
BDL227	11493,5	Av			1,38
BDL230	10672,4	P		0,79
BDL230	10672,4	Av		1,1
BDL230	10673,2	P						0,42
BDL230	10673,2	Av						1,1
BDL233	10822,1	P				0,14
BDL233	10822,1	Av				1,37
BDL233	10822,2	P		0,02		0,46
BDL.233	10822,2	Av		1,16		1,4
BDL233	10824,2	P				0,46
BDL233	10824,2	Av				1,69

205/218

Continuação da Tabela 26

BDL233	10825,4	P		0,03		0,16	0,15		0,19	0,12	0,19
BDL233	10825,4	Av		1,16		1,15	1,3		1,26	1,17	1,26
BDL237	10892,2	P		0,23
BDL237	10892,2	Av		1,15
BDL237	10893,1	P			0,48
BDL237	10893,1	Av			2,25 .
BDL237	10895,1	P		0,57	0,48	0,47			0,54		0,54
BDL237	10895,1	Av		1,11	1,28	1,35			1,11		1,11
BDL237	10895,2	P										0,61
BDL237	10895,2	Av										1,11
BDL237	10895,3	P		0,03	0,48
BDL237	10895,3	Av		1,18	2,07
BDL238	10951,4	P		0,03
BDL238	10951,4	Av		1,16
BDL238	10952,3	P				0,12		0,16
BDL238	10952,3	Av				1,15		1,16
BDL238	10953,1	P			0,43
BDL238	10953,1	Av			1,2
BDL238	10953,3	P		0,36
BDL238	10953,3	Av		1,18
BDL238	10954,2	P					0,02		0,01	0,05	0,01	0,04
BDL238	10954,2	Av					1,45		1,5	1,19	1,5	1,25
BDL238	10954,3	P			0,16
BDL238	10954,3	Av			1,77
BDL240.	10802,2	P		0,24		0,44	0,1		0,07	0,06	0,07	0,25
BDL240-	10802,2 .	AV-		1,15 -	- - - -	1,45 -	.1,3		1,35	1,18	1,35	1,28
BDL240	10803,1	P				0,62 -	- ·		• -	- -	- - -
BDL240	10803,1	Av				1,45
BDL240	10803,5	P			0,63
BDL240	10803,5	Av			1,4
BDL240	10806,2	P		0,09								0,39
BDL240	10806,2	Av	- *	1,1 -	-- - ...							1,11
BDL241	10873,1	P			0,55		0,11		0,09 ~	0,17' '	0,09-	0;34 -
BDL241---	10873,1----	-Av			1,86		1,32		1,33	1,13	1,33	1,25
BDL241	10873,4	P				0,44
BDL241	10873,4	Av				1,73
BDL241	10874,2	P	<0,01
BDL241	10874,2	Av	1,03
BDL241	10875,1	P				0,33
BDL241	10875,1	Av				1,57
BDL241	10875,2	P			0,58	0,09
BDL241	10875,2	Av			1,48	1,19
BDL242	10731,2	P					0,59		0,46		0,46
BDL242	10731,2	Av					1,1		1,14		1,14
BDL242	10731,3	P			<0,01
BDL242	10731,3	Av			1,74
BDL242	10731,5	P			0,7
BDL242	10731,5	Av			1,18
BDL242	10731,6	P			0,63		0,07		0,07	0,09	0,07	0,04
BDL242	10731,6	Av			1,48		1,36		1,35	1,17	1,35	1,16
BDL242	10731,7	P			0,18
BDL242	10731,7	Av			2,28
BDL242	10737,2	P				0,07
BDL242	10737,2	Av				1,22
BDL245	10811,3	P		0,22	0,05	<0,01		0,2
BDL245	10811,3	Av		1,47	1,25	1,25		1,16
BDL245	10813,3	P			0,28	0,02		0,22
BDL245	10813,3	Av			1,17	1,33		1,15
BDL245	10811,2	P		0,37		0,3
BDL245	10811,2	Av		1,22		1,49
BDL245	10811,3	P		0,21	0,12	0,5

206/218

Continuação da Tabela 26
BDL245	10811,3	Av		1,18	1,44	1,79
BDL245	10812,3	P			0,55	0,11
BDL245	10812,3	Av			2,2	1,12
BDL245	10813,3	P		0,37		0,45		0,04
BDL245	10813,3	Av		1,19		1,1		1,26
BDL245	10816(3	r -	- - -		0,52- .	0,23
BDL245	10816,3	Av			1,81	1,14
BDL247	10911,4	P		0,42
BDL247	10911,4	Av		1,1
BDL247	10912,1	P			0,48	0,58
BDL247	10912,1	Av			1,26	1,16
BDL247	10912,6	P				0,6
BDL247	10912,6	Av				1,33
BDL248	11051,2	P		0,45
BDL248	11051,2	Av		1,14
BDL250	10841,3	P		0,2		0,13	0,58		0,36		0,36
BDL250	10841,3	Av		1,14		1,16	1,1		1,17		1,17
BDL250	10842,1	P		0,45		0,37
BDL250	10842,1	Av		1,12		1,31
BDL250	10842,3	P		0,02		0,46
BDL250	10842,3	Av		1,15		1,14
BDL250	10843,2	P				0,42
BDL250	10843,2	Av				1,19
BDL250	10846,2	P		0,01		0,06
BDL250	10846,2	Av		1,17		1,22
BDL250 -	10846,3	:p* ~	• — - -	-- - -	0,48 -	0,22 -	0,26		0,34	0,25	0,34
BDL250	10846,3	Av			1713’ ’	1,11 -	1,23— -		1,19	1,12	1,19' *	- - -
BDL252	10881,1	P			0,54
BDL252	10881,1	Av			2,4
BDL252	10882,1	P				0,59	0,24		0,2	0,14	0,2
BDL252	10882,1	Av				1,24	1,22		1,24	1,16	1,24
BDL252	10882,2	p-		- - -	0 -,5 -- ,	0,71.
BDL252	10882,2	Av			1,52	1,27					- - -
BDL252—	10882,4	-P			0,52
BDL252	10882,4	Av			2,2	— ----- —	———
			—
BDL252	10884,1	P		0,22		0,27
BDL252	10884,1	Av		1,16		1,28
BDL48	10271,1	P			0,01							0,34
BDL48	10271,1	Av			1,22							1,3
BDL48	10271,3	P				0,33		0,31
BDL48	10271,3	Av				1,23		1,17
BDL48	10271,5	P	<0,01
BDL48	10271,5	Av	1,03
BDL48	10274,4	P		0,5	0,02	0,01	0,07	0,52	0,06	0,15	0,06	0,01
BDL48	10274,4	Av		2,17	1,24	1,13	1,34	1,11	1,37	1,22	1,37	1,51
BDL48	10271,1	P					0,13	0,12	0,08	0,03	0,08
BDL48	10271,1	Av					1,25	1,17	1,29	1,2	1,29
BDL48	10271,3	P		0,21
BDL48	10271,3	Av		1,1
BDL48	10271,5	P		<0,01
BDL48	10271,5	Av		1,26
BDL48	10274,3	P		0,01			0,31		0,18		0,18
BDL48	10274,3	Av		1,18			1,15		1,21		1,21
BDL48	10274,4	P		0,57			0,22		0,12	0,18	0,12
BDL48	10274,4	Av		1,13			1,2		1,27	1,12	1,27
BDL48	10274,5	P			<0,01		0,45	0,35	0,2	0,3	0,2
BDL48	10274,5	Av			1,16		1,13	1,11	1,22	1,1	1,22
BDL58	10281,2	P				0,26		0,27
BDL58	10281,2	Av				1,11		1,19
BDL58	10281,3	P		0,65	0,64
BDL58	10281,3	Av		1,23	1,2

207/218

Continuação da Tabela 26
BDL58	10281,5	P				0,01
BDL58	10281,5	Av				1,12
BDL58	10282,3	P				0,02
BDL58	10282,3	Av				1,11
BDL63	10381,1	P		0,62	0,25	0,39
BDL63	10381,1	Av		1/35	1,28	1r11 -
BDL63	10381,2	P		0,1	0,19	0,39
BDL63	10381,2	Av		1,67	1,19	1,12
BDL63	10384,5	P		0,54		0,05						0,29
BDL63	10384,5	Av		1,95		1,09						1,19
BDL63	10381,1	P					0,06		0,02	0,04	0,02	<0,01
BDL63	10381,1	Av					1,31		1,4	1,18	1,4	1,16
BDL63	10381,2	P	0,06				0,19		0,1	0,07	0,1
BDL63	10381,2	Av	1,02				1,25		1,32	1,2	1,32
BDL63	10384,2	P			0,41	0,45						<0,01
BDL63	10384,2	Av			1,14	1,12						1,17
BDL63	10384,3	P										0,3
BDL63	10384,3	Av										1,14
BDL63	10384,7	P		0,04								<0,01
BDL63	10384,7	Av		1,12								1,16
BDL63	10384,8	P					0,12		0,11	0,06	0,11	0,31
BDL63	10384,8	Av					1,25		1,26	1,17	1,26	1,12
BDL79	11041,1	P		0,13	0,49	0,77
BDL79	11041,1	Av		1,11	2,06	1,1
BDL79 - -	11042,1 .	P		0,09				0,2	0,54		0,54
'BDL79 - *	11042,1 -	Av		1,15 -	- - - _	- - -	- - - .	1,46 .	1,t1		1,11
BDL79	11042,3	P			0,46			- -				- — - - -
BDL79	11042,3	Av			1,37
BDL79	11043,1	P			0,47
BDL79	11043,1	Av			1,92
BDL79 . .	11044,3	P		0,01		0,15
BDL79	11044,3	Av		1,21	L - - -	1,23
BDL81	10371,5	P			0,6							- = -
BDL81	'10371/5---	Av—	---	__	.1,27
BDL81	10371,8	P			0,51				------	-----------------:---------------	—
BDL81	10371,8	Av			2,2
BDL81	10372,1	P			0,54
BDL81	10372,1	Av			2,43
BDL81	10372,2	P		0,06	0,66
BDL81	10372,2	Av		1,12	1,28
BDL81	10374,1	P			0,42
BDL81	10374,1	Av			1,99
BDL81	10371,5	P				0,01	0,25		0,37	0,14	0,37	0,07
BDL81	10371,5	Av				1,13	1,18		1,14	1,13	1,14	1,11
BDL81	10371,8	P		0,2	0,05	0,02	0,33		0,23	0,19	0,23	0,04
BDL81	10371,8	Av		1,12	1,1	1,1	1,19		1,24	1,18	1,24	1,07
BDL81	10372,1	P		0,05
BDL81	10372,1	Av		1,1
BDL81	10372,2	P		0,33	0,4							0,59
BDL81	10372,2	Av		1,13	1,29							1,18
BDL81	10373,2	P		0,01
BDL81	10373,2	Av		1,19
BDL81	10374,1	P					0,06		0,02	0,23	0,02	0,04
BDL81	10374,1	Av					1,35		1,48	1,14	1,48	1,15
BDL85	10411,1	P				0,01	0,12		0,12	0,26	0,12	0,07
BDL85	10411,1	Av				1,09	1,29		1,28	1,12	1,28	1,16
BDL85	10411,3	P		0,59
BDL85	10411,3	Av		1,51
BDL85	10412,2	P		0,62
BDL85	10412,2	Av		1,6
BDL85	10414,1	P	0,1

208/218

Continuação da Tabela 26
BDL85	10414,1	Av	1,03
BDL85	10414,2	P										0,62
BDL85	10414,2	Av										1,19

Tabela 26. Resultados dos experimentos de estufa. São fornecidos os valores medidos de cada parâmetro [parâmetros (Par.) 21-30 de acordo com os parâmetros descritos na Tabela 23 acima] em plantas expressando os polinucleotídeos 5 indicados. Ev = evento =, P = valor de P; AV = relação entre as médias do evento e controle. Observe que quando a proporção média é superior a 1 o efeito da expressão do gene exógeno é um aumento da característica desej ada;

Tabela 27

Resultados dos Experimentos de’ estufa- - -

Gene	Ev.	Par	31	32	33	34	35	36	37
BDL102	10471,1	P	0,12
BDL102	10471,1	Av	1,12
BDL102	1.0474,1	P	0,26
BDL102	10474,1	Av	1,35 -		* - -	=· --	— _ _
BDL117	10074,1	P				0,69
BDL117	10074,1------	~Av---				1,1
BDL117	10074,4	P				0,45		—
BDL117	10074,4	Av				1,14
BDL138	9811,1	P		0,06	0,11		0,22
BDL138	9811,1	Av		1,18	1,11		1,1
BDL138	9811,4	P		<0,01	0,19		0,48
BDL138	9811,4	Av		1,21	1,11		1,2
BDL138	9813,1	P		0,1			0,02
BDL138	9813,1	Av		1,17			1,05
BDL138	9813,4	P						0,01
BDL138	9813,4	Av						1,08
BDL138	9811,1	P					0,26	0,58
BDL138	9811,1	Av					1,15	1,13
BDL138	9811,4	P		<0,01	0,02
BDL138	9811,4	Av		1,18	1,18
BDL138	9812,1.	P		0,01	0,03		0,1
BDL138	9812,1 .	Av		1,13	1,1		1,07
BDL138	9813,1	P		0,02	0,09
BDL138	9813,1	Av		1,09	1,08
BDL138	9813,3	P		0,09	0,03
BDL138	9813,3	Av		1,17	1,16
BDL140 .	10423,1	P	0,71
BDL140	10423,1	Av	1,11
BDL147	10301,5	P		0,01
BDL147	10301,5	Av		1,1
BDL147	10301,6	P		0,06	0,02
BDL147	10301,6	Av		1,14	1,09
BDL147	10303,1	P		0,16				0,66

209/218

Continuação da Tabela 27
BDL147	10303,1	Av		1,11				1,14
BDL147	10303,5	P		0,01	0,01
BDL147	10303,5	Av		1,13	1,11
BDL147	10303,6	P						0,1
BDL147	10303,6	Av						1,13
BDLT49	9824,4	P -	0,01
BDL149	9824,4	Av	1,19					-
BDL152	10434,4	P	0,8
BDL152	10434,4	Av	1,13
BDL153	10143,1	P				0,65		0,52
BDL153	10143,1	Av				1,1		1,19
BDL153	10143,2	P				0,26			0,05
BDL153	10143,2	Av				1,1			1,02
BDL155	9991,5	P	0,56
BDL155	9991,5	Av	1,23
BDL155	9991,9	P	0,1
BDL155	9991,9	Av	1,31
BDL155	9993,2	P	0,62
BDL155	9993,2	Av	1,1
BDL155	9994,3	P	0,47
BDL155	9994,3	Av	1,14
BDL157	9911,3	P		0,02	0,33
BDL157	9911,3	Av		1,32	1,19
BDL157	9911,4	P				0,64
BDL157	9911,4	Av				1,14
BDL157 ~	9913,1	p- -		0,01----	<0,0-1.
BDL157	9913,1	Av		1,19 - ’	' 1,08 -	-- —- ~	- =— - - =-·		— - —
BDL157	9913,3	P		0,11
BDL157	9913,3	Av		1,17
BDL157	9914,2	P		0,13			0,4
BDL157	9914,2	Av		1,18			1,1
BDL157 ‘	9911,3 -	P* -	-	0,15 . .
BDL157	9911,3	Av		1,13				- — - -	• * - -
-BDL457-----	-9913,-1	P						0,36
dULIO/ BDL157	yy ί ο, ί 9913,3 .	AV P						—ΤγΤΟ----- 0,03
BDL157	9913,3	Av						1,06
BDL157	9914,2	P				0,22
BDL157	9914,2	Av				1,18
BDL162	10492,2	P	0,1
BDL162	10492,2	Av	1,8
BDL167	10042,3	P		0,14
BDL167	10042,3	Av		1,15
BDL167	10042,4	P		0,01	0,01	0,19	0,01
BDL167	10042,4	Av		1,15	1,05	1,1	1,06
BDL167	10043,1	P		0,01	0,04		<0,01
BDL167	10043,1	Av		1,16	1,06		1,1
BDL167	10043,3	P		0,04	0,08		0,01
BDL167	10043,3	Av		1,15	1,05		1,06
BDL167	10044,2	P					0,52
BDL167	10044,2	Av					1,11
BDL167	10043,2	P				0,44	0,07
BDL167	10043,2	Av				1,22	1,08
BDL167	10043,3	P				<0,01
BDL167	10043,3	Av				1,2
BDL167	10043,4	P				0,22		0,2
BDL167	10043,4	Av				1,21		1,2
BDL167	10044,2	P				0,1			0,05
BDL167	10044,2	Av				1,22			1,03
BDL168	9881,3	P				<0,01
BDL168	9881,3	Av				1,27

210/218

Continuação da Tabela 27
BDL168	9881,4	P					0,4	0,42
BDL168	9881,4	Av					1,21	1,2
BDL168	9882,1	P						0,11
BDL168	9882,1	Av						1,39
BDL168	9882,3	P						0,18
BDL168	9882,3	Av		-				1,32
BDL169	10744,2	P	0,57
BDL169	10744,2	Av	1,16
BDL169	10747,1	P	0,46
BDL169	10747,1	Av	1,11
BDL169	10747,5	P	0,28
BDL169	10747,5	Av	1,16
BDL171	10661,2	P	0,7
BDL171	10661,2	Av	1,23
BDL171	10664,1	P	0,6
BDL171	10664,1	Av	1,39
BDL173	9951,2	P	0,66
BDL173	9951,2	Av	1,13
BDL173	9952,1	P				0,21	0,12
BDL173	9952,1	Av				1,23	1,14
BDL173	9952,2	P		0,14		0,64	0,34		0,04
BDL173	9952,2	Av		1,1		1,15	1,11		1,04
BDL173	9953,4	P		0,58		<0,01	0,47	0,06
BDL173	9953,4	Av		1,13		1,41	1,1	1,1
BDL173	9954,2	P		0,12	0,05	0,22
BDL173 - -	9954,2 .	,Av L.	- - --	1,17- - -	1,08 - -	1-,1- .
BDL173	9954,5	P		<0,01	0,04 ''	0,57			0,07
BDL173	9954,5	Av		1,21	1,09	1,13			1,03
BDL176	9891,2	P		0,01	<0,01	0,31	0,01		<0,01
BDL176	9891,2	Av		1,17	1,06	1,22	1,14		1,06
BDL176 ..	9891,4	P		<0,01	0,05
BDL176	9891,4	Av ’	‘ -	1,23 · -	1,11 . =	.
BDL176	9892,3	P		<0,01 .	<0,01 .			---	‘0,09 * ’
BDL176	9892,3-------	Av	_	1,34	1,17				1,03
BDL176	9893,2	P		0,08	0,16	0,25-----		—- -—-—
BDL176	9893,2	Av		1,23	1,15	1,13
BDL176	9893,3	P		<0,01		0,01	0,12
BDL176	9893,3	Av		1,2		1,36	1,22
BDL177	10521,3	P	0,03
BDL177	10521,3	Av	1,43
BDL177	10524,2	P	0,22
BDL177	10524,2	Av	1,28
BDL183	9941,1	P					0,58
BDL183	9941,1	Av					1,1
BDL183	9942,1	P					0,08
BDL183	9942,1	Av					1,11
BDL183	9943,4	P				<0,01
BDL183	9943,4	Av				1,25
BDL183	9944,2	P						0,29
BDL183	9944,2	Av						1,24
BDL190	10232,2	P		0,27		0,54
BDL190	10232,2	Av		1,14		1,13
BDL190	10233,2	P		0,38					0,03
BDL190	10233,2	Av		1,13					1,04
BDL190	10233,4	P		0,03		<0,01	0,05
BDL190	10233,4	Av		1,13		1,34	1,12
BDL190	10234,1	P		0,21	0,03	0,53
BDL190	10234,1	Av		1,16	1,03	1,19
BDL190	10231,1	P				0,07	0,07	0,01
BDL190	10231,1	Av				1,06	1,09	1,15
BDL190	10231,2	P						0,33

211/218

Continuação da Tabela 27
BDL190	10231,2	Av						1,4
BDL190	10232,2	P				0,04
BDL190	10232,2	Av				1,08
BDL190	10233,2	P						0,25
BDL190	10233,2	Av						1,25
BDL192	9921,1' -	p -		0,22	0,11 .				0,07
BDL192	9921,1	Av		1,18	1,1				i;03
BDL192	9922,1	P		0,01	0,04
BDL192	9922,1	Av		1,15	1,06
BDL192	9922,2	P		0,02	0,04			<0,01
BDL192	9922,2	Av		1,21	1,09			1,12
BDL192	9922,5	P				0,68
BDL192	9922,5	Av				1,1
BDL193	10152,2	P							0,08
BDL193	10152,2	Av							1,04
BDL196	10243,2	P						0,01
BDL196	10243,2	Av						1,14
BDL201	9963,6	P	0,15
BDL201	9963,6	Av	1,28
BDL201	9964,3	P	0,15
BDL201	9964,3	Av	1,36
BDL220	10333,5	P	0,35
BDL220	10333,5	Av	1,19
BDL223	10793,5	P	0,05
BDL223	10793,5	Av	1,15
BDL224 -	=10451,8.	P “	0;02----	- - -	- — — _	__ —
BDL224	10451,8	Av	1,5	---	— =— -^=-- =.	- — -		—= - -
BDL225	10401,1	P	0,08
BDL225	10401,1	Av	1,32
BDL225	10401,4	P	0,01
BDL225	10401,4	Av	1,52
BDL225	10402,2 '	P '	0,03 -	= . _
BDL225	10402,2	Av	1,43
BDt225-----	-10402 5	P	-0,26
BDL225	10402,5	Av	1,39
BDL225	10402,6	P	.0,08
BDL225	10402,6	Av	1,57
BDL225	10402,9	P	0,12
BDL225	10402,9	Av	1,36
BDL226	10861,2	P	0,35
BDL226	10861,2	Av	1,1
BOL227	11492,3	P	0,05
BDL227	11492,3	Av	1,15
BDL233	10825,4	P	0,53
BDL233	10825,4	Av	1,13
BDL238	10954,2	P	<0,01
BDL238	10954,2	Av	1,34
BDL240	10802,2	P	0,23
BDL240	10802,2	Av	1,3
BDL241	10873,1	P	0,07
BDL241	10873,1	Av	1,29
BDL242	10731,2	P	0,62
BDL242	10731,2	Av	1,1
BDL242	10731,6	P	0,04
BDL242	10731,6	Av	1,21
BDL250	10846,3	P	0,53
BDL250	10846,3	Av	1,15
BDL48	10271,1	P	0,2
BDL48	10271,1	Av	1,23
BDL48	10271,3	P	0,08
BDL48	10271,3	Av	1,48

212/218

Continuação da Tabela 27
BDL48	10273,2	P	0,58
BDL48	10273,2	Av	1,12
BDL48	10274,4	P	0,01
BDL48 .	10274,4	Av	1,95
BDL48	10271,3	P		0,01	0,01
BDL48	10271,3	Av		1,12	1,1
BDL48	10271,5	P		0,06	0,1
BDL48	10271,5	Av		1,06	1,05
BDL48	10274,3	P						<0,01
BDL48	10274,3	Av						1,44
BDL48	10274,4	P						0,08
BDL48	10274,4	Av						1,05
BDL58	10282,3	P	0,63
BDL58	10282,3	Av	1,19
BDL63	10384,3	P	0,26
BDL63	10384,3	Av	1,27
BDL63	10381,1	P				<0,01	0,06
BDL63	10381,1	Av				1,26	1,08
BDL63	10381,2	P				0,56
BDL63	10381,2	Av				1,14
BDL63	10384,2	P				<0,01	0,04
BDL63	10384,2	Av				1,27	1,08
BDL63	10384,3	P		0,01	0,02	0,3			0,01
- BDL63	10.384,3	Av		1,12	1,09	1,15			1,04
-BDL63---	-10384,7- ·.	P- .	.	0,05 - ~	0,06 - -	0,08 - -
BDL63	10384,7	Av		1,07	1,07 - -	1,15 -	- — - —.	- - _ ·.
BDL63	10384,8	P				0,51
BDL63	10384,8	Av				1,13
BDL81	10371,5	P		<0,01	0,01	<0,01		0,23	0,04
BDL81 ..	.10371,5	Av		1,13	1,1	1,15		1,14	1,02
BDL81	10371,8	P		-- -	- - - -	0,03
BDL81	10371,8	Av				1,08
BDL81	10372/1------	-p----	---.	-<0,01	0,01
BDL81	10372,1	Av		1,17	1,1				---------
BDL81	10372,2	P		0,22	0,1	0,59
BDL81	10372,2	Av		1,11	1,11	1,14
BDL81	10373,2	P		0,05
BDL81	10373,2	Av		1,07
BDL81	10374,1	P				0,05
BDL81	10374,1	Av				1,2
BDL85	10411,1	P	0,1
BDL85	10411,1	Av	1,21

Tabela 27. Resultados dos experimentos de estufa. São fornecidos os valores medidos de cada parâmetro [parâmetros (Par.) 31-37 de acordo com os parâmetros descritos na Tabela 23 acima] em plantas expressando os polinucleotídeos indicados. Ev = evento =, P = valor de P; AV = relação entre as médias do evento e controle. Observe que quando a proporção média é superior a 1 o efeito d a expressão do gene exógeno é um aumento da característica

213/218 desej ada;

EXEMPLO 10

PRODUÇÃO DE TOMATE TRANSCRIPTOM E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DA ALTA TAXA DE TRANSFERÊNCIA DE RENDIMENTO E/OU VIGOR 5 PARÂMETROS RELACIONADOS COM TOMATE 44K OLIGONUCLEOTÍDEO DE

MICRO-ARRANJO: EXPERIÊNCIAS DE CAMPO DE TOMATE

A fim de produzir uma análise de correlação da alta taxa de transferência, os inventores presentes utilizaram um oligonucleotídeo de micro-arranjo de 10 tomate, produzido pela Agilent Technologies [Hypertext

Transfer Protocol:// World Wide Web chem (ponto). (ponto) ·—- com (ponto) Agilent/Scripts/ASP PDS (ponto)? lPage = 50879],

O oligonucleotídeo arranjado representa cerca7 ' de’^-’44T000” genes de tomate e transcrições. A fim de definir as 15 correlações entre òs níveis- 'de - expressão, do RNA com os componentes dõ rendimento^—A-B-ST—ou—parâmetros relacionados com o vigor das plantas de características de 18 variedades diferentes de tomate foram analisados. Entre eles, 10 variedades que englobam a variação observada foi selecionada 20 para a análise da expressão do RNA. A correlação entre os níveis do RNA e os parâmetros caracterizados em experimentos de campo foi analisada por meio do teste de correlação de Pearson [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web davidmlane (ponto) (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) 25 html] .

Procedimentos Experimentais

Processo de crescimento em experimentos de campo de tomate Variedades foram cultivadas sob condições normais (4-6

214/218 litros/m² por dia) até o estágio da flor.

Extração de RNA - Folhas em diferentes estágios de desenvolvimento, representando características diferentes da planta, foram amostrados e RNA 5 foi extraído utilizando reagente Trizol da Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) invitrogen com (ponto)/conteúdo (ponto) cfm pageid = 469 ] .

Cerca de 30-50 mg de tecido foi tomado a partir de amostras. Os tecidos pesados foram 10 moídos utilizando almofariz e pilão em nitrogênio líquido e ressuspendido em 500μ1 de reagente TRIzol. Para o lisado _ _ _ _homogeneizado, ΙΟΟμΙ de clorofórmio foi adicionado seguido de precipitação com ísop’fõp'anol duas —lavagens/. com _ etanol

75%. O RNA foi eluído em 30μ1 de água livre de RNase.

Amostras de RNA foram, limpas utilizando o minikit de limpeza ------da--Qiagen. RNase, conforme o protocolo do fabricante (QIAGEN Inc, CA EUA).

Peso médio dos frutos maduros (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelho)], todos os frutos das parcelas dentro dos blocos A-C foram recolhidos. O total de frutos foi contado e pesado. O peso médio dos frutos foi calculado pela divisão do peso total do fruto pelo número de frutos. Resultados Experimentais

10 diferentes variedades de tomate foram cultivadas e caracterizadas para o peso médio dos frutos maduros (gramas), conforme descrito acima e os parâmetros medidos [peso médio de frutos maduros (gr.) com

215/218

Irrigação Normal] é apresentado na Tabela 28 abaixo.

Tabela 28

Parâmetros medidos em amostras de tomates

Variedade	.. Irrigação.Normal; Peso Médio dos Frutos Maduros (gr.)
612	0,05
613	0,01
617	0,01
618	0,05
622	0,01
623	0,01
626	0,03
629	0,00
630	0,00
631	0,01

Tabela 28: É fornecida a medida dos componentes do rendimento (peso médio de frutos maduros sob irrigação normal) para as amostras de tomate (Variedades) .

.. Após análise de correlação entre o conjunto~dè 'folhas 'transcriptom Gene.BDL83_H74 (SEQ ID N°: 282) e o peso médio dos frutos maduros, em condições normais de irrigação^ foi realizado e o coeficiente de ---correlação (R) foi encontrado para ser 0,73 4.

EXEMPLO 11

PRODUÇÃO DE TOMATE TRANSCRIPTOM E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA TRANSFERÊNCIA DE PARÂMETROS DE VIGOR RELACIONADOS COM

TOMATE 44K OLIGONUCLEOTÍDEO MICROARRANJADO

Procedimentos Experimentais

Condições de crescimento para os experimentos de tomate

Correlação das características vigor precoce por meio de recolha de Ecótipos de Tomate 20 Dez variedades de tomate foram cultivadas em três parcelas repetitivas, cada uma contendo 17 unidades, na casa de um líquido em condições semi-hidropônicas. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: Sementes de tomate

216/218 foram semeadas em bandejas plásticas com uma mistura de vermiculita e turfa na proporção de 1:1. Após a germinação, as bandejas, foram transferidas para a solução de crescimento normal [completo de Hogland; KNO₃ - 0,808 gramas/litro,

MgSO₄ - 0,12 gramas/litro, KH2 PO₄ - 0,172 gramas/litro e

0,01% (volume/volume) dos micro elementos 'Super coratin' (ferro-EDDHA [etilenodiamino-N, Ν'-bis (ácido 2hidroxifenilacético) ] - 40,5 gramas/litro, Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro, e 10 Mo 1,1 gramas/litro), pH da solução deve ser 6,5-6,81, a uma temperatura de 20-24°C.

___ Extração de RNA - Todas as 10 variedades de tomates foram selecionadas da amostra. As folhas da planta em condições normais, foram amostrados e 15 RNA foi extraído utilizando, reagente Trizol da Invitrogen [Hypertext--Tr-aasfer__Protocol://World Wide Web (ponto) invitrogen com (ponto)/conteúdo cfm (ponto) pageid = 469] .

Parâmetros de vigor relacionado de tomate apos cinco semanas de crescimento, as plantas foram colhidas e analisadas para número de folhas.

Os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados com o software de análise estatística

JMP (SAS Institute).

Resultados Experimentais

10 diferentes variedades de tomate foram cultivadas e caracterizados para o número de folhas, como descrito acima. O número médio de folhas foi calculado utilizando o software JMP e os valores estão

217/218 resumidos na Tabela 29 abaixo.

Tabela 29

Parâmetros medidos amostras de tomate

Variedade	- Número de Folhas
1139	6,56
2078	6,89
2958	7,33
5077	6,22
5080	6,33
5084	6,44
5085	5,89
5088	5,56
5089	6,11
5092	5,67

Tabela 29. É fornecido o parâmetro de vigor medido relacionado (número de folhas) para as amostras de tomate

	(Variedade). ---- _____ Após análise de - correlação entre o conjunto de genes da folha transcriptom BDL83 H73 (SEQ ID N° : 2 81) com o número médio de folhas foi realizada,
10	o coeficienüe~de~correlação_CR) foi de -0,794. Os genes identificados neste melhoram a produtividade das plantas em geral, e mais especificamente a produção de óleo, produção de sementes, teor de óleo, a taxa de crescimento das plantas, biomassa da
15	planta, medidas de raiz, e vigor das plantas. A saída do método de bioinformática aqui descrito é um conjunto de genes altamente previstos para melhorar a produtividade (produção de sementes, produção de óleo e de conteúdo, biomassa) e/ou outros rendimentos agronômicos importantes,
20	modificando a sua expressão. Apesar de cada gene ser previsto para ter seus próprios efeitos, modificando o modo de expressão de mais de um gene é esperado para proporcionar

218/218 um efeito aditivo ou sinérgico sobre o rendimento de planta, taxa de crescimento da planta, medidas de raiz, vigor da planta e/ou desempenho de outros importantes rendimentos agronômicos. Alterando a expressão de cada gene descrito aqui sozinho ou conjunto de genes em conjunto aumenta a produtividade geral a taxa de crescimento da planta, medidas de raiz, o vigor da planta e/ou

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com concretizações específicas do 10 mesmo, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para aqueles hábeis na arte. Assim, pretende-se reunir todas essas alternativas, modificações e variações que se’ enquadrem -no -espírito e amplo alcance das reivindicações anexado.

” Todas as publicações, patentes e pedidos de—patentes_mencionadas nesta espe cificação são aqui incorporadas na sua totalidade por referência a especificação, na mesma medida, como se cada indivíduo da publicação de patentes, ou pedido de patente for específica e individualmente indicada para ser incorporadas por referência. Além disso, a citação ou a identificação de qualquer referência a este pedido não deve ser interpretado como uma admissão de que tal referência como arte antes da presente invenção. Na medida em que títulos de seção são 25 utilizados, não devem ser entendidas como necessariamente limitante.

Claims (7)

1. MÉTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO, A BIOMASSA, A TAXA DE CRESCIMENTO, O VIGOR, O TEOR DE ÓLEO, E/OU A EFICIÊNCIA DA UTILIZAÇÃO DO NITROGÊNIO DE UMA PLANTA, caracterizado pelo fato de compreender (a) transformar uma célula vegetal com um polinucleotídeo exógeno tendo a sequência de ácido nucleico das SEQ ID NOs: 868, 27 ou 311 estando operacionalmente ligada a um promotor para direcionar a expressão da referida sequência de ácido nucleico na referida célula vegetal, e (b) gerar uma planta madura a partir da referida célula vegetal transformada com a referida sequência de ácido nucleico, aumentando assim o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, o vigor, teor de óleo e/ou a eficiência da utilização do nitrogênio da planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido aumento de rendimento, biomassa e/ou taxa de crescimento de uma planta está sob condições de não-estresse.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda selecionar a referida planta madura para um rendimento biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo e/ou eficiência de uso de nitrogênio aumentados em comparação com uma planta não transformada nas mesmas condições de crescimento.

Petição 870190006437, de 21/01/2019, pág. 20/24

2 / 2

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida seleção é para referido aumento de rendimento, biomassa, e/ou taxa de crescimento sob condições não estressantes.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é heterólogo à referida célula vegetal.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor específico de tecido.