ES2773985T3 - Polinucleótidos y polipéptidos aislados, y métodos para usar los mismos para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, y/o tolerancia al estrés abiótico - Google Patents

Abstract

Un método para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa en condiciones limitantes de nitrógeno, y/o tasa de crecimiento de una planta que comprende: (a) expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos un 80% idéntico sobre la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEQ ID NO: 563, y (b) que comprende además crecer la planta que expresa dicho polinucleótido exógeno en condiciones limitantes de nitrógeno, incrementando de esta manera la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa en condiciones limitantes de nitrógeno, y/o tasa de crecimiento de la planta.

Description

DESCRIPCIÓN

Polinucleótidos y polipéptidos aislados, y métodos para usar los mismos para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, y/o tolerancia al estrés abiótico

Campo y antecedentes de la invención

La presente descripción se refiere a nuevos polinucleótidos y polipéptidos que pueden incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento (p. ej., rendimiento semilla/grano, rendimiento de aceite), tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de las fibras, calidad y/o longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta.

Una estrategia común para promover el crecimiento de las plantas ha sido, y continúa siendo, el uso de nutrientes naturales, así como sintéticos (fertilizantes). Así, los fertilizantes son el combustible que está detrás de la "revolución verde", responsable directamente del incremento excepcional de los rendimientos de los cultivos durante los últimos 40 años, y se considera que son el gasto general más importante en la agricultura. De los tres macronutrientes proporcionados como fertilizantes principales [Nitrógeno (N), Fosfato (P) y Potasio (K)], el nitrógeno es frecuentemente el elemento limitante en el crecimiento de las plantas y todos los cultivos de campo tienen una dependencia fundamental de fertilizante nitrogenado inorgánico. Habitualmente, es necesario reponer el nitrógeno cada año, particularmente para los cereales, que comprenden más de la mitad de las áreas cultivadas en todo el mundo. Por ejemplo, los fertilizantes nitrogenados inorgánicos, tales como nitrato de amonio, nitrato de potasio, o urea, representan típicamente el 40% de los costes asociados con cultivos tales como maíz y trigo.

El nitrógeno es un macronutriente esencial para la planta, responsable de la biosíntesis de aminoácidos y ácidos nucleicos, grupos prostéticos, hormonas de las plantas, defensas químicas de las plantas, etc. Además, el nitrógeno es frecuentemente el elemento limitante en el crecimiento de las plantas y todos los cultivos de campo tienen una dependencia fundamental de nitrógeno inorgánico. Así, el nitrógeno se transloca al brote, donde se almacena en las hojas y pedúnculo durante la etapa rápida del desarrollo de la planta y hasta la floración. En el maíz, por ejemplo, las plantas acumulan la mayor parte de su nitrógeno orgánico durante el periodo de la germinación de los granos, y hasta la floración. Una vez se ha producido la fertilización de la planta, los granos empiezan a formarse y se convierten en el sumidero principal del nitrógeno de la planta. El nitrógeno almacenado puede redistribuirse entonces desde las hojas y pedúnculo que sirvieron como compartimentos de almacenamiento hasta la formación de los granos.

Como el fertilizante se depleciona rápidamente de la mayor parte de los tipos de suelos, debe suministrarse a los cultivos en crecimiento dos o tres veces durante la temporada de crecimiento. Además, la baja eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE) de los cultivos principales (p. ej., en el rango de solo el 30-70%) afecta de forma negativa los gastos aportados para el agricultor, debido al exceso de fertilizante aplicado. Además, el uso excesivo e ineficiente de los fertilizantes son factores principales responsables de los problemas medioambientales, tales como eutrofización del agua subterránea, lagos, ríos y mares, contaminación por nitrato del agua potable que puede causar metahemoglobinemia, contaminación por fosfato, contaminación atmosférica y semejantes. Sin embargo, a pesar del impacto negativo de los fertilizantes en el medioambiente, y de los límites en el uso de fertilizante, que se ha legislado en varios países, se espera que el uso de los fertilizantes se incremente con el fin de soportar la producción de alimento y fibra para el rápido crecimiento de la población con recursos terrestres limitados. Por ejemplo, se ha estimado que sobre el 2050, anualmente, se usarán más de 150 millones de toneladas de fertilizante nitrogenado.

La eficiencia incrementada en el uso del nitrógeno por las plantas debería permitir el cultivo de cultivos con una menor aportación de fertilizante, o, alternativamente, el cultivo en suelos con peor calidad y, por lo tanto, tendría un impacto económico significativo tanto en sistemas agrícolas desarrollados como en desarrollo.

La mejora genética de la eficiencia en el uso de fertilizantes (FUE) en plantas puede generarse bien mediante fitomejoramiento tradicional o mediante ingeniería genética.

Los intentos de generar plantas con una FUE incrementada se han descrito en la Solic. de Pat. de EE.UU. No.

20020046419 de Choo, et al.; Solic. de Pat. de EE.UU. No. 2005010879 de Edgerton et al.; Solic. de Pat. de EE.UU. No. 20060179511 de Chomet et al.; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); y Good AG et al. 2004 (Trends Plant Sci. 9:597-605).

Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004 101:7833-8) describen plantas transgénicas para Dof1 que presentan un crecimiento mejorado en condiciones de nivel bajo de nitrógeno.

La Patente de EE.UU. No. 6.084.153 de Good et al. describe el uso de un promotor que responde al estrés para controlar la expresión de la Alanina Amino Transferasa (AlaAT) y plantas de canola transgénicas con una tolerancia mejorada frente a la sequía y la deficiencia de nitrógeno cuando se comparan con plantas control.

La cada vez más creciente población mundial y la disponibilidad decreciente de tierra arable para la agricultura afecta el rendimiento de las plantas y de los productos relacionados con las plantas. La escasez global de suministros de agua, la desertificación, las condiciones de estrés abiótico (ABS) (p. ej., salinidad, sequía, inundaciones, temperatura subóptima y contaminación por productos químicos tóxicos), y/o las fuentes limitadas de nitrógeno y fertilizante, causan un daño sustancial a las plantas agrícolas, tales como alteraciones importantes en el metabolismo de la planta, muerte celular, y disminuciones en el crecimiento de las plantas y productividad de los cultivos.

La sequía es un fenómeno gradual, que implica periodos de clima anormalmente seco que persisten durante un tiempo suficiente como para producir desequilibrios hidrológicos graves, tales como daño en los cultivos, escasez en el suministro de agua y susceptibilidad incrementada a varias enfermedades.

La salinidad, altos niveles de sal, afecta a una de cinco hectáreas de tierra irrigada. Ninguno de los cinco cultivos alimentarios más importantes, es decir, trigo, maíz, arroz, patatas, y soja, pueden tolerar un nivel excesivo de sal. Los efectos perjudiciales de la sal en las plantas provienen tanto de un déficit de agua, que da lugar a estrés osmótico (similar al estrés por sequía), como del efecto del exceso de iones sodio en procesos bioquímicos críticos. Como con la congelación y la sequía, un alto nivel de sal causa un déficit de agua; y la presencia de altos niveles de sal hace que sea más difícil para las raíces de las plantas extraer agua de su entorno. Así, la salinización de los suelos que se usan para la producción agrícola es un problema significativo y creciente en regiones que se basan firmemente en la agricultura, y se empeora por la utilización excesiva, fertilización excesiva y escasez de agua, típicamente causadas por el cambio climático y las demandas de la población creciente.

Las temperaturas subóptimas afectan al crecimiento y desarrollo de las plantas a través del ciclo de vida de la planta completa. Así, las temperaturas bajas reducen la tasa de germinación y las temperaturas altas dan lugar a la necrosis de las hojas. Además, las plantas maduras que están expuestas a un exceso de calor pueden experimentar un choque de calor, que puede producirse en varios órganos, incluyendo hojas y particularmente frutos, cuando la transpiración es insuficiente para superar el estrés por calor. El calor también daña las estructuras celulares, incluyendo orgánulos y citoesqueleto, y altera la función de la membrana. El choque por calor puede producir una disminución de la síntesis global de proteínas, acompañada de la expresión de proteínas de choque térmico, p. ej., chaperonas, que están implicadas en el replegamiento de proteínas desnaturalizadas por el calor. El daño al polen por la alta temperatura ocurre casi siempre conjuntamente con el estrés por sequía, y ocurre raramente en condiciones de buen nivel de agua. El estrés combinado puede alterar el metabolismo de la planta de nuevas maneras. Las condiciones de enfriamiento excesivo, p. ej., las temperaturas bajas, pero por encima de la congelación, afectan a los cultivos de orígenes tropicales, tales como soja, arroz, maíz, y algodón. El daño típico por enfriamiento incluye marchitamiento, necrosis, clorosis o pérdida de iones de las membranas celulares. Las condiciones de luz excesiva, que ocurren en condiciones atmosféricas claras posteriores a noches frías de verano/otoño tardío, pueden dar lugar a la fotoinhibición de la fotosíntesis (disrupción de la fotosíntesis). Además, el enfriamiento puede dar lugar a pérdidas en el rendimiento y a una menor calidad del producto a través de la maduración retrasada del maíz.

Las deficiencias de nutrientes causan adaptaciones de la arquitectura de la raíz, particularmente notablemente, por ejemplo, es la proliferación de la raíz en zonas ricas en nutrientes para incrementar la captación de nutrientes. Las deficiencias de nutrientes también causan la activación de rutas metabólicas de las plantas que maximizan los procesos de absorción, asimilación y distribución, tales como mediante la activación de cambios en la arquitectura. La modificación por ingeniería de la expresión de los genes diana puede hacer que la planta presente los cambios en la arquitectura y aumente el metabolismo también bajo otras condiciones.

Además, es ampliamente conocido que las plantas responden habitualmente a la deficiencia de agua creando un sistema de raíces más profundo que permite el acceso a la humedad localizada en capas más profundas del suelo. El desencadenamiento de este efecto permitirá a las plantas acceder a nutrientes y agua localizados en horizontes más profundos del suelo, particularmente aquellos ya disueltos en agua como los nitratos.

El rendimiento se ve afectado por varios factores, tales como, el número y tamaño de los órganos de la planta, la arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), longitud establecida de los granos, número de granos llenos, vigor (p. ej., plántula), tasa de crecimiento, desarrollo de las raíces, utilización de agua, nutrientes (p. ej., nitrógeno) y fertilizantes, y tolerancia al estrés.

Los cultivos tales como, maíz, arroz, trigo, canola y soja representan más de la mitad de la ingesta calórica humana total, ya sea a través del consumo directo de las semillas en sí mismas o a través del consumo de productos cárnicos producidos a partir de semillas procesadas o forraje. Las semillas también son una fuente de azúcares, proteínas y aceites y metabolitos usados en procesos industriales. La capacidad de incrementar el rendimiento de las plantas, ya sea a través del incremento de la tasa de acumulación de materia seca, modificación de la composición de celulosa o lignina, incremento de la fuerza del tallo, aumento del tamaño del meristemo, cambio en el patrón de ramificación de las plantas, erectilidad de las hojas, incremento en la eficiencia de la fertilización, tasa de acumulación de materia seca en las semillas aumentada, modificación del desarrollo de las semillas, llenado de las semillas aumentado o mediante el incremento del contenido de aceite, almidón o proteína en las semillas tendría muchas aplicaciones en usos agrícolas y no agrícolas, tales como en la producción biotecnológica de productos farmacéuticos, anticuerpos o vacunas.

Los estudios han mostrado que las adaptaciones de las plantas a condiciones ambientales adversas son rasgos genéticos complejos de naturaleza poligénica. Los medios convencionales para las mejoras de cultivos y hortícolas utilizan técnicas de fitomejoramiento selectivo para identificar las plantas que tienen las características deseables. Sin embargo, el fitomejoramiento selectivo es tedioso, largo y tiene un resultado impredecible. Además, los recursos limitados de plasma germinal para la mejora del rendimiento y la incompatibilidad de los cruces entre especies de plantas relacionadas de forma distante representan problemas significativos que se encuentran en el fitomejoramiento convencional. Los avances en la ingeniería genética han permitido que los hombres modifiquen el plasma germinal de las plantas mediante la expresión de genes de interés en las plantas. Dicha tecnología tiene la capacidad de generar cultivos o plantas con rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados.

La publicación WO No. 2009/013750 describe genes, construcciones y métodos para incrementar la tolerancia al estrés abiótico, biomasa y/o rendimiento en plantas generadas mediante ellos.

La publicación WO No. 2008/122980 describe genes construcciones y métodos para incrementar el contenido de aceite, tasa de crecimiento y biomasa de las plantas.

La publicación WO No. 2008/075364 describe polinucleótidos implicados en el desarrollo de las fibras de las plantas y métodos para usar los mismos.

La publicación WO No. 2007/049275 describe polipéptidos aislados, polinucleótidos que codifican los mismos, plantas transgénicas que expresan los mismos y métodos para usar los mismos para incrementar la eficiencia en el uso de fertilizantes, tolerancia de las plantas al estrés abiótico y biomasa.

La publicación WO No. 2004/104162 describe métodos para incrementar la tolerancia al estrés abiótico y/o la biomasa en plantas y plantas generadas de esta manera.

La publicación WO No. 2005/121364 describe polinucleótidos y polipéptidos implicados en el desarrollo de la fibras de las plantas y métodos para usar los mismos para mejorar la calidad de las fibras, rendimiento y/o biomasa de una planta productora de fibras.

La publicación WO No. 2007/020638 describe métodos para incrementar la tolerancia al estrés abiótico y/o biomasa en plantas y plantas generadas de esta manera.

La publicación WO No. 2009/083958 describe métodos para incrementar la eficiencia en el uso del agua, eficiencia en el uso de fertilizantes, tolerancia al estrés biótico/abiótico, rendimiento y biomasa en plantas y plantas generadas de esta manera.

La publicación WO No. 2010/020941 describe métodos para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, tolerancia al estrés abiótico, rendimiento y biomasa en plantas y plantas generadas de esta manera.

La publicación WO No. 2009/141824 describe polinucleótidos aislados y métodos que usan los mismos para incrementar la utilidad de las plantas.

Sumario la invención

Según un aspecto de la descripción, se proporciona un método para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, y/o tolerancia al estrés abiótico de una planta, que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 1-467, 785-3046 o 3047, incrementando de esta manera la eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, y/o tolerancia al estrés abiótico de la planta.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa, tasa de crecimiento de una planta, que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende la secuencia de ácido nucleico que consiste en las SEQ ID NO:352, 96 y 235, incrementando de esta manera la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa, tasa de crecimiento de la planta. Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa, tasa de crecimiento de una planta, que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos un 80% idéntico a la SEQ ID NO: 563, incrementando de esta manera la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa, tasa de crecimiento de la planta.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa, tasa de crecimiento de una planta, que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 352, 96 y 235, incrementando de esta manera la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa, tasa de crecimiento de la planta.

Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 80% idéntica a las SEQ ID NO: 1-467, 785-3046 o 3047, en donde la secuencia de ácido nucleico es capaz para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, y/o tolerancia al estrés abiótico de una planta.

Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-467, y 785-3047.

Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 468-784, 3048-4333, 4335-4681 o 4682, en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, y/o tolerancia al estrés abiótico de la planta.

Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 468-784, 3048-4333, 4335-4682 y 4334.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se usa una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido aislado de algunas realizaciones de la invención y un promotor para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped.

Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% homóloga a la SEQ ID NO: 468-784, 3048-4333, 4335-4681 o 4682, en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, y/o tolerancia al estrés abiótico de una planta.

Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 468-784, 3048-4333, y 4335-4682.

Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona una célula de planta que expresa exógenamente el polinucleótido de algunas realizaciones de la invención, o la construcción de ácido nucleico de algunas realizaciones de la invención.

Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona una célula de planta que expresa exógenamente el polipéptido de algunas realizaciones de la invención.

Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia de ácido nucleico es como se muestra en la SEQ ID NO: 352, 96 o 235.

Según algunos aspectos de la descripción, el polinucleótido consiste en la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-467, y 785-3047.

Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos al menos un 80% homóloga a la SEQ ID NO: 563.

Según algunos aspectos de la descripción, la secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 468-784, 3048-4333, y 4335-4682.

Según algunas realizaciones de la invención, la célula de planta forma parte de una planta.

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además crecer la planta que expresa el polinucleótido exógeno en estrés abiótico.

A no ser que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y/o científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de realizaciones de la invención, a continuación, se describen métodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de la patente, incluyendo definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean necesariamente limitantes.

Descripción breve de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en la presente memoria, solo como ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Ahora con referencia específica a los dibujos en detalle, se enfatiza que las particularidades mostradas son como ejemplo y para los propósitos de la discusión ilustrativa de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos, pone de manifiesto para los expertos en la técnica cómo pueden llevarse a la práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

La Figura 1 es una ilustración esquemática del plásmido binario pGI modificado que contiene el nuevo promotor At6669 (SEQ ID NO: 4687) y el GUSintrón (pQYN_6669) usados para expresar las secuencias del polinucleótido aislado de la invención. RB - T-ADN límite derecho; LB - T-ADN límite izquierdo; MCS - Sitio de clonación múltiple; RE - cualquier enzima de restricción; NOS pro= promotor de la nopalina sintasa; NPT-II= gen de la neomicina fosfotransferasa; NOS ter= terminador de la nopalina sintasa; señal poli-A (señal de poliadenilación); GUSintrón - el gen informador GUS (secuencia codificadora e intrón). Las secuencias del polinucleótido aislado de la invención se clonaron en el vector mientras se reemplazaba el gen informador GUSintrón.

La Figura 2 es una ilustración esquemática del plásmido binario pGI modificado que contiene el nuevo promotor At6669 (SEQ ID NO: 4687) (pQFN) usado para expresar las secuencias del polinucleótido aislado de la invención. RB - T-ADN límite derecho; LB - T-ADN límite izquierdo; MCS - Sitio de clonación múltiple; RE - cualquier enzima de restricción; NOS pro= promotor de la nopalina sintasa; NPT-II= gen de la neomicina fosfotransferasa; NOS ter= terminador de la nopalina sintasa; Señal poli-A (señal de poliadenilación); GUSintrón - el gen informador GUS (secuencia codificadora e intrón). Las secuencias del polinucleótido aislado de la invención se clonaron en el MCS del vector.

Las Figura 3A-F son imágenes que representan la visualización del desarrollo de la raíz de plantas transgénicas que expresan exógenamente el polinucleótido de algunas realizaciones de la invención cuando se crecen en placas de agar transparentes en condiciones normales (Figuras 3A-B), de estrés osmótico (PEG al 15%; Figuras 3C-D) o con nitrógeno limitante (Figuras 3E-F). Los diferentes transgenes se crecieron en placas de agar transparentes durante 17 días (7 días en vivero y 10 días después del trasplante). Las placas se fotografiaron cada 3-4 días empezando en el día 1 después del trasplante. Figura 3A - Una imagen de una fotografía de plantas tomada después de 10 días después del trasplante en placas de agar cuando se crecieron en condiciones normales (estándar). Figura 3B - Una imagen del análisis de raíces de las plantas mostradas en la Figura 3A en la que se representan con flechas las longitudes de las raíces medidas. Figura 3C - Una imagen de una fotografía de plantas tomada después de 10 días después del trasplante en placas de agar, crecidas en condiciones altamente osmóticas (PEG AL 15%). Figura 3D - Una imagen del análisis de raíces de las plantas mostradas en la Figura 3C en la que se representan con flechas las longitudes de las raíces medidas. Figura 3E - Una imagen de una fotografía de plantas tomada después de 10 días después del trasplante en placas de agar, crecidas en condiciones con bajo nivel de nitrógeno. Figura 3F - Una imagen del análisis de raíces de las plantas mostradas en la Figura 3E en la que se representan con flechas las longitudes de las raíces medidas.

La Figura 4 es una ilustración esquemática del plásmido binario pGI modificado que contiene el Promotor de Raíces (pQNa_RP) usado para expresar las secuencias del polinucleótido aislado de la invención. RB - T-ADN límite derecho; LB - T-ADN límite izquierdo; NOS pro= promotor de la nopalina sintasa; NPT-II= gen de la neomicina fosfotransferasa; NOS ter= terminador de la nopalina sintasa; Señal poli-A (señal de poliadenilación); Las secuencias del polinucleótido aislado según algunas realizaciones de la invención se clonaron en el MCS del vector.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente descripción se refiere a nuevos polinucleótidos y polipéptidos, construcciones de ácido nucleico que comprenden los mismos, células huésped que expresan los mismos, plantas transgénicas que expresan exógenamente los mismos y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos para usar los mismos para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta.

Antes de explicar al menos una realización de la invención con detalle, debe entenderse que la invención no está limitada necesariamente en su aplicación a los detalles mostrados en la siguiente descripción o ejemplificada por los Ejemplos. La invención es capaz de otras realizaciones o de ser llevada a la práctica o realizada de varias maneras.

Los presentes inventores han identificado nuevos polipéptidos y polinucleótidos que pueden usarse para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta.

Así, como se muestra en la sección de los Ejemplos que sigue, los presentes inventores han utilizado herramientas bioinformáticas para identificar polinucleótidos que aumentan la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento (p. ej., rendimiento de semillas, rendimiento de aceite), tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, desarrollo de las fibras (p. ej., rendimiento, calidad y/o longitud de las fibras), tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta. Los genes que afectan el rasgo de interés se identificaron sobre la base de los perfiles de expresión de genes de varios ecotipos y tejidos de Arabidopsis, Arroz, Sorgo, Cebada, Maíz y Tomate (Tablas 3-84; Ejemplos 3-16), homología con genes que se sabe que afectan el rasgo de interés y el uso de perfiles de expresión digitales en tejidos y condiciones específicos (Tabla 1, Ejemplo 1). También se identificaron polipéptidos y polinucleótidos homólogos que tienen la misma función (Tabla 2, Ejemplo 2). Conjuntamente, estos resultados sugieren el uso de los nuevos polinucleótidos y polipéptidos de la descripción para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento (p. ej., rendimiento de semillas, rendimiento de aceite), tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta.

Así, según un aspecto de la descripción, se proporciona un método para incrementar la eficiencia en el uso de fertilizantes, eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, y/o tolerancia al estrés abiótico de una planta, que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 1-467, 785-3046 o 3047, incrementando de esta manera la eficiencia en el uso de fertilizantes, eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, rendimiento de fibras, longitud de las fibras, calidad de las fibras, y/o tolerancia al estrés abiótico de la planta.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "eficiencia en el uso de fertilizantes" se refiere al o a los procesos metabólicos que dan lugar a un incremento en el rendimiento, biomasa, vigor, y tasa de crecimiento de la planta por unidad de fertilizante aplicada. El proceso metabólico puede ser la captación, diseminación, absorción, acumulación, relocalización (en la planta) y uso de uno o más de los minerales y restos orgánicos absorbidos por la planta, tales como nitrógeno, fosfatos y/o potasio.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "condiciones limitantes de fertilizante" se refiere a condiciones de crecimiento que incluyen un nivel (p. ej., concentración) de un fertilizante aplicado que está por debajo del nivel necesario para el metabolismo, crecimiento, reproducción y/o viabilidad normal de la planta.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE)" se refiere al o a los procesos metabólicos que dan lugar a un incremento en el rendimiento, biomasa, vigor, y tasa de crecimiento de la planta por unidad de nitrógeno aplicada. El proceso metabólico puede ser la captación, diseminación, absorción, acumulación, relocalización (en la planta) y uso del nitrógeno absorbido por la planta.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "condiciones limitantes de nitrógeno" se refiere a condiciones de crecimiento que incluyen un nivel (p. ej., concentración) de nitrógeno (p. ej., amonio o nitrato) aplicado que está por debajo del nivel necesario para el metabolismo, crecimiento, reproducción y/o viabilidad normal de la planta.

La NUE y FUE mejoradas de la planta se traduce en el campo bien en la recolección de cantidades similares de rendimiento, mientras se implementan menos fertilizantes, o rendimientos incrementados conseguidos al implementar los mismos niveles de fertilizantes. Así, una NUE o FUE mejorada tiene un efecto directo en el rendimiento de la planta en el campo. Así, los polinucleótidos y polipéptidos de algunas realizaciones de la invención afectan positivamente el rendimiento de la planta, rendimiento de las semillas, y biomasa de la planta. Además, el beneficio de una NUE mejorada de la planta mejorará ciertamente la calidad del cultivo y los constituyentes bioquímicos de la semilla, tales como rendimiento de proteínas y rendimiento de aceite.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "rendimiento de la planta" se refiere a la cantidad (p. ej., como se determina por peso o tamaño) o cantidad (número) de tejidos u órganos producidos por planta o por temporada de crecimiento. Por lo tanto, un rendimiento incrementado podría afectar al beneficio económico que se puede obtener de la planta en una determinada área de crecimiento y/o tiempo de crecimiento.

Debe indicarse que el rendimiento de una planta puede verse afectado por varios parámetros incluyendo, pero no limitado a, biomasa de la planta; vigor de la planta; tasa de crecimiento; rendimiento de las semillas; cantidad de semillas o granos; calidad de las semillas o granos; rendimiento de aceite; contenido de aceite, almidón y/o proteína en los órganos recolectados (p. ej., semillas o partes vegetativas de la planta); número de flores (flósculo) por panículo (expresado como una relación del número de semillas llenas sobre el número de panículos primarios); índice de recolección; número de plantas crecidas por área; número y tamaño de los órganos recolectados por planta y por área; número de plantas por área de crecimiento (densidad); número de órganos recolectados en el campo; área total de las hojas; asimilación de carbono y partición de carbono (la distribución/reparto del carbono en la planta); resistencia a la sombra; número de órganos que se pueden recolectar (p. ej., semillas), semillas por vaina, peso por semilla; y arquitectura modificada [tal como diámetro de tallo incrementado, grosor o mejora de las propiedades físicas (p. ej., elasticidad)].

El término "semilla" (también referido como "grano" o "corazón"), tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una planta embrionaria pequeña contenida en una cubierta denominada la cubierta de la semilla (habitualmente con algo de alimento almacenado), el producto del óvulo maduro de las plantas gimnospermas y angiospermas que se produce después de la fertilización y algo de crecimiento en la planta madre.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "rendimiento de las semillas" se refiere al número o peso de las semillas por planta, semillas por vaina, o por área de crecimiento o al peso de una única semilla, o al aceite extraído por semilla. Por lo tanto, el rendimiento de las semillas puede verse afectado por las dimensiones de las semillas (p. ej., longitud, anchura, perímetro, área y/o volumen), número de semillas (llenas) y tasa de llenado de las semillas y por el contenido de aceite de las semillas. Por lo tanto, un incremento en el rendimiento de las semillas por planta podría afectar el beneficio económico que puede obtenerse de la planta en una determinada área de crecimiento y/o tiempo de crecimiento; y un incremento en el rendimiento de las semillas por área de crecimiento podría conseguirse incrementando el rendimiento de las semillas por planta, y/o incrementando el número de plantas crecidas en la misma área dada.

La expresión "contenido de aceite", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad de lípidos en un órgano de la planta dado, bien las semillas (contenido de aceite de las semillas) o la parte vegetativa de la planta (contenido de aceite vegetativo) y se expresa típicamente como porcentaje de peso seco (10% de humedad de las semillas) o peso húmedo (para la parte vegetativa).

Debe indicarse que el contenido de aceite se ve afectado por la producción intrínseca de aceite de un tejido (p. ej., semilla, parte vegetativa), así como por la masa o tamaño del tejido productor de aceite por planta o por periodo de crecimiento.

El incremento en el contenido de aceite de la planta puede conseguirse incrementando el tamaño/masa del o de los tejidos de una planta, que comprenden aceite por periodo de crecimiento. Así, el contenido de aceite incrementado de una planta puede conseguirse incrementando el rendimiento, tasa de crecimiento, biomasa y vigor de la planta.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "biomasa de la planta" se refiere a la cantidad (p. ej., medida en gramos de tejido secado al aire) de un tejido producido de la planta en una temporada de crecimiento, que también podría determinar o afectar el rendimiento de la planta o el rendimiento por área de crecimiento. Un incremento en la biomasa de la planta puede ser en la planta completa o en partes de la misma, tales como partes aéreas (recolectables), biomasa vegetativa, raíces y semillas.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "tasa de crecimiento" se refiere al incremento en el tamaño de los órganos/tejidos de la planta por tiempo (puede medirse en cm2 por día).

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "vigor de la planta" se refiere a la cantidad (medida en peso) de tejido producido por la planta en un tiempo dado. Por lo tanto, un vigor incrementado podría determinar o afectar el rendimiento de la planta o el rendimiento por tiempo de crecimiento o área de crecimiento. Además, el vigor temprano (semilla y/o plántula) da lugar a una posición mejorada en el campo.

Debe indicarse que el rendimiento de una planta puede determinarse bajo estrés (p. ej., estrés abiótico, condiciones limitantes de nitrógeno) y/o condiciones no estresantes (normales).

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "condiciones no estresantes" se refiere a las condiciones de crecimiento (p. ej., agua, temperatura, ciclos de luz-oscuridad, humedad, concentración de sal, concentración de fertilizante en el suelo, suministro de nutrientes, tales como nitrógeno, fósforo y/o potasio), que no van más allá significativamente de las condiciones climáticas y otras abióticas diarias que pueden encontrarse las plantas, y que permiten el crecimiento, metabolismo, reproducción y/o viabilidad óptimos de una planta en cualquier estadio de su ciclo de vida (p. ej., en una planta cultivada desde la semilla a la planta madura y de nuevo a la semilla). Los expertos en la técnica son conscientes de las condiciones normales del suelo y las condiciones climáticas para una planta dada en una localización geográfica dada. Debe indicarse que, aunque las condiciones no estresantes pueden incluir algunas variaciones leves respecto a las condiciones óptimas (que varían de un tipo/especie de una planta a otro), dichas variaciones no producen un cese del crecimiento de la planta sin la capacidad de reiniciar el crecimiento.

La expresión "estrés abiótico'', tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier efecto adverso sobre el metabolismo, crecimiento, reproducción y/o viabilidad de una planta. Por consiguiente, el estrés abiótico puede inducirse por condiciones de crecimiento ambientales subóptimas, tales como, por ejemplo, salinidad, privación de agua, inundaciones, congelación, temperatura baja o alta, toxicidad por metales pesados, anaerobiosis, deficiencia de nutrientes, contaminación atmosférica o irradiación UV. Las implicaciones del estrés abiótico se discuten en la sección de Antecedentes.

La expresión "tolerancia al estrés abiótico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad de una planta para soportar un estrés abiótico sin padecer una alteración sustancial en el metabolismo, crecimiento, productividad y/o viabilidad.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "eficiencia en el uso del agua (WUE)", se refiere al nivel de materia orgánica producida por unidad de agua consumida por la planta, es decir, el peso seco de una planta en relación con el uso de agua por la planta, p. ej., la biomasa producida por unidad de transpiración.

Debe indicarse que una ABST mejorada conferirá a las plantas un vigor mejorado también bajo condiciones no estresantes, lo que da lugar a cultivos que tienen una biomasa y/o rendimiento mejorados, p. ej., fibras elongadas para la industria del algodón, mayor contenido de aceite.

El término "fibra" es habitualmente inclusivo de células conductoras con pared gruesa tales como vasos y traqueidas y agregados fibrilares de muchas células de fibra individuales. Por lo tanto, el término "fibra" se refiere a (a) células conductoras y no conductoras con pared gruesa del xilema; (b) fibras de origen extraxilario, incluyendo aquellas formadas a partir de floema, corteza, tejido fundamental, y epidermis; y (c) fibras de tallos, hojas, raíces, semillas, y flores o inflorescencias (tales como los de Sorghum vulgare usados en la fabricación de cepillos y escobas).

El ejemplo de plantas productoras de fibras, incluyen, pero no están limitados a, cultivos agrícolas tales como algodón, árbol del algodón de seda (Capoc, Ceiba pentandra), sauce del desierto, larrea, winterfat, balsa, kenaf, rosa de Jamaica, yute, sisal abacá, lino, maíz, caña de azúcar, cáñamo, ramio, capoc, fibra de coco, bambú, musgo español y Agave spp. (p. ej., sisal).

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "calidad de las fibras", se refiere al menos a un parámetro de las fibras que se desea desde un punto de vista agrícola, o se requiere en la industria de las fibras (descrito adicionalmente en la presente memoria más adelante). Los ejemplos de dichos parámetros, incluyen, pero no están limitados a, longitud de las fibras, resistencia de las fibras, idoneidad de las fibras, peso de las fibras, por unidad de longitud, relación de madurez y uniformidad (descrito adicionalmente en la presente memoria más adelante).

La calidad de las fibras de algodón (hebra) se mide típicamente según la longitud, resistencia y fineza de las fibras. Por consiguiente, la calidad de la hebra se considera mayor cuando la fibra es más larga, resistente y fina.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "rendimiento de fibras" se refiere a la cantidad o cuantía de fibras producidas a partir de la planta productora de fibras.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "se incrementa" se refiere al menos aproximadamente a un 2%, al menos aproximadamente un 3%, al menos aproximadamente un 4%, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, de incremento en la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, rendimiento de las semillas, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta de una planta en comparación con una planta nativa [es decir, una planta no modificada con las biomoléculas (polinucleótido o polipéptidos) de la invención, p. ej., una planta no transformada de la misma especie que se crece bajo las mismas condiciones de crecimiento).

La expresión "expresar en la planta un polinucleótido exógeno", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a regular al alza el nivel de expresión de un polinucleótido exógeno en la planta mediante la introducción del polinucleótido exógeno en una célula de planta o planta y expresión por medios recombinantes, como se describe adicionalmente en la presente memoria más adelante.

Tal y como se usa en la presente memoria, "expresar" se refiere a la expresión a nivel de ARNm y, opcionalmente, de polipéptido.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "polinucleótido exógeno" se refiere a una secuencia de ácido nucleico heteróloga que puede no expresarse naturalmente en la planta o cuya sobreexpresión en la planta es deseable. El polinucleótido exógeno puede introducirse en la planta de una manera estable o transitoria, con el fin de producir una molécula de ácido ribonucleico (ARN) y/o una molécula de polipéptido. Debe indicarse que el polinucleótido exógeno puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o parcialmente homóloga a secuencia de ácido nucleico endógena de la planta.

El término "endógeno", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier polinucleótido o polipéptido que está presente y/o se expresa naturalmente en una planta o en una célula de la misma.

Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 81%, al menos aproximadamente un 82%, al menos aproximadamente un 83%, al menos aproximadamente un 84%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 86%, al menos aproximadamente un 87%, al menos aproximadamente un 88%, al menos aproximadamente un 89%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, p. ej., un 100% idéntica a la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 352, 96 y 235.

La identidad (p. ej., porcentaje de homología) puede determinarse usando cualquier software de comparación de homología, incluyendo, por ejemplo, el software BlastN del National Center of Biotechnology Information (NCBI) tal como mediante el uso de parámetros por defecto.

Según algunas realizaciones de la invención, la homología es una homología global, es decir, una homología sobre las secuencias completas de aminoácidos o ácido nucleico de la invención y no sobre partes de las mismas.

Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno es al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 81%, al menos aproximadamente un 82%, al menos aproximadamente un 83%, al menos aproximadamente un 84%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 86%, al menos aproximadamente un 87%, al menos aproximadamente un 88%, al menos aproximadamente un 89%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, p. ej., un 100% idéntico al polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 325, 96 y 235.

Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno se muestra por la SEQ ID NO: 325, 96 o 235.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "polinucleótido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico mono o bicatenaria que se aísla y proporciona en la forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómica y/o una secuencia de polinucleótidos compuesta (p. ej., una combinación de las anteriores).

El término "aislado" se refiere a al menos parcialmente separado del entorno natural, p. ej., de una célula de planta.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "secuencia de polinucleótidos complementaria" se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripción inversa de ARN mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Dicha secuencia puede amplificarse posteriormente in vivo o in vitro usando una ADN polimerasa dependiente de ADN.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "secuencia de polinucleótidos genómica" se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y, así representa una parte contigua de un cromosoma.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "secuencia de polinucleótidos compuesta" se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exónicas requeridas para codificar el polipéptido de la presente invención, así como algunas secuencias intrónicas interpuestas entre ellas. Las secuencias intrónicas pueden proceder de cualquier fuente, incluyendo de otros genes, y típicamente incluirán secuencias señal de corte y empalme conservadas. Dichas secuencias intrónicas pueden incluir además elementos reguladores de la expresión que actúan en cis.

Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno de la invención codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 81%, al menos aproximadamente un 82%, al menos aproximadamente un 83%, al menos aproximadamente un 84%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 86%, al menos aproximadamente un 87%, al menos aproximadamente un 88%, al menos aproximadamente un 89%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, o más, es decir, un 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 563.

La homología (p. ej., porcentaje de homología) puede determinarse usando cualquier software de comparación de homología, incluyendo por ejemplo, el software BlastP o TBLASTN del National Center of Biotechnology Information (NCBI) tal como mediante el uso de parámetros por defecto, cuando se empieza de una secuencia de polipéptido; o el algoritmo tBLASTX (disponible a través del NCBI) tal como mediante el uso de parámetros por defecto, que compara los productos de traducción conceptuales de seis marcos de una secuencia de nucleótidos de búsqueda (ambas cadenas) frente a una base de datos de secuencias de proteínas.

Las secuencias homólogas incluyen tanto secuencias ortólogas como parálogas. El término "paráloga" se refiere a duplicaciones génicas en el genoma de una especie, que dan lugar a genes parálogos. El término "ortólogo" se refiere a genes homólogos en diferentes organismos debido una relación ancestral.

Una opción para identificar a los ortólogos en especies de plantas monocotiledóneas es realizando una búsqueda en blast recíproca. Esto puede hacerse por una primera búsqueda en blast que implica buscar en blast la secuencia de interés frente a cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos NCBI disponible públicamente que puede encontrarse en: Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) ncbi (punto) nlm (punto) nih (punto) gov. Si se buscan los ortólogos en arroz, la secuencia de interés se buscaría en blast frente a, por ejemplo, los 28.469 clones de ADNc de longitud completa de Oryza sativa Nipponbare disponible en NCBI. Los resultados de blast pueden filtrarse. Las secuencias de longitud completa de los resultados bien filtrados o de los resultados no filtrados se buscan entonces en blast de nuevo (segunda búsqueda en blast) frente a las secuencias del organismo del que deriva la secuencia de interés. Se comparan entonces los resultados de la primera y segunda búsqueda en blast. Un ortólogo se identifica cuando la secuencia que produce la mayor puntuación (mejor acierto) en la primera búsqueda en blast identifica en la segunda búsqueda en blast la secuencia de búsqueda (la secuencia de interés original) como el mejor acierto. Usando la misma base racional, se encuentra un parálogo (homólogo a un gen en el mismo organismo). En el caso de familias de secuencias más grandes, puede usarse el programa ClustalW [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) cbi (punto) ac (punto) uk/Tools/clustalw2/index (punto) html], seguido de un árbol de unión de vecinos (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://en (punto) wikipedia (punto) org/wiki/Neighbor-joining) que ayuda a visualizar el agrupamiento.

Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 563.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la presente invención pueden optimizarse para la expresión. Los ejemplos de dichas modificaciones de secuencia incluyen, pero no están limitadas a, un contenido alterado de G/C para aproximarse más al encontrado típicamente en la especie de planta de interés, y la eliminación de codones encontrados atípicamente en la especia de la planta, referido comúnmente como optimización de codones.

La expresión "optimización de codones" se refiere a la selección de nucleótidos de ADN apropiados para uso en un gen estructural o fragmento del mismo que se aproxima al uso de codones en la planta de interés. Por lo tanto, un gen o secuencia de ácido nucleico optimizada se refiere a un gene en el que la secuencia de nucleótidos de un gen nativo o natural ha sido modificada con el fin de utilizar codones estadísticamente preferidos o estadísticamente favorecidos en la planta. La secuencia de nucleótidos típicamente se examina a nivel de ADN y la región codificante se optimiza para la expresión en la especie de planta determinada usando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, como se describe en Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). En este método, la desviación estándar del uso de codones, una medida del sesgo en el uso de codones, puede calcularse encontrando en primer lugar la desviación proporcional al cuadrado del uso de cada codón del gen nativo respecto al de los genes de la planta altamente expresados, seguido de un cálculo de la desviación cuadrada promedio. La fórmula usada es: 1 SDCU= n= 1 N [(Xn -Yn ) / Yn] 2 / N, donde Xn se refiere a la frecuencia de uso del codón n en genes de la planta altamente expresados, donde Yn es la frecuencia del uso del codón n en el gen de interés y N se refiere al número total de codones en el gene de interés. Una Tabla del uso de codones de genes altamente expresados de plantas dicotiledóneas se compila usando los datos de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).

Un método para optimizar la secuencia de ácido nucleico según el uso de codones preferido para un tipo de célula de planta particular se basa en el uso directo, si realizar ningún cálculo estadístico adicional, de las Tablas de optimización de codones tales como las proporcionadas en línea en la Base de Datos de Uso de Codones a través del banco de ADN de NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) en Japón (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) kazusa (punto) o (punto) jp/codon/). La Base de Datos de Uso de Codones contiene tablas de uso de codones para un número de diferentes especies, habiéndose determinado cada Tabla de uso de codones estadísticamente sobre la base de los datos presentes en Genbank.

Mediante el uso de las Tablas anteriores para determinar los codones más preferidos o más favorecidos para cada aminoácido en una especie particular (por ejemplo, arroz), una secuencia de nucleótidos natural que codifica una proteína de interés puede optimizarse por codones para esa especie de planta particular. Esto se efectúa reemplazando los codones que pueden tener una baja incidencia estadística en el genoma de la especie particular con codones correspondientes, respecto a un aminoácido, que están más favorecidos estadísticamente. Sin embargo, uno o más codones menos favorecidos pueden seleccionarse para delecionar sitios de restricción existentes, para crear unos nuevos en uniones potencialmente útiles (extremos 5' y 3' para añadir un péptido señal o casetes de terminación, sitios internos que podrían usarse para cortar y empalmar segmentos conjuntamente para producir una secuencia de longitud completa correcta), o para eliminar secuencias de nucleótidos que pueden afectar negativamente la estabilidad o expresión del ARNm.

La secuencia de nucleótidos codificante natural puede contener ya, antes de cualquier modificación, un número de codones que corresponden a un codón estadísticamente favorecido en una especie de planta particular. Por lo tanto, la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos nativa puede comprender determinar qué codones, en la secuencia de nucleótidos nativa, no están estadísticamente favorecidos respecto a una planta particular, y modificar estos codones según una tabla de uso de codones de la planta particular para producir un derivado con optimización de codones. Una secuencia de nucleótidos modificada puede optimizarse completamente o parcialmente para el uso de codones de la planta, siempre que la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos modificada se produzca a un nivel mayor que la proteína codificada por el gen natural o nativo correspondiente. La construcción de genes sintéticos mediante la alteración del uso de codones se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente PCT 93/07278.

Según algunos aspectos de la descripción, el polinucleótido exógeno es un ARN no codificador.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "ARN no codificador " se refiere a una molécula de ARN que no codifica una secuencia de aminoácidos (un polipéptido). Los ejemplos de dichas moléculas de ARN no codificadoras incluyen, pero no están limitadas a, un ARN antisentido, un preARNmi (precursor de un microARN), o un precursor de un ARN que interacciona con Piwi (ARNpi).

Los ejemplos no limitativos de polinucleótidos de ARN no codificadores se proporcionan en las SEQ ID NO:214, 215, 216, 466, 467, 967, 968, 969, y 1575.

Así, la descripción engloba secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria anteriormente; fragmentos de las mismas, secuencias hibridizables con las mismas, secuencias homólogas a las mismas, secuencias que codifican polipéptidos similares con un uso de codones diferente, secuencias alteradas caracterizadas por mutaciones, tales como deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, bien naturales o inducidas artificialmente, bien aleatoriamente o de una forma dirigida.

La invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 81%, al menos aproximadamente un 82%, al menos aproximadamente un 83%, al menos aproximadamente un 84%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 86%, al menos aproximadamente un 87%, al menos aproximadamente un 88%, al menos aproximadamente un 89%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, p. ej., un 100% idéntica al polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-467, y 785-3047.

Según algunos aspectos de la descripción, la secuencia de ácido nucleico es capaz de incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, rendimiento de las semillas, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta.

Según algunos aspectos de la descripción, el polinucleótido aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 -467, y 785-3047.

Según algunos aspectos de la descripción, el polinucleótido aislado se muestra por la SEQ ID NO: 1-467, 785-3046 o 3047.

La descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 81%, al menos aproximadamente un 82%, al menos aproximadamente un 83%, al menos aproximadamente un 84%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 86%, al menos aproximadamente un 87%, al menos aproximadamente un 88%, al menos aproximadamente un 89%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, o más, es decir, un 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 468-784, 3048-4333, y 4335-4682.

Según algunos aspectos de la descripción, la secuencia de aminoácidos es capaz de incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, rendimiento de las semillas, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta.

La descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 468­ 784, 3048-4333, 4335-4682 y 4334.

La descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 81%, al menos aproximadamente un 82%, al menos aproximadamente un 83%, al menos aproximadamente un 84%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 86%, al menos aproximadamente un 87%, al menos aproximadamente un 88%, al menos aproximadamente un 89%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, o más, es decir, un 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 468-784, 3048-4333, y 4335-4682.

Según algunos aspectos de la descripción, el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 468-784, 3048-4333, 4335-4682 y 4334.

Según algunos aspectos de la descripción, el polipéptido se muestra por la SEQ ID NO: 468-784, 3048-4333, 4335­ 4682 o 4334.

Según algunos aspectos de la descripción, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido aislado de la invención, y un promotor para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido aislado en una célula huésped.

La descripción también engloba fragmentos de los polipéptidos descritos anteriormente y polipéptidos que tienen mutaciones, tales como deleciones, inserciones o sustituciones de uno o más aminoácidos, bien naturales o inducidas artificialmente, bien aleatoriamente o de una forma dirigida.

El término "planta", tal y como se usa en la presente memoria, engloba plantas completas, ancestros y progenie de la las plantas y partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, raíces (incluyendo tubérculos), y células, tejidos y órganos de las plantas. La planta puede estar en cualquier forma incluyendo cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo un forraje o legumbre de forraje, planta ornamental, cultivo alimentario, árbol o arbusto seleccionado de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Doryenium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, coles de Bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, acelgas, lino, kale, lentejas, colza, ocra, cebolla, patata, arroz, soja, paja, remolacha, caña de azúcar, girasol, tomate, té de calabaza, maíz, trigo, cebada, centeno, avena, cacahuetes, guisantes, lentejas y alfalfa, algodón, semilla de colza, canola, pimiento, girasol, tabaco, berenjena, eucalipto, un árbol, una planta ornamental, una hierba perenne y un cultivo de forraje. Alternativamente, pueden usarse algas y otras no Viridiplantae para los métodos de la presente invención.

Según algunas realizaciones de la invención, la planta usada por el método de la invención es una planta de cultivo tal como arroz, maíz, trigo, cebada, cacahuete, patata, sésamo, olivo, aceite de palma, banana, soja, girasol, canola, caña de azúcar, alfalfa, mijo, leguminosas (judía, guisante), lino, altramuz, colza, tabaco, álamo y algodón.

Según algunos aspectos de la descripción, se proporciona una célula de planta que expresa exógenamente el polinucleótido, la construcción de ácido nucleico y/o el polipéptido de algunos aspectos de la descripción.

Según algunas realizaciones de la invención, la expresión del polinucleótido exógeno de la invención en la planta se realiza mediante la transformación de una o más células de la planta con el polinucleótido exógeno, seguido de la generación de una planta madura a partir de las células transformadas y el cultivo de la planta madura en condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótido exógeno en la planta madura.

Según algunas realizaciones de la invención, la transformación se realiza introduciendo en la célula de planta una construcción de ácido nucleico que incluye el polinucleótido exógeno de algunas realizaciones de la invención y al menos un promotor para dirigir la transcripción del polinucleótido exógeno en una célula huésped (una célula de planta). Los detalles adicionales para las estrategias de transformación adecuadas se proporcionan en la presente memoria más adelante.

Como se ha mencionado, la construcción de ácido nucleico según algunos aspectos de la descripción comprende una secuencia de promotor y el polinucleótido aislado de la descripción.

Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido aislado está unido de forma operativa a la secuencia del promotor.

Una secuencia de ácido nucleico codificadora está "unida de forma operativa" a una secuencia reguladora (p. ej., promotor) si la secuencia reguladora es capaz de ejercer un efecto regulador sobre la secuencia codificadora unida a ella.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "promotor" se refiere a una región de ADN que se encuentra en 5' del sitio de inicio de la transcripción de un gen al que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción del ARN. El promotor controla dónde (p. ej., qué parte de una planta) y/o cuándo (p. ej., en qué estadio o condición en el tiempo vital de un organismo) se expresa el gen.

Según algunas realizaciones de la invención, el promotor es heterólogo para el polinucleótido aislado (p. ej., derivado de otro gen o especie con respecto al polinucleótido aislado).

Según algunas realizaciones de la invención, el promotor es heterólogo para la célula huésped (p. ej., derivado de otro tipo de célula, o especie con respecto a la célula huésped).

Según algunas realizaciones de la invención, el promotor es heterólogo para el polinucleótido aislado y para la célula huésped.

Puede usarse cualquier secuencia de promotor adecuada por la construcción de ácido nucleico de la presente descripción. Preferiblemente, el promotor es un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido o inducible por estrés abiótico.

Los promotores constitutivos adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor de CaMV 35S (SEQ ID NO: 4685; Odell et al., Nature 313:810-812, 1985); el promotor de Arabidopsis At6669 (SEQ ID NO: 4684; véase la Publicación PCT No. WO04081173A2); el nuevo promotor de Arabidopsis At6669 (SEQ ID NO: 4687); Ubi 1 de maíz (Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al, Plant J nov;2(6):837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); ciclofilina de arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); histona H3 de maíz (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276­ 285, 1992); actina 2 (An et al, Plant J. 10(1 );107-121, 1996) y Super MAS sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661 -76, 1995). Otros promotores constitutivos incluyen los de las Pat. de EE.UU. Nos. 5.659.026, 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142.

Los promotores específicos de tejido adecuados incluyen, pero no están limitados a, promotores específicos de hojas [tales como los descritos, por ejemplo, por Yamamoto et al., Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol.

105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; y Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993], promotores preferidos de semillas [p. ej., Napina (originado de Brassica napus que se caracteriza por una actividad de promotor específica de semilla; Stuitje A. R. et. al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309; SEQ ID NO:4686), de genes específicos de semillas (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191,1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), albúmina de nuez brasileña (Pearson' et al., Plant Mol. Biol.

18: 235- 245, 1992), legúmina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), zeína (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), SPA de trigo (Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina de girasol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992)], promotores específicos de endospermo [p. ej., LMW y HMW de trigo, glutenina-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), gliadinas a, b y g de trigo (EMBO3:1409-15, 1984), promotor Itrl de cebada, hordeína B1, C, D de cebada (Theor Apple Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996), DOF de cebada (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629­ 640, 1998), prolamina NRP33 de arroz, globulina Glb-1 de arroz (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), alfa-globulina REB/OHP-1 de arroz (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glucosa PP de arroz (Trans Res 6:157-68, 1997), familia de genes ESR de maíz (Plant J 12:235-46, 1997), gamma-cafirina de sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores específicos de embriones [p. ej., OSHI de arroz (Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), oleosina de arroz (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], y promotores específicos de flores [p. ej., AtPRP4, caleno sintasa (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apetala-3], y promotores de raíces, tales como el promotor RootP [SEQ ID NO: 4688; Región en 5' del gen ATXTH19 (AT4G30290, Xiloglucan endotransglucosilasa/hidrolasa 19, descrito en Vissenberg K, et al. Plant Cell Physiol. 2005 ene;46(1):192-200].

Los promotores inducibles por estrés abiótico adecuados incluyen, pero no están limitados a, promotores inducibles por sal, tales como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331 -340, 1993); promotores inducibles por sequía, tales como el promotor del gen rab17 de maíz (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), promotor del gen rab28 de maíz (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997) y promotor del gen Ivr2 de maíz (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores inducibles por calor, tales como promotor de calor de hsp80 de tomate (Pat. de EE.UU. No. 5.187.267).

La construcción de ácido nucleico puede incluir además un marcador seleccionable apropiado y/o un origen de replicación. Según algunas realizaciones de la invención, la construcción de ácido nucleico utilizada es un vector lanzadera, que puede propagarse tanto en E. coli (en donde la construcción comprende un marcador seleccionable apropiado y origen de replicación) como ser compatible con la propagación en células. La construcción puede ser, por ejemplo, un plásmido, un bácmido, un fagémido, un cósmido, un fago, un virus o un cromosoma artificial.

La construcción de ácido nucleico de algunas realizaciones de la invención puede utilizarse para transformar de forma estable o transitoria células de plantas. En la transformación estable, el polinucleótido exógeno se integra en el genoma de la planta y, como tal, representa un rasgo estable y hereditario. En la transformación transitoria, el polinucleótido exógeno se expresa por la célula transformada pero no se integra en el genoma y, como tal, representa un rasgo transitorio.

Hay varios métodos para introducir genes extraños en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

Los métodos principales para causar la integración estable de ADN exógeno en el ADN genómico de una planta incluyen dos estrategias principales:

(i) transferencia génica mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee y Rogers en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, en Plant Biotechnology, eds. Kung, S. y Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.

(ii) captación directa del ADN: Paszkowski et al., en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluyendo métodos para la captación directa del ADN en protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captación de ADN inducida por choques elcétricos breves de células de plantas: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Inyección de ADN en células o tejidos de plantas por bombardeo de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; mediante el uso de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformación con fibras de vidrio o fibras muy cortas de carburo de silicio de cultivos celulares, embriones o tejido de callo, Pat. de EE.UU. No.

5.464.765 o por la incubación directa de ADN con polen en germinación, DeWet et al. en Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. y Mantell, S. H. y Daniels, W. Longman, Londres, (1985) p. 197-209; y Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

El sistema de Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos definidos de ADN que se integran en el ADN genómico de la planta. Los métodos de inoculación del tejido de la planta varían dependiendo de la especie de la planta y del sistema de administración de Agrobacterium. Una estrategia ampliamente usada es el procedimiento del disco de hoja que puede realizarse con cualquier explante de tejido que proporciona una buena fuente para el inicio de la diferenciación en planta completa. Véase, p. ej., Horsch et al. en Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1 -9. Una estrategia suplementaria emplea el sistema de administración de Agrobacterium en combinación con infiltración en vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente viable en la creación de plantas dicotiledóneas transgénicas.

Hay varios métodos para la transferencia directa de ADN en las células de plantas. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un campo eléctrico fuerte. En la microinyección, el ADN se inyecta mecánicamente directamente en las células usando micropipetas muy pequeñas. En el bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe en microproyectiles tales como cristales de sulfato de magnesio o partículas de tungsteno, y los microproyectiles se aceleran físicamente en células o tejidos de la planta.

Después de la transformación estable, se ejecuta la propagación de la planta. El método más común para propagar platas es por semillas. La regeneración por propagación de semillas, sin embargo, tiene la deficiencia de que, debido a la heterocigosidad, hay una ausencia de uniformidad en el cultivo, ya que las semillas se producen por las plantas según las varianzas genéticas gobernadas por las reglas mendelianas. Básicamente, cada semilla es genéticamente diferente y cada una crecerá con sus propios rasgos específicos. Por lo tanto, se prefiere producir la planta transformada de manera que la planta regenerada tenga los rasgos y características idénticas de la planta transgénica parental. Por lo tanto, se prefiere regenerar la planta transformada por micropropagación que proporciona una reproducción rápida y consistente de las plantas transformadas.

La micropropagación es un proceso para crecer una nueva generación de plantas a partir de una única pieza de tejido que se ha escindido de una planta parental o variedad cultivada seleccionada. Este proceso permite la reproducción en masa de plantas que tienen el ejido preferido que expresa la proteína de fusión. La nueva generación de plantas que se produce es genéticamente idéntica a, y tiene todas las características de, la planta original. La micropropagación permite la producción en masa de material vegetal de calidad en un periodo de tiempo corto y ofrece una rápida multiplicación de variedades cultivadas seleccionadas con la conservación de las características de la planta transgénica o transformada original. Las ventajas de clonar plantas son la velocidad de multiplicación de las plantas y la calidad y uniformidad de las plantas producidas.

La micropropagación es un procedimiento con múltiples etapas que requiere la alteración del medio de cultivo o de las condiciones de crecimiento entre estadios. Así, el proceso de micropropagación implica cuatro etapas básicas: Etapa uno, cultivo tisular inicial; etapa dos, multiplicación del cultivo tisular; etapa tres, diferenciación y formación de la planta; y etapa cuatro, cultivo en invernadero y madurez. Durante la etapa uno, cultivo tisular inicial, el cultivo tisular se establece y se certifica que carece de contaminantes. Durante la etapa dos, el cultivo tisular inicial se multiplica hasta que se produce un número suficiente de muestras de tejido para cumplir con los objetivos de la producción. Durante la etapa tres, las muestras de tejido crecidas en la etapa dos se dividen y se crecen en plántulas individuales. En la etapa cuatro, las plántulas transformadas se transfieren a un invernadero para madurar, donde la tolerancia a la luz de las plantas se incrementa gradualmente, con el fin de que puedan crecerse en el entorno natural.

Según algunos aspectos de la descripción, las plantas transgénicas se generan por la transformación transitoria de células de las hojas, células meristemáticas o la planta completa.

La transformación transitoria puede efectuarse por cualquiera de los métodos de transferencia directa de ADN descritos anteriormente o por infección viral usando virus de plantas modificados.

Los virus que se ha mostrado que son útiles para la transformación de huéspedes de plantas incluyen CaMV, virus del mosaico del tabaco (TMV), virus del mosaico del bromo (BMV) y virus del mosaico de la judía común (BV o BCMV). La transformación de plantas usando virus de plantas se describe en la Pat. de EE.UU. No. 4.855.237 (virus del mosaico dorado del frijol; BGV), EP-A 67.553 (TMV), Solicitud Publicada Japonesa No. 63-14693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); y Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, p. 172-189 (1988). Las partículas de pseudovirus para uso en la expresión de ADN extraño en muchos huéspedes, incluyendo plantas, se describen en WO 87/06261.

Según algunos aspectos de la descripción, el virus usado para las transformaciones transitorias es avirulento y así es incapaz de causar síntomas graves, tales como tasa de crecimiento reducida, mosaico, manchas anulares, enrollamiento de las hojas, amarilleo, formación de estrías, formación de pústulas, formación de tumores y concavidades. Un virus avirulento adecuado puede ser un virus avirulento natural o un virus atenuado artificialmente. La atenuación de los virus puede efectuarse usando métodos muy conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, calentamiento subletal, tratamiento químico o por técnicas de mutagénesis dirigida, tal como se describe, por ejemplo, por Kurihara y Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) y Huet et al. (1994).

Las cepas de virus adecuadas pueden obtenerse a partir de fuentes disponibles tales como, por ejemplo, la American Type culture Collection (ATCC) o por aislamiento de plantas infectadas. El aislamiento de virus de tejidos de plantas infectadas puede efectuarse por técnicas muy conocidas en la técnica tal como se describe, por ejemplo, por Foster y Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Brevemente, los tejidos de una planta infectada que se cree que contienen una alta concentración de un virus adecuado, preferiblemente hojas jóvenes y pétalos de flores, se muelen en una disolución de tampón (p. ej., disolución de tampón fosfato) para producir una savia infectada con virus que puede usarse en inoculaciones posteriores.

La construcción de virus de ARN de plantas para la introducción y expresión de secuencias de polinucleótidos exógenas no virales en plantas se demuestra por las referencias anteriores, así como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; y la Pat. de EE.UU. No. 5.316.931.

Cuando el virus es un virus de ADN, pueden hacerse modificaciones adecuadas al virus en sí mismo. Alternativamente, el virus puede clonarse en primer lugar en un plásmido bacteriano para facilitar la construcción del vector viral deseado con el ADN extraño. El virus puede escindirse entonces del plásmido. Si el virus es un virus de ADN, puede unirse un origen de replicación bacteriano al ADN viral, que se replica entonces por las bacterias. La transcripción y traducción de este ADN producirá la proteína de la cubierta que encapsidará el ADN viral. Si el virus es un virus de ARN, el virus se clona generalmente como un ADNc y se inserta en un plásmido. El plásmido se usa entonces para preparar todas las construcciones. El virus de ARN se produce entonces mediante la transcripción de la secuencia viral del plásmido y la traducción de los genes virales para producir la o las proteínas de la cubierta que encapsidan el ARN viral.

Se proporciona un polinucleótido viral de planta en el que la secuencia codificadora de la proteína de cubierta nativa se ha delecionado de un polinucleótido viral, se ha insertado una secuencia codificadora de proteína de cubierta viral no nativa y un promotor no nativo, preferiblemente el promotor subgenómico de la secuencia codificadora de proteína de cubierta no nativa, capaz de la expresión en una planta huésped, del empaquetamiento del polinucleótido viral de planta recombinante, y de asegurar una infección sistémica del huésped por el polinucleótido viral de planta recombinante. Alternativamente, el gen de la proteína de cubierta puede inactivarse por la inserción de la secuencia del polinucleótido no nativa en él, de manera que se produce una proteína. El polinucleótido viral de planta recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales. Cada uno de los promotores subgenómicos no nativos es capaz de transcribir o expresar genes o secuencias de polinucleótidos adyacentes en la planta huésped y es incapaz de recombinación entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Las secuencias de polinucleótidos no nativas (extrañas) pueden insertarse adyacentes al promotor subgenómico viral de la planta nativo o los promotores subgenómicos virales de planta nativos y no nativos, si se incluye más de una secuencia de polinucleótidos. Las secuencias de polinucleótidos no nativas se transcriben o expresan en la planta huésped bajo el control del promotor subgenómico para producir los productos deseados.

Se proporciona un polinucleótido viral de planta recombinante como en el primer aspecto. excepto en que la secuencia codificadora de la proteína de cubierta nativa se pone adyacente a uno de los promotores subgenómicos de proteína de cubierta no nativa en lugar de una secuencia codificadora de proteína de cubierta no nativa.

Se proporciona un polinucleótido viral de planta recombinante en el que el gen de la proteína de cubierta nativo está adyacente a su promotor subgenómico y se han insertado uno o más promotores subgenómicos no nativos en el polinucleótido viral. Los promotores subgenómicos no nativos insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes en una planta huésped y son incapaces de recombinación entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Las secuencias de polinucleótidos no nativas pueden insertarse adyacentes a los promotores virales de planta subgenómicos no nativos, de manera que las secuencias se transcriben o expresan en la planta huésped bajo el control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado.

Se proporciona un polinucleótido viral de planta recombinante como en la tercera realización, excepto en que la secuencia codificadora de la proteína de cubierta nativa se reemplaza por una secuencia codificadora de la proteína de cubierta no nativa.

Los vectores virales son encapsidados por las proteínas de cubierta codificadas por el polinucleótido viral de planta recombinante para producir un virus de planta recombinante. El polinucleótido viral de planta recombinante o virus de planta recombinante se usa para infectar las plantas huésped apropiadas. El polinucleótido viral de planta recombinante es capaz de replicación en el huésped, diseminación sistémica en el huésped, y transcripción o expresión de gen(es) extraño(s) (polinucleótido exógeno) en el huésped para producir la proteína deseada.

Las técnicas para la inoculación de virus en plantas pueden encontrarse en Foster y Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh y Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, Nueva York 1967­ 1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, Nueva York, 1985; y Kado y Agrawa, eds. "Principles and Techniques in Plant Virology", Van Nostrand-Reinhold, Nueva York.

Además de lo anterior, el polinucleótido de la presente descripción también puede introducirse en un genoma de cloroplasto, permitiendo de esta manera la expresión en cloroplastos.

Se conoce una técnica para introducir secuencias de polinucleótidos exógenas en el genoma de los cloroplastos. Esta técnica implica los siguientes procedimientos. En primer lugar, las células de la planta se tratan químicamente para reducir el número de cloroplastos por célula hasta aproximadamente uno. Después, el polinucleótido exógeno se introduce por bombardeo de partículas en las células con el objetivo de introducir al menos una molécula de polinucleótido exógeno en los cloroplastos. Los polinucleótidos exógenos se seleccionan de manera que se puedan integrar en el genoma del cloroplasto por recombinación homóloga que se efectúa fácilmente por enzimas inherentes al cloroplasto. Para este fin, el polinucleótido exógeno incluye, además de un gen de interés, al menos una cadena de polinucleótido que deriva del genoma del cloroplasto. Además, el polinucleótido exógeno incluye un marcador seleccionable, que sirve, por procedimientos de selección secuencial, para averiguar que todas o sustancialmente todas las copias de los genomas de los cloroplastos, después de dicha selección, incluirán el polinucleótido exógeno. Los detalles adicionales relacionados con esta técnica se encuentran en las Pat. de EE.UU. Nos. 4.945.050; y 5.693.507 que se incorporan en la presente memoria por referencia. Un polipéptido puede producirse así por el sistema de expresión de proteínas del cloroplasto e integrarse en la membrana interna del cloroplasto.

Como los procesos que incrementan la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, contenido de aceite, rendimiento, rendimiento de las semillas, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tasa de crecimiento, biomasa, vigor y/o tolerancia al estrés abiótico de una planta pueden implicar múltiples genes que actúan de manera aditiva o sinérgica (véase, por ejemplo, en Quesda et al., Plant Physiol. 130:951-063, 2002), la presente descripción también considera expresar una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una única planta huésped para conseguir de esta manera un efecto superior sobre el contenido de aceite, rendimiento, tasa de crecimiento, biomasa, vigor y/o tolerancia al estrés abiótico.

La expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una única planta huésped puede realizarse mediante la cointroducción de múltiples construcciones de ácido nucleico, incluyendo cada una un polinucleótido exógeno diferente, en una única célula de planta. La célula transformada puede regenerarse entonces en una planta madura usando los métodos descritos en la presente memoria anteriormente.

Alternativamente, la expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una única planta huésped puede realizarse mediante la cointroducción en una única célula de la planta de una única construcción de ácido nucleico que incluye una pluralidad de polinucleótidos exógenos diferentes. Dicha construcción puede diseñarse con una única secuencia de promotor que puede transcribir un ARN mensajero policistrónico que incluye todas las secuencias de polinucleótidos exógenos diferentes. Para permitir la cotraducción de los diferentes polipéptidos codificados por el ARN mensajero policistrónico, las secuencias de polinucleótidos pueden ligarse ente sí mediante una secuencia de sitio de entrada ribosomal interno (IRES) que facilita la traducción de las secuencias de polinucleótidos posicionadas en 3' de la secuencia del IRES. En este caso, una molécula de ARN policistrónico transcrita que codifica los diferentes polipéptidos descritos anteriormente se traducirá tanto desde el extremo 5' protegido como desde las dos secuencias de IRES internas de la molécula de ARN policistrónico para producir de esta manera en la célula todos los diferentes polipéptidos. Alternativamente, la construcción puede incluir varias secuencias de promotor cada una unida a una diferente secuencia de polinucleótido exógeno.

La célula de la planta transformada con la construcción que incluye una pluralidad de diferentes polinucleótidos exógenos, puede regenerarse en una planta madura, usando los métodos descritos en la presente memoria anteriormente.

Alternativamente, la expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una única planta huésped puede realizarse introduciendo diferentes construcciones de ácido nucleico, incluyendo diferentes polinucleótidos exógenos, en una pluralidad de plantas. Las plantas transformadas regeneradas pueden entonces cruzarse y la progenie resultante seleccionarse para rasgos de una tolerancia superior al estrés abiótico, eficiencia en el uso del agua, eficiencia en el uso de fertilizantes, crecimiento, biomasa, rendimiento y/o vigor, usando técnicas convencionales de fitomejoramiento de plantas.

Según algunas realizaciones de la descripción, el método comprende además crecer la planta que expresa el polinucleótido exógeno bajo el estrés abiótico.

Los ejemplos no limitativos de condiciones de estrés abiótico incluyen, salinidad, sequía, privación de agua, exceso de agua (p. ej., inundaciones, anegamiento), etiolación, temperatura baja, temperatura alta, toxicidad por metales pesados, anaerobiosis, deficiencia de nutrientes, exceso de nutrientes, contaminación atmosférica e irradiación UV.

Así, la descripción engloba plantas que expresan exógenamente el o los polinucleótidos, las construcciones de ácido nucleico y/o polipéptido(s) de la descripción. Una vez expresado en la célula de la planta o en la planta completa, el nivel del polipéptido codificado por el polinucleótido exógeno puede determinarse por métodos muy conocidos en la técnica, tales como, ensayos de actividad, transferencias Western usando anticuerpos capaces de unirse específicamente al polipéptido, Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, inmunofluorescencia y semejantes.

Los métodos para determinar el nivel en la planta del ARN transcrito a partir del polinucleótido exógeno son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, análisis por transferencia Northern, análisis por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (incluyendo RT-PCR cuantitativa, semicuantitativa o en tiempo real) e hibridación de ARN in situ.

La información y las anotaciones de las secuencias no cubiertas por las presentes enseñanzas pueden aprovecharse a favor del fitomejoramiento clásico. Así, los datos de subsecuencias de los polinucleótidos descritos anteriormente, pueden usarse como marcadores para la selección asistida por marcadores (MAS), en la que se usa un marcador para la selección indirecta de un determinante o determinantes genéticos de un rasgo de interés (p. ej., biomasa, tasa de crecimiento, contenido de aceite, rendimiento, tolerancia al estrés abiótico, eficiencia en el uso del agua, eficiencia en el uso de nitrógeno y/o eficiencia en el uso de fertilizantes). Los datos de ácidos nucleicos de las presentes enseñanzas (secuencia de ADN o ARN) pueden contener o estar ligados a sitios polimórficos o marcadores genéticos en el genoma, tales como polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), microsatélites y polimorfismo de nucleótido único (SNP), huellas de ADN (DFP), polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismo del nivel de expresión, polimorfismo del polipéptido codificado y cualquier otro polimorfismo en la secuencia de ADN o ARN.

Los ejemplos de selecciones asistidas por marcadores incluyen, pero no están limitadas a, la selección por un rasgo morfológico (p. ej., un gen que afecta la forma, coloración, esterilidad masculina o resistencia, tal como la presencia o ausencia de arista, coloración de la vaina de las hojas, altura, color de los granos, aroma del arroz); selección por un rasgo bioquímico (p. ej., un gen que codifica una proteína que puede extraerse y observarse; por ejemplo, isozimas y proteínas de almacenamiento); selección por un rasgo biológico (p. ej., las clases de patógenos o biotipos de insectos sobre la base de la interacción huésped patógeno o huésped parásito pueden usarse como un marcador ya que la constitución genética de un organismo puede afectar su susceptibilidad a los patógenos o parásitos).

Los polinucleótidos y polipéptidos descritos en la presente memoria anteriormente pueden usarse en un amplio rango de plantas económicas, de una manera segura y rentable.

Las líneas de plantas que expresan exógenamente el polinucleótido o el polipéptido se criban para identificar aquellas que muestran el mayor incremento del rasgo de la planta deseado.

El efecto del transgén (el polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido) sobre la tolerancia al estrés abiótico puede determinarse usando métodos conocidos, tal como se detalla más adelante y en la sección de los Ejemplos que sigue.

Tolerancia al estrés abiótico - Las plantas transformadas (es decir, que expresan el transgén) y no transformadas (tipo salvaje) se exponen a una condición de estrés abiótico, tal como privación de agua, temperatura subóptima (temperatura baja, temperatura alta), deficiencia de nutrientes, exceso de nutrientes, una condición de estrés por sal, estrés osmótico, toxicidad por metales pesados, anaerobiosis, contaminación atmosférica e irradiación UV.

Ensayo de tolerancia a la salinidad - Se espera que las plantas transgénicas con tolerancia a altas concentraciones de sal presenten una mejor germinación, vigor o crecimiento de las plántulas en altas concentraciones de sal. El estrés por sal puede realizarse de muchas maneras, tales como, por ejemplo, irrigando las plantas con una disolución hiperosmótica, cultivando las plantas hidropónicamente en una disolución de crecimiento hiperosmótica (p. ej., disolución de Hoagland), o cultivando las plantas en un medio de crecimiento hiperosmótico [p. ej., medio de Murashige-Skoog al 50% (medio MS)]. Como las diferentes plantas varían considerablemente en su tolerancia a la salinidad, la concentración de sal en el agua de irrigación, disolución de crecimiento, o medio de crecimiento puede ajustarse según las características específicas de la variedad cultivada o variedad de planta específica, de manera que se produzca un efecto leve o moderado sobre la fisiología y/o morfología de las plantas (para directrices sobre la concentración apropiada, véase, Bernstein y Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress En: Plant Roots, The Hidden Half 3a ed. Waisel Y, Eshel A y Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., Nueva York, 2002, y referencias en ellas).

Por ejemplo, un ensayo de tolerancia a la salinidad puede realizarse irrigando las plantas en diferentes estadios de desarrollo con concentraciones crecientes de cloruro de sodio (por ejemplo, NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM) aplicadas desde la parte inferior y desde arriba para asegurar una dispersión uniforme de sal. Después de la exposición a la condición de estrés, las plantas se monitorizan frecuentemente hasta que aparecen efectos fisiológicos y/o morfológicos sustanciales en las plantas de tipo salvaje. Así, se comparan la apariencia fenotípica externa, grado de marchitamiento y éxito global para alcanzar la madurez y rendimiento de la progenie entre las plantas control y transgénicas.

Los parámetros cuantitativos de tolerancia medidos incluyen, pero no están limitados a, el peso húmedo y seco promedio, tasa de crecimiento, tamaño de las hojas, cobertura de las hojas (área global de las hojas), el peso de las semillas obtenidas, el tamaño promedio de las semillas y el número de semillas producidas por planta. Las plantas transformadas que no presentan efectos fisiológicos y/o morfológicos sustanciales, o que presentan una mayor biomasa que las plantas de tipo salvaje, se identifican como plantas tolerantes al estrés abiótico.

Ensayo de tolerancia osmótica - Los ensayos de estrés osmótico (incluyendo ensayos con cloruro de sodio y manitol) se llevan a cabo para determinar si un fenotipo de estrés osmótico era específico de cloruro de sodio o si era un fenotipo relacionado con estrés osmótico general. Las plantas que son tolerantes al estrés osmótico pueden tener más tolerancia a la sequía y/o congelación. Para los experimentos de germinación bajo estrés de sal y osmótico, el medio se suplementa, por ejemplo, con NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM o NaCl 100 mM, 200 mM, manitol 400 mM.

Ensayo de tolerancia a la sequía/agente osmótico - La tolerancia a la sequía se realiza para identificar los genes que confieren una mejor supervivencia a las plantas después de una privación aguda de agua. Para analizar si las plantas transgénicas son más tolerantes a la sequía, puede realizarse un estrés osmótico producido por el osmolito no iónico sorbitol en el medio. Las plantas control y transgénicas se germinan y crecen en placas de agar para plantas durante 4 días, después de lo cual, se transfieren a placas que contienen sorbitol 500 mM. El tratamiento causa un retraso en el crecimiento, después se comparan las plantas control y transgénicas, midiendo el peso de la planta (húmedo y seco), rendimiento, y por tasas de crecimiento medidas como tiempo hasta la floración.

A la inversa, se realizan cribados de sequía basados en suelo con plantas que sobreexpresan los polinucleótidos detallados anteriormente. Las semillas de plantas de Arabidopsis control, u otras plantas transgénicas que sobreexpresan el polipéptido de la invención se germinan y se transfieren a macetas. El estrés por sequía se obtiene después de cesar la irrigación acompañado de poner las macetas en papel absorbente para aumentar la tasa de secado del suelo. Las plantas transgénicas y control se comparan entre sí cuando la mayoría de las plantas control desarrollan un marchitamiento severo. Las plantas se vuelven a regar después de obtener una fracción significativa de las plantas control presentando un marchitamiento severo. Las plantas se clasifican comparando con los controles para cada uno de dos criterios: tolerancia a las condiciones de sequía y recuperación (supervivencia) después de volver a regar.

Tolerancia al estrés por frío - Para analizar el estrés por frío, se transfieren plantas maduras (25 días de edad) a cámaras a 4°C durante 1 o 2 semanas, con luz constitutiva. A continuación, las plantas se devuelven al invernadero. Dos semanas después, se comparan los daños del periodo de enfriamiento, que dan lugar a retraso en el crecimiento y otros fenotipos, entre las plantas control y transgénicas, midiendo el peso de la planta (húmedo y seco), y comparando las tasas de crecimiento medidas como tiempo hasta la floración, tamaño de la planta, rendimiento, y semejantes.

Tolerancia al estrés por calor - La tolerancia al estrés por calor se consigue exponiendo las plantas a temperaturas por encima de 34°C durante un determinado periodo. La tolerancia de las plantas se examina después de transferir las plantas de nuevo a 22°C para la recuperación y la evaluación después de 5 días respecto a los controles internos (plantas no transgénicas) o plantas no expuestas a estrés por frío o calor.

Eficiencia en el uso del agua - puede determinarse como la biomasa producida por unidad de transpiración. Para analizar la WUE, puede medirse el contenido relativo de agua de las hojas en las plantas control y transgénicas. Inmediatamente, se registra el peso fresco (FW); después, las hojas se empapan durante 8 horas en agua destilada a temperatura ambiente en oscuridad, y se registra el peso turgente (TW). Se registra el peso seco total (DW) después de secar las hojas a 60°C hasta un peso constante. El contenido relativo de agua (RWC) se calcula según la siguiente Fórmula I:

Fórmula I

RWC = [(FW - DW) / (TW - DW)] x 100

Eficiencia en el uso de fertilizantes - Para analizar si las plantas transgénicas responden mejor a los fertilizantes, las plantas se crecen en placas de agar o macetas con una cantidad limitada de fertilizante, como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 14, 15 y 16, en la presente memoria más adelante, y en Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci U S A.

2004; 101:7833-8). Las plantas se analizan para determinar su tamaño global, tiempo hasta la floración, rendimiento, contenido de proteínas de los brotes y/o granos. Los parámetros evaluados son el tamaño global de la planta madura, su peso húmedo y seco, el peso de las semillas producidas, el tamaño promedio de las semillas y el número de semillas producidas por planta. Otros parámetros que pueden ensayarse son: el contenido de clorofila de las hojas (ya que el estado de nitrógeno en la planta y el grado de verdor de las hojas están altamente correlacionados), contenido de aminoácidos y de proteínas totales de las semillas u otras partes de la planta, tales como hojas o brotes, contenido de aceite, etc. De forma similar, en lugar de proporcionar nitrógeno en cantidades limitantes, puede añadirse fosfato o potasio a concentraciones crecientes. De nuevo, los mismos parámetros medidos son los mismos que los enumerados anteriormente. De esta manera, se evalúan la eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE), eficiencia en el uso de fosfato (PUE) y eficiencia en el uso de potasio (KUE), comprobando la capacidad de las plantas transgénicas de desarrollarse bajo condiciones de restricción de nutrientes.

Eficiencia en el uso de nitrógeno - Para analizar si las plantas transgénicas (p. ej., plantas de Arabidopsis) responden mejor al nitrógeno, las plantas se crecen en 0,75-3 mM (condiciones de déficit de nitrógeno) o 6-10 mM (concentración óptima de nitrógeno). Se deja que las plantas crezcan durante 25 días adicionales o hasta la producción de semillas. Las plantas se analizan entonces para determinar su tamaño global, tiempo hasta la floración, rendimiento, contenido de proteínas de los brotes y/o producción de granos / semillas. Los parámetros evaluados pueden ser el tamaño global de la planta, peso húmedo y seco, el peso de las semillas producidas, el tamaño promedio de las semillas y el número de semillas producidas por planta. Otros parámetros que pueden ensayarse son: el contenido de clorofila de las hojas (ya que el estado de nitrógeno en la planta y el grado de verdor de las hojas están altamente correlacionados), contenido de aminoácidos y de proteínas totales de las semillas u otras partes de la planta, tales como hojas o brotes y contenido de aceite. Las plantas transformadas que no presentan efectos fisiológicos y/o morfológicos sustanciales, o que presentan niveles de los parámetros medidos mayores que las plantas de tipo salvaje, se identifican como plantas eficientes en el uso de nitrógeno.

Ensayo de eficiencia en el uso de nitrógeno usando plántulas - El ensayo se hace según Yanagisawa-S. et al. con modificaciones menores ("Metabolic engineering with Dof1 transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation and growth under low nitrogen conditions" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7833-7838). Brevemente, las plantas transgénicas que se crecen durante 7-10 días en 0,5 x MS [Murashige-Skoog] suplementado con un agente de selección, se transfieren a dos condiciones limitantes de nitrógeno: medio MS en el que la concentración de nitrógeno combinada (NH⁴NO³ y KNO³) fue 0,75 mM (condiciones de déficit de nitrógeno) o 6-15 mM (concentración óptima de nitrógeno). Se dejó que las plantas crecieran durante 30-40 días adicionales y después se fotografiaron, se retiraron individualmente del Agar (el brote sin las raíces) e inmediatamente se pesaron (peso fresco) para un análisis estadístico posterior. Las construcciones para las que solo están disponibles las semillas T1 se siembran en medio selectivo y al menos 20 plantones (representando cada uno un evento de transformación independente) se transfieren cuidadosamente al medio con nitrógeno limitante. Para las construcciones para las que cada están disponibles las semillas T2, se analizan diferentes eventos de transformación. Habitualmente, 20 plantas seleccionadas aleatoriamente para cada evento se transfieren al medio con nitrógeno limitante, se dejan crecer durante 3-4 semanas adicionales y se pesan individualmente al final de ese periodo. Las plantas transgénicas se comparan con las plantas control crecidas en paralelo en las mismas condiciones. Se usan como control las plantas transgénicas simuladas que expresan el gen informador uidA (GUS) bajo el mismo promotor o las plantas transgénicas que portan el mismo promotor pero que carecen de un gen informador.

Determinación de nitrógeno - El procedimiento para la determinación de la concentración de N (nitrógeno) en las partes estructurales de las plantas implica el método de digestión con persulfato de potasio para convertir el N orgánico en NO³-(Purcell y King 1996 Argon. J. 88:111-113, la reducción mediada por Cd- modificada de NO³- en NO²-(Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) y la medición de nitrito por el ensayo de Griess (Vodovotz 1996, supra). Los valores de absorbancia se miden a 550 nm frente a una curva estándar de NaNO². El procedimiento se describe con detalle en Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.

Ensayos de germinación - Los ensayos de germinación comparan el porcentaje de semillas de plantas transgénicas que podrían completar el proceso de germinación con el porcentaje de semillas de plantas control que se tratan de la misma manera. Las condiciones normales se consideran, por ejemplo, incubaciones a 22°C bajo ciclos diarios de 22 horas de luz 2 horas de oscuridad. La evaluación de la germinación y vigor de los plantones se realiza entre 4 y 14 días después de plantar. El medio basal es medio MS al 50% (Murashige y Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473­ 497).

La germinación también se evalúa en condiciones desfavorables tales como frío (incubando a temperaturas menores de 10°C en lugar de 22°C) o usando disoluciones que inhiben las semillas que contienen altas concentraciones de un osmolito tal como sorbitol (a concentraciones de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, y hasta 1.000 mM) o aplicando concentraciones crecientes de sal (de NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM).

El efecto del transgén en el vigor de la planta, tasa de crecimiento, biomasa, rendimiento y/o contenido de aceite puede determinarse usando métodos conocidos.

Vigor de las plantas - El vigor de las plantas puede calcularse por el incremento en los parámetros de crecimiento, tales como área de las hojas, longitud de las fibras, diámetro de la roseta, peso fresco de la planta y semejantes por tiempo.

Tasa de crecimiento - La tasa de crecimiento puede medirse usando análisis digitales de las plantas en crecimiento. Por ejemplo, pueden capturarse imágenes de las plantas creciendo en invernadero en macetas cada 3 días y el área de la roseta puede calcularse por análisis digital. El crecimiento del área de la roseta se calcula usando la diferencia del área de la roseta entre días de muestreo dividido por la diferencia en días entre las muestras.

La evaluación de la tasa de crecimiento puede hacerse midiendo la biomasa de la planta producida, área de la roseta, tamaño de las hojas o longitud de las raíces por tiempo (puede medirse en cm2 por día de área de las hojas).

El área de crecimiento relativo puede calcularse usando la Fórmula II.

Fórmula II:

Área de tasa de crecimiento relativo= Coeficiente de regresión del área a lo largo del curso temporal. Rendimiento de las semillas - La evaluación del rendimiento de las semillas por planta puede hacerse midiendo la cantidad (peso o tamaño) o cuantía (es decir, número) de semillas secas producidas y recolectadas de 8-16 plantas y dividido por el número de plantas.

Por ejemplo, las semillas totales de 8-16 plantas pueden recogerse, pesarse usando, p. ej., una balanza analítica y el peso total puede dividirse por el número de plantas. El rendimiento de las semillas por área de crecimiento puede calcularse de la misma manera mientras se tiene en cuenta el área de crecimiento dada en una única planta. El incremento en el rendimiento de las semillas por área de crecimiento podría conseguirse incrementando el rendimiento de las semillas por planta, y/o incrementando el número de plantas capaces de crecer en un área dada.

Además, el rendimiento de las semillas puede determinarse a través del peso de 1.000 semillas. El peso de 1.000 semillas puede determinarse como sigue: las semillas se esparcen en una bandeja de vidrio y se hace una fotografía. Cada nuestra se pesa y después, usando el análisis digital, se calcula el número de semillas en cada muestra. El peso de las 1.000 semillas puede calcularse usando la fórmula III:

Fórmula III:

Peso de 1.000 semillas= número de semillas en la muestra / peso de la muestra X 1.000 El Índice de Recolección puede calcularse usando la Fórmula IV

Fórmula IV:

Índice de recolección= rendimiento promedio de las semillas por planta/ peso seco promedio

Concentración de las proteínas de los granos - El contenido de proteínas de los granos (g de proteína en el grano m-2) se estima como el producto de la masa del grano N (g de grano N m-2) multiplicada por la relación de conversión N/proteína de k-5,13 (Mosse 1990, supra). La concentración de proteínas de los granos se estima como la relación del contenido de proteínas de los granos por unidad de masa del grano (g de proteína del grano kg-1 de grano).

Longitud de las fibras - La longitud de las fibras puede medirse usando un fibrógrafo. El sistema de fibrógrafo se usó para computar la longitud en términos de longitud "Media de la Mitad Superior". La media de la mitad superior (UHM) es la longitud promedio de la mitad más larga de la distribución de las fibras. El fibrógrafo mide la longitud en longitudes de tramo a un punto de porcentaje dado (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) cottoninc (punto) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).

Según algunos aspectos de la descripción, el rendimiento incrementado de maíz puede manifestarse como uno o más de los siguientes: incremento en el número de plantas por área de crecimiento, incremento en el número de espigas por planta, incremento en el número de filas por espiga, número de granos por fila de espigas, peso de granos, pero de mil granos (peso de 1.000), longitud/diámetro de la espiga, incremento en el contenido de aceite por grano e incremento en el contenido de almidón por grano.

Como se ha mencionado, el incremento en el rendimiento de una planta puede determinarse por varios parámetros. Por ejemplo, el rendimiento incrementado del arroz puede manifestarse por un incremento en uno o más de los siguientes: número de plantas por área de crecimiento, número de panículos por planta, número de espiguillas por panículo, número de flores por panículo, incremento en la tasa de llenado de las semillas, incremento en el peso de mil granos (peso de 1.000), incremento en el contenido de aceite por semilla, incremento en el contenido de almidón por semilla, entre otros. Un incremento en el rendimiento también puede dar lugar a una arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a una arquitectura modificada.

De forma similar, el rendimiento incrementado de la soja puede manifestarse por un incremento en uno o más de los siguientes: número de plantas por área de crecimiento, número de vainas por planta, número de semillas por vaina, incremento en la tasa de llenado de las semillas, incremento en el peso de mil semillas (peso de 1.000), resquebrajamiento reducido de las vainas, incremento en el contenido de aceite por semilla, incremento en el contenido de proteínas por semilla, entre otros. Un incremento en el rendimiento también puede dar lugar a una arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a una arquitectura modificada.

El rendimiento incrementado de la canola puede manifestarse por un incremento en uno o más de los siguientes: número de plantas por área de crecimiento, número de vainas por planta, número de semillas por vaina, incremento en la tasa de llenado de las semillas, incremento en el peso de mil semillas (peso de 1.000), resquebrajamiento reducido de las vainas, incremento en el contenido de aceite por semilla, entre otros. Un incremento en el rendimiento también puede dar lugar a una arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a una arquitectura modificada.

El rendimiento incrementado del algodón puede manifestarse por un incremento en uno o más de los siguientes: número de plantas por área de crecimiento, número de bellotas por planta, número de semillas por bellota, incremento en la tasa de llenado de las semillas, incremento en el peso de mil semillas (peso de 1.000), incremento en el contenido de aceite por semilla, longitud de las fibras mejorada, resistencia de las fibras, entre otros. Un incremento en el rendimiento también puede dar lugar a una arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a una arquitectura modificada.

Contenido de aceite - El contenido de aceite de una planta puede determinarse por extracción del aceite de la semilla o de la parte vegetativa de la planta. Brevemente, los lípidos (aceite) pueden retirarse de la planta (p. ej., semilla) moliendo el tejido de la planta en presencia de disolventes específicos (p. ej., hexano o éter de petróleo) y extraerse el aceite en un extractor continuo. El análisis indirecto del contenido de aceite puede llevarse a cabo usando varios métodos conocidos, tales como Espectroscopía por Resonancia Magnética Nuclear (RMN), que mide la energía de resonancia absorbida por átomos de hidrógeno en el estado líquido de la muestra [Véase, por ejemplo, Conway TF. y Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Impreso) 1558-9331 (En línea)]; la Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (NI), que utiliza la absorción de la energía del infrarrojo cercano (1.100-2.500 nm) por la muestra; y un método descrito en WO/2001/023884, que se basa en extraer aceite con un disolvente, evaporar el disolvente en una corriente de gas que forma partículas de aceite, y dirigir una luz en la corriente de gas y partículas de aceite que forma una luz reflejada detectable.

Así, la presente descripción tiene un alto valor agrícola para promover el rendimiento de cultivos comercialmente deseados (p. ej., biomasa de órgano vegetativo, tal como madera de álamo, u órgano reproductor, tal como número de semillas o biomasa de las semillas).

Cualquiera de las plantas transgénicas descritas en la presente memoria anteriormente o partes de las mismas puede procesarse para producir un alimento, comida, preparación de proteínas o aceite, tal como para animales rumiantes. Las plantas transgénicas descritas en la presente memoria anteriormente, que presentan un contenido de aceite incrementado pueden usarse para producir aceite de plantas (mediante la extracción del aceite de la planta).

El aceite de las plantas (incluyendo el aceite de las semillas y/o el aceite de las partes vegetativas) producido según el método de la descripción puede combinarse con una variedad de otros ingredientes. Los ingredientes específicos incluidos en un producto se determinan según el uso pretendido. Los productos ejemplares incluyen alimento animal, material bruto para modificación química, plástico biodegradable, producto alimenticio mezclado, aceite comestible, biocombustible, aceite de cocina, lubricante, biodiésel, tentempié, cosméticos, y material bruto para procesos de fermentación. Los productos ejemplares que se van a incorporar en el aceite de las plantas incluyen alimentos animales, productos alimenticios humanos, tales como tentempiés extruidos, panes, como un agente de unión de alimentos, alimentos para acuacultura, mezclas fermentables, suplementos alimenticios, bebidas deportivas, barras alimenticias nutricionales, suplementos con múltiples vitaminas, bebidas dietéticas, y alimentos de cereales.

Según algunas realizaciones de la invención, el aceite comprende un aceite de semillas.

Según algunas realizaciones de la invención, el aceite comprende aceite de una parte vegetativa.

Según algunas realizaciones de la invención, la célula de la planta forma una parte de una planta.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%.

Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye, pero no limitado a".

El término "que consiste en" significa "que incluye y limitado a".

El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y nuevas de la composición, método o estructura reivindicada.

Tal y como se usa en la presente memoria, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias plurales a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

A lo largo de esta solicitud, varias realizaciones de esta invención pueden presentarse en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es meramente por conveniencia y brevedad y no debe considerarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un rango ha descrito específicamente todos los posibles subrangos, así como los valores numéricos individuales en ese rango. Por ejemplo, la descripción de un rango tal como de 1 a 6 debe considerarse que ha descrito específicamente subrangos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales en ese rango, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango. Siempre que se indique un rango numérico en la presente memoria, se quiere decir que incluye cualquier número citado (fraccional o integral) en el rango indicado. Las expresiones "que varía/varía entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varía/varía de" un primer número indicado "a" un segundo número indicado se usan en la presente memoria indistintamente y se quiere decir que incluyen el primer y segundo números indicados y todos los números fraccionales e integrales entre ellos.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para conseguir una tarea dada incluyendo, pero no limitado a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos bien conocidos para, o desarrollados fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por, los expertos en las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

Varias realizaciones y aspectos de la presente invención, como se delinea en la presente memoria anteriormente y como se reivindica en la sección de reivindicaciones más adelante, encuentran un soporte experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora, se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de una forma no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican concienzudamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como las mostradas en las Pat. de EE.UU. Nos. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la bibliografía de patentes y científica, véanse, por ejemplo, las Pat. de EE.UU. Nos.

3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos los cuales se incorporan por referencia como se muestra completamente en la presente memoria. A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos en estos son muy conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.

Métodos experimentales y bioinformáticos generales

Extracción de ARN - Los tejidos crecidos en varias condiciones de crecimiento (como se describe más adelante) se muestrearon y se extrajo el ARN usando el Reactivo TRIzol de Invitrogen [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) invitrogen (punto) com/content (punto)cfm?pageid=469]. Se tomaron aproximadamente 30-50 mg de tejido de las muestras. Los tejidos pesados se molieron usando una mano y mortero en nitrógeno líquido y se resuspendieron en 500 gl de Reactivo TRIzol. Al lisado homogeneizado, se añadieron 100 gl de cloroformo seguido de precipitación usando isopropanol y dos lavados con etanol al 75%. El ARN se eluyó en 30 gl de agua sin ARNasa. Las muestras de ARN se lavaron usando el protocolo de lavado del minikit RNeasy de Qiagen según el protocolo del fabricante (QIAGEN Inc, CA EE.UU.). Por conveniencia, la información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de conjunto de expresión.

Análisis de correlación - se realizó para genes seleccionados según algunas realizaciones de la invención, en el que los parámetros caracterizados (parámetros medidos según las ID de correlación) se usaron como "eje de las x" para correlación con el transcriptoma de tejido que se usó como el "eje de las Y". Para cada gen y parámetro medido, se calculó un coeficiente de correlación "R" (usando la correlación de Pearson) junto con un valor p para la significancia de la correlación. Cuando el coeficiente de correlación (R) entre los niveles de la expresión de un gen en un determinado tejido y un comportamiento fenotípico a lo largo de ecotipos/variedad/híbrido es alto en valor absoluto (entre 0,5-1), hay una asociación entre el gen (específicamente, el nivel de expresión de ese gen) la característica fenotípica (p. ej., eficiencia mejorada en el uso de nitrógeno, tolerancia al estrés abiótico, rendimiento, tasa de crecimiento y semejantes).

Ejemplo 1

Identificación de genes que incrementan la eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE), eficiencia en el uso de fertilizantes (FUE), rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, tolerancia al estrés abiótico (ABST) y/o eficiencia en el uso del agua (WUE) en plantas

Los presentes inventores han identificado polinucleótidos cuya expresión regulada al alza en plantas incrementa la eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE), eficiencia en el uso de fertilizantes (FUE), rendimiento (p. ej., rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, biomasa, cantidad y/o calidad de los granos), tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico (ABST) y/o eficiencia en el uso del agua (WUE) de una planta.

Todos los conjuntos de datos de secuencias de nucleótidos usados aquí se originaron a partir de bases de datos disponibles públicamente o a partir de la realización de secuenciación usando la tecnología Solexa (p. ej., Cebada y Sorgo). Los datos de las secuencias de 100 especies de plantas diferentes se introdujeron en una única base de datos completa. También se incorporó otra información sobre la expresión génica, anotación de proteínas, enzimas y rutas. Las bases de datos principales usadas incluyen:

• Genomas

o Genoma de Arabidopsis [TAIR genome versión 6 (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) arabidopsis (punto) org/)]

o Genoma de arroz [IRGSP build 4.0 (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rgp (punto) dna (punto) affrc (punto) go (punto) jp/IRGSP/)].

o Álamo [Populus trichocarpa lanzamiento 1.1 de JGI (lanzamiento del conjunto v1.0) (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) genome (punto) jgi-psf (punto) org/)]

o Brachypodium [JGI 4x conjunto, Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) brachpodium (punto) org)]

o Soja [DOE-JGI SCP, versión Glyma0 (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) phytozome (punto) net/)]

o Uva [Consorcio Público Franco-Italiano para la Caracterización del genoma de Vid genoma de vid (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) genoscope (punto) ens (punto) fr /)]

o Semilla de ricino [TIGR/J Craig Venter Institute 4x conjunto [(Protocolo de Transferencia de Hipertexto://msc (punto) jcvi (punto) org/r communis]

o Sorgo [DOE-JGI SCP, version Sbil [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) phytozome (punto) net/)].

o Maíz [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://maizesequence (punto) org/]

o Pepino [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://cucumber (punto) genomics (punto) org (punto) cn/page/cucumber/index (punto) jsp]

o Tomate [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://solgenomics (punto) net/tomato/]

o Mandioca [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://www (punto) phytozome (punto) net/cassava (punto) php] • Se extrajeron secuencias de EST y ARNm expresadas de las siguientes bases de datos:

o GenBank (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) ncbi (punto) nlm (punto) nih (punto) gov/Genbank/).

o RefSeq (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) ncbi (punto) nlm (punto) nih (punto) gov/RefSeq/).

o TAIR (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) arabidopsis (punto) org/).

• -Bases de datos de proteínas y rutas

o Uniprot [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) uniprot (punto) org/].

o AraCyc [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) arabidopsis (punto) org/biocyc/index (punto) jsp].

o ENZYME [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://expasy (punto) org/enzyme/].

• Los conjuntos de datos de micromatrices se descargaron de:

o GEO (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)

o TAIR (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web.arabidopsis.org/).

o Datos de micromatrices patentados (Véase, W02008/122980 y los Ejemplos 3-10 más adelante).

• Información de QTL y SNP

o Gramene [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) gramene (punto) org/qtl/].

o Panzea [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) panzea (punto) org/index (punto) html].

o QTL de soja: [Protocolo de Transferencia de Hipertexto:// World Wide Web (punto) sojabreederstoolbox(punto) com/].

Ensamblaje de bases de datos - se realizó para construir una base de datos amplia, rica, con anotación fiable y fácil de analizar comprendida por secuencias disponibles públicamente de secuencias de ARNm genómico, EST ADN, datos de varios cultivos, así como expresión génica, anotación de proteínas y ruta, datos de QTL, y otra información relevante.

El ensamblaje de bases de datos está comprendido por una caja de herramientas de herramientas de refinado de genes, estructuración, anotación y análisis que permiten construir una base de datos personalizada para cada proyecto de descubrimiento de genes. Las herramientas de refinado y estructuración de genes permiten detectar de forma fiable las variantes de corte y empalme y transcritos antisentido, generando un entendimiento de varios resultados fenotípicos potenciales de un único gen. Las capacidades de la plataforma "LEADS" de Compugen LTD para analizar el genoma humano han sido confirmadas y aceptadas por la comunidad científica [véase, p. ej., "Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; "Splicing of Alu Sequences", Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; "Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information", Xie H et al. Genomics 2002], y se ha demostrado que también son muy eficientes en la genómica de plantas.

Agrupación de EST y ensamblaje de genes - Para la agrupación y ensamblaje de genes de organismos con datos de secuencia genómica disponibles (arabidopsis, arroz, ricino, uva, brachypodium, álamo, soja, sorgo), se empleó la versión de LEADS genómica (GANG). Esta herramienta permite una agrupación más exacta de las EST y secuencias de ARNm en el genoma, y predice la estructura génica, así como los eventos de corte y empalme alternativos y trascripción antisentido.

Para los organismos con datos de secuencia genómica completa disponibles, se aplicó el software de agrupamiento "LEADS expresado".

Anotación génica - Los genes y proteínas predichos se anotaron como sigue: Se realizó una búsqueda en blast de secuencias [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://blast (punto) ncbi (punto) nlm (punto) nih (punto) gov /Blast (punto) cgi] frente a UniProt de todas las plantas [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) uniprot (punto) org/]. Se analizaron los marcos de lectura abiertos de cada transcrito potencial y los ORF más largos con el mayor número de homólogos se seleccionaron como proteína predicha del transcrito. Las proteínas predichas se analizaron por InterPro [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) ebi (punto) ac (punto) uk/interpro/].

Se usó blast frente a proteínas de las bases de datos AraCyc y ENZYME para mapear los transcritos predichos con las rutas de AraCyc.

Las proteínas predichas de diferentes especies se compararon usando el algoritmo de blast [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) ncbi (punto) nlm (punto) nih (punto) gov /Blast (punto) cgi] para validar la exactitud de la secuencia de proteína predicha, y para la detección eficiente de ortólogos.

Perfilado de la expresión génica - Se explotaron varias fuentes de datos para el perfilado de la expresión génica, concretamente datos de micromatrices y perfil de expresión digital (véase más adelante). Según el perfil de expresión génica, se realizó un análisis de correlación para identificar los genes que están coregulados en diferentes estadios de desarrollo y condiciones ambientales y que están asociados con diferentes fenotipos.

Se descargaron conjuntos de datos de micromatrices públicamente disponibles de los sitios TAIR y NCBI GEO, se renormalizaron, y se integraron en la base de datos. El perfilado de la expresión es uno de los recursos de datos más importantes para identificar genes importantes para el rendimiento.

Se compiló un resumen del perfil de expresión digital para cada agrupación según todas las palabras clave incluidas en los registros de las secuencias que comprenden la agrupación. La expresión digital, también conocida como T ransferencia Northern electrónica, es una herramienta que presenta el perfil de expresión virtual sobre la base de las secuencias EST que forman la agrupación génica. La herramienta proporciona el perfil de expresión de una agrupación en términos de anatomía de la planta (p. ej., el tejido/órgano en el que se expresa el gen), estadio de desarrollo (los estadios de desarrollo en los que puede encontrarse un gen) y el perfil del tratamiento (proporciona las condiciones fisiológicas bajo las cuales se expresa un gen, tales como sequía, frío, infección por patógenos, etc). Dada una distribución aleatoria de EST en las diferentes agrupaciones, la expresión digital proporciona un valor de probabilidad que describe la probabilidad de que una agrupación que tiene un total de N EST contenga X EST de una determinada colección de bibliotecas. Para los cálculos de probabilidad, se tiene en cuenta lo siguiente: a) el número de EST en la agrupación, b) el número de EST de las bibliotecas implicadas y relacionadas, c) el número global de EST disponibles que representan la especie. Por lo tanto, las agrupaciones con valores de probabilidad más bajos están altamente enriquecidas con EST del grupo de bibliotecas de interés que indican una expresión especializada.

Recientemente, la exactitud de este sistema ha sido demostrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) en: Plant & Animal Genomes XVII Conference, San Diego, CA. Se realizó el análisis transcriptómico, sobre la base de la abundancia relativa de EST en los datos, por 454 pirosecuenciación de ADNc que representa ARNm del fruto del melón. Se secuenciaron catorce muestras de ADNc bicatenario obtenidas de dos genotipos, dos tejidos de fruto (carne y corteza) y cuatro estadios de desarrollo. La pirosecuenciación GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de muestras de ADNc no normalizadas y purificadas rindió 1.150.657 etiquetas de secuencia expresada (EST) que se ensamblaron en 67.477 unigenes (32.357 singletones y 35.120 cóntigos). El análisis de los datos obtenidos frente a la base de datos Cucurbit Genomics [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) icugi (punto) org/] confirmó la exactitud de la secuenciación y ensamblaje. Los patrones de expresión de genes seleccionados se ajustaron bien con sus datos de qRT PCR.

Globalmente, se identificaron 257 genes que tenían un impacto importante en la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento (p. ej., rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, cantidad y/o calidad de los granos), tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua cuando se incrementa la expresión de los mismos en plantas. Los genes identificados, sus secuencias de polinucleótidos y polipéptidos curados, así como sus secuencias actualizadas según la base de datos GenBank se resumen en la Tabla 1, en la presente memoria más adelante.

Tabla 1

Polinucleótidos identificados para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta

Tabla 1. "Polip."= polipéptido; "Polin." - Polinucleótido.

Ejemplo 2

Identificación de secuencias homólogas que incrementan la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua en plantas

Los conceptos de ortología y paralogía se han aplicado recientemente a caracterizaciones y clasificaciones funcionales en la escala de comparaciones de genomas completos. Los ortólogos y parálogos constituyen dos tipos principales de homólogos: Los primeros evolucionaron de un ancestro común por especialización, y los últimos están relacionados por eventos de duplicación. Se asume que es probable que los parálogos que surgen de eventos antiguos de duplicación han divergido en función, mientras que es más probable que los ortólogos verdaderos retengan una función idéntica durante el tiempo evolutivo.

Para investigar e identificar adicionalmente ortólogos potenciales de los genes que afectan la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento (p. ej., rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, biomasa, cantidad y/o calidad de los granos), tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua, todas las secuencias se alinearon usando BLAST (/Basic Local Alignment Search Tool/). Las secuencias suficientemente similares se agruparon de forma tentativa. Estos ortólogos potenciales se organizaron adicionalmente bajo un Filograma - un diagrama ramificado (árbol) que se asume que es una representación de las relaciones evolutivas entre los taxones biológicos. Los grupos de ortólogos potenciales se analizaron según su concordancia con el filograma y, en el caso de ausencia de concordancia, estos grupos de ortólogos se rompieron de acuerdo con esto. Los datos de expresión se analizaron y las bibliotecas de EST se clasificaron usando un vocabulario fijado de términos personalizado, tales como estadios de desarrollo (p. ej., genes que muestran un perfil de expresión similar a lo largo del desarrollo con regulación al alza en un estadio específico, tal como en el estadio de llenado de las semillas) y/o órgano de la planta (p. ej., genes que muestran un perfil de expresión similar a lo largo de sus órganos con regulación al alza en órganos específicos, tales como la semilla). Las anotaciones de todas las EST agrupadas en un gen se analizaron estadísticamente comparando su frecuencia en la agrupación frente a su abundancia en la base de datos, lo que permite la construcción de un perfil de expresión numérico y gráfico de ese gen, que se denomina "expresión digital". La base racional de usar estos dos métodos complementarios con métodos de estudios de asociación fenotípica de QTL, SNP y correlación de la expresión fenotípica se basa en la asunción de que es probable que los ortólogos verdaderos retengan una función idéntica durante el tiempo evolutivo. Estos métodos proporcionan diferentes conjuntos de indicaciones sobre las similitudes de función entre dos genes homólogos, similitudes en el nivel de secuencia - aminoácidos idénticos en los dominios de proteínas y similitudes en los perfiles de expresión.

La búsqueda e identificación de genes homólogos implica el cribado de la información de secuencias disponible, por ejemplo, en bases de datos públicas, que incluyen, pero no están limitadas a, la base de datos de ADN de Japón (DDBJ), Genbank, y la base de datos de secuencias de ácidos nucleicos del European Molecular Biology Laboratory (EMBL) o versiones de la misma o la base de datos MIPS. Se han desarrollado varios algoritmos de búsqueda diferentes, incluyendo, pero no limitado a, el paquete de programas referido como programas BLAST. Hay cinco implementaciones de BLAST, tres diseñadas para búsquedas de secuencias de nucleótidos (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX) y dos diseñadas para búsquedas de secuencias de proteínas (BLASTP y TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, 1: 543, 1997). Dichos métodos implican el alineamiento y comparación de secuencias. El algoritmo BLAST calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Centre for Biotechnology Information. Otros de dichos softwares o algoritmos son GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de concordancias y minimiza el número de huecos.

Los genes homólogos pueden pertenecer a la misma familia de genes. El análisis de una familia de genes puede llevarse a cabo usando análisis de similitud de secuencia. Para realizar este análisis, se pueden usar programas estándar para alineamientos múltiples, p. ej., Clustal W. Puede usarse un árbol de unión de vecinos de las proteínas homólogas a los genes de algunas realizaciones de la invención para proporcionar una visión global de relaciones estructurales y ancestrales. La identidad de secuencia puede calcularse usando un programa de alineamiento como se ha descrito anteriormente. Se espera que otras plantas portarán un gen funcional similar (ortólogo) o una familia de genes similar y estos genes proporcionarán el mismo fenotipo preferido que los genes presentados aquí. Ventajosamente, estos miembros de la familia pueden ser útiles en los métodos de algunas realizaciones de la invención. Los ejemplos de otras plantas incluyen, pero no están limitados a, cebada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), maíz (Zea mays), algodón (Gossypium), Semilla de colza (Brassica napus), Arroz (Oryza sativa), Caña de azúcar (Saccharum officinarum), Sorgo (Sorghum bicolor), Soja (Glycine max), Girasol (Helianthus annuus), Tomate (Lycopersicon esculentum) y Trigo (Triticum aestivum).

Los análisis mencionados anteriormente para la homología de secuencia se llevan a cabo preferiblemente en una secuencia de longitud completa, pero también pueden estar basados en una comparación de determinadas regiones, tales como dominios conservados. La identificación de dichos dominios, también estará en el ámbito del experto en la técnica e implicará, por ejemplo, un formato legible por ordenador de los ácidos nucleicos de algunas realizaciones de la invención, el uso de programas de software de alineamiento y el uso de información públicamente disponible sobre dominios de proteínas, restos y cajas conservadas. Esta información está disponible en las bases de datos PRODOM (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) biochem (punto) ucl (punto) ac (punto) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (punto) html), PIR (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://pir (punto) Georgetown (punto) edu/) o Pfam (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) sanger (punto) ac (punto) uk/Software/Pfam/). Los programas de análisis de secuencias diseñados para la búsqueda de restos pueden usarse para la identificación de fragmentos, regiones y dominios conservados como se ha mencionado anteriormente. Los programas informáticos preferidos incluyen, pero no están limitados a, MEME, SIGNALSCAN, y GENESCAN.

Un experto en la técnica puede usar las secuencias homólogas proporcionadas en la presente memoria para encontrar secuencias similares en otras especies y otros organismos. Los homólogos de una proteína engloban, péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos respecto a la proteína en cuestión no modificada y que tienen una actividad biológica y funcional similar que la proteína no modificada de la que derivan. Para producir dichos homólogos, los aminoácidos de la proteína pueden reemplazarse por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (cambios conservativos, tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad similares, propensión a formar o romper estructuras de a-hélice o de 3 láminas). Las Tablas de sustituciones conservativas son muy conocidas en la técnica [véase, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company]. Los homólogos de un ácido nucleico engloban ácidos nucleicos que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de nucleótidos respecto al ácido nucleico en cuestión no modificado y que tienen una actividad biológica y funcional similar que el ácido nucleico no modificado del que derivan.

Se identificaron polinucleótidos y polipéptidos con homología significativa con los genes identificados descritos en la Tabla 1 (Ejemplo 1 anterior) a partir de las bases de datos usando software BLAST usando los algoritmos Blastp y tBlastn. Las secuencias de polipéptidos de búsqueda fueron las SEQ ID NO: 468-706 (que están codificadas por los polinucleótidos de las SEQ ID NO: 1-257, mostrado en la Tabla 1 anterior) y las SEQ ID NO: 707-784 (que están codificadas por los genes clonados de SEQ ID NO: 258-467, mostrado en la Tabla 59 y las secuencias homólogas identificadas se proporcionan en la Tabla 2, a continuación.

Tabla 2

Homólogos de los genes/polipéptidos identificados para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, rendimiento de las semillas, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta

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Tabla 2: Se proporcionan los polipéptidos y polinucleótidos homólogos de los genes identificados en la Tabla 1 y de sus genes clonados, que pueden incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, rendimiento de las semillas, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, calidad de las fibras, longitud de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta. Se calculó la homología como el % de identidad sobre las secuencias alineadas. Las secuencias de búsqueda fueron las secuencias de polipéptido SEQ ID NO: 468-706, y 707-784 y las secuencias objeto son las secuencias de polipéptido o secuencias de polinucleótido que se tradujeron dinámicamente en los seis marcos de lectura identificados en la base de datos sobre la base de una identidad mayor del 80% con las secuencias de polipéptido de búsqueda.

"Polip." = polipéptido; "Polin." - Polinucleótido. Algor. = Algoritmo. "globlastp" homología global usando blastp; "glotblastn" - homología global usando tblastn. "Hom." homólogo.

El resultado de la estrategia de genómica funcional descrita en la presente memoria es un conjunto de genes con una predicción alta de mejorar la eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, rendimiento de las semillas, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, rendimiento de fibras, longitud de las fibras, calidad de las fibras, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta mediante el incremento de su expresión.

Aunque se predice que cada gen tiene su propio impacto, se espera que la modificación del modo de expresión de más de un gen o producto génico (ARN, polipéptido) proporcione un efecto aditivo o sinérgico en el rasgo deseado (p. ej., eficiencia en el uso de nitrógeno, eficiencia en el uso de fertilizantes, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia en el uso del agua de una planta). La alteración de la expresión de cada gen descrito aquí solo o de un conjunto de genes conjuntamente, incrementa el rendimiento global y/u otros rasgos agronómicos importantes, por lo tanto, se espera que incremente la productividad agrícola.

Ejemplo 3

Producción del transcriptoma de Arabidopsis y análisis de correlación de alto rendimiento usando la micromatriz de oligonucleótidos 44k de Arabidopsis

Con el fin de producir un análisis de correlación de alto rendimiento que compare el fenotipo de la planta y el nivel de expresión génica, los presentes inventores utilizaron una micromatriz de oligonucleótidos de Arabidopsis, producida por Agilent Technologies [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) chem (punto) agilent (punto) com/Scripts/PDS (punto) asp?lPage=50879]. La matriz de oligonucleótidos representa aproximadamente 44.000 genes y transcritos de Arabidopsis. Para definir las correlaciones entre los niveles de expresión de ARN con NUE, componentes de rendimiento o parámetros relacionados con el vigor, se analizaron varias características de las plantas de 14 ecotipos diferentes de Arabidopsis. Entre ellos, diez ecotipos que engloban la varianza observada se seleccionaron para el análisis de la expresión de ARN. La correlación entre los niveles de ARN y los parámetros caracterizados se analizó usando el ensayo de la correlación de Pearson [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) davidmlane (punto) com/hyperstat/A34739 (punto) html].

Procedimientos experimentales

Tejidos de Arabidopsis analizados - Se muestrearon dos tejidos de plantas [hojas y tallos] crecidas a dos niveles diferentes de fertilización de nitrógeno (nitrógeno 1,5 mM o nitrógeno 6 mM) y se extrajo el ARN como se ha descrito anteriormente. La información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de Conjunto como se resume en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Conjuntos experimentales de transcriptoma de Arabidopsis

Tabla 3.

Evaluación de los componentes del rendimiento y los parámetros relacionados con el vigor de Arabidopsis en diferentes niveles de fertilización de nitrógeno - Se crecieron en un invernadero 10 accesiones de Arabidopsis en 2 parcelas repetitivas, conteniendo cada una 8 plantas por parcela. El protocolo de crecimiento usado fue como sigue: se sembraron semillas esterilizadas en superficie en tubos Eppendorf que contenían 0,5 x medio salino basal Murashige-Skoog y se crecieron a 23°C bajo ciclos diarios de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad durante 10 días. Después, las plántulas con un tamaño similar se transfirieron cuidadosamente a macetas llenas con una mezcla de perlita y turba en una relación 1:1. Se consiguieron condiciones limitantes de nitrógeno constantes mediante la irrigación de las plantas con una disolución que contenía nitrógeno inorgánico 1,5 mM en la forma de KNO³, suplementado con CaCl²2 mM, KH²PO⁴ 1,25 mM, MgSO4 1,50 mM, KCl 5 mM, H³BO³0,01 mM y microelementos, mientras se consiguieron condiciones de irrigación normales aplicando una disolución de nitrógeno inorgánico 6 mM también en la forma de KNO³, suplementado con CaCl²2 mM, KH²PO⁴1,25 mM, MgSO41,50 mM, H³BO³0,01 mM y microelementos. Para seguir el crecimiento de las plantas, se fotografiaron bandejas el día en el que se iniciaron las condiciones limitantes de nitrógeno y posteriormente cada 3 días durante aproximadamente 15 días adicionales. El área de roseta de las plantas se determinó entonces a partir de las imágenes digitales. Se usó el software ImageJ para cuantificar el tamaño de las plantas a partir de las imágenes digitales [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsb (punto) info (punto) nih (punto) gov/ij/] utilizando secuencias de comandos patentados diseñadas para analizar el tamaño del área de la roseta de plantas individuales como una función del tiempo. El sistema de análisis de las imágenes incluyó un ordenador personal de escritorio (procesador Intel P43.0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.37 (programa de procesamiento de imágenes basado en Java, que se desarrolló en los U.S. National Institutes of Health y que está disponible libremente en internet [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (punto) nih (punto) gov/]. A continuación, los datos analizados se guardaron en archivos de texto y se procesaron usaron el software de análisis estadístico JMP (SAS institute).

Los parámetros de los datos recogidos se resumen en la Tabla 4, a continuación, en la presente memoria.

Tabla 4

Parámetros correlacionados de Arabidopsis (vectores)

Tabla 4. "N" = Nitrógeno a las concentraciones indicadas; "gr." = gramos; "SPAD" = niveles de clorofila; "t50" = tiempo en el que ha florecido el 50% de las plantas; "gr/unidad de SPAD"= biomasa de la planta expresada en gramos por unidad de nitrógeno en la planta medida por SPAD. "DW"= peso seco de la planta; "nivel de N /DW"= nivel de nitrógeno de la planta medido en unidad de SPAD por biomasa de la planta [gr]; "DW/nivel de N"= biomasa de la planta por planta [gr]/unidad de SPAD;

Evaluación de NUE, componentes del rendimiento y parámetros relacionados con el vigor - Se crecieron diez ecotipos de Arabidopsis en bandejas, conteniendo cada una 8 plantas por parcela, en un invernadero con condiciones de temperatura controlada durante aproximadamente 12 semanas. Las plantas se irrigaron con diferentes concentraciones de nitrógeno como se ha descrito anteriormente dependiendo del tratamiento aplicado. Durante este tiempo, los datos se recogieron, se documentaron y se analizaron. La mayor parte de los parámetros elegidos se analizaron por imagenología digital.

Imagenología digital - Ensayo en invernadero

Se usó un sistema de adquisición de imágenes, que consiste en una cámara réflex digital (Canon EOS 400D) equipada con una lente de longitud focal 55 mm (serie Canon EF-S) situada en un montaje de aluminio personalizado, para capturar imágenes de las plantas plantadas en contenedores en un invernadero con ambiente controlado. El proceso de captura de imágenes se repite cada 2-3 días empezando en el día 9-12 hasta el día 16-19 (respectivamente) desde el trasplante.

Se usó un sistema de procesamiento de imágenes, que consiste en un ordenador de escritorio personal (procesador Intel P43.0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.37, software de procesamiento de imágenes basado en Java, que se desarrolló en los U.S. National Institutes of Health y está públicamente disponible en internet en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (punto) nih (punto) gov/. Las imágenes se capturaron con una resolución de 10 Mega Píxeles (3888x2592 píxeles) y se almacenaron en un formato JPEG de baja compresión (estándar Joint Photographic Experts Group). A continuación, los datos resultantes del procesamiento de las imágenes se guardaron como archivos de texto y se analizaron usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute).

Análisis de las hojas - Usando el análisis digital, se calcularon datos de las hojas, incluyendo número de hojas, área de la lámina foliar, diámetro y área de la roseta.

Tasa de área de crecimiento relativo: Se calculó la tasa de crecimiento relativo de la roseta y de las hojas según la Fórmula II como se ha descrito anteriormente.

Rendimiento de las semillas y peso de 1.000 semillas - Al final del experimento, todas las semillas de todas las parcelas se recogieron y se pesaron con el fin de medir el rendimiento de las semillas por planta en términos de peso total de las semillas por planta (gr). Para el cálculo del peso de 1.000 semillas, se midió un peso promedio de 0,02 gramos de cada muestra, las semillas se esparcieron en una bandeja de vidrio y se hizo una fotografía. Usando el análisis digital, se calculó el número de semillas en cada muestra.

Peso seco y rendimiento de las semillas - Al final del experimento, las plantas se recolectaron y se dejaron secar a 30°C en una cámara de secado. La biomasa se separó de las semillas, se pesó y se dividió por el número de plantas. Peso seco= peso total de la parte vegetativa aérea (excluyendo las raíces) después de secado a 30°C en una cámara de secado.

Índice de recolección - El índice de recolección se calculó usando la Fórmula IV como se ha descrito anteriormente.

T⁵⁰ en días hasta la floración - Cada una de las repeticiones se monitorizó para determinar la fecha de floración. Los días de floración se calcularon a partir de la fecha de la siembra hasta que floreció el 50% de las parcelas.

Nivel de nitrógeno en las plantas - El contenido de clorofila de las hojas es un buen indicador del estado de nitrógeno de las plantas, ya que el grado de verdor de las hojas está altamente correlacionado con este parámetro. El contenido de clorofila se determinó usando un medidor de clorofila Minolta SPAD 502 y la medición se realizó en el momento de la floración. Las lecturas del medidor SPAD se hicieron en hojas jóvenes completamente desarrolladas. Se hicieron tres mediciones por hoja por parcela. Sobre la base de esta medición, se calcularon parámetros tales como la relación entre el rendimiento de las semillas por unidad de nitrógeno [rendimiento de las semillas/nivel de N= rendimiento de las semillas por planta [gr]/unidad de SPAD], DW de la planta por unidad de nitrógeno [DW/nivel de N= biomasa de la planta por planta [g]/unidad de SPAD], y nivel de nitrógeno por gramo de biomasa [nivel de N/DW= unidad de SPAD/biomasa de la planta por planta (gr)].

Reducción del porcentaje de rendimiento de las semillas - mide la cantidad de semillas obtenidas en plantas cuando se crecen en condiciones limitantes de nitrógeno en comparación con el rendimiento de las semillas producidas a niveles normales de nitrógeno expresado en %.

Resultados experimentales

Se crecieron 10 accesiones diferentes de Arabidopsis (ecotipos) y se caracterizaron para 37 parámetros como se ha descrito anteriormente. El promedio de cada uno de los parámetros medidos se calculó usando el software JMP y los valores se resumen en la Tabla 5 a continuación. Se realizó el análisis de correlación posterior entre los varios conjuntos de transcriptoma (Tabla 3) y los parámetros medidos (Tablas 6 y 7 a continuación). A continuación, se presentan los resultados integrados en la base de datos.

Tabla 5

Parámetros medidos en accesiones de Arabidopsis

Tabla 5. Se proporcionan los parámetros medidos bajo varios tratamientos en varios ecotipos (accesiones de Arabidopsis).

Tabla 6

Correlación entre el nivel de expresión de genes LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico bajo condiciones de fertilización con niveles normales o bajos de nitrógeno en accesiones de Arabidopsis

Tabla 6. "ID del Conjunto de Correl. " - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Tabla 7

Correlación entre el nivel de expresión de genes ortólogos LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico bajo condiciones de fertilización con niveles normales o bajos de nitrógeno en accesiones de Arabidopsis

Tabla 7. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Ejemplo 4

Producción del transcriptoma de arroz usando la micromatriz de oligonucleótidos 44k de arroz

Con el fin de producir el análisis de expresión diferencial de plantas de arroz sometidas a condiciones limitantes de nitrógeno en comparación con condiciones normales (no limitantes) de nitrógeno, los presentes inventores han utilizado una micromatriz de oligonucleótidos de arroz, producida por Agilent Technologies [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) chem. (punto) agilent (punto) com/Scripts/PDS (punto) asp?lPage=50879]. La matriz de oligonucleótidos representa aproximadamente 44.000 genes y transcritos de arroz.

Procedimientos experimentales

Evaluación de plantas de arroz crecidas bajo diferentes niveles de fertilización de nitrógeno - Se crecieron cinco accesiones de arroz en 3 parcelas repetitivas, conteniendo cada una 10 plantas, en una casa malla en condiciones semi-hidropónicas. Brevemente, el protocolo de crecimiento fue como sigue: se sembraron semillas de arroz en bandejas llenas con una mezcla de vermiculita y turba en una relación 1:1. Se consiguieron condiciones limitantes de nitrógeno constantes mediante la irrigación de las plantas con una disolución que contenía nitrógeno inorgánico 0,8 mM en la forma de KNO³, suplementado con KH²PO⁴ 1 mM, MgSO4 1 mM, K²SO⁴ 3,6 mM y microelementos, mientras se consiguieron niveles normales de nitrógeno aplicando una disolución de nitrógeno inorgánico 8 mM también en la forma de KNO³, con KH²PO⁴1 mM, MgSO41 mM, y microelementos.

Tejidos de arroz analizados - Las 5 variedades de arroz seleccionadas se combinaron en 1 lote para cada tratamiento. Dos tejidos [hojas y raíces] crecidos en dos niveles diferentes de fertilización de nitrógeno, nitrógeno 0,8 mM (condiciones limitantes de nitrógeno) o nitrógeno 8 mM (condiciones normales de nitrógeno), se muestrearon y se extrajo el ARN como se ha descrito anteriormente. Por conveniencia, la información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de conjunto como se resume en la Tabla 8 a continuación.

Tabla 8

Conjuntos experimentales de transcriptoma de arroz

Tabla 8.

Resultados experimentales

La regulación génica al alza bajo niveles reducidos de fertilización de nitrógeno indica la implicación de los genes en la mejora de NUE. LNU116, LNU117, LNU118, LNU119, LNU120, LNU216, LNU217 y LNU276 estaban regulados al alza en el Conjunto con ID C en comparación con su nivel de expresión en el Conjunto con ID D. Además, LNU116, LNU121, LNU176, LNU216, LNU217, LNU276 estaban regulados al alza en el Conjunto con ID A en comparación con su nivel de expresión en el Conjunto con ID B.

Ejemplo 5

Producción del transcriptoma de Arabidopsis y análisis de correlación de alto rendimiento del rendimiento, biomasa y/o parámetros relacionados con el vigor usando micromatriz de oligonucleótidos de genoma completo 44k de Arabidopsis

Con el fin de producir un análisis de correlación de alto rendimiento que compare el fenotipo de la planta y el nivel de expresión génica, los presentes inventores utilizaron una micromatriz de oligonucleótidos de Arabidopsis thaliana, producida por Agilent Technologies [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) chem. (punto) agilent (punto) com/Scripts/PDS (punto) asp?lPage=50879]. La matriz de oligonucleótidos representa aproximadamente 40.000 genes y transcritos de A. thaliana diseñados sobre la base de los datos de la base de datos TIGR ATHI v.5 y las bases de datos Arabidopsis MPSS (Universidad de Delaware). Para definir las correlaciones entre los niveles de expresión de ARN y rendimiento, componentes de biomasa o parámetros relacionados con el vigor, se analizaron varias características de las plantas de 15 ecotipos diferentes de Arabidopsis. Entre ellos, nueve ecotipos que engloban la varianza observada se seleccionaron para el análisis de la expresión de ARN. La correlación entre los niveles de ARN y los parámetros caracterizados se analizó usando el ensayo de la correlación de Pearson [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) davidmlane (punto) com/hyperstat/A34739 (punto) html].

Procedimientos experimentales

Tejidos de Arabidopsis analizados - Se muestrearon cinco tejidos en diferentes estadios de desarrollo incluyendo raíz, hoja, flor en antesis, semilla a los 5 días después de la floración (DAF) y semilla a 12 DAF, que representan diferentes características de las plantas y se extrajo el ARN como se ha descrito anteriormente. La información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de Conjunto como se resume en la Tabla 9 a continuación.

Tabla 9

Tejidos usados para los conjuntos de expresión de transcriptoma de Arabidopsis

Tabla 9: Se proporcionan las letras de identificación (ID) de cada uno de los conjuntos de expresión de Arabidopsis (A-E). DAF = días después de la floración.

Evaluación de los componentes del rendimiento y parámetros relacionados con el vigor - Ocho de los nueve ecotipos de Arabidopsis se usaron en cada uno de 5 bloques repetitivos (denominados A, B, C, D y E), conteniendo cada uno 20 plantas por parcela. Las plantas se crecieron en un invernadero en condiciones controladas a 22°C, y se añadió el fertilizante N:P:K (20:20:20; relaciones en peso) [nitrógeno (N), fósforo (P) y potasio (K)]. Durante este tiempo, los datos se recogieron, se documentaron y se analizaron. Se recogieron datos adicionales a lo largo del estadio de plántula de plantas crecidas en un cultivo tisular en placas de agar transparente de crecimiento vertical. La mayor parte de los parámetros elegidos se analizaron por imagenología digital.

Imagenología digital en cultivo tisular - Se usó un sistema de adquisición de imágenes de laboratorio para capturar imágenes de plántulas sembradas en placas de agar cuadradas. El sistema de adquisición de imágenes consiste en una cámara réflex digital (Canon EOS 300D) equipada con una lente de longitud focal 55 mm (serie Canon EF-S), montada en un dispositivo de reproducción (Kaiser RS), que incluyó 4 unidades de luz (4x bombillas de 150 Watios) y localizado en una habitación oscura.

Imagenología digital en invernadero - El proceso de captura de imágenes se repitió cada 3-4 días empezando el día 7 hasta el día 30. Se usó la misma cámara equipada con una lente de longitud focal 24 mm (serie Canon EF), situada en un montaje de hierro personalizado, para capturar imágenes de las plantas mayores sembradas en contenedores blancos en un invernadero con ambiente controlado. Los contenedores blancos tenían una forma cuadrada con medidas de 36 x 26,2 cm y 7,5 cm de profundidad. Durante el proceso de captura, los contenedores se pusieron debajo del montaje de hierro, mientras se evitaba la luz directa del sol y casting de sombras. Este proceso se repitió cada 3­ 4 días durante hasta 30 días.

Se usó un sistema de análisis de imágenes, que consiste en un ordenador personal de escritorio (procesador Intel P43.0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.37, programa de procesamiento de imágenes basado en Java, que se desarrolló en los U.S National Institutes of Health y está públicamente disponible en internet en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (punto) nih (punto) gov/. Las imágenes se capturaron con una resolución de 6 Mega Píxeles (3.072 x 2.048 píxeles) y se almacenaron en un formato JPEG de baja compresión (estándar Joint Photographic Experts Group). A continuación, los datos analizados se guardaron como archivos de texto y se procesaron usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute).

Análisis de las hojas - Usando el análisis digital, se calcularon datos de las hojas, incluyendo número, área, perímetro, longitud y anchura de las hojas. En el día 30, se eligieron 3-4 plantas representativas de cada parcela de los bloques A, B y C. Las plantas se diseccionaron, cada hoja se separó y se introdujo entre dos bandejas de vidrio, se hizo una foto de cada planta y se calcularon los distintos parámetros (tales como área total de la hoja, longitud laminar etc.) a partir de las imágenes. La circularidad de la lámina se calculó como anchura laminar dividida por longitud laminar.

Análisis de las raíces - Durante 17 días, se crecieron los diferentes ecotipos en placas de agar transparentes. Las placas se fotografiaron cada 3 días empezando el día 7 en la habitación de fotografía y el desarrollo de las raíces se documentó (véanse los ejemplos en las Figuras 3A-F). La tasa de crecimiento de las raíces se calculó según la Fórmula V.

Fórmula V: tasa de crecimiento relativo de la cobertura de las raíces= coeficiente de regresión de la cobertura de las raíces a lo largo del curso temporal.

Análisis de la tasa de crecimiento vegetativo - se calculó según la Fórmula VI. El análisis se terminó con la aparición de plantas superpuestas.

Fórmula VI Área de tasa de crecimiento vegetativo relativo= coeficiente de regresión del área vegetativa a lo largo del curso temporal.

Para la comparación entre ecotipos, la tasa calculada se normalizó usando el estadio de desarrollo de las plantas como se representa por el número de hojas verdaderas. En los casos en los que las plantas con 8 hojas se habían muestreado dos veces (por ejemplo, en el día 10 y día 13), solo se eligió la muestra mayor y se añadió a la comparación por Anova.

Análisis de semillas en la silicuas - En el día 70, se recogieron 15-17 silicuas de cada parcela en los bloques D y E. Las silicuas elegidas tenían un color marrón claro, pero estaban todavía intactas. Las silicuas se abrieron en la habitación de fotografía y las semillas se esparcieron en una bandeja de vidrio, se hizo una fotografía digital de alta resolución de cada parcela. Usando las imágenes, se determinó el número de semillas por solicua.

Peso promedio de las semillas - Al final del experimento, se recogieron todas las semillas de las parcelas de los bloques A-C. Se midió un peso promedio de 0,02 gramos de cada muestra, las semillas se esparcieron en una bandeja de vidrio y se hizo una fotografía. Usando el análisis digital, se calculó el número de semillas en cada muestra. Porcentaje de aceite en las semillas - Al final del experimento, se recogieron todas las semillas de las parcelas de los bloques A-C. Las semillas Columbia de 3 parcelas se mezclaron, se molieron y después se montaron en la cámara de extracción. Se usaron como disolvente 210 ml de n-Hexano (No. de Cat. 080951 Biolab Ltd.). La extracción se realizó durante 30 horas a calor medio de 50°C. Una vez terminó la extracción, el n-Hexano se evaporó usando el evaporador a 35°C y en condiciones de vacío. El proceso se repitió dos veces. La información obtenida del extractor Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) se usó para crear una curva de calibración para la RMN de baja resonancia. El contenido de aceite de todas las muestras de semillas se determinó usando la RMN de baja resonancia (MARAN Ultra- Oxford Instrument) y su paquete de software MultiQuant.

Análisis de la longitud de las silicuas - En el día 50 desde la siembra, se muestrearon 30 silicuas de diferentes plantas en cada parcela en el bloque A. Las silicuas elegidas tenían un color verde amarillento y se recogieron de las partes inferiores del tallo de una planta crecida. Se hizo una fotografía digital para determinar la longitud de las silicuas. Peso seco y rendimiento de las semillas - En el día 80 desde la siembra, las plantas de los bloques A-C se recolectaron y se dejaron secar a 30°C en una cámara de secado. La biomasa y el peso de las semillas de cada parcela se separaron, se midieron y se dividieron por el número de plantas. Peso seco= peso total de la parte vegetativa aérea (excluyendo las raíces) después de secar a 30°C en una cámara de secado; Rendimiento de las semillas por planta= peso total de las semillas por planta (gr).

Rendimiento de aceite - El rendimiento de aceite se calculó usando la Fórmula VII.

Fórmula VII: Rendimiento de aceite de las semillas= rendimiento de las semillas por planta (gr) * % de aceite en las semillas.

Índice de recolección (semilla) - El índice de recolección se calculó usando la Fórmula IV (descrita anteriormente). Resultados experimentales

Se crecieron nueves ecotipos diferentes de Arabidopsis y se caracterizaron para 18 parámetros (denominados como vectores).

Tabla 10

Parámetros correlacionados de Arabidopsis (vectores)

Tabla 10. Se proporcionan los parámetros correlacionados de Arabidopsis (ID de correlación Nos. 1-18).

Abreviaturas: Cm = centímetro(s); gr = gramo(s); mg = milígramo(s).

Los valores caracterizados se resumen en la Tablas 11 y 12 a continuación.

Tabla 11

Parámetros medidos en ecotipos de Arabidopsis

Tabla 11. Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros medidos en ecotipos de Arabidopsis: 15= Rendimiento de las semillas por planta (gramo); 16= rendimiento de aceite por planta (mg); 12= % de aceite por semilla; 11= peso de 1.000 semillas (gr); 5= materia seca por planta (gr); 17= índice de recolección; 10= área total de las hojas por planta (cm); 13= semillas por silicua; 14= longitud de las silicuas (cm).

Tabla 12

Parámetros adicionales medidos en ecotipos de Arabidopsis

Tabla 12. Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros medidos en ecotipos de Arabidopsis: 6= tasa de crecimiento vegetativo (cm2/día) hasta 8 hojas verdaderas; 3= crecimiento relativo de la raíz (cm/día) (día 13); 2= longitud de la raíz día 7 (cm); 1= longitud de la raíz día 13 (cm); 4= peso fresco por planta (gr) en el estadio de crecimiento acelerado; 9. = Longitud de la lámina (cm); 8= Anchura de la lámina (cm); 18= Anchura/longitud de las hojas; 7= Circularidad de la lámina.

Tabla 13

Correlación entre el nivel de expresión de genes LNU seleccionados genes de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico bajo condiciones de fertilización con niveles normales o bajos de nitrógeno en las accesiones de Arabidopsis

Tabla 13. "ID Conjunto Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Tabla 14

Correlación entre el nivel de expresión de genes ortólogos LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico bajo condiciones de fertilización con niveles normales o bajos de nitrógeno en accesiones de Arabidopsis

Tabla 14. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Ejemplo 6

Producción de transcriptoma de cebada y análisis de correlación de alto rendimiento usando la micromatriz de oligonucleótidos 44k de cebada

Con el fin de producir un análisis de correlación de alto rendimiento que compare el fenotipo de la planta y el nivel de expresión génica, los presentes inventores utilizaron la micromatriz de oligonucleótidos de cebada, producida por Agilent Technologies [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) chem. (punto) agilent (punto) com/Scripts/PDS (punto) asp?lPage=50879]. La matriz de oligonucleótidos representa aproximadamente 47.500 genes y transcritos de cebada. Con el fin de definir las correlaciones entre los niveles de expresión de ARN y el rendimiento o parámetros relacionados con el vigor, se analizaron varias características de las plantas de 25 accesiones diferentes de cebada. Entre ellas, 13 accesiones que engloban la varianza observada se seleccionaron para el análisis de la expresión de ARN. La correlación entre los niveles de ARN y los parámetros caracterizados se analizó usando el ensayo de la correlación de Pearson [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) davidmlane (punto) com/hyperstat/A34739 (punto) html].

Procedimientos experimentales

Tejidos de cebada analizados - Se muestrearon cinco tejidos en diferentes estadios de desarrollo [meristemo, flor, emergencia de la espiga, tallo, hoja bandera], que representan diferentes características de las plantas y se extrajo el ARN como se ha descrito anteriormente. La información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de Conjunto como se resume en la Tabla 15 a continuación.

Tabla 15

Conjuntos de expresión de transcriptoma de cebada

Tabla 15

Evaluación de los componentes del rendimiento y parámetros relacionados con el vigor en cebada - Se crecieron en casa malla 25 accesiones de cebada en 4 bloques repetitivos (denominados A, B, C, y D), conteniendo cada uno 4 plantas por parcela. Las plantas se fenotiparon diariamente según el descriptos estándar de cebada (Tabla 16, a continuación). La recolección se llevó a cabo mientras el 50% de las espigas estaban secas para evitar la liberación espontánea de las semillas. Las plantas se separaron en la parte vegetativa y espigas, de ellas, 5 espigas se trillaron (los granos se separaron de las cáscaras) para un análisis adicional de los granos tal como la medición del tamaño, recuento de granos por espiga y rendimiento de granos por espiga. Todo el material se secó en el horno y las semillas se trillaron manualmente de las espigas antes de la medición de las características de las semillas (peso y tamaño) usando análisis por escaneo e imágenes. El sistema de análisis de imágenes incluyó un ordenador de escritorio personal (procesador Intel P43.0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.37 (programa de procesamiento de imágenes basado en Java, que se desarrolló en los U.S. National Institutes of Health y disponible públicamente en internet [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (punto) nih (punto) gov/]. A continuación, los datos analizados se guardaron como archivos de texto y se procesaron usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute).

Tabla 16

Descriptores estándar de cebada

Tabla 16.

Granos por espiga - Al final del experimento (el 50% de las espigas estaban secas), se recogen todas las espigas de las parcelas en los bloques A-D. Se contó el número total de granos de 5 espigas que se trillaron manualmente. El promedio de granos por espiga se calculó dividiendo el número total de granos por el número de espigas.

Tamaño promedio de los granos (cm) - Al final del experimento (el 50% de las espigas estaban secas), se recogen todas las espigas de las parcelas en los bloques A-D. Se escanearon los granos totales de 5 espigas que se trillaron manualmente y las imágenes se analizaron usando el sistema de imagenología digital. El escaneo de los granos se hizo usando el escáner Brother (modelo DCP 135), a una resolución de 200 dpi, y se analizó con software Image J. El tamaño promedio de los granos se calculó dividiendo el tamaño total de los granos por el número total de los granos. Peso promedio de los granos (mgr) - Al final del experimento (el 50% de las espigas estaban secas), se recogen todas las espigas de las parcelas en los bloques A-D. Se contaron y pesaron los granos totales de 5 espigas que se habían trillado manualmente. El peso promedio se calculó dividiendo el peso total por el número total de granos.

Rendimiento de granos por espiga (gr) - Al final del experimento (el 50% de las espigas estaban secas), se recogen todas las espigas de las parcelas en los bloques A-D. Se pesaron los granos totales de 5 espigas que se habían trillado manualmente. El rendimiento de granos se calculó dividiendo el peso total por el número espigas.

Análisis de la longitud de las espigas - Al final del experimento (el 50% de las espigas estaban secas), se recogen todas las espigas de las parcelas en los bloques A-D. Las cinco espigas elegidas por planta se midieron usando cinta métrica excluyendo las aristas.

Análisis del número de espigas - Al final del experimento (el 50% de las espigas estaban secas), se recogen todas las espigas de las parcelas en los bloques A-D. Se contaron las espigas por planta.

Puntuación del hábito de crecimiento - En el estadio de crecimiento 10 (emergencia de la espiga), cada una de las plantas se puntuó por la naturaleza de su hábito de crecimiento. La escala que se usó fue 1 para naturaleza postrada hasta 9 para erecta.

Pilosidad de las hojas basales - En el estadio de crecimiento 5 (vaina de la hoja fuertemente erecta; final de macollaje), cada una de las plantas se puntuó por la naturaleza pilosa de la penúltima hoja. La escala que se usó fue 1 para naturaleza postrada hasta 9 para erecta.

Altura de las plantas - En el estadio de recolección (el 50% de las espigas estaban secas), cada una de las plantas se midió para determinar su altura usando cinta métrica. La altura se midió desde el nivel del suelo hasta la parte superior de la espiga más larga, excluyendo las aristas.

Días hasta la floración - Cada una de las plantas se monitorizó para determinar la fecha de floración. Los días de floración se calcularon desde la fecha de la siembra hasta la fecha de la floración.

Pigmentación del tallo - En el estadio de crecimiento 10 (emergencia de la espiga), cada una de las plantas se puntuó por el color de su tallo. La escala que se usó fue 1 para verde hasta 5 para completamente morado.

Peso seco vegetativo y rendimiento de espigas - Al final del experimento (el 50% de las espigas estaban secas), se recogen todas las espigas y material vegetativo de las parcelas en los blocks A-D. El peso de la biomasa y espigas de cada parcela se separó, se midió y se dividió por el número de plantas.

Peso seco= peso total de la parte vegetativa aérea (excluyendo raíces) después de secado a 70°C en horno durante 48 horas;

Rendimiento de espigas por planta= peso total de las espigas por planta (gr) después de secado a 30°C en horno durante 48 horas.

Índice de recolección (para cebada) - El índice de recolección se calcula usando la Fórmula VIII.

Fórmula VIII: Índice de recolección= peso seco promedio de espigas por planta/(peso seco vegetativo promedio por planta peso seco promedio de espigas por planta)

Tabla 17

Parámetros correlacionados de cebada (vectores)

Tabla 17.

Resultados experimentales

Se crecieron 13 accesiones diferentes de cebada y se caracterizaron para 13 parámetros como se ha descrito anteriormente. Se calculó el promedio para cada uno de los parámetros medidos usando el software JMP y los valores se resumen en las Tablas 18 y 19 a continuación. Se llevaron a cabo análisis de correlación posteriores entre los distintos conjuntos de transcriptomas (Tabla 15) y los parámetros promedio (Tablas 20 y 21). A continuación, los resultados se integraron en la base de datos.

Tabla 18

Parámetros medidos de las Id de correlación en accesiones de cebada

Tabla 18. Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros medidos en accesiones de cebada según las siguientes identificaciones de correlación (Id de correlación): 6= Espigas por planta; 10= Días hasta la floración; 3= Peso de los granos; 5= Longitud de las espigas; 2= Tamaño de los granos; 1= Granos por espiga; 7= Hábito de crecimiento.

Tabla 19

Accesiones de cebada, parámetros medidos adicionales

^{--------------------------------------------------------------------- ------------------------------- -------- "}

Tabla 19. Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros medidos en accesiones de cebada según las siguientes identificaciones de correlación (Id de correlación): 8= Pilosidad de las hojas basales; 9= Altura de las plantas; 4= Rendimiento de granos por espiga; 11 = Pigmentación del tallo; 12= Peso seco vegetativo; 13= Índice de recolección.

Tabla 20

Correlación entre el nivel de expresión de genes LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de fertilización normales en accesiones de cebada

Tabla 20. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Tabla 21

Correlación entre el nivel de expresión de genes ortólogos LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de fertilización normales en accesiones de cebada

Tabla 21. "ID Conjunto Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Ejemplo 7

Producción del transcriptoma de sorgo y análisis de correlación de alto rendimiento con parámetros relacionados con rendimiento, NUE, y ABST medidos en campos usando micromatrices de oligonucleótidos 44k de sorgo

Con el fin de producir un análisis de correlación de alto rendimiento entre el fenotipo de las plantas y el nivel de expresión génica, los presentes inventores utilizaron una micromatriz de oligonucleótidos de sorgo, producida por Agilent Technologies [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) chem. (punto) agilent (punto) com/Scripts/PDS (punto) asp?lPage=50879]. La matriz de oligonucleótidos representa aproximadamente 44.000 genes y transcritos de sorgo. Con el fin de definir las correlaciones entre los niveles de expresión de ARN con los componentes de ABST, rendimiento y NUE o parámetros relacionados con el vigor, se analizaron varias características de las plantas de 17 híbridos de sorgo diferentes. Entre ellos, 10 híbridos que engloban la varianza observada se seleccionaron para el análisis de la expresión de ARN. La correlación entre los niveles de ARN y los parámetros caracterizados se analizó usando el ensayo de la correlación de Pearson [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) davidmlane (punto) com/hyperstat/A34739 (punto) html].

Correlación de las variedades de sorgo en los ecotipos crecidos en condiciones de bajos niveles de nitrógeno, crecimiento regular y sequía severa

Procedimientos experimentales

Se crecieron 17 variedades de sorgo en 3 parcelas repetitivas, en el campo. Brevemente, el protocolo de crecimiento fue como sigue:

1. Condiciones de crecimiento regular: las plantas de sorgo se crecieron en el campo usando protocolos de fertilización e irrigación comerciales.

2. Condiciones de fertilización con bajos niveles de nitrógeno: las plantas de sorgo se fertilizaron con una cantidad un 50% menor de nitrógeno en el campo que la cantidad de nitrógeno aplicada en el tratamiento de crecimiento regular. Todo el fertilizante se aplicó antes de la floración.

3. Estrés por sequía: las semillas de sorgo se sembraron en tierra y se crecieron en condición normal hasta aproximadamente 35 días desde la siembra, alrededor de V8. En este punto, la irrigación se paró, y se desarrolló un estrés por sequía severa. Con el fin de definir las correlaciones entre los niveles de expresión de ARN con NUE, sequía, y componentes del rendimiento o parámetros relacionados con el vigor, se analizaron las 17 variedades de sorgo diferentes. Entre ellas, 10 variedades que engloban la varianza observada se seleccionaron para el análisis de la expresión de ARN. La correlación entre los niveles de ARN y los parámetros caracterizados se analizó usando el ensayo de la correlación de Pearson [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) davidmlane (punto) com/hyperstat/A34739 (punto) html].

Tejidos de sorgo analizados - Se muestrearon los 10 híbridos de sorgo seleccionados para cada tratamiento. Se muestrearon los tejidos de las plantas [Hoja bandera, Meristemo floral y Flor] crecidos en bajos niveles de nitrógeno, estrés por sequía severa y plantas crecidas bajo condiciones normales y el ARN se extrajo como se ha descrito anteriormente. La información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de Conjunto como se resume en la Tabla 22 a continuación.

Tabla 22

Conjuntos de expresión del transcriptoma de sorgo experimentos en campo

Tabla 22: Se proporcionan los conjuntos de expresión de transcriptoma de sorgo.

Los siguientes parámetros se recogieron usando un sistema de imagenología digital:

Área promedio de granos (cm2) - Al final del periodo de crecimiento, los granos se separaron de la "Cabeza" de la planta. Se pesó una muestra de ~200 granos, se fotografió y las imágenes se procesaron usando el sistema de procesamiento de imágenes descrito más adelante. El área de los granos se midió a partir de esas imágenes y se dividió por el número de granos.

Longitud promedio de los granos (cm) - Al final del periodo de crecimiento, los granos se separaron de la "Cabeza" de la planta. Se pesó una muestra de ~200 granos, se fotografió y las imágenes se procesaron usando el sistema de procesamiento de imágenes descrito más adelante. La suma de las longitudes de los granos (eje más largo) se midió a partir de esas imágenes y se dividió por el número de granos.

Área promedio de la cabeza (cm2) Al final del periodo de crecimiento, se fotografiaron 5 "Cabezas" y las imágenes se procesaron usando el sistema de procesamiento de imágenes descrito más adelante. El área de la "Cabeza" se midió a partir de esas imágenes y se dividió por el número de "Cabezas".

Longitud Promedio de la cabeza (cm) Al final del periodo de crecimiento, se fotografiaron 5 "Cabezas" y las imágenes se procesaron usando el sistema de procesamiento de imágenes descrito más adelante. La longitud de la "Cabeza" (eje más largo) se midió a partir de esas imágenes y se dividió por el número de "Cabezas".

Se usó el sistema de procesamiento de imágenes que consiste en un ordenador personal de escritorio (procesador Intel P4 3.0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.37, software de procesamiento de imágenes basado en Java, que se desarrolló en los U.S. National Institutes of Health y que está disponible libremente en internet en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (punto) nih (punto) gov/. Las imágenes se capturaron con una resolución de 10 Mega Píxeles (3.888x2.592 píxeles) y se guardaron en un formato JPEG de baja compresión (estándar Joint Photographic Experts Group). A continuación, los datos de los resultados del procesamiento de imágenes para el área de las semillas y la longitud de las semillas se guardaron como archivos de texto y se analizaron usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute).

Se recogieron parámetros adicionales bien por muestreo de 5 plantas por parcela o midiendo el parámetro en todas las plantas en la parcela.

Peso total de las semillas por cabeza (gr.) - Al final del experimento ("Cabezas" de plantas), se recogieron las cabezas de las parcelas en los bloques A-C. Se trillaron separadamente 5 cabezas y los granos se pesaron, todas las cabezas adicionales se trillaron conjuntamente y también se pesaron. El peso promedio de los granos por cabeza se calculó dividiendo el peso total de los granos por el número total de cabezas por parcela (basado en parcela). En el caso de 5 cabezas, el peso total de los granos de 5 cabezas se dividió por 5.

FW de cabeza por planta gr - Al final del experimento (cuando las cabezas se recolectaron), se recogieron separadamente las cabezas totales y 5 seleccionadas por parcelas en los bloques A-C. Las cabezas (total y 5) se pesaron (gr.) separadamente y el peso fresco promedio por planta se calculó para el total (FW de cabeza/Planta gr basado en la parcela) y para 5 (FW de cabeza/Planta gr basado en 5 plantas).

Altura de las plantas - Las plantas se caracterizaron respecto a la altura durante el periodo de crecimiento en 5 puntos de tiempo. En cada medición, se midió la altura de las plantas usando una cinta métrica. La altura se midió desde el nivel del suelo hasta la parte superior de la hoja más larga.

Número de hojas en las plantas - Las plantas se caracterizaron respecto al número de hojas durante el periodo de crecimiento en 5 puntos de tiempo. En cada medición, se midió el número de hojas de las plantas contando todas las hojas de 3 plantas seleccionadas por parcela.

La tasa de crecimiento relativo se calculó usando las Fórmulas IX y X.

Fórmula IX Tasa de crecimiento relativo de la altura de la planta= coeficiente de regresión de la altura de la planta a lo largo del curso temporal.

Fórmula X Tasa de crecimiento relativo del número de hojas de la planta= coeficiente de regresión del número de hojas de la planta a lo largo del curso temporal.

SPAD - El contenido de clorofila se determinó usando un medidor de clorofila Minolta SPAD 502 y la medición se realizó 64 días después de la siembra. Las lecturas del medidor de SPAD se hicieron en hojas jóvenes completamente desarrolladas. Se tomaron tres mediciones por hoja por parcela.

Peso seco vegetativo y cabezas - Al final del experimento (cuando las inflorescencias estaban secas), se recogió todo el material de inflorescencias y vegetativo de las parcelas en los bloques A-C. El peso de la biomasa y las cabezas de cada parcela se separó, se midió y se dividió por el número de cabezas.

Peso seco= peso total de la parte vegetativa aérea (excluyendo las raíces) después de secar a 70°C en horno durante 48 horas;

Índice de recolección (HI) (Sorgo)- El índice de recolección se calculó usando la Fórmula XI.

Fórmula XI: Índice de recolección= peso seco de los granos promedio por cabeza/(peso seco vegetativo promedio por cabeza peso seco de cabezas promedio)

FW de cabezas/(FW de cabezas FW de plantas) - El peso fresco total de las cabezas y su biomasa vegetal respectiva se midieron en el día de la recolección. El peso de las cabezas se dividió por la suma de los pesos de cabezas y plantas.

Resultados experimentales

Se crecieron 17 híbridos de sorgo diferentes y se caracterizaron respecto a diferentes parámetros: el promedio para cada uno de los parámetros medidos se calculó usando el software JMP (Tablas 23-29) y se realizó un análisis de correlación posterior (Tablas 30-31). Los resultados se integraron entonces en la base de datos.

Tabla 23

Parámetros correlacionados de sorgo (vectores)

Tabla 23. Se proporcionan los parámetros correlacionados de sorgo (vectores). "gr."= gramos; "SPAD"= niveles de clorofila; "FW"= Peso fresco de la planta; "DW"= Peso seco de la planta;

"normal"= condiciones de crecimiento estándar.

Tabla 24

Parámetros medidos en accesiones de sorgo en condiciones normales

Tabla 24: se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones normales. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 25

Parámetros adicionales medidos en accesiones de sorgo en condiciones de crecimiento normales

Tabla 25: se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones normales. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 26

Parámetros medidos en accesiones de sorgo en condiciones de bajos niveles de nitrógeno

Tabla 26: se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de bajos niveles de nitrógeno. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 27

Parámetros adicionales medidos en accesiones de sorgo en condiciones de crecimiento con bajos niveles de nitrógeno

Tabla 27: se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de bajos niveles de nitrógeno. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 28

Parámetros medidos en accesiones de sorgo en condiciones de sequía

Tabla 28: se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de sequía. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 29

Parámetros adicionales medidos en accesiones de sorgo en condiciones de crecimiento de sequía

Tabla 29: Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de sequía. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 30

Correlación entre el nivel de expresión de genes LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de bajo nivel de nitrógeno, normales o estrés por sequía en accesiones de sorgo

Tabla 30. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Tabla 31

Correlación entre el nivel de expresión de genes homólogos LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de bajo nivel de nitrógeno, normales o estrés por sequía en accesiones de sorgo

;

1

1

Tabla 31. "ID Conjunto Correl."- ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Ejemplo 8

Producción del transcriptoma de sorgo y análisis de correlación de alto rendimiento con parámetros relacionados con rendimiento, NUE, y ABST medidos en condiciones semi-hidropónicas usando micromatrices de oligonucleótidos 44k de sorgo

Parámetros relacionados con el vigor de sorgo en condiciones de crecimiento con bajos niveles de nitrógeno, NaCl 100 mM, temperatura baja (10 ± 2°C) y normales - Se crecieron diez híbridos de sorgo en 3 parcelas repetitivas, conteniendo cada una 17 plantas, en una casa malla en condiciones semihidropónicas. Brevemente, el protocolo de crecimiento fue como sigue: se sembraron semillas de sorgo en bandejas llenas con una mezcla de vermiculita y turba en una relación 1:1. Después de la germinación, las bandejas se trasfirieron a la disolución de alta salinidad (NaCl 100 mM además de la disolución de Hoagland completa), temperatura baja (10 ± 2°C en presencia de disolución de Hoagland completa), disolución con bajo nivel de nitrógeno (la cantidad de nitrógeno total se redujo en un 90% respecto a la disolución de Hoagland completa (es decir, hasta una concentración final del 10% de la disolución de Hoagland completa, cantidad final de N 1,2 mM) o a en una disolución de crecimiento normal (Hoagland completa que contenía disolución de N 16 mM, a 28 ± 2°C). Las plantas se crecieron a 28 ± 2°C.

La disolución de Hoagland completa consiste en: KNO³ - 0,808 gramos/litro, MgSÜ4 - 0,12 gramos/litro, KH²PO⁴ -0,172 gramos/litro y microelementos "Super coratin" al 0,01% (volumen/volumen) (hierro-EDDHA [ácido etilendiamino-N,N'-bis(2-hidroxifenilacético)]- 40,5 gramos/litro; Mn - 20,2 gramos/litro; Zn 10,1 gramos/litro; Co 1,5 gramos/litro; y Mo 1,1 gramos/litro), el pH de la disolución debe ser 6,5 - 6,8].

Tejidos de sorgo analizados - Los 10 híbridos de sorgo seleccionados se muestrearon por cada tratamiento. Se muestrearon tres tejidos [hojas, meristemos y raíces] crecidos en condiciones de NaCl 100 mM, temperatura baja (10 ± 2°C), nivel bajo de nitrógeno (N 1,2 mM) o normales y el ARN se extrajo como se ha descrito anteriormente. La información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de Conjunto como se resume en la Tabla 32 a continuación.

Tabla 32

Conjuntos de expresión de transcriptoma de sorgo en condiciones semi hidropónicas

Tabla 32: Se proporcionan los conjuntos de expresión de transcriptoma de sorgo. Condiciones de frío= 10 ± 2°C;

NaCl= NaCl 100 mM; nitrógeno bajo= nitrógeno 1,2 mM; Condiciones normales= nitrógeno 16 mM.

Resultados experimentales

Se crecieron 10 híbridos diferentes de sorgo y se caracterizaron para los siguientes parámetros: "Número de hojas normal"= número de hojas por planta en condiciones normales (promedio de cinco plantas); "Altura de la planta normal"= altura de la planta en condiciones normales (promedio de cinco plantas); "DW de la raíz" - peso seco de la raíz por planta (promedio de cinco plantas); El promedio para cada uno de los parámetros medidos se calculó usando el software JMP y los valores se resumen en la Tabla 34, 35, 36 y 37 a continuación. Se realizó un análisis de correlación posterior (Tablas 38 y 39). Los resultados se integraron entonces en la base de datos.

Tabla 33

Parámetros correlacionados de sorgo (vectores)

Tabla 33: Se proporcionan los parámetros correlacionados de sorgo. Condiciones de frío= 10 ± 2°C; NaCl= NaCl 100 mM; nitrógeno bajo= nitrógeno 1,2 mM; Condiciones normales= nitrógeno 16 mM * TP-1-2-3 se refiere a los puntos de tiempo 1, 2 y 3.

Tabla 34

Accesiones de sorgo, parámetros medidos en condiciones de crecimiento de bajo nivel de nitrógeno

Tabla 34: Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de bajo nivel de nitrógeno. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 35

Accesiones de sorgo, parámetros medidos en condiciones de crecimiento con NaCl 100 mM

Tabla 35: Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de crecimiento con NaCl 100 mM. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 36

Accesiones de sorgo, parámetros medidos en condiciones de crecimiento en frío

Tabla 36: Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de crecimiento en frío. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 37

Accesiones de soro, parámetros medidos en condiciones de crecimiento normales

Tabla 37: Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de crecimiento normales. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 38

Correlación entre el nivel de expresión de genes LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de bajo nivel de nitrógeno, normales, estrés por frío o salinidad en accesiones de sorgo

Tabla 38. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Tabla 39

Correlación entre el nivel de expresión de genes homólogos LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de bajo nivel de nitrógeno, normales, estrés por frío o salinidad en accesiones de sorgo

.

;

Tabla 39. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Ejemplo 9

Producción del transcriptoma de maíz y análisis de correlación de alto rendimiento con parámetros relacionados con rendimiento y NUE usando micromatrices de oligonucleótidos 44k de maíz

Con el fin de producir un análisis de correlación de alto rendimiento entre el fenotipo de la planta y el nivel de expresión génica, los presentes inventores utilizaron una matriz de oligonucleótidos de maíz, producida por Agilent Technologies [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) chem. (punto) agilent (punto) com/Scripts/PDS (punto) asp?lPage=50879]. La matriz de oligonucleótidos representa aproximadamente 44.000 genes y transcritos de maíz. Con el fin de definir las correlaciones entre los niveles de expresión de ARN con componentes de rendimiento y NUE o parámetros relacionados con el vigor, se analizaron varias características de las plantas de 12 híbridos diferentes de maíz. Entre ellos, 10 híbridos que engloban la varianza observada se seleccionaron para el análisis de la expresión de ARN. La correlación entre los niveles de ARN y los parámetros caracterizados se analizó usando el ensayo de la correlación de Pearson [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) davidmlane (punto) com/hyperstat/A34739 (punto) html].

Correlación de los híbridos de maíz en ecotipos crecidos en condiciones de crecimiento normales

Procedimientos experimentales

Se crecieron 12 híbridos de maíz en 3 parcelas repetitivas, en el campo. Se plantaron semillas de maíz y las plantas se crecieron en el campo usando protocolos comerciales de fertilización e irrigación. Con el fin de definir las correlaciones entre los niveles de expresión de ARN con componentes de NUE y del rendimiento o parámetros relacionados con el vigor, se analizaron los 12 híbridos diferentes de maíz. Entre ellos, 10 híbridos que engloban la varianza observada se seleccionaron para el análisis de la expresión de ARN. La correlación entre los niveles de ARN y los parámetros caracterizados se analizó usando el ensayo de la correlación de Pearson [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) davidmlane (punto) com/hyperstat/A34739 (punto) html].

Tejidos de sorgo analizados - Se muestrearon los 10 híbridos de maíz seleccionados por cada tratamiento. Se muestrearon tejidos de las plantas [Hoja bandera, meristemo de la flor, grano, mazorcas, internodos] crecidas en condiciones normales y el ARN se extrajo como se ha descrito anteriormente. La información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de Conjunto como se resume en la Tabla 40 a continuación.

Tabla 40

Conjuntos de expresión de transcriptoma de maíz

Tabla 40: se proporcionan los conjuntos de expresión de transcriptoma de maíz. Hoja= la hoja

por debajo de la mazorca principal; Meristemo de la flor= Meristemo apical posterior al inicio

de la flor masculina; Mazorca= la flor femenina en el día de la antesis. Grano distal= maíz que

desarrolla granos desde el área del extremo de la mazorca, Grano basal= maíz que

desarrolla granos desde el área basal de la mazorca; Internodos= internodos localizados por

encima y por debajo de la mazorca principal en la planta.

Los siguientes parámetros se recogieron usando un sistema de imagenología digital:

Área de los granos (cm2) - Al final del periodo de crecimiento, los granos se separaron de la mazorca. Se pesó una muestra de ~200 granos, se fotografió y las imágenes se procesaron usando el sistema de procesamiento de imágenes descrito más adelante. El área de los granos se midió a partir de esas imágenes y se dividió por el número de granos.

Longitud de los granos y anchura de los granos (cm) - Al final del periodo de crecimiento, los granos se separaron de la mazorca. Se pesó una muestra de ~200 granos, se fotografió y las imágenes se procesaron usando el sistema de procesamiento de imágenes descrito más adelante. La suma de las alturas /o anchura (eje más largo) se midió a partir de esas imágenes y se dividió por el número de granos.

Área de la mazorca (cm2)- Al final del periodo de crecimiento, 5 mazorcas se fotografiaron y las imágenes se procesaron usando el sistema de procesamiento de imágenes descrito más adelante. El área de las mazorcas se midió a partir de esas imágenes y se dividió por el número de mazorcas.

Longitud de las mazorcas y anchura de las mazorcas (cm) Al final del periodo de crecimiento, 5 mazorcas se fotografiaron y las imágenes se procesaron usando el sistema de procesamiento de imágenes descrito más adelante. La longitud y anchura de las mazorcas (eje más largo) se midió a partir de esas imágenes y se dividió por el número de mazorcas.

Se usó el sistema de procesamiento de imágenes que consiste en un ordenador personal de escritorio (procesador Intel P43.0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.37, software de procesamiento de imágenes basado en Java, que se desarrolló en los U.S. National Institutes of Health y que está disponible libremente en internet en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (punto) nih (punto) gov/. Las imágenes se capturaron con una resolución de 10 Mega Píxeles (3.888x2.592 píxeles) y se almacenaron en un formato JPEG de baja compresión (estándar Joint Photographic Experts Group). A continuación, los datos resultantes del procesamiento de las imágenes para el área de la semilla y la longitud de la semilla se guardaron en archivos de texto y se analizaron usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute).

Se recogieron parámetros adicionales bien por muestreo de 6 plantas por parcela o midiendo el parámetro en todas las plantas en la parcela.

Peso normalizado de granos por planta (gr.) - Al final del experimento, se recogieron todas las mazorcas de las parcelas en los bloques A-C. Se trillaron 6 mazorcas separadamente y los granos se pesaron, todas las mazorcas adicionales se trillaron conjuntamente y también se pesaron. El peso promedio de los granos por mazorca se calculó dividiendo el peso total de los granos por el número total de mazorcas por parcela (basado en la parcela). En el caso de 6 mazorcas, el peso total de los granos de 6 mazorcas se dividió por 6.

FW de las mazorcas (gr.) - Al final del experimento (cuando se recolectaron las mazorcas), se recogieron separadamente las mazorcas totales y 6 seleccionadas por parcelas en los bloques A-C. Las plantas con (total y 6) se pesaron (gr.) separadamente y el promedio de mazorcas por planta se calculó para el total (FW de las mazorcas por parcela) y para 6 (FW de las mazorcas por planta).

Altura de la planta y altura de las mazorcas - Las plantas se caracterizaron respecto a altura en la recolección. En cada medición, se midió la altura de 6 plantas usando una cinta métrica. La altura se midió desde el nivel del suelo hasta la parte superior de la planta por debajo de la panoja. La altura de las mazorcas se midió desde el nivel del suelo hasta el lugar donde está localizada la mazorca principal.

Número de hojas por planta - Las plantas se caracterizaron respecto al número de hojas durante el periodo de crecimiento a 5 puntos de tiempo. En cada medición, se midió el número de hojas de las plantas contando todas las hojas de 3 plantas seleccionadas por parcela.

La tasa de crecimiento relativo se calculó usando las Fórmulas IX y X (descritas anteriormente).

SPAD - El contenido de clorofila se determinó usando un medidor de clorofila Minolta SPAD 502 y la medición se realizó 64 días después de la siembra. Las lecturas del medidor de SPAD se hicieron en hojas jóvenes completamente desarrolladas. Se tomaron tres mediciones por hoja por parcela. Los datos se tomaron después de 46 y 54 días después de la siembra (DPS)

Peso seco por planta - Al final del experimento (cuando las inflorescencias estaban secas), se recogió todo el material vegetativo de las parcelas en los bloques A-C.

Peso seco= peso total de la parte vegetativa aérea (excluyendo las raíces) después de secar a 70°C en un horno durante 48 horas;

Índice de recolección (HI) (Maíz)- El índice de recolección se calculó usando la Fórmula XII.

Fórmula XII: Índice de recolección= peso seco promedio de los granos por mazorca / (peso seco promedio vegetativo por mazorca peso seco promedio de las mazorcas)

Porcentaje de llenado de las mazorcas [%] - se calculó como el porcentaje del área de la mazorca con granos respecto a la mazorca total.

Diámetro de la mazorca [cm]- El diámetro de la mazorca sin granos se midió usando una regla.

Número de filas de granos por mazorca - Se contó el número de filas en cada mazorca.

Resultados experimentales

Se crecieron 12 híbridos diferentes de maíz y se caracterizaron respecto a diferentes parámetros: El promedio para cada uno de los parámetros medidos se calculó usando el software JMP (Tablas 42-43) y se realizó un análisis de correlación posterior (Tablas 44 y 45). Los resultados se integraron entonces en la base de datos.

Tabla 41

Parámetros correlacionados de maíz (vectores)

Tabla 41. SPAD 46DPS y SPAD 54DPS: nivel de clorofila después de 46 y 54 días después de la siembra (DPS).

Tabla 42

Parámetros medidos en accesiones de maíz en condiciones normales

Tabla 42. Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de maíz (ID de la semilla) en condiciones de crecimiento normales. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 43

Parámetros adicionales medidos en accesiones de maíz en condiciones de crecimiento normales

Tabla 43. Se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de maíz (ID de la semilla) en condiciones de crecimiento normales. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 44

Correlación entre el nivel de expresión de genes LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones normales en accesiones de maíz

Tabla 44. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Tabla 45

Correlación entre el nivel de expresión de genes homólogos LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones normales en accesiones de maíz

Tabla 45. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior. Ejemplo 10

Producción de transcriptoma de tomate y análisis de correlación de alto rendimiento usando una micromatriz de oligonucleótidos 44k de tomate

Con el fin de producir un análisis de correlación de alto rendimiento entre los fenotipos relacionados con NUE y la expresión génica, los presentes inventores utilizaron una micromatriz de oligonucleótidos de tomate, producida por Agilent Technologies [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) chem. (punto) agilent (punto) com/Scripts/PDS (punto) asp?lPage=50879]. La matriz de oligonucleótidos representa aproximadamente 44.000 genes y transcritos de tomate. Con el fin de definir las correlaciones entre los niveles de expresión de ARN con NUE, ABST, componentes del rendimiento o parámetros relacionados con el vigor se analizaron varias características de las plantas de 18 variedades diferentes de tomate. Entre ellas, 10 variedades que engloban la varianza observada se seleccionaron para el análisis de la expresión de ARN. La correlación entre los niveles de ARN y los parámetros caracterizados se analizó usando el ensayo de la correlación de Pearson [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) davidmlane (punto) com/hyperstat/A34739 (punto) html].

Correlación de las variedades de tomate en ecotipos crecidos en condiciones de crecimiento de bajo nivel de nitrógeno, sequía y normales

Procedimientos experimentales:

Se crecieron 10 variedades de tomate en 3 boques repetitivos, conteniendo cada uno 6 plantas por parcela en una casa malla. Brevemente, el protocolo de crecimiento fue como sigue:

1. Condiciones de crecimiento normales: se crecieron variedades de tomate en condiciones normales (4-6 Litros/m2 de agua por día y se fertilizaron con NPK según se recomienda en los protocolos para la producción comercial de tomate).

2. Condiciones de fertilización con bajo nivel de nitrógeno: se crecieron variedades de tomate en condiciones normales (4-6 Litros/m2 por día y se fertilizaron con NPK según se recomienda en los protocolos para la producción comercial de tomate) hasta el estadio de floración. En este estadio, se paró la fertilización con nitrógeno.

3. Estrés por sequía: se creció la variedad de tomate en condiciones normales (4-6 Litros/m2 por día) hasta el estadio de floración. En este momento, la irrigación se redujo hasta el 50% en comparación con las condiciones normales. Las plantas se fenotiparon en una base diaria siguiendo el descriptor estándar de tomate (Tabla 47). La recolección se llevó a cabo cuando el 50% de los frutos estaba rojo (maduro). Las plantas se separaron en la parte vegetativa y los frutos, de ellas, 2 nodos se analizaron para parámetros inflorescentes adicionales tales como tamaño, número de flores, y peso inflorescente. Se midió el peso fresco de todo el material vegetativo. Los frutos se separaron por colores (rojo frente a verde) y según el tamaño del fruto (pequeño, medio y grande). A continuación, los datos analizados se guardaron en archivos de texto y se procesaron usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute). Los datos de los parámetros recogidos se resumen en la Tabla 47, en la presente memoria más adelante.

Tejidos de sorgo analizados - se muestrearon dos tejidos en diferentes estadios de desarrollo [flor y hoja], que representan diferentes características de las plantas y el ARN se extrajo como se ha descrito anteriormente. Por conveniencia, la información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de Conjunto como se resume en la Tabla 46 a continuación.

Tabla 46

Conjuntos de expresión de transcriptoma de tomate

Tabla 46: se proporcionan las letras de identificación (ID) de cada uno de los conjuntos de expresión de tomate.

El promedio de cada uno de los parámetros medidos se calculó usando el software JMP y los valores se resumen en las Tablas 48, 49 y 50 a continuación. Se realizó un análisis de correlación posterior (Tablas 51-52) con el coeficiente de correlación (R) y los valores p. Los resultados se integraron en la base de datos.

Tabla 47

Parámetros correlacionados de tomate (vectores)

Tabla 47. Se proporcionan los parámetros correlacionados de tomate.

Rendimiento de frutos (gramos) - Al final del experimento [cuando el 50% de los frutos estaban maduros (rojos)], se recogieron todos los frutos de las parcelas en los bloques A-C. Los frutos totales se contaron y pesaron. El peso promedio de los frutos se calculó dividiendo el peso total de los frutos por el número de frutos.

Peso fresco de la planta (gramos) - Al final del experimento [cuando el 50% de los frutos estaban maduros (rojos)], se recogieron todas las plantas de las parcelas en los bloques A-C. Se midió el peso fresco (gramos).

Peso de las inflorescencias (gramos) - Al final del experimento [cuando el 50% de los frutos estaban maduros (rojos)], se recogieron dos inflorescencias de las parcelas en los bloques A-C. Se contaron el peso de las inflorescencias (gr.) y el número de flores por inflorescencia.

SPAD - El contenido de clorofila se determinó usando un medidor de clorofila Minolta SPAD 502 y la medición se realizó en el momento de la floración. Las lecturas del medidor de SPAD se hicieron en hojas jóvenes completamente desarrolladas. Se tomaron tres mediciones por hoja por parcela.

Eficiencia en el uso del agua (WUE) - puede determinarse como la biomasa producida por unidad de transpiración. Para analizar la WUE, se midió el contenido relativo de agua de las hojas en plantas control y transgénicas. Inmediatamente, se registró el peso fresco (FW); después, las hojas se empaparon durante 8 horas en agua destilada a temperatura ambiente en oscuridad, y se registró el peso turgente (TW). El peso seco (DW) total se registró después de secar las hojas a 60°C hasta un peso constante. El contenido relativo de agua (RWC) se calculó según la siguiente Fórmula I [(FW - DW/TW - DW) x 100] como se ha descrito anteriormente.

Las plantas que mantienen un alto contenido relativo de agua (RWC) en comparación con las líneas control se consideraron más tolerantes a la sequía que aquellas que presentan un contenido relativo de agua reducido.

Resultados experimentales

Tabla 48

Parámetros medidos en accesiones de tomate en condiciones de sequía

Tabla 48: se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de crecimiento de sequía. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 49

Parámetros medidos en accesiones de tomate en condiciones normales

Tabla 49: se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de crecimiento normales. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 50

Parámetros medidos en accesiones de tomate en condiciones de bajo nivel de nitrógeno

Tabla 50: se proporcionan los valores de cada uno de los parámetros (como se ha descrito anteriormente) medidos en accesiones de sorgo (ID de la semilla) en condiciones de crecimiento con bajo nivel de nitrógeno. Las condiciones de crecimiento se especifican en la sección de procedimiento experimental.

Tabla 51

Correlación entre el nivel de expresión de genes LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de bajo nivel de nitrógeno, normales o estrés por sequía en accesiones de tomate

Tabla 51. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Tabla 52

Correlación entre el nivel de expresión de genes homólogos LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de bajo nivel de nitrógeno, normales o estrés por sequía en accesiones de tomate

Tabla 52. "ID del Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Correlación de rasgos tempranos de vigor en una colección de ecotipos de tomate en condiciones de crecimiento con bajo nivel de nitrógeno, NaCl 300 mM, y normales - Se crecieron diez híbridos de tomate en 3 parcelas repetitivas, conteniendo cada una 17 plantas, en una casa malla en condiciones semihidropónicas. Brevemente, el protocolo de crecimiento fue como sigue: se sembraron semillas de tomate en bandejas llenas con una mezcla de vermiculita y turba en una relación 1:1. Después de la germinación, las bandejas se transfirieron a la disolución de alta salinidad (NaCl 300 mM además de la disolución de Hoagland completa), disolución con bajo nivel de nitrógeno (la cantidad de nitrógeno total se redujo en un 90% respecto a la disolución de Hoagland completa, cantidad final de N 0,8 mM) o a la disolución de crecimiento normal (Hoagland completa que contenía disolución de N 8 mM, a 28 ± 2°C). Las plantas se crecieron a 28 ± 2°C.

La disolución de Hoagland completa consiste en: KNO³ - 0,808 gramos/litro, MgSÜ4 - 0,12 gramos/litro, KH²PO⁴ -0,172 gramos/litro y microelementos "Super coratin" al 0,01% (volumen/volumen) (Hierro-EDDHA [ácido etilendiamino-N,N'-bis(2-hidroxifenilacético)]- 40,5 gramos/litro; Mn - 20,2 gramos/litro; Zn 10,1 gramos/litro; Co 1,5 gramos/litro; y Mo 1,1 gramos/litro), el pH de la disolución debe ser 6,5 - 6,8].

Tejidos de sorgo analizados - Se muestrearon las 10 variedades de tomate seleccionadas para cada tratamiento. Se muestrearon tres tejidos [hojas, meristemos y flores] y el ARN se extrajo como se ha descrito anteriormente. Por conveniencia, la información de la expresión de cada tipo de tejido en la micromatriz ha recibido una ID de Conjunto como se resume en la Tabla 53 a continuación.

Tabla 53

Conjuntos experimentales de transcriptoma de tomate

Tabla 53. Se proporcionan los conjuntos experimentales de transcriptoma de tomate

Parámetros relacionados con el vigor del tomate - después de 5 semanas de crecimiento, las plantas se recolectaron y se analizaron para determinar el número de hojas, la altura de las plantas, y el peso de las plantas. A continuación, los datos analizados se guardaron como archivos de texto y se procesaron usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute). Los datos de los parámetros recogidos se resumen en la Tabla 54, en la presente memoria a continuación.

Tabla 54

Parámetros correlacionados de tomate (vectores)

Tabla 54. Se proporcionan los parámetros correlacionados de tomate.

Resultados experimentales

Se crecieron 10 variedades diferentes de tomate y se caracterizaron respecto a 3 parámetros como se ha descrito anteriormente. El promedio de cada uno de los parámetros medidos se calculó usando el software JMP y los valores se resumen en las Tablas 55 a continuación. Se llevaron a cabo análisis de correlación posteriores (Tablas 56 y 57). Después, los resultados se integraron en la base de datos.

Tabla 55

Parámetros medidos en accesiones de tomate en condiciones normales, de salinidad y bajo nivel de nitrógeno

Tabla 55

Tabla 56

Correlación entre el nivel de expresión de genes LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de bajo nivel de nitrógeno, normales o de estrés por salinidad en accesiones de tomate

Tabla 56. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Tabla 57

Correlación entre el nivel de expresión de genes homólogos LNU seleccionados de algunas realizaciones de la invención en varios tejidos y el comportamiento fenotípico en condiciones de bajo nivel de nitrógeno, normales o de estrés por salinidad en accesiones de tomate

Tabla 57. "ID Conj. Correl." - ID del conjunto de correlación según la Tabla de parámetros correlacionados anterior.

Ejemplo 11

Clonación génica y generación de vectores binarios para la expresión en plantas

Para validar su papel en la mejora del rendimiento, se sobreexpresaron genes seleccionados en plantas, como sigue.

Estrategia de clonación

Se clonaron genes seleccionados de los presentados en los Ejemplos 1-10 en la presente memoria anteriormente en vectores binarios para la generación de plantas transgénicas. Para la clonación, se identificaron los marcos de lectura abiertos (ORF) de longitud completa. Las agrupaciones de EST y, en algunos casos, las secuencias de ARNm se analizaron para identificar el marco de lectura abierto completo mediante la comparación de los resultados de varios algoritmos de traducción con proteínas conocidas de otras especies de plantas.

Con el fin de clonar los ADNc de longitud completa, se realizó transcripción inversa (RT) seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; RT-PCR) en ARN total extraído de hojas, raíces u otros tejidos de las plantas, crecidas en condiciones normales/limitantes o de estrés. La extracción del ARN total, producción de ADNc y amplificación por PCR se realizaron usando protocolos estándar descritos en otra parte (Sambrook J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.) que son muy conocidos para los expertos en la técnica. Los productos de PCR se purifican usando el kit de purificación de PCR (Qiagen).

Habitualmente, se prepararon 2 conjuntos de cebadores para la amplificación de cada gen, mediante PCR anidada (si se requiere). Ambos conjuntos de cebadores se usaron para la amplificación en ADNc. En el caso en el que no se obtuviera producto, se realizó una reacción de PCR anidada. La PCR anidada se realizó por amplificación del gen usando cebadores externos y usando entonces el producto de PCR producido como un molde para una segunda reacción de PCR, donde se usa el conjunto de cebadores interno. Alternativamente, se usan uno o dos de los cebadores internos para la amplificación génica, ambos en la primera y segunda reacciones de PCR (lo que significa que solo se diseñaron 2-3 cebadores para un gen). Para facilitar la clonación adicional de los ADNc, se añadió una extensión de 8-12 pb en el 5' de cada cebador interno. La extensión de los cebadores incluye un sitio de restricción de endonucleasa. Los sitios de restricción se seleccionaron usando dos parámetros: (a) el sitio de restricción no existe en la secuencia de ADNc; y (b) los sitios de restricción en los cebadores directo e inverso se diseñaron de manera que el ADNc digerido se insertaba en la dirección con sentido en el vector binario utilizado para la transformación.

Los productos de PCR se digirieron con las endonucleasas de restricción (New England BioLabs Inc) según los sitios diseñados en los cebadores. Cada producto de PCR digerido se insertó en un vector con alto número de copias, vector plasmídico pBlue-script KS [vector plasmídico pBlue-script KS, Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) stratagene (punto) com/manuals/212205 (punto) pdf), o en plásmidos originados a partir de este vector. En el caso del vector con alto número de copias originado a partir del vector plasmídico pBlue-script KS (pGXN o pGXNa), el producto de PCR se insertó en el plásmido con alto número de copias en 5' del terminador NOS (SEQ ID NO: 4683) originado a partir del vector binario pBI 101.3 (No. de acceso de GenBank U12640, nucleótidos 4356 a 4693) y en 3' del promotor 35S (SEQ ID NO: 4685). Los productos digeridos y el vector plasmídico linearizado se ligan usando la enzima ADN ligasa T4 (Roche, Suiza).

En algunos casos, los productos de PCR se clonaron sin digestión en el vector pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen).

La secuenciación de los genes insertados se realizó usando el secuenciador ABI 377 (Applied Biosystems). En algunos casos, después de confirmar las secuencias de los genes clonados, el ADNc clonado acompañado o no del terminador NOS se introdujo en un vector binario pGI modificado que contenía el promotor At6669 o el promotor RootP a través de digestión con las endonucleasas de restricción apropiadas. En cualquier caso, el inserto estaba seguido de una única copia del terminador NOS (SEQ ID NO: 5683).

Varias secuencias de ADN de los genes seleccionados fueron sintetizadas por GeneArt [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (punto) geneart (punto) com/]. El ADN sintético se diseñó in silico. Se añaden los sitios de las enzimas de restricción adecuadas a las secuencias clonadas en el extremo 5' y en el extremo 3' para permitir la clonación posterior en el vector binario deseado.

El vector plasmídico pPI se construyó insertando una secuencia señal poli-(A) sintética, originada a partir del vector plasmídico básico pGL3 (Promega, No. de acceso de GenBank U47295; nucleótidos 4658-4811) en el sitio de restricción HindIII del vector binario pBI101.3 (Clontech, No. de acceso de GenBank U12640). pGI (Figura 1) era similar a pPI, pero el gen original en la parte central era GUS-Intrón y no GUS.

El vector pG I modificado (pQFN o pQNa_RP) era una versión modificada del vector pGI, en la que el casete se invirtió entre los límites izquierdo y derecho, de manera que el gen y su promotor correspondiente están cerca del límite derecho y el gen NPTII estaba cerca del límite izquierdo.

At6669, la nueva secuencia de promotor de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 4687) o la secuencia de promotor Root P (SEQ ID NO: 4688) se insertó en el vector binario pGI modificado, en 5' de los genes clonados, seguido de la ligación del ADN y la extracción del plásmido binario de colonias de E. coli positivas, como se ha descrito anteriormente. Las colonias se analizaron por PCR usando los cebadores que abarcan el inserto, que se diseñaron para abarcar el promotor y gen introducidos. Los plásmidos positivos se identificaron, se aislaron y se secuenciaron.

En el caso en el que se clonó el ADN genómico, los genes se amplificaron por PCR directa en el ADN genómico extraído del tejido de las hojas usando el kit DNAeasy (Qiagen No. de Cat. 69104).

La Tabla 58 a continuación proporciona los cebadores usados para la clonación de genes seleccionados.

Tabla 58

Los cebadores de PCR usados para clonar los genes de algunas realizaciones de la invención en vectores con alto número de copias

1

.

..........

...................

Tabla 58. Se proporcionan los cebadores de PCR usados para clonar los genes de algunas realizaciones de la invención. Fwd= cebador directo; Rev= cebador inverso; Anidado= cebador anidado para PCR (cebador interno); Externo= cebador externo para PCR. NF= directo anidado; EF - directo externo; NR - inverso anidado; ER - inverso externo.

Tabla 59

Genes clonados a partir de bibliotecas de ADNc o ADN genómico en un plásmido con alto número de copias

Tabla 59. "Polín." - Polinucleótido; "Polip." - polipéptido.

Ejemplo 12

Transformación de células de Agrobacterium tumefaciens con vectores binarios que portan posibles genes

Cada uno de los vectores binarios descritos en el Ejemplo 11 anterior se usaron para transformar células de Agrobacterium. Se usaron dos construcciones binarias adicionales, que tenían solo el promotor At6669, o RootP o ningún promotor adicional como controles negativos.

Los vectores binarios se introdujeron en células competentes de Agrobacterium tumefaciens GV301, o LB4404 (aproximadamente 109 células/mL) por electroporación. La electroporación se realizó usando un electroporador MicroPulser (Biorad), cubetas de 0,2 cm (Biorad) y el programa de electroporación EC-2 (Biorad). Las células tratadas se cultivaron en medio líquido LB a 28°C durante 3 horas, después se sembraron en placas sobre agar LB suplementado con gentamicina (50 mg/L; para las cepas de Agrobacterium GV301) o estreptomicina (300 mg/L; para la cepa de Agrobacterium LB4404) y kanamicina (50 mg/L) a 28°C durante 48 horas. Las colonias de Agrobacterium, que se desarrollaron en los medios selectivos, se analizaron adicionalmente por PCR usando los cebadores diseñados para abarcar la secuencia insertada en el plásmido pPI. Los productos de PCR resultantes se aislaron y se secuenciaron como se describe en el Ejemplo 11 anterior, para verificar que se introducen apropiadamente en las células de Agrobacterium las secuencias de polinucleótidos correctas de la invención.

Ejemplo 13

Transformación de plantas de Arabidopsis thaliana con los polinucleótidos de la invención

Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana Columbia (plantas T⁰) usando el procedimiento de Inmersión Floral descrito por Clough y Bent, 1998 (Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-43) y por Desfeux et al., 2000 (Female Reproductive Tissues Are the Primary Target of Agrobacterium-Mediated Transformation by the Arabidopsis Floral-Dip Method. Plant Physiol, julio 2000, Vol.

123, p. 895-904), con modificaciones menores. Brevemente, se sembraron plantas T⁰ en macetas de 250 ml llenas con una mezcla de crecimiento húmeda basada en turba. Las macetas se cubren con papel de aluminio y un domo de plástico, se mantienen a 4°C durante 3-4 días, después se descubren y se incuban en una cámara de crecimiento a 18-24°C en ciclos de luz/oscuridad de 16/8 horas. Las plantas T⁰ estaban listas para la transformación seis días antes de la antesis.

Se generaron colonias únicas de Agrobacterium que portaban las construcciones binarias, como se describe en los Ejemplos 11 y 12 anteriores. Las colonias se cultivaron en medio LB suplementado con kanamicina (50 mg/L) y gentamicina (50 mg/L). Los cultivos se incubaron a 28°C durante 48 horas con agitación vigorosa y después se centrifugaron a 4.000 rpm durante 5 minutos. Los sedimentos que comprendían las células de Agrobacterium se resuspendieron en un medio de transformación que contenía Murashige-Skoog al 50% (2,15 g/L) (Duchefa); bencillamino purina 0,044 pM (Sigma); 112 pg/L de vitaminas B5 de Gambourg (Sigma); sacarosa al 5%; y 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) en agua doblemente destilada, a un pH de 5,7.

La transformación de las plantas T⁰ se realizó invirtiendo cada planta en una suspensión de Agrobacterium, de manera que el tejido aéreo de la planta se sumergió durante 3-5 segundos. Cada planta T⁰ inoculada se puso inmediatamente en una bandeja de plástico, después se cubrió con u domo de plástico claro para mantener la humedad y se mantuvo en oscuridad a temperatura ambiente durante 18 horas, para facilitar la infección y transformación. Las plantas transformadas (transgénicas) se descubrieron entonces y se transfirieron a un invernadero para su recuperación y maduración. Las plantas T⁰ transgénicas se crecieron en el invernadero durante 3-5 semanas hasta que las silicuas eran marrones y estaban secas. Las semillas se recolectaron de las plantas y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta la siembra.

Para generar plantas transgénicas T¹ y T² que portaban los genes, las semillas recogidas de las plantas transgénicas T⁰ se esterilizaron en superficie empapándolas en etanol al 70% durante 1 minuto, seguido de empape en hipocloruro de sodio al 5% y tritón al 0,05% durante 5 minutos. Las semillas esterilizadas en superficie se lavaron concienzudamente en agua destilada estéril, después se pusieron en placas de cultivo que contenían Murashige-Skoog al 50% (Duchefa); sacarosa al 2%; agar de plantas al 0,8%; kanamicina 50 mM; y carbenicilina 200 mM (Duchefa). Las placas de cultivo se incubaron a 4°C durante 48 horas, después se transfirieron a una habitación de crecimiento a 25°C durante una semana adicional de incubación. Las plantas de Arabidopsis T¹ vitales se transfirieron a placas de cultivo nuevas durante otra semana de incubación. Después de la incubación, las plantas T¹ se retiraron de las placas de cultivo y se plantaron en una mezcla de crecimiento contenida en macetas de 250 ml. Se dejó que las plantas transgénicas crecieran en un invernadero hasta la madurez. Las semillas recolectadas de las plantas T¹ se cultivaron y se crecieron hasta la madurez como plantas T² en las mismas condiciones que se usaron para el cultivo y crecimiento de las plantas T¹.

Ejemplo 14

Evaluación de NUE de Arabidopsis transgénica en condiciones de nivel bajo o normal de nitrógeno usando ensayos in vitro (cultivo tisular)

Ensayo 1: crecimiento de las plantas en niveles de concentración baja y favorable de nitrógeno

Las semillas esterilizadas en superficie se sembraron en medio basal [medio Murashige-Skoog al 50% (MS) suplementado con agar de plantas al 0,8% como agente solidificante] en presencia de Kanamicina (usada como agente de selección). Después de la siembra, las placas se transfirieron durante 2-3 días para estratificación a 4°C y después se crecieron a 25°C en ciclos diarios de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad durante 7 a 10 días. En este punto de tiempo, se transfirieron cuidadosamente plántulas elegidas al azar a placas que contenían medio MS 1/2 (N 15 mM) para el tratamiento con concentración normal de nitrógeno y nitrógeno 0,75 mM para los tratamientos con concentración baja de nitrógeno. Para los experimentos realizados en las líneas T², cada placa contenía 5 plántulas del mismo evento transgénico, y 3-4 diferentes placas (replicados) para cada evento. Para cada polinucleótido de la invención, se analizaron al menos cuatro-cinco eventos de transformación independientes de cada construcción. Para los experimentos realizados en las líneas T¹, cada placa contenía 5 plántulas de 5 eventos transgénicos independentes y se plantaron 3-4 diferentes placas (replicados). En total, para las líneas T¹, se evaluaron 20 eventos independentes.

Las plantas que expresaban los polinucleótidos de la invención se compararon con la medición promedio de las plantas control (vector vacío o gen informador GUS bajo el mismo promotor) usadas en el mismo experimento.

Imagenología digital - Se usa un sistema de adquisición de imágenes de laboratorio, que consiste en una cámara réflex digital (Canon EOS 300D) equipada con una lente con una longitud focal de 55 mm (serie Canon EF-S), montada en un dispositivo de reproducción (Kaiser RS), que incluye 4 unidades de luz (4 x bombillas de 150 Watios) y localizada en una habitación oscura, para capturar imágenes de plántulas sembradas en las placas de agar.

El proceso de captura de imágenes se repite cada 3-4 días empezando en el día 1 hasta el día 10 (véanse, por ejemplo, las imágenes en las Figuras 3A-B). Se usó un sistema de análisis de imágenes, que consiste en un ordenador personal de escritorio (procesador Intel P4 3.0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.39 [programa de procesamiento de imágenes basado en Java que fue desarrollado en los U.S. National Institutes of Health y disponible libremente en internet en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (punto) nih (punto) gov/]. Las imágenes se capturaron con una resolución de 10 Mega Píxeles (3.888 x 2.592 píxeles) y se guardaron en un formato JPEG de baja compresión (estándar Joint Photographic Experts Group). A continuación, los datos analizados se guardaron en archivos de texto y se procesaron usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute).

Análisis de las plántulas - Usando el análisis digital, se calcularon datos de las plántulas, incluyendo área de las hojas, cobertura de las raíces y longitud de las raíces.

La tasa de crecimiento relativo para los distintos parámetros de las plántulas se calculó según las siguientes fórmulas XIII, V (descrita anteriormente) y XIV.

Fórmula XIII:

Tasa de crecimiento relativo del área de las hojas= coeficiente de regresión del área de las hojas a lo largo del curso temporal.

Fórmula XIV:

Tasa de crecimiento relativo de la longitud de las raíces= coeficiente de regresión de la longitud de las raíces a lo largo del curso temporal.

Al final del experimento, las plántulas se retiraron de los medios y se pesaron para la determinación del peso fresco de las plantas. Las plántulas se secaron entonces durante 24 horas a 60°C, y se pesaron de nuevo para medir el peso seco de la planta para los análisis estadísticos posteriores. La tasa de crecimiento se determinó comparando la cobertura del área de las hojas, cobertura de las raíces y longitud de las raíces, entre cada pareja de fotografías secuenciales, y los resultados se usan para resolver el efecto del gen introducido en el vigor de las plantas en condiciones óptimas. De forma similar, se determinó el efecto del gen introducido en la acumulación de biomasa, en condiciones óptimas, comparando el peso fresco y seco de las plantas con el de las plantas control (que contenían un vector vacío o el gen informador GUS bajo el mismo promotor). A partir de cada construcción creada, se examinan en replicado 3-5 eventos de transformación independentes.

Análisis estadísticos - Para identificar los genes que confieren un vigor significativamente mejorado a la planta o una arquitectura agrandada de las raíces, los resultados obtenidos de las plantas transgénicas se compararon con los obtenidos de las plantas control. Para identificar los genes y construcciones con los mejores resultados, se analizaron separadamente los resultados de los eventos de transformación independentes ensayados. Para evaluar el efecto de un evento génico sobre un control, los datos se analizaron por el ensayo de la t de Student y se calcula el valor p. Los resultados se consideraron significativos si p < 0,1. Se usó el paquete de software estadístico JMP (Versión 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).

Resultados experimentales:

Los genes presentados en las Tablas 60-63 mostraron una mejora significativa en la NUE de las plantas, ya que produjeron una mayor biomasa de las plantas (peso fresco y seco de las plantas y área de las hojas) en la generación T² (Tablas 60-61) o generación T¹ (Tablas 62-63), cuando se crecieron en condiciones de crecimiento con nitrógeno limitante, en comparación con las plantas control. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) o promotor preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se llevó a cabo ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. Algunos de los genes se evaluaron en más de un ensayo de cultivo tisular. Los resultados obtenidos en estos segundos experimentos también fueron significativamente positivos.

Tabla 60

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las plantas en condiciones deficientes en nitrógeno (generación T²)

:

____ ____________

_______

Tabla 60. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 61

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las plantas en condiciones deficientes en nitrógeno (generación

T2)

T a b la 61 Tabla 62

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las plantas en condiciones deficientes en nitrógeno (generación

Ti)

Tabla 62. "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 63

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las plantas en condiciones deficientes en nitrógeno (generación

Ti)

Tabla 63.

Los genes presentados en las Tablas 64-65 mostraron una mejora significativa en la NUE de las plantas, ya que produjeron una mayor biomasa de las raíces (longitud de las raíces y cobertura de las raíces) cuando se crecieron en condiciones de crecimiento con nitrógeno limitante, en comparación con las plantas control. Las plantas que producen mayor biomasa de las raíces tienen mejores posibilidades de absorber una mayor cantidad de nitrógeno de la tierra. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) o un promotor preferido para las raíces (RootP). La evaluación de cada gen se llevó a cabo ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. Algunos de los genes se evaluaron en más de un ensayo de cultivo tisular. Este segundo experimento confirmó el incremento significativo en el rendimiento de las raíces. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo.

Tabla 64

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las raíces en condiciones deficientes en nitrógeno (generación T²)

_i

Tabla 64. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 65

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las raíces en condiciones deficientes en nitrógeno (generación T¹)

:

________

Tabla 65. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr." = % de incremento.

Los genes enumerados en las Tablas 66, 67, 68 y 69 tienen una tasa de crecimiento de las plantas mejorada (tasa de crecimiento del área de las hojas, cobertura de las raíces y longitud de las raíces) cuando se crecen en condiciones de crecimiento con nitrógeno limitante, en comparación con las plantas control. Las plantas que muestran una tasa de crecimiento rápida muestran un mejor establecimiento de la planta en la tierra en condiciones deficientes de nitrógeno.

Se observó un crecimiento más rápido cuando se midió la tasa de crecimiento del área de las hojas y longitud y cobertura de las raíces. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) o promotor preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se realizó ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. Algunos de los genes se evaluaron en más de un ensayo de cultivo tisular y los resultados obtenidos también fueron positivos. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo.

Tabla 66

Genes que muestran una tasa de crecimiento mejorada de las plantas en condiciones deficientes en nitrógeno (generación T²)

Tabla 66. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 67

Genes que muestran una tasa de crecimiento mejorada de las plantas en condiciones de nitrógeno limitante (generación T²)

Tabla 67.

Tabla 68

Genes que muestran una tasa de crecimiento mejorada de las plantas en condiciones deficientes en nitrógeno (generación T¹)

Tabla 68. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 69

Genes que muestran una tasa de crecimiento mejorada de las plantas en condiciones deficientes en nitrógeno (generación T¹)

Tabla 69.

Los genes enumerados en las Tablas 70, 71,72 y 73 mejoraron la NUE de las plantas cuando se crecieron en niveles de concentración estándar de nitrógeno. Estos genes produjeron una mayor biomasa de las plantas (peso fresco y seco de las plantas y área de las hojas) cuando se crecieron en condiciones de crecimiento con nivel de nitrógeno estándar, en comparación con las plantas control. Una mayor biomasa de las plantas en estas condiciones de crecimiento indica la alta capacidad de la planta para metabolizar mejor el nitrógeno presente en el medio. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) o promotor preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se realizó ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. Algunos de los genes se evaluaron en más de un ensayo de cultivo tisular y los resultados obtenidos también fueron positivos. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo

Tabla 70

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las plantas en condiciones de crecimiento con nivel de nitrógeno estándar (generación T²)

Tabla 70. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 71

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las plantas en condiciones de crecimiento con nivel de nitrógeno estándar (generación T²)

Tabla 71.

Tabla 72

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las plantas en condiciones de crecimiento con nivel de nitrógeno estándar (generación T¹)

Tabla 72. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 73

Genes que muestran un rendimiento mejorado de las plantas en condiciones de crecimiento con nivel de nitrógeno estándar (generación T¹)

T a b la 73.

Los genes enumerados en las Tablas 74 y 75 mejoraron la NUE de las plantas cuando se crecieron en niveles de concentración estándar de nitrógeno. Estos genes produjeron una mayor biomasa de raíces (longitud de las raíces y cobertura de las raíces) cuando se crecieron en condiciones de crecimiento con nivel estándar de nitrógeno, en comparación con las plantas control. Las plantas que producen una mayor biomasa de raíces tienen mejores posibilidades de absorber una mayor cantidad de nitrógeno de la tierra. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) o promotor preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se realizó ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. Algunos de los genes se evaluaron en más de un ensayo de cultivo tisular dando lugar también a resultados positivos. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo

Tabla 74

Genes que muestran rendimiento mejorado de las raíces en condiciones de crecimiento con nivel estándar de nitrógeno (generación T²)

Tabla 74. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 75

Genes que muestran el rendimiento mejorado de las raíces en condiciones de crecimiento con nivel estándar de nitrógeno (generación T¹)

__________

Tabla 75. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Los genes enumerados en las Tablas 76 y 77 mejoraron la tasa de crecimiento de las plantas (tasa de crecimiento del área de las hojas, longitud de las raíces y cobertura de las de las raíces) cuando se crecieron en niveles estándar de concentración de nitrógeno. Estos produjeron plantas que crecieron más rápido que las plantas control cuando se crecieron en condiciones de crecimiento con nivel estándar de nitrógeno. Se observó un crecimiento más rápido cuando se midió la tasa de crecimiento del área de las hojas y longitud y cobertura de las raíces. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) o promotor preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se realizó ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. Algunos de los genes se evaluaron en más de un ensayo de cultivo tisular dando lugar también a resultados positivos. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo

Tabla 76

Genes que muestran una tasa de crecimiento mejorada en condiciones de crecimiento con nivel de nitrógeno estándar (generación T²)

1

Tabla 76. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 77

Genes que muestran una tasa de crecimiento mejorada en condiciones de crecimiento con nivel de nitrógeno estándar (generación T¹)

Tabla 77. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Ejemplo 15

Evaluación de NUE, rendimiento y tasa de crecimiento de plantas de Arabidopsis transgénicas con fertilización de nitrógeno baja o normal en ensayo en invernadero

Ensayo 1: eficiencia en el uso de nitrógeno: rendimiento de las semillas biomasa de las plantas y tasa de crecimiento de las plantas a concentración limitada y óptima de nitrógeno en condiciones de invernadero - Este ensayo sigue la producción del rendimiento de las semillas, la formación de biomasa y el área crecimiento de las rosetas de plantas crecidas en el invernadero en condiciones de crecimiento con nivel limitante y no limitante de nitrógeno. Se sembraron semillas de Arabidopsis transgénica en medio de agar suplementado con medio MS 1/2 y un agente de selección (Kanamicina). Las plántulas transgénicas T² se trasplantaron entonces a 1,7 bandejas llenas con turba y perlita en una relación 1:1. Las bandejas se irrigaron con una disolución que contenía condiciones limitantes de nitrógeno, que se consiguieron irrigando las plantas con una disolución que contenía nitrógeno inorgánico 1,5 mM en la forma de KNO³, suplementado con KH²PO⁴1 mM, MgSO41 mM, KCl 3,6 mM, CaCl²2 mM y microelementos, mientras que los niveles normales de nitrógeno se consiguieron aplicando una disolución de nitrógeno inorgánico 6 mM también en la forma de KNO³ con KH²PO⁴1 mM, MgSO41 mM, CaCl² 2 mM y microelementos. Todas las plantas se crecieron en el invernadero hasta la madurez de las semillas. Las semillas se recolectaron, se extrajeron y se pesaron. El resto de la biomasa de las plantas (el tejido aéreo) también se recolectó y se pesó inmediatamente o después de secado en un horno a 50°C durante 24 horas.

Cada construcción se validó en su generación T². Las plantas transgénicas transformadas con una construcción conformada por un vector vacío que portaba el promotor 35S y el marcador seleccionable se usaron como control.

Las plantas se analizaron para determinar su tamaño global, tasa de crecimiento, floración, rendimiento de las semillas, peso de 1.000 semillas, materia seca e índice de recolección (HI- rendimiento de las semillas/materia seca). El rendimiento de las plantas transgénicas se comparó con las plantas control crecidas en paralelo en las mismas condiciones. Se usaron como control las plantas transgénicas simuladas que expresaban el gen informador uidA (GUS-Intrón) o sin ningún gen, bajo el mismo promotor.

El experimento se planeó en una distribución en parcelas aleatorizada anidada. Para cada gen de la invención, se analizaron tres a cinco eventos de transformación independientes de cada construcción.

Imagenología digital - Se usa un sistema de adquisición de imágenes de laboratorio, que consiste en una cámara réflex digital (Canon EOS 300D) equipada con una lente con una longitud focal de 55 mm (serie Canon EF-S), montada en un dispositivo de reproducción (Kaiser RS), que incluye 4 unidades de luz (4 x bombillas de 150 Watios) para capturar las imágenes de las muestras de plantas.

El proceso de captura de imágenes se repite cada 2 días empezando en el día 1 después del trasplante hasta el día 15. La misma cámara, situada en un montaje de hierro personalizado, se usa para capturar imágenes de plantas mayores sembradas en contenedores blancos en un invernadero con ambiente controlado. Los contenedores tienen una forma cuadrada e incluyen bandejas de 1,7 litros. Durante el proceso de captura, los contenedores se ponen debajo del montaje de hierro, mientras se evita la luz solar directa y la proyección de sombras.

Se usa un sistema de análisis de imágenes, que consiste en un ordenador personal de escritorio (procesador Intel P4 3.0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.39 [programa de procesamiento de imágenes basado en Java que fue desarrollado en los U.S. National Institutes of Health y que está disponible libremente en internet en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (punto) nih (punto) gov/]. Las imágenes se capturan con una resolución de 10 Mega Píxeles (3.888 x 2.592 píxeles) y se almacenan en un formato JPEG de baja compresión (estándar Joint Photographic Experts Group). A continuación, los datos analizados se guardan en archivos de texto y se procesan usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute).

Análisis de las hojas - Usando el análisis digital, se calculan los datos de las hojas, incluyendo el número de hojas, área de la roseta, diámetro de la roseta, área de la lámina foliar.

Tasa de crecimiento vegetativo: se calculan la tasa de crecimiento relativo (RGR) del número de hojas [fórmula X (descrita anteriormente)], área de la roseta (fórmula XV), cobertura de la parcela (fórmula XVI) e índice de recolección (fórmula IV) con las fórmulas indicadas.

Fórmula XV:

Tasa de crecimiento relativo del área de las rosetas= coeficiente de regresión del área de las rosetas a lo largo del curso temporal.

Fórmula XVI

Tasa de crecimiento relativo de la cobertura de las parcelas= coeficiente de regresión de la cobertura de las parcelas a lo largo del curso temporal.

Peso promedio de las semillas - Al final del experimento, se recogen todas las semillas. Las semillas se esparcen en una bandeja de vidrio y se hizo una fotografía. Usando el análisis digital, se calcula el número de semillas en cada muestra.

Peso seco y rendimiento de las semillas - Aproximadamente en el día 80 desde la siembra, las plantas se recolectan y se dejan secar a 30°C en una cámara de secado. Se miden la biomasa y el peso de las semillas de cada parcela y se dividen por el número de plantas en cada parcela. Peso seco= peso total de la parte vegetativa aérea (excluyendo las raíces) después de secado a 30°C en una cámara de secado; Rendimiento de las semillas por planta= peso total de las semillas por planta (gr). Peso de 1.000 semillas (el peso de 1.000 semillas) (gr.).

El índice de recolección (HI) se calculó usando la Fórmula IV como se ha descrito anteriormente.

Porcentaje de aceite en las semillas - Al final del experimento, se recogen todas las semillas de cada parcela. Las semillas de 3 parcelas se mezclan por molienda y se montan entonces en la cámara de extracción. Se usan 210 ml de n-Hexano (No. de Cat. 080951 Biolab Ltd.) como el disolvente. La extracción se realiza durante 30 horas con calor medio de 50°C. Una vez ha terminada la extracción, el n-Hexano se evaporó usando el evaporador a 35°C y condiciones de vacío. El proceso se repite dos veces. La información obtenida del extractor Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) se usa para crear una curva de calibración para la RMN de baja resonancia. El contenido de aceite de todas las muestras de semillas se determina usando la RMN de baja resonancia (MARAN Ultra- Oxford Instrument) y su paquete de software MultiQuant

Análisis de la longitud de las silicuas - En el día 50 desde la siembra, se muestrean 30 silicuas de diferentes plantas en cada parcela en el bloque A. Las silicuas elegidas tienen un color verde amarillento y se recogen de las partes inferiores del tallo de una planta crecida. Se hace una fotografía digital para determinar la longitud de las silicuas.

Análisis estadístico - Para identificar los genes que confieren una tolerancia significativamente mejorada a los estreses abióticos, los resultados obtenidos de las plantas transgénicas se comparan con los obtenidos de las plantas control. Para identificar los genes y construcciones con los mejores resultados, los resultados de los eventos de transformación independientes ensayados se analizan separadamente. Los datos se analizan usando el ensayo de la t de Student y los resultados se consideran significativos si el valor de p era menor de 0,1. Se usa el paquete de software estadístico JMP (Versión 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).

Ejemplo 16

Evaluación de NUE, rendimiento y tasa de crecimiento de las plantas de Arabidopsis transgénicas con fertilización de nitrógeno baja o normal en ensayo en invernadero

Ensayo 2: eficiencia en el uso de nitrógeno medida en el estadio de crecimiento acelerado: biomasa de las plantas y tasa de crecimiento de las plantas a una concentración limitada y óptima de nitrógeno en condiciones de invernadero - Este ensayo sigue la formación de la biomasa de las plantas y el crecimiento del área de las rosetas de plantas crecidas en el invernadero en condiciones de crecimiento con nivel de nitrógeno limitante y no limitante. Se sembraron semillas de Arabidopsis transgénicas en medio de agar suplementado con medio MS 1/2 y un agente de selección (Kanamicina). Las plántulas transgénicas T² se trasplantaron entonces a bandejas de 1,7 llenas con turba y perlita en una relación 1:1. Las bandejas se irrigaron con una disolución que contenía condiciones limitantes de nitrógeno, que se consiguieron irrigando las plantas con una disolución que contenía nitrógeno inorgánico 1,5 mM en la forma de KNO³, suplementado con KH²PO⁴1 mM, MgSO41 mM, KCl 3,6 mM, CaCl²2 mM y microelementos, mientras que los niveles normales de nitrógeno se consiguieron aplicando una disolución de nitrógeno inorgánico 6 mM también en la forma de KNO³ con KH²PO⁴1 mM, MgSO41 mM, CaCl²2 mM y microelementos. Todas las plantas se crecieron en el invernadero hasta la madurez de las semillas. La biomasa de las plantas (el tejido aéreo) se pesó directamente después de la recolección de la roseta (peso fresco de la planta [FW]). Después, las plantas se secaron en un horno a 50°C durante 48 horas y se pesaron (peso seco de la planta [DW]).

Cada construcción se validó en su generación T². Las plantas transgénicas transformadas con una construcción conformada por un vector vacío que portaba el promotor 35S y el marcador seleccionable se usaron como control.

Las plantas se analizaron para determinar su tamaño global, tasa de crecimiento, peso fresco y materia seca. El rendimiento de las plantas transgénicas se comparó con las plantas control crecidas en paralelo en las mismas condiciones. Se usaron como control las plantas transgénicas simuladas que expresaban el gen informador uidA (GUS-Intrón) o sin ningún gen, bajo el mismo promotor.

El experimento se planeó en una distribución de parcelas aleatorizada anidada. Para cada gen de la invención, se analizaron tres a cinco eventos de transformación independientes de cada construcción.

Imagenología digital - Se usa un sistema de adquisición de imágenes de laboratorio, que consiste en una cámara réflex digital (Canon EOS 300D) equipada con una lente con una longitud focal de 55 mm (serie Canon EF-S), montada en un dispositivo de reproducción (Kaiser RS), que incluye 4 unidades de luz (4 x bombillas de 150 Watios) para capturar las imágenes de las muestras de plantas.

El proceso de captura de imágenes se repitió cada 2 días empezando en el día 1 después del trasplante hasta el día 15. La misma cámara, situada en un montaje de hierro personalizado, se usó para capturar imágenes de plantas mayores sembradas en contenedores blancos en un invernadero con ambiente controlado. Los contenedores tenían una forma cuadrada e incluyeron bandejas de 1,7 litros. Durante el proceso de captura, los contenedores se pusieron debajo del montaje de hierro, mientras se evitaba la luz solar directa y la proyección de sombras.

Se usó un sistema de análisis de imágenes, que consiste en un ordenador personal de escritorio (procesador Intel P4 3.0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.39 [programa de procesamiento de imágenes basado en Java que fue desarrollado en los U.S. National Institutes of Health y que está disponible libremente en internet en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (punto) nih (punto) gov/]. Las imágenes se capturaron con una resolución de 10 Mega Píxeles (3.888 x 2.592 píxeles) y se almacenaron en un formato JPEG de baja compresión (estándar Joint Photographic Experts Group). A continuación, los datos analizados se guardaron en archivos de texto y se procesaron usando el software de análisis estadístico JMP (SAS institute).

Análisis de las hojas - Usando el análisis digital, se calcularon los datos de las hojas, incluyendo el número de hojas, área de la roseta, diámetro de la roseta, área de la lámina foliar.

Tasa de crecimiento vegetativo: se calculan la tasa de crecimiento relativo (RGR) del número de hojas (Fórmula X, descrita anteriormente), área de la roseta (Fórmula XV, descrita anteriormente), y cobertura de la parcela (Fórmula XVI, descrita anteriormente) usando las fórmulas indicadas.

Peso fresco y seco de las plantas - Aproximadamente en el día 80 desde la siembra, las plantas se recolectaron y se pesaron directamente para la determinación del peso fresco (FW) de las plantas y se dejaron secar a 50°C en una cámara de secado durante aproximadamente 48 horas antes de pesarlas para determinar el peso seco (DW) de las plantas.

Análisis estadístico - Para identificar los genes que confieren una tolerancia significativamente mejorada a los estreses abióticos, los resultados obtenidos de las plantas transgénicas se compararon con los obtenidos de las plantas control. Para identificar los genes y construcciones con los mejores resultados, los resultados de los eventos de transformación independientes ensayados se analizaron separadamente. Los datos se analizaron usando el ensayo de la t de Student y los resultados se consideran significativos si el valor de p era menor de 0,1. Se usó el paquete de software estadístico JMP (Versión 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).

Resultados experimentales:

Los genes enumerados en las Tablas 78 y 79 mejoraron la NUE de las plantas cuando se crecieron en niveles limitantes de concentración de nitrógeno. Estos genes produjeron plantas mayores con una mayor área fotosintética, biomasa (peso fresco, peso seco, diámetro de la roseta, área de la roseta y cobertura de la parcela) cuando se crecieron en condiciones de nitrógeno limitante. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) y preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se realizó ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo.

Tabla 78

Genes que muestran una producción mejorada de la biomasa de las plantas en condiciones de crecimiento con nitrógeno limitante

Tabla 78. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 79

Genes que muestran una producción mejorada de la biomasa de las plantas en condiciones de crecimiento con nitrógeno limitante

'

Tabla 79. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Los genes enumerados en la Tabla 80 mejoraron la NUE de las plantas cuando se crecieron en niveles de concentración limitante de nitrógeno. Estos genes produjeron áreas fotosintéticas como se observa por su mayor número de hojas, área de la lámina foliar y área de los peciolos. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) y preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se realizó ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo.

Tabla 80

Genes que muestran una capacidad fotosintética mejorada de las plantas en condiciones de crecimiento con nitrógeno limitante

Tabla 80. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Los genes enumerados en la Tabla 81 mejoraron la NUE de las plantas cuando se crecieron en niveles estándar de concentración de nitrógeno. Estos genes produjeron plantas con un desarrollo más rápido cuando se crecieron en condiciones de crecimiento con nitrógeno limitante, en comparación con las plantas control según se mide por la tasa de crecimiento del área de la roseta, diámetro de la roseta y cobertura de la parcela. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) y preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se realizó ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo.

Tabla 81

Genes que muestran un rendimiento mejorado del crecimiento de las rosetas en condiciones de crecimiento con nitrógeno limitante

Tabla 81. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Los genes enumerados en las Tablas 82 y 83 mejoraron la NUE de las plantas cuando se crecieron en niveles estándar de concentración de nitrógeno. Estos genes produjeron plantas mayores con un área fotosintética mayor y biomasa incrementada (peso fresco, peso seco, diámetro de las rosetas, área de las rosetas y cobertura de la parcela) cuando se crecieron en condiciones de nivel estándar de nitrógeno. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) y preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se realizó ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo.

Tabla 82

Genes que muestran una producción mejorada de la biomasa de las plantas en condiciones de crecimiento con nivel estándar de nitrógeno

Tabla 82. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Tabla 83

Genes que muestran una producción mejorada de la biomasa de las plantas en condiciones de crecimiento con nivel estándar de nitrógeno

Tabla 83. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Los genes enumerados en la Tabla 84 mejoraron la NUE de las plantas cuando se crecieron en niveles estándar de concentración de nitrógeno. Estos genes produjeron mayores áreas fotosintéticas como puede observarse por su mayor área de la lámina foliar y longitud del peciolo de las hojas. Los genes se clonaron bajo la regulación de un promotor constitutivo (At6669) y preferido de raíces (RootP). La evaluación de cada gen se realizó ensayando el rendimiento de diferentes números de eventos. El evento con un valor p <0,1 se consideró estadísticamente significativo.

Tabla 84

Genes que muestran una capacidad fotosintética mejorada en condiciones de crecimiento con nivel estándar de nitrógeno

________

Tabla 84. "CONT." - Control; "Prom." - Promedio; "% Incr."= % de incremento.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa en condiciones limitantes de nitrógeno, y/o tasa de crecimiento de una planta que comprende:

(a) expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos un 80% idéntico sobre la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEQ ID NO: 563, y

(b) que comprende además crecer la planta que expresa dicho polinucleótido exógeno en condiciones limitantes de nitrógeno,

incrementando de esta manera la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa en condiciones limitantes de nitrógeno, y/o tasa de crecimiento de la planta.

2. Un método para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa en condiciones limitantes de nitrógeno, y/o tasa de crecimiento de una planta que comprende:

(a) expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 80% idéntica sobre la secuencia de ácido nucleico completa mostrada en la SEQ ID NO: 352, 96, o 235, y

(b) que comprende además crecer la planta que expresa dicho polinucleótido exógeno en condiciones limitantes de nitrógeno,

incrementando de esta manera la eficiencia en el uso de nitrógeno, biomasa en condiciones limitantes de nitrógeno, y/o tasa de crecimiento de la planta.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además seleccionar una planta que tiene una eficiencia en el uso de nitrógeno, crecimiento, y/o biomasa en condiciones limitantes de nitrógeno incrementados en comparación con una planta no transformada de la misma especie que se crece en las mismas condiciones de crecimiento.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, en donde dicho polipéptido es al menos un 85% idéntico sobre la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEQ ID NO: 563.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, en donde dicho polipéptido es al menos un 90% idéntico sobre la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEQ ID NO: 563.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, en donde dicho polipéptido es al menos un 95% idéntico sobre la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEQ ID NO: 563.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, en donde dicho polipéptido es al menos un 98% idéntico sobre la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEQ ID NO: 563.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, en donde dicho polipéptido se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 563, y 4040-4045.

9. El método de la reivindicación 1 y 3, en donde dicha secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 563.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en donde dicho polinucleótido exógeno comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 352, 96, 235, y 2283-2288.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en donde dicho polinucleótido exógeno comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 352, 96 o 235.