ES2547305T3 - Polinucleótidos, polipéptidos codificados por los mismos, y métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o la biomasa y/o el rendimiento en plantas que los expresan - Google Patents

Polinucleótidos, polipéptidos codificados por los mismos, y métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o la biomasa y/o el rendimiento en plantas que los expresan Download PDF

Info

Publication number
ES2547305T3
ES2547305T3 ES08776651.5T ES08776651T ES2547305T3 ES 2547305 T3 ES2547305 T3 ES 2547305T3 ES 08776651 T ES08776651 T ES 08776651T ES 2547305 T3 ES2547305 T3 ES 2547305T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
plant
plants
lsm
seq
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08776651.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Gil Ronen
Hagai Karchi
Alex Diber
Basia Judith Vinocur
Sharon Ayal
Eyal Emmanuel
Michael Gang
Dotan Dimet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evogene Ltd
Original Assignee
Evogene Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40281935&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2547305(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Evogene Ltd filed Critical Evogene Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2547305T3 publication Critical patent/ES2547305T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Un método para aumentar la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de una planta en comparación con la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de una planta no transgénica, en el que el estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste en estrés osmótico, estrés salino y déficit de nitrógeno, comprendiendo el método la sobreexpresión en la planta de un polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido SEC ID Nº: 201 o un ortólogo del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201, en el que dicho polipéptido es capaz de aumentar la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de una planta, en el que el estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste en estrés osmótico, estrés salino y déficit de nitrógeno, en el que dicho polinucleótido exógeno está comprendido en una construcción de ácido nucleótido que adicionalmente comprende un promotor para dirigir la transcripción de dicho polinucleótido exógeno en una célula de una planta, siendo dicho promotor un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, o un promotor inducible por un estrés abiótico, aumentando así la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de la planta en comparación con la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de la planta no transgénica.

Description

Polinucleótidos, polipéptidos codificados por los mismos, y métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o la biomasa y/o el rendimiento en plantas que los expresan
Campo y antecedentes de la invención
La presente invención, en algunas de sus realizaciones, se refiere a polipéptidos y a polinucleótidos aislados y más particularmente, a métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia de una planta al estrés abiótico, crecimiento, biomasa, vigor y/o rendimiento de una planta.
Las condiciones de estrés abiótico (EAB; también denominado “estrés ambiental”), tales como salinidad, sequía, inundación, temperatura subóptima y polución química tóxica, causan daños sustanciales a plantas agrícolas. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerlas contra estas condiciones. Sin embargo, si la gravedad y duración de las condiciones de estrés son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo, crecimiento y rendimiento son muy pronunciados. Además, la mayoría de las plantas de cultivo son muy susceptibles al EAB y por tanto requieren condiciones de crecimiento óptimas para rendimientos de cultivos comerciales. La exposición continua al estrés causa alteraciones principales en el metabolismo de las plantas conduciendo finalmente a la muerte celular y como consecuente a la pérdida de rendimiento. Por tanto, a pesar de llevar a cabo investigaciones de gran alcance y de tomar fuertes medidas en lo que respecta a la protección de los cultivos, anualmente continua habiendo pérdidas de billones de dólares anuales debido a condiciones de estrés abiótico.
La sequía es un fenómeno gradual, que implica periodos de clima anormalmente seco que persiste durante un tiempo suficiente largo como para producir graves desequilibrios hidrológicos, tales como daños a los cultivos y escasez de reservas hidrológicas. En casos graves, la sequía puede durar muchos años y producir efectos devastadores en la agricultura y en las reservas hidrológicas. Con el creciente aumento de la población y la escasez crónica de agua dulce disponible, la sequía no es solo el problema principal relacionado con el clima en la agricultura, sino que también destaca como uno de los principales desastres naturales de todos los tiempos, causando no solo daños económicos (por ejemplo, las pérdidas por sequía en los Estados Unidos en el año 1988 superaron los 40 billones de dólares), sino también pérdida de vidas humanas, como ocurrió entre 1984 y 1985 conla sequía en el Cuerno de África, que condujo a una hambruna que produjo la muerte de 750.000 personas. Además, la sequía se asocia con un aumento de la susceptibilidad a diversas enfermedades.
Para la mayoría de las plantas de cultivo, las regiones agrarias mundiales son demasiada áridas. Además, el uso excesivo de agua disponible produce una pérdida aumentada de terreno agrícolamente utilizable (desertificación), y un aumento de la acumulación de sales en suelos, añadido a la pérdida de agua disponible en los mismos.
La salinidad, altos niveles de sal, afecta a una de cinco hectáreas de tierra de regadío. Se espera que esta condición empeore únicamente, reduciendo adicionalmente la disponibilidad de tierra arable y la producción de cultivos, ya que ninguno de los cinco mejores cultivos alimenticios, es decir, trigo, maíz, arroz, patatas y soja, puede tolerar el exceso de sal. Los efectos perjudiciales de la sal en las plantas producen déficit hídrico que conduce a estrés osmótico (similar al estrés por sequía) y el efecto de exceso de iones de sodio sobre procesos bioquímicos críticos. Al igual que con la congelación y la sequía, el alto contenido en sal causa déficit hídrico; y la presencia de alto contenido en sal dificulta a las raíces de las plantas la extracción de agua de su entorno. La salinidad del suelo es por tanto una de las variables más importantes que determinan si una planta puede prosperar. En muchas partes del mundo, extensas áreas de tierra no son cultivables debido a una salinidad naturalmente elevada en el suelo. Por tanto, la salinización de los suelos que se usan para la producción agrícola es un problema significativo y que va en aumento en regiones que dependen en gran medida de la agricultura y está empeorando por un exceso de utilización, de fertilización y escasez de agua, típicamente causadas por el cambio climático y por las demandas de la población en aumento. La tolerancia a la sal es de particular importancia al inicio del ciclo de vida de las plantas, ya que la evaporación de la superficie del suelo causa un movimiento de agua ascendente y la sal se acumula en la capa superior del suelo donde se disponen las semillas. Por otro lado, normalmente la germinación se produce a una concentración salina que es más alta que el nivel salino medio en todo el perfil del suelo.
La germinación de muchos cultivos es sensible a la temperatura. Un gen que pudiese potenciar la germinación en condiciones cálidas podría ser útil para cultivos que se plantan en una estación tardía o en climas cálidos. Además, las plántulas y las plantas maduras que se exponen a un exceso de calor, pueden sufrir choque térmico, que puede originarse en diversos órganos, incluyendo las hojas y particularmente los frutos, cuando la transpiración es insuficiente para superar el estrés por calor. El calor también daña a las estructuras celulares, incluyendo los orgánulos y el citoesqueleto y altera la función de la membrana. El choque térmico puede producir una disminución en la síntesis global de proteínas, acompañado por expresión de proteínas de choque térmico, por ejemplo, chaperonas, que están implicadas en el replegamiento de proteínas desnaturalizadas por calor.
El estrés por calor a menudo viene acompañado de condiciones de baja disponibilidad de agua. El propio calor se contempla como un estrés interrelacionado y añadido a los efectos perjudiciales causados por condiciones de déficit
hídrico. La demanda evaporativa de agua presenta aumentos casi exponenciales con aumentos en temperaturas diurnas y puede producir elevadas tasas de transpiración y bajos potenciales de agua para las plantas. Los daños al polen por altas temperaturas casi siempre se producen junto con estrés por sequía y raramente se producen en condiciones bien hidratadas. El estrés combinado puede alterar el metabolismo de las plantas de nuevas maneras; por lo tanto el entendimiento de la interacción entre diferentes estreses puede ser importante para el desarrollo de estrategias para potenciar la tolerancia al estrés mediante manipulación genética.
Las condiciones de enfriamiento excesivo, por ejemplo, bajas temperaturas, aunque por encima de la temperatura de congelación, afectan a cultivos de origen tropical, tales como soja, arroz, maíz y algodón. Los daños típicos por enfriamiento incluyen marchitamiento, necrosis, clorosis o filtración de iones de las membranas celulares. Los mecanismos subyacentes de sensibilidad por enfriamiento aún no se comprenden del todo, pero probablemente implican el nivel de saturación de membrana y otras deficiencias fisiológicas. Por ejemplo, la fotoinhibición de la fotosíntesis (interrupción de la fotosíntesis debido a altas intensidades de luz) a menudo se produce en condiciones atmosféricas claras posteriores a noches frías al final del verano/otoño. Además, el enfriamiento puede conducir a pérdidas de producción y a una menor calidad del producto a través de la maduración retrasada del maíz.
El déficit hídrico es un componente común de muchos estreses de plantas. El déficit hídrico se produce en las células de las plantas cuando toda la tasa de transpiración de la planta supera la captación del agua. Además de la sequía, otros estreses, tales como la salinidad y la baja temperatura, producen deshidratación celular.
La transducción de señales por estrés salino y sequía consiste en rutas de señalización de homeostasis iónica y osmótica. El aspecto iónico del estrés salino está señalizado mediante la ruta SOS en la que un complejo de proteína quinasa SOS3-SOS2 sensible a calcio, controla la expresión y la actividad de transportadores de iones tales como SOS1. El componente osmótico del estrés salino implica reacciones complejas en plantas que se solapan con respuestas al estrés por sequía y/o frio.
Aspectos comunes de respuesta al estrés provocado por sequía, por frío y por sal [Revisados en Xiong y Zhu (2002) Plant Cell Environ. 25: 131-139] incluyen: (a) cambios transitorios en los niveles de calcio citoplasmático de manera temprana en el evento de señalización [Knight, (2000) Int. Rev. Cytol. 195: 269-324; Sanders et al. (1999) Plant Cell
11: 691-706]; (b) transducción de señales mediante proteína quinasas dependientes de calcio (CDPK) y/o activadas por mitógeno y proteína fosfatasas [Merlot et al. (2001) Plant J. 25: 295-303; Tahtiharju y Palva (2001) Plant J. 26: 461-470]; (c) aumentos en los niveles de ácido abscísico en respuesta al estrés desencadenando un subconjunto de respuestas; (d) inositol fosfatos como moléculas señalizadoras (al menos para un subconjunto de los cambios transcripciones sensibles a estrés [Xiong et al. (2001) Genes Dev. 15: 1971-1984]; (e) activación de fosfolipasas que a su vez generan una diversa serie de moléculas mensajeras secundarias, algunas de las cuales podrían regular la actividad de las quinasas sensibles a estrés (por ejemplo, fosfolipasa D; Frank et al. (2000) Plant Cell 12: 111-124];
(f) inducción de genes de tipo (LEA, Late Embryogenesis Abundant) abundantes en embriogénesis tardía, incluyendo los genes COR/RD sensibles a CRT/DRE; (g) niveles aumentados de antioxidantes y osmolitos compatibles, tales como prolina y azúcares solubles [Hasegawa et al. (2000) Annu. Rev. Plant Mol. Plant Physiol. 51: 463-499)]; y (h) acumulación de especies de oxígeno reactivas tales como superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo.
La biosíntesis de ácido abscísico se regula mediante estrés osmótico en etapas múltiples. El estrés osmótico tanto dependiente como independiente de ABA, señaliza modificando primero los factores de transcripción expresados constitutivamente, lo que conduce a la expresión de activadores transcripcionales de respuesta temprana, que después activan genes efectores de tolerancia al estrés aguas abajo.
Diversos genes que aumentan la tolerancia al estrés por frío o por sal también pueden mejorar la protección al estrés por sequía, éstos incluyen, por ejemplo, el factor de transcripción AtCBF/DREB1, OsCDPK7 (Saijo et al. 2000, Plant J. 23: 319-327) o AVP1 (una bomba de protones de pirofosfatasa vacuolar, Gaxiola et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11444-11449).
El desarrollo de plantas tolerantes a estrés es una estrategia que tiene la posibilidad de resolver o mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de reproducción de plantas usadas para desarrollar nuevas líneas de plantas que presenten tolerancia al EAB, son relativamente ineficaces dado que son tediosas, lentas y con resultados impredecibles. Además, los recursos limitados del germoplasma para la tolerancia al estrés e incompatibilidad en cruces entre especies de plantas distantemente relacionadas, representan problemas significativos encontrados en la reproducción convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a tolerancia al EAB son complejos de naturaleza e implican mecanismos múltiples de adaptación celular y numerosas rutas metabólicas.
En la técnica se han descrito tentativas de modificación por ingeniería genética, destinadas a conferir tolerancia al estrés abiótico a cultivos transgénicos. Todos los estudios realizados por Apse y Blumwald (Curr Opin Biotechnol.
13: 146-150, 2002), Quesada et al. (Plant Physiol. 130:951-963, 2002), Holmström et al. (Nature 379: 683-684, 1996), Xu et al. (Plant Physiol 110: 249-257, 1996), Pilon-Smits y Ebskamp (Plant Physiol 107: 125-130, 1995) y Tarczynski et al. (Science 259: 508-510, 1993) han intentado generar plantas tolerantes al estrés.
Además, diversas patentes y solicitudes de patente de Estados Unidos también describen polinucleótidos asociados con tolerancia al estrés y su uso en la generación de plantas tolerantes al estrés. Las Patentes de Estados Unidos Nos 5.296.462 y 5.356.816 describen la transformación de plantas con polinucleótidos que codifican proteínas implicadas en la adaptación al frío en Arabidopsis thaliana para promover la tolerancia al frío.
5 La Patente de Estados Unidos Nº 6.670.528 describe la transformación de plantas con polinucleótidos que codifican polipéptidos que se unen a elementos sensibles a estrés para promover la tolerancia al estrés abiótico.
La Patente de Estados Unidos Nº 6.720.477 describe la transformación de plantas con un polinucleótido que codifica 10 una proteína de transducción de señal relacionada con el estrés, capaz de aumentar la tolerancia al estrés abiótico de las plantas transformadas.
Las solicitudes de Estados Unidos Nos de Serie 09/938842 y 10/342224 describen genes relacionados con el estrés abiótico y su uso para conferir a las plantas tolerancia al estrés abiótico.
15 La Solicitud de Estados Unidos Nº de Serie 10/231035 describe la sobreexpresión de una sulfurasa de cofactor de molibdeno en plantas para aumentar la tolerancia al estrés abiótico.
El documento WO2004/104162 de Evogene Ltd. enseña secuencias de polinucleótidos y métodos para utilizarlas 20 para aumentar la tolerancia de una planta a un estrés abiótico y/o aumentar la biomasa de una planta.
El documento WO2007/020638 de Evogene Ltd. enseña secuencias de polinucleótidos y métodos para utilizarlas para aumentar la tolerancia de una planta a un estrés abiótico y/o aumentar la biomasa, el vigor y/o el rendimiento de una planta.
25 El documento WO2007/049275 de Evogene Ltd. enseña polipéptidos aislados, polinucleótidos que codifican los mismos para aumentar la tolerancia de una planta al estrés abiótico, y/o o para aumentar la biomasa, el vigor y/o el rendimiento de una planta.
30 La técnica anterior adicional incluye las solicitudes de Patente de Estados Unidos Nos 20060183137A1 A1 y 20030056249A1.
El documento US 2004/0123343 desvela secuencias de polinucleótidos y plantas transgénicas.
35 Sumario de la invención
De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula de la planta forma parte de una planta.
40 De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste en salinidad, sequía, falta de agua, baja temperatura, alta temperatura, toxicidad a metales pesados, anaerobiosis, déficit de nutrientes, exceso de nutrientes, polución atmosférica y radiación UV.
45 De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el método comprende adicionalmente cultivar la planta que expresa el polinucleótido exógeno en condiciones de estrés abiótico.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos científicos y/o técnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto habitual en la técnica a la cual pertenece la
50 invención. Aunque en la práctica o en los ensayos de las realizaciones de la invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, se controlará la memoria descriptica de la patente, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.
55 Breve descripción de los dibujos
En el presente documento se describen algunas realizaciones de la invención, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos con detalle, se hace hincapié en que
60 las particularidades mostradas son a modo de ejemplo y con el fin de comentar de manera ilustrativa las realizaciones de la invención. En este sentido, tomando la descripción junto con los dibujos, se pone de manifiesto para los expertos en la técnica cómo pueden llevarse a la práctica las realizaciones de la invención.
En los dibujos: 65
La FIG. 1 es una ilustración esquemática del plásmido binario pGI usado para expresar las secuencias de polinucleótidos aisladas de la invención. LD – límite derecho del ADN-T; LI – límite izquierdo del ADN-T; H- enzima de restricción HindIII; X - enzima de restricción XbaI; B - enzima de restricción BamHI; S - enzima de restricción SalI; Sm - enzima de restricción SmaI; R-I - enzima de restricción EcoRI; Sc -SacI/SstI/Ecl136II; (números) - Longitud en pares de bases; pro NOS = promotor de nopalina sintasa; NPT-II = gen de neomicina fosfotransferasa; ter NOS = terminador de nopalina sintasa; señal Poli-A (señal de poliadenilación); GUSintrón gen indicador GUS (secuencia codificante e intrón). Las secuencias de polinucleótidos aisladas de la invención se clonaron en el vector reemplazando al mismo tiempo el gen indicador GUSintrón. Las FIGs. 2a-b son imágenes que representan la visualización del desarrollo radicular de plantas cultivadas en placas transparentes con agar. Los diferentes transgenes se cultivaron en placas transparentes con agar durante 17 días y las placas se fotografiaron cada 2 días comenzando el día 7. La Figura 2a es una imagen de una fotografía de las plantas tomada después de 12 días en placas con agar. La Figura 2b es una imagen del análisis radicular en la que la medida de la longitud de la raíz se representa con una flecha roja.
Descripción de realizaciones específicas de la invención
La presente divulgación se refiere, en algunos de sus aspectos, a polipéptidos aislados y a polinucleótidos que los codifican, y más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico, la tasa de crecimiento, el rendimiento, la biomasa y/o el vigor de una planta.
Antes de explicar con detalle al menos una realización de la divulgación, debe entenderse que la invención no está necesariamente limitada en esta solicitud a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ilustrados a través de los Ejemplos. La invención puede tener otras realizaciones o llevarse a la práctica o realizarse de diversas maneras.
Limitando la invención a la práctica, los autores de la presente invención han identificado nuevos polipéptidos y polinucleótidos que pueden usarse para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y mejorar la tasa de crecimiento, la biomasa, el rendimiento y/o el vigor de una planta.
Por tanto, como se muestra más adelante en la sección de Ejemplos, los autores de la presente invención han empleado una estrategia bioinformática que combina el agrupamiento y el conjunto de secuencias de bases de datos de los genomas de plantas de Arabidopsis, arroz y otros genomas de plantas disponibles para el público, etiquetas de secuencia expresada (EST, Expressed Sequence Tags), bases de datos de proteínas y rutas e información QTL (Quantitative Trait Locus, «locus de carácter cuantitativo») con un perfil de expresión digital (“Electronic Northern Blot”, Transferencia de Northen Electrónica) y han identificado polinucleótidos y polipéptidos que pueden aumentar la tolerancia al estrés abiótico y mejorar el crecimiento, la biomasa, el rendimiento y el vigor (SEC ID Nos: 1-200 y 1653 para los polinucleótidos; SEC ID Nos: 201-391 y 1655 para los polipéptidos; Tabla 1, Ejemplo 1). Se identificaron supuestos ortólogos con TEAB (Tolerancia al Estrés Abiótico) de especies monocotiledóneas mediante alineamientos de secuencias ortólogas y perfiles de expresión digital (SEC ID Nos: 392960, 1656-1659 para los polinucleótidos; SEC ID Nos: 961-1529, 1660-1663 para los polipéptidos; Tabla 2, Ejemplo 1). Como se describe adicionalmente en las Tablas 3 y 4 de la sección de Ejemplos más adelante, se clonaron polinucleótidos representativos (polinucleótidos de SEC ID Nos: 1530, 1538, 1532, 1549, 1665, 1566, 1554, 1563, 1557, 1561, 1564, 1534, 1536, 1552, 1553, 1666, 1547, 1548, 1556, 1559, 1560, 1654, 1555, 1540, 1543 y 1668). Se prepararon polinucleótidos adicionales que tenían secuencias de ácidos nucleicos optimizadas (polinucleótidos de SEC ID Nos: 1531, 1539, 1533, 1550, 1558, 1562, 1565, 1541, 1667, 1542, 1544, 1537, 1551 y 1545). Como se describe adicionalmente en la sección de Ejemplos más adelante, se generaron plantas transgénicas que expresaban exógenamente los polinucleótidos de la invención clonados y/u optimizados. Como se muestra en las Tablas 5-76, estas plantas presentaron aumento del peso de la plántula, de la cobertura radicular, de la longitud radicular y de la tasa de crecimiento relativa, cuando se cultivaron en condiciones de estrés osmótico (en presencia de PEG al 25 %), con déficit de nitrógeno (en presencia de nitrógeno 0,75 mM) o en condiciones regulares. Además, como se muestra en las Tablas 77-188, las plantas que expresaban exógenamente los polinucleótidos de la invención, presentaron aumento del área de la roseta, del diámetro de la roseta, del área foliar promedio, de la tasa de crecimiento de lo anterior, de la biomasa de las plantas, del rendimiento de las semillas de las plantas, del peso de 1000 semillas y del índice de cosecha, cuando se cultivaban en condiciones de estrés por salinidad o en condiciones normales. En conjunto, estos resultados sugieren el uso de nuevos polinucleótidos y polipéptidos de la divulgación para aumentar la tolerancia al estrés abiótico, y mejorar la tasa de crecimiento, la biomasa, el vigor y/o el rendimiento de una planta.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la divulgación, se proporciona un método para aumentar la tolerancia al estrés abiótico, la tasa de crecimiento, la biomasa, el rendimiento y/o el vigor de una planta. El método se efectúa expresando en la planta un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de al menos 60 % con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 201.
La frase “estrés abiótico”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier efecto adverso sobre el metabolismo, el crecimiento, la reproducción y/o la viabilidad de una planta. Por consiguiente, el estrés abiótico puede inducirse mediante condiciones de crecimiento ambientales subóptimas, tales como, por ejemplo, salinidad,
falta de agua, déficit hídrico, sequía, inundación, congelación, bajas o altas temperaturas (por ejemplo, enfriamiento
o calor excesivo), polución química tóxica, toxicidad por metales pesados, anaerobiosis, déficit de nutrientes, exceso de nutrientes, polución atmosférica o radiación UV. Las implicaciones del estrés abiótico se analizan en la sección de Antecedentes.
La frase “tolerancia al estrés abiótico” como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de una planta para resistir un estrés abiótico sin sufrir una alteración sustancial en el metabolismo, crecimiento, productividad y/o viabilidad.
Como se usa en el presente documento, la frase “biomasa vegetal” se refiere a la cantidad (medida en gramos de tejido secado al aire o seco) de un tejido producido por la planta en una estación de cultivo, que podría también determinar el, o afectar al, rendimiento de la planta o al rendimiento por área de cultivo.
Como se usa en el presente documento, la frase “rendimiento de la planta” se refiere a la cantidad (determinada en peso, volumen o tamaño) o a la cantidad (en números) de tejido producido o cosechado por planta o por estación de cultivo. Por tanto, un rendimiento aumentado podría afectar al beneficio económico que podría obtenerse de la planta en una determinada área de cultivo y/o tiempo de cultivo.
Como se usa en el presente documento, la frase “vigor de la planta” se refiere a la cantidad (medida en peso) de tejido que produce la planta en un tiempo determinado. Por tanto, el aumento de vigor podría determinar el, o afectar al, rendimiento de la planta o al rendimiento por tiempo de cultivo o área de cultivo.
Como se usa en el presente documento el término “aumentar” se refiere a un aumento de al menos aproximadamente 2 %, al menos aproximadamente 3 %, al menos aproximadamente 4 %, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 % o mayor en la tolerancia al estrés abiótico, en el crecimiento, en la biomasa, en el rendimiento y/o en el vigor de una planta en comparación con una planta nativa [es decir, una planta no modificada con las biomoléculas (polinucleótidos o polipéptidos) de la divulgación, por ejemplo, una planta no transformada de la misma especie que se cultiva en las mismas condiciones de cultivo].
Como se usa en el presente documento, la frase “polinucleótido exógeno” se refiere a una secuencia de ácido nucleico heterólogo que no puede expresarse naturalmente en la planta o cuya sobreexpresión se desea en la planta. El polinucleótido exógeno puede introducirse en la planta de una manera estable o transitoria, para producir una molécula de ácido ribonucleico (ARN) y/o una molécula polipeptídica. Debe observarse que el polinucleótido exógeno puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o parcialmente homóloga a una secuencia de ácido nucleico endógeno de la planta.
Como se ha mencionado, el polinucleótido exógeno de la divulgación codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 81 %, al menos aproximadamente 82 %, al menos aproximadamente 84 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 86 %, al menos aproximadamente 87 %, al menos aproximadamente 88 %, al menos aproximadamente 89 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o más, es decir, del 100 % con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 201.
La homología (por ejemplo, porcentaje de homología) puede determinarse usando cualquier programa informático de comparación de homología, incluyendo, por ejemplo, el programa informático BlastP o TBLASTN del National Center o Biotechnology Information (NCBI) tal como usando parámetros por defecto, cuando se comienza desde una secuencia polipeptídica; o el algoritmo tBLASTX (disponible en el NCBI) tal como usando parámetros por defecto, que compara los seis productos de traducción conceptuales en fase de una secuencia de búsqueda de nucleótidos (ambas cadenas) frente a una base de datos de secuencias de proteínas.
Las secuencias homólogas incluyen secuencias tanto ortólogas como parálogas. El término “parálogo” se refiere a duplicaciones génicas dentro del genoma de una especie que conduce a genes parólogos. El término “ortólogo” se refiere a genes homólogos en diferentes organismos debido a una relación ancestral.
Una opción para identificar ortólogos en especies de plantas monocotiledóneas, es realizar una búsqueda blast recíproca. Esto puede realizarse mediante una primera búsqueda blast que implique aplicar el programa blast a la secuencia de interés contra cualquier base de datos de secuencia, tal como la base de datos del NCBI disponible al público que puede encontrarse en el: Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) ncbi (.) nlm (.)
nih (.) gov. Si se buscan ortólogos en arroz, a la secuencia de interés se la podría aplicar el programa blast, por ejemplo, contra los 28.469 clones de ADNc de longitud completa de Oryza sativa Nipponbare, disponible en el NCBI. Los resultados del blast pueden filtrarse. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o no filtrados se analizan de nuevo con el programa blast (segundo blast) contra las secuencias del organismo del cual procede la secuencia de interés. Después, los resultados del primer y segundo blast se comparan. Un ortólogo se identifica cuando la secuencia resultante en la puntuación más alta (mayor acierto) en el primer blast identifica en el segundo blast la secuencia de búsqueda (la secuencia original de interés) como el mejor acierto. Usando la misma lógica, se encuentra un parálogo (homólogo a un gen en el mismo organismo). En caso de familias de secuencias grandes, puede usarse del programa ClustaIW [Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) ebi (.) ac (.) uk/Tools/clustalw2/index (.) html], seguido de un árbol de unión del vecino más próximo (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://en (.) Wikipedia (.) org/wiki/Neighbor-joining) que ayuda a visualizar la agrupación.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el polinucleótido exógeno codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación el polinucleótido exógeno comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 81 %, al menos aproximadamente 82 %, al menos aproximadamente 83 %, al menos aproximadamente 84 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 86 %, al menos aproximadamente 87 %, al menos aproximadamente 88 %, al menos aproximadamente 89 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, por ejemplo, 100 % idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos: 1530, 1531.
La identidad (por ejemplo, porcentaje de homología) puede determinarse usando cualquier programa informático de comparación de homología, incluyendo, por ejemplo, el programa informático BlastN del National Center of Biotechnology Information (NCBI) tal como usando parámetros por defecto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el polinucleótido exógeno es al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 81 %, al menos aproximadamente 82 %, al menos aproximadamente 83 %, al menos aproximadamente 84 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 86 %, al menos aproximadamente 87 %, al menos aproximadamente 88 %, al menos aproximadamente 89 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, por ejemplo, 100 %, idéntico al polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nos: 1530, 1531.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación el polinucleótido exógeno se expone en las SEC ID Nos: 1530, 1531.
Como se usa en el presente documento el término “polinucleótido” se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos mono o bicatenaria que se aísla y se proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómica y/o secuencias de polinucleótidos compuestas (por ejemplo, una combinación de las anteriores).
Como se usa en el presente documento, la frase “secuencia de polinucleótidos complementaria” se refiere a una secuencia, que es el resultado de la transcripción inversa de ARN mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Dicha secuencia puede amplificarse posteriormente in vivo o in vitro usando una ADN polimerasa dependiente de ADN.
Como se usa en el presente documento, la frase “secuencia de polinucleótidos genómica” se refiere a una secuencia (identificada o aislada) que procede de un cromosoma y por tanto representa una parte contigua de un cromosoma.
Como se usa en el presente documento la frase “secuencia de polinucleótidos compuesta” se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exónicas necesarias para codificar el polipéptido de la presente invención, así como algunas secuencias intrónicas interpuestas entre las mismas. Las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo de otros genes, y típicamente incluirán secuencias señalizadoras de corte y empalme conservadas. Dichas secuencias intrónicas pueden incluir adicionalmente elementos reguladores de expresión que actúan en cis.
La expresión de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la presente invención puede optimizarse. Un ejemplo no limitante de una secuencia de ácidos nucleicos optimizada se proporciona en la SEC ID Nº: 1531, que codifica el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201. Los ejemplos de dichas modificaciones de secuencia incluyen, pero sin limitación, un contenido de G/C alterado para una estrategia más estrecha que la típicamente encontrada en especies de plantas de interés y la retirada de codones atípicamente encontrada en las especies de plantas normalmente se denomina optimización de codones.
La frase “optimización de codones” se refiere a la selección de nucleótidos de ADN apropiados para su uso dentro de un gen estructural o fragmento del mismo que aborda el uso de codones dentro de la planta de interés. Por lo tanto, un gen optimizado o una secuencia de ácidos nucleicos optimizada se refieren a un gen en el que la secuencia de nucleótidos de un gen nativo o de origen natural se ha modificado para utilizar codones estadísticamente favorecidos o estadísticamente preferidos en la planta. Típicamente, la secuencia de nucleótidos se examina al nivel de ADN y la región codificante se optimiza para la expresión en la especie vegetal determinada usando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, como describen Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15: 677-681). En este método, la desviación típica del uso de codones, una medida del sesgo del uso de codones, puede calcularse para hallar primero la desviación cuadrática proporcional del uso de cada codón del gen nativo con respecto a la de genes de plantas altamente expresados, seguido de un cálculo de la desviación cuadrática media. La fórmula usada es: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, en la que Xn se refiere a la frecuencia de uso de n codones en genes de plantas altamente expresados, en la que Yn es la frecuencia de uso de n codones en el gen de interés y N se refiere al número total de codones en el gen de interés. Usando los datos de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17: 477-498), se recopila una Tabla del uso de codones de genes altamente expresados de plantas dicotiledóneas.
Un método para optimizar la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con el uso de codones preferidos para un tipo de célula de planta particular, se basa en el uso directo, sin realizar ningún cálculo estadístico extra, de Tablas de optimización de codones, tales como las proporcionadas on-line en la Base de Datos de Uso de Codones a través del banco de ADN del NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) en Japón (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) kazusa (.) o (.) jp/codon/). La base de datos de uso de codones contiene Tablas de uso de codones para diversas especies diferentes, habiéndose determinado estadísticamente cada Tabla de uso de codones basándose en los datos presentes en el Genbank.
Usando las Tablas anteriores para determinar los codones más preferidos o más favorecidos para cada aminoácido en una especie particular (por ejemplo, arroz), una secuencia de nucleótidos de origen natural que codifica una proteína de interés puede optimizarse por codones para esa especie de planta particular. Esto se efectúa reemplazando codones que puedan tengan una frecuencia estadísticamente baja en el genoma de la especie en particular por codones correspondientes, en lo que respecta a un aminoácido, que están estadísticamente más favorecidos. Sin embargo, puede seleccionarse uno o más codones menos favorecidos para delecionar sitios de restricción existentes, para crear nuevos sitios en uniones posiblemente útiles (extremos 5’ y 3’ para añadir un péptido de señal o casetes de terminación, sitios internos que podrían usarse para cortar y cortar y empalmar segmentos entre sí para producir una secuencia de longitud completa correcta) o para eliminar secuencias de nucleótidos que pueden afectar negativamente a la estabilidad o expresión del ARNm.
La secuencia de nucleótidos codificada de origen natural puede, ya con antelación a cualquier modificación, contener diversos codones que corresponden a un codón estadísticamente favorecido en una especie de planta particular. Por lo tanto, la optimización por codones de la secuencia de nucleótidos nativa puede comprender determinar qué codones, dentro de la secuencia de nucleótidos nativa, no están estadísticamente favorecidos con respecto a una planta particular, y modificar estos codones de acuerdo con la tabla de uso de codones de la planta particular para producir un derivado optimizado por codones. Una secuencia de nucleótidos modificada puede optimizarse completa o parcialmente para el uso de codones de plantas siempre que la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos modificada se produzca a un nivel más alto que el de la proteína codificada por el gen nativo o de origen natural correspondiente. La construcción de genes sintéticos alterando el uso de codones se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente PCT 93/07278.
Por lo tanto, la divulgación, incluye secuencias de ácidos nucleicos descritas anteriormente en el presente documento; fragmentos de las mismas, secuencias que pueden hibridarse con estas, secuencias homólogas a estas, secuencias que codifican polipéptidos similares con diferente uso de codones, secuencias alteradas caracterizadas por mutaciones, tales como deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, bien de origen natural o inducidas por el hombre, bien al azar o de un modo dirigido.
La divulgación proporciona un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos con una homología de al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 81 %, al menos aproximadamente 82 %, al menos aproximadamente 83 %, al menos aproximadamente 84 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 86 %, al menos aproximadamente 87 %, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos
aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o más, por ejemplo, del 100 % con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 201.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido se expone en la SEC ID Nº: 201.
La invención también incluye fragmentos de los polipéptidos descritos anteriormente y polipéptidos que tienen mutaciones, tales como deleciones, inserciones o sustituciones de uno o más aminoácidos, bien de origen natural o inducidas por el hombre, bien al azar o de un modo dirigido.
El término “planta”, como se usa en el presente documento, incluye plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y partes de la planta, incluyendo semillas, brotes, tallos, raíces (incluyendo tubérculos) y células, tejidos y órganos de la planta. La planta puede tener cualquier forma, incluyendo cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callos, hojas, gametocitos, esporofitos, polen y microesporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la divulgación incluyen todas las plantas que pertenecen a la súper familia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen leguminosas de pasto o forraje, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica.spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, coles de Bruselas, repollo, colza, zanahoria, coliflor, apio, berza, lino, col rizada, lenteja, cánola, quimbombó, cebolla, patata, arroz, soja, paja, remolacha, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, maíz, trigo, cebada, centeno, avena, cacahuete, guisante pinto, lenteja y alfalfa, algodón, soja, canola, pimiento, girasol, tabaco, berenjena, eucalipto, un árbol, una planta ornamental, una herbácea perenne y un cultivo forrajero. Como alternativa, en los métodos de la presente divulgación pueden usarse algas y otras plantas que no sean de la superfamilia Viridiplantae.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, las plantas usadas en el método de la invención son: una planta de cultivo, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, cacahuete, patata, sésamo, olivo, aceite de palma, banana, soja, girasol, canola, caña de azúcar, alfalfa, mijo, leguminosas (judía, guisante pinto), lino, altramuz, colza, tabaco, álamo y algodón.
La expresión del polinucleótido exógeno de la divulgación en la planta puede efectuarse transformando una o más células de la planta con el polinucleótido exógeno, seguido de la generación de una planta madura de las células transformadas y del cultivo de la planta madura en condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótido exógeno en la planta madura.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, la transformación se efectúa introduciendo en la célula de la planta una construcción de ácido nucleico que incluye el polinucleótido exógeno de algunas realizaciones de la divulgación y al menos un promotor capaz de dirigir la transcripción del polinucleótido exógeno en la célula de la planta. A continuación, más adelante, se proporcionan detalles de estrategias de transformación adecuadas.
Como se usa en el presente documento, el término “promotor” se refiere a una región de ADN que se encuentra aguas arriba del sitio de inicio transcripcional de un gen al cual se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción del ARN. El promotor controla dónde (por ejemplo, en que parte de una planta) y/o cuándo (por ejemplo, en qué fase
o estado de la vida de un organismo) se expresa el gen.
Puede usarse cualquier secuencia promotora adecuada para la construcción del ácido nucleico de la presente divulgación. De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el promotor es un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, o un promotor inducible por estrés abiótico.
Los promotores constitutivos adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor 35S del CaMV (SEC ID Nº: 1546; Odell et al., Nature 313:810-812, 1985); el promotor At6669 de Arabidopsis (SEC ID Nº: 1652; véase la Publicación PCT Nº WO04081173A2); Ubi 1 de maíz (Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18: 675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81: 581-588, 1991); 19S del CaMV (Nilsson et al., Physiol. Plant 100: 456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al., Plant J Nov; 2(6): 837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); ciclofilina de arroz (Bucholz et al., Plant Mol Biol. 25(5):83743, 1994); histona H3 de maíz (Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al., Plant J. 10(1); 107-121, 1996), el promotor constitutivo CT2 de la punta de las raíces (SEC ID Nº: 1535; véase también la Solicitud PCT Nº IL/2005/000627) y Súper MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Otros promotores constitutivos incluyen los indicados en las Patentes de Estados Unidos Nos 5.659.026, 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142.
Los promotores específicos de tejido adecuados incluyen, pero sin limitación, los promotores específicos de hoja [tales como los descritos, por ejemplo, por Yamamoto et al., Plant J. 12: 255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol.
105: 357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35: 773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3: 509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138, 1993; y Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9586-9590, 1993], promotores preferidos de semilla [por ejemplo, de genes específicos de semilla (Simon, et al., Plant Mol. Biol.
5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), albúmina de nuez de Brasil (Pearson’ et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zeína (Matzke et al., Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al., Planta 199: 515-519, 1996), SPA de Trigo (Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina de girasol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992)], promotores específicos de endospermo [por ejemplo, glutelina-1 de trigo de BPM y APM (Mol Gen Genet 216: 81-90, 1989; NAR 17:461-2), gliadinas a, b y g de trigo (EMBO3: 1409-15, 1984), promotor ltrl. de cebada, hordeina B1, C, D de cebada (Theor Appl Gen 98: 1253-62, 1999; Plant J 4: 343-55, 1993; Mol Gen Genet 250: 750- 60, 1996), DOF de Cebada (Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina NRP33 de arroz, globulina Glb-1 de arroz (Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), alfa-globulina de arroz REB/OHP-1 (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22,1997), ADP-glucosa PP de arroz (Trans Res 6: 157-68, 1997), familia de genes ESR de maíz (Plant J 12: 235-46, 1997), gamma-kafirina de sorgo (PMB 32: 1029-35, 1996)], promotores específicos de embrión [por ejemplo, OSH1 de arroz (Sato et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999), oleosina de arroz (Wu et at, J. Biochem., 123: 386, 1998)], y promotores específicos de flor [por ejemplo, AtPRP4, caleno sintasa (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al., Mol. Gen Genet. 217: 240-245; 1989), apétala3].
Los promotores inducibles por estrés abiótico adecuados incluyen, pero sin limitación, promotores inducibles por sal, tales como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236: 331-340, 1993); promotores inducibles por sequía, tal como el promoter del gen rab17 de maíz (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21: 259-266, 1993), el promotor del gen rab28 de maíz (Busk et. al., Plant J. 11: 1285-1295, 1997) y el promotor del gen Ivr2 de maíz (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39: 373-380, 1999); promotores inducibles por calor tal como el promotor hsp80 inducible por calor del tomate (Patente de Estados Unidos Nº 5.187.267).
La construcción de ácido nucleico de algunas realizaciones de la divulgación puede incluir adicionalmente un marcador de selección y/o un origen de replicación apropiados. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la construcción de ácido nucleico utilizada es un vector lanzadera, que puede propagarse tanto en E. coli (donde la construcción comprende un marcador de selección y un origen de replicación apropiados) como ser compatible con la propagación en células. La construcción de acuerdo con la presente divulgación puede ser, por ejemplo, un plásmido, un bácmido, un fagémido, un cósmido, un fago, un virus o un cromosoma artificial.
La construcción de ácido nucleico de algunas realizaciones de la divulgación puede utilizarse para transformar de manera estable o transitoria células de plantas. En la transformación estable, el polinucleótido exógeno se integra en el genoma de la planta y como tal esto representa un rasgo estable y heredado. En la transformación transitoria, la célula transformada expresa el polinucleótido exógeno pero no está integrado en el genoma y como tal esto representa un rasgo transitorio.
Existen diversos métodos para introducir genes ajenos en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42: 205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338: 274-276).
Los métodos principales para efectuar la integración estable de ADN exógeno en ADN genómico de plantas incluyen dos estrategias principales:
(i)
transferencia de genes mediada por Agrobacterium: (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee y Rogers en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) págs. 2-25; Gatenby, en Plant Biotechnology, eds Kung, S. y Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) págs. 93-112.
(ii)
captación directa de ADN: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) págs. 52-68; incluyendo métodos de captación directa de ADN en protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074. Captación de ADN inducida por electrochoque breve de células de planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7: 379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319: 791-793. Inyección de ADN en células o tejidos de plantas mediante bombardeo con partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6: 559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6: 923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79: 206-209; mediante el uso de sistemas con micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:3 0-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79: 213-217; transformación con whiskers de carburo de silicio o fibra de vidrio de cultivos de células, de tejidos de embriones o de callos, Patente de Estados Unidos Nº 5.464.765 o por incubación directa de ADN con polen en germinación, DeWet et al. en Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. y Mantell, S. H. y Daniels, W. Longman, Londres, (1985) págs. 197-209; y Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986)
83: 715-719.
El sistema Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que están integrados en el ADN genómico de la planta. Los métodos de inoculación del tejido de la planta varían dependiendo de la especie de la planta y del sistema de suministro de Agrobacterium. Una estrategia muy usada es el procedimiento con disco foliar que puede realizarse con cualquier explante tisular que proporcione una buena fuente para iniciar la diferenciación de toda la planta. Véase, por ejemplo, Horsch et al. en Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) págs. 1-9. Una estrategia complementaria emplea el sistema de suministro de Agrobacterium en combinación con infiltración al vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente viable en la creación de planta dicotiledóneas transgénicas.
Existen diversos métodos de transferencia directa de ADN en las células de las plantas. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un fuerte campo eléctrico. En la microinyección, el ADN se inyecta mecánicamente directamente en las células usando micropipetas muy pequeñas. En el bombardeo con micropartículas, el ADN se adsorbe en microproyectiles, tales como cristales de sulfato de manganeso o partículas de tungsteno, y los microproyectiles se aceleran físicamente en las células o tejidos de la planta.
Después de la transformación estable se realiza la propagación de la planta. El método más habitual para realizar la propagación de la planta es por semillas. Sin embargo, la regeneración mediante propagación por semillas, tiene el defecto de que, debido a la heterocigosidad, hay una ausencia de uniformidad en el cultivo, dado que las semillas se producen por plantas según variaciones genéticas regidas por las leyes de Mendel. Básicamente, cada semilla es genéticamente diferente y cada una de ellas crecerá con sus propios rasgos específicos. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se produzca de tal manera que la planta regenerada tenga los mismos rasgos y características que los de la planta transgénica parental. Por esta razón se prefiere que la planta transformada se regenere mediante micropropagación lo que proporciona una reproducción uniforme y rápida de las plantas transformadas.
La micropropagación es un proceso de cultivo de nuevas generaciones de plantas a partir de un solo trozo de tejido que se ha extraído de una planta o variedad de cultivo parental seleccionada. Este proceso permite la reproducción masiva de las plantas que tienen el tejido preferido que expresa la proteína de fusión. Las plantas de nueva generación que se producen son genéticamente idénticas a, y tienen todas las características de, la planta original. La micropropagación permite la producción masiva de material vegetal de calidad en un corto periodo de tiempo y ofrece una rápida multiplicación de las variedades de cultivo seleccionadas en la conservación de las características de la planta transformada o transgénica original. Las ventajas de la clonación de plantas son la velocidad de la multiplicación de la planta y la calidad y uniformidad de las plantas producidas.
La micropropagación es un procedimiento de fases múltiples que requiere la alteración del medio de cultivo o de las condiciones de cultivo entre las fases. Por tanto, el proceso de micropropagación implica cuatro fases básicas: fase una, cultivo tisular inicial; fase dos, multiplicación del cultivo tisular; fase tres, diferenciación y formación de la planta; y fase cuatro, cultivo y fortalecimiento en invernadero. Durante la fase uno de cultivo tisular inicial, el cultivo tisular se establece y se verifica que está libre de contaminantes. Durante la fase dos, el cultivo tisular inicial se multiplica hasta producir un número suficiente de muestras tisulares para alcanzar los objetivos de producción. Durante la fase tres, las muestras tisulares cultivadas en la fase dos se dividen y se desarrollan en plántulas individuales. En la fase cuatro, las plántulas transformadas se transfieren a un invernadero para fortalecerse, donde la tolerancia de las plantas a la luz se aumenta gradualmente de tal manera que puedan crecer en un entorno natural.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, las plantas transgénicas se generan por transformación transitoria de células foliares, células meristemáticas o de toda la planta.
La transformación transitoria puede efectuarse mediante cualquiera de los métodos de transferencia directa de ADN descritos anteriormente o mediante infección viral usando virus de plantas modificados.
Los virus que se ha demostrado que son útiles para la transformación de huéspedes de plantas incluyen CaMV, virus del mosaico del Tabaco (TMV), virus del mosaico del bromo (BMV) y Virus del Mosaico Común de la Judía (BV
o BCMV). La transformación de plantas usando virus de plantas se describe en la Patente de Estados Unidos Nº
4.855.237 (virus del mosaico amarillo de la judía; BGV), EP-A 67.553 (TMV), Solicitud Publicada Japonesa Nº 6314693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); y Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, págs. 172-189 (1988). En el documento WO 87/06261 se describen partículas de Pseudovirus para su uso en la expresión de ADN exógeno en muchos hospedadores, incluyendo plantas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el virus usado para las transformaciones transitorias es un virus avirulento y por tanto incapaz de causar graves síntomas tales como tasa de crecimiento reducida, mosaico, manchas anulares, enrollamiento foliar, amarillamiento, formación de vetas, formación de pústulas, formación de tumores y picaduras. Un virus avirulento adecuado puede ser un virus avirulento de origen natural o un virus artificialmente atenuado. La atenuación de virus puede efectuarse usando métodos bien conocidos en la técnica incluyendo, pero sin imitación, calentamiento subletal, tratamiento químico o mediante técnicas de mutagénesis dirigida, como las descritas, por ejemplo, por Kurihara y Watanabe (Molecular Plant Pathology 4: 259-269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) y Huet et al. (1994).
Pueden obtenerse cepas de virus adecuadas procedentes de fuentes disponibles tales como, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) o por aislamiento de plantas infectadas. El aislamiento de virus de tejidos de plantas infectadas puede efectuarse por técnicas bien conocidas en la materia, tales como las descritas, por ejemplo, por Foster y Tatlor, Eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998. En resumen, los tejidos de una planta infectada, que se piensa que contiene una alta concentración de un virus adecuado, preferentemente hojas y pétalos de flores jóvenes, se cultivan en una solución tampón (por ejemplo, solución de tampón fosfato) para producir una savia infectada con virus que puede usarse en inoculaciones posteriores.
La construcción de virus de ARN de plantas para la introducción y expresión de secuencias de polinucleótidos exógenos no virales en plantas, se demuestra en las referencias anteriores, así como en Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172: 285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:12941297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; y en Patente de Estados Unidos Nº 5.316.931.
Cuando el virus es un virus de ADN, pueden realizarse modificaciones adecuadas en el propio virus. Como alternativa, el virus puede clonarse primero en un plásmido bacteriano para facilitar la construcción del vector viral deseado con el ADN exógeno. Después, el virus puede extraerse del plásmido. Si el virus es un virus de ADN, al ADN viral puede unirse un origen de replicación bacteriano, que después replica la bacteria. La transcripción y traducción de este ADN producirá la proteína de recubrimiento que encapsidará el ADN viral. Si el virus es un virus de ARN, el virus se clona generalmente como un ADNc y se inserta en un plásmido. Después, el plásmido se usa para fabricar todas las construcciones. El virus de ARN se produce después transcribiendo la secuencia viral del plásmido y traduciendo los genes virales para producir una o más proteínas de recubrimiento que encapsidan el ARN viral.
En una realización, se proporciona un polinucleótido viral de planta en el que se ha insertado la secuencia codificante de la proteína de recubrimiento nativa que se ha delecionado de un polinucleótido viral, una secuencia codificante de la proteína de recubrimiento viral de una planta no nativa y un promotor no nativo, preferentemente el promotor subgenómico de la secuencia codificante de la proteína de recubrimiento no nativa, capaz de expresión en la planta hospedadora, empaquetar el polinucleótido viral de la planta recombinante y garantizar una infección sistémica del hospedador mediante el polinucleótido viral de la planta recombinante. Como alternativa, el gen de la proteína de recubrimiento puede inactivarse por inserción de la secuencia de polinucleótidos no nativa en su interior, de tal manera que se produce una proteína. El polinucleótido viral de la planta recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales. Cada promotor subgenómico no nativo puede transcribir o expresar genes adyacentes o secuencias de polinucleótidos en la planta hospedadora y no puede recombinarse entre sí ni con promotores subgenómicos nativos. Las secuencias de polinucleótidos (exógenas) no nativas pueden insertarse adyacentes al promotor subgenómico viral de la planta nativa o a los promotores subgenómicos virales de la planta nativa y no nativa si se incluye más de una secuencia de polinucleótidos. Las secuencias de polinucleótidos no nativas se transcriben o expresan en la planta hospedadora bajo el control del promotor subgenómico para producir los productos deseados.
En una segunda realización, al igual que en la primera realización, se proporciona un polinucleótido viral de planta recombinante, salvo que la secuencia codificante de la proteína de recubrimiento nativa se coloca adyacente a uno de los promotores sugbenómicos de la proteína de recubrimiento no nativa en lugar de a una secuencia codificante de la proteína de recubrimiento no nativa.
En una tercera realización, se proporciona un polinucleótido viral de planta recombinante en el que el gen de la proteína de recubrimiento nativa es adyacente a su promotor subgenómico y uno o más promotores subgenómicos no nativos se han insertado en el polinucleótido viral. Los promotores subgenómicos no nativos insertados pueden transcribir o expresar genes adyacentes en una planta hospedadora y no pueden recombinarse entre sí ni con promotores subgenómicos nativos. Las secuencias de polinucleótidos no nativas pueden insertarse adyacentes a los promotores virales de plantas subgenómicos no nativos de tal manera que las secuencias se transcriben o expresan en la planta hospedadora bajo el control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado.
En una cuarta realización, al igual que en la tercera realización, se proporciona un polinucleótido viral de planta recombinante, salvo que la secuencia codificante de la proteína de recubrimiento nativa se reemplaza por una secuencia codificante de la proteína de recubrimiento no nativa.
Los vectores virales están encapsidados por las proteínas de recubrimiento codificadas por el polinucleótido viral de la planta recombinante para producir un virus de planta recombinante. El polinucleótido viral de planta recombinante
o virus de planta recombinante se usa para infectar plantas hospedadoras apropiadas. El polinucleótido viral de planta recombinante puede replicarse en el hospedador, propagarse sistémicamente en el hospedador y transcribir o expresar uno o más genes ajenos (polinucleótido exógeno) en el hospedador para producir la proteína deseada.
En Foster y Taylor, eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998; Maramorosh y Koprowski, eds. “Methods in Virology” 7 vols, Academic Press, Nueva York 1967-1984; Hill, S.A. “Methods in Plant Virology”, Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. “Applied Plant Virology”, Wiley, Nueva York, 1985; y Kado y Agrawa, eds. “Principles and Techniques in Plant Virology”, Van Nostrand-Reinhold, Nueva York pueden encontrarse técnicas para la inoculación de virus en plantas.
Además de lo anterior, el polinucleótido de la presente invención también puede introducirse en un genoma de cloroplasto mediante lo cual se facilita la expresión del cloroplasto.
Se conoce una técnica para introducir secuencias de polinucleótidos exógenas en el genoma de los cloroplastos. Esta técnica implica los siguientes procedimientos. En primer lugar, las células de la planta se tratan químicamente para reducir el número de cloroplastos por célula a aproximadamente uno. Después, se introduce el polinucleótido exógeno mediante bombardeo de partículas en las células con el objetivo de introducir al menos una molécula de polinucleótido exógeno en el cloroplasto. El polinucleótido exógeno se selecciona de tal manera que sea integrable en el genoma del cloroplasto mediante recombinación homóloga fácilmente efectuada por enzimas intrínsecas al cloroplasto. Para esta finalidad, el polinucleótido exógeno incluye, además de un gen de interés, al menos un tramo polinucleotídico que procede del genoma del cloroplasto. Además, el polinucleótido exógeno incluye un marcador de selección, que desempeña procedimientos de selección secuenciales para confirmar que todas, o sustancialmente todas, las copias de los genomas del cloroplasto, después de dicha selección, incluirán el polinucleótido exógeno. Detalles adicionales con respecto a esta técnica se encuentran en las Patentes de Estados Unidos Nos 4.945.050; y
5.693.507. Un polipéptido puede por tanto producirse por el sistema de expresión de proteínas del cloroplasto y llegar a integrarse en la membrana interna del cloroplasto.
Dado que la tolerancia al estrés abiótico, el crecimiento, la biomasa, el rendimiento y/o el vigor en las plantas puede implicar la acción de genes múltiples de manera aditiva o en sinergia (véase, por ejemplo, Quesda et al., Plant Physiol. 130: 951-063, 2002), la presente divulgación también contempla expresar una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una sola planta hospedadora para así obtener un efecto superior sobre la tolerancia al estrés abiótico, crecimiento, biomasa, rendimiento y/o vigor.
La expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una sola planta hospedadora puede efectuarse cointroduciendo construcciones de ácido nucleico múltiples, incluyendo cada una de ellas, un polinucleótido exógeno diferente, en una sola célula de planta. La célula transformada puede después regenerarse en una planta madura usando los métodos descritos anteriormente en el presente documento.
Como alternativa, la expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una sola planta hospedadora puede efectuarse co-introduciendo en una sola célula de planta una sola construcción de ácido nucleico que incluya una pluralidad de polinucleótidos exógenos diferentes. Dicha construcción puede diseñarse con una sola secuencia promotora que puede transcribir un ARN mensajero policistrónico incluyendo todas las diferentes secuencias de polinucleótidos exógenas diferentes. Para permitir la co-traducción de los diferentes polipéptidos codificados por el ARN mensajero policistrónico, las secuencias de polinucleótidos pueden interconexionarse mediante una secuencia de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) que facilita la traducción de las secuencias de polinucleótidos ubicadas aguas abajo de la secuencia IRES. En este caso, una molécula de ARN policistrónico transcrito que codifica los diferentes polipéptidos descritos anteriormente se traducirá desde el extremo 5’ protegido y las dos secuencias IRES internas de la molécula de ARN policistrónico para producir de este modo en la célula todos los polipéptidos diferentes. Como alternativa, la construcción puede incluir diversas secuencias promotoras, cada una de ellas unida a una secuencia de polinucleótidos diferente.
La célula de la planta transformada con la construcción incluyendo una pluralidad de polinucleótidos exógenos diferentes puede regenerarse en una planta madura, usando los métodos descritos anteriormente en el presente documento.
Como alternativa, la expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos puede efectuarse introduciendo diferentes construcciones de ácido nucleico, incluyendo polinucleótidos exógenos diferentes, en una pluralidad de plantas. Después, las plantas transformadas regeneradas pueden cruzarse y la progenie resultante puede seleccionarse con respecto a rasgos superiores de tolerancia al estrés abiótico, crecimiento, biomasa, rendimiento y/o vigor, usando técnicas convencionales de cultivo de plantas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, la planta que expresa el polinucleótido (o polinucleótidos) exógeno se cultiva en condiciones normales.
De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende adicionalmente cultivar la planta que expresa el polinucleótido (o polinucleótidos) exógeno con estrés abiótico.
Por tanto, la invención incluye plantas que expresan exógenamente (como se ha descrito anteriormente), el polinucleótido (o polinucleótidos) y/o el polipéptido (o polipéptidos) de la invención. Una vez expresado en la célula de la planta o en toda la planta, el nivel del polipéptido codificado por el polinucleótido exógeno puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica tales como, ensayos de actividad, transferencias de Western usando anticuerpos capaces de unirse específicamente al polipéptido, Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, inmunofluorescencia y similares.
Los métodos para determinar en la planta el nivel de ARN transcrito del polinucleótido exógeno son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, análisis de transferencia de Northen, análisis de reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (incluyendo RT-PCR cuantitativa, semi-cuantitativa o en tiempo real) e hibridación de ARN in situ.
Los polinucleótidos y polipéptidos descritos anteriormente en el presente documento pueden usarse en una amplia serie de plantas económicas, de manera inocua y rentable.
En efecto del transgén (el polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido) sobre la tolerancia al estrés abiótico, crecimiento, biomasa, rendimiento y/o vigor puede determinarse usando métodos conocidos.
Tolerancia al estrés abiótico - Plantas transformadas (es decir, que expresan el transgén) y no transformadas (de tipo natural) se exponen a una condición de estrés abiótico, tal como falta de agua, temperatura subóptima (baja temperatura, alta temperatura), déficit de nutrientes, exceso de nutrientes, a una condición de estrés salino, estrés osmótico, toxicidad a metales pesados, anaerobiosis, polución atmosférica y radiación UV.
Ensayo de tolerancia a la salinidad – Se espera que las plantas transgénicas con tolerancia a altas concentraciones de sal presenten mejor germinación, vigor o crecimiento de las semillas en condiciones con alto contenido en sal. El estrés salino puede efectuarse de muchas maneras, tal como, por ejemplo, regando las plantas con una solución híper osmótica, cultivando las plantas hidropónicamente en una solución de cultivo híper osmótica (por ejemplo, solución de Hoagland con sal añadida) o cultivando las plantas en un medio de cultivo híper osmótico [por ejemplo, medio Murashige-Skoog (medio MS) al 50 % de con sal añadida]. Dado que las diferentes plantas varían considerablemente en cuanto a su tolerancia con respecto a la salinidad, la concentración salina en el agua de riego, en la solución de cultivo o en el medio de cultivo, pueden ajustarse de acuerdo con las características específicas de la variedad de cultivo o variedad específica de una planta, para infringir un efecto leve o moderado sobre la fisiología y/o morfología de las plantas (para una orientación sobre la concentración apropiada véase, Bernstein y Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3ª ed. Waisel Y, Eshel A y Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., Nueva York, 2002, y referencias en su interior).
Por ejemplo, puede realizarse un ensayo de tolerancia a la salinidad regando plantas a diferentes fases de desarrollo con concentraciones en aumento de cloruro de sodio (por ejemplo NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM) aplicadas desde abajo y desde arriba para garantizar la dispersión homogénea de la sal. Después de la exposición a la condición de estrés, las plantas se monitorizan frecuentemente hasta que aparecen efectos fisiológicos y/o morfológicos sustanciales en las plantas de tipo natural. Por tanto, el aspecto fenotípico externo, el grado de marchitamiento y el éxito global para alcanzar la madurez y producir descendencia se compara entre las plantas de control y las transgénicas. Los parámetros cuantitativos de tolerancia medios incluyen, pero sin limitación, humedad promedio y peso seco, tasa de crecimiento, tamaño foliar, cobertura foliar (área foliar total), el peso de las semillas producidas, el tamaño promedio de la semilla y el número de semillas producidas por planta. Las plantas transformadas que no presentan efectos fisiológicos y/o morfológicos sustanciales, o que presentan mayor biomasa en comparación con las plantas de tipo natural, se identifican como plantas tolerantes al estrés abiótico.
Ensayo de tolerancia osmótico - Los ensayos de estrés osmótico (incluyendo ensayos con cloruro de sodio y PEG) se realizan para determinar si un fenotipo de estrés osmótico es específico de cloruro de sodio o si es un fenotipo
general relacionado con el estrés osmótico. Las plantas que son tolerantes al estrés osmótico pueden tener más tolerancia a la sequía y/o a la congelación. Para experimentos de estrés salino y osmótico, el medio se complementa, por ejemplo, con NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM o PEG al 15 %, 20 % o 25 %. Véanse también los Ejemplos 6 y 7 de la sección de Ejemplos más adelante.
Ensayo de tolerancia a la sequía/ensayo osmótico - La tolerancia a la sequía se realiza para identificar los genes que confieren una mejor supervivencia a las plantas después de falta de agua intensa. Para analizar si las plantas transgénicas son más tolerantes a la sequía, puede realizarse un estrés osmótico producido por el osmolito no iónico sorbitol en el medio. Las plantas de control y transgénicas germinan y se cultivan en placas de agar vegetal durante 4 días, después de los cuales se transfieren a placas que contienen sorbitol 500 mM. El tratamiento ocasiona retraso del crecimiento, después, las plantas tanto transgénicas como de control se comparan, midiendo el peso de la planta (húmedo y seco), el rendimiento y mediante tasas de crecimiento medidas como tiempo para la floración.
Por otro lado, se realizan exploraciones de sequía basadas en suelo con plantas que sobreexpresan los polinucleótidos detallados anteriormente. Las semillas de plantas de control de Arabidopsis, o de otras plantas transgénicas que sobreexpresan el polipéptido de la divulgación germinan y se transfieren a macetas. El estrés por sequía se obtiene después de parar de regar, acompañado por la colocación de las macetas en papel absorbente para potenciar la tasa de secado del suelo. Las plantas transgénicas y de control se comparan entre sí cuando la mayoría de las plantas de control desarrollan marchitamiento severo. Las plantas vuelven a regarse después obteniendo una fracción significativa de plantas de control que presentan un marchitamiento severo. Las plantas se clasifican comparando los controles para cada uno de dos criterios: tolerancia a las condiciones de sequía y recuperación después de volver a regar (supervivencia).
Tolerancia al estrés por frío – Una manera de analizar el estrés por frío es la siguiente. Plantas maduras (25 días de vida) se transfirieren a cámaras durante 1 o 2 meses a una temperatura de 4 ºC, con luz constitutiva. Después las plantas se vuelven a llevar al invernadero. Dos semanas después, se comparan los daños del periodo de enfriamiento, resultantes del retraso del crecimiento y otros fenotipos, entre las plantas de control y las transgénicas, midiendo el peso de la planta (húmedo y seco), y comparando las tasas de crecimiento medidas como tiempo de floración, tamaño de la planta, rendimiento y similares.
Tolerancia al estrés por calor – Una manera de medir la tolerancia al estrés por calor es exponer las plantas a temperaturas por encima de 34 ºC durante un periodo de tiempo determinado. La tolerancia de la planta se examina después de transferir las plantas de nuevo a 22 ºC para su recuperación y evaluación después de 5 días con respecto a controles internos (plantas no transgénicas) o plantas no expuestas ni a estrés por frío ni a estrés por calor.
Ensayos de germinación – Los ensayos de germinación comparan el porcentaje de semillas de las plantas transgénicas que pueden completar el proceso de germinación con respecto al porcentaje de semillas de plantas de control que se tratan de la misma manera. Se consideran condiciones normales, por ejemplo, incubaciones a 22 ºC con ciclos diarios de 22 horas de luz y de 2 horas de oscuridad. La evaluación de la germinación y el vigor de la plántula se realizan entre 4 y 14 días después de plantar. El medio basal es medio MS (Murashige y Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497) al 50 %.
La germinación se comprueba también en condiciones desfavorables tales como frío (incubando a temperaturas inferiores a 10 ºC en lugar de a 22 ºC) o usando soluciones de inhibición de semilla que contienen altas concentraciones de un osmolito tal como sorbitol (a concentraciones de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, y hasta 1000 mM) o aplicando concentraciones en aumento de sal (de NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM).
Efecto del transgén sobre el crecimiento, la biomasa, el rendimiento y/o el vigor de la planta - El vigor de la planta puede calcularse a través del aumento de los parámetros de crecimiento tales como el área foliar, la longitud de la fibra, el diámetro de la roseta, el peso fresco de la planta y similar por intervalo de tiempo.
La tasa de crecimiento puede medirse usando análisis digital del crecimiento de las plantas. Por ejemplo, cada tres días pueden capturarse imágenes de plantas que crecen en invernaderos en parcelas y puede calcularse el área de la roseta mediante análisis digital. El crecimiento del área de la roseta se calcula usando la diferencia del área de la roseta entre días de muestreo dividido entre la diferencia en días entre muestras.
Las mediciones del rendimiento de las semillas pueden realizarse recogiendo las semillas totales de 8-16 plantas juntas, pesándolas usando una balanza analítica y dividiendo el peso total entre el número de plantas. El área de crecimiento por semilla puede calcularse de la misma manera aunque teniendo en cuenta el área de crecimiento determinado de una sola planta. El aumento del rendimiento de la semilla por área de crecimiento puede obtenerse aumentando el rendimiento de la semilla por planta y/o aumentando el número de plantas capaces de crecer en un área determinada.
La evaluación del rendimiento de la semilla por planta puede realizarse midiendo la cantidad (peso o tamaño) o cifra (es decir, número) de las semillas secas producidas y cosechadas de 8-16 plantas y dividido entre el número de plantas.
La evaluación de la tasa de crecimiento puede realizarse midiendo la biomasa de la planta producida, el área de la roseta, el tamaño foliar o la longitud radicular por tiempo (que puede medirse en cm2 por día de área foliar).
La longitud de la fibra puede medirse usando un fibrógrafo. El sistema con fibrógrafo se usó para contar la longitud en cuanto a longitud “Media de la Mitad Superior”. La longitud media de la mitad superior (MMS) es la longitud promedio de la mitad más larga de la distribución de la fibra. El fibrógrafo mide la longitud en longitudes por tramos a un punto de porcentaje determinado (Protocolo de Transfer de Hipertexto://World Wide Web (.) cottoninc (.) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).
Por tanto, la presente invención es de alto valor agrícola para promover el rendimiento de cultivos comercialmente deseados (por ejemplo, biomasa de órganos vegetativos tales como madera de álamo, u órganos reproductores tales como diversas semillas o biomasa de semillas).
Como se usa en el presente documento el término “aproximadamente” se refiere a 10 %.
Los términos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye” y “que tiene” y sus conjugados significan “incluyendo pero sin limitación”.
La expresión “que consta de” significa “incluyendo y limitado a”.
La expresión “que consta esencialmente de” significa que la composición, el método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, las etapas y/o las partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y nuevas de la composición, método o estructura que se reivindica.
Como se usa en el presente documento, la forma singular “uno”, “una”, “el” y “la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto dictamine claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo sus mezclas.
A lo largo de esta solicitud, diversas realizaciones de la presente invención pueden presentarse en un formato de intervalos. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalos es exclusivamente por conveniencia y brevedad y no debe considerarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que en la descripción de un intervalo se han desvelado específicamente todos los subintervalos posibles así como los valores numéricos individuales dentro del intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo, tal como, de 1 a 6, debe considerarse que se ha desvelado específicamente en subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como en números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica con independencia de la amplitud del intervalo.
Siempre que en el presente documento se indique un intervalo numérico, se entiende que incluye cualquier número (fracción o entero) citado dentro del intervalo indicado. Las frases “que varía/varía entre” un primer número indicado y un segundo número indicado y “que varía/varía de” un primer número indicado “a” un segundo número indicado, se usan en el presente documento indistintamente y pretenden incluir el primer y segundo número indicado y todos los números, fracciones o enteros, entre los mismos.
Como se usa en el presente documento, el término “método” se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada incluyendo, pero sin limitación, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos bien conocidos, o fácilmente desarrollados de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los facultativos de la técnica química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.
Se aprecia que determinadas características de la invención, que por claridad se describen en el contexto de realizaciones distintas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la invención que, por brevedad se describen en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o, según sea adecuado, en cualquier realización descrita distinta de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de las diversas realizaciones no han de considerarse características esenciales de aquellas realizaciones, a menos que la realización sea inoperativa sin aquellos elementos.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención se han definido anteriormente en el presente documento y, como se reivindica más adelante en la sección de reivindicaciones, encuentran respaldo experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ahora, se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con la descripción anterior ilustran algunas realizaciones de la invención de modo no limitante. Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y en los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención, incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley y Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como las expuestas en las Patentes de Estados Unidos Nos 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 Y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la bibliografía de patente y científica, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 Y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se piensa que los procedimientos del presente documento son muy conocidos en la técnica y se proporcionan por comodidad para el lector.
EJEMPLO 1
IDENTIFICACIÓN DE SUPUESTOS GENES QUE AUMENTAN LA TOLERANCIA AL ESTRÉS ABIÓTICO Y O EL RENDIMIENTO/BIOMASA
Los autores de la presente invención han identificado genes que aumentan la tolerancia al estrés abiótico (TEAB) y/o la tasa de crecimiento/rendimiento/biomasa/vigor, de la siguiente manera. Los genes se validaron in vivo como previamente describió en el documento WO2004/104162 el presente cesionario. Todos los conjuntos de datos de secuencias de nucleótidos usados en el presente documento se originaron en bases de datos disponibles al público. Los datos de secuencias de 50 especies diferentes (principalmente especies vegetales) se introdujeron en una sola base de datos integral.
También se incorpora otra información sobre la expresión de genes, anotación de proteínas, enzimas y rutas. Las bases de datos principales usadas incluyen:
●
Genomas
○
Genoma de Arabidopsis [genoma TAIR versión 6 (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) Arabidopsis (.) org/)]
○
Genoma de arroz [construcción IRGSP 4.0 (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rgp (.) dna (.) affrc (.) go (.) jp/IRGSP/)].
○
Álamo [Populus trichocarpa versión 1.1 de JGI (ensamblaje versión v1.0) (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) genome (.) jgi-psf (.) org/)]
○
Brachypodium [JGI 4x ensamblaje Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) brachpodium (.) org)]
○
Soja [DOE-JGI SCP, versión Glyma0 (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) phytozome (.) net/)]
○
Uva [NCBI WGS ensamblaje ftp://ftp (.) ncbi (.) nih (.) gov/ genbank/wgs/)]
○
Ricino [TIGR/J Craig Venter Institute 4x ensamblaje
○
Protocolo de Transferencia de Hipertexto://msc (.) jcvi (.) org/r_communis
○
Sorgo [DOE-JGI SCP, version Sbi1 Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) phytozome (.) net/)].
●
Las secuencias de EST (del acrónimo Expressed Sequence Tags, etiquetas de secuencia expresada) expresadas y de ARNm se extrajeron de
○
GeneBank versiones 154, 157, 160, 161, 164, y 165 (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov/dbEST/)
○
RefSeq (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov/RefSeq/).
○
TAIR (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) arabidopsis (.) org/).
●
Las bases de datos de proteínas y rutas se extrajeron de
○
Uniprot (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web.expasy.uniprot.org/).
○
AraCyc (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) arabidopsis (.) org/biocyc/index (.) jsp).
○
ENZYME (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://expasy.org/enzyme/).
●
Los conjuntos de datos de micromatrices se descargaron de
○
GEO (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
○
TAIR (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web.arabidopsis.org/).
○
Datos de micromatrices de la fibra de algodón de la patente de Evogene
●
Información QTL (acrónimo de Quantitative Trait Locus, locus de carácter cuantitativo
○ Gramene (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) gramene (.) org/qtl/).
Se realizó un ensamblaje de Bases de Datos para construir una base de datos amplia, rica, fiable, anotada y fácil de analizar que comprendía datos de secuencias de ARNm genómico, EST y ADN, de diversos cultivos así como datos de expresión de genes, anotación de proteínas y rutas, QTL, y otra información relevante.
El ensamblaje de las bases de datos comprendía una aplicación de herramientas de refinamiento de genes, estructuración, anotación y análisis que permitía construir una base de datos a medida para cada proyecto de descubrimiento génico. Las herramientas del refinamiento de genes y estructuración permiten detectar, de manera fiable, variantes de corte y empalme y transcritos antisentido, generando el entendimiento de los posibles diversos resultados fenotípicos de un solo gen. La capacidad de la plataforma “LEADS” de Compugen LTD para analizar el genoma humano se ha confirmado y aceptado por el comité científico (“Widespread Antisense Transcription”, Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; “Splicing of Alu Sequences”, Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91), y también ha demostrado ser la más eficaz en genómica de plantas.
Agrupamiento de EST y ensamblaje de genes - Para agrupar y ensamblar genes de arabidopsis y de arroz se empleó la versión “genomic LEADS”. Esta herramienta permite agrupar de un modo más exacto secuencias de EST y de ARNm en el genoma y predice la estructura génica así como eventos de corte y empalme alternativo y transcripción antisentido.
Para organismos con datos de secuencias de genoma completo no disponibles, se aplicó “LEADS expresado”, así como el programa informático de agrupamiento TIGR (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) tigr (.) org/). Los resultados de las dos herramientas de agrupamiento se compararon y en los casos en los que los grupos previstos por las dos herramientas eran significativamente diferentes, se presentaron y se consideraron las dos versiones.
Anotación de genes – los genes y las proteínas previstos(as) se anotaron de la siguiente manera:
•
Se realizó búsqueda con Blast (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov (.) library (.) vu (.) edu (.) au/BLAST/) contra todas las secuencias UniProt de plantas (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) expasy (.) uniprot (.) org/).
•
Se utilizaron cálculos con Frame-Finder (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) ebi (.) ac (.) uk/~guy/estate/) con valores estadísticos por defecto para predecir secuencias de proteínas para cada transcrito.
•
Las proteínas previstas se analizaron con InterPro (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) ebi (.) ac (.) uk/interpro/).
•
Se usaron proteínas contra Blast de las bases de datos de AraCyc y ENZYME para mapear los transcritos previstos para las rutas AraCyc.
•
Cada transcrito se comparó usando el algoritmo tblastx (Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov (.) library (.) vu (.) edu (.) au/BLAST/) contra el resto de las bases de datos de otros organismos para validar la exactitud de la secuencia de proteínas prevista y para una detección eficaz de ortólogos.
Perfil de expresión de genes - Se aprovecharon muy pocas fuentes de datos para realizar el perfil de expresión de genes, particularmente datos de micromatriz y de perfil de expresión digital (véase más adelante). De acuerdo con el perfil de expresión de genes, se realizó un análisis de correlación para identificar genes que estaban co-regulados en diferentes fases de desarrollo y condiciones ambientales.
Se descargaron conjuntos de datos de micromatrices disponibles para el público de los sitios TAIR y NCBI GEO, se renormalizaron y se integraron en las bases de datos. El perfil de expresión fue uno de los datos de recursos más importantes para identificar genes importantes para la TEAB. Además, cuando genes homólogos de diferentes cultivos eran sensibles a la TEAB, los genes se marcaban como “altamente predictivos para mejorar la TEAB”.
Se recopiló un resumen de perfil de expresión digital para cada grupo de acuerdo con todas las palabras clave incluidas en los registros de secuencias que comprendían el grupo. La expresión digital, también conocida como transferencia de Northern electrónica, es una herramienta que muestra un perfil de expresión virtual basado en las secuencias EST que forman el grupo génico. La herramienta puede proporcionar el perfil de expresión de un grupo en cuanto a la anatomía de la planta (al ser los tejidos/órganos el gen expresado), fase de desarrollo (las fases de desarrollo a las que puede encontrarse un gen) y perfil de tratamiento (que proporciona las condiciones fisiológicas en las que se expresa un gen, tal como sequía, frío, infección por patógenos, etc.). Dada una distribución al azar de las EST en los diferentes grupos, la expresión digital proporciona un valor de probabilidad que describe la probabilidad de un grupo que tiene un total de N EST para contener X EST de una determinada colección de bibliotecas. Para efectuar los cálculos de probabilidad se tiene en cuenta: a) el número de EST en el grupo, b) el número de un EST de las bibliotecas implicadas y relacionadas, c) el número total de EST disponibles que representan las especies. Por lo tanto los grupos con valores de baja probabilidad están enormemente enriquecidos con EST del grupo de bibliotecas de interés indicando una expresión especializada.
Los conceptos de ortología y paralogía se han aplicado recientemente a caracterizaciones y clasificaciones funcionales en la escala de comparaciones de todo el genoma. Los ortólogos y parálogos constituyen dos tipos de homólogos principales los primeros evolucionaron de un ancestro común por especialización y los segundos están relacionados por eventos de duplicación. Se supone que los parálogos surgen de eventos de duplicación antiguos cuya función probablemente ha divergido mientras que es más probable que los ortólogos verdaderos no conserven la misma función a lo largo de la evolución.
Para investigar e identificar adicionalmente supuestos genes ortólogos de especies monocotiledóneas con TEAB, se integraron dos métodos informáticos:
(i)
Método para alineaciones de secuencias ortólogas - basado en la construcción de grupos ortólogos a través de múltiples taxones eucariotas, usando modificaciones en el algoritmo de grupos de Markov para agrupar supuestos ortólogos y parálogos. Estos supuestos ortólogos se organizaron adicionalmente en un Filograma - un diagrama con ramificaciones (árbol) que se supone que es una estimación de una filogenia de los genes.
(ii)
Método para generar perfiles de expresión de genes “Expresión Digital” - los autores de la presente invención han realizado un considerable esfuerzo dirigido a secuencias de anotación. Los datos de expresión se analizaron y las bibliotecas de EST se clasificaron usando un vocabulario fijo de términos habituales tales como tratamientos experimentales. Las anotaciones de todas las EST agrupadas para un gen se analizaron estadísticamente comparando su frecuencia en el grupo frente a su abundancia en la base de datos, lo que permitió construir un perfil de expresión número y gráfico de ese gen, que se denomina “expresión digital”.
La lógica de usar estos dos métodos complementarios se basa en la suposición de que probablemente los ortólogos verdaderos conservan la misma función a lo largo de la evolución. Estos dos métodos (patrón de secuencias y de expresión) proporcionan dos conjuntos de indicaciones diferentes en función de las similitudes entre dos genes homólogos, similitudes en el nivel de secuencia – mismos aminoácidos en los dominios de las proteínas y similitudes en los perfiles de expresión.
En total, se identificaron 110 genes que tenían un impacto principal sobre la TEAB cuando se sobreexpresaban en plantas. Los genes de TEAB identificados, sus secuencias curadas de polinucleótidos y polipéptidos, así como sus secuencias actualizadas de acuerdo con la base de datos del GenBank se resumen más adelante en la Tabla 1 del presente documento.
Los polinucleótidos y polipéptidos que tienen homología significativa con los genes de TEAB identificados se han identificado de las bases de datos usando el programa informático BLAST con el algoritmo BlastX. Las secuencias de nucleótidos de búsqueda fueron las de las SEC ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71,73 ,75 ,77, 79, 81, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 116, 118, 119, 121, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 138, 140, 142, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 161, 163, 165, 168, 169, 170, 171, 173, 175, 177, 179, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198 y 1653 y los homólogos de TEAB identificados se proporcionan en la siguiente Tabla 2.
EJEMPLO 2
GENERACIÓN DE LOS SUPUESTOS GENES DE TEAB
Se sintetizaron diversas secuencias de ADN de los genes con TEAB (Tolerancia al Estrés Abiótico) a través del GeneArt (Protocolo de Transferencia Hipertexto://World Wide Web (.) geneart (.) com/). El ADN sintético se diseñó in silico (con ordenador), basándose en las secuencias de aminoácidos codificadas de los genes de TEAB y usando Tablas de uso de codones calculados de transcriptomas de plantas (en la base de datos de uso de codones disponible en línea en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) kazusa (.) o (.) jp/codon pueden encontrarse ejemplos de dichas Tablas). Las secuencias codificantes optimizadas se diseñaron sin introducir cambios en la secuencia de aminoácidos codificada aunque usando codones preferidos para la expresión en plantas dicotiledóneas (principalmente tomate y Arabidopsis) y en plantas monocotiledóneas tales como maíz. En la secuencia se introdujo al menos una mutación silenciosa por 20 pares de nucleótidos en comparación con las secuencias originales para evitar un posible silenciamiento cuando se sobreexpresaba el gen en el cultivo diana. A las secuencias optimizadas se añadieron las siguientes enzimas de restricción Sall, Xbal, BamHI, Smal en el extremo 5’ y Sacl en el extremo 3’. Las secuencias sintetizadas por el proveedor (GeneArt, Gmbh) se clonaron en el plásmido pCR-Script.
EJEMPLO 3
CLONACIÓN DE GENES Y GENERACIÓN DE VECTORES BINARIOS PARA LA EXPRESIÓN EN PLANTAS
Para validar su papel en la mejora de la TEAB y en el rendimiento, los genes seleccionados se sobreexpresaron en plantas de la siguiente manera.
Estrategia de clonación
Los genes seleccionados de los presentados en el Ejemplo 1 se clonaron en vectores binarios para la generación de plantas transgénicas. Para la clonación, se identificaron fases de lectura abierta (ORF, acrónimo de Open Reading Frame) de longitud completa. Se analizaron grupos de EST y en algunos casos secuencias de ARNm para identificar toda la fase de lectura abierta comparando los resultados de diversos algoritmos de traducción con proteínas conocidas de otras especies de plantas.
Para clonar los ADNc de longitud completa, se realizó transcripción inversa (TR, reverse transcription) seguido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR; RT-PCR) en ARN total extraído de hojas, raíces u otros tejidos de la planta, que se desarrollaban en condiciones normales o en condiciones con déficit de nutrientes. La extracción de ARN total, la producción de ADNc y la amplificación por PCR se realizaron usando protocolos convencionales, descritos en cualquier documento (Sambrook J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2º Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.), conocidos por los expertos en la técnica. Los productos de la PCR se purificaron usando el kit de purificación de PCR (Qiagen).
Normalmente, se prepararon 2 conjuntos de cebadores para la amplificación de cada gen, mediante PCR anidada (lo que significa ampliar primero el gen usando cebadores externos y después usar el producto de la PCR producido como un molde para una segunda reacción PCR, en la que se usa el conjunto interno de cebadores). Como alternativa, se usaron uno o dos de los cebadores internos para la amplificación génica, tanto en la primera como en la segunda reacción PCR (lo que significa que solamente se diseñaron 2-3 cebadores para un gen). Para facilitar la clonación adicional de los ADNc, se añadieron 8-12 pb de extensión en el extremo 5’ de cada cebador interno. La extensión del cebador incluye un sitio de restricción endonucleasa. Los sitios de restricción se seleccionan usando dos parámetros: (a) el sitio de restricción no existe en la secuencia de ADNc; y (b) los sitios de restricción en los cebadores directo e inverso se diseñan de tal manera que el ADNc digerido se inserta en la dirección en sentido en el vector binario utilizado para la transformación. En la siguiente Tabla 3, se proporcionan los cebadores usados para la clonación de genes de TEAB.
Tabla 3
Genes de TEAB clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico y los cebadores usados para la clonación
Id del Gen
Polinucleótido SEC ID Nº del gen clonado Polipéptido SEC ID Nº del polipéptido codificado Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para la amplificación (SEC ID Nº:)
MAB1
1530 201 EcoRV MAB1 EF EcoRV MAB1_NF_EcoRV MAB1_ER_EcoRV MAB1_NR_EcoRV
MAB1_GA (optimizado para la expresión en maíz y G. Max)
1531 AND and Producto sintético (de pGA14_MAB1_GA)
MAB14
1538 219 EcoRV MAB14 EF EcoRV MAB14_NF_EcoRV MAB14_ER_EcoRV MAB14_NR_EcoRV
MAB14_GA (optimizado para la expresión en maíz)
1539 Producto sintético (de pGA14_MAB14_GA)
MAB10
1532 212 SalI, Xbal MAB 10 F Sal -MAB 10_Ext_R Xba -MAB10_NR_Xba
MAB10_GA (optimizado para la expresión en maíz)
1533 Producto sintético (de pGA118_MAB10_GA)
Genes de TEAB clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico y los cebadores usados para la clonación
Id del Gen
Polinucleótido SEC ID Nº del gen clonado Polipéptido SEC ID Nº del polipéptido codificado Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para la amplificación (SEC ID Nº:)
MAB25
1549d 237 PstI, Smal MAB25 EF PstI MAB25_NF_PstI - MAB25_ER_SmaI - MAB25_NR_SmaI -
MAB25 GA (optimizado para la expresión en maíz)
1550 Producto sintético (de pGA118_MAB10_GA)
MAB134
1665 311 SalI, Xbal MAB134_EF_SalI - MAB134_NF_SalI - MAB134_ER_XhaI MAB134_NR_XbaI -
MAB99
1566 283 SalI, Scal MAB99_NF_SalI - MAB99_NR_SacI -
MAB36
1554 254 SalI, Xbal MAB_36 F_Sal - MAB 36 Ext R Xba -MAB 36 NR Xba -
Genes de TEAB clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico y los cebadores usados para la clonación
Id del Gen
Polinucleótido SEC ID Nº del gen clonado Polipéptido SEC ID Nº del polipéptido codificado Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para la amplificación (SEC ID Nº:)
MAB7
1563 208 SalI, Xbal, MAB 7 ExF Sal - MAB 7 NF Sal -MAB_7 Ex R Xba - MAB_7 NR_Xba -
MAB44
1557 267 SalI, Sacl MAB 44 NF sal MAB 44 NR Sc
MAB44_GA (optimizado para la expresión en maíz)
1558 Producto sintético(de pCR4Blunt- TOPO_MAB44_GA)
MAB6
1561 207 SalI, Xbal MAB_6 - Ex_F_Sal -MAB_6 NF_Sal - MAB 6 - Ext R_XbaI -MAB_6 - R_XbaI -
MAB6_GA (optimizado para la expresión en maíz)
1562 Producto sintético (de pGA15_MAB6_GA)
MAB9
1564 211 EcoRV MAB9_F_EcoRV MAB9_ER_EcoRV MAB9_NR_EcoRV
Genes de TEAB clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico y los cebadores usados para la clonación
Id del Gen
Polinucleótido SEC ID Nº del gen clonado Polipéptido SEC ID Nº del polipéptido codificado Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para la amplificación (SEC ID Nº:)
MAB9_GA (optimizado para la expresión en maíz y G. Max)
1565 Producto sintético (de pGA15_MAB9_GA)
MAB100
1534 284 SalI, Xbal MAB_100_EF_SalI - MAB100_NF_SalI - MAB100_ER_XbaI - MAB100_NR_XbaI
MAB 13
1536 217 Sacl, Sall MAB13F_SalI_new MAB 13 ExR Sc MAB_13_F_Sal MAB_13_NR_Sc
MAB32
1552 247 EcoRV MAB32_F_EcoRV - MAB32 ER EcoRV - MAB32_NR_EcoRV -
MAB35
1553 252 SmaI MAB35_F MAB35_ER_SmaI - MAB35_NR_SmaI -
Genes de TEAB clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico y los cebadores usados para la clonación
Id del Gen
Polinucleótido SEC ID Nº del gen clonado Polipéptido SEC ID Nº del polipéptido codificado Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para la amplificación (SEC ID Nº:)
MAB146
1666 334 SalI, Xbal MAB146_F_Sal - MAB146_ER_Xba -MAB146_NR_Xba -
MAB2
1547 No codificado SalI, Xbal MAB2_F_SalI MAB2_R_Xba
MAB20
1548 229 PstI, Smal MAB20_EF_PstI - MAB20_NF_PstI - MAB20_ER_SmaI - MAB20_NR_SmaI -
MAB43
1556 265 PstI, Smal MAB43_NF_PstI MAB43_ER_SmaI MAB43_NR_SmaI
Genes de TEAB clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico y los cebadores usados para la clonación
Id del Gen
Polinucleótido SEC ID Nº del gen clonado Polipéptido SEC ID Nº del polipéptido codificado Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para la amplificación (SEC ID Nº:)
MAB46
1559 271 SalI, Sacl MAB_46_ExF_Sal - MAB_46_NF_Sal - MAB46 ExR Sc MAB_46_NR_Sc -
MAB50
1560 277 SmaI MAB_50_ExF_Sal MAB50_NF MAB50_ExR_Sac MAB50_NR_Sma
MAB66
1654 1655 SalI, Xbal MAB66_F_Sal - MAB66_ER_Xba - MAB66_NR_Xba -
MAB4
1555 205 EcoRV MAB4_EF_EcoRV - MAB4_NF_EcoRV - MAB4_ER_EcoRV - MAB4_NR_EcoRV -
MAB15_GA (optimizado para la expresión en Arabidopsis y maíz)
1541 221 XbaI, Sacl Producto sintético (de pGA4_MAB15)
Genes de TEAB clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico y los cebadores usados para la clonación
Id del Gen
Polinucleótido SEC ID Nº del gen clonado Polipéptido SEC ID Nº del polipéptido codificado Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para la amplificación (SEC ID Nº:)
MAB15a_G A (optimizado para la expresión en maíz)
Producto sintético (de pGA18_ MAB15a_GA)
MAB15_GA _original (secuencia original, no optimizada)
1540 Producto sintético (de pGA14_MAB15_(EV0220)-original)
MAB17_GA (optimizado para la expresión en Arabidopsis y maíz)
1542 224 XbaI, Sacl Producto sintético (de pGA4_MAB17)
MAB17a_GA (optimizado para la expresión en maíz)
1544 Producto sintético (de pCR4Blunt- TOPO_MAB17a_GA)
MAB17_GA _original (secuencia original, no optimizada)
1543 Producto sintético (pGA14_MAB17_(EVO222)-original)
MAB137_GA (optimizado para la expresión en maíz, Arabidopsis y tomate)
1537 317 XbaI, Sacl Producto sintético (de pGA15_MAB137)
MAB3_GA (optimizado para la expresión en maíz, Arabidopsis y tomate)
1551 203 XbaI, Sacl Producto sintético (de pCR4Blunt- Topo_MAB3)
MAB3_GA_ original (secuencia original, no optimizada)
1688 Producto sintético (de pGA14_MAB3_(EVO235)-original)
MAB18_GA (optimizado para la expresión en Arabidopsis y maíz)
1545 225 XbaI, Sacl Producto sintético (de pGA4_MAB18)
Gen de Control: GUI
1664
Genes de TEAB clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico y los cebadores usados para la clonación
Id del Gen
Polinucleótido SEC ID Nº del gen clonado Polipéptido SEC ID Nº del polipéptido codificado Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para la amplificación (SEC ID Nº:)
Tabla 3: Se presentan los genes de TEAB clonados y el gen (o genes) de control mediante el número Id del gen y la SEC ID Nº: del polinucleótido. También se presentan los cebadores y las enzimas de restricción usadas para clonar los genes de TEAB.
Los productos de la PCR se digirieron con las endonucleasas de restricción (Roche, Suiza) de acuerdo con los sitios diseñados en los cebadores (Tabla 3). Cada producto de la PCR digerido se insertó en un vector con alto número de copias originado del vector plasmídico pBlue-script KS (vector plasmídico pBlue-script KS, Protocolo de 5 Transferencia Hipertexto://World Wide Web (.) stratagene (.) com/manuals/212205 (.) pdf). En caso del vector con alto número de copias originado del vector plasmídico pBlue-script KS (pGN) el producto PCR se insertó en el plásmido con alto número de copias cadena arriba del terminador NOS (SEC ID Nº: 1651) originado del vector binario pBI 101.3 (Nº de Acceso GenBank U12640, nucleótidos 4417 a 4693), Tabla 4 a continuación. En otros casos (pKSJ_6669a) el promotor de At6669 (SEC ID Nº: 1652) ya se clonó en el pBlue-script KS, de tal manera que
10 el gen se introduce cadena abajo del promotor (Tabla 4 a continuación).
Se realizó la secuenciación de los genes insertados, usando el secuenciador ABI 377 (Applied Biosystems). En algunos casos, después de confirmar las secuencias de los genes clonados, el ADNc clonado acompañado con el terminador NOS se introdujo en los vectores binarios pGI que contenían el promotor At6669 mediante digestión con
15 endonucleasas de restricción apropiadas. En otros casos, el ADNc clonado acompañado con el promotor At6660 se introdujo en el vector pGI (que ya no tenía el promotor At6669. En cualquier caso después del inserto se realizó una sola copia del terminador NOS (SEC ID Nº: 1651). Los productos digeridos y el vector plasmídico linealizado se ligaron usando la enzima ADN ligasa de T (Roche, Suiza).
20 Tabla 4
Genes clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico en el plásmido con alto número de copias
Nombre del gen
Plásmido con alto número de copias Amplificado de
MAB1
pKSJ_6669 ARN
MAB1
Gen Art
MAB10
Gen Art
MAB10
pGN ARN
MAB14
pKSJ_6669 ARN
MAB14
Gen Art
MAB15
pGN Gen Art (3 plásmidos)
MAB17
pGN Gen Art (3 plásmidos)
MAB137
pGN Gen Art
MAB25
pKSJ_6669 ARN
MAB25
Gen Art
MAB3
pGN Gen Art (2 plásmidos)
MAB44
pGN RNA
MAB44
Gen Art
MAB6
Gen Art
MAB9
pKSJ_6669 ARN
MAB9
Gen Art
MAB100
pGN ARN
MAB13
pGN ARN
MAB134
pGN ARN
MAB18
pGN Gen
MAB2
pGN ARN
MAB20
pKSJ_6669 ARN
MAB146
pGN ARN
MAB32
pKSJ_6669 ARN
MAB35
pKS_6669 ARN
MAB36
pGN ARN
MAB43
pKSJ_6669 ARN
MAB46
pGN ARN
MAB50
pKSJ_6669 ARN
MAB7
pGN ARN
MAB99
pGN ARN
Genes clonados de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico en el plásmido con alto número de copias
Nombre del gen
Plásmido con alto número de copias Amplificado de
MAB66
pGN ARN
MAB4
pKSJ_6669 ARN
Tabla 4
El vector plasmídico pPI se construyó insertando una secuencia de señal sintética poli-(A), originada del vector plasmídico básico pGL3 (Promega, Nº de Acceso GenBank U47295; nucleótidos 4658-4811) en el sitio de restricción HindIII del vector binario pBI101.3 (Clontech, Nº de Acceso GenBank U12640). pGI (Figura 1) es similar a pPI, pero el gen original en la cadena principal es GUS-Intrón en lugar de GUS.
At6669, la secuencia promotora de Arabidopsis thaliana (expuesta en la SEC ID Nº: 1652) se insertó en el vector binario pPI, cadena arriba de los genes clonado usando las enzimas de restricción HindIII y SalI o BamHI (Roche), seguido de ligamiento de ADN y extracción de plásmido binario de colonias positivas de E. coli, como se ha descrito anteriormente.
Las colonias positivas se identificaron por PCR usando cebadores que se diseñaron para abarcar el promotor introducido (At6669) y el gen clonado en el vector binario. En todos los casos el cebador directo de la PCR fue el cebador expuesto en la SEC ID Nº: 1650 (del promotor At6669) y los cebadores inversos (derivados del gen clonado específico) fueron los siguientes: para MAB1, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1570; para MAB14, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1574, para MAB10, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1577; para MAB25, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1581; para MAB134, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1585; para MAB99, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1587; para MAB36, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1590; para MAB7, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1594; para MAB44, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1596; para MAB4, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1600; para MAB9, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1603 (MAB9); para MAB100, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1606; para MAB13, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1611; para MAB32, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1614; para MAB35, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1617; para MAB146, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1620; para MAB2, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1622; para MAB20, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1626; para MAB43, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1629; para MAB46, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1633; para MAB50, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1637; para MAB66, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1640; para MAB4, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1644; para el gen sintético MAB15, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1645; para el gen sintético MAB17, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1646; para el gen sintético MAB18, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1647; para el gen sintético MAG137, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1648; y para el gen sintético MAB3, el cebador inverso fue SEC ID Nº: 1649, que se diseñaron para abarcar el promotor introducido y el gen, en el vector binario.
Las secuencias sintéticas (tales como de MAB14, nucleótido SEC ID Nº: 23, que codifica la proteína SEC ID Nº: 219) de algunos de los polinucleótidos clonados se solicitaron a un proveedor comercial (GeneArt, GmbH). Para optimizar la secuencia codificante, se usaron las Tablas de uso de codones calculados de transcriptomas de plantas [pueden encontrarse ejemplos de dichas Tablas en la Base de Datos de Uso de Codones disponible en línea en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://World Wide Web (.) kazusa (.) o (.) jp/codon/]. Las secuencias codificantes optimizadas se diseñaron sin introducir cambios en la secuencia de aminoácidos codificada aunque usando codones preferidos para la expresión en plantas dicotiledóneas, principalmente tomate y Arabidopsis; y en plantas monocotiledóneas tales como maíz. Dichas secuencias optimizadas promueven una mejor tasa de traducción y por lo tanto niveles de expresión de proteína más altos. Se solicitaron partes de las secuencias como las secuencias originales. Para las secuencias optimizadas/no optimizadas se añadieron sitios de enzimas de restricción exclusivos adicionales flanqueantes para facilitar los genes de clonación en vectores binarios.
Promotores usados: promotor At6669 de Arabidopsis (SEC ID Nº: 1652; que es la SEC ID Nº: 61 del documento WO04081173 de Evogene Ltd.).
Las secuencias de los ADNc clonados se proporcionan en las SEC ID Nos: 1530-1534, 1536-1545, 1547-1566, 1654, 1665, 1666, 1667 y 1668. La traducción de proteínas de la secuencia de ADNc amplificada coincidió exactamente con la de la predicción bioinformática inicial de las secuencias de proteínas. Las secuencias polipeptídicas predichas de los polinucleótidos clonados se proporcionan en las SEC ID Nos: 201, 212, 284, 213, 217, 317, 219, 221, 224, 225, 226, 227, 229, 237, 203, 247, 252, 205, 265, 267, 271, 277, 207, 208, 211, 283, 1655, 311, 334 y 254.
EJEMPLO 4
TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS CON VECTORES BINARIOS QUE LLEVAN SUPUESTOS GENES DE TEAB
Cada uno de los vectores binarios descritos en el Ejemplo 3 anterior se usó para la transformación de células de Agrobacterium. Dos construcciones binarias adicionales, que tenían un gen indicador GUS/Luciferasa que reemplazaba el gen de TEAB (ubicado cadena abajo del promotor At6669), se usaron como controles negativos.
Los vectores binarios se introdujeron en células competentes de Agrobacterium tumefaciens GV301 o LB4404 (aproximadamente 109 células/ml) por electroporación. La electroporación se realizó usando un electroporador MicroPulser (Biorad), cubetas de 0,2 cm (Biorad) y el programa de electroporación EC-2 (Biorad). Las células tratadas se cultivaron en medio líquido LB a 28 ºC durante 3 horas, y después se sembraron en placas sobre agar LB complementado con gentamicina (50 mg/l; para cepas de Agrobacterium GV301) o estreptomicina (300 mg/l; para la cepa de Agrobacterium LB4404) y kanamicina (50 mg/l) a 29 ºC durante 48 horas. Las colonias de Agrobacterium que se desarrollaron sobre los medios selectivos se analizaron por PCR usando los cebadores descritos anteriormente (Ejemplo 3) con respecto a la identificación de colonias positivas de vectores binarios. Los productos resultantes de la PCR se aislaron y se secuenciaron como se describe en el Ejemplo 3 anterior, para verificar que las secuencias correctas de TEAB se introducían apropiadamente en las células de Agrobacterium.
EJEMPLO 5
TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS DE ARABIDOPSIS THALIANA CON SUPUESTOS GENES DE TEABT
Plantas de Arabidopsis thaliana Columbia (plantas To) se transformaron usando el procedimiento de Inmersión Floral descrito por Clough y Bent (10) y por Desfeux et al. (11), con pequeñas modificaciones. En resumen, se sembraron Plantas T0 en macetas de 250 ml cargadas con una mezcla de crecimiento basada en turba húmeda. Las macetas se taparon con papel de aluminio y con un domo de plástico, se mantuvieron a 4 ºC durante 3-4 días, después se destaparon y se incubaron en una cámara de cultivo a 18-24 ºC con ciclos de luz/oscuridad de 16/8 horas. Las plantas T0 estaban listas para la transformación seis días antes de la antesis.
Se generaron colonias sencillas de Agrobacterium que llevaban las construcciones binarias, como las generadas en el Ejemplo 4 anterior. Las colonias se cultivaron en medio LB complementado con kanamicina (50 mg/l) y gentamicina (50 mg/l). Los cultivos se incubaron a 29 ºC durante 48 horas con agitación intensa y después se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos. Los sedimentos que comprendían las células de Agrobacterium se resuspendieron en un medio de transformación que contenía Murashige-Skoog (2,15 g/l) diluido al 50 % (Duchefa); benzilamino purina 0,044 M (Sigma); vitaminas Gambourg B5 112 g/L (Sigma); sacarosa al 5 %; y Silwet L-77 0,2 ml/l (OSI Specialists, CT) en agua doblemente destilada, a pH de 5,7.
La transformación de plantas To se realizó invirtiendo cada planta en una suspensión de Agrobacterium, de tal manera que el tejido de la planta por encima del suelo se sumergía durante 3-5 segundos. Cada planta To inoculada se colocó inmediatamente en una bandeja de plástico, después se tapó con un domo de plástico transparente para mantener la humedad y se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 18 horas, para facilitar la infección y la transformación. Después, las plantas transformadas (transgénicas) se destaparon y se transfirieron a un invernadero para su recuperación y maduración. Las plantas transgénicas To se cultivaron en el invernadero durante 3-5 semanas hasta que las silicuas se volvieron de color marrón y se secaron. Las semillas se recogieron de las plantas y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta la siembra.
Para generar plantas transgénicas T1 y T2 que llevaban los genes, la superficie de las semillas recogidas de las plantas transgénicas To se esterilizó sumergiéndolas en etanol al 70 % durante 1 minuto, seguido de inmersión en hipocloruro de sodio al 5 % y tritón al 0,05 % durante 5 minutos. Las semillas con la superficie esteriliza se lavaron cuidadosamente en agua destilada estéril y después se colocaron en placas de cultivo que contenían Murashige-Skoog diluido al 50 % (Duchefa); sacarosa al 2 %; agar vegetal al 0,8 %; kanamicina 50 mM; y carbenicilina 200 mM (Duchefa). Las placas de cultivo se incubaron a 4 ºC durante 48 horas, después se transfirieron a una sala de cultivo a 25 ºC durante una semana de incubación más. Las plantas de Arabidopsis T1 vitales es transfirieron a placas de cultivo recientes durante otra semana de incubación. Después de la incubación, las plantas T1 se retiraron de las placas de cultivo y se plantaron en macetas de 250 ml que contenían mezcla de crecimiento. Se dejó que las plantas transgénicas se desarrollasen en un invernadero hasta su madurez. Las semillas recogidas de las plantas T1 se cultivaron y crecieron hasta la madurez como plantas T2 en las mismas condiciones a las usadas para el cultivo y crecimiento de las plantas T1.
EJEMPLO 6
TEAB MEJORADA EN ENSAYO DE CULTIVO DE TEJIDO
Ensayo 1: crecimiento de plantas con estrés Osmótico (PEG) en condiciones de cultivo de tejido – Las condiciones de estrés osmótico (PEG) se parecen a las de alta osmolaridad encontradas durante la sequía (por ejemplo, PEG8000 al 25 %). Una de las consecuencias de la sequía es la inducción de estrés osmótico en la zona que rodea las raíces; por lo tanto, en muchos estudios científicos, el PEG sirve para simular sequía.
Se sembraron semillas con la superficie esterilizada en medio basa (medio Murasige-Skoog (MS) al 50 % complementado con agar vegetal al 0,8 % como agente solidificante] en presencia de Kanamicina (para seleccionar solo plantas transgénicas). Después de sembrar, las placas se transfirieron durante 2-3 días a 4 ºC para estratificación y después se cultivaron a 25 ºC con ciclos diarios de 12 horas de luz, 12 horas de oscuridad, durante 7 a 10 días. En este momento, las plántulas seleccionadas al azar se transfirieron cuidadosamente a placas calientes con PEG al 25 % en medio MS 0,5 o en condiciones normales (medio MS 0,5). Cada placa contenía 5 plántulas del mismo evento, y 3-4 placas diferentes (copias) para cada evento. Para cada polinucleótido de la invención se analizaron al menos cuatro eventos de transformación independientes de cada construcción. Las plantas que expresaban los polinucleótidos de la invención se compararon con la medición promedio de las plantas de control. Como control se usaron plantas transgénicas simuladas que expresaban el gen indicador uidA (GUS Intrón – GUI) bajo el mismo promotor.
Formación de imágenes digitales – Se usó un sistema de adquisición de imágenes de laboratorio, que consistía en una cámara réflex digital (Canon EOS 300D) conectada a una lente de longitud focal de 55 mm (serie Canon EF-S), montada sobre un dispositivo reproductor (Kaiser RS), que incluía 4 unidades de luz (4x bombillas de luz de 150 vatios) y localizado en una sala oscura, para capturar imágenes de plantones cultivados en placas cuadradas con agar.
El proceso de captura de imágenes se repitió cada 7 días comenzando el día 0 hasta el día 14. La misma cámara conectada a una lente de longitud focal de 24 mm (serie Canon EF), colocada en un montaje de hierro hecho a medida se usó para tomar imágenes.
Se usó un sistema de análisis de imágenes, que consistía en un ordenador de escritorio personal (procesador Intel P4 3.0 GHz) y en un programa de dominio público – ImageJ 1.37 (programa de procesamiento de imágenes basado en Java que se desarrolló en el U.S. National Institutes of Health y gratuito en Internet en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (.) nih (.) gov/). Las imágenes se capturaron en resolución de 6 Megapíxeles (3072 x 2048 píxeles) y se almacenaron en un formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard) de baja compresión. Después, los datos analizados se guardaron en archivos de texto y se procesaron usando el programa informático de análisis estadístico JMP (Instituto SAS).
Análisis de las plántulas – Usando el análisis digital se calcularon los datos de las plántulas, incluyendo el área foliar, la cobertura radicular y la longitud radicular.
La Tasa de Crecimiento Relativo (TCR) se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula I.
Fórmula I:
Tasa del área de crecimiento relativo = ( Area / (t) * (1/ Area t0)
t es el día en curso de la imagen analizada restado del día inicial (t-t0). Por tanto, la tasa del área de crecimiento relativo es en unidades de 1/día y la tasa de crecimiento longitudinal es en unidades de 1/día.
Al final del experimento, las plántulas se retiraron de los medios y se pesaron para la determinación del peso fresco de la planta. La Tasa de Crecimiento Relativo se determinó comparando el área foliar, la longitud radicular y la cobertura radicular entre cada pareja de fotografías secuenciales, y los resultados se usaron para resolver el efecto del gen introducido sobre el vigor de la planta, en condiciones de estrés osmótico, así como en condiciones óptimas. De manera similar, el efecto del gen introducido sobre la acumulación de la biomasa, en condiciones de estrés, así como en condiciones óptimas, se determinó comparando el peso fresco de las plantas con las plantas de control (GUI).
Análisis estadísticos – Para identificar los genes y las construcciones superiores, se evaluaron los resultados de los eventos de transformación independientes para la influencia global del gen (efecto del gen) y para cada uno de los eventos ensayados (mejor evento). Se aplicó el ensayo de la t de Student, usando la significación de p < 0,05 o p < 0,1. Se usó el paquete informático estadístico JMP (Versión 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EE.UU.).
Resultados Experimentales
Las secuencias de polinucleótidos de la invención se ensayaron para diversos rasgos deseados.
Las Tablas 5-6 representan análisis del Área Foliar en las plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones de PEG al 25 %. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control, indicando A una diferencia a un nivel de significancia de P < 0,05 y A* una diferencia a un nivel de significancia de P < 0,1.
Las Tablas 7-9 representan análisis de la Cobertura Radicular en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones de PEG al 25 %. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 10-11 representan análisis de Longitud Radicular en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones de PEG al 25 %. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 12-13 representan análisis de TCR (Tasa de Crecimiento Relativa) del Área Foliar en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones de PEG al 25 %. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 14-18 representan análisis de TCR de la cobertura radicular en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones de PEG al 25 %. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control
Las Tablas 19-21 representan análisis de Longitud Radicular TCR en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 con PEG al 25 %. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 22-23 representan análisis del Peso Freso de Plantas en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 con PEG al 25 %. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 22
Id del Gen
Peso Fresco de la Planta [g], PEG al 25 %
LSM
Significación Mejor evento LSM Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,20 B 0,20 B
MAB15
0,25 B 0,30 A 51
MAB18
0,21 B 0,26 A 33
Tabla 22; LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 23
Id del Gen
Peso Fresco de la Planta [g], PEG al 25 %
LSM
Significación Mejor evento LSM Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,18 B 0,18 B
MAB17
0,22 B 0,29 A 66
MAB3_GA
0,18 B 0,27 A 53
Tabla 23; LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
10 Las Tablas 24-27 representan análisis del Área Foliar Plantas en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones normales. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 28-31 representan análisis de Cobertura Radicular en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones normales. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 29
Cobertura Radicular [cm2], Condiciones normales
Id del Gen
Día 7 desde la plantación
LSM
Significación Mejor evento LSM Significación % de mejora del mejor evento
GUI
5,40 B 5,40 B
MAB100
5,05 B 7,06 A 31
Tabla 29: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
Las Tablas 32-33 representan análisis de Longitud Radicular en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones normales. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 34-36 representan análisis de la TCR del Área Foliar en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones normales. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 37-41 representan análisis de la TCR de la Cobertura Radicular en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones normales. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 42-46 representan análisis de la TCR de la Longitud Radicular en plantas que se sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones normales. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados por la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 42
Longitud Radicular TCR [cm/día], Condiciones normales
ID del Gen
Día 7 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
1,07 B 1,07 B
MAB10
1,29 B 2,01 A 88
Tabla 42: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 43
Longitud Radicular TCR [cm/día], Condiciones normales
ID del Gen
Día 7 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
0,17 B 0,17 B
MAB1
0,26 A 0,34 A 93
MAB15
0,32 A 0,45 A 156
MAB17
0,24 A 0,28 A 61
MAB18
0,30 A 0,41 A 136
MAB146
0,26 A 0,34 A 93
Tabla 43: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 45
Longitud Radicular TCR [cm/día], Condiciones normales
ID del Gen
Día 14 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
0,11 B 0,11 B
MAB32
0,11 B 0,15 A 35
MAB35
0,11 B 0,20 A 76
MAB4
0,11 B 0,17 A 50
MAB146
0,15 A 0,19 A 71
Tabla 45: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 47-48 representan análisis de Peso Fresco de Plantas en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones normales. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 47
Peso Fresco de Planta [g], Condiciones normales
ID del Gen
Día 14 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
0,15 B 0,15 B
MAB15
0,24 A 0,28 A 93
MAB17
0,21 A 0,25 A 73
MAB18
0,22 A 0,29 A 101
Tabla 47: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 48
Peso Fresco de Planta [g], Condiciones normales
ID del Gen
Día 14 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
0,20 B 0,20 B
MAB100
0,28 A* 0,33 A 62
MAB134
0,23 B 0,34 A 64
MAB13
0,31 A 0,35 A 73
MAB15
0,38 A 0,42 A 106
MAB17
0,37 A 0,53 A 159
MAB3_GA
0,28 A* 0,40 A 94
Tabla 48: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
10 Ensayo 2: crecimiento de las plantas con déficit de Nitrógeno, en condiciones de cultivo Tisular – Los autores de la presente invención han descubierto que el ensayo EUN (Eficiencia de la Utilización de Nitrógeno) es relevante para la evaluación de los genes de TEAB candidatos, dado que un déficit de la EUN promueve el alargamiento radicular, aumenta la cobertura radicular y permite detectar el potencial de la planta para generar un mejor sistema radicular en condiciones de sequía. Además, en la bibliografía (Wesley et al., 2002 Journal of Experiment Botany Vol. 53, No.
15 366, págs. 13-25) existen indicios de que los mecanismos biológicos de la EUN y de la tolerancia a la sequía están relacionados.
Semillas esterilizadas en la superficie se sembraron en medio basal [Medio Murashige-Skoog (MS) al 50 % complementado con agar vegetal al 0,8 % como agente solidificante] en presencia de kanamicina (para seleccionar 20 solo plantas transgénicas). Después de sembrar, las placas se transfirieron durante 2-3 días a 4 ºC para la estratificación y después crecieron a 25 ºC con ciclos diarios de 12 horas de luz, 12 horas de oscuridad, durante 7 a 10 días. En este momento, las plántulas seleccionadas al azar se transfirieron cuidadosamente a placas que contenían condiciones limitantes de nitrógeno: medio MS 0,5 en el que la concentración de nitrógeno combinado (NH4NO3 y KNO3) es de 0,75 mM (condiciones con déficit de nitrógeno) o a placas que llevan condiciones de 25 nitrógeno normales: medio 0,5 MS en el que la concentración de nitrógeno combinado (NH4NO3 y KNO3) es de 3 mM (concentración normal de nitrógeno). Todos los experimentos de cultivo tisular se desarrollaron al mismo tiempo (EUN, PEG y Normal). Los resultados del crecimiento en condiciones normales para EUN son los mismos que para PEG y se presentan en el ensayo 1. Cada placa contiene 5 plántulas del mismo evento, y 3-4 placas diferentes (copias) para cada evento. Para cada polinucleótido de la invención se analizaron al menos cuatro eventos de
30 transformación independientes de cada construcción. Las plantas que expresan los polinucleótidos de la invención se comparan con la medición promedio de las placas de control (GUI – que lleva el gen GUS bajo el mismo promotor) usadas en el mismo experimento.
Formación de imágenes digitales y análisis estadístico – Los parámetros se midieron y analizaron como se describe 35 en el Ensayo 1 anterior.
Resultados experimentales – Las secuencias de polinucleótidos de la invención se ensayaron con respecto a diversos rasgos deseados.
Las Tablas 49-53 representan análisis del Área Foliar en plantas que se sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones con déficit de nitrógeno. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 51
Área Foliar [cm2], EUN 0,75 mM
ID del Gen
Día 7 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
0,34 B 0,34 B
MAB17
0,32 B 0,44 A 31
MAB3_GA
0,32 B 0,44 A 31
Tabla 51: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 54-57 representan análisis de Cobertura Radicular en plantas que se sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones con déficit de nitrógeno. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 58-61 representan análisis de la Longitud Radicular en plantas que se sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones con déficit de nitrógeno. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 58
Longitud Radicular [cm], EUN 0,75 mM
ID del Gen
Día 7 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
6,31 B 6,31 B
MAB44
5,34 B 7,07 A 12
Tabla 58: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 61
Longitud Radicular [cm], EUN 0,75 mM
ID del Gen
Día 7 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
4,87 B 4,87 B
MAB66
5,27 B 5,74 A 18
Tabla 61: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 62-64 representan análisis de la TCR del Área Foliar en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones con déficit de nitrógeno. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 63
Área Foliar TCR [cm/día], EUN 0,75 mM
ID del Gen
Día 7 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
0,80 B 0,80 B
MAB18
0,87 B 1,24 A 56
MAB32
0,94 B 1,53 A 91
MAB35
0,96 B 1,21 A 51
MAB4
0,71 B 0,81 B 1
MAB46
0,64 B 0,75 B -7
MAB146
0,82 B 1,04 B 30
Tabla 63: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 65-69 representan análisis de la TCR de la Cobertura Radicular en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones con déficit de nitrógeno. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B, C) son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 67
Cobertura Radicular TCR [cm/día], EUN 0,75 mM
ID del Gen
Día 7 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
2,30 B 2,30 B
MAB100
2,85 B 4,02 A 74
MAB134
4,27 A 5,99 A 160
MAB13
3,95 A 4,84 A 110
MAB15
3,05 A* 3,97 A 73
MAB17
2,96 B 3,76 A 63
Tabla 67: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 69
Cobertura Radicular TCR [cm/día], EUN 0,75 mM
ID del Gen
Día 7 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
1,60 B 1,60 B
MAB137
2,19 A 2,55 B 60
MAB43
2,00 B 2,75 A 72
MAB50
2,26 A 3,28 A 105
MAB6
2,45 A 2,96 A 85
MAB66
1,81 B 2,87 A 80
MAB99
2,25 A 3,73 A 133
Tabla 69: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 70-74 representan análisis de la TCR de la Longitud Radicular en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones con déficit de nitrógeno. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B) son significativamente diferentes de los del control.
Las Tablas 75-76 representan análisis del Peso Fresco de la Planta en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones con déficit de nitrógeno. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 75
Peso Fresco de la Planta [g], EUN 0,75 mM
ID del Gen
Día 14 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
0,15 B
MAB1
0,25 A 0,46 A 208
MAB6
0,20 B 0,29 A 95
Tabla 75: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 76
Peso Fresco de la Planta [g], EUN 0,75 mM
ID del Gen
Día 10 desde la plantación
LSM
Significación* Mejor evento LSM Significación* % de mejora del mejor evento
GUI
0,15 B
MAB137
0,18 A 0,19 A 31
MAB50
0,16 B 0,22 A 49
MAB6
0,16 B 0,22 A 52
MAB66
0,15 B 0,19 A 32
Tabla 76: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
10 EJEMPLO 7
TEAB MEJORADA EN ENSAYOS DE INVERNADERO
Tolerancia al EAB: Tasa de rendimiento y de crecimiento de las plantas a concentración de alta salinidad en
15 condiciones de invernadero – Este ensayo obedece al crecimiento del área de la roseta de plantas que crecen en invernadero, así como al rendimiento de las semillas con riego de alta salinidad. Las semillas se sembraron en medio con agar complementado solo con un agente de selección (Kanamicina) y solución de Hoagland en condiciones de vivero. Después, las plántulas transgénicas T2 se trasplantaron en bandejas de 1,7 litros cargadas con turba y perlita. Las bandejas se regaron con agua corriente (proporcionada desde la base de las macetas). La
20 mitad de las plantas se regó con una solución salina (NaCl 40-80 mM y CaCl2 5 mM) para inducir estrés por salinidad (condiciones de estrés). La otra mitad de las plantas continuó regándose con agua corriente (condiciones normales). Todas las plantas crecieron en el invernadero hasta que las plantas alcanzaron la fase de semillas maduras, después se recogieron (el tejido por encima del suelo) y se pesaron (inmediatamente o después de secar en un horno a 50 ºC durante 24 horas). Las condiciones de alta salinidad se obtuvieron regando con una solución
25 que contenía NaCl 40-80 mM (condiciones de crecimiento con “EAB”) y después se compraron con condiciones de crecimiento regulares.
Se analizó el tamaño, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y el peso de 1.000 semillas, la materia seca y el índice de cosecha (IC- rendimiento de semilla/materia seca) global de las plantas. El rendimiento de las
30 plantas transgénicas se comparó con el de las plantas de control que crecían en paralelo en las mismas condiciones. Como control se usaron plantas transgénicas simuladas que expresaban el gen indicador uidA (GUS Intrón– GUI) bajo el mismo promotor.
El experimento se planificó en una distribución en parcelas aleatorizada anidada. Las condiciones de alta salinidad 35 se consiguieron regando con una solución que contenía NaCl 40-80 mM (condiciones de crecimiento con “EAB”).
Formación de imágenes digitales – Se usó un sistema de adquisición de imágenes de laboratorio, que consistía en una cámara réflex digital (Canon EOS 300D) acoplada a una lente de longitud focal de 55 mm (serie Canon EF-S), montada en un dispositivo reproductor (Kaiser RS), que incluía 4 unidades de luz (4x bombillas de luz de 150 vatios) para capturar imágenes de los plantones.
El proceso de captura de imágenes se repitió cada 2-3 días comenzando el día 1 después de sembrar hasta el día
10. La misma cámara acoplada con una lente de longitud focal de 24 mm (serie Canon EF), se colocó en un montaje de hierro fabricado a medida, usado para capturar imágenes de plantas más grandes que se cultivaron en macetones blancos en un invernadero con ambiente controlado (como se observa en las Figuras 2a-b). Los macetones, que eran cuadrados, incluían bandejas de 1,7 litros. Durante el proceso de captura, las bandejas se colocaron debajo del montaje de hierro, evitando la luz solar directa y la proyección de sombras. Este proceso se repitió cada 2-3 días durante hasta 10 días.
Se usó un sistema de análisis de imágenes, que consistía en un ordenador de escritorio personal (procesador Intel P4 3.0 GHz) y en un programa de dominio público – ImageJ 1.37 (programa de procesamiento de imágenes basado en Java que se desarrolló en el U.S. National Institutes of Health y gratuito en Internet en el Protocolo de Transferencia de Hipertexto://rsbweb (.) nih (.) gov/). Las imágenes se capturaron en resolución de 6 Megapíxeles (3072 x 2048 píxeles) y se almacenaron en un formato JPEG (Joint Photographic Experts Group) de baja compresión. Después, los datos analizados se guardaron en archivos de texto y se procesaron usando el programa informático de análisis estadístico JMP (Instituto SAS).
Análisis de los parámetros vegetativos – Usando los análisis digitales se calcularon los datos de las hojas, incluyendo el área foliar promedio, el diámetro de la roseta y el área de la roseta. La Tasa de Crecimiento Relativo (TCR) de los parámetros de la roseta se calculó de acuerdo con la Fórmula I, como se describe en el Ejemplo 6. El día 80 desde la siembra, las plantas se recogieron y se dejaron secar a 30 ºC en una cámara de secado. La biomasa y el peso de las semillas de cada parcela se separó, se midió y se dividió entre el número de plantas. El peso seco es = al peso total de la parte vegetativa por encima del suelo (excluyendo las raíces) después de secar a 30 ºC en una cámara de secado; el Rendimiento de semilla por planta es = al peso de semilla total por planta (g).
El peso de 1000 semillas se determinó de la siguiente manera: las semillas se diseminaron en una bandeja de vidrio y se hizo una foto. Cada muestra se pesó y después, usando el análisis digital, se calculó el número de semillas de cada muestra. El peso de 1000 semillas se calculó usando la fórmula II:
Fórmula II
Peso de 1000 Semillas = número de semillas en la muestra/peso la muestra X 1000
Índice de Cosecha – El índice de cosecha se calculó usando la Fórmula III
Fórmula III:
Índice de Cosecha = Rendimiento de semilla promedio por planta/peso seco promedio
Cada construcción se validó en su generación T2. Como control se usaron plantas transgénicas que expresaban el gen indicador uidA (GUI) bajo el mismo promotor.
Analizadores estadísticos – Para identificar genes que conferían tolerancia significativamente mejorada al estrés abiótico o una arquitectura radicular alargada, los resultados obtenidos de las plantas transgénicas se compararon con los obtenidos de las plantas de control. Para identificar los genes y las construcciones con comportamiento superior, se analizaron por separado los resultados de los eventos de transformación independientes ensayados Además, también se analizaron los genes y las construcciones teniendo en cuenta los resultados obtenidos en todos los eventos de transformación independientes ensayados en la construcción específica. Para los análisis de los genes frente a los controles, se aplicó el ensayo de la t de Student, usando una significación de P  0,05 o de P < 0,1. Se usó el paquete informático estadístico JMP (Versión 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).
Resultados Experimentales
Las secuencias de polinucleótidos de la invención se ensayaron con respecto a diversos rasgos deseados.
Las Tablas 77-86 representan análisis del Área de Roseta en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 77
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,58 B 0,58 B
MAB20
0,59 B 0,84 A 43
MAB50
0,57 B 0,88 A 51
Tabla 77: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 78
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,27 B 1,27 B
MAB20
1,20 B 1,73 a 36
MAB50
1,21 B 2,04 a 61
Tabla 78: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 79
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
3,62 B 3,62 B
MAB20
3,97 B 5,18 A 43
MAB50
3,88 B 6,11 A 69
Tabla 79: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 80
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
7,22 B 7,22 B
MAB50
6,75 B 10,18 A 41
Tabla 80: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
Tabla 81 Tabla 82
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,63 B 1,63 B
MAB1
2,03 A 2,29 A 40
MAB6
1,34 B 2,40 A 47
Tabla 81: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,88 B 2,88 B
MAB1
3,41 A* 3,76 A 31
Tabla 82: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 83
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,73 B 0,73 B
MAB1
0,77 B 0,91 A 25
Tabla 83: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
Tabla 84
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,41 B 1,41 B
MAB1
1,62 A* 2,02 A 44
NAB17
1,14 B 1,80 A 28
Tabla 84: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 85 Tabla 86
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,37 B 2,37 B
MAB1
2,59 B 3,56 A 50
MAB13
2,45 B 3,44 A 45
MAB17
1,96 C 3,10 A 31
Tabla 85: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
4,67 B 4,67 B
MAB1
5,37 A* 7,93 A 70
MAB15
4,78 B 6,08 A 30
MAB17
4,02 B 6,19 A 32
MAB3_GA
4,39 B 6,07 A 30
Tabla 86: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
Las Tablas 87-96 representan análisis del Diámetro de la Roseta en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 87
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,50 B 1,50 B
MAB50
1,35 B 1,80 A 20
Tabla 87: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
10 Tabla 88
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,05 B 2,05 B
MAB50
1,82 C 2,44 A 19
Tabla 88: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
Tabla 89 Tabla 90
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
3,23 B 3,23 B
MAB50
3,16 B 4,12 A 27
Tabla 89: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
4,47 B 4,47 B
MAB50
4,20 B 5,31 A 19
Tabla 90: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 91
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,25 B 2,25 B
MAB1
2,60 A 2,78 A 23
Tabla 91: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 92
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,87 B 2,87 B
MAB1
3,27 A* 9,25 A 223
MAB20
2,63 B 9,69 A 238
MAB6
2,51 B 10,00 A 249
Tabla 92: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 93
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
4,90 B 4,90 B
MAB6
4,35 B 6,26 A 28
Tabla 93: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 94 Tabla 95
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,05 B 2,05 B
MAB1
2,22 B 2,55 A 25
Tabla 94: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,56 B 2,56 B
MAB1
2,78 B 3,29 A 29
MAB3 GA
2,56 B 3,04 A 19
Tabla 95: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 96
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
3,52 B 3,52 B
MAB1
3,79 B 4,76 A 35
MAB17
3,24 B 4,14 A 17
MAB3_GA
3,44 B 4,12 A 17
Tabla 96: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
5 Las Tablas 97-105 representan análisis del Área Promedio Foliar en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
10 Tabla 97
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,10 B 0,10 B
MAB25
0,10 B 0,13 A 30
Tabla 97: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 98 Tabla 99
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,16 B 0,16 B
MAB50
0,15 B 0,23 A 45
Tabla 98: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,45 B 0,45 B
MAB50
0,41 B 0,61 A 34
Tabla 99: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 100
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,74 B 0,74 B
MAB50
0,66 B 0,92 A 25
Tabla 100: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 101
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,20 B 0,20 B
MAB1
0,25 A 0,28 A 43
MAB6
0,18 B 0,30 A 51
MAB7
0,23 B 0,27 A 36
Tabla 101: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 102
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,69 B 0,69 B
MAB1
0,80 A* 0,86 A* 24
MAB20
0,62 B 0,87 A 25
MAB6
0,59 B 0,99 A 44
Tabla 102: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 103 Tabla 104
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,20 B 0,20 B
MAB1
0,22 B 0,27 A 30
MAB17
- - 0,25 A 21
Tabla 103: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,28 B 0,28 B
MAB1
0,30 B 0,37 A 33
MAB17
0,24 B 0,34 A 22
Tabla 104: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 105
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,49 B 0,49 B
MAB1
0,55 B 0,76 A 53
MAB15
0,52 B 0,63 A 26
MAB17
0,45 B 0,64 A 28
Tabla 105: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
5 Las Tablas 106-111 representan análisis de la TCR del Área de Roseta [cm2] de plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
10 Tabla 106
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,73 B 0,73 B
MAB10
1,21 B 1,86 A 156
MAB14
1,31 B 1,80 A 149
MAB2
1,59 A 2,24 A 208
MAB20
1,87 A 2,33 A 221
MAB25
1,44 A 1,63 A* 125
MAB36
1,49 A 1,89 A 161
MAB43
1,73 A 3,85 A 430
MAB44
1,76 A 2,51 A 246
MAB50
1,37 A* 1,57 A* 117
MAB9
1,47 A 1,75 A 141
Tabla 106: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 107
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,61 B 0,61 B
MAB10
0,75 A* 0,91 A 50
MAB14
0,79 A 0,86 B 42
MAB19
0,78 A 0,85 A 41
MAB2
0,80 A 0,93 A 54
MAB20
0,79 A 0,98 A 61
MAB36
0,83 A 0,95 A 56
MAB44
0,75 A* 0,84 A 38
MAB50
0,76 A* 0,83 B 38
MAB6
0,82 A 0,99 A 64
MAB7
0,78 A 0,87 A 44
MAB9
0,77 A 0,84 A 38
Tabla 107: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 108
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,38 B 0,38 B
MAB6
0,37 B 0,51 A 33
Tabla 108: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 109
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,88 B 0,88 B
MAB18
0,99 A* 1,24 A 41
Tabla 109: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 110 Tabla 111
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,47 B 0,47 B
MAB1
0,55 A 0,64 A 38
MAB13
0,52 A 0,54 A* 16
MAB17
0,52 A 0,54 A* 17
MAB18
0,53 A 0,58 A 24
MAB3_GA
0,53 A 0,62 A 33
MAB32
0,52 A* 0,54 A* 17
MAB35
0,54 A 0,57 A 22
MAB4
0,51 A* 0,51 A* 10
MAB46
0,52 A* 0,55 A 19
MAB146
0,54 A 0,55 A 19
MAB99
0,53 A 0,57 A 23
Tabla 110: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,49 B 0,49 B
MAB1
0,53 B 0,62 A 27
MAB35
0,57 A* 0,59 A* 22
MAB46
0,55 B 0,63 A 30
Tabla 111: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 112-118 representan análisis de la TCR del Diámetro de Roseta en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 112
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,28 B
MAB2
0,41 B 0,80 A 184
MAB43
0,46 B 0,83 A 195
MAB44
0,40 B 0,73 A 160
Tabla 112: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 113
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,19 B 0,19 B
MAB1
0,22 B 0,24 B 25
MAB10
0,25 A 0,29 A 49
MAB14
0,23 A 0,25 A 31
MAB19
0,24 A 0,26 A 37
MAB2
0,24 A 0,26 A 34
MAB20
0,25 A 0,29 A 52
MAB25
0,24 A 0,27 A 42
MAB36
0,25 A 0,28 A 45
MAB43
0,22 B 0,25 B 28
MAB50
0,25 A 0,28 A 46
MAB6
0,24 A 0,27 A 41
MAB7
0,22 B 0,27 A 38
MAB9
0,23 A 0,26 A 34
Tabla 113: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 114 Tabla 115
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,14 B 0,14 B
MAB10
0,14 B 0,31 A 122
MAB20
0,13 B 0,21 A 49
MAB25
0,15 B 0,33 A 138
MAB9
0,15 B 0,20 A 45
Tabla 114: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,21 B 0,21 B
MAB20
0,23 B 0,34 A 67
MAB9
0,22 B 0,44 A 114
Tabla 115: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 116
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,34 B 0,34 B
MAB18
0,37 B 0,46 A 35
MAB3_GA
0,34 B 0,43 A 26
MAB35
0,43 A 0,55 A 62
MAB46
0,39 B 0,49 A 42
MAB99
0,34 B 0,43 A 26
Tabla 116: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 117
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,16 B 0,16 B
MAB1
0,22 A 0,26 A 66
MAB18
0,20 A* 0,23 A* 44
MAB46
0,25 A 0,45 A 185
MAB146
0,20 A* 0,22 A* 42
Tabla 117: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 118
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] NaCl 80 mM, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,08 B 0,08 B
MAB35
0,10 B 0,13 A 57
MAB46
0,10 B 0,14 A 64
MAB146
0,10 B 0,14 A 66
MAB99
0,10 B 0,13 A 56
Tabla 118: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
10 Las Tablas 119-121 representan análisis de la TCR del Área Promedio Foliar [cm2] en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 119
ID del Gen
TCR del Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,35 B 0,35 B
MAB14
0,34 B 0,63 A 82
MAB25
0,44 B 0,83 A 137
MAB36
0,43 B 0,77 A 120
MAB6
0,24 B 0,70 A 102
Tabla 119: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 120
ID del Gen
TCR del Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,32 B 0,32 B
MAB10
0,32 B 0,56 A 74
Tabla 120: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 121
ID del Gen
TCR del Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,39 B 0,39 B
MAB13
0,41 B 0,57 A 49
MAB15
0,46 A* 0,54 A 40
MAB17
0,46 A* 0,50 A* 30
Tabla 121: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
10 La Tabla 122 representa análisis de la TCR del Área Promedio Foliar [cm2] en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 122
ID del Gen
TCR del Área Promedio Foliar [cm2] NaCl 80 mM, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,28 B 0,28 B
MAB2
0,41 B 0,80 A 184
MAB43
0,46 B 0,83 A 195
MAB44
0,40 B 0,73 A 160
Tabla 122: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
La Tabla 123 representa análisis del Peso Seco (PS) por Parcela en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 20 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 123
ID del Gen
Peso Seco [g] NaCl 80 mM
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
4,00 B 4,00 B
MAB1
4,92 A 6,40 A 60
MAB134
4,35 B 5,35 A 34
MAB15
4,42 B 5,57 A 39
MAB18
4,52 B 5,35 A 34
MAB3 GA
4,53 B 5,47 A 37
Tabla 123: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
Las Tablas 124-126 representan análisis del Peso de 1000 Semillas en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 124
ID del Gen
Peso de 1000 Semillas [g] NaCl 80 mM
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,02 B 0,02 B
MAB14
0,02 B 0,03 A 32
MAB19
0,02 B 0,03 A 27
MAB2
0,02 B 0,03 A 24
MAB6
0,03 A 0,03 A 53
Tabla 124: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 125
ID del Gen
Peso de 1000 Semillas [g] NaCl 80 mM
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,02 B 0,02 B
MAB20
0,02 A* 0,02 A 17
MAB25
0,02 B 0,02 A 20
MAB6
0,02 A* 0,02 A 21
MAB7
0,02 B 0,02 A 21
MAB9
0,02 B 0,02 A 19
Tabla 125: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 126
I
Peso de 1000 Semillas [g] NaCl 80 mM
LSM
% de mejora del mejor evento LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,02 B 0,02 B
MAB100
0,02 B 0,02 A 28
MAB134
0,02 B 0,02 A 26
MAB17
0,02 B 0,02 A 23
MAB18
0,02 B 0,02 A 17
MAB32
0,02 B 0,02 A 13
MAB4
0,02 B 0,02 A 19
MAB46
0,02 B 0,02 A 18
MAB99
0,02 B 0,02 A 15
Tabla 126: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa
I
Peso de 1000 Semillas [g] NaCl 80 mM
LSM
% de mejora del mejor evento LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
Las Tablas 127-129 representan análisis del Rendimiento de Semillas por Planta en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 127
ID del Gen
Rendimiento de Semillas por Planta [g] NaCl 80 mM
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,07 B 0,07 B
MAB44
0,11 B 0,22 A 210
MAB50
0,11 B 0,19 A 170
Tabla 127: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 128
ID del Gen
Rendimiento de Semillas por Planta [g] NaCl 80 mM
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,09 B 0,09 B
MAB6
0,11 A* 0,21 A 142
MAB9
0,09 B 0,14 A 59
Tabla 128: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 129
ID del Gen
Rendimiento de Semillas por Planta [g] NaCl 80 mM
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,14 B 0,14 B
MAB1
0,19 A 0,33 A 139
MAB100
0,17 B 0,24 A 79
Tabla 129: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior
La Tabla 130 representa análisis del Índice de Cosecha en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669 en condiciones con déficit de nitrógeno. Cada Tabla representa un 15 experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 130
ID del Gen
Índice de Cosecha NaCl 80 mM
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,11 B 0,11 B
MAB25
0,16 B 0,26 A 139
MAB44
0,20 A* 0,30 A 174
MAB7
0,12 B 0,29 A 172
Tabla 130: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1.
ID del Gen
Índice de Cosecha NaCl 80 mM
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 131-140 representan análisis del Área de Roseta en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 131
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,37 B 1,37 B
MAB1
1,43 B 1,80 A 31
MAB9
1,32 B 1,74 A 27
Tabla 131: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 132
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
4,73 B 4,73 B
MAB1
4,95 B 6,45 A 36
Tabla 132: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 133
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
8,45 B 8,45 B
MAB1
8,87 B 11,11 A 31
Tabla 133: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 134
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,65 B 1,65 B
MAB1
2,09 A 2,27 A 37
MAB36
1,65 B 2,58 A 56
MAB7
1,83 B 2,81 A 70
Tabla 134: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 135
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,93 B 2,93 B
MAB1
3,60 A* 3,78 A* 29
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
MAB36
2,91 B 4,55 A 55
MAB7
3,14 B 4,69 A 60
Tabla 135: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 136
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
7,73 B 7,73 B
MAB1
9,77 A 10,58 A 37
MAB36
8,05 B 12,12 A 57
MAB7
8,69 B 12,82 A 66
Tabla 136: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 137
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,55 B 0,55 B
MAB1
0,58 B 0,81 A 47
MAB100
0,60 B 0,74 A 34
MAB15
0,65 A* 0,90 A 64
MAB17
0,55 B 0,85 A 55
Tabla 137: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 138
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,03 B 1,03 B
MAB1
1,17 B 1,54 A 49
MAB100
1,18 B 1,46 A 42
MAB15
1,23 A 1,67 A 62
MAB17
1,01 B 1,59 A 54
Tabla 138: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 139 Tabla 140
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,09 B 2,09 B
MAB1
2,46 B 3,43 A 64
MAB100
2,29 B 2,81 A 34
MAB15
2,60 A 3,63 A 73
MAB17
2,06 B 3,35 A 60
Tabla 139: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
4,81 B 4,81 B
MAB1
5,57 A* 8,29 A 72
MAB15
5,72 A 8,05 A 67
MAB17
4,78 B 7,50 A 56
Tabla 140: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 141-148 representan análisis del Diámetro de Roseta en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 141
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
3,52 B 3,52 B
MAB1
3,58 B 4,17 A 18
Tabla 141: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 142
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,28 B 2,28 B
MAB36
2,23 B 2,91 A 28
MAB7
2,47 B 3,11 A 36
Tabla 142: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 143
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,99 B 2,99 B
MAB7
3,24 B 4,08 A 36
Tabla 143: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 144 Tabla 145
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
5,00 B 5,00 B
MAB1
5,65 A* 5,87 A* 17
MAB7
5,06 B 6,32 A 26
Tabla 144: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,30 B 1,30 B
MAB15
1,48 A 1,69 A 30
MAB17
1,33 B 1,60 A 23
Tabla 146: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 146
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,87 B 1,87 B
MAB1
1,86 B 2,21 A 18
MAB15
1,96 B 2,29 A 22
MAB17
1,78 B 2,26 A 21
Tabla 146: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 147
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
2,49 B
MAB1
2,60 B 3,14 A 26
MAB15
2,64 B 3,17 A 27
MAB17
2,39 B 3,09 A 24
Tabla 147: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 148
ID del Gen
Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
3,49 B 3,49 B
MAB1
3,88 A* 4,81 A 38
MAB 15
3,78 B 4,52 A 29
MAB17
3,53 B 4,45 A 27
Tabla 148: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 149-157 representan análisis del Área Promedio Foliar en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 10 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 149 Tabla 150
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,17 B 0,17 B
MAB1
0,17 B 0,21 A 27
Tabla 149: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,51 B 0,51 B
MAB1
0,52 B 0,69 A 35
Tabla 150: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 151
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,19 B 0,19 B
MAB1
0,25 A 0,27 A 38
MAB36
0,20 B 0,31 A 58
MAB7
0,23 A* 0,33 A 67
Tabla 151: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 152
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,32 B 0,32 B
MAB1
0,38 B 0,43 A 34
MAB36
0,32 B 0,46 A 43
MAB7
0,33 B 0,47 A 45
Tabla 152: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 153
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,69 B 0,69 B
MAB36
0,69 B 0,93 A 36
MAB7
0,79 B 1,17 A 71
Tabla 153: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 154
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,11 B 0,11 B
MAB1
0,12 B 0,15 A 28
MAB15
0,13 B 0,17 A 53
MAB17
0,11 B 0,15 A 34
Tabla 154: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1.
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 155
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,16 B 0,16 B
MAB1
0,17 B 0,21 A 26
MAB100
0,18 B 0,21 A 30
MAB15
0,18 A* 0,23 A 39
MAB17
0,16 B 0,22 A 35
Tabla 155: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 156
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,24 B 0,24 B
MAB1
0,28 A* 0,37 A 50
MAB 15
0,29 A* 0,37 A 53
MAB17
0,25 B 0,34 A 40
Tabla 156: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 157
ID del Gen
Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,54 B 0,54 B
MAB1
0,57 B 0,80 A 49
MAB15
0,59 B 0,78 A 45
MAB17
0,51 B 0,74 A 37
Tabla 157: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 158-166 representan análisis de la TCR del Área de Roseta [cm2] de plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento 10 independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 158 Tabla 159
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
1,73 B 1,73 B
MAB20
2,18 B 3,62 A 109
MAB43
2,04 B 3,80 A 119
MAB50
2,25 B 3,81 A 120
Tabla 158: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,48 B 0,48 B
MAB2
0,58 A* 0,70 A 45
MAB43
0,62 A 0,75 A 56
MAB6
0,52 B 0,72 A 50
Tabla 159: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 160
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,84 B 0,84 B
MAB50
0,87 B 0,99 A 18
MAB6
0,87 B 1,06 A 26
Tabla 160: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 161
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,39 B 0,39 B
MAB10
0,44 B 0,54 A 37
MAB36
0,45 B 0,51 A 30
MAB50
0,45 A* 0,53 A 35
MAB6
0,44 B 0,60 A 51
MAB7
0,43 B 0,50 A 27
Tabla 161: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 162
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,39 B 0,39 B
MAB20
0,38 B 0,50 A 28
MAB25
0,39 B 0,53 A 38
Tabla 162: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 163 Tabla 164
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,55 B 0,55 B
MAB10
0,64 A* 0,71 A* 30
MAB2
0,63 A* 0,70 A 28
MAB20
0,63 A* 0,67 A* 21
MAB25
0,64 A 0,73 A 32
MAB44
0,65 A 0,77 A 41
MAB50
0,70 A 0,83 A 51
MAB6
0,63 A* 0,81 A 48
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
MAB7
0,61 B 0,73 A 34
MAB9
0,60 B 0,69 A 26
Tabla 163: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,45 B 0,45 B
MAB13
0,63 A 0,68 A* 49
MAB32
0,50 B 0,74 A 64
MAB46
0,52 B 0,75 A 65
MAB146
0,64 A 0,88 A 94
MAB99
0,52 B 0,73 A 61
Tabla 164: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 165
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,34 B 0,34 B
MAB1
0,36 B 0,45 A 31
MAB99
0,33 B 0,43 A 28
Tabla 165: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 166
ID del Gen
TCR del Área de Roseta [cm2] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,66 B 0,66 B
MAB13
0,73 B 0,81 A 23
MAB3 GA
0,70 B 0,85 A 29
MAB32
0,70 B 0,86 A 31
MAB99
0,68 B 0,82 A 25
Tabla 166: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 167-175 representan análisis de la TCR del Diámetro de Roseta en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento 10 independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 167 Tabla 168
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,43 B 0,43 B
MAB50
0,70 A* 1,50 A 251
MAB6
0,45 B 1,21 A 183
Tabla 167: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,16 B 0,16 B
MAB10
0,19 A* 0,21 A* 28
MAB19
0,20 A 0,23 A 45
MAB36
0,18 B 0,21 A 32
MAB50
0,17 B 0,23 A 42
MAB6
0,18 B 0,25 A 57
MAB7
0,18 B 0,24 A 52
Tabla 168: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 169
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,25 B 0,25 B
MAB10
0,28 A 0,30 A 19
MAB14
0,27 B 0,31 A 23
MAB19
0,28 A 0,32 A 29
MAB2
0,27 B 0,30 A 21
MAB20
0,27 B 0,29 A 18
MAB36
0,27 A* 0,32 A 28
MAB43
0,25 B 0,26 B 5
MAB44
0,26 B 0,30 A 21
MAB50
0,27 B 0,30 A 21
MAB7
0,28 A* 0,29 A 17
MAB9
0,27 A* 0,30 A 20
Tabla 169: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 170
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,17 B 0,17 B
MAB19
0,19 A* 0,23 A 31
MAB2
0,20 A 0,23 A 32
MAB20
0,19 A 0,23 A 33
MAB43
0,19 B 0,21 A 24
MAB44
0,18 B 0,22 A 25
MAB50
0,20 A 0,23 A 32
MAB6
0,19 A* 0,24 A 42
MAB9
0,18 B 0,21 A 25
Tabla 170: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 171
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,16 B 0,16 B
MAB50
0,19 B 0,22 A 42
MAB6
0,15 B 0,24 A 49
Tabla 171: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 172
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,22 B 0,22 B
MAB2
0,26 A* 0,28 A 27
MAB20
0,26 B 0,30 A 33
MAB25
0,26 A* 0,29 A* 31
MAB43
0,24 B 0,29 A 29
MAB44
0,25 B 0,29 A 31
Tabla 172: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 173
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 3 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,29 B 0,29 B
MAB100
0,37 A* 0,51 a 74
MAB13
0,38 A 0,58 A 95
MAB15
0,36 A 0,45 A 54
MAB18
0,36 A* 0,38 A* 28
MAB3_GA
0,43 A 0,60 A 105
MAB35
0,39 A 0,44 A 50
MAB46
0,31 B 0,49 A 65
MAB146
0,35 A 0,44 A 50
Tabla 173: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 174 Tabla 175
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,11 B 0,11 B
MAB1
0,13 A* 0,16 A 49
MAB13
0,13 A* 0,16 A 41
MAB18
0,14 A 0,16 A 45
MAB32
0,13 B 0,15 A 39
MAB146
0,16 A 0,19 A 72
MAB99
0,12 B 0,15 A 40
Tabla 174: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
ID del Gen
TCR del Diámetro de Roseta [cm] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,20 B 0,20 B
MAB1
0,25 A 0,27 A 30
MAB17
0,24 A 0,26 A* 25
MAB18
0,25 A 0,31 A 51
MAB35
0,25 A 0,28 A 36
MAB146
0,25 A 0,28 A 36
MAB99
0,24 A 0,29 A 44
Tabla 175: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 176-178 representan análisis de la TCR del Área Promedio Foliar [cm2] en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 176
ID del Gen
TCR del Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,34 B 0,34 B
MAB10
0,35 B 0,52 A 56
MAB36
0,40 B 0,52 A 55
MAB7
0,37 B 0,50 A 49
Tabla 176: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 177
ID del Gen
TCR del Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 10 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,23 B 0,23 B
MAB13
0,34 A* 0,39 A* 70
MAB146
0,35 A* 0,50 A 117
MAB99
0,26 B 0,44 A 89
Tabla 177: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 178
ID del Gen
TCR del Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,38 B 0,38 B
MAB10
0,47 A 0,51 A* 35
MAB2
0,41 B 0,49 A 29
MAB25
0,43 B 0,55 A 44
MAB50
0,47 A 0,53 A 41
MAB7
0,45 A* 0,50 A* 31
MAB9
0,43 B 0,54 A 41
Tabla 178: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 179-180 representan análisis de la TCR de Área Promedio Foliar [cm2] en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 179
ID del Gen
TCR del Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 5 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,31 B 0,31 B
MAB19
0,35 B 0,48 A 56
MAB43
0,39 B 0,52 A 70
MAB6
0,28 B 0,50 A 62
Tabla 179: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 180
ID del Gen
TCR del Área Promedio Foliar [cm2] Condiciones normales, Día 8 desde la plantación
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,69 B 0,69 B
MAB14
0,72 B 0,92 A 32
MAB6
0,69 B 0,96 A 38
Tabla 180: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
10 Las Tablas 181-182 representan análisis de Peso Seco (PS) por parcelas en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
15 Tabla 181
ID del Gen
Peso seco [g] Condiciones normales
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
7,75 B 7,75 B
MAB36
10,37 A* 13,21 A 71
Tabla 181: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 182
ID del Gen
Peso seco [g] Condiciones normales
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
5,23 B 5,23 B
MAB1
6,81 A 8,09 A 55
MAB13
6,08 B 7,61 A 45
MAB18
6,10 B 8,18 A 56
MAB99
6,51 A* 8,42 A 61
Tabla 182: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 183-185 representan análisis del Peso de 1000 Semillas en plantas que sobreexpresan los
20 polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 183
ID del Gen
Peso de 1000 Semillas [g] Condiciones normales
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,02 B 0,02 B
MAB19
0,02 B 0,03 A 23
MAB2
0,02 B 0,03 A 44
MAB20
0,02 A 0,04 A 71
MAB36
0,02 B 0,03 A 24
MAB50
0,02 B 0,03 A 32
MAB6
0,02 B 0,03 A 22
MAB9
0,02 A 0,02 A 19
Tabla 183: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 184
ID del Gen
Peso de 1000 Semillas [g] Condiciones normales
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,02 B 0,02 B
MAB20
0,02 A* 0,02 A 17
MAB6
0,02 A* 0,02 A 21
Tabla 184: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Tabla 185
ID del Gen
Peso de 1000 Semillas [g] Condiciones normales
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,02 B 0,02 B
MAB100
0,02 B 0,02 A 23
MAB17
0,02 A 0,03 A 33
MAB18
0,02 B 0,02 A 18
MAB35
0,02 B 0,02 A 28
MAB46
0,02 A 0,02 A 21
MAB99
0,02 A 0,03 A 37
Tabla 185: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Las Tablas 186-187 representan análisis del Rendimiento de Semilla por Planta en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del
10 control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 186 Tabla 187
Id del Gen
Rendimiento de Semilla por Planta [g] Condiciones normales
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,38 B 0,38 B
MAB1
0,50 B 0,61 A 61
MAB10
0,46 B 0,59 A 53
MAB14
0,50 A* 0,60 A 57
MAB36
0,52 A 0,68 A 77
MAB50
0,46 B 0,60 A 56
Tabla 186: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
Id del Gen
Rendimiento de Semilla por Planta [g] Condiciones normales
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,32 B 0,32 B
MAB1
0,41 A* 0,49 A 53
MAB13
0,43 A 0,55 A 69
MAB18
0,39 B 0,49 A 53
MAB32
0,41 B 0,50 A 56
MAB35
0,41 A* 0,50 A 57
MAB99
0,41 A* 0,51 A 57
Tabla 187: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
La Tabla 188 representa análisis del Índice de Cosecha en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación del promotor 6669. Cada Tabla representa un experimento independiente, usando 4 eventos independientes por gen. Los genes no relacionados con la misma letra que la del control (A, B), son significativamente diferentes de los del control.
Tabla 188
Id del Gen
Índice de Cosecha Condiciones normales
LSM
Significación LSM del mejor evento Significación % de mejora del mejor evento
GUI
0,48 B 0,48 B
MAB17
0,46 B 0,62 A 28
Tabla 188: LSM = Media de mínimos cuadrados; % de mejora = en comparación con el control (GUI); A significa diferencia significativa a P < 0,05, A* significa diferencia significativa a P < 0,1. Las SEC ID Nos de los genes clonados (de acuerdo con el ID del gen) que se expresan exógenamente en las plantas se proporcionan en la Tabla 3 anterior.
EJEMPLO 8
TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS DE TOMATE M82 CON SUPUESTOS GENES DE TEAB
15 Para la transformación del tomate, semillas M82 de tomate se esterilizaron previamente con hipocloruro de sodio al 3 % + 2-3 gotas de Tween 20 (Polisorbato 20). Las semillas se lavaron 3 veces con agua destilada estéril. Después las semillas germinaron en medio de Nitsch al 100% y germinaron durante 8 días en una sala de cultivo a 25 ºC en la oscuridad. Después, las plántulas se cortaron con un tallo de 2-4 cm y se insertaron en placas de Petri de 10 cm que se cargaron con 30-40 ml de medio líquido MS. Después, los cotiledones se cortaron y se usaron como
20 explantes y posteriormente se transfirieron a medio solidificado KCMS con acetosiringona 100 M en una placa de Petri de 10 cm. Los explantes se inocularon con A. tumefaciens durante 30-50 minutos. Los explantes se cocultivaron durante 24 horas y se transfirieron a medio de regeneración que incluía Kanamicina como medio de selección. Las plántulas resistentes regeneradas se transfirieron después a un medio de enraizamiento durante 1014 días hasta la aparición de las raíces.
25 EJEMPLO 9
CRECIMIENTO DE PLANTAS DE TOMATE M82 TRANSFORMADAS Y CARACTERIZACIONES FENOTÍPICAS
Procedimientos Experimentales
30 Producción de plantas de tomate transgénicas – Las plantas se transformaron como se ha descrito en el Ejemplo 8, anterior. Después de la transformación, las plantas de tomate T1 M82 se cultivaron hasta el establecimiento del fruto. Las semillas T2 se han introducido en experimentos para evaluar la resistencia al estrés abiótico.
35 Resultados Experimentales
Ensayo 1 – Ensayo de campo en tomate con regímenes de déficit hídrico y regular – Se proyectó un ensayo de campo en tomate como un sistema de riego por goteo de una fuente (RGUF) similar al de un campo agrícola convencional. Dado que el déficit hídrico se aplicó de una manera relativamente uniforme, esto permitió medir el 40 efecto de la sequía en poblaciones de plantas de pequeño tamaño. El método RGUF se desarrolló en base a un sistema de riego por aspersión de fuente en línea (Hanks et al. 1976 Soil Sci. Soc Am. J. 40 págs. 426-429) con algunas modificaciones significativas. En lugar de riego por aspersión, se usó riego por goteo. Para crear una capa
húmeda profunda y uniforme (al menos de una profundidad de 60 cm), y no la capa en forma de cebolla que se crea típicamente mediante riego por goteo, se usó un sistema de riego por goteo con compensación de baja presión. Este sistema permite proporcionar pequeñas cantidades de agua en un intervalo de tiempo relativamente largo. El ensayo de campo de estrés por sequía se realizó en un suelo iluminado, en un campo abierto (casa de malla) cerca de Rehovot, Israel. Se evaluaron entre 4 a 5 eventos por cada gen y se usaron poblaciones de segregación nula como controles negativos. Durante las tres primeras semanas, todas las plantas se desarrollaron en un vivero en condiciones de riego normales. Después de este periodo, las plantas se trasplantaron de acuerdo con un protocolo de cultivo comercial, que mantenía una distancia de 30 cm entre las plantas que alcanzaban una densidad total de
2.600 plantas por 1000 m2 (la densidad recomendada en los cultivos comerciales). Cada planta se trasplantó cerca de un gotero de riego de agua y posteriormente se sometió a dos tratamientos diferentes:
Óptimo (100 %): condiciones de riego óptimas (100 %). El riego se aplicó cada 2 días como un suministro de agua estándar recomendado. El suministro de agua estándar recomendado es la cantidad aplicada por los agricultores comerciales locales de acuerdo con protocolos estándar. Estrés grave (50 %): Una vez al día se aplicó el 50 % de la cantidad de riego de agua óptima (al mismo tiempo que se aplicaba riego regular). Todos los fertilizantes se aplicaron de acuerdo con los protocolos estándar locales. El nitrógeno se aplicó del mismo modo, según se recomienda, a todos los tratamientos a través del sistema por riego. Cada hilera, de 193 cm de anchura, contenía dos líneas de riego por goteo creando una cobertura de seis goteros por 1 m2. El control del riego se realizó individualmente en cada tratamiento. El experimento se estructuró en un diseño de 4 bloques distribuidos al azar, ocho plantas por parcela. Los diferentes regímenes hídricos comenzaron al cabo de tan solo cuatro semanas del trasplante de los árboles, cuando las plantas comenzaban la fase de floración. La disponibilidad hídrica en el suelo se registró usando tensiómetros (usados para determinar el potencial hídrico matricial m que permite evaluar la gravedad del estrés). Ensayo 2 – Experimento de baño salino en el tomate – Se sembraron semillas de tomate transgénicas en bandejas que contenían medio de cultivo desnitrificado. Las plántulas germinaron en condiciones de vivero. Se usó el modelo experimental de 3 bloques distribuidos al azar, en el que en cada bloque se sembraron 10 plantas por evento. En la fase de primera hoja verdadera, las bandejas se transfirieron a diferentes “tanques” que contenían solución de cultivo de NaCl 300 mM. Para el tratamiento normal, se aplicó una solución completa de Hoagland. Se evaluaron 5 eventos para cada gen, usando, como controles negativos poblaciones segregantes anuladas. El experimento se realizó durante un periodo de 8 semanas, midiendo parámetros tales como el contenido de clorofila (medido como unidades SPAD, Soil Plant Analysis Development) y la biomasa de las plantas (PF y PS).
Aunque la invención se ha descrito junto con sus realizaciones específicas, es obvio que aparecerán muchas alternativas, modificaciones y variaciones para los expertos en la técnica. Por consiguiente, se pretende incluir todas estas alternativas, modificaciones y variaciones que se encuentran dentro del espíritu y amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas.
REFERENCIAS CITADAS
(Anteriormente en el presente documento se han citado referencias adicionales)
1.
Red Informática Mundial WWW (.) fao (.) org/ag/agl/agll/spush/degrad (.) htm.
2.
Red Informática Mundial WWW (.) fao (.) org/ag/agl/aglw/watermanagement/introduc (.) stm.
3.
McCue KF, Hanson AD (1990). Drought and salt tolerance: towards understanding and application.Trends Biotechnol 8: 358-362.
4.
Flowers TJ, Yeo Ar (1995). Breeding for salinity resistance in crop plants: where next? Aust J Plant Physiol 22: 875-884.
5.
Nguyen BD, Brar DS, Bui BC, Nguyen TV, Pham LN, Nguyen HT (2003). Identification and mapping of the QTL for aluminum tolerance introgressed from the new source, ORYZA RUFIPOGON Griff., into indica rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet. 106: 583-93.
6.
Sanchez AC, Subudhi PK, Rosenow DT, Nguyen HT (2002). Mapping QTLs associated with drought resistance in sorghum (Sorghum bicolor L. Moench). Plant Mol Biol. 48: 713-26.
7.
Quesada V, García-Martínez S, Piqueras P, Ponce MR, Micol JL (2002). Genetic architecture of NaCl tolerance in Arabidopsis. Plant Physiol. 130: 951-963.
8.
Apse MP, Blumwald E (2002). Engineering salt tolerance in plants. Curr Opin Biotechnol. 13: 146-150.
9.
Rontein D, Basset G, Hanson AD (2002). Metabolic engineering of osmoprotectant accumulation in plants.Metab Eng 4: 49-56
10.
Clough SJ, Bent AF (1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16: 735-43.
11.
Desfeux C, Clough SJ, Bent AF (2000). Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol 123: 895-904.
Contenido del CD-ROM (Disco Compacto Solamente Para Lectura)
A continuación se indica el listado del contenido de los archivos del CD-ROM que se adjunta con la presente memoria y se presenta con la solicitud. La información del archivo se proporciona como: nombre del archivo/tamaño en bytes/fecha de creación/sistema operativo/formato del equipo.
CD-ROM1 (1 archivo de LISTADO DE SECUENCIAS):
1. “43562 Sequence Listing.txt”/ 3,856,000 bytes/ July 24, 2008/ Microsoft Windows XP Professional/ PC.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un método para aumentar la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de una planta en comparación con la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de una planta no transgénica, en el que el estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste en estrés osmótico, estrés salino y déficit de nitrógeno, comprendiendo el método la sobreexpresión en la planta de un polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido SEC ID Nº: 201 o un ortólogo del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201, en el que dicho polipéptido es capaz de aumentar la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de una planta, en el que el estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste en estrés osmótico, estrés salino y déficit de nitrógeno, en el que dicho polinucleótido exógeno está comprendido en una construcción de ácido nucleótido que adicionalmente comprende un promotor para dirigir la transcripción de dicho polinucleótido exógeno en una célula de una planta, siendo dicho promotor un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, o un promotor inducible por un estrés abiótico, aumentando así la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de la planta en comparación con la biomasa, la tasa de crecimiento, el rendimiento de las semillas y/o la tolerancia al estrés abiótico de la planta no transgénica.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos tiene una homología de al menos 86 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos tiene una homología de al menos 95 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201.
  4. 4.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polinucleótido exógeno codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201.
  5. 5.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho promotor es un promotor constitutivo.
  6. 6.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polinucleótido exógeno se expone en la SEC ID Nº: 1530, 1 o 1531.
  7. 7.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polinucleótido es heterólogo de dicha planta.
  8. 8.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente cultivar la planta que expresa dicho polinucleótido exógeno bajo estrés abiótico.
  9. 9.
    El método de la reivindicación 1, en el que dicho ortólogo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 289.
ES08776651.5T 2007-07-24 2008-07-24 Polinucleótidos, polipéptidos codificados por los mismos, y métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o la biomasa y/o el rendimiento en plantas que los expresan Active ES2547305T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93504607P 2007-07-24 2007-07-24
US935046P 2007-07-24
PCT/IL2008/001024 WO2009013750A2 (en) 2007-07-24 2008-07-24 Polynucleotides, polypeptides encoded thereby, and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance and/or biomass and/or yield in plants expressing same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2547305T3 true ES2547305T3 (es) 2015-10-05

Family

ID=40281935

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15151271.2T Active ES2685631T3 (es) 2007-07-24 2008-07-24 Polinucleótidos, polipéptidos codificados por los mismos, y métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o biomasa y/o rendimiento en plantas que los expresan
ES08776651.5T Active ES2547305T3 (es) 2007-07-24 2008-07-24 Polinucleótidos, polipéptidos codificados por los mismos, y métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o la biomasa y/o el rendimiento en plantas que los expresan

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15151271.2T Active ES2685631T3 (es) 2007-07-24 2008-07-24 Polinucleótidos, polipéptidos codificados por los mismos, y métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o biomasa y/o rendimiento en plantas que los expresan

Country Status (9)

Country Link
US (6) US8686227B2 (es)
EP (2) EP2910638B1 (es)
CN (1) CN102037127A (es)
AU (1) AU2008278654B2 (es)
BR (3) BRPI0812742B1 (es)
CA (3) CA2694481C (es)
ES (2) ES2685631T3 (es)
WO (1) WO2009013750A2 (es)
ZA (1) ZA201001205B (es)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005234725B2 (en) 2003-05-22 2012-02-23 Evogene Ltd. Methods of Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass in Plants and Plants Generated Thereby
US7554007B2 (en) 2003-05-22 2009-06-30 Evogene Ltd. Methods of increasing abiotic stress tolerance and/or biomass in plants
CA2570195C (en) 2004-06-14 2017-10-24 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides involved in plant fiber development and methods of using same
AU2006307457B2 (en) 2005-10-24 2012-03-22 Evogene Ltd. Isolated polypeptides, polynucleotides encoding same, transgenic plants expressing same and methods of using same
AU2007335706B2 (en) 2006-12-20 2013-03-28 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides involved in plant fiber development and methods of using same
BRPI0809796B1 (pt) 2007-04-09 2021-09-08 Evogene Ltd Métodos para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, e para produzir óleo
ES2685631T3 (es) 2007-07-24 2018-10-10 Evogene Ltd. Polinucleótidos, polipéptidos codificados por los mismos, y métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o biomasa y/o rendimiento en plantas que los expresan
WO2009083958A2 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Evogene Ltd. Isolated polypeptides, polynucleotides useful for modifying water user efficiency, fertilizer use efficiency, biotic/abiotic stress tolerance, yield and biomass in plants
TR201808744T4 (tr) 2008-05-22 2018-07-23 Evogene Ltd İzole polinükleotidler ve polipeptidlerle bunların bitki yararını artırmaya yönelik kullanımına ilişkin yöntemler.
BR122021014158B1 (pt) 2008-08-18 2022-08-16 Evogene Ltd. Método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, e/ou tolerância à deficiência de nitrogênio de uma planta
AR074071A1 (es) * 2008-10-30 2010-12-22 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados y metodos para utilizarlos para aumentar el rendimiento de la planta, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, tolerancia al estres abiotico de las plantas y eficacia en el uso de nitrogeno
AR074925A1 (es) 2008-12-29 2011-02-23 Evogene Ltd Polinucleotidos, polipeptidos codificados, y metodos para utilizarlos para modular la tolerancia al estres abiotico, biomasa y/o rendimiento en plantas que los expresan
DE112010000887T5 (de) * 2009-02-25 2012-09-27 Basf Plant Science Company Gmbh Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu deren Herstellung
SI3460062T1 (sl) 2009-03-02 2021-09-30 Evogene Ltd. Izolirani polinukleotidi in polipeptidi in postopki uporabe le-teh za zvišanje donosa in/ali poljedelskih značilnosti rastlin
CA3095630A1 (en) 2009-06-10 2010-12-16 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
MX352610B (es) 2009-08-04 2017-11-30 Evogene Ltd Polinucleótidos y polipéptidos aislados, y métodos para utilizarlos para mejorar la tolerancia al estrés abiótico, rendimiento,tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite y/o eficacia en el uso de nitrógeno de las plantas.
WO2011080674A2 (en) 2009-12-28 2011-07-07 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
US9328353B2 (en) 2010-04-28 2016-05-03 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
EP2593468B1 (en) * 2010-07-12 2020-06-10 The State of Israel, Ministry of Agriculture and Rural Development, Agricultural Research Organization, (A.R.O.), Volcani Center Isolated polynucleotides and methods and plants using same for regulating plant acidity
AR082530A1 (es) 2010-08-30 2012-12-12 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados, y metodos para utilizarlos para aumentar la eficacia en el uso de nitrogeno, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite y/o tolerancia al estres abiotico
MX344728B (es) 2010-12-22 2017-01-05 Evogene Ltd Polinucleótidos y polipéptidos aislados, y métodos para utilizarlos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite y/o eficacia en el uso de nitrógeno de las plantas.
BR122020018202B1 (pt) 2011-05-03 2022-02-08 Evogene Ltd Método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta
AR087952A1 (es) 2011-08-23 2014-04-30 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados y metodos de utilizacion de los mismos para aumentar el rendimiento y/o las caracteristicas agricolas de plantas
RU2014125127A (ru) 2011-11-21 2015-12-27 Зингента Партисипейшнс Аг Композиции и способы для повышения устойчивости к нематодам у растений
WO2013080203A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
BR112014016080A2 (pt) 2011-12-28 2020-06-30 Evogene Ltd., polínucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar à produção das plantas
AR091312A1 (es) 2012-02-29 2015-01-28 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados y metodos para utilizarlos para mejorar el rendimiento de la planta, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, tolerancia al estres abiotico de las plantas y eficacia en el uso de nitrogeno
BR122021002081B1 (pt) 2012-05-28 2022-07-26 Evogene Ltd Método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construção de ácido nucleico isolado
KR101416506B1 (ko) * 2012-08-10 2014-07-09 연세대학교 산학협력단 비생물학적 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 그의 용도
US20150267218A1 (en) 2012-08-27 2015-09-24 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides, polypeptides and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance, biomass and yield of plants
BR122020015325B1 (pt) 2012-12-25 2022-05-24 Evogene Ltd Métodos para aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, capacidade fotossintética e / ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, para produzir uma cultura, e, para selecionar uma planta transformada
BR122020005660B1 (pt) 2012-12-26 2022-03-22 Evogene Ltd Método para aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento de sementes, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construção de ácido nucleico
WO2014188428A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
EP3091077A3 (en) * 2013-08-21 2017-03-01 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Gene implicated in abiotic stress tolerance and growth accelerating and use thereof
MX361557B (es) 2013-08-27 2018-12-10 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipetidos aislados, y metodos para utilizarlos para mejorar el rendimiento y/o caracteristicas agricolas de la planta.
CA2948591A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides, polypeptides and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance, biomass and yield of plants
CA2958039A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Evogene Ltd. Constructs and methods for increasing plant yield or agricultural characteristics or both
US10766935B2 (en) 2015-12-28 2020-09-08 Evogene Ltd. Plant traits conferred by isolated polynucleotides and polypeptides
CN111233988B (zh) * 2018-11-29 2021-11-30 上海交通大学 茄子钾离子通道蛋白SmAKT1及其编码基因和应用
CN114574499A (zh) * 2020-11-30 2022-06-03 华中农业大学 OsREP3基因在控制水稻抗旱性中的应用

Family Cites Families (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) * 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
CA1192510A (en) 1981-05-27 1985-08-27 Lawrence E. Pelcher Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom
US5504200A (en) * 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
JPS6054684A (ja) 1983-09-05 1985-03-29 Teijin Ltd 新規ｄνａ及びハイブリツドｄνａ
US5011771A (en) * 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) * 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4946674A (en) * 1984-10-05 1990-08-07 Bioferon Biochemische Substanzen Gmbh & Co. Process for treatment of rheumatic diseases
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US5420034A (en) * 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) * 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
GB8608850D0 (en) 1986-04-11 1986-05-14 Diatech Ltd Packaging system
JPS6314693A (ja) 1986-07-04 1988-01-21 Sumitomo Chem Co Ltd 植物ウイルスｒｎａベクタ−
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) * 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
ES2060646T3 (es) 1987-02-09 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Virus rna hibrido.
US5316931A (en) * 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5495070A (en) * 1988-10-04 1996-02-27 Agracetus, Inc. Genetically engineering cotton plants for altered fiber
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US6329570B1 (en) 1989-07-19 2001-12-11 Calgene, Llc Cotton modification using ovary-tissue transcriptional factors
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5859330A (en) * 1989-12-12 1999-01-12 Epitope, Inc. Regulated expression of heterologous genes in plants and transgenic fruit with a modified ripening phenotype
EP0452269B1 (en) 1990-04-12 2002-10-09 Syngenta Participations AG Tissue-preferential promoters
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5187267A (en) 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
EP0600993B1 (en) 1991-08-27 1999-11-10 Novartis AG Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
JPH06511152A (ja) 1991-10-04 1994-12-15 ノースカロライナ　ステイト　ユニバーシティー 病原体耐性トランスジェニック植物
US5356816A (en) 1991-11-19 1994-10-18 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and compositions using polypeptides of arabidopsis thaliana
US5281521A (en) * 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
FR2697723B1 (fr) * 1992-11-06 1995-03-03 Ungda Utilisation des antibiotiques ionophores polyéthers dans les procédés industriels d'extraction ou de production de produits sucrés.
US5296462A (en) 1992-11-19 1994-03-22 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and compositions using polypeptides of arabidopsis thaliana
US5521708A (en) * 1992-11-25 1996-05-28 Canon Information & Systems, Inc. Correlated color temperature detector
ZA939767B (en) 1993-01-21 1994-09-14 Univ North Carolina State Nematode-resistant transgenic plants
AU7925094A (en) 1993-09-30 1995-04-18 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase
US5598515A (en) * 1994-01-10 1997-01-28 Gen Tech Corp. System and method for reconstructing surface elements of solid objects in a three-dimensional scene from a plurality of two dimensional images of the scene
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US7262055B2 (en) * 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US6310194B1 (en) * 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5961466A (en) 1995-01-03 1999-10-05 Omnicorder Technologies, Inc. Method of detection of cancerous lesions by their effect on the spatial distribution of modulation of temperature and homogeneity of tissue
US5659026A (en) * 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
CA2221747A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Kevin Mcbride Cotton fiber transcriptional factors
JPH0967270A (ja) * 1995-08-31 1997-03-11 Res Dev Corp Of Japan 水晶体混濁の予防および治療法、並びにそのための薬 剤
US6084153A (en) * 1996-02-14 2000-07-04 The Governors Of The University Of Alberta Plants having enhanced nitrogen assimilation/metabolism
JPH1094392A (ja) 1996-09-20 1998-04-14 Nisshinbo Ind Inc ワタ遺伝子
AU4722797A (en) 1996-10-24 1998-05-15 Japan Tobacco Inc. Method for controlling water content of plant
IL119831A (en) 1996-12-15 2002-12-01 Cognitens Ltd A device and method for three-dimensional reconstruction of the surface geometry of an object
CA2278796A1 (en) * 1997-01-21 1998-07-23 Monsanto Company Strawberry promoters and genes
AU9117598A (en) * 1997-08-27 1999-03-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding enzymes for lignin biosynthesis and uses thereof
US6201541B1 (en) * 1997-12-11 2001-03-13 Cognitens, Ltd. System and method for “Stitching” a plurality of reconstructions of three-dimensional surface features of object(s) in a scene defined relative to respective coordinate systems to relate them to a common coordinate system
US20090093620A1 (en) * 2000-09-05 2009-04-09 David Kovalic Annotated Plant Genes
WO2000008187A2 (en) * 1998-08-04 2000-02-17 Cropdesign N.V. Genes involved in tolerance to environmental stress
US6313375B1 (en) 1998-08-13 2001-11-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize aquaporins and uses thereof
US6313376B1 (en) 1998-08-14 2001-11-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize aquaporins and uses thereof
US7511190B2 (en) * 1999-11-17 2009-03-31 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
US6717034B2 (en) 2001-03-30 2004-04-06 Mendel Biotechnology, Inc. Method for modifying plant biomass
US20050086718A1 (en) 1999-03-23 2005-04-21 Mendel Biotechnology, Inc. Plant transcriptional regulators of abiotic stress
JP3178672B2 (ja) 1998-10-14 2001-06-25 農林水産省国際農林水産業研究センター所長 環境ストレス耐性植物
EP1033405A3 (en) 1999-02-25 2001-08-01 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US6392122B1 (en) * 1999-04-30 2002-05-21 Agritope, Inc. Apple promoters for expression of transgenes in plants
US20100293669A2 (en) * 1999-05-06 2010-11-18 Jingdong Liu Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US20030233670A1 (en) 2001-12-04 2003-12-18 Edgerton Michael D. Gene sequences and uses thereof in plants
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
US20110214206A1 (en) 1999-05-06 2011-09-01 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US8877916B2 (en) * 2000-04-26 2014-11-04 Ceres, Inc. Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
US6563022B2 (en) * 1999-07-05 2003-05-13 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Cotton plants with improved cotton fiber characteristics and method for producing cotton fibers from these cotton plants
US7151202B1 (en) 1999-07-19 2006-12-19 Japan Science And Technology Agency Environmental stress resistance gene
US6472588B1 (en) 1999-09-10 2002-10-29 Texas Tech University Transgenic cotton plants with altered fiber characteristics transformed with a sucrose phosphate synthase nucleic acid
US6359196B1 (en) * 1999-09-23 2002-03-19 Finn Lok Germination-specific plant promoters
US6403862B1 (en) * 1999-09-24 2002-06-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoter from maize
IT1313518B1 (it) * 1999-10-22 2002-07-24 Meta Instr S R L Metodi ed apparecchiatura per la misura della distribuzionetridimensionale delle temperature all'interno dei mezzi dielettrici.
US6407315B1 (en) 1999-11-02 2002-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoter from barley
US6828476B1 (en) 1999-12-02 2004-12-07 The Regents Of The University Of California Cotton transcription factors and their uses
GB2358752A (en) 2000-01-31 2001-08-01 Tricorder Technology Plc Surface or volumetric data processing method and apparatus
JP3807721B2 (ja) * 2000-02-21 2006-08-09 シャープ株式会社 画像合成装置
ES2295230T3 (es) 2000-04-07 2008-04-16 Basf Plant Science Gmbh Proteina fosfatasa relacionada con el estres y metodos de uso en las plantas.
US20110131679A2 (en) * 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US7834146B2 (en) 2000-05-08 2010-11-16 Monsanto Technology Llc Recombinant polypeptides associated with plants
US20040181830A1 (en) * 2001-05-07 2004-09-16 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US6701081B1 (en) * 2000-06-06 2004-03-02 Air Controls, Inc. Dual camera mount for stereo imaging
AU2001286811B2 (en) 2000-08-24 2007-03-01 Syngenta Participations Ag Stress-regulated genes of plants, transgenic plants containing same, and methods of use
TW519485B (en) * 2000-09-20 2003-02-01 Ind Tech Res Inst Infrared 3D scanning system
US20020170088A1 (en) 2000-11-03 2002-11-14 The Regents Of The University Of California Novel auxin binding proteins and uses thereof
JP2002164066A (ja) 2000-11-22 2002-06-07 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 積層型熱交換器
WO2003014347A2 (en) * 2000-12-01 2003-02-20 Michigan State University Plant seed specific promoters
BR0115782A (pt) 2000-12-08 2004-01-20 Commonwealh Scient And Ind Res Modificação de expressão de gene de sacarose sintase em tecido de planta e usos
US7214786B2 (en) * 2000-12-14 2007-05-08 Kovalic David K Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US6801257B2 (en) 2001-01-12 2004-10-05 Cognitens Ltd. Optical three-dimensional digital imaging and mensuration system for industrial applications
KR100350216B1 (ko) 2001-02-02 2002-08-28 (주)제노마인 삼투 스트레스 신호 전달 경로에서 억제 조절 작용을 하는 삼투 스트레스에 의해 유도되는 단백질
ATE540575T1 (de) * 2001-03-16 2012-01-15 Basf Plant Science Gmbh Regulatoren des zucker- und lipidstoffwechsels in pflanzen
JP4739569B2 (ja) * 2001-04-09 2011-08-03 パナソニック株式会社 運転支援装置
WO2002082988A2 (en) 2001-04-16 2002-10-24 The Johns Hopkins University Method for imaging and spectroscopy of tumors and determination of the efficacy of anti-tumor drug therapies
WO2002090557A2 (en) 2001-05-03 2002-11-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Freeze-tolerant eukaryotic cells
WO2002101079A2 (en) 2001-06-12 2002-12-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Anti-apoptosis genes and methods of use thereof
AU2002332795A1 (en) 2001-08-31 2003-03-18 The Dow Chemical Company Nucleic acid compositions conferring insect control in plants
US7038111B2 (en) * 2001-09-06 2006-05-02 The Arizona Board Of Regents Method for increasing stress tolerance in plants
DE10150918C2 (de) 2001-10-18 2003-10-09 Inframedic Ag Verfahren zur Auswertung von Wärmebildern einer weiblichen oder männlichen Brust
US20050108791A1 (en) * 2001-12-04 2005-05-19 Edgerton Michael D. Transgenic plants with improved phenotypes
MXPA04009778A (es) 2002-04-08 2004-12-13 Pionner Hi Bred International Exsercion de fibra sedosa mejorada bajo estres.
EP1506289B1 (de) * 2002-05-08 2012-08-08 BASF Plant Science GmbH Verfahren zum erhöhen des ölgehaltes in pflanzen
US20030221218A1 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 The Regents Of The University Of California Bioengineering cotton fiber properties
JP2005185101A (ja) * 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用
WO2004007727A1 (en) * 2002-07-10 2004-01-22 Basf Plant Science Gmbh Use of a gene for increasing the oil content in plants
EP1551983A2 (en) 2002-10-18 2005-07-13 CropDesign N.V. Identification of e2f target genes and uses thereof
AU2002351325A1 (en) 2002-12-04 2004-06-30 G. Banu Transgenic maize with enhanced phenotype
AU2003288710A1 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Department Of Biotechnology A novel gene osisap1 of rice confers tolerance to stresses and a method thereof
US7695968B2 (en) 2003-03-12 2010-04-13 Evogene Ltd. Nucleotide sequences regulating gene expression and constructs and methods utilizing same
CN1836045B (zh) 2003-03-28 2012-05-09 孟山都技术有限公司 用于早期种子发育的新型植物启动子
EP2361977A1 (en) * 2003-04-15 2011-08-31 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response, and transgenic plant cells transformed with the same
DE602004013569D1 (de) 2003-04-16 2008-06-19 Basf Plant Science Gmbh N pflanzen
BRPI0411182B1 (pt) 2003-05-22 2019-08-20 Evogene Ltd. Método para aumentar a tolerância de uma planta ao estresse salino e construto deácido nucleico
AU2005234725B2 (en) 2003-05-22 2012-02-23 Evogene Ltd. Methods of Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass in Plants and Plants Generated Thereby
US7554007B2 (en) 2003-05-22 2009-06-30 Evogene Ltd. Methods of increasing abiotic stress tolerance and/or biomass in plants
EP1636333A4 (en) 2003-06-19 2007-10-24 Evogene Ltd NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR REGULATING GENE EXPRESSION IN VEGETABLE TRICHROMES, AND HYBRID GENES AND METHODS IN WHICH THEY INTERVENE
JP4452876B2 (ja) 2003-08-06 2010-04-21 国立大学法人 香川大学 ＬＫＰ２部分ｃＤＮＡを用いた遺伝子導入による植物体の種子収量、乾燥重量の制御
US7803983B2 (en) * 2004-06-30 2010-09-28 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant growth rate and biomass in plants
US7884261B2 (en) * 2004-06-30 2011-02-08 CERES,Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant growth rate and biomass in plants
US20050054931A1 (en) 2003-09-09 2005-03-10 Clark David W. Tracking clutter filter for spectral & audio doppler
US20060143729A1 (en) * 2004-06-30 2006-06-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for modifying plant characteristics
US7569389B2 (en) 2004-09-30 2009-08-04 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for modifying plant characteristics
US20060048240A1 (en) * 2004-04-01 2006-03-02 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US7989676B2 (en) * 2006-08-31 2011-08-02 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
US20060150283A1 (en) * 2004-02-13 2006-07-06 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US20060107345A1 (en) * 2003-09-30 2006-05-18 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US20050096515A1 (en) * 2003-10-23 2005-05-05 Geng Z. J. Three-dimensional surface image guided adaptive therapy system
WO2005060664A2 (en) 2003-12-10 2005-07-07 Monsanto Technology Llc Stress tolerant plants and methods thereof
WO2005084331A2 (en) 2004-03-01 2005-09-15 Syngenta Participations Ag Sorghum gene expression profiling
AU2005229157B2 (en) 2004-03-31 2011-07-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genes involved in plant fibre development
US8049069B2 (en) 2004-03-31 2011-11-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genes involved in plant fibre development
BRPI0510082A (pt) * 2004-04-23 2007-10-16 Ceres Inc seqüências de nucleotìdeo e polipeptìdeos codificados por elas úteis para modificar as caracterìsticas de eficiência de uso de nitrogênio em plantas
EP1742653A2 (en) 2004-05-05 2007-01-17 The Royal Veterinary and Agricultural University Ammonium/ammonia transporter
CA2570195C (en) 2004-06-14 2017-10-24 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides involved in plant fiber development and methods of using same
JP2008505684A (ja) 2004-07-07 2008-02-28 リアル イメージング リミテッド ３ｄサーマル乳癌検出
US7563942B2 (en) 2004-10-22 2009-07-21 Agrinomics Llc Generation of plants with altered oil content
WO2006076099A2 (en) * 2004-12-08 2006-07-20 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant size and biomass in plants
WO2008069878A2 (en) 2006-10-27 2008-06-12 Ceres, Inc. Modulating lignin in plants
US20080148432A1 (en) * 2005-12-21 2008-06-19 Mark Scott Abad Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US8895818B2 (en) * 2004-12-21 2014-11-25 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
EP1681128A1 (de) * 2005-01-14 2006-07-19 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung eines Lochs und Vorrichtung
WO2006138005A2 (en) * 2005-05-10 2006-12-28 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement
EP1885175A2 (en) 2005-05-26 2008-02-13 Monsanto Technology, LLC Elevation of oil in monocot plants
WO2006138012A1 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Ceres Inc. P450 substrates and methods related thereto
EP1928227A4 (en) 2005-08-30 2009-05-20 Monsanto Technology Llc TRANSGENIC PLANTS WITH IMPROVED AGRONOMIC CHARACTERISTICS
AU2006307457B2 (en) 2005-10-24 2012-03-22 Evogene Ltd. Isolated polypeptides, polynucleotides encoding same, transgenic plants expressing same and methods of using same
CA2637058A1 (en) * 2006-01-13 2007-07-26 Ceres Inc NUCLEOTIDE SEQUENCES AND CORRESPONDING POLYPEPTIDES IMPROVING THE EFFICACY FEATURES OF PLANTS IN NITROGEN EXPLOITATION
EP2221382A3 (en) 2006-03-24 2010-12-01 BASF Plant Science GmbH Proteins associated with abiotic stress response and homologs
EP2199398A1 (en) 2006-03-31 2010-06-23 BASF Plant Science GmbH Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
AU2007335706B2 (en) * 2006-12-20 2013-03-28 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides involved in plant fiber development and methods of using same
BRPI0809796B1 (pt) 2007-04-09 2021-09-08 Evogene Ltd Métodos para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, e para produzir óleo
EP2573178A3 (en) 2007-07-10 2013-07-24 Monsanto Technology LLC Transgenic plants with enhanced agronomic traits
ES2685631T3 (es) 2007-07-24 2018-10-10 Evogene Ltd. Polinucleótidos, polipéptidos codificados por los mismos, y métodos de uso de los mismos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o biomasa y/o rendimiento en plantas que los expresan
US8362325B2 (en) * 2007-10-03 2013-01-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
WO2009083958A2 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Evogene Ltd. Isolated polypeptides, polynucleotides useful for modifying water user efficiency, fertilizer use efficiency, biotic/abiotic stress tolerance, yield and biomass in plants
TR201808744T4 (tr) 2008-05-22 2018-07-23 Evogene Ltd İzole polinükleotidler ve polipeptidlerle bunların bitki yararını artırmaya yönelik kullanımına ilişkin yöntemler.
CA2725882A1 (en) 2008-05-29 2009-12-03 Vib Vzw Minichromosome maintenance complex interacting protein involved in cancer
BR122021014158B1 (pt) 2008-08-18 2022-08-16 Evogene Ltd. Método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, e/ou tolerância à deficiência de nitrogênio de uma planta
AR074071A1 (es) 2008-10-30 2010-12-22 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados y metodos para utilizarlos para aumentar el rendimiento de la planta, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, tolerancia al estres abiotico de las plantas y eficacia en el uso de nitrogeno
AR074925A1 (es) 2008-12-29 2011-02-23 Evogene Ltd Polinucleotidos, polipeptidos codificados, y metodos para utilizarlos para modular la tolerancia al estres abiotico, biomasa y/o rendimiento en plantas que los expresan
SI3460062T1 (sl) 2009-03-02 2021-09-30 Evogene Ltd. Izolirani polinukleotidi in polipeptidi in postopki uporabe le-teh za zvišanje donosa in/ali poljedelskih značilnosti rastlin
CA3095630A1 (en) 2009-06-10 2010-12-16 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
MX352610B (es) 2009-08-04 2017-11-30 Evogene Ltd Polinucleótidos y polipéptidos aislados, y métodos para utilizarlos para mejorar la tolerancia al estrés abiótico, rendimiento,tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite y/o eficacia en el uso de nitrógeno de las plantas.
US20110080674A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-07 Joel Durand Magnetic azimuth adjustment for tonearm
WO2011080674A2 (en) 2009-12-28 2011-07-07 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
US9328353B2 (en) 2010-04-28 2016-05-03 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
AR082530A1 (es) * 2010-08-30 2012-12-12 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados, y metodos para utilizarlos para aumentar la eficacia en el uso de nitrogeno, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite y/o tolerancia al estres abiotico
MX344728B (es) 2010-12-22 2017-01-05 Evogene Ltd Polinucleótidos y polipéptidos aislados, y métodos para utilizarlos para aumentar la tolerancia al estrés abiótico, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite y/o eficacia en el uso de nitrógeno de las plantas.
BR122020018202B1 (pt) 2011-05-03 2022-02-08 Evogene Ltd Método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta
AR087952A1 (es) 2011-08-23 2014-04-30 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados y metodos de utilizacion de los mismos para aumentar el rendimiento y/o las caracteristicas agricolas de plantas
RU2014125127A (ru) 2011-11-21 2015-12-27 Зингента Партисипейшнс Аг Композиции и способы для повышения устойчивости к нематодам у растений
WO2013080203A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
BR112014016080A2 (pt) 2011-12-28 2020-06-30 Evogene Ltd., polínucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar à produção das plantas
AR091312A1 (es) 2012-02-29 2015-01-28 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados y metodos para utilizarlos para mejorar el rendimiento de la planta, biomasa, tasa de crecimiento, vigor, contenido de aceite, tolerancia al estres abiotico de las plantas y eficacia en el uso de nitrogeno
BR122021002081B1 (pt) 2012-05-28 2022-07-26 Evogene Ltd Método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, teor de óleo, produção de sementes, produção de fibra, qualidade da fibra, eficiência no uso de nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construção de ácido nucleico isolado
US20150267218A1 (en) 2012-08-27 2015-09-24 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides, polypeptides and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance, biomass and yield of plants
BR122020015325B1 (pt) 2012-12-25 2022-05-24 Evogene Ltd Métodos para aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, capacidade fotossintética e / ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, para produzir uma cultura, e, para selecionar uma planta transformada
BR122020005660B1 (pt) 2012-12-26 2022-03-22 Evogene Ltd Método para aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento de sementes, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construção de ácido nucleico
WO2014188428A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
MX361557B (es) 2013-08-27 2018-12-10 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipetidos aislados, y metodos para utilizarlos para mejorar el rendimiento y/o caracteristicas agricolas de la planta.
CA2948591A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides, polypeptides and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance, biomass and yield of plants
CA2958039A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Evogene Ltd. Constructs and methods for increasing plant yield or agricultural characteristics or both
US10766935B2 (en) 2015-12-28 2020-09-08 Evogene Ltd. Plant traits conferred by isolated polynucleotides and polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
EP2183371B1 (en) 2015-07-01
US20170009251A1 (en) 2017-01-12
CN102037127A (zh) 2011-04-27
US10961544B2 (en) 2021-03-30
ZA201001205B (en) 2011-05-25
EP2910638B1 (en) 2018-05-30
WO2009013750A2 (en) 2009-01-29
US10995341B2 (en) 2021-05-04
AU2008278654B2 (en) 2014-06-05
WO2009013750A3 (en) 2010-03-04
US20140068819A1 (en) 2014-03-06
BRPI0812742B1 (pt) 2021-04-20
BR122020022199B1 (pt) 2021-08-10
BRPI0812742A2 (pt) 2014-10-07
EP2183371A4 (en) 2010-09-01
AU2008278654A1 (en) 2009-01-29
US9518267B2 (en) 2016-12-13
CA3019282C (en) 2021-11-23
ES2685631T3 (es) 2018-10-10
CA3019282A1 (en) 2009-01-29
CA3133548A1 (en) 2009-01-29
US20100319088A1 (en) 2010-12-16
US8686227B2 (en) 2014-04-01
US10155957B2 (en) 2018-12-18
BR122020022203B1 (pt) 2021-04-20
CA2694481A1 (en) 2009-01-29
EP2910638A2 (en) 2015-08-26
CA2694481C (en) 2018-11-13
EP2183371A2 (en) 2010-05-12
US20190100767A1 (en) 2019-04-04
EP2910638A3 (en) 2015-10-14
US20210171974A1 (en) 2021-06-10
US20190032075A1 (en) 2019-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210171974A1 (en) Polynucleotides, polypeptides encoded thereby, and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance and/or biomass and/or yield in plants expressing same
ES2773985T3 (es) Polinucleótidos y polipéptidos aislados, y métodos para usar los mismos para incrementar la eficiencia en el uso de nitrógeno, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite, y/o tolerancia al estrés abiótico
BRPI0912898A2 (pt) Polinucleotídeos e polipeptídeos isolados úteis para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, produção e biomassa em plantas
BRPI0914522B1 (pt) Método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, oteor de óleo, e/ou a eficiência da utilização do nitrogênio de uma planta
BR122019017037B1 (pt) Método de aumento de eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor e/ou tolerância ao estresse à deficiência de nitrogênio de uma planta
BR112012002543B1 (pt) método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, e/ou vigor de uma planta, e, construto de ácido nucléico isolado
BR122021002366B1 (pt) Método de aumento de produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor e/ou eficiência de uso de nitrogênio de uma planta
AU2017228711B2 (en) Polynucleotides, Polypeptides Encoded Thereby, and Methods of Using Same for Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass and/or Yield in Plants Expressing Same
AU2014215945B2 (en) Polynucleotides, Polypeptides Encoded Thereby, and Methods of Using Same for Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass and/or Yield in Plants Expressing Same