KR100350216B1

KR100350216B1 - 삼투 스트레스 신호 전달 경로에서 억제 조절 작용을 하는 삼투 스트레스에 의해 유도되는 단백질

Info

Publication number: KR100350216B1
Application number: KR1020010005097A
Authority: KR
Inventors: 황인환; 임정화; 피경태
Original assignee: (주)제노마인
Priority date: 2001-02-02
Filing date: 2001-02-02
Publication date: 2002-08-28
Also published as: WO2002074801A1; KR20010035308A; US20050054831A1

Abstract

본 발명은 삼투 스트레스 유도 유전자에 대해 억제 조절 작용을 하는 단백질인 AtSIK에 관한 것이며, 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터 분리된 상기 AtSIK는 삼투 스트레스에 의해 유도되며 삼투 스트레스에 대한 저항성에 관여하는 유전자를 억제 조절하는 역할을 수행하므로,AtSIK유전자의 활성이 억제된 형질전환 식물을 생산하여 삼투 스트레스 저항성을 증진시킴으로써, 이를 통해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있다.

Description

삼투 스트레스 신호 전달 경로에서 억제 조절 작용을 하는 삼투 스트레스에 의해 유도되는 단백질{Osmotic stress-inducible kinase functioning as a negative regulator in osmotic stress signaling pathway in plants}

본 발명은 삼투 스트레스 유도 유전자에 대해 억제 조절 작용을 하는 단백질인 AtSIK에 관한 것이며, 상기 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 억제시킴으로써 식물의 삼투 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

삼투 스트레스는 탈수, 고염도 및 저온과 같은 외부 환경에 의해 유발되며,식물의 성장을 저해하는 환경 스트레스에 있어서 가장 가혹한 스트레스 중 하나이다. 최근에는 이러한 삼투 스트레스에 대한 식물의 반응 기작을 분자생물학적인 관점에서 연구하려는 노력이 진행되어 왔으며 (Bohnertet al.,Plant Cell7:1099-1111 1995; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki,Curr. Opin. Plant Biol. 3:17-223, 2000), 삼투 스트레스에 관여하는 다수의 유전자들이 분리되었고, 또한 이들의 특성이 연구되었다 (Skriver and Mundy,Plant Cell2:503-512, 1990; Pihet al., Mol Cells 9:84-90, 1998; Anderberg and Walker-Simmons,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:10183-10187, 1993; Mizoguchiet al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 93:765-769, 1996). 이러한 연구를 통하여 삼투 스트레스 반응 유전자들의 발현을 유도하는 다양한 신호 전달 경로가 존재하며 (Jonaket al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 93:11274-11279, 1996; Ishitani.,Plant Cell9:1935-1949, 1997), 이러한 신호 전달 경로는 ABA-의존성 경로 또는 ABA-비의존성 경로를 포함하고 있음이 밝혀졌다 (LaRosaet al.,Plant Physiol. 85:174-181, 1987; Savoureet al.,Mol. Gen. Genet. 254: 104-109, 1997). 또한, 어떤 신호 전달 경로는 모든 삼투 스트레스 조건에서 공통으로 작용하는 반면, 어떤 신호 전달 경로는 저온, 고염도 및 탈수와 같은 특정한 삼투 스트레스 조건에서 작용한다는 것이 밝혀졌다 (Janget al.,Plant Mol. Biol. 37:839-847, 1998; Liuet al.,Science280:1943-1945, 1998; Pardoet al.,Proc. Acad. Natl. Sci. USA 95:9681-9686, 1998; Liuet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3730-3734, 2000).

다양한 종류의 삼투 스트레스 유도 유전자 중에서, 많은 수가 단백질 인산화효소 (protein kinase)를 암호화하는 유전자이며 (Anderberg and Walker-Simmons,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:10183-10187, 1993; Uraoet al.,Plant Cell11:1743-1754, 1994; Hwang and Goodman,Plant J. 8:37-43, 1995; Mizoguchiet al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 93:765-769, 1996; Munniket al.,Plant J. 20:381-388, 1999), 이들이 삼투 스트레스 신호 전달 경로에서 중요한 역할을 함이 밝혀졌다.

따라서, 삼투 스트레스 신호 전달 경로에 대한 기작을 이해하기 위해서는 이러한 유전자들의 분자생물학적 수준에서의 연구가 요구되나, 현재까지 제한된 수의 인산화효소만이 삼투 스트레스 신호 전달 경로에 관여한다고 알려져 있다. MAP 인산화효소 캐스케이드 (kinase cascade)는 동물과 효모 세포에서 삼투 스트레스 반응에 관여하는 중요한 신호 전달 경로이며 (Blumeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4925-4929, 1994; Bodeet al.,J. Biol. Chem.274:30222-30227, 1999; Maedaet al.,Nature369:242-245, 1995; Posaset al.,Cell86:865-875, 1996), 이러한 경로에 관여하는 인산화효소의 유사체가 애기장대 (Mizoguchiet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:765-769, 1996; Covicet al.,Biochem. Biophys. Acta1451:242-254, 1999), 완두콩 (Poppinget al.,Plant Mol. Biol. 31:355-363, 1996) 및 자주개자리 (Jonaket al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11274-11279, 1996)와 같은 식물로부터 분리되었다.

또한, 이러한 MAP 인산화효소 유사체는 저온, 탈수 및 고농도 염과 같은 삼투 스트레스 조건하에서 빠르게 활성화 될 뿐만 아니라, 생체외 실험시 외부로부터주입된 ABA (absicic acid)에 의해서도 활성화된다 (Foster and Chua,Plant J. 17:363-372, 1999; Droillardet al.,FEBS Lett. 474:217-222, 2000; Mikolajczyket al.,Plant Cell12:165-178, 2000).

인산화효소 2C 형은 자주개자리 식물로부터 분리된 MAP 인산화효소 체계의 억제 조절제로 알려져 있으며 (Meskieneet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1938-1943, 1998), 효모의 삼투 인지 히스티딘 인산화효소인 Sln1p와 유사한 단백질인 ATHK1 단백질이 애기장대로부터 분리되었다 (Uraoet al.,Plant Cell11:1743-1754, 1999). 이들은 효모 세포에서와 마찬가지로, 식물에서의 삼투 스트레스 신호를 개시하는 역할을 담당하고 있음이 밝혀졌다.

SOS2유전자는 염 내성에 요구되는 인산화효소를 암호화하며 (Liuet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3730-3734 2000), 애기장대에서 분리된 AtGSK1은 동물에서 분리된 GSK3/shaggy 인산화효소와 높은 유사성을 보이며, 염 스트레스 반응에 관여함이 밝혀졌다 (Piaoet al.,Plant Physiol. 119:1527-1534 1999).

그러나, 아직까지 식물의 삼투 스트레스 유도와 관련된 신호 전달 경로에 관련된 유전자의 종류와 이들의 정확한 기작에 대해서 명확히 밝혀진 바가 없다.

본 발명에서는 식물체에 대한 환경 스트레스, 그 중에서도 특히 삼투 스트레스에 대한 저항성과 관련된 유전자를 탐색하기 위한 연구를 수행한 결과, 애기장대로부터 분리한 AtSIK가 인산화효소 도메인을 가지며, 스트레스 반응 유전자들의 활성을 억제하는 기능을 갖고 있고, 이들의 비활성화에 의해 식물체의 삼투 스트레스에 대한 저항성이 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 각종 삼투 스트레스에 대해 저항성을 나타내는 유전자들의 억제 조절자 역할을 하는 새로운 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 삼투 스트레스 저항 유전자의 억제 조절자를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 목적은 상기 유전자를 비활성화하여 식물체의 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 AtSIK의 아미노산 서열을 다른 단백질 인산화효소와 비교하여 나타낸 것이고,

도 2는 애기장대의 꽃 (Flower), 잎 (Leaf), 뿌리 (Root), 장각 (Silique)조직에서의AtSIK유전자 발현 양상을 노던 블럿 (Northern Blot)으로 분석한 결과이고,

도 3은 다양한 삼투 스트레스 유도에 의한AtSIK유전자의 발현양상을 노던 블럿으로 분석한 결과 (숫자는 각각의 삼투 스트레스 처리 시간을 의미)이고,

도 4는AtSIK유전자 내부에 T-DNA가 삽입된 변이체를 PCR 선별 (PCR screening) 및 서던 블럿 (Southern Blot)으로 선별한 뒤, PCR 산물을 염기서열 분석하여 T-DNA의 삽입 위치를 확인한 것이고,

A: 첫번째, 두번째 및 세번째 PCR 선별 산물을 아가로즈 겔상에서 전기영동한 결과

B: T-DNA 삽입 변이체에서 T-DNA의 삽입 위치를 나타낸 것

도 5는 T-DNA 삽입 변이체의 표현 형질을 조사한 것으로,

A: 야생형과 T-DNA 삽입 변이체의 유전체 DNA를BamHI,EcoRI,HindIII 및XhoI 처리한 후 서던 블럿을 수행한 것

B: 야생형과 T-DNA 삽입 변이체에 탈수, 저온, 고농도 염을 처리하고AtSIK유전자의 발현을 노던 블럿으로 확인한 것

도 6은 야생형과 T-DNA 삽입 변이체에 탈수, 저온 및 고농도 염을 처리한 후 식물의 표현형질의 변화를 조사한 결과이고,

A: 야생형과 T-DNA 삽입 변이체를 탈수처리한 것

B: 야생형과 T-DNA 삽입 변이체를 150mM의 NaCl로 처리한 것

C: 야생형과 T-DNA 삽입 변이체를 4℃저온으로 처리한 것

D: 야생형과 T-DNA 삽입 변이체를 삼투 스트레스 처리 한 후 잎의 크기를 비교한 것

도 7은 야생형과 T-DNA 삽입 변이체의 잎을 저온 스트레스로 처리한 후 미세절단하고 전자 현미경으로 단면을 관찰한 결과이고,

A: 야생형 잎을 미세 절단하고 전자현미경으로 단면을 관찰한 것

B: T-DNA 삽입 변이체의 잎을 미세 절단하고 전자현미경으로 단면을 관찰한 것

C: 4℃저온처리 후 미세 절단한 야생형 잎을 전자현미경으로 단면을 관찰한 것

D: 4℃저온처리 후 미세 절단한 T-DNA 삽입 변이체 잎을 전자현미경으로 단면을 관찰한 것

도 8은 야생형과 T-DNA 삽입 변이체에서 삼투 스트레스에 의해 유도되는 다른 유전자Cor15a, Cor47, RD29A및AtSIZ의 발현양상을 노던 블럿으로 분석한 결과이고,

A: 야생형과 T-DNA 삽입 변이체를 4℃ 저온 처리 한 후 유도되는 유전자의 발현을 확인한 것

B: 야생형과 T-DNA 삽입 변이체 및 T-DNA 삽입 변이체/AtSIK를 150mM NaCl로 처리한 후 유전자의 발현을 확인한 것

도 9는 야생형 및AtSIK유전자 과발현 형질전환체에서AtSIK의 발현여부를 노던 블럿으로 분석하고 (A), 이들 식물체에 각각 0, 0.1, 0.15, 0.2mM의 NaCl을 처리하고 민감성을 조사한 결과 (B)이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은서열번호 2로 기재되는 삼투 스트레스 저항 유전자의 억제 조절자인, AtSIK를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 삼투 스트레스 억제 조절자 AtSIK를 암호화하는서열번호 1로 기재되는AtSIK유전자를 제공한다.

상기AtSIK유전자에 변이가 생긴 경우 식물체는 삼투 스트레스에 저항성을 보인다. 반면에AtSIK유전자에 변이가 없는 야생형 식물의 경우 식물체는 삼투 스트레스에 민감성을 나타내어 잎에 안토시아닌 (anthocyanin)이 축적되고, 잎의 가장자리에 손상이 나타나며, 잎의 크기가 작아지고 황화 현상이 나타난다.

따라서, 본 발명은 상기AtSIK유전자를 비활성화시킨 형질전환체를 제조하여 식물체의 삼투 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공하며, 상기 방법을 통해식물체의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다.

본 발명에서 '삼투 스트레스 유도 유전자' 또는 '삼투 스트레스 반응 유전자'라 함은 식물체에 가해지는 고농도의 염, 저온, 탈수, 외부 ABA 처리 등에 의해 야기되는 삼투 스트레스에 의해 식물체로부터 유전자 발현이 유도되며, 삼투 스트레스에 대한 내성 또는 저항성을 나타내는데 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자를 말한다.

또한, 'AtSIK보완체'라 함은 활성AtSIK유전자를 포함하고 변이체에서 AtSIK 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터를 의미하며, '변이체/AtSIK'는 상기AtSIK보완체로 형질 전환된 변이 식물체를 의미한다.

본 발명의 기재에 있어, 단백질 AtSIK를 암호화하는 유전자는 이탤릭체를 이용하여 'AtSIK유전자' 또는 'AtSIK'로 나타내었으며, 이에 의해 암호화되는 단백질은 'AtSIK단백질' 또는 'AtSIK'로 나타내었다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 삼투 스트레스에 의해 발현되는 새로운 유전자를 탐색하기 위해, 고농도의 염 스트레스에 의해 유도된 cDNA 라이브러리와 스트레스를 처리하지 않은 상태에서 항상적으로 발현되는 대조군 cDNA 라이브러리로부터 각각 단일 가닥 DNA를 분리하여 이들을 혼성화함으로써 항상적으로 발현되는 cDNA를 제거한 감산 라이브러리 (subtraction library)를 제작하였다.

구체적으로 항상적으로 발현되는 cDNA의 제거는 대조군 cDNA 라이브러리에서얻은 단일 가닥 DNA를 바이오틴 (biotin)으로 표지하고, 염 스트레스에 의해 유도된 cDNA 라이브러리의 단일 가닥 DNA와 혼성화시킨 다음, 바이오틴이 스트렙타비딘 (streptavidin)과 결합하는 성질을 이용하여 스트렙타비딘으로 코팅된 막으로 혼성화된 DNA를 제거함으로써 수행하였다. 이러한 과정을 거쳐 남아 있는 단일 가닥 DNA는 고농도의 염 스트레스에 의해 특이적으로 발현되는 유전자에 해당하는 것으로, 이들에 대한 염기 서열을 분석하였다. 그 결과, 삼투 스트레스에 의해 발현이 유도되는 클론들을 찾아내었고, 이들 중 새로운 클론 OS195을 탐침으로 하여 애기장대의 cDNA 라이브러리로부터 약 61kDa의 분자량을 갖는 557개의 아미노산을 암호화하는 전사해독틀 (open reading frame)을 갖고 2090bp의 크기를 갖는 전장 cDNA를 분리하였고, 이를AtSIK(Arabidopsis thalianaStress-Inducible kinase)로 명명하였다.

상기AtSIK유전자의 염기서열은서열번호 1에 나타나 있으며, 이로부터 추정되는 AtSIK 단백질의 아미노산 서열은서열번호 2에 나타나 있다.

상기 AtSIK 단백질의 키나아제 도메인 (kinase domain)은 275개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, ARSK1 (Hwang and Goodman,Plant J. 8:37-43 1995), NAK (Moran and Walker,Biochem. Biophys. Acta. 1216:9-14 1993)와 같은 다른 인산화효소와 높은 아미노산 서열 유사성을 보인다. 그러나, 183개의 아미노산으로 이루어진 C-말단과 104개의 아미노산으로 이루어진 N-말단부위는 다른 인산화효소와 유사성이 없었다 (도 1 참조). 이는 C-말단과 N-말단 부위가 AtSIK 특이 기능을 수행하는데 관여한다는 것을 보여준다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 AtSIK 단백질의 생물학적인 기능을 조사하기 위하여 애기장대의 꽃, 잎, 뿌리 및 장각으로부터 전체 RNA를 분리하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 그 결과, 꽃에서 가장 높은AtSIK발현 양상을 보였으며, 뿌리와 잎 순서로 발현 양상을 보였으나 장각에서는 거의 발현되지 않았다 (도 2 참조). 이는 조직별로AtSIK의 발현이 조절됨을 보여주는 것이다. 또한,AtSIK는 삼투 스트레스에 의해 유도된 클론들로부터 분리된 유전자이므로 다양한 삼투 스트레스 조건하에서의 유전자 발현 양상을 조사하기 위하여 ABA, 저온, 탈수 및 고농도의 염을 각각 처리한 후AtSIK의 발현 정도를 노던 블럿으로 분석하였다. 그 결과, 상기의 모든 삼투 스트레스 조건하에서AtSIK의 발현이 유도되었으며, 특히 고농도의 염을 처리하였을때, 30분 내의 빠른 유도 양상을 보였고, ABA와 탈수 처리시 60분 후, 저온 처리시 6시간 후 각각 최대 발현 양상을 보였다. 이는AtSIK가 삼투 스트레스 신호 전달 경로에 관여하며,AtSIK의 발현이 특정한 스트레스 조건에 따라 다양한 수준으로 조절받는다는 것을 보여주는 것이다 (도 3 참조).

한편, 본 발명의 또 다른 실시예에서는, AtSIK 단백질의 삼투 스트레스에 대한 생물학적인 역할을 조사하기 위한 수단으로 아그로박테리움의 T-DNA를 애기장대의AtSIK유전자에 삽입하여 이 유전자를 비활성화시켰다. 일반적으로 유전자를 비활성화시키는 방법에는 유전자 제거 (deletion), 유전자 삽입 (insertion), antisense 도입, T-DNA 삽입, 동종 재조합 (homologous recombination) 및 트랜스포전 태깅 (transposon tagging) 등의 방법이 있으며, 본 발명의 목적을 위해 이용될 수 있다. 본 실시예에서는 T-DNA 삽입 후 PCR 스크리닝 방법 (Screeningmethod)을 통하여 T-DNA가 삽입되어AtSIK유전자가 비활성화된 변이체인 CD380-2를 선별하였다. 구체적으로는AtSIK유전자의 3' 및 5' 말단에 특이적인 두 종류의 프라이머와 T-DNA 삽입체의 오른쪽 경계 (RB) 및 왼쪽 경계 (LB)에 특이적인 프라이머의 조합과, T-DNA 삽입체를 가지고 있는 형질전환 집단으로부터 획득한 게놈 DNA (ABRC, USA) 주형을 이용하여 실시하였다. 상기 PCR 산물은³²P로 표지된AtSIKcDNA를 혼성화 탐침으로 사용하여 서던 블럿으로 분석하였다 (도 4a 참조). 또한, 이 변이체의 T-DNA의 삽입 여부를 확인하기 위하여 PCR산물에 대해 염기서열을 조사한 결과, T-DNA가AtSIKcDNA의 1,582번째 염기서열상에 삽입되어 있음을 확인하였고 (도 4b 참조), 야생형과 돌연변이체의 유전체 DNA를 분리하고 제한효소 처리하여 서던 블럿을 수행한 결과 역시AtSIK유전자 상에 T-DNA가 삽입되어 있음을 확인하였다 (도 5a 참조). 야생형과 변이체에 각각 저온, 탈수, 고염도를 처리한 후AtSIK의 발현 양상을 노던 블럿으로 분석한 결과 야생형에서만AtSIK가 유도되었으며 변이체에서는AtSIK의 발현이 유도되지 않았다(도 5b 참조). 이로써 역시AtSIK유전자상에 T-DNA가 삽입되어 변이가 일어났음을 확인할 수 있었다.

T-DNA의 삽입으로 변이가 일어난 식물체에서 AtSIK의 생리학적인 역할을 조사하기 위하여, 변이체에 다양한 삼투 스트레스를 처리하고 식물의 표현형 변화를 조사하였다. 그 결과, 변이체가 탈수, 고농도염을 처리하였을때 야생형 식물체에 비해 잎의 손상 정도가 약하고 황화 현상의 정도도 약해 변이체 식물이 삼투 스트레스에 저항성을 가지고 있으며 (도 6a, 6b 참조), 저온처리에 의한 스트레스에도저항성을 가지고 있음을 알 수 있었다 (도 6c 참조). 또한, 삼투 스트레스 처리 후 잎의 크기는 야생형에 비해 변이체가 50%이상임을 확인할 수 있었다 (도 6d 참조). 이러한 결과들은AtSIK유전자에 변이가 일어난 변이체 식물이 야생형 식물에 비해 삼투 스트레스에 저항성을 가짐을 보여주는 것으로,AtSIK유전자가 삼투 스트레스에 대한 민감성에 관여함을 나타내는 것이다. 한편, 애기장대의 잎에 4℃ 저온 처리하고 미세절단하여 전자 현미경하에서 확인한 결과, 야생형 식물에서 틸라코이드 막의 손실이 큼을 확인할 수 있어 (도 7 참조), 변이체 식물이 삼투 스트레스에 보다 저항성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

상기와 같이 변이체/AtSIK식물이 삼투 스트레스에 저항성을 갖고 있음을 확인하였고, 이를 분자생물학적 수준에서 연구하기 위하여, 다양한 삼투 스트레스를 처리한 후에 삼투 스트레스 유도 유전자의 발현 양상을 조사하였다. 대상이 되는 삼투 스트레스 반응 유전자로는 외부 ABA 처리뿐만 아니라 다양한 형태의 삼투 스트레스에 의해 발현이 유도되는Cor15a, Cor47, AtSIZ및RD29A의 발현에 초점을 맞추었다.

Cor15a는 추위 순응을 겪는 식물체에서 발현되는Cor(cold-regulated) 유전자 중의 하나인데 이들 유전자의 산물은 냉동 (freezing) 내성에 관여할 것이라 생각되어 왔으며 (Artuset al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 93(23):13404-13409, 1996), 최근 보고에 의하면Cor15a의 항시 발현은 추위에서 애기장대가 생존할 확률을 높이는 것으로 알려져 있다. 온도가 내려가면 삼투 반응성에 필요한 세포막 (plasma membrane)의 물리적인 연속성과 반투막 특징이 파괴되기 때문에 세포질과기관내에 있는 물질의 누수가 일어나고 세포막이 파괴되기 때문에 세포질과 기관내에 있는 물질의 누수가 일어나고 세포막이 엽록체의 외막과 같은 세포 내부의 막 (endomembrane)과 융합되어 냉동 저항성이 떨어지게 된다.Cor15a는 냉동-유도에 의한 이러한 세포막과 엽록체막 사이의 변화를 감소시켜 식물의 생존률을 높이는 역할을 하는 스트레스 반응 유전자이다.

Cor47은Cor15a와 마찬가지로 저온, ABA 및 탈수 스트레스에 의해 유도되는 유전자로 알려져 있다.

한편, AtSIZ는 애기장대로부터 분리된 C₃H 징크 모티브를 갖는 폴리펩타이드로서 식물의 스트레스 반응에 관련된 유전자들의 전사를 활성화하는 전사 조절 인자로 작용하며 대한민국 특허출원 제2000-0072720호에 명시되어있다.

한편,RD29는 탈수, 저온, 고농도의 염 조건하에서 발현이 유도되는 애기장대의 유전자로,RD29A와RD29B두 종류의 유전자가 있으며RD29A프로모터는 수분 결핍이 있을 때 성장하는 식물체의 대부분의 기관과 조직에서 작동하여 탈수 스트레스에 대한 저항성을 높이는 것으로 알려져 있다 (Yamaguchiet al.,Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993).

구체적으로, 야생형과 변이체 식물을 저온 처리한 후, 총 RNA를 분리하고, 삼투 유도 유전자인Cor15a, Cor47, AtSIZ 및 RD29A유전자의 발현 양상을 노던 블럿으로 분석하여 조사하였다. 그 결과, 야생형과 변이체에서 모두 상기 유전자들의 발현이 증가하였지만 변이체에서Cor15a와 Cor47유전자가 야생형에서보다 다량발현되었으며 (도 8a 참조), 고농도 NaCl을 처리하고Cor47과 AtSIZ유전자의 발현을 노던 블럿으로 조사한 결과, 역시 변이체에서Cor47과 AtSIZ유전자가 다량 발현됨을 확인할 수 있었다 (도 8b 참조). 반면, 야생형 식물체에서는Cor15a, Cor47및AtSIZ유전자의 발현 정도가 상대적으로 낮았다. 따라서,AtSIK유전자가 삼투 스트레스에 의해 유도되는 유전자들을 억제하는 기능을 갖고 있음을 알 수 있었다. 그러나,RD29A의 경우에는 저온과 고농도 염 처리시 변이체 식물에서보다 야생형 식물체에서 다량 발현되어,AtSIK유전자가 다른 삼투 스트레스 유도 유전자와는 달리RD29A유전자의 발현을 억제하지 않음을 알 수 있었다. 이는 식물에서 AtSIK에 의해 삼투 스트레스 유도 유전자들이 억제되는 음성 조절 경로 (negative regulation pathway)가 존재하지만 반면 양성 조절 경로 (positive regulation pathway)도 존재함을 보여준다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 변이체 식물의 표현형의 변화가 T-DNA 삽입에 의해AtSIK유전자 내부가 변형이 되어 발생됨을 조사하기 위하여 보완 실험 (complementation test)을 수행하였다. 즉 변이체에 대해AtSIK유전자가 보완 능력을 가졌는지를 확인함으로써, 상기 변이체들이 나타내는 삼투 스트레스에 의한 표현형 변화가AtSIK유전자 내부에 T-DNA가 삽입되어 일어났음을 증명하고자 하였다.

AtSIKcDNA를 하이그로마이신 (hygromycin) 저항성 유전자를 표지 유전자로 가지고 있는 pBIB-HYG 바이너리 벡터의 35S CaMV 프로모터하에 삽입하였고, 이를 아그로박테리움-매개 형질전환법으로 돌연변이체에 도입하였다. 하이그로마이신저항성을 보이는 변이체를 선별하였고, 상기에서 얻어진 변이체/AtSIK와 변이체 및 야생형 식물체에서 각각 총 RNA를 분리하여AtSIK의 발현정도를 노던 블럿으로 확인하였다. 도 9a에서와 같이,AtSIK유전자가 도입된 변이체에서 높은AtSIK발현 양상을 보이고 있다. 한편, 고농도의 염을 처리한 후, 각각의 식물의 표현형을 조사한 결과,AtSIK보완체의 경우 야생형과 같이 고농도의 염에 민감함을 보이고 있어 (도 9b 참조), 변이체 식물의 삼투 스트레스 저항성 형질이 T-DNA의 삽입에 의한AtSIK유전자의 변이에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다

<실시예 1> 시료 애기장대의 재배

본 발명의 실험에서 사용한 모든 애기장대는 22℃ 배양실 (culture room)안에서 MS 플레이트 (plate) 또는 70% 상대습도와 16시간 명조건/8시간 암조건의 주기로 조절되는 온실에서 재배하였다. 한편 화학 처리를 하기 위해서는 어린 애기장대를 MS 배양액이 들어있는 250ml 플라스크에서 22℃, 16/8시간 명암 주기의 조건하에 1000rpm으로 교반하면서 재배하였다. 식물의 다양한 조직 부분은 채취한 뒤 액화 질소에서 급격히 얼렸다.

<실시예 2> 삼투 스트레스 유도 유전자 분리

삼투 스트레스, 그 중에서도 염 (salt) 스트레스에 의해서 발현이 유도되는 유전자들을 분리하기 위하여 감산 라이브러리 (subtraction library)를 제작하고 무작위로 선택된 cDNA를 염기서열 분석하여 스크리닝 하였다. 상기 감산 라이브러리는 염 스트레스에 의해 유도된 식물체에서 cDNA를 추출하고 상기 cDNA를 스트레스 유도되지 않은 과량의 대조군 (control) cDNA와 혼성화하여 항시적으로 발현되는 cDNA를 제거하는 과정을 거쳐 제작하였다.

2-1) 식물체의 배양

스트레스 유도된 cDNA를 얻기 위해 실시예 1의 조건으로 애기장대를 배양하고 일주일이 지난 후 염 스트레스를 주기 위해서 0.15M NaCl을 포함한 MS 배지로 교체한 다음, 교반을 하면서 1시간 내지 6시간 동안 더 키웠다. 모든 식물 묘목 (seedling)은 즉시 얼리고 -80℃에 보관하였다.

2-2) RNA 추출과 cDNA 라이브러리 제조

삼투 스트레스 유도된 cDNA 라이브러리를 만들기 위해서 애기장대를 0.15M NaCl로 6시간 동안 처리하고 애기장대 묘목으로부터 염화리튬/페놀 (LiCl/phenol) 방법으로 RNA를 추출하였고, 추출된 전체 RNA로부터 mRNA 분리 키트 (Pharmacia, USA)의 프로토콜에 따라 poly(A)+ RNA를 분리하였으며, 삼투 스트레스를 처리하지 않은 대조군 cDNA의 경우 스트레스 처리하지 않은 식물 표본으로부터 poly(A)+ RNA를 분리하였다. poly(A)+ RNA와 cDNA 합성 키트 (Stratagene, USA)를 이용하여 이중 가닥의 cDNA를 제조하고 이를 λ ZAPII (Stratagene, Inc)에 연결하여 λ ZAPII cDNA 라이브러리를 제조하였다.

2-3) 감산 라이브러리의 제조

λ ZAPII cDNA 라이브러리로부터 단일 가닥의 파아지 (filamentous phage)를 얻은 다음, 이로부터 단일 가닥의 DNA를 순수 분리하였다. λ ZAPII cDNA 라이브러리로부터 항시적으로 발현되는 cDNA를 제거하기 위해 스트레스 처리하지 않은 과량의 대조군 cDNA로 감산 (subtraction)을 수행하였다.

감산을 하기 위한 과량의 대조군 cDNA를 바이오틴으로 표지하기 위해 바이오틴과 결합한 (biotinylated) dUTP 존재하에 상기에서 얻어진 이중 가닥 대조군 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.

구체적으로 이중 가닥의 대조군 cDNA 100ng을 주형으로 사용하였고, 프라이머로는서열번호 3및4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하여 각각 50ng씩 이용하였으며, 94℃에서 30초, 38℃에서 30초, 72℃에서 30초로 50회 증폭하였다. 상기 반응 혼합물 안에는 바이오틴-16-dUTP 50μM을 첨가하여 PCR산물이 바이오틴과 결합된 형태로 제조되도록 하였다.

염에 의해 유도된 라이브러리에서 항상적으로 발현되는 cDNA를 제거하기 위하여 65℃ 혼성화 반응용액 (50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.25M NaCl, 1.0mM EDTA) 100μl에서 λ ZAPII cDNA 라이브러리의 단일 가닥 DNA 0.1μg을 상기 바이오틴과 결합한 대조군 cDNA 1.0μg과 밤새 혼성화 (hybridize)하였다. 혼성화된 DNA를 스트렙타비딘으로 코팅된 여러개의 막과 혼합하여 얼음 위에서 2시간 동안 때때로 교반하면서 배양한 다음, 막 조각들을 제거하였다. 스트렙타비딘은 바이오틴과 결합하는 성질을 가지므로 바이오틴과 결합되어 있는 대조군 cDNA와 혼성화된 시료 cDNA는 상기 스트렙타비딘이 코팅된 막을 반응 후 제거함으로써 제거할 수 있다. 즉, 혼성화 결과 염 스트레스에 의해 특이적으로 발현된 cDNA들만이 혼성화 반응에 참여하지 않고 용액 안에 남게 되므로, 이 cDNA를 페놀/클로로포름 (phenol/CHCl₃)과 CHCl₃로 추출하였다. 최종적으로 상기 cDNA를 운반체 (carrier) tRNA 2μg과 차가운 에탄올로 -20℃에서 침전시켰다. 상기에서 얻어진 cDNA를 전기천공법으로 숙주인 대장균에 도입한 다음, 무작위로 추출된 cDNA 클론의 염기서열을 자동 염기서열 분석기 (automatic sequencer)로 분석하였다.

상기 염기서열 분석 결과, 애기장대에서 총 15개의 삼투 스트레스 유도 EST (expressed sequence tag) cDNA 클론을 찾아냈고, 이들 중 4개의 cDNA 가 새로운 유전자였으며, 이들 중 0.8 kb 크기의 클론에 대해 이후의 실험을 진행하였다.

<실시예 3> AtSIK cDNA 분리

삼투 스트레스에 대한 식물의 반응 기작을 이해하기 위하여, 발현 정도가 삼투 스트레스 환경에 따라 조절되는 cDNA 클론들을 분리하였고, 이들 중 새로운 클론 OS195을 탐침으로하여 애기장대의 cDNA 라이브러리로부터 약 61kDa의 분자량을갖는 557개의 아미노산을 암호화하는 전사해독틀 (open reading frame)을 갖고 2090bp의 크기를 갖는 전장 cDNA를 분리하였고, 이를AtSIK(Arabidopsis thalianaStress-Inducible kinase)로 명명하였다. 분리된 전장 cDNA를 pBluescript 벡터에 서브클로닝 (subcloning)하여 재조합 플라스미드를 제조하고, 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균 (E.coli)을 2001년 1월 9일 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하였다 (기탁 번호 : KCTC 0932BP).

상기 AtSIK 단백질의 키나아제 도메인 (kinase domain)은 275개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 상기 전장 cDNA의 염기서열로부터 추정되는 AtSIK 아미노산 서열을 BlasrX 서열비교 프로그램을 이용하여 비교하여 본 결과, 상기 cDNA로부터 추정되는 아미노산 서열에서 인산화효소 도메인이 ARSK1 (Hwang and Goodman,Plant J. 8:37-43 1995), NAK (Moran and Walker,Biochem. Biophys. Acta. 1216:9-14 1993)와 같은 다른 인산화효소와 높은 아미노산 서열 유사성을 보인다. 그러나, 183개의 아미노산으로 이루어진 C-말단과 104개의 아미노산으로 이루어진 N-말단부위는 다른 인산화효소와 유사성이 없었다 (도 1 참조). 이는 C-말단과 N-말단 부위가 AtSIK 특이 기능을 수행하는데 관여한다는 것을 보여준다.

<실시예 4> 다양한 삼투 스트레스에 의한 AtSIK 발현 유도

AtSIK의 생물학적인 기능을 알아보기 위하여 다양한 조직과 다양한 삼투 스트레스에 대한AtSIK의 발현 양상을 조사하였다.

4-1) 조직별 발현 양상

먼저, 꽃, 잎, 뿌리 및 장각 조직으로부터 염화리튬/페놀 (LiCl/phenol) 방법으로 전체 RNA를 분리하고AtSIKcDNA를 탐침으로 한 노던 블럿으로 전사량을 조사하였다. 15μg의 전체 RNA를 65℃에서 15분간 열처리하여 2차 구조를 풀어준 다음, 포름알데히드 겔 로딩 완충용액 (50% glycerol, 1mM EDTA, pH 8.0, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF)과 섞어 2.2M의 포름알데히드를 포함한 1% 아가로스 겔에 4 V/cm으로 천천히 전기영동하였다. 전개된 RNA를 1시간 정도 DEPC 처리한 물에 담가 포름알데히드를 제거한 뒤, 모세관 이동 방법 (capillary transfer)을 이용하여 약 16시간 동안 나일론 막으로 옮긴 다음 80℃에서 1시간 열처리로 RNA를 고정화시켰다. 한편,AtSIKcDNA는 랜덤 프라이머 표지 키트 (random primer labelling kit, Boeringer Manheim)를 사용하여 [α-³²P] dCTP로 표지하여 혼성화 반응의 탐침으로 이용하였다. RNA 겔을 EtBr이 포함된 용액에서 30분 정도 교반시켜 염색하였고, 각 레인별로 총 RNA 로딩양이 동일함을 확인하였으며, 최종적인 혼성화 반응 정도는 X-선 필름을 사용하여 -70℃에서 감광시켜 확인하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 꽃에서 가장 높은 발현 양상을 나타내었고, 그 다음으로 뿌리, 잎의 순서였으나, 장각에서는 거의 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 삼투 스트레스에 의해AtSIK의 발현이 식물의 조직별로 다양하게 조절받는다는 것을 알 수 있다.

4-2) 삼투 스트레스의 종류에 따른 발현 양상

다양한 삼투 스트레스 조건하에서의AtSIK발현 양상을 조사하였다. 이를 위해, 고염처리, 탈수, 4℃ 저온처리 또는 외부에서 ABA를 처리한 애기장대로부터 전체 RNA를 분리한 다음 상기 4-1)과 동일한 방법으로 노던 블럿을 수행하였다. 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이,AtSIK의 발현은 상기 모든 처리에 의해 유도되었으며, 이는AtSIK가 일반적인 삼투 스트레스 반응에 관련되어 있음을 의미한다. 그러나 유도 양상은 사용된 특정 조건에 따라 달랐다. 저온처리시 처리 후 30분 뒤에 높은 발현을 보이다가 6시간 후 최고 수준의 발현 양상을 보였다. 그러나, 탈수, 고염, ABA 처리시 처리 후 60분 후 최고 수준의 발현 양상을 보이다가 6시간째에는 다시 발현이 저하되었다. 따라서, 이러한 결과로부터AtSIK의 발현이 특정한 스트레스 조건에 따라 다양한 수준으로 조절받는다는 것을 알 수 있다.

<실시예 5> AtSIK 유전자 내부에 T-DNA가 삽입된 변이 식물체의 분리

AtSIK의 생물학적인 역할을 조사하기 위하여 T-DNA로 표지된 형질 전환 식물체들의 게놈 DNA (ABRC, 미국)에 대한 PCR 선별 방법 (PCR screening method; McKinneyet al.,Plant J. 4:613-622, 1995)을 이용하여 T-DNA 삽입 변이체를 분리하였다. 세 차례의 PCR 선별은AtSIK유전자의 3' 및 5' 말단에 특이적인서열번호 5및6의 두 종류의 프라이머와 T-DNA 삽입체의 오른쪽 경계 및 왼쪽 경계에 특이적인 프라이머 (각각서열번호 7및8)의 조합과, T-DNA 삽입체를 가지고 있는 형질전환 집단으로부터 획득한 게놈 DNA (ABRC, USA) 주형을 이용하여 실시하였다.상기 PCR 산물은³²P로 표지된AtSIKcDNA를 혼성화 탐침으로 사용하여 서던 블럿으로 분석하였다 (도 4a 참조). 한편, 상기 PCR 산물의AtSIK유전자와의 동일성 및 T-DNA 삽입위치를 확인하기 위해 PCR 산물을 pBluescript 벡터에 서브클로닝하고 염기서열을 분석한 결과, T-DNA는AtSIKcDNA의 1582번 째 뉴클레오티드 위치에 삽입되어 있었다 (도 4b 참조).

AtSIK유전자의 붕괴는 변이 식물체로부터 얻은 게놈 DNA를 제한효소BamHI, EcoRI, HindIII및XhoI으로 절단하고 서던 블럿을 수행하여 보다 확실히 확인할 수 있었다 (도 5a 참조). 또한, 변이체와 야생형 식물체에 각각 저온, 탈수 및 NaCl을 처리하고AtSIK의 발현양상을 노던 블럿으로 확인한 결과 변이체 식물에서는AtSIK의 발현이 유도되지 않았다 (도 5b 참조). 이로써 변이체 식물의AtSIK유전자가 붕괴되었음을 보다 확실히 확인할 수 있었다.

<실시예 6> T-DNA 삽입 변이체의 표현형 조사

다양한 환경에서 변이체의 표현형을 조사하였다. 저온 처리를 위해 23℃의 MS 플레이트상에서 1주일동안 키운 식물을 4℃의 배양실로 옮겨 3달동안 배양하였다. 고농도염에 의한 스트레스 효과를 조사하기 위해 10일간 키운 식물을 다양한 농도의 염이 첨가된 MS 플레이트상으로 옮기고 4일 후 표현형을 조사하였다. 탈수 처리를 위해, 4주간 키운 식물을 물이 없는 상태의 플레이트로 옮겨 10일간 배양하였다. 그 결과, 변이체가 탈수, 고농도염을 처리하였을때 야생형 식물체에 비해잎의 손상 정도가 약하고 황화 현상의 정도도 약해 변이체 식물이 삼투 스트레스에 저항성을 가지고 있으며 (도 6a, 6b 참조), 저온처리에 의한 스트레스에도 저항성을 가지고 있음을 알 수 있었다 (도 6c 참조). 또한, 삼투 스트레스 처리 후 잎의 크기는 야생형에 비해 변이체가 50%이상임을 확인할 수 있었다 (도 6d 참조). 또한, 야생형과 변이체 식물의 자엽과 로제트 잎을 미세 절단한 후 전자현미경을 통하여 저온 스트레스 처리 후의 틸라코이드 막의 변화를 조사하였고, 그 결과 변이체 식물의 경우 저온 처리 후 틸라코이드 막의 변화가 없는 반면 야생형 식물의 경우는 틸라코이드 막이 보이지 않았다 (도 7 참조). 상기의 결과들로부터AtSIK유전자가 비활성화된 변이체 식물이 야생형 식물에 비해 삼투 스트레스에 보다 저항성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 7> 스트레스 반응 유전자에 대한 AtSIK의 억제 조절 작용 조사

변이체 식물은 삼투 스트레스에 저항성을 갖고 있으므로, 이를 분자생물학적 수준에서 연구하기 위하여, 야생형과 변이체 식물에 삼투 스트레스를 처리한 후에 삼투 스트레스 유도 유전자인Cor15a, Cor47, RD29A및AtSIZ의 발현 양상을 노던 블럿 분석을 통하여 조사하였다. 먼저 스트레스를 유도하기 위하여 야생형, 변이체 및 변이체/AtSIK식물을 액체 MS 배양액에서 1주일 동안 재배한 후 150mM NaCl 및 4℃ 저온에서 각각 3시간 및 6시간 처리하였고, 리포터 유전자로 사용될 스트레스 유도 유전자로는 외부 ABA 처리뿐만 아니라 다양한 형태의 삼투 스트레스에 의해 유전자의 발현이 조절되는Cor15a, Cor47, AtSIZ및RD29A의 발현에 초점을 맞추었다. 노던 블럿 분석은³²P로 표지된Cor15a, Cor47, AtSIZ및RD29AcDNA를 사용하였다. 그 결과, 저온 처리 후 돌연변이형에서Cor15a와 Cor47유전자가 다량 발현되었으며 (도 8a 참조), 150mM NaCl을 처리하고Cor47과 AtSIZ유전자의 발현을 노던 블럿으로 조사한 결과 역시 돌연변이형에서 다량 발현됨을 확인할 수 있었다 (도 8b 참조). 따라서,AtSIK유전자가 삼투 스트레스에 의해 유도되는 유전자들을 억제하는 기능을 갖고 있음을 알 수 있었다. 그러나,RD29A의 경우에는 저온과 고농도 염 처리시 야생형에서 보다 많이 발현되어,AtSIK유전자가 이 유전자의 발현을 유도함을 알 수 있었다.

<실시예 8> 변이체 보완 (complementation test)

상기 변이체들은 T-DNA가 삽입된 형질전환 계통 집단에서 분리하였으므로, 변이체에 대해AtSIK유전자가 보완 능력을 가졌는지를 확인함으로써, 상기 변이체들의 삼투 스트레스 표현형이AtSIK위치에 T-DNA가 삽입되어 일어났음을 증명하고자 하였다.

8-1)AtSIK보완체 및 이를 이용한 변이체/AtSIK보완 식물의 제조

AtSIK보완체를 제조하기 위해AtSIKcDNA를 하이그로마이신 저항 표시 유전자를 가지고 있는 pBIB-HYG 바이너리 벡터 (Becker D., Institut fur Genetic der Universitat zu Koln, FRG;Nucleic Acid Res. 180(1):203, 1990)에 삽입하였다. pBluescript에 서브클로닝되어있는AtSIK를EcoRI과XhoI제한효소로 절단한 후 Klenow 효소와 dNTP 혼합물로 처리하여 절단 부분을 채워 넣어 둔단 말단 (blunt end)을 만든 다음 pBIB-HYG벡터의Ecl136II제한효소 위치에 연결 (ligation)하여 CaMV 35S 프로모터와 NOS 터미네이터 (terminator)사이에 삽입되도록 함으로서 AtSIK 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움-매게 진공침투법으로 변이체 식물에 도입시키고, 이 형질전환체를 하이그로마이신 (50 mg/ml)이 포함된 MS 플레이트상에서 선별하였다. 선별된 기초 형질전환체를 토양으로 옮겨 종자를 얻고, 상기 종자를 다시 하이그로마이신이 들어 있는 MS 플레이트에서 선별한 다음 야생형, 변이체 및 변이체/AtSIK보완 식물로부터 총 RNA를 분리하고,³²P로 표지된AtSIKcDNA를 탐침으로 하여 노던 블럿을 수행하였다. 그 결과, 도 9a에서 볼 수 있듯이 변이체는AtSIK전사체 양이 거의 없는 것으로 나타난 반면에,AtSIK보완체가 삽입된 변이체AtSIK2-1은 많은AtSIK전사체 양을 보였다.

8-2) 변이체/AtSIK보완 식물의 NaCl 스트레스 민감도 측정

다양한 농도의 NaCl 스트레스에 대한 변이체/AtSIK보완 식물의 민감도를 측정하여 동형접합 T2 변이체/AtSIK식물체에서AtSIK보완체에 의한 보완이 일어나는지 조사하였다. 먼저, NaCl 스트레스를 주기 위하여 토양에서 3주간 재배한 야생형, 변이체 및 변이체/AtSIK식물 (형질전환계열 2-1)을 플레이트로 옮겨 10일 동안 키우고 다시 각각 0, 0.1, 0.15, 0.2M NaCl 용액이 포함된 플레이트로 옮겨 4일 동안 재배하였다. 그 결과 도 9b에서 볼 수 있듯이AtSIK보완체의 경우 야생형과 같이 고농도의 염에 민감함을 보였다. 이는 변이체의 NaCl 민감 표현형이 T-DNA의 삽입에 의한AtSIK유전자의 변이에 의해 유발된 것임을 보여주는 것이다.

상기에서 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명자들은 삼투 스트레스에 의해 유도되는 유전자들을 억제 조절하는 역할을 하는 신규한 단백질인 AtSIK 및 이의 유전자를 찾아내고, 상기 유전자가 식물체의 삼투 스트레스에 저항성을 가지는 유전자를 억제함을 보였다. 즉, 상기 유전자에 변이가 일어난 변이 식물체가 삼투 스트레스에 저항성을 보이고, 변이가 일어나지 않은 야생형은 삼투 스트레스에 민감함을 확인하였다. 따라서, 상기AtSIK유전자를 포함하는 발현벡터로 식물체를 형질전환시켜 아그로박테리움 T-DNA를 도입하여 AtSIK의 기능을 비활성화시킨 식물체를 제조하여 삼투 스트레스에 저항성을 보이는 유전자들의 과발현을 유도함으로써, 이를 통해 식물의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다.

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질.
제 1항에 있어서, 애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 단백질.
제 1항에 있어서, 인산화효소 도메인을 가지며, C-말단 영역과 N-말단 영역에 삼투 스트레스 유도 유전자 억제 활성 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 1항의 단백질을 암호화하는 유전자.
제 4항에 있어서,서열번호 2의 염기서열을 갖는AtSIK유전자.
제 5항의 유전자를 포함하는 진핵세포 발현 벡터.
제 6항에 있어서,서열번호 2의 염기서열을 갖는AtSIK유전자를 포함하는 진핵세포 발현 벡터 (기탁 번호 : KCTC 0932BP).
제 5항의 유전자를 비활성화시켜 제 1항의 단백질 생산을 억제함으로써 식물체의 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법.
제 8에 있어서, 유전자를 비활성화시키는 방법이 유전자 제거 (deletion), 유전자 삽입 (insertion), antisense 도입, T-DNA 도입, 동종 재조합 (homologous recombination) 또는 트랜스포전 태깅 (transposon tagging)으로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 식물체의 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법.
제 8항에 있어서, 삼투 스트레스는 고농도의 염, 저온, 탈수 또는 ABA 처리등에 의해 유발되는 스트레스인 것을 특징으로 하는, 식물체의 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법.
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