KR101329157B1 - ＡｔＳＩＺ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법 - Google Patents

ＡｔＳＩＺ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101329157B1
KR101329157B1 KR1020110007862A KR20110007862A KR101329157B1 KR 101329157 B1 KR101329157 B1 KR 101329157B1 KR 1020110007862 A KR1020110007862 A KR 1020110007862A KR 20110007862 A KR20110007862 A KR 20110007862A KR 101329157 B1 KR101329157 B1 KR 101329157B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
atsiz
seq
soybean
gene
primer
Prior art date
Application number
KR1020110007862A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120086552A (ko
Inventor
정순천
김환묵
백인순
김유진
김창기
박기웅
육은수
이기훈
이동희
정영수
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020110007862A priority Critical patent/KR101329157B1/ko
Publication of KR20120086552A publication Critical patent/KR20120086552A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101329157B1 publication Critical patent/KR101329157B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법에 관한 것으로서, 구체적으로 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자가 삽입된 콩의 6번 사상이 환경 스트레스에 대한 저항성이 높았으며, 이에 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상에 삽입된 AtSIZ 유전자 카세트가 도입된 유전자의 LB 와 RB, 및 상기 LB와 RB에 인접된 콩 게놈 염기서열을 이용하여 제조된 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 판별용 프라이머 쌍, 이를 포함하는 키트를 이용하여 환경 스트레스에 대하여 저항성이 높은 콩을 검출하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

ＡｔＳＩＺ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법{Location of insert gene of AtSIZ LM soybean event ６ and method for using thereof}
본 발명은 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법에 관한 것이다.
1994년에 유전자변형 토마토가 첫 상업화를 위하여 승인받은 이래로 해마다 수많은 유전자변형생물체(living genetically modified organism, LMO)들이 개발 생산되어 지고 있다. 유전자변형생물체는 노동력 절감이나 병해충 저항성 LMO가 성공적으로 상업화된 이후 최근 몇 년간 전 세계적으로 여러 나라에서 수많은 LMO의 재배 및 상품화가 승인되고 있으며, 변형된 특징의 수뿐만 아니라 경작면적이 증가하는 경향이 뚜렷해지고 있다(Nap JP et al ., Plant J 33:1-18, 2003). 하지만 과학계는 물론 일반 대중에게 있어 인위적으로 외래 유전자를 주입한 LMO에 대한 잠재적 위해성에 대한 우려가 사회 문제화로 부각되어 왔다. 이에 세계 각국은 LMO가 과학적으로는 안전성을 확보하였지만 소비자 스스로 선택할 수 있는 권리를 보장하기 하기 위하여 LMO 표시제도를 마련하였고, 안전성이 승인된 LMO에 대해서도 각기 그 나라의 비의도적 혼입기준치를 설정하여 LMO의 수출입 및 유통을 정부가 직접 관리하고 있는데, 유럽은 0.9%, 우리나라는 3%, 일본은 5%로 운영하고 있다(Jeong et al ., Food Control 18:1434-1442, 2007).
국내외적으로 LMO(living genetically modified organism, LMO)의 상업화는 과학적 조사에 근거하여 환경 및 인체 위해성이 없었음에 대한 규제 당국의 심사를 통과하여야 한다. 위해성 심사에 대한 법적인 근거는 국제적으로는 Cartegna Protocol로 통칭되는 바이오 안정성 의정서에 근거하고 있다. 2002년 9월부터 국제적으로 발효된 본 의정서는 LMO의 국가간 이동에 대한 제반 사항들을 규정하고 있다. 우리나라는 2001년부터 바이오안전성 의정서에 대비하여 "유전자변형생물체의 국가간 이동등에 관한 법률"을 제정하였고, 그 동안에 시행령, 시행 규칙 등을 제정한 후 본법을 2008년 1월 1일부터 시행하고 있다. 본 법률에 따르면 LMO를 개발한 자는 상업화 이전에 위해성 평가 자료를 규제 당국에 심사를 받게 되는데, 위해성 평가 항목에는 상업화를 목표로 하는 LMO 사상(event)에 도입된 유전자의 도입위치, 도입유전자의 수, 발현 등이 환경 및 인체에 대한 위해성 평가자료에 필수적으로 포함되도록 규정하고 있다. 또한 개발자는 LMO의 상업화 이후에 LMO를 추적할 수 있는 검출 수단을 제시하여야 한다. 결론적으로, LMO의 상업화는 형질전환단계에서 나오는 다양한 사상들을 무작위적으로 상업화할 수는 없고, 이들 중 특정 사상에 대한 유전 분석, 환경 위해성 분석, 인체 위해성 분석 결과가 본 특정 사상이 유전적으로 안정적이고 위해성이 없는 것임을 제시한 후에 이루어질 수 있다.
한국 바이오안전성 정보센터에 의하면, 유전자 변형 작물은 1996년부터 그 재배 면적이 꾸준히 증가하고 있으며, LM-콩의 경우 2009년 총 134백만 ha 면적 중 69.2 백만ha에서 재배되고 있다고 보고되어 있다(ISAAA, 2000). 그러나, 이러한 유전자 변형 콩의 상업화를 위해서는 우선 그 안전성을 확인할 수 있는, LM-콩의 유통경로상이나 환경 모니터링에서 LMO의 혼입률 분석이나 환경 모니터링을 위한 키트의 제작이 선행되어야 한다.
본 발명자들은 환경 스트레스에 의한 작물의 생산량 손실을 감소시키기 위하여(Bray et al., 2000, In Biochemistry & Molecular Biology of Plants, BB Buchanan, W Gruissem, and RL Jones ed, American Society of Plant Biologists, Rockville; Wang et al., 2007, Planta 218: 1-14), 환경 스트레스에 대하여 내성을 갖는 LM-콩을 제조하기 위하여, 식물체의 환경 스트레스 중 삼투 스트레스에 대한 저항성을 높인다고 알려진 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자(공개특허 제 2001-0074013호)를 콩에 도입하여 LM-콩을 제조하였다. 삼투 스트레스에 대한 저항성이 약간만 증가하여도 농업 생산성과 수율에 막대한 영향을 미칠 수 있기 때문에, AtSIZ 유전자를 도입한 콩은 농작물 생산에 크게 기여할 수 있을 것이라고 예상된다. AtSIZ 유전자를 도입하여 제조한 LM-콩 또한, 상업화를 위해서는 그 안정성을 확보하여야 하므로, 콩의 게놈의 특정 위치에 AtSIZ 유전자가 삽입되어, 환경 스트레스에 대하여 저항성이 높아진 AtSIZ 형질전환 콩을 검출할 수 있는 키트의 제작이 우선되어야 한다.
이에, 본 발명자들은 AtSIZ 유전자 카세트를 광안콩에 형질전환한 다수의 사상(event) 중 6번 사상에는 하나의 유전자 카세트만 삽입되어 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가되는 것을 확인하였으며, 삽입시킨 AtSIZ 유전자 카세트의 LB(left border) 및 RB(right border) 부위의 인접 게놈 서열과 유전자 카세트의 말단부위를 동시에 증폭할 수 있는 프라이머 쌍과 콩 내재 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하는 멀티플렉스 PCR을 통하여 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 환경 스트레스에 대하여 높은 저항성을 갖는AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 형질전환 콩 6번 사상을 특이적으로 검출하는 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사상 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사상 판별용 프라이머 쌍을 이용하여 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 프라이머 쌍 1 또는 2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, Genbank 등록번호(CM000851.1) 콩 18번 염색체 게놈 서열의 59,799,931-59,800,050 사이에 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border)와 RB(right border) 및 상기 LB와 RB에 인접된 콩 게놈 염기서열을 사용하여 제조된 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 판별용 프라이머쌍:
프라이머 쌍 1: 서열번호 22로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 20으로 기재되는 역방향 프라이머(산물 크기: 234 bp); 및
프라이머 쌍 2: 서열번호 23로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 24로 기재되는 역방향 프라이머(산물 크기: 200 bp)을 제공한다.
본 발명에 따른 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별방법을 제공한다:
1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
2) 제 1항의 사상 판별용 프라이머 쌍을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별방법을 제공한다:
1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
2) 본 발명의 사상 판별용 프라이머 쌍 및 콩의 내재 유전자인 Lectin 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 25로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 26으로 기재되는 역방향 프라이머의 프라이머 쌍의 혼합물을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별방법.
또한, 본 발명은 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border) 및 상기 LB와 인접된 콩 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 21로 기재되는 염기서열을 제공한다.
아울러, 본 발명은 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 RB(right border) 및 상기 RB와 인접된 콩 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 제공한다.
본 발명에 따른 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상에 삽입된 AtSIZ 유전자 카세트를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍, 이를 포함하는 정성분석 키트 및 이들을 이용한 형질전환 콩의 정성 분석방법은 본 발명자들에 의하여 제조된 환경 스트레스 저항성을 갖는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상을 판별할 수 있는 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 AtSIZ 도입유전자 카세트의 구조를 나타낸 그림이다:
LB: 왼쪽 보더(left border); 및
RB: 오른쪽 보더(right border).
도 2는 도입유전자의 카피수를 분석하기 위해 제작한 35S 프로브의 위치를 AtSIZ 도입유전자 카세트에 나타낸 그림이다.
도 3은 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상을 35S 프로브와 혼성화 반응시켜 서던 블랏팅 한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 인버스 PCR을 위한 RB 부위의 구조 및 프라이머 위치를 나타낸 그림이다.
도 5는 인버스 PCR을 위한 LB 부위의 구조 및 프라이머 위치를 나타낸 그림이다.
도 6은 인버스 PCR을 통해서 확인된 AtSIZ 유전자 카세트 RB 부위(1번 ~ 323번) 및 인접한 콩 게놈 유전자 서열을 나타낸 그림이다.
도 7은 AtSIZ 유전자 카세트 LB 부위의 도입 위치를 확인하기 위한 인버스 PCR 산물을 SIZ-LB U2 프라이머를 이용하여 시퀀싱한 결과를 나타낸 그림이다.
도 8는 AtSIZ 유전자 카세트 LB 부위의 도입 위치를 확인하기 위하여, 인버스 PCR 산물을 SIZ-LB L2 프라이머를 이용하여 시퀀싱한 결과를 나타낸 그림이다.
도 9a는 AtSIZ 유전자 카세트 RB 부위의 Event-특이 프라이머 쌍을 이용한 대조군 콩 및 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상의 DNA의 PCR 결과를 나타낸 그림이다:
SM: 100 bp DNA 래더;
1: 대조군 광안콩; 및
2: AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상.
도 9b는 AtSIZ 유전자 카세트 RB 부위의 Event-특이 프라이머 쌍을 이용한 대조군 콩 및 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상의 DNA의 PCR 결과를 나타낸 그림이다:
도 10은 LB 부위의 Event-특이 프라이머를 이용한 PCR 산물을 시퀀싱한 결과를 나타낸 그림이다.
도 11은 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상의 RB 부위 및 LB 부위의 멀티플렉스 정성 PCR 분석 결과를 나타낸 그림이다:
Lectin: 콩 내재 유전자;
SM: 100 bp DNA 래더;
WT: 대조군 광안콩; 및
LM: AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
용어 '멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)'는 복수의 프라이머 쌍을 동시에 사용하여 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법이다. 이 경우 복수 프라이머의 상호 작용을 계산하여 프라이머가 다이머(dimer)를 형성하지 않는 프라이머 조합을 만들어야 한다. 또한, 복수의 PCR 산물 크기를 아가로즈 겔에서 충분히 구별할 수 있어야 한다.
용어 '유니플렉스 PCR(uniplex PCR)'은 멀티플렉스 PCR과 대조적인 PCR 방법으로 단일 프라이머 쌍을 이용하여 단일의 표적 유전자를 증폭하는 방법이다.
용어 '내재유전자'는 특정 작물의 게놈에 자연적으로 존재하고 전체 게놈 중에 단일 카피(single copy)로 존재하여 특정작물의 유전자분석에서 특정 작물의 존재를 알려주는 양성 대조구로 이용될 수 있는 유전자이며, 또한 여타 근연종에는 존재하지 않는 종 특이적 유전자로써 음성 대조구로 사용될 수 있는 유전자를 말한다.
용어 '도입유전자'는 식물체의 저항성 부여 등의 형질 개량을 위하여 식물체에 형질도입된 유전자를 의미한다.
용어 '사상(Event)'은 형질전환에 의해 외래 DNA가 유전체의 특정 위치에 재조합되어 도입된 경우를 지칭하는데, 전통 육종의 계통(line)과 유사한 개념이다. 특정 event의 도입유전자 삽입 부위의 인접 유전체 DNA의 염기서열을 이용한 정성 검증 PCR 키트는 event 특이 검출 키트(event-specific detection kit)로 불린다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 프라이머 쌍 1 또는 2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, Genbank 등록번호(CM000851.1) 콩 18번 염색체 게놈 서열의 59,799,931-59,800,050 사이에 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border)와 RB(right border) 및 상기 LB와 RB에 인접된 콩 게놈 염기서열을 사용하여 제조된 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 판별용 프라이머쌍:
프라이머 쌍 1: 서열번호 22로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 20으로 기재되는 역방향 프라이머(산물 크기: 234 bp); 및
프라이머 쌍 2: 서열번호 23로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 24로 기재되는 역방향 프라이머(산물 크기: 200 bp)을 제공한다.
상기 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 판별용 프라이머쌍에 있어서, AtSIZ 형질전환 콩에 도입된 유전자 카세트의 LB 부위를 판별할 수 있는 프라이머 쌍 1의 산물 크기는 234 bp인 것이 바람직하며, AtSIZ 형질전환 콩에 도입된 유전자 카세트의 RB 부위를 판별할 수 있는 프라이머 쌍 2의 산물 크기는 200 bp인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별용 프라이머쌍에 있어서, AtSIZ 형질전환 콩은 환경적 스트레스에 대하여 저항성을 갖는 것이 바람직하며, 상기 환경적 스트레스는 건조 스트레스, 염 스트레스 및 저온 스트레스 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 환경 스트레스에 대한 저항성을 갖는 형질전환 콩을 제조하기 위하여, AtSIZ 유전자 카세트를 제조하여 광안콩에 삽입하는 방법을 이용하여, 환경 스트레스에 대한 저항성이 높은 형질전환 콩을 선별하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, AtSIZ 도입 유전자 카세트를 제작하였으며(도 1 참조), AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상에서 AtSIZ 도입 유전자 카세트가 단일 카피로 삽입되었음이 확인되었다(도 3 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 AtSIZ 유전자 카세트의 도입 위치를 확인하기 위하여 도 4에 나타난 바와 같이, AtSIZ 유전자 카세트의 RB 부위를 검출하기 위한 인버스 PCR 프라이머를 작성하였으며(도 4 참조), 인버스 PCR을 수행하기 위한 주형으로는 본 발명에 따른 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상으로부터 추출한 DNA를 이용하였다. 인버스 PCR 산물을 시퀀싱한 결과 도 6과 같은 결과를 확인할 수 있었으며, 그 결과 본 발명에 따른 AtSIZ 유전자 카세트의 RB 부위가 콩 18번 염색체의 59,800,050 위치에 삽입되어 있음을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 AtSIZ 유전자 카세트의 도입 위치를 확인하기 위하여 도 5에 나타난 바와 같이, AtSIZ 유전자 카세트의 LB 부위를 검출하기 위한 인버스 PCR 프라이머를 작성하였으며(도 5 참조), 인버스 PCR을 수행하기 위한 주형으로는 본 발명에 따른 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상으로부터 추출한 DNA를 이용하였다. 인버스 PCR 산물을 시퀀싱한 결과 도 7과 도 8과 같은 결과를 확인할 수 있었으며, 이러한 결과를 바탕으로 작성한 프라이머를 사용하여 획득한 염기서열의 분석 결과, 본 발명에 따른 AtSIZ 유전자 카세트의 LB 부위가 콩 18번 염색체의 59,799,931 위치에 삽입되어 있음을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
아울러, 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여, AtSIZ 유전자의 도입에 의해서 환경 스트레스에 대하여 저항성이 높아진 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상을 검출하기 위한 Event 특이-프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 결과, AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상에서만 PCR 산물이 확인됨으로써, 본 발명의 프라이머 쌍의 사상 특이성을 확인하였다(도 10 참조).
따라서, 본 발명에 따른 서열번호 22 및 서열번호 20으로 구성되는 프라이머 쌍 1 또는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성되는 프라이머 쌍 2는 환경 스트레스에 대하여 저항성이 높아진 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상을 특이적으로 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 판별용 키트를 제공한다.
상기 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 판별용 키트에 있어서, 추가로 콩의 내재 유전자인 Lectin 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 것이 바람직하며, 콩 내재 유전자인 Lectin 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 25로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 26으로 기재되는 역방향 프라이머의 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, AtSIZ 형질전환 콩은 환경적 스트레스에 대하여 저항성을 갖는 것이 바람직하며, 상기 환경적 스트레스는 건조 스트레스, 염 스트레스 및 저온 스트레스 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별방법을 제공한다:
1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
2) 본 발명에 따른 사상 판별용 프라이머 쌍을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및,
3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별방법.
상기 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 판별방법에 있어서, 단계 1)의 시료는 AtSIZ 형질전환 콩 또는 환경 스트레스 저항성 콩이 포함된 것으로 예상되는 식품인 것이 바람직하다. 또한, 상기 AtSIZ 형질전환 콩은 환경적 스트레스에 대하여 저항성을 갖는 것이 바람직하며, 상기 환경적 스트레스는 건조 스트레스, 염 스트레스 및 저온 스트레스 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border) 및 상기 LB와 인접된 콩 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 21로 기재되는 염기서열을 제공한다.
상기 서열번호 21로 기재되는 염기서열은 본 발명에 따른 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 콩에 삽입된 것을 확인하기 위하여, 본 발명에 따른 AtSIZ 6번 사상 판별용 프라이머 쌍 1번을 이용하여 증폭한 DNA의 PCR결과를 나타낸 것으로서, 이를 이용하여 본 발명에 따른 환경 스트레스에 대한 저항성을 갖는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상에서 AtSIZ 유전자 카세트의 도입 부위를 확인할 수 있다. 상기 서열번호 21로 기재되는 염기서열은 서열번호 22 및 서열번호 20으로 기재되는 사상 특이 프라이머 쌍 1의 염기서열, 도입 카세트의 LB 부위와 이와 인접한 콩 게놈 DNA를 포함하고 있으므로, 상기 서열정보를 이용하여 제조된 프라이머 쌍은 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 검출에 이용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 RB(right border) 및 상기 RB와 인접된 콩 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 제공한다.
상기 서열번호 9로 기재되는 염기서열은 본 발명에 따른 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 콩에 삽입된 것을 확인하기 위한 인버스 PCR 결과를 나타낸 것으로서, 이를 이용하여 본 발명에 따른 환경 스트레스에 대한 저항성을 갖는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상에서 AtSIZ 유전자 카세트의 도입 부위를 확인할 수 있다. 상기 서열번호 9로 기재되는 염기서열은 서열번호 23 및 서열번호 24로 기재되는 사상 특이 프라이머 쌍 2의 염기서열, 도입 카세트의 RB 부위와 이와 인접한 콩의 게놈 DNA를 포함하고 있으므로, 상기 서열정보를 이용하여 제조된 프라이머 쌍은 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 검출에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> AtSIZ 형질전환 콩( event 6)의 제조
Binary vector pB2GW7(GenBank 미등록; https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pB2GW7/search/index/ 에서 염기서열 얻을 수 있음)을 기본으로 하여 제작된 Binary vector pB2GW7에 AtSIZ 유전자를 삽입한 벡터를 사용하여 형질전환한 AtSIZ 형질전환 콩(event 6)의 시료는 동아대학교로부터 제공받았다.
< 실험예 1> AtSIZ 형질전환 콩 (event 6)로부터 DNA 의 추출
AtSIZ 형질전환 콩의 잎 조직 3 ~ 5 g을 막자와 막자사발을 이용하여 액체질소와 함께 미세하게 분쇄한 후, 상기 시료를 50 ㎖ 튜브에 넣고 사가이 마루프 등의 방법(Saghai Maroof et al., Proceedings of National Academy of Sciences, USA, Vol. 81 pp. 8014-8018, 1984)을 참고로 하여 DNA를 분리 및 정제하였으며, 수득한 DNA는 PicoGreen dsDNA quantification kit(Molecular Probes, 미국)을 사용하여 형광 발색한 후, BioQ™-mini fluorometer((주) 바이오니아, 한국)를 사용하여 형광을 측정함으로써 정량하였다.
< 실험예 2> 도입유전자의 카피( copy ) 수 분석
AtSIZ 도입유전자의 카피수를 분석하고자 서던 블랏팅(Southern blotting)을 수행하였다.
<2-1> 프라이머 제작
도입한 AtSIZ 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 제작하였다.
AtSIZ의 서열정보를 토대로 하여 모든 프라이머는 프라이머 Express 프로그램(Rozen and Skaletsky, 프라이머3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In S. Krawets and S. Misener(Eds.), Bioinformatics methods and protocols: Methods in moleclar biology(pp. 365-386). Totowa, NJ: Humans Press)을 이용하여 디자인되었고,(주)바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
프라이머 명칭 서열(5'→3')
SMV35S 3031F TCCATCTTTGGGACCACTGT(서열번호 1)
SMV35S 3642R ATCAAGACGATCTACCCGAG(서열번호 2)
<2-2> 프로브 제작
우선, <실험예 1>의 방법으로 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상으로부터 수득한 DNA를 주형 DNA로 하고, 상기 실험예 <2-1>의 방법으로 제조한 프라이머 쌍을 이용하여, 100 내지 200 ng의 주형 DNA, 2.5 ㎕ 10×PCR 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μM의 각 프라이머 쌍(서열번호 1 및 서열번호 2) 및 1.25 units AmpliTaqGold polymerase((주) 바이오니아, 한국)의 총 25 ㎕의 반응액을 수득한 후, 95℃ 1분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 1분, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 1%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다. 상기 아가로즈 겔로부터 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)을 이용하여 각각의 PCR 산물을 정제하였고, 상기 PCR 산물을 T-easy 벡터(Promega, USA)와 연결하였다. 상기 벡터를 대장균에 형질전환한 뒤 상기 형질전환된 대장균을 증식하여 플라스미드를 추출하였다. 상기 플라스미드를 주형 DNA로 하여 2 ng의 주형 DNA, 2.5 ㎕ 10×PCR 버퍼, 0.2 mM Biotin-14-dCTP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μM의 각 프라이머 쌍(서열번호 1 및 서열번호 2) 및 1.25 units AmpliTaqGold polymerase((주) 바이오니아, 한국)의 총 25 ㎕의 반응액을 수득한 후, 95℃ 1분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 1분, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 1.5%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다. 상기 아가로즈 겔로부터 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)을 이용하여 PCR 산물을 정제함으로써 프로브를 제작하였다.
<2-3> 혼성화 반응
상기 실험예 <2-2>의 방법으로 수득한 프로브를 이용하여 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 및 형질전환 콩 control DNA 내의 도입유전자의 카피 수를 측정하였다. 실험예 <2-2>의 방법으로 수득한 프로브 내에 있는 제한효소 자리를 제외한 제한효소로 AflⅡ와 HindⅢ를 선정하였고, <실험예 1>의 방법으로 수득한 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상과 정상형질전환 콩 DNA 5 ㎍에 상기 선정된 제한효소를 각각 30 유닛씩 처리하여 밤새 상기 DNA를 절단하였다.
상기 결과물을 1% Seakem 아가로즈 겔(Cambrex, USA)에 전기영동하여 분리하였다. 상기 절단된 DNA를 모세관 전달(capillary transfer) 방법을 이용하여 상기 아가로즈 겔로부터 나일론 막(nylon membrane)으로 전달하였다. 상기 과정이 끝나면, 나일론 막을 1 ㎎의 Salmon Sperm DNA를 포함하는 혼성화 완충용액(1mM EDTA, 0.25M Na2HPO4, 7% SDS)을 이용하여 65℃에서 1시간 동안 전-혼성화한 다음, 실험예 <2-2>의 방법으로 수득한 프로브를 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후, 500 내지 700 ng을 나일론 막을 담고 있는 용기에 주입하여 65℃에서 하룻밤 동안 혼성화하였다. 상기 반응이 끝나면 나일론 막을 세척용 완충용액(1.5 mM Sodium Citrate, 15 mM Sodium Chloride, 1% SDS)으로 3회 세척한 뒤, AvidxTM-AP conjugate(Roche, Germany) 0.75 units 및 CDP-star substrate(Applied Biosystems, USA) 0.25 mM 용액을 처리하여 화학발광을 시키고, 처리된 나일론 막을 X-ray 필름에 감광시켜 현상하였다.
그 결과, AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 및 형질전환 콩 control DNA 중, AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상에서만 35S의 프로브에 의해 하나의 밴드가 관찰되었는데, 이는 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상에 AtSIZ의 도입 유전자가 1 카피 존재함을 제시하는 것이다(도 3).
<실험예 3> AtSIZ를 포함하는 도입 유전자의 삽입 위치 확인
<3-1> AtSIZ RB 부위의 삽입 위치 확인
<3-1-1> 인버스 PCR 템플릿 DNA
AtSIZ 콩의 6번 사상에 도입된 유전자 카세트의 RB(right border) 부위의 인접(flanking) 게놈 DNA 염기서열을 확보하고자, <실험예 1>의 방법으로 수득한 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 DNA를 도 5에서 나타난 바와 같이 AtSIZ 도입 유전자 내에 제한효소 자리를 갖는 제한효소 NsiI으로 부분 제한효소 처리(partial digestion) 하였다. 효소처리 후 페놀:CHCl3법으로 DNA를 정제하고 자가 결합(self ligation)하였다.
<3-1-2> 인버스 PCR
상기 실험예 <3-1-1>의 방법으로 수득한 원형의 DNA를 주형 DNA로 하여 인버스 PCR(inverse PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 서열번호 3(SIZ-RB L1: 5'-GAC CAC CAA GTC TCC GGT TA-3') 및 서열번호 6(SIZ-RB U1: 5'-CAG ATG TGT CGT GGG TGA AC-3')의 프라이머 쌍(도 4)을 이용하여 95℃ 1분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초의 과정을 30회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 1차 PCR을 수행하였고, 상기 1차 PCR 산물을 이용하여 서열번호 4(SIZ-RB L2: 5'-TGT TCT GCC ATA AAC CAC CA-3') 및 서열번호 7(SIZ-RB U2: 5'-GTT GGG ATT ACG GTG AAT GG-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초의 과정을 35회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 2차 PCR을 수행하였다. 상기 2차 PCR 산물을 전기영동하여 겔 상에서 확인한 후, 상기 산물의 겔 상의 밴드를 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제 산물을 서열번호 4 및 서열번호 7의 프라이머 쌍을 이용하여(주) 솔젠트(한국)에 의뢰하여 시퀀싱 하였다.
그 결과, 하기 도 6(서열번호 9, 서열번호 10)과 같은 결과를 얻을 수 있었다(도 6). 도 6에 나타난, 서열번호 9의 서열은 도입 유전자 카세트 RB 부분 근처의 콩 게놈 DNA 서열을 의미하며, 서열번호 10의 괄호 내의 서열은 RB 말단 부위에서 도입시 결실된 도입 유전자 카세트 DNA 염기서열을 나타낸다. 이러한 시퀀싱 결과로부터 얻은 RB 인접 서열을 이용하여, 콩 게놈 서열에 대하여 BLAST를 통하여 상동성을 비교한 결과 도입유전자의 RB 부위는 콩의 염색체(chromosome) 18(MLG G)의 59,800,050에 위치하였고, 인버스 PCR을 통해 획득한 RB 인접부위 서열은 59,800,050-59,801,767(1717 bp)에 상응하였다.
프라이머 명칭 서열(5'→3')
SIZ-RB-L1 GACCACCAAGTCTCCGGTTA(서열번호 3)
SIZ-RB-L2 TGTTCTGCCATAAACCACCA(서열번호 4)
SIZ-RB-L3 GGAACCATTGCAGAACCAGT(서열번호 5)
SIZ-RB-U1 CAGATGTGTCGTGGGTGAAC(서열번호 6)
SIZ-RB-U2 GTTGGGATTACGGTGAATGG(서열번호 7)
SIZ-RB-U3 GAGCAGCAGATTGTGGCATA(서열번호 8)
<3-2> AtSIZ LB 부위의 삽입 위치 확인
<3-2-1> 인버스 PCR 템플릿 DNA
AtSIZ 콩의 6번 사상에 도입된 유전자 카세트의 LB(left border) 부위의 인접(flanking) 게놈 DNA 염기서열을 확보하고자, <실험예 1>의 방법으로 수득한 AtSIZ 콩의 DNA를 도 5에서 나타난 바와 같이 35S 프로모터 내에 제한효소 자리를 갖는 제한효소 SacI으로 부분 제한효소 처리(partial digestion) 하였다. 효소처리 후 페놀:CHCl3법으로 DNA를 정제하고 자가 결합(self ligation)하였다.
<3-2-2> 인버스 PCR
실험예 <3-2-1>의 방법으로 수득한 원형의 DNA를 주형 DNA로 하여 인버스 PCR(inverse PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 서열번호 11(SIZ-LB L1: 5'-TCG AGG GGA TCT ACC ATG AG-3') 및 서열번호 14(SIZ-LB U1: 5'-GGA ACG TCA GTG GAG CAT TT-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초의 과정을 30회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 1차 PCR을 수행하였고, 상기 1차 PCR 산물을 이용하여 서열번호 12(SIZ-LB L2: 5'-AAG CAC GGT CAA CTT CCG TA-3') 및 서열번호 15(SIZ-LB U2: 5'-CCT TAG GCG ACT TTT GAA CG-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초의 과정을 35회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 2차 PCR을 수행하였다. 상기 2차 PCR 산물을 전기영동하여 겔 상에서 확인한 후, 상기 산물의 겔 상의 밴드를 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다. 서열번호 12(SIZ-LB L2) 및 서열번호 15(SIZ-LB U2)의 프라이머 쌍을 이용하여(주) 솔젠트(한국)에 의뢰하여 시퀀싱 하였다.
SIZ-LB-L2 프라이머를 이용하여 시퀀싱한 결과, 하기 도 7과 같은 결과를 얻었으며(서열번호 17), 또한 SIZ-LB-U2 프라이머를 이용하여 시퀀싱한 결과, 하기 도 8과 같은 결과를 얻을 수 있었다(서열번호 18).
획득한 서열(서열번호 17)을 콩 게놈 서열과 BLAST한 결과, 도입 유전자의 LB 부위는 콩 염색체(MLG G)의 59,799,931에 위치하는 것을 확인할 수 있었다.
프라이머 명칭 서열(5'→ 3')
SIZ-LB-L1 TCGAGGGGATCTACCATGAG(서열번호 11)
SIZ-LB-L2 AAGCACGGTCAACTTCCGTA(서열번호 12)
SIZ-LB-L3 AGTCGACCGTGTACGTCTCC(서열번호 13)
SIZ-LB-U1 GGAACGTCAGTGGAGCATTT(서열번호 14)
SIZ-LB-U2 CCTTAGGCGACTTTTGAACG(서열번호 15)
SIZ-LB-U3 CCAAACGTAAAACGGCTTGT(서열번호 16)
< 실험예 4> 멀티플렉스 PCR 을 이용한 AtSIZ 형질전환 콩 확인
<4-1> Event -특이 프라이머 쌍의 제작
상기 실험예 <3-2-2>를 통해서 확인된 LB 인접 부위의 서열(서열번호 17)을 콩 게놈 서열과 BLAST한 결과을 바탕으로 <표 4>에 기재된 예측되는 LB 부위의 염기서열에서 서열번호 19(SIZ-LR2-F: 5'-TGT GGA TTA ATA GGC ATG AA-3') 및 유전자 카세트의 LB 내부에서 서열번호 20(SIZ6LB-cfm R: 5'-TGA TTA GAG TCC CGC AAT TA-3')의 프라이머 쌍을 제작하였다. 상기 프라이머 쌍을 이용하여 <실시예 1>의 방법으로 수득한 AtSIZ 콩의 DNA를 주형으로 95℃ 5분 유지한 후, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 산물을 전기영동하여 겔 상에서 확인한 후, 상기 산물의 겔 상의 밴드를 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제 산물을 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍을 이용하여(주) 솔젠트(한국)에 의뢰하여 시퀀싱 하였다. 획득한 서열(서열번호 21)은 LB 인접 염기서열의 길이를 확장하였을 뿐만 아니라, 인버스 PCR의 도입 유전자의 LB 부위에서 획득한 서열번호 17이 인접 염기서열이 짧으나 정확함을 확증하였다 (도 9).
프라이머 명칭 서열(5'→ 3')
SIZ-LR2-F TGTGGATTAATAGGCATGAA (서열번호 19)
SIZ6LB-cfm R TGATTAGAGTCCCGCAATTA (서열번호 20)
<4-2> AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상의 삽입위치의 염기서열 배열
인버스 PCR을 통해 획득한 LB 및 RB의 삽입위치의 염기서열을 콩 염색체 18번(GM18)에 배열하였을 때, 도입유전자 카세트는 이를 통해 AtSIZ 도입 유전자가 콩 게놈으로 삽입 시 콩 게놈 DNA가 118 bp 결실되었음을 알 수 있었다(도 10).
도 10의 LB 확인 서열을 콩 게놈 서열에 대하여 BLAST한 결과를 통하여, 인버스 PCR을 통해 획득한 LB 및 RB의 삽입위치의 염기서열을 콩 염색체 18번(GM18)에 배열하였을 때, 도입유전자의 LB 부위는 LB의 말단으로부터 카세트 내부 방향으로 64 bp가 남아있는 상태에서 GM18의 59,799,931에서 삽입되었고, RB는 RB 말단으로부터 243 bp가 결실된 상태에서 GM18의 59,800,050에 위치에서 콩의 유전체에 결합되었음을 알 수 있었다. 또한, 도입유전자 카세트의 결합시에 콩 유전체의 118 bp의 DNA 절편의 결실이 일어났음을 알 수 있었다 (도 10).
<4-3> AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상용 multiplex PCR 정성분석 kit 제작
Event-특이 염기서열의 정방향 및 역방향 프라이머와, 콩에서 단일 카피로 존재하는 렉틴(lectin) 유전자를 내재 유전자로 이용하여 멀티플렉스 PCR 방법으로 AtSIZ 콩의 6번 사상을 유무를 검출하고자 하였다.
우선, <실시예 1>의 방법으로 AtSIZ 콩부터 수득한 DNA를 주형 DNA로 하고, 100 ng의 주형 DNA, 2 ㎕ 10×PCR 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μM의 서열번호 22(AtSIZ6LB-F1) 및 서열번호 20(SIZ6LB-cfm R)의 프라이머 각각 5 pmoles과 서열번호 25(Lectin-F; 5'-TCT TGG GAT TTG GCC AAC AAT A -3') 및 서열번호 26(Lectin-R; 5'- TTA GAT GGC CTC ATG CAA CAC -3')의 프라이머 각각 20 pmoles이 혼합된 프라이머 세트 및 1.25 units AmpliTaqGold polymerase(ABI, USA)의 총 20 ㎕의 반응액을 수득한 후, 95℃ 5분 30초 유지한 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 1.5%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다.
또한, <실시예 1>의 방법으로 AtSIZ 콩부터 수득한 DNA를 주형 DNA로 하고, 100 ng의 주형 DNA, 2 ㎕ 10×PCR 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μM의 서열번호 23(SIZ6RB-F1) 및 서열번호 24(SIZ6RB-R1)의 프라이머 각각 10 pmoles과 서열번호 25(Lectin-F) 및 서열번호 26(Lectin-R)의 프라이머 각각 20 pmoles이 혼합된 프라이머 세트 및 1.25 units AmpliTaqGold polymerase(ABI, USA)의 총 20 ㎕의 반응액을 수득한 후, 95℃ 5분 30초 유지한 후, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 1.5%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다(도 11).
그 결과, 대조군 콩에서는 Lectin 유전자의 PCR 산물만 확인되었으나, AtSIZ 콩에서는 Lectin 유전자와 Event-특이 유전자의 PCR 산물도 확인되었다(도 11).
프라이머 명칭 서열(5'→ 3')
AtSIZ6LB-F1 AAAGCTTGTGGATGATTTA (서열번호 22)
AtSIZ6RB-F1 ATAGGGTTTCGCTCATGTGT (서열번호 23)
AtSIZ6RB-R1 TCGTGAGAAACCAAGAAAAT (서열번호 24)
Lectin-F TCTTGGGATTTGGCCAACAATA (서열번호 25)
Lectin-R TTAGATGGCCTCATGCAACAC (서열번호 26)
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 AtSIZ 유전자가 특이적으로 도입된 형질전환 콩 6번 사상을 검출할 수 있는 프라이머 쌍, 이를 포함하는 키트는 환경 스트레스에 대하여 저항성을 형질전환 콩을 효과적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하여 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 검출에 유용하게 사용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 하기 프라이머 쌍 1 또는 2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, Genbank 등록번호(CM000851.1) 콩 18번 염색체 게놈 서열의 59,799,931-59,800,050 사이에 AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border)와 RB(right border) 및 상기 LB와 RB에 인접된 콩 게놈 염기서열을 사용하여 제조된 AtSIZ 형질전환 콩의 6번 사상 판별용 프라이머쌍:
    프라이머 쌍 1: 서열번호 22로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 20으로 기재되는 역방향 프라이머; 및
    프라이머 쌍 2: 서열번호 23으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 24로 기재되는 역방향 프라이머.
  2. 제 1항의 사상 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별용 키트.
  3. 제 2항에 있어서, 추가로 콩의 내재 유전자인 Lectin 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별용 키트.
  4. 1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
    2) 제 1항의 사상 판별용 프라이머 쌍을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별방법.
  5. 1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
    2) 제 1항의 사상 판별용 프라이머 쌍 및 콩의 내재 유전자인 Lectin 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 25로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 26으로 기재되는 역방향 프라이머의 프라이머 쌍의 혼합물을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 AtSIZ 형질전환 콩 6번 사상 판별방법.
  6. AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border) 및 상기 LB와 인접된 콩 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 21로 기재되는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  7. AtSIZ(Arabidopsis SIZ) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 RB(right border) 및 상기 RB와 인접된 콩 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 9로 기재되는 분리된 폴리뉴클레오티드.
KR1020110007862A 2011-01-26 2011-01-26 ＡｔＳＩＺ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법 KR101329157B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110007862A KR101329157B1 (ko) 2011-01-26 2011-01-26 ＡｔＳＩＺ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110007862A KR101329157B1 (ko) 2011-01-26 2011-01-26 ＡｔＳＩＺ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120086552A KR20120086552A (ko) 2012-08-03
KR101329157B1 true KR101329157B1 (ko) 2013-11-14

Family

ID=46872331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110007862A KR101329157B1 (ko) 2011-01-26 2011-01-26 ＡｔＳＩＺ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101329157B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010035308A (ko) * 2001-02-02 2001-05-07 남홍길 삼투 스트레스 신호 전달 경로에서 억제 조절 작용을 하는삼투 스트레스에 의해 유도되는 식물의 인산화효소
KR20010074013A (ko) * 2000-12-02 2001-08-04 남홍길 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 식물의 신규전사 조절 인자

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010074013A (ko) * 2000-12-02 2001-08-04 남홍길 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 식물의 신규전사 조절 인자
KR20010035308A (ko) * 2001-02-02 2001-05-07 남홍길 삼투 스트레스 신호 전달 경로에서 억제 조절 작용을 하는삼투 스트레스에 의해 유도되는 식물의 인산화효소

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120086552A (ko) 2012-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101076095B1 (ko) 대두 계통 ｍｏｎ89788 및 이들의 검출방법들
KR20190003739A (ko) 포르말린-고정 파라핀-포매 생물학적 샘플로부터 약물 내성 박테리아를 특성화하는 방법 및 조성물
KR100753676B1 (ko) 배추과 작물의 품종 구분 및 유용표지인자 개발수단으로서의 왜성전이인자, 이를 이용한 ｄｎａ 표지인자제작용 프라이머, 및 이들을 이용한 배추과 작물의 품종구분방법
KR101047322B1 (ko) 앵귈라 뱀장어 종들의 판별을 위한 ｄｎａ 마커
KR100781206B1 (ko) 참깨 속 식물에서 분리한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR101329157B1 (ko) ＡｔＳＩＺ 형질전환 콩 6번 사상의 도입 유전자 위치 및 이의 이용방법
CN113278723B (zh) 合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物及应用
Nishihara et al. Efficient double-flowered gentian plant production using the CRISPR/Cas9 system
KR101468205B1 (ko) Ｗｍｖ－ｃｐ 형질전환 수박의 정성 분석방법
CN112921112B (zh) 鉴定万寿菊瓣型的caps分子标记、检测引物及检测试剂盒
KR101822390B1 (ko) 국내 육성밀 품종 판별용 마커 및 이를 이용한 판별 방법
Kasajima et al. Rapid identification of apple (Malus× domestica Borkh.) S alleles using sequencing-based DNA marker APPLid
KR101720582B1 (ko) 엽록체 염기서열을 이용한 Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ과 감자（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）를 포함한 다른 Ｓｏｌａｎｕｍ 종의 구별 마커 및 구별 방법
KR101099624B1 (ko) 웅성 불임성 감귤나무의 판별에 특이적인 프라이머 및 이의 용도
JP5750672B2 (ja) 短稈コシヒカリ型の水稲品種ヒカリ新世紀のｄｎａ識別法
CN112852996B (zh) 鉴定万寿菊舌状花花瓣裂片性状的scar分子标记、检测引物及其应用
JP6145102B2 (ja) 植物におけるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ遺伝子（ａａｄ−１２）を検出するための材料および方法
CN112094940B (zh) 与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用
CN110129359B (zh) 检测基因编辑事件以及测定基因编辑效率的方法以及其应用
WO2021029344A1 (ja) キウイフルーツかいよう病Ｐｓａ３系統に対する耐病性又は感受性の判定方法
US11560599B2 (en) Onion discrimination method
KR102080873B1 (ko) 인삼뿌리썩음병원균(Ilyonectria mors-panacis) 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 식별방법
JP4171798B2 (ja) イチゴの品種識別方法
CN117844821A (zh) 一种水稻转化事件l290-2-2的侧翼序列及其特异性引物与应用
KR20120105677A (ko) Ｐ34 유전자 특이적 ｄｎａ 마커를 이용한 항알러지 콩 품종의 판별방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161103

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170921

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181205

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181226

Year of fee payment: 18