KR101468205B1 - Ｗｍｖ－ｃｐ 형질전환 수박의 정성 분석방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 WMV-cp 형질전환 수박공대 정성 분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로 수박모자이크바이러스의 코트 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 수박공대 3번 사상이 수박모자이크바이러스에 대한 저항성이 높았으며, 이에 수박공대 3번 사상에 삽입된 WMV-cp 유전자 카세트가 도입된 유전자의 LB 와 RB, 및 상기 LB와 RB에 인접된 수박공대 게놈 염기서열을 이용하여 제조된, WMV-cp 형질전환 수박공대의 사상 판별용 프라이머 쌍, 이를 포함하는 키트를 이용하여 수박모자이크바이러스에 대하여 저항성이 높은 수박공대를 검출하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

ＷＭＶ－ＣＰ 형질전환 수박의 정성 분석방법{Qualitative analysis methods for ＷＭＶ－ＣＰ watermelon}
본 발명은 WMV-CP 형질전환 수박의 정성 분석방법에 관한 것이다.
식물병 연구에 따르면 우리나라 주요 재배 박과 작물은 수박, 오이, 멜론, 호박 등이며 이외에 수박 대목으로 사용하는 박이 있다. 박과 작물에 발생하여 피해를 입히는 바이러스에는 오이녹반모자이크바이러스(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)와 같은 종자전염하는 막대형 바이러스 3종, 수박모자이크바이러스(Watermelon mosaic virus 2, WMV2)와 같은 진딧물 전염하는 사상형 바이러스 3종, 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 멜론괴저반점바이러스(Melon necrotic spot virus, MNSV)와 같은 구형 바이러스를 포함하여 모두 8종이 있다. 이 중에서 종자전염하는 바이러스는 CGMMV, 쥬니키니녹반모바이크바이러스(Zucchini green mottle mosaic virus, ZGMMV)가 있으며, 큐리녹반모자이크바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus, KGMMV) 3종은 외국에서 유입되는 종자에 대한 검역대상 바이러스로 취급되고 있으며, 특히 CGMMV는 수박 연작 포장에서 토양전염에 의하여 지속적으로 발생하고 있다.
수박에 발생하는 바이러스는 주로 CGMMV인데, 이 바이러스는 수박 대목으로 사용하는 박 종자의 종자전염에 기인하는 경우가 대부분이다. 1997년에 수박에 CGMMV병이 전국적으로 463 ha 발생하여 막대한 경제적 손실이 발생하였으며, 2002년에는 논산과 창원지역에서 재배한 수박 21 ha에서 CGMMV병이 발생하였으며, 이때 사용한 수박 종자는 바이러스에 감염되지 않았으나 대목용 박 종자의 CGMMV 감염률이 약 83%로 병 발생의 중요한 역할을 하였으며, 200에 걸쳐 서천, 논산, 전주지역 15 ha의 수박에 CGMMV가 발생하였으며 진딧물 전염 바이러스인 WMV2가 복합감염되어 피해가 더욱 확대되었다.
수박모자이크바이러스(WMV)는 매년 9월 상순에 발생하여 수박재배 농가에 많은 피해를 주고 있다. WMV에 감염되면 잎에서 모자이크 병징이 나타나고, 과피는 그을음이 묻은 것처럼 되어 상품성이 현저히 떨어진다. WMV는 주로 진딧물에 의해서 전염되며 현재 WMV에 대한 효과적인 방제약제는 개발되어 있지 않아 확산된 이후에는 방제대책이 없는 형편이다.
식물 바이러스에 대한 저항성을 갖는 유전자 변형 식물을 제조하기 위하여, 바이러스의 코트 단백질(coat protein) 유전자를 식물에 도입시키는 방법을 사용하고 있다. 그 대표적인 예로는 CGMMV 저항성 수박 품종개발의 한 방법으로, CGMMV 유전자의 접목 중 지하부에 해당하는 대목으로 사용되는 야생 수박의 근연 품종인 수박공대에 CGMMV의 코트 단백질 유전자인 CGMMV-cp 유전자를 형질전환한 수박이 있다(Park et al., Plant Cell Rep 24: 350~356, 2005; 박상미 등, 식물생명공학회지 34:11~17, 2007). 또한, CGMMV-cp 유전자를 도입한 수박공대의 제조 및 이를 이용한 변형된 수박공대를 정성분석하는 방법이 알려져 있다(등록특허 10-0973181, 등록특허 10-0956059).
바이러스 코트 단백질 유전자를 식물에 발현시켰을 때, 식물의 저항성이 높아지는 기작은 정확하게 알려져 있지 않으며, 다만 바이러스의 RNA가 복제되기 전, 언코트(uncoat)하여 질병이 진행된다는 것을 고려해 볼 때, 바이러스의 복제 또는 바이러스의 언코팅 과정을 방해하여 저항성을 높일 것이라고 추정하고 있다. 바이러스 코트 단백질을 이용하여, 바이러스에 대한 저항성을 갖는 식물을 제조하는 방법이 알려져 있으나, 실제로 바이러스의 코트 단백질 유전자를 식물에 도입하여 하나의 카피만이 삽입되어, 도입된 식물에 다른 영향을 미치지 않은 상태로 바이러스에 대한 저항성이 있는 식물을 제조하는 것은 매우 어려운 일이다.
이에, 본 발명자들은 WMV-cp 유전자 카세트를 수박 공대에 형질전환한 다수의 사상(event) 중 3번 사상에는 하나의 유전자 카세트만 삽입되어 수박모자이크바이러스에 저항성만을 증가시킴을 확인하였으며, 삽입시킨 WMV-cp의 LB(left border) 및 RB(right border) 부위의 인접 게놈 서열과 유전자 카세트의 말단부위을 동시에 증폭할 수 있는 프라이머 쌍과 수박 내재 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하는 멀티플렉스 PCR을 통하여 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 WMV-cp(Watermelon mosaic virus-coat protein)가 수박공대에 도입되어, 수박모자이크바이러스에 대하여 높은 저항성을 갖는 형질전환 수박공대 3번 사상을 특이적으로 검출하는 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사상 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대의 사상 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사상 판별용 프라이머 쌍을 이용하여, WMV-cp 형질전환 수박공대의 사상을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 프라이머 쌍 1 또는 2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border)와 RB(right border) 및 상기 LB와 RB에 인접된 수박공대 게놈 염기서열을 사용하여 제조된, WMV-cp(Watermelon mosaic virus-coat protein) 형질전환 수박공대 3번 사상 판별용 프라이머 쌍을 제공한다:
프라이머 쌍 1: 서열번호 13으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머; 및
프라이머 쌍 2: 서열번호 15로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 16으로 기재되는 역방향 프라이머.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 수박공대 3번 사상 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별방법을 제공한다.
1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
2) 본 발명에 따른 사상 판별용 프라이머 쌍을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및,
3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별방법.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대의 판별방법을 제공한다:
1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
2) 본 발명에 따른 사상 판별용 프라이머 쌍 및 수박공대의 내재유전자인 DIP-1을 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 18로 기재되는 역방향 프라이머의 프라이머 쌍의 혼합물을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별방법.
또한, 본 발명은 WMV-cp(Watermelon mosaic virus-coat protein) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border) 및 상기 LB와 인접된 수박공대 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 제공한다.
아울러, 본 발명은 WMV-cp(Watermelon mosaic virus-coat protein) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 RB(right border) 및 상기 RB와 인접된 수박공대 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 제공한다.
본 발명에 따른 수박공대 사상 3에 삽입된 WMV-cp 유전자 카세트를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍, 이를 포함하는 정성분석 키트 및 이들을 이용한 수박공대의 정성 분석방법은 본 발명자들에 의하여 제조된 수박모자이크바이러스에 대하여 우수한 저항력을 갖는 수박공대 3번 사상을 판별할 수 있는 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 WMV-cp 도입유전자 카세트의 구조를 나타낸 그림이다:
LB: 왼쪽 보더(left border); 및
RB: 오른쪽 보더(right border).
도 2는 인버스 PCR을 위한 LB 부위의 구조 및 프라이머 위치를 나타낸 그림이다.
도 3은 인버스 PCR을 위한 RB 부위의 구조 및 프라이머 위치를 나타낸 그림이다.
도 4는 서던 블랏팅(Southern blotting)을 위한 프로브(probe) 위치를 나타낸 그림이다:
WMV: 수박모자이크바이러스(Watermelon mosaic virus);
LB: 왼쪽 보더(left border); 및
RB: 오른쪽 보더(right border).
도 5는 WMV-cp 형질전환 수박공대의 도입유전자 카피수를 서던 블랏팅으로 확인한 결과를 나타낸 그림이다:
#3: 3번 사상에 도입된, WMV-cp 형질전환 수박공대;
WT: 수박공대 대조군.
도 6은 LB 부위의 Event-특이 프라이머 쌍을 이용한 수박공대 및 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상의 DNA의 PCR 결과를 나타낸 그림이다:
SM: DNA 래더;
#3: 3번 사상에 도입된, WMV-cp 형질전환 수박공대; 및
WT: 수박공대 대조군.
도 7은 RB 부위의 Event-특이 프라이머 쌍을 이용한 수박공대 및 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상의 DNA의 PCR 결과를 나타낸 그림이다:
SM: DNA 래더;
#3: 3번 사상에 도입된, WMV-cp 형질전환 수박공대; 및
WT: 수박공대 대조군.
도 8은 WMV-cp 형질전환 수박공대의 3번 사상의 LB 부위의 멀티플렉스 정성 PCR 분석 결과를 나타낸 그림이다:
SM: DNA 래더;
#3: 3번 사상에 도입된, WMV-cp 형질전환 수박공대;
WT: 수박공대 대조군;
DIP-1: 수박 내재 유전자(Drought induced polypeptide-1); 및
LB region: 왼쪽 보더(left border) 부분.
도 9은 WMV-cp 형질전환 수박공대의 3번 사상의 RB 부위의 멀티플렉스 정성 PCR 분석 결과를 나타낸 그림이다:
SM: DNA 래더;
#3: 3번 사상에 도입된, WMV-cp 형질전환 수박공대;
WT: 수박공대 대조군;
DIP-1: 수박 내재 유전자(Drought induced polypeptide-1); 및
RB region: 오른쪽 보더(right border) 부분.
도 10은 인버스 PCR을 통해 얻은 도입된 벡터의 LB 부위와 그 인접 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 11은 인버스 PCR을 통해 얻은 도입된 벡터의 RB 부위와 그 인접 염기서열을 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
'멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)'은 복수의 프라이머 쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법이다. 이 경우 복수 프라이머의 상호 작용을 계산하여 프라이머가 다이머(dimer)를 형성하지 않는 프라이머 조합을 만들어야 한다. 또한, 복수의 PCR 산물 크기를 아가로즈 겔에서 충분히 구별할 수 있어야 한다.
'유니플렉스 PCR(uniplex PCR)'은 멀티플렉스 PCR과 대조적인 PCR 방법으로 단일 프라이머 쌍을 이용하여 단일의 표적 유전자를 증폭하는 방법이다.
'내재유전자'는 특정 작물의 게놈에 자연적으로 존재하고 전체 게놈 중에 단일 카피(single copy)로 존재하여 특정작물의 유전자분석에서 특정 작물의 존재를 알려주는 양성 대조구로 이용될 수 있는 유전자이며, 또한 여타 근연종에는 존재하지 않는 종 특이적 유전자로써 음성 대조구로 사용될 수 있는 유전자를 말한다.
'도입유전자'는 식물체의 저항성 부여 등의 형질 개량을 위하여 식물체에 형질도입된 유전자를 의미한다.
'Event'는 사상으로 번역될 수 있는데, 형질전환에 의해 외래 DNA가 유전체의 특정 위치에 재조합되어 도입된 경우를 지칭하는데, 전통 육종의 계통(line)과 유사한 개념이다. 특정 event의 도입유전자 삽입 부위의 인접 유전체 DNA의 염기서열을 이용한 정성 검증 PCR 키트는 event 특이 검출 키트(event-specific detection kit)로 불린다.
수박은 토양 병해충에 약하여 병 저항성을 향상시키기 위하여 수박, 박, 호박 등의 대목에 접목하여 재배하는데, '수박공대'는 야생 수박의 근연 품종으로 지상부 수박에 비해 토양 적응성이나 병해충 저항성이 높은 것으로 알려져 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 프라이머 쌍 1 또는 2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border)와 RB(right border) 및 상기 LB와 RB에 인접된 수박공대 게놈 염기서열을 사용하여 제조된, WMV-cp(Watermelon mosaic virus-coat protein) 형질전환 수박공대 3번 사상 판별용 프라이머 쌍을 제공한다:
프라이머 쌍 1: 서열번호 13으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머; 및
프라이머 쌍 2: 서열번호 15로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 16으로 기재되는 역방향 프라이머.
상기 WMV-cp 형질전환 수박의 사상 판별용 프라이머 쌍에 있어서, WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상은 서열번호 19로 기재되는 수박공대의 게놈 DNA 서열의 380번째 위치에 WMV-cp 유전자가 삽입된 수박공대인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 WMV-cp 형질전환 수박의 사상 판별용 프라이머 쌍에 있어서, WMV-cp 형질전환 수박의 사상 판별용 프라이머 쌍은 LB 부위를 판별할 수 있는 서열번호 13으로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머 쌍 또는 RB 부위를 판별할 수 있는 서열번호 15로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 16으로 기재되는 역방향 프라이머 쌍인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, WMV-cp 유전자 카세트가 삽입된 도입 유전자의 LB와 RB에 인접된 수박 게놈 염기서열을 이용하여 도입 유전자 부위를 증폭할 수 있는 염기서열이라면 한정되지 않는다. WMV-cp 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB와 인접된 수박공대 게놈 염기서열은 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하며, WMV-cp 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 RB와 인접된 수박공대 게놈 염기서열은 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기, 서열번호 13 및 서열번호 14로 기재되는 프라이머 쌍 1을 이용하여 중합연쇄반응(PCR)을 수행하였을 때, PCR 산물의 크기는 416bp이며, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 기재되는 프라이머 쌍 2를 이용할 경우, PCR 산물의 크기는 422bp인 것이 바람직하나, WMV-cp 유전자의 수박공대의 3번 사상에 도입 판단 여부는, 상기 PCR 산물의 크기에 의해서 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명자들은 수박모자이크바이러스에 대하여 저항성이 높은 수박공대를 제조하고자 예의 노력한 결과, 수박모자이크바이러스의 코트 유전자를 수박공대에 삽입하는 방법을 이용하여, 식물 병재 바이러스에 대하여 저항성이 높은 수박공대를 선별하고자 하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, WMV-cp 도입 유전자 카세트를 제작하였으며(도 1 참조), 수박공대의 3번 사상에서 WMV-cp 도입 유전자 카세트가 단일 카피로 삽입되었음이 확인되었다(도 5 참조). WMV-cp 유전자 카세트가 도입된 위치는, 상기 단일 MV-cp 도입 유전자 카세트가 단일 카피만이 삽입된 형질전환 수박공대 3번 사상으로부터 추출된 DNA를 이용하여 인버스 PCR을 결과를 통해서 알게 된 서열번호 10과 서열번호 11의 염기서열을 통해서 확인할 수 있다. 상기 서열번호 10으로 기재되는 염기서열은 WMV-cp 도입 유전자의 카세트를 구성하고 있는 LB 및 LB에 인접된 수박공대의 게놈 DNA 서열을 포함하고 있으며, 서열번호 11로 기재되는 염기서열은 WMV-cp 도입 유전자의 카세트를 구성하고 있는 RB 및 RB에 인접된 수박공대의 게놈 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여, WMV-cp 유전자의 도입에 의해서 수박모자이크 바이러스에 대하여 저항성이 높아진 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상을 검출하기 위한, Event 특이-프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 결과, WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상에서만 PCR 산물이 확인됨으로써, 본 발명의 프라이머 쌍의 사상 특이성을 확인하였다(도 6 및 7 참조).
따라서, 본 발명에 따른 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성되는 프라이머 쌍 1 또는 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 쌍 2는 수박모자이크바이러스에 대하여 저항성이 높아진 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상을 특이적으로 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 수박공대 3번 사상 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별용 키트를 제공한다.
상기 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별용 키트에 있어서, WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상은 서열번호 19로 기재되는 수박공대의 게놈 DNA 서열에서 380번째 위치에 삽입된 수박공대를 의미하며, 삽입된 위치는 WMV-cp 유전자 도입 카세트의 LB와 RB 및 이의 인접한 수박공대의 게놈 DNA 서열을 이용하여 확인할 수 있다. 구체적으로 WMV-cp 유전자 도입 카세트의 LB 및 이의 인접한 수박공대의 게놈 DNA는 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하며, WMV-cp 유전자 도입 카세트의 RB 및 이의 인접한 수박공대의 게놈 DNA는 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별용 키트에 있어서, WMV-cp 형질전환 수박의 사상 판별용 프라이머 쌍은 LB 부위를 판별할 수 있는 서열번호 13으로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머 쌍, 및 RB 부위를 판별할 수 있는 서열번호 15로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 16으로 기재되는 역방향 프라이머 쌍인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, WMV-cp 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB와 RB에 인접된 수박 게놈 염기서열을 이용하여 도입 유전자 부위를 증폭할 수 있는 염기서열이라면 한정되지 않는다. WMV-cp 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB와 인접된 수박공대 게놈 염기서열은 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하며, WMV-cp 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 RB와 인접된 수박공대 게놈 염기서열은 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 서열번호 13 및 서열번호 14로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 중합연쇄반응(PCR)을 수행하였을 때, PCR 산물의 크기는 416bp이며, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용할 경우, PCR 산물의 크기는 422bp인 것이 바람직하나, WMV-cp 유전자의 수박공대의 3번 사상에 도입 판단 여부는, 상기 PCR 산물의 크기에 의해서 한정되지 않는다.
또한, 상기 WMV-cp 형질전환 수박 판별용 키트에 있어서, 수박 내재 유전자는 DIP -1(drought induced polypeptide-1)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 수박 내재유전자인 DIP -1(drought induced polypeptide-1) 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 17로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 18로 기재되는 역방향 프라이머인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 WMV-cp 형질전환 수박 사상 판별용 프라이머 쌍과 함께 수박 내재유전자인 DIP -1(drought induced polypeptide-1) 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였으며, 그 결과 내재유전자 특이적인 PCR 산물이 정상 수박과 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 모두에서 확인 되었지만, WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상에서만 사상 특이적인 PCR 산물이 확인되었다(도 8 및 9 참조).
따라서, 본 발명에 따른 Event 특이 프라이머는 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상을 검출하는데 용이하며, 추가적으로 수박 내재 유전자를 검출하는데 이용되는 DIP-1 유전자에 대한 특이적 프라이머 쌍을 이용함으로써, 수박공대의 유전자 변형 검출의 신뢰도를 더욱 상승시켰다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별방법을 제공한다.
1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
2) 본 발명에 따른 사상 판별용 프라이머 쌍을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및,
3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별방법.
상기 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별방법에 있어서, 단계 1)의 시료는 WMV-cp 형질전환 수박공대 또는 WMV 저항성 수박이 포함된 것으로 예상되는 식품인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 단계 2)의 본 발명에 따른 WMV-cp 형질전환 수박 판별용 프라이머 쌍은 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성되는 프라이머 쌍 1 및 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 쌍2로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, WMV-cp 유전자가 도입된 수박공대 3번 사상의 인접 게놈 서열정보를 이용하여 WMV-cp 도입된 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 모두 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 사상 특이 프라이머 쌍 중 LB 부위를 확인할 수 있는 서열번호 13과 서열번호 14로 구성되는 프라이머 쌍과 수박 내재 유전자인 DIP -1에 특이적인 프라이머 쌍(서열번호 17 및 서열번호 18)을 이용한 멀티플렉스 PCR 결과, WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상에서 특이적으로 검출되었다(도 8 참조). 또한, RB 부위를 확인할 수 있는 서열번호 15와 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 쌍과 수박 내재 유전자인 DIP -1에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 멀티플렉스 PCR에서도, 형질전환 수박공대에서 특이적으로 밴드가 관찰되었다.
따라서, 본 발명에 따른 사상 특이 프라이머 쌍 1(서열번호 13 및 서열번호 14) 또는 프라이머 쌍 2(서열번호 15 및 서열번호 16)은 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상을 효과적으로 검출하는데 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대의 판별방법을 제공한다:
1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
2) 제 1항의 사상 판별용 프라이머 쌍 및 수박공대의 내재유전자인 DIP -1을 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 18로 기재되는 역방향 프라이머의 프라이머 쌍의 혼합물을 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별방법.
상기 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상 판별방법에 있어서, 단계 1)의 시료는 WMV-cp 형질전환 수박공대 또는 WMV 저항성 수박이 포함된 것으로 예상되는 식품인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 단계 2)의 본 발명에 따른 WMV-cp 형질전환 수박 판별용 프라이머 쌍은 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성되는 프라이머 쌍 1 및 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 쌍 2로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, WMV-cp 유전자가 도입된 수박공대 3번 사상의 인접 게놈 서열정보를 이용하여 WMV-cp 도입된 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 모두 이용할 수 있다. 또한, 수박 내재 유전자는 DIP -1(drought induced polypeptide-1)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 수박 내재유전자인 DIP -1(drought induced polypeptide-1) 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 17로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 18로 기재되는 역방향 프라이머인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 사상 특이 프라이머 쌍 중 LB 부위를 확인할 수 있는 서열번호 13과 서열번호 14로 구성되는 프라이머 쌍과 수박 내재 유전자인 DIP-1에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 멀티플렉스 PCR 결과, WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상에서 특이적으로 검출되었다(도 8 참조). 또한, RB 부위를 확인할 수 있는 서열번호 15와 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 쌍과 수박 내재 유전자인 DIP -1에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 멀티플렉스 PCR에서도, 형질전환 수박공대에서 특이적으로 밴드가 관찰되었다.
따라서, 본 발명에 따른 사상 특이 프라이머 쌍 1(서열번호 13 및 서열번호 14) 또는 프라이머 쌍 2(서열번호 15 및 서열번호 16)를 WMV-cp 형질전환 수박공대 3번 사상을 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 WMV-cp(Watermelon mosaic virus-coat protein) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 LB(left border) 및 상기 LB와 인접된 수박공대 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 제공한다.
상기 서열번호 7로 기재되는 염기서열은 본 발명에 따른 WMV-cp 유전자 카세트가 수박공대에 삽입된 것을 확인하기 위한 인버스 PCR결과를 나타낸 것으로써, 이를 이용하여 본 발명에 따른 수박모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 수박공대 3에 있어서, WMV-cp 유전자 카세트의 도입 부위를 확인할 수 있다. 상기 서열번호 7로 기재되는 염기서열에는 서열번호 13 및 서열번호 14로 기재되는 사상 특이 프라이머 쌍 1의 염기서열을 통하여 도입 카세트의 LB 부위와 이와 인접한 수박공대의 게놈 DNA를 포함하고 있으므로, 상기 서열정보를 이용하여 제조된 프라이머 쌍은 WMV-cp 형질전환 수박공대 3 번 사상의 검출에 이용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 WMV-cp(Watermelon mosaic virus-coat protein) 유전자 카세트가 삽입된 도입유전자의 RB(right border) 및 상기 RB와 인접된 수박공대 게놈 염기서열로 구성된 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 제공한다.
상기 서열번호 12로 기재되는 염기서열은 본 발명에 따른 WMV-cp 유전자 카세트가 수박공대에 삽입된 것을 확인하기 위한 인버스 PCR결과를 나타낸 것으로써, 이를 이용하여 본 발명에 따른 수박모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 수박공대 3번 사상에 있어서, WMV-cp 유전자 카세트의 도입 부위를 확인할 수 있다. 상기 서열번호 12로 기재되는 염기서열에는 서열번호 15 및 서열번호
16으로 기재되는 사상 특이 프라이머 쌍 2의 염기서열을 통하여 도입 카세트의 RB 부위와 이와 인접한 수박공대의 게놈 DNA를 포함하고 있으므로, 상기 서열정보를 이용하여 제조된 프라이머 쌍은 WMV-cp 형질전환 수박공대 3 번 사상 검출에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> WMV - cp 수박공대(event 3)의 제조
Binary vector pCAMBIA-3300(GenBank 미등록)을 기본으로 하여 제작된 Binary vector NW3300에 WMV-cp 유전자를 삽입한 벡터를 사용하여 형질전환한 WMV-cp 수박공대(event 3)의 시료는 (주) 농우바이오로부터 제공받았다.
< 실험예 1> WMV - cp 수박공대(event 3)로부터 DNA 의 추출
WMV-cp 수박공대, 수박공대의 잎 조직 3 ~ 5 g을 막자와 막자사발을 이용하여 액체질소와 함께 미세하게 분쇄한 후, 상기 각각의 시료들 1 g을 50 ㎖ 튜브에 넣고 사가이 마루프 등의 방법(Saghai Maroof et al ., Proceedings of National Academy of Sciences, USA, Vol. 81 pp. 8014-8018, 1984)을 참고로 하여 DNA를 분리 및 정제하였으며, 수득한 DNA는 PicoGreen dsDNA quantification kit(Molecular Probes, 미국)을 사용하여 형광 발색한 후, BioQ™-mini fluorometer((주) 바이오니아, 한국)를 사용하여 형광을 측정함으로써 정량하였다.
< 실험예 2> 도입유전자의 카피( copy ) 수 분석
WMV-cp 도입유전자의 카피수를 분석하고자 서던 블랏팅(Southern blotting)을 수행하였다.
<2-1> 프라이머 제작
도입한 WMV-cp 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 제작하였다.
WMV-cp의 서열정보를 토대로 하여 모든 프라이머는 Primer Express 프로그램(Rozen and Skaletsky, Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In S. Krawets and S. Misener (Eds.), Bioinformatics methods and protocols: Methods in moleclar biology (pp. 365-386). Totowa, NJ: Humans Press)을 이용하여 디자인되었고, 바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다:
서던 블랏팅용 WMV-cp 정방향 프라이머(서열번호 1):5'-TGGATCGAAAGGAAAAGAAGTC-3' ; 및
서던 블랏팅용 WMV-cp 역방향 프라이머(서열번호 2):5'-CGAGATATTACCATCAAGTCC-3'.
<2-2> 프로브 제작
우선, <실험예 1>의 방법으로 WMV-cp 수박공대 3번 사상으로부터 수득한 DNA를 주형 DNA로 하고, 상기 실험예 <2-1>의 방법으로 제조한 프라이머 쌍을 이용하여, 100 내지 200 ng의 주형 DNA, 2.5 ㎕ 10×PCR 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μM의 각 프라이머 쌍 및 1.25 units AmpliTaqGold polymerase(ABI, USA)의 총 25 ㎕의 반응액을 수득한 후, 95℃ 1분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 2%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다. 상기 아가로즈 겔로부터 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)을 이용하여 각각의 PCR 산물을 정제하였고, 상기 PCR 산물을 T-easy 벡터(Promega, USA)와 연결하였다. 상기 벡터를 대장균에 형질전환한 뒤 상기 형질전환된 대장균을 증식하여 플라스미드를 추출하였다. 상기 플라스미드를 주형 DNA로 하여 2 ng의 주형 DNA, 2.5 ㎕ 10×PCR 버퍼, 0.2 mM Biotin-14-dCTP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μM의 각 프라이머 쌍(서열번호 1 및 서열번호 2) 및 1.25 units AmpliTaqGold polymerase(ABI, USA)의 총 25 ㎕의 반응액을 수득한 후, 94℃ 1분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 1.5%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다. 상기 아가로즈 겔로부터 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)을 이용하여 PCR 산물을 정제함으로써 프로브를 제작하였다.
<2-3> 혼성화 반응
상기 실험예 <2-2>의 방법으로 수득한 프로브를 이용하여 WMV-cp 수박공대 및 수박공대 DNA 내의 WMV-cp의 카피 수를 측정하였다.
실험예 <2-2>의 방법으로 수득한 프로브 내에 있는 제한효소 자리를 제외한 제한효소로 BamHI과 HindIII를 선정하였고, <실험예 1>의 방법으로 수득한 WMV-cp 수박공대 3번 사상과 정상수박공대 DNA 5 ㎍에 상기 선정된 제한효소를 각각 30 유닛씩 처리하여 밤새 상기 DNA를 절단하였다.
상기 결과물을 1% Seakem 아가로즈 겔(Cambrex, USA)에 전기영동하여 분리하였다. 상기 절단된 DNA를 모세관 전달(capillary transfer) 방법을 이용하여 상기 아가로즈 겔로부터 나일론 막(nylon membrane)으로 전달하였다. 상기 과정이 끝나면, 나일론 막을 1 ㎎의 Salmon Sperm DNA를 포함하는 혼성화 완충용액(1mM EDTA, 0.25M Na2HPO, 7% SDS)을 이용하여 65℃에서 1시간 동안 전-혼성화한 다음, 실험예 <2-2>의 방법으로 수득한 프로브를 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후, 500 내지 700 ng을 나일론 막을 담고 있는 용기에 주입하여 65℃에서 하룻밤 동안 혼성화하였다. 상기 반응이 끝나면 나일론 막을 세척용 완충용액(1.5 mM Sodium Citrate, 15 mM Sodium Chloride, 1% SDS)으로 3회 세척한 뒤, AvidxTM-AP conjugate(Roche, Germany) 0.75 units 및 CDP-star substrate(Applied Biosystems, USA) 0.25 mM 용액을 처리하여 화학발광을 시키고, 처리된 나일론 막을 X-ray 필름에 감광시켜 현상하였다.
그 결과, WMV-cp 수박공대 3번 사상 및 수박공대 control DNA 중, WMV-cp 수박공대 3번 사상에서만 WMV-cp의 프로브에 의해 하나의 밴드가 관찰되었는데, 이는 오직 WMV-cp 수박공대 3번 사상에 WMV-cp 유전자가 1 카피 존재함을 제시하는 것이다(도 5).
< 실험예 3> WMV - cp 를 포함하는 도입 유전자의 삽입 위치 확인
<3-1> WMV - cp LB 부위의 삽입 위치 확인
<3-1-1> 인버스 PCR 템플릿 DNA
WMV-cp 수박공대 3번 사상에 도입된 유전자 카세트의 LB(left border) 부위의 인접(flanking) 게놈 DNA 염기서열을 확보하고자, <실험예 1>의 방법으로 수득한 WMV-cp 수박공대의 DNA를 도 2에서 나타난 바와 같이 Binary vector NW3300 내에 제한효소 자리를 갖는 제한효소 AflII, EcoRI, NsiI 및 PvuI으로 부분 제한효소 처리(partial digestion) 하였다. 구체적으로, <실험예 1>에서 수득한 2 ㎍ DNA, 10 ㎕의 10×효소 버퍼, 3 ㎕ 제한효소, 10 ㎕ 10×BSA를 혼합한 후, 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 후, 37℃에서 오버나잇(overnight)으로 반응시켜, DNA 단편을 획득하였다.
효소처리 후 페놀:CHCl3법으로 DNA를 정제한 후, 200 ng의 DNA에 최종부피가 34 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 후 얼음에서 10분 동안 반응시킨 후, 4 ㎕의 10×T4 라이게이즈(ligase) 버퍼, 2 ㎕의 T4 라이게이즈를 첨가하여 16℃에서 오버나잇으로 반응시켜 자가 결합(self ligation)시켰다. 이를 인버스 PCR(inverse PCR) 시 템픔릿(template) DNA로 사용하였다.
<3-1-2> 인버스 PCR
서열번호 3(WMV-LB L1: 5'-CTC TAC ACC CAC CTG CTG-3') 및 서열번호 4(WMV-LB U1: 5'-TGT CTC GAT GTA GTG GTT GA-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초, 30회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 1차 PCR을 수행하였고, 상기 1차 PCR 산물을 이용하여 서열번호 5(WMV-LB L2: 5'-ATT TGA CTC GAG TTT CTC CA-3') 및 서열번호 6(WMV-LB U2: 5'-GTC CTC TCC AAA TGA AAT GA-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 2차 PCR을 수행하였다. 상기 2차 PCR 산물을 전기영동하여 겔 상에서 확인한 후, 상기 산물의 겔 상의 밴드를 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다. 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍을 이용하여 (주) 솔젠트(한국)에 의뢰하여 시퀀싱 하였다.
그 결과, 616 bp 길이의 염기서열정보(서열번호 7)를 수득하였다(도 10). 즉, 도 10의 1 내지 379번째 염기서열은 도입위치 인접 게놈 DNA의 염기서열이었으며, 380 내지 616번째 염기서열은 WMV-cp 벡터의 LB(left border) 부분의 말단 염기서열이었다. 이를 통해 게놈 DNA로의 삽입 시 NW3300 binary 벡터의 WMV-cp 도입유전자 카세트의 LB 말단의 보존된 부위에 해당하는 13 bp가 결실되면서 도입유전자가 온전히 삽입되었음을 알 수 있었다.
<3-2> WMV-cp RB 부위의 삽입 위치 확인
<3-2-1> 인버스 PCR 템플릿 DNA
WMV-cp 수박공대 이벤트 3에 도입된 유전자 카세트의 RB(left border) 부위의 인접(flanking) 게놈 DNA 염기서열을 확보하고자, <실험예 1>의 방법으로 수득한 WMV-cp 수박공대의 DNA를 도 3에서 나타난 바와 같이 Binary vector NW3300 내에 제한효소 자리를 갖는 제한효소 EcoRI, NotI, NsiI 및 XhoI으로 부분 제한효소 처리(partial digestion) 하였다. 구체적으로, <실험예 1>에서 수득한 2 ㎍ DNA, 10 ㎕의 10×효소 버퍼, 3 ㎕ 제한효소, 10 ㎕ 10×BSA를 혼합한 후, 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 후, 37℃에서 오버나잇(overnight)으로 반응시켜, DNA 단편을 획득하였다.
효소처리 후 페놀:CHCl3법으로 DNA를 정제한 후, 200 ng의 DNA에 최종부피가 34 가 되도록 증류수를 첨가한 후 얼음에서 10분 동안 반응시킨 후, 4 ㎕의 10×T4 라이게이즈(ligase) 버퍼, 2 ㎕의 T4 라이게이즈를 첨가하여 16℃에서 오버나잇으로 반응시켜 자가 결합(self ligation)시켰다. 이를 인버스 PCR(inverse PCR) 시 템픔릿(template) DNA로 사용하였다.
<3-2-2> 인버스 PCR
서열번호 8(WMV-RB L4: 5'-AAC GTC GTG ACT GGG AAA AC-3') 및 서열번호 9(WMV-RB U4: 5'-CAA CCA CGT CTT CAA AGC AA-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 1분 30초의 과정을 30회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 1차 PCR을 수행하였고, 상기 1차 PCR 산물을 이용하여 서열번호 10(WMV-RB L5: 5'-CTG GCG TAA TAG CGA AGA GG-3') 및 서열번호 11(WMV-RB U5: 5'-CGC ACA ATC CCA CTA TCC TT-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃ 1분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 1분 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 2차 PCR을 수행하였다. 상기 2차 PCR 산물을 전기영동하여 겔 상에서 확인한 후, 상기 산물의 겔 상의 밴드를 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제 산물을 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 쌍을 이용하여 (주) 솔젠트(한국)에 의뢰하여 시퀀싱 하였다.
그 결과, 286 bp 길이의 염기서열정보(서열번호 12)를 수득하였다(도 11). 즉, 도 11의 1 내지 84번째 염기서열은 WMV-cp 벡터의 RB(right border) 부분의 말단 염기서열이었으며, 도입위치 인접 게놈 DNA의 염기서열이었으며, 85 내지 286번째 염기서열은 도입위치 인접 게놈 DNA 염기서열이었다. 이를 통해 게놈 DNA로의 삽입 시 NW3300 binary 벡터의 WMV-cp 도입유전자 카세트의 RB 말단의 보존된 부위에 해당하는 48 bp가 결실되면서 도입유전자가 온전히 삽입되었음을 알 수 있었다.
< 실험예 4> 멀티플렉스 PCR 을 이용한 WMV - cp 형질전환 수박 확인
<4-1> Event -특이 프라이머 쌍의 제작
서열번호 13(WMV3LB-cfm F: 5'-GCT ACC GGT TGC AAT TAG TC-3') 및 서열번호 14(WMV3LB-cfm R: 5'-TAT GGG TTT CGC TCA TGT GT-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 실시예 1의 방법으로 수득한 WMV-cp 수박공대의 DNA를 주형으로 95℃ 5분 유지한 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다.
그 결과, WMV-cp 수박공대에서 416 bp의 PCR 산물이 생성되나, 대조군 수박공대에서는 PCR 산물이 생성되지 않는 것을 확인하였다(도 6).
또한, 서열번호 15(WMV3RB-cfm F: 5'-AAG GCT AAT CTG GGG ACC TG-3') 및 서열번호 16(WMV3RB-cfm R: 5'-GAA AGC CCA AAT TTT GTT TCA-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 <실시예 1>의 방법으로 수득한 WMV-cp 수박공대의 DNA를 주형으로 95℃ 5분 유지한 후, 94℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다.
그 결과, WMV-cp 수박공대에서 422 bp의 PCR 산물이 생성되나, 대조군 수박공대에서는 PCR 산물이 생성되지 않는 것을 확인함으로써(도 7), 본 발명에 따른 Event-특이 프라이머 쌍이 WMV-cp 형질전환 수박공대를 검출하는데 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
<4-2> WMV - cp 형질전환 수박공대 3번 사상용 multiplex PCR 정성분석 kit 제작
Event-특이 염기서열의 프라이머를 정방향으로 및 역방향 프라이머와, 수박에서 단일 카피로 존재하는 DIP -1 유전자를 내재 유전자로 이용하여 멀티플렉스 PCR 방법으로 WMV-cp 수박공대 3번 사상을 유무를 검출하고자 하였다.
우선, <실시예 1>의 방법으로 WMV-cp 수박공대부터 수득한 DNA를 주형 DNA로 하고, 100 ng의 주형 DNA, 2 ㎕ 10×PCR 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μM의 서열번호 13(WMV3LB-cfm F) 및 서열번호 14(WMV3LB-cfm R)의 프라이머를 각각 5 pmoles과 서열번호 17(DIP-1 F; 5'-GTG GGC TTC AGA AGG AAT CA-3') 및 서열번호 18(DIP-1 R; CAT CCA TGT GAC TTC CAA CG-3')의 프라이머를 각각 20 pmoles이 혼합된 프라이머 세트 및 1.25 units AmpliTaqGold polymerase(ABI, USA)의 총 20 ㎕의 반응액을 수득한 후, 95℃ 5분 30초 유지한 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 1.5%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다(도 8).
또한, <실시예 1>의 방법으로 WMV-cp 수박공대부터 수득한 DNA를 주형 DNA로 하고, 100 ng의 주형 DNA, 2 ㎕ 10×PCR 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μM의 서열번호 15(WMV3RB-cfm F) 및 서열번호 16(WMV3RB-cfm R)의 프라이머 각각 10 pmoles과 서열번호 17(DIP-1 F) 및 서열번호 18(DIP-1 R)의 프라이머 각각 20 pmoles이 혼합된 프라이머 세트 및 1.25 units AmpliTaqGold polymerase(ABI, USA)의 총 20 ㎕의 반응액을 수득한 후, 95℃ 5분 30초 유지한 후, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 1.5%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다(도 9).
그 결과, 대조군 수박 공대에서는 DIP-1 유전자의 PCR 산물만 확인되었으나, WMV-cp 수박공대에서는 DIP-1 유전자와 Event-특이 유전자의 PCR 산물도 확인되었다(도 8 및 도 9).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Qualitative analysis methods for WMV-cp watermelon <130> 10p-09-21 <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-cp forward primer for southern blot <400> 1 tggatcgaaa ggaaaagaag tc 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-cp rerward primer for southern blot <400> 2 cgagatatta ccatcaagtc c 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-LB L1(inverse PCR) <400> 3 ctctacaccc acctgctg 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-LB U1(inverse PCR) <400> 4 tgtctcgatg tagtggttga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-LB L2(inverse PCR) <400> 5 atttgactcg agtttctcca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-LB U2(inverse PCR) <400> 6 gtcctctcca aatgaaatga 20 <210> 7 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inverse PCR result(LB region) <400> 7 atatagcaaa atttatatcc aactctcaaa ttctctatat cggtgataag aatctatcaa 60 caatagaatt tatgactaat aagagtctgt gatagagtct attactaata gaattttgtt 120 atatttgcaa atttttaaaa atgttactat acacttaatt attagtctta aaagggctac 180 cggttgcaat tagtcttaaa aaatgtcttt taaactaaag acctctttag ctctctctca 240 acaaagaata tgtgtatgtt gaacatatct cgttgtttca tgaaaataac gattaattct 300 aaaattgtgt atatgtcttc ggttgtgtgt gcgcgcgcac gtgtgcctac ttttaattaa 360 cgaaaacatt caaatagtat gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac 420 attgcggacg tttttaatgt actgaattaa cgccgaatta attcggggga tctggatttt 480 agtactggat tttggtttta ggaattagaa attttattga tagaagtatt ttacaaatac 540 aaatacatac taagggtttc ttatatgctc aacacatgag cgaaacccta taggaaccct 600 600 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-RB L4(inverse PCR) <400> 8 aacgtcgtga ctgggaaaac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-RB U4(inverse PCR) <400> 9 caaccacgtc ttcaaagcaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-RB L5(inverse PCR) <400> 10 ctggcgtaat agcgaagagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV-RB U5(inverse PCR) <400> 11 cgcacaatcc cactatcctt 20 <210> 12 <211> 286 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inverse PCR result(RB region) <400> 12 gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc ttggatcaga ttgtcgtttc 60 ccgccttcag tttaaactat cagtatttga taatagaatc gaatatcaat gttcggttat 120 ttaattggta ctgctcctac ttctaattaa agaaaacata ttaaaacaaa tttatttttc 180 taaataccat aattagataa tgattccata gtaaataaga acaaattaat atgaaacaaa 240 atttgggctt tcctttataa tgatttcaat tttttttttt tttttt 286 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV3LB-cfm F <400> 13 gctaccggtt gcaattagtc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV3LB-cfm R <400> 14 tatgggtttc gctcatgtgt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV3RB-cfm F <400> 15 aaggctaatc tggggacctg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV3RB-cfm R <400> 16 gaaagcccaa attttgtttc a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIP-1 F <400> 17 gtgggcttca gaaggaatca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIP-1 R <400> 18 catccatgtg acttccaacg 20 <210> 19 <211> 581 <212> DNA <213> Citrullus lanatus (Twinser) <400> 19 atatagcaaa atttatatcc aactctcaaa ttctctatat cggtgataag aatctatcaa 60 caatagaatt tatgactaat aagagtctgt gatagagtct attactaata gaattttgtt 120 atatttgcaa atttttaaaa atgttactat acacttaatt attagtctta aaagggctac 180 cggttgcaat tagtcttaaa aaatgtcttt taaactaaag acctctttag ctctctctca 240 acaaagaata tgtgtatgtt gaacatatct cgttgtttca tgaaaataac gattaattct 300 aaaattgtgt atatgtcttc ggttgtgtgt gcgcgcgcac gtgtgcctac ttttaattaa 360 cgaaaacatt caaatagtaa tttgataata gaatcgaata tcaatgttcg gttatttaat 420 tggtactgct cctacttcta attaaagaaa acatattaaa acaaatttat ttttctaaat 480 accataatta gataatgatt ccatagtaaa taagaacaaa ttaatatgaa acaaaatttg 540 ggctttcctt tataatgatt tcaatttttt tttttttttt t 581

Claims (12)

  1. 하기 프라이머 쌍 1 및 2로 구성된 WMV-cp(Watermelon mosaic virus-coat protein) 형질전환 수박공대 사상 판별용 프라이머 쌍을 포함하는, WMV-cp 유전자가 하나의 카피(copy)로 도입된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별용 키트;
    프라이머 쌍 1: 서열번호 13으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머; 및
    프라이머 쌍 2: 서열번호 15로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 16으로 기재되는 역방향 프라이머.
  2. 제 1항에 있어서, WMV-cp 형질전환 수박공대 사상은 서열번호 19로 기재되는 수박공대의 게놈 DNA 서열의 380번째 위치에 WMV-cp 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 WMV-cp 유전자가 하나의 카피로 도입된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별용 키트.
  3. 제 1항에 있어서, 프라이머 쌍 1의 산물 크기는 416 bp인 것을 특징으로 하는 WMV-cp 유전자가 하나의 카피로 도입된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별용 키트.
  4. 제 1항에 있어서, 프라이머 쌍 2의 산물 크기는 422bp인 것을 특징으로 하는 WMV-cp 유전자가 하나의 카피로 도입된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별용 키트.
  5. 삭제
  6. 하기 프라이머 쌍 1 및 2로 구성된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별용 프라이머 쌍 및
    추가로 수박공대의 내재유전자인 DIP-1(drought induced polypeptide-1)을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, WMV-cp 유전자가 하나의 카피로 도입된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별용 키트.;
    프라이머 쌍 1: 서열번호 13으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머; 및
    프라이머 쌍 2: 서열번호 15로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 16으로 기재되는 역방향 프라이머.
  7. 제 6항에 있어서, 수박공대 내재 유전자인 DIP-1 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 17로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 18로 기재되는 역방향 프라이머의 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 WMV-cp 유전자가 하나의 카피로 도입된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별용 키트.
  8. 1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
    2) 제 1항의 키트를 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및,
    3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는, WMV-cp 유전자가 하나의 카피로 도입된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 단계 1)의 시료는 WMV-cp 형질전환 수박공대 또는 WMV 저항성 수박이 포함된 것으로 예상되는 식품인 것을 특징으로 하는, WMV-cp 유전자가 하나의 카피로 도입된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별 방법.
  10. 1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;
    2) 제 6항의 키트를 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 WMV-cp 유전자가 하나의 카피로 도입된 WMV-cp 형질전환 수박공대 사상 판별 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
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