CN111254212A - 水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记及其应用 - Google Patents

水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁的分子标记及其应用，属于分子生物技术领域。所述分子标记为与水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁的共显性分子标记STS68‑7和STS68‑15，所述分子标记特异性高，在双亲间的差异明显，所述两个分子标记位于水稻第6染色体长臂上，两分子标记的物理距离大约为76kb。分别用其中任一分子标记均能够准确筛选出是否含有抗稻瘟病基因Pi68(t)的水稻材料，上述分子标记可用于抗稻瘟病基因Pi68(t)在水稻抗稻瘟病育种中的分子标记辅助选择，提高水稻抗稻瘟病育种中基因Pi68(t)的选拔准确性与效率。

Description

水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及水稻抗病性分子生物技术领域，具体涉及一种抗稻瘟病新基因紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食。由真菌Magnaporthe oryzae(Couch and Kohn，2002)引起的稻瘟病是世界水稻生产区为害最为严重的病害之一，全球每年因稻瘟病危害所造成的经济损失超过70亿美元；发病田块通常可造成10-30％的水稻减产，严重的田块甚至绝收(Wilson RA et al.，Under pressure:investigating the biology of plant infection by Magnaportheoryzae.Nature Reviews Microbiology,2009,7:185-195；Dean R et al.,The top10fungal pathogens in molecular plant pathology.Molecular Plant Pathology,2012,13:414-430)。该病既可降低水稻产量，也可降低水稻品质，已成为限制水稻生产的重要因素。由于稻瘟病菌和水稻品种之间的特异性互作符合Flor“基因对基因”假说，持有特定抗病基因的水稻品种与病原菌互作时，只有病原菌持有与该特定基因相对应的无毒基因时，品种才表现出抗性，其它任何一种情况品种均表现感病(Flor HH,Current status ofthe gene-for-gene concept.Annual Review of Phytopathology,1971,9(1):275-296；Silue D et al.,Evidence of a gene-for-gene relationship in the Oryza sativa-Magnaporthe grisea pathosystem.Phytopathology,1992,82(5):557-580)。因此，抗病品种的利用、选育和推广是水稻生产上控制该病最经济、有效和环境友好的防治措施，特别是广谱抗病基因用于抗病育种以解决品种的抗病性，以成为当前抗病育种中最为紧迫的问题。
抗病品种传统选育的方法主要依赖于抗性鉴定和表型选择，不仅周期长，选拔效率低，而且受环境等诸多条件的限制，因而制约了抗病新品种的选育；建立在PCR扩增基础上的分子标记辅助选择(mark-assisted selection，MAS)技术因其具有操作简便、稳定性好、选拔效率高和对抗性基因的选择不受环境因素影响等特点，而被广泛应用于抗病品种育种中。
非洲栽培稻具有优良的抗病虫特性、耐旱、耐盐和较强的杂草竞争能力等诸多抵抗生物和非生物胁迫的能力，本申请人项目组利用前期构建了一套以滇粳优1号为背景的非洲栽培稻渗入系BC5F4。利用采自不同稻区的53个优势稻瘟病菌单孢菌株温室苗期接种发现，其中非洲栽培稻渗入系IL106(简称：IL106)对全部的菌株表现为抗病，本发明在研究过程中将IL106与感病轮回亲本滇粳优1号杂交获得的F2代群体，发现IL106持有1个显性的稻瘟病抗性基因(抗稻瘟病基因Pi68(t))，并开发出与其紧密连锁的分子标记用于水稻抗稻瘟病的辅助选择。
发明内容
为了选育广谱抗稻瘟病水稻品种，有针对性地选择含有抗稻瘟病基因Pi68(t)的后代材料，本发明提供用于检测水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)的共显性分子标记STS68-7和STS68-15，这两个分子标记可将抗稻瘟病基因Pi68(t)精细锚定在水稻第6染色体长臂上，约76kb的物理距离范围内。与抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁的分子标记STS68-7和分子标记STS68-15均特异性高，在双亲间多态性明显，可高效用于水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)的辅助选择，不仅操作简单，而且能加快选择抗稻瘟病品种或水稻材料的选育进度。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记STS68-7为STS68-7F引物和STS68-7R引物PCR扩增的片段，目标片段长度131bp，所述STS68-7F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，STS68-7R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供所述的水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记STS68-7在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种中的应用。在其所述的应用中，用STS68-7F引物和STS68-7R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中扩增出的片段长度为131bp，则目标水稻材料含有抗稻瘟病基因Pi68(t)位点。用STS68-7F引物和STS68-7R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中扩增出的片段长度为136bp，则目标水稻材料不含抗稻瘟病基因Pi68(t)位点；或用STS68-7F引物和STS68-7R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中同时扩增出131bp和136bp两个片段，则目标水稻材料为含有抗稻瘟病基因Pi68(t)位点的杂合水稻材料。所述PCR扩增的反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM STS68-7F引物1μL、10μM STS68-7R引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸5min，PCR扩增产物于4℃保存。
本发明还提供另一个水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记STS68-15，所述紧密连锁分子标记STS68-15为STS68-15F引物和STS68-15R引物PCR扩增的片段，目标片段长度165bp，所述STS68-15F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，STS68-15R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供所述的水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记STS68-15在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种中的应用。在其应用中，用STS68-15F引物和STS68-15R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中扩增出的片段长度为165bp，则目标水稻材料含有抗稻瘟病基因Pi68(t)位点。用STS68-15F引物和STS68-15R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中扩增出的片段长度为184bp，则目标水稻材料不含抗稻瘟病基因Pi68(t)位点；或用STS68-15F引物和STS68-15R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中同时扩增出165bp和184bp两个片段，则目标水稻材料为含有抗稻瘟病基因Pi68(t)位点的杂合水稻材料。所述PCR扩增的反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM STS68-15F引物1μL、10μM STS68-15R引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸5min，PCR扩增产物于4℃保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
独立起源和驯化的非洲栽培稻(O.glaberrima)具有许多抵抗生物胁迫与非生物胁迫的特性，是改良亚洲栽培稻的重要基因库之一。本申请人项目组前期在IL106中鉴定到1个新的广谱抗稻瘟病基因Pi68(t)，在该区域尚未见其它稻瘟病抗性基因被定位的报道，为拓宽亚洲栽培稻的抗性遗传基础提供了重要的抗源。
在IL106中定位到广谱抗稻瘟病的新基因Pi68(t)，也是到目前为止定位的第一个在非洲栽培稻上的广谱抗稻瘟病的基因。
本发明所用的对稻瘟病抗病亲本IL106和对稻瘟病感病轮回亲本滇粳优1号分别来自于非洲栽培稻渗入系和亚洲粳稻品种，属于远源杂交，双亲间差异明显，在双亲多态性选择上更具有特异性，而且扩增的目标片段单一，能够准确筛选出含有目标基因的材料。
非洲栽培稻与云南水稻主栽品种在分子标记上有更多且条带清晰的多态性，有利于应用分子标记辅助选择抗病品种。
本发明的两个分子标记在水稻整个生育期的任何阶段都可以对其DNA进行PCR扩增检测抗稻瘟病基因Pi68(t)；通过检测与抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁的分子标记，即可预测水稻稻瘟病的抗性，进而快速筛选抗稻瘟病的材料。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是STS68-7F引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是STS68-7R引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是STS68-15F引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是STS68-15R引物的核苷酸序列。
附图说明
图1：分子标记STS68-7所用STS68-7F引物和STS68-7R引物对IL106(抗病亲本)及8个云南水稻主栽品种的DNA进行PCR扩增，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中的垂直电泳图。图1中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，编号1-9各表示：1：IL106，2：滇粳优1号，3：云粳29号，4：楚粳28号，5：凤稻29号，6：靖稻1号，7：丽粳9号，8：丽粳14号，9：云光109。
图2：分子标记STS68-15所用为STS68-15F引物和STS68-15R引物对IL106(抗病亲本)及8个云南水稻主栽品种的DNA进行PCR扩增，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中的垂直电泳图。图2中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，编号1-9各表示：1：IL106，2：滇粳优1号，3：云粳29号，4：楚粳28号，5：凤稻29号，6：靖稻1号，7：丽粳9号，8：丽粳14号，9：云光109。
图3：分子标记STS68-7所用STS68-7F引物和STS68-7R引物对IL106(抗病亲本)与滇粳优1号(感病亲本)杂交获得的F2代分离群体的DNA进行PCR扩增，部分扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中的垂直电泳图。其中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，图中编号1：IL106，编号2：滇粳优1号，编号3～35：随机选取的抗病亲本IL106与感病亲本滇粳优1号杂交后自交的F2代分离群体植株。
图4：分子标记STS68-15所用STS68-15F引物和STS68-15R引物对IL106(抗病亲本)与滇粳优1号(感病亲本)杂交获得的F2代分离群体的DNA进行PCR扩增，部分扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中的垂直电泳图。其中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，图中编号1：IL106，编号2：滇粳优1号，编号3～35：随机选取的抗病亲本IL106与感病亲本滇粳优1号杂交后自交的F2代分离群体植株。
其中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，片段长度分别为：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。
具体实施方式
本发明的实施方案，如未特别说明，实施过程中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。
实施例涉及的生物材料IL106在非专利文献“Dong Liying etal.Identification and mapping of a new blast resistance gene Pi67(t)in Oryzaglaberrima.中国植物病理学会2019年学术年会论文集，P45”公开。稻瘟病菌株09BSH-10-5A在非专利文献“刘树芳等.抗稻瘟病基因Piz-t和Pi9连锁标记开发及在云南粳稻中的应用.西南农业学报,2016,29(4)：721-725”公开，IL106和稻瘟病菌株09BSH-10-5A由申请人保存，自本专利申请日起20年内申请人可提供，申请人联系地址：云南省昆明市盘龙区北京路2238号，云南省农业科学院农业环境资源研究所，邮编：650205。
各实施例中所用的滇粳优1号、云粳29号、楚粳28号、凤稻29号、靖稻1号，丽粳9号、丽粳14号、云光109以及所有试剂均可通过商业渠道购买。
实施例1稻瘟病菌接种及表型评价
稻瘟病菌株09BSH-10-5A进行活化接种于燕麦培养基上，25℃下培养7～9d，待菌丝基本长满培养基后，用灭菌水洗去气生菌丝，在普通日光灯下连续光照培养3d进行产孢。之后，用蒸馏水洗下孢子并加入为0.02％的Tween-20制成孢子悬浮液用于喷雾接种，孢子悬浮液浓度调整到2×105个孢子/mL。
水稻种子在浸种催芽后，用镊子播于装有秧田土的12cm×18cm×5cm塑料育苗盒内，在温室内育苗。2叶期开始追施尿素0.5g/盒，共2～3次(每次间隔5～7d施一次尿素)。用上述稻瘟病菌株09BSH-10-5A孢子悬浮液于3.5叶期进行喷雾接种，接种后的苗置于保湿培养箱(日本池田理化产)内黑暗状态下25℃保湿培养24h(相对湿度≥95％)。保湿培养后取出放在温室内，每天进行多次清水喷雾以保持温室的湿度，创造有利发病的条件。接种7～10d后进行稻瘟病发病情况调查。稻瘟病分级标准按6级进行划分(参考董丽英等,云南省稻瘟病菌群体对稻瘟病抗性单基因系的致病性分析,西南农业学报,2012,25(2)：467-473)，0级：无病斑；1级：褐点型病斑，直径≤1mm，不具产孢能力；2级：椭圆形病斑，1mm＜直径≤2mm，病斑周围具褐色边缘，中央灰白色，具产孢能力；3级：椭圆形病斑，2mm＜直径≤3mm，病斑周围具褐色边缘，中央灰白色，具产孢能力；4级：典型的梭形或纺锤形病斑，直径>3mm，病斑有融合或无融合；5级：病斑类型与4级相同，但由于病斑间融合，叶片上半部枯死。其中，0～2级归为抗病反应(R)，3～5级归为感病反应(S)。
实施例2水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁的分子标记引物设计
以亚洲栽培稻日本晴及非洲栽培稻CG14等品种的已知基因组系列为参考，设计扩增分子标记STS68-7所用引物为STS68-7F引物(正向引物)和STS68-7R引物(反向引物)，STS68-7F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，STS68-7R引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。设计扩增分子标记STS68-15所用引物为STS68-15F引物(正向引物)和STS68-15R引物(反向引物)，STS68-15F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，STS68-15R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
上述两对引物对分别进行PCR均采用如下PCR扩增的反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM正向引物1μL、10μM反向引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL。在PCR扩增前需要对PCR管中需加入一滴石蜡油，防止PCR反应体系中液体的蒸发。
以分子标记STS68-7所用的STS68-7F引物和STS68-7R引物进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸5min，PCR扩增产物于4℃保存。
以分子标记STS68-15所用的STS68-15F引物和STS68-15R引物进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸5min，PCR扩增产物于4℃保存。
上述各PCR扩增产物均分别在8％聚丙烯酰胺凝胶中垂直电泳，分子标记STS68-7所用STS68-7F引物和STS68-7R引物在IL106(抗病亲本)和滇粳优1号(感病亲本)中分别可以扩增出131bp、136bp条带，如果是杂合单株就会同时扩增出131bp和136bp两条带(如图1、图3)。分子标记STS68-15所用STS68-15F引物和STS68-15R引物在IL106(抗病亲本)和滇粳优1号(感病亲本)中分别可以扩增出165bp、184bp的条带；如果是杂合单株就会同时扩增出165bp和184bp两条带(如图2、图4)。
实施例3本发明水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁的分子标记的验证实验
分别对IL106(抗病亲本)及8个云南水稻主栽品种(滇粳优1号、云粳29号、楚粳28号、凤稻29号、靖稻1号、丽粳9号、丽粳14号、云光109)浸种催芽后，在温室按顺序用镊子播于装有秧田土的6cm×18cm×10cm塑料育苗盒内，每行播种9粒，重复播种4行；当育苗盒的水稻长到3.5叶期时，用定位抗稻瘟病基因Pi68(t)的稻瘟病菌株09BSH-10-5A接种水稻植株，7-10天后对其进行表型鉴定，具体稻瘟病菌株培养、接种、调查等与实例1相同；接种后，除抗病亲本IL106表现抗病外，其余的8个水稻主栽品种(滇粳优1号、云粳29号、楚粳28号、凤稻29号、靖稻1号、丽粳9号、丽粳14号、云光109)均表现为感病。调查结束后，采用CTAB法按调查顺序提取水稻叶片的DNA，分别利用实例2中的两对引物对提取的水稻DNA分别进行PCR扩增，扩增反应体系及条件同实例2，PCR扩增产物均在8％聚丙烯酰胺凝胶中垂直电泳后，采用硝酸银染色法进行DNA染色并进行观察，分别出现分子标记STS68-7所用引物对扩增的条带和分子标记STS68-15所用引物对扩增的条带(如图1、图2)，图1中扩增子长度约131bp片段是含有抗稻瘟病基因Pi68(t)的抗病亲本IL106，而扩增子长度约136bp片段的品种是感病的云南8个主栽水稻品种(滇粳优1号、云粳29号、楚粳28号、凤稻29号、靖稻1号，丽粳9号、丽粳14号和云光109)。图2中扩增子长度约165bp片段是含有抗稻瘟病基因Pi68(t)的抗病亲本IL106，而扩增子长度约184bp片段的品种是感病的云南8个主栽水稻品种(滇粳优1号、云粳29号、楚粳28号、凤稻29号、靖稻1号，丽粳9号、丽粳14号和云光109)；而且抗病亲本IL106与云南8个主栽水稻品种(滇粳优1号、云粳29号、楚粳28号、凤稻29号、靖稻1号，丽粳9号、丽粳14号、云光109)分别通过上述两个分子标记STS68-7和分子标记STS68-15所用的引物对进行PCR扩增分析结果与接种表型鉴定的结果一致，即含有抗稻瘟病基因Pi68(t)的IL106的植株表现抗病，不含有抗稻瘟病基因Pi68(t)的滇粳优1号等上述8个云南水稻主栽品种植株表现感病。
实施例4利用紧密连锁分子标记在杂交后代中筛选携带Pi68(t)基因的纯合个体
如实施例1所述的抗病亲本IL106，感病亲本滇粳优1号及抗病亲本IL106与感病亲本滇粳优1号杂交后自交的F2代群体的种子浸种催芽后，在温室分别用镊子播于装有秧田土的12cm×18cm×5cm塑料育苗盒内，每行播种5粒，共播种10行；待育苗盒的水稻长到3.5叶期时，用稻瘟病菌株09BSH-10-5A接种这盒水稻植株，7-10天后进行表型鉴定，具体稻瘟病菌株培养、接种、调查与实例1相同。表型调查后，按播种顺序采用CTAB法提取水稻植株DNA(其中，编号1为抗病亲本IL106，编号2为感病亲本滇粳优1号、编号10、11、12、15、18、20、22、25和35鉴定均表现为感病的F2代个体，其余F2代植株鉴定表现为抗病)；分别利用实例2中的两对引物对提取的水稻DNA进行PCR扩增(扩增反应体系及条件同实例2)，PCR扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中垂直电泳后，采用硝酸银染色法进行DNA染色并进行观察，分别出现分子标记STS68-7所用引物对扩增的条带和分子标记STS68-15所用引物对扩增的条带(如图3、图4)。接种鉴定及基因扩增的结果表明：
图3中F2代分离群体中扩增子为1条长度约131bp片段的纯合个体及扩增子为2条长度约131bp和136bp片段的杂合个体均对稻瘟病抗病，F2代分离群体中扩增子为1条长度约136bp片段的纯合个体均对稻瘟病感病；图4中F2代分离群体中扩增子为1条长度约165bp片段的纯合个体以及扩增子为2条长度约165bp和184bp片段的杂合个体均对稻瘟病抗病；F2代分离群体中扩增子为1条长度约184bp片段的纯合个体均对稻瘟病感病。
结果表明：含有抗稻瘟病基因Pi68(t)的IL106及其杂合个体表现抗病，不含抗稻瘟病基因Pi68(t)的植株表现感病。
结论：分子标记STS68-7和分子标记STS68-15与抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁，可以作为检测水稻品种或水稻材料中抗稻瘟病基因Pi68(t)是否存在的分子标记，可以高效地用于杂交后代中携带抗稻瘟病基因Pi68(t)纯合个体的筛选，不仅节约生产成本、准确度高、不受环境影响而且大大提高了选择效率，加速育种进程。
序列表
<110> 云南省农业科学院农业环境资源研究所
<120> 水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcggcctgg tctactacga gtaatc 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccattgatca aattctacat gaatc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgtgtacg tgtgttctgt atgc 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catccacaag cagagctggt c 21

Claims (10)

1.水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记STS68-7，其特征在于，所述紧密连锁分子标记STS68-7为STS68-7F引物和STS68-7R引物PCR扩增的片段，目标片段长度131bp，所述STS68-7F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，STS68-7R引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
2.权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记STS68-7在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用STS68-7F引物和STS68-7R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中扩增出的片段长度为131bp，则目标水稻材料含有抗稻瘟病基因Pi68(t)位点。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用STS68-7F引物和STS68-7R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中扩增出的片段长度为136bp，则目标水稻材料不含抗稻瘟病基因Pi68(t)位点；或用STS68-7F引物和STS68-7R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中同时扩增出131bp和136bp两个片段，则目标水稻材料为含有抗稻瘟病基因Pi68(t)位点的杂合水稻材料。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM STS68-7F引物1μL、10μM STS68-7R引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸5min。
6.水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记STS68-15；其特征在于，所述紧密连锁分子标记STS68-15为STS68-15F引物和STS68-15R引物PCR扩增的片段，目标片段长度165bp，所述STS68-15F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，STS68-15R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
7.权利要求6所述的水稻抗稻瘟病基因Pi68(t)紧密连锁分子标记STS68-15在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，用STS68-15F引物和STS68-15R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中扩增出的片段长度为165bp，则目标水稻材料含有抗稻瘟病基因Pi68(t)位点。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，用STS68-15F引物和STS68-15R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中扩增出的片段长度为184bp，则目标水稻材料不含抗稻瘟病基因Pi68(t)位点；或用STS68-15F引物和STS68-15R引物通过PCR扩增在目标水稻材料中同时扩增出165bp和184bp两个片段，则目标水稻材料为含有抗稻瘟病基因Pi68(t)位点的杂合水稻材料。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM STS68-15F引物1μL、10μM STS68-15R引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸5min。
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