CN102749450B - 西瓜花叶病毒的单克隆抗体 - Google Patents

西瓜花叶病毒的单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体。本发明提供的一种保藏号为CGMCC No.6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6。还提供了一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6产生。本发明的实验证明，本发明研制的西瓜花叶病毒单克隆抗体的特异性好、效价高，与购自ATCC的3个西瓜花叶病毒分离物均起反应，具有较好的广谱性，应用于植物病毒血清学诊断试剂中，特异型好，避免了交叉反应。

Description

西瓜花叶病毒的单克隆抗体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体。
背景技术
西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)在分类上属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus),此病毒被多种蚜虫以非持久方式传播。该病毒主要危害西瓜和甜瓜等葫芦科植物，引起花叶病，在国内西甜瓜产区广泛发生，造成的损失为30%～50%,甚至造成绝产，已经成为制约西瓜和甜瓜高产稳产最主要的因素之一。目前植物病毒的检测方法主要包括生物学、血清学和分子生物学方法，而单克隆抗体由于其是针对单一抗原决定簇产生的，所以具有特异性好的优势，为植物病毒免疫学方法的应用奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体及应用。
本发明提供了一种保藏号为CGMCC No.6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6。
本发明还提供了一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6产生。
所述的单克隆抗体在检测西瓜花叶病毒抗原中的应用也是本发明保护的范围。
所述的单克隆抗体在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用；或所述的单克隆抗体在制备检测西瓜花叶病毒的胶体金快速检测试纸条中的应用，上述应用均是本发明保护的范围。
含有所述的单克隆抗体的检测西瓜花叶病毒的试剂盒也是本发明保护的范围；或含有所述的单克隆抗体的检测西瓜花叶病毒的胶体金快速检测试纸条也是本发明保护的范围。
经筛选得到能稳定分泌的西瓜花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6，该杂交瘤细胞株6C6的分类命名为分泌西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2012年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6100。
本发明的实验证明，本发明研制的西瓜花叶病毒单克隆抗体的特异性好、效价高，与购自ATCC的3个西瓜花叶病毒分离物均起反应，具有较好的广谱性，应用于植物病毒血清学诊断试剂中，特异性好，避免了交叉反应。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的病毒和试剂如下：
南瓜，品种名：一味，购自北京世农种苗；
本生烟（Nicotiana benthamiana）：公众可以从中国检验检疫科学研究院获得；参考文献：黄峰，陈青，陈红运，白静，李桂芬等，黄瓜绿斑驳花叶病毒低风险参照物质的研制，植物检疫，2009年第4期，第23卷，24-26页。
昆诺藜(Chenopodium guinoa)：公众可以从中国检验检疫科学研究院获得；参考文献：李桂芬，朱水芳、周群等，侵染紫松果菊的黄瓜花叶病毒分离物的鉴定，植物保护，2007年第33卷，第1期，54-56页。
西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，缩写：WMV），购自ATCC，编号：PV-27；西瓜花叶病毒，购自ATCC，编号PV-379；西瓜花叶病毒，购自ATCC，编号PV-511。接种在南瓜上。
马铃薯A病毒(Potato virus A，缩写：PVA)，购自DSMZ,DSMZ编号：PV-0320，接种在本生烟（Nicotiana benthamiana）上。
莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus，缩写：LMV)，购自ATCC,编号：PV-63，接种在昆诺藜（Chenopodium quinoa）上。
李痘病毒（Plum pox virus，缩写：PPV），购自DSMZ，编号：PV-0213，接种在本生烟上。
碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠酶标抗体购自中杉金桥公司，货号:AP-2000。
样品抽提缓冲液为0.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)，配方如下：
Na2HPO4·12H2O      146.837g
KH2PO4              12.248g
先加入800ml蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1000ml。
实施例1、西瓜花叶病毒的单克隆抗体的制备和生物学特性的测定
一、西瓜花叶病毒的单克隆抗体的制备
1、病毒繁殖与纯化
病汁液的制备：将购自ATCC的西瓜花叶病毒毒源（PV-27）接种在南瓜上，18天采收病叶，病叶加2倍体积的0.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5,含0.1%巯基乙醇)，匀浆，双层纱布过滤，低速离心（3750×g,15min），取上清即为病汁液。
将上述病汁液中加入2.5%TRITON X-100、0.1mol/L氯化钠、4%PEG(分子量6000)，4℃搅拌3h，离心（18160×g,20min）。沉淀悬浮于0.5mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5,含0.5mol/L尿素）中，4℃搅拌过夜，离心（2860×g，15min）。取上清经20%蔗糖垫离心（210000×g,2.5h），沉淀悬浮于0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）中，4℃搅拌3h，离心(2860×g,10min），上清液即为纯化的西瓜花叶病毒制剂。
2、小鼠免疫
将纯化的西瓜花叶病毒制剂在与其同体积的弗氏完全佐剂中乳化，乳化后对8周龄的BALB/c小鼠做腹腔注射，每只小鼠100μg纯化病毒。2周后，将纯化的西瓜花叶病毒制剂在与其同体积的弗氏不完全佐剂中乳化作第二次腹腔注射，每只小鼠100μg纯化病毒。2周后第三次免疫小鼠（同第二次）。融合前3d加强免疫，加强免疫是采用200μg纯化的西瓜花叶病毒制剂直接注射小鼠腹腔。
3、杂交瘤细胞的筛选
将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，用纯化的西瓜花叶病毒制剂4μg/ml的浓度包被酶标板，采用间接ELISA进行测定。对阳性孔的细胞用有限稀释法克隆3次，使阳性率达100%，阳性克隆细胞及时冻存。
经间接ELISA法筛选，3次亚克隆化获得了1株能稳定分泌西瓜花叶病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:8000。
经筛选得到能稳定分泌的西瓜花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6，该杂交瘤细胞株6C6的分类命名为分泌西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2012年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6100。
4、单克隆抗体的制备
将上述筛选得到的杂交瘤细胞株6C6 CGMCC No.6100置于细胞培养基（含体积百分含量为20%的胎牛血清的DMEM培养基）中，放置在二氧化碳培养箱中培养72小时（96小时），得到6C6培养上清，即为单克隆抗体。
DMEM培养基，购自ATCC，货号30-2002；上述培养时间3天，培养条件：温度37℃，二氧化碳浓度5%，pH 7.0。
用G蛋白柱（G蛋白柱购自GE公司，产品目录号为17-0404-01）对6C6培养上清进行纯化（完全按照G蛋白柱的使用说明进行操作），得到纯化单克隆抗体（浓度为0.63mg/ml），-20℃保存。
二、单克隆抗体生物学特性的测定
1、效价的测定
方法：①用纯化西瓜花叶病毒4μg/mL的浓度包被酶标板，37℃孵育2h,洗酶标板。②用含5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液封板，37℃孵育30min，洗酶标板。③将由上述一得到的6C6培养上清（单克隆抗体）按一定比例稀释加入到酶标板中，37℃孵育2h，洗酶标板。④加入1：1000稀释的碱性磷酸酶标记的马抗小鼠抗体，37℃孵育2h。洗酶标板。⑤加入底物溶液，室温避光孵育60min后用酶标仪测定405nm波长下各孔的吸收值，结果见表1。
表1为效价的测定结果
  处理   OD405nm值
  6C6培养上清1:100稀释   1.518
  6C6培养上清1:500稀释   1.046
  6C6培养上清1:1000稀释   0.634
  6C6培养上清1:2000稀释   0.429
  6C6培养上清1:4000稀释   0.213
  6C6培养上清1:8000稀释   0.173
  6C6培养上清1:16000稀释   0.079
  SP2/0细胞培养上清   0.068
因此，6C6培养上清（单克隆抗体）效价为1:8000。
2、单克隆抗体特异性测定
采用TAS-ELISA方法，检测单克隆抗体分别与西瓜花叶病毒同属病毒-马铃薯A病毒、莴苣花叶病毒、李痘病毒有无交叉反应。
1）、样本的制备
将西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus）PV-27接种在南瓜上，18天采收感染西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus）PV-27病叶；
马铃薯A病毒(Potato virus A)PV-0320接种在本生烟（Nicotiana benthamiana）上，18天采收感染马铃薯A病毒(Potato virus A)PV-0320病叶；
莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus)PV-63接种在昆诺藜（Chenopodiumquinoa）上，18天采收感染莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus)PV-63病叶；
李痘病毒（Plum pox virus）PV-0213接种在本生烟上，18天采收感染李痘病毒（Plum pox virus）PV-0213病叶；
按照上述一的1病汁液的制备的方法，1g组织（叶片）加入10ml样品抽提缓冲液的比例，分别制备感染西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus）PV-27病汁液、感染马铃薯A病毒(Potato virus A)PV-0320病汁液、感染莴苣花叶病毒(Lettucemosaic virus)PV-63病汁液、感染李痘病毒（Plum pox virus）PV-0213病汁液，同时按照上述的方法，提取南瓜健康植株、本生烟健康植株、昆诺藜健康植株的汁液。
2）、单克隆抗体的特异性测定
①西瓜花叶病毒包被抗体（购自Agdia公司，货号：CAB 54001/0500）按照说明书使用浓度包被酶标板，37℃孵育2h,洗酶标板。②分别加入上述1）得到的各样本（见表2）的1：10稀释研磨的病汁液，4℃冰箱过夜，洗酶标板。③将上述一得到的浓度为3μg/mL纯化的单克隆抗体与1:1000稀释的碱性磷酸酶标记的马抗小鼠酶标抗体混合均匀后一起加入到酶标板中，37℃孵育4h，洗酶标板。④加入底物溶液，100μL/孔（底物溶液：二乙醇胺（C4H11NO2）97mL，硝基苯磷酸二钠1g，蒸馏水(H2O)600mL，用盐酸(HCl)调pH值至9.8,然后用蒸馏水定容至1L；4℃储存），37℃避光放置，90min时读数。
结果见表2，从表2可以看出，单克隆抗体特异性好，与马铃薯A病毒、莴苣花叶病毒、李痘病毒没有交叉反应。
表2单克隆抗体的特异性
  处理   OD405nm值
  西瓜花叶病毒（PV-27）1:10稀释的病汁液   2.407
  马铃薯A病毒（PV-0320）1:10稀释的病汁液   0.139
  莴苣花叶病毒（PV-63）1:10稀释的病汁液   0.102
  李痘病毒1:10（PV-0213）稀释的病汁液   0.123
  南瓜健康植株1:10稀释汁液   0.146
  本生烟健康植株1:10稀释汁液   0.115
  昆诺藜健康植株1:10稀释汁液   0.119
3、单抗与西瓜花叶病毒不同分离物的反应
1）、样本的制备
将西瓜花叶病毒PV-27、西瓜花叶病毒PV-379和西瓜花叶病毒PV-511分别接种在南瓜上，18天采收感染西瓜花叶病毒PV-27病叶、感染西瓜花叶病毒PV-379病叶和感染西瓜花叶病毒PV-511病叶；
按照1g组织加入10ml样品抽提缓冲液的比例，分别制备感染西瓜花叶病毒PV-27的病汁液、感染西瓜花叶病毒PV-379的病汁液和感染西瓜花叶病毒PV-511病汁液，同时按照上述的方法，制备南瓜健康植株汁液。
2）、TAS-ELISA检测
方法同2的2），结果见表3所示，从表3可以看出，西瓜花叶病毒单克隆抗体与PV-27、PV-379、PV-511均呈阳性反应。
表3单抗与西瓜花叶病毒不同分离物的反应
  处理   OD405nm值
  西瓜花叶病毒PV-27 1：10稀释   2.407
  西瓜花叶病毒PV-379 1：10稀释   2.014
  西瓜花叶病毒PV-511 1：10稀释   2.056
  南瓜健康植株叶片1:10稀释   0.146

Claims (6)

1.保藏号为CGMCC No.6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6。
2.由权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6产生的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测西瓜花叶病毒的胶体金快速检测试纸条中的应用。
5.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测西瓜花叶病毒的试剂盒。
6.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测西瓜花叶病毒的胶体金快速检测试纸条。
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