CN104513811B

CN104513811B - 分泌抗西瓜花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN104513811B
Application number: CN201410628926.5A
Authority: CN
Inventors: 吴建祥; 周雪平; 陈浙; 谢艳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2034-11-10
Also published as: CN104513811A

Abstract

本发明公开了一种分泌抗西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用纯化的西瓜花叶病毒（WMV）的病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗WMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C5，其保藏号为CGMCC No.9340。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达10^‑7，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。该株单抗与WMV有特异性反应。利用1C5单抗建立的检测蚜虫和白南瓜中WMV的dot‑ELISA检测病毒。该杂交瘤细胞株1C5及其单抗的获得和相关血清学检测方法的建立为该病毒病的诊断、预报及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗西瓜花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus, WMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）重要成员，由蚜虫进行非持久性传播。WMV分布于全世界各地，主要集中于温带和地中海地区。1954年，美国的Anderson等人首次在Florida的西瓜上发现了该病毒。1965年，R.E.Webb和H.A.Scot在西瓜上最早分离得到了两种危害西瓜的病毒，并根据寄主范围的差异和交互保护作用的有无将其分为两株系，分别命名为WMV-1和WMV-2。后来，Purcifull在研究中发现，WMV-1实际上是PRSV的一个株系，在西瓜上大量发生并广泛分布于世界的病毒是WMV-2，此名称也被沿用至今，现在将其称为WMV。

WMV在国内广泛发生，在陕西、山东、云南、辽宁、山西、新疆、河南和黑龙江等地均获得了不同的分离物。自然条件下，WMV可侵染葫芦科、藜科、豆科等27科170多种植物，并常与番木瓜环斑病毒西瓜株系（Papaya ringspot virus, PRSV-W）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaic virus, CMV）、小西葫芦黄化花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV）、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus, SqMV）、南瓜曲叶病毒（Squash leaf curlvirus,SLCV）和莴苣侵染性黄化病毒（Lettuce infection yellow virus, LIYV）、烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus, TRSV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）等病毒复合侵染。

WMV病毒粒子具有典型的Potyvirus属病毒形态，病毒粒子外无包膜，呈线状，大多弯曲，长730-765nm，直径11-13nm。病毒粒子中5%的成分为核酸，粒子包含1分子线状单链RNA，长约10kb。病毒粒子中95%的成分为蛋白质，1个结构蛋白，9个非结构蛋白。病毒粒子在CsCl中的浮力密度是1.32 g.cm^-3，沉降系数为150S，病毒汁液的稀释限点为10^-3-10^-5，钝化温度为55-65℃，体外存活期为6-18天。

该病毒粒子主要存在于表皮和叶肉细胞的细胞质中，内含体通常以一定的形状存在于受侵染的细胞中，一般以卷筒状和片层状聚集在细胞质和细胞核中。它们中有些包含有病毒粒子，有些没有病毒粒子。WMV在世界范围内广泛发生，不同地区针对不同的分离物分别进行了不同的生理学和病理学的研究，并对病毒侵染寄主后引起的结构学变化进行了超微观察，发现受WMV侵染的植株细胞膜受到严重的破坏，细胞质外渗，电导率值增加，并且叶绿体、线粒体的膜结构明显受损。这一系列的指标说明寄主在受WMV侵染后，寄主的部分细胞器受到病毒的危害，尤其是叶绿体，由于基粒片层的崩解，叶绿素大量解体，使得寄主组织出现褪绿的现象。

WMV在田间主要由蚜虫以非持久方式传播，Edwardson和Christie研究发现至少有29种蚜虫能够传播该病毒，如桃蚜（Myzus persicae）、棉蚜（Aphis gossypii）、麦二叉蚜（Schizaphis graminum）、苜蓿蚜（A. medicagenis）和麦长管蚜（Macrosiphum avenae）等。另外，WMV也可通过汁液机械方式和种子传播。

由于WMV在许多国家中试瓜类一类重要的病毒株系，因此在寻找抗源方面做了较多的研究工作。如在甜瓜上，Sowell和Demski用PI 180280，633-3，PI 180283，PI 403994，Criollo和Hales Best等4个品系2个品种对WMV-1和WMV-2的抗性进行研究，结果发现PI180280，633-3，PI 180283都对WMV-1具有抗性，但都感WMV-2，而PI 403994感WMV-1但抗WMV-2.。又如在西瓜上，Provvidenti研究来自Nigeria的Citrullus colocynthis，发现PI494528，PI 494532对WMV-2具有一定的抗性，并且该野生种与一些西瓜栽培种具有很强的亲和性，已被利用于抗病毒育种。

另外，在转病毒抗病育种方面，国内外对转WMV-2 CP基因的工作都有大量报道，通过转WMV-2 CP基因不仅可以获得新的抗WMV-2的新的品系或者可以利用的抗原材料，而且可以进一步对转WMV-2 CP基因的植株可能的抗病毒基因进行分析研究。1991年，黄学森等将WMV-2 CP基因插入了双元载体获得可以在高等植物中表达的质粒PIW，通过农杆菌介导的方法筛选出了抗WMV-2的西瓜品种。2000年王慧中等将WMV-2 CP基因转入黄瓜植株，获得的转基因子一代植株对WMV-2表现出较强的抗性，可以延迟发病时间，减轻发病程度。2003年，王慧中等又运用农杆菌转化技术把WMV-2 CP基因导入西瓜，获得的转基因工程植株及其纯合株系（尤其是R4T32-7株系）表现出对WMV-2的高度抗性。1998-2003年，中国农业大学生物技术国家实验室、新加坡国立大学、山西金鼎生物种业有限公司合作，针对危害西瓜的3种主要病毒，将WMV-2外壳蛋白基因、ZYMV复制酶基因、CMV复制酶基因，通过农杆菌介导，成功导入西瓜植株。经分子检测和抗病毒鉴定，外源基因均明显表达，具有耐病性，培育成了转基因抗病毒西瓜新材料BH-1。

近几年西瓜病毒病的发生呈上升趋势，我国大部分地区因西瓜病毒病造成的损失为30%-50%，甚至绝产，由WMV引起的病毒病已经成为制约瓜类高产稳产最主要的因素之一。

针对西瓜花叶病毒单克隆抗体的制备展开工作。当前西瓜花叶病毒病的预警和监测体系尚不完善，甚至很多主要流行区并未进行相关预测和防控工作。另外，目前仅用田间观测、RT-PCR检测、电镜观察等方法来检测该病毒，这几种方法效率低，并不适合大批量样品检测。而血清学的方法操作简单，特异性好，且可以同时处理大量样品，但必须依赖于特异性的病毒单抗。因此，利用杂交瘤技术制备了1株能分泌抗WMV单抗的杂交瘤细胞1C5，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，从而为我国西瓜花叶病毒病的早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

分泌抗西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C5，它能分泌抗西瓜花叶病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株1C5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No. 9340，分类命名为：分泌抗西瓜花叶病毒(WMV)单抗杂交瘤细胞。

抗西瓜花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与西瓜花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，能用于传毒介体蚜虫体内西瓜花叶病毒的检测。

抗西瓜花叶病毒的单克隆抗体仅与西瓜花叶病毒有特异性免疫反应，而与小西葫芦黄化花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻条纹病毒、烟草花叶病毒均不发生免疫反应。

抗西瓜花叶病毒单克隆抗体在抗西瓜花叶病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株1C5分泌抗西瓜花叶病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测西瓜花叶病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测西瓜花叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物及蚜虫中的西瓜花叶病毒的检测。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测WMV的灵敏度分析；

生物保藏杂交瘤细胞株1C5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCCNo.9340。

具体实施方式

分泌抗西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C5于2014年7月3日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 9340，它能分泌抗西瓜花叶病毒的单克隆抗体。

抗西瓜花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株1C5能大量分泌抗西瓜花叶病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立的检测WMV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间WMV的检测，从而为我国西瓜花叶病毒病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

用下面的操作步骤提纯病毒粒子：

1)将大研钵和组织搅拌器预冷；

2)称取500g白南瓜病叶，每100g病叶中加入 pH 7.5的0.5M磷酸盐缓冲液(即PB缓冲液）200ml（含0.01M Na-EDTA和0.1%巯基乙醇），匀浆2分钟后用双层尼龙纱布过滤，滤液离心（6000r/min, 20min）去植物组织残渣；

3)所得上清液边搅拌边滴加2.5% Triton X-100, 4% PEG（分子量为6000）和0.1mol/L NaCl, 4℃搅拌4h以上；

4)离心（11000r/min, 15min）得沉淀；

5)沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂和0.5M脲)充分洗涤，离心（6000r/min, 15min）后吸出上清置于离心管，沉淀再洗涤，离心反复3次；

6)合并上清液，超速离心（33000r/min，100min）所得沉淀悬浮后离心（8000r/min,15min）；

7)合并上清液再超离心（33000r/min，100min），离心管底部加有20%-30%蔗糖垫；

8)所得沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂）悬浮，悬浮液即为病毒提纯液；

9）用电子显微镜观察提纯样品，发现大量高纯度的西瓜花叶病毒粒子。

2.免疫动物

用WMV提纯病毒免疫四周龄体重18-20g BALB/C 雌性小鼠。即WMV提纯病毒粒子35µL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5：1的比例，在无血清的RPMI-1640（Gibco）培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5 % CO2的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-30%时，以感染WMV病毒的白南瓜叶片和提纯病毒为抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获130个阳性孔。选择15个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗WMV的特异性单抗的杂交瘤细胞株1C5。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5. 单克隆抗体的特异性检测

用感染小西葫芦黄化花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻条纹病毒、烟草花叶病毒的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以感染西瓜花叶病毒的病叶汁液为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为：上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100ul/孔，37℃ 1-2 小时；PBST洗涤三次后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记羊抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，1C5单抗对WMV有特异性反应，而与小西葫芦黄化花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻条纹病毒、烟草花叶病毒和健康植物均无特异性反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、 IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果显示，1C5单抗亚类为IgG1、kappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价达到10^－7。

二、病毒免疫学检测方法及其试剂盒

1.以单抗为核心建立抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测病毒

ACP-ELISA方法的操作步骤：

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 30（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液100ul/孔加入ELISA板，以WMV病叶为阳性对照，健叶为阴性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

检测结果发现该单抗建立的上述ACP-ELISA方法能很好地检测植物样品中的WMV病毒。

ACP-ELISA方法进行灵敏度检测：

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1：20至10240作倍比稀释分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：5120倍稀释的病叶汁液检测仍呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：5120，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

2. dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

2.1 dot-ELISA检测葫芦科植物中WMV方法的建立及其田间样品检测

将白南瓜叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，同时设置健康和感病白南瓜叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30min； NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3-4次，每次3 min； NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min; PBST洗膜4-5次，每次3min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L TrisCl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测白南瓜病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明1C5单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测WMV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当白南瓜叶片稀释到1:5120倍（w/v, g/mL）时，以1C5单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:5120倍稀释（图1）。

用建立的dot-ELISA方法对2014年采自浙江温岭田间疑似发病葫芦科样品进行检测，结果发现，40个检测样品中有15个样品产生紫色的阳性斑点，阳性样品进一步用PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到WMV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染WMV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于葫芦科样品中西瓜花叶病毒的检测。

2.2 dot-ELISA检测蚜虫体内WMV方法的建立及其田间样品检测

单头蚜虫放入0.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入20 μL PBS (0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂蚜虫后，取3 μL 上清点到NC膜上，膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测植物中WMV方法相同，不同的只是二抗为适度稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，显色底物是HRP的显色底物，即TMB显色底物。同时设非带毒和带毒的蚜虫作为阴性和阳性对照。

用方阵试验确定检测蚜虫的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明1C5单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:4000和1:6000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测蚜虫体内WMV的dot-ELISA方法，检测结果表明携带WMV的蚜虫呈现蓝色斑点，而无毒的蚜虫没有任何显色反应，即建立的dot-ELISA方法能特异性地检测蚜虫体内的WMV。

用建立的dot-ELISA方法对2014年采自浙江杭州人工饲喂获毒的和无毒的蚜虫进行检测。结果发现， 110头蚜虫检测样品中有58头产生蓝色的阳性斑点，而无毒的蚜虫没有产生任何蓝色斑点。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到WMV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染WMV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于蚜虫样品中西瓜花叶病毒的检测。

3 西瓜花叶病毒dot-ELISA检测试剂盒（检测葫芦科植物和蚜虫样品）

1）试剂盒主要成分：

WMV 单克隆抗体1管 0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

HRP标记的羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

NBT/BCIP底物各1瓶分别为2 ml和1ml

TMB底物 1瓶 10 ml

阳性对照1（含WMV叶片汁液） 1管 2 ml

阳性对照2 （带毒WMV蚜虫匀浆液） 1管 2 ml

阴性对照1（健康白南瓜叶片汁液）1管 2 ml

阴性对照2（非带毒蚜虫匀浆液） 1管 2 ml

抗体稀释液（10X） 1瓶 80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2）检测葫芦科植物样品的操作步骤：

a.将葫芦科样品叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；

b.病汁液 5000 rpm离心3 min;

c. 取3 μl上清点到NC上，同时设置健康和感病白南瓜叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min;

d. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e. NC膜放入1:2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min；

f. 用PBST洗膜3-4次，每次3 min； NC膜放入1:3000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min;

g. PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h. 待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）检测蚜虫样品的操作步骤：

a.单头蚜虫放入0.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入10-50 μL PBS(0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂蚜虫后，取3 μL 上清点到NC膜上，同时设置带毒和非带毒的蚜虫分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min；

b. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

c. NC膜放入1:4000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min；

d. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:6000倍稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min；

e. PBST洗膜4～5次，每次3 min；膜放入TMB底物液中反应，肉眼观察结果；

f.待阳性对照显色明显(蓝色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

4）保存及有效期于2～8℃避光保存，有效期12个月。

5）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

KH₂PO₄ 0.2 g

Na₂HPO₄12H₂O 3g

叠氮化钠 0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

ELISA洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。

Claims

1.一种分泌抗西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C5，其特征在于能分泌抗西瓜花叶病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株1C5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9340。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株1C5分泌的抗西瓜花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单抗与西瓜花叶病毒有特异性免疫结合反应，能用于传毒介体蚜虫体内西瓜花叶病毒的检测。

3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株1C5分泌的抗西瓜花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体仅与西瓜花叶病毒有特异性免疫反应，而与小西葫芦黄化花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻条纹病毒、烟草花叶病毒均不发生免疫反应。

4.一种如权利要求2所述的抗西瓜花叶病毒单克隆抗体在西瓜花叶病毒检测上的应用，其特征在于应用于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。