CN105624120B

CN105624120B - 分泌抗马铃薯s病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN105624120B
Application number: CN201610096088.0A
Authority: CN
Inventors: 周雪平; 吴建祥; 宋革
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2016-02-22
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2036-02-22
Also published as: CN105624120A

Abstract

本发明公开了一种分泌抗马铃薯S病毒(PVS)单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。利用差速离心法提纯的PVS病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗PVS单抗的杂交瘤细胞株16C10，其保藏号为CGMCC No.12002。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10^‑7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与34kDa的PVS外壳蛋白亚基有特异反应。利用16C10单抗建立检测马铃薯植株中PVS的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue blot‑ELISA检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:81920和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。抗PVS单抗的制备及其检测方法的建立为该马铃薯病毒病的诊断和检测、流行病学分析及科学防控提供物质和技术支撑。

Description

分泌抗马铃薯S病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗马铃薯S病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)也称作马铃薯潜隐病毒，是危害马铃薯的主要病毒之一，该病毒属于乙型线型病毒科(Betaflexiviridae)麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)的成员。PVS在1948年首次报道于荷兰，随后在世界各马铃薯种植地区皆有报道，且其分布十分广泛。目前在我国北方的内蒙古、黑龙江、辽宁、河北、山东、青海以及南方的广西、湖南、四川、浙江、福建、贵州等地均被发现，为给马铃薯的生产造成了严重的损失。PVS在大多数马铃薯品种上可引起叶脉颜色变深、叶片粗缩、叶尖下卷、叶色变浅；有的马铃薯品种感病后产生轻度斑驳、脉带；有的品种感病后期变成青铜色，严重皱缩，叶面产生小的坏死斑，甚至落叶。研究发现该病毒可以通过汁液接触和蚜虫介体传播到茄科和藜科植物上，且该病毒常常与其他病毒复合侵染马铃薯造成更为严重的危害。PVS的基因组全长8.4-8.5kb，包含六个开放阅读框(ORF)，其中ORF 5编码一个34kDa的外壳蛋白(CP)。通过电镜观察纯化的病毒粒子发现该病毒为直径为10-15nm，长约610-700nm的弯曲线状病毒。

为了调查我国马铃薯上PVS的发病情况、强化我国马铃薯S病毒病检测和诊断技术及科学指导防控，急需建立检测PVS经济、高通量的检测技术。目前，对PVS的检测和诊断多采用低效率的指示植物、电镜观察、RT-PCR等方法进行小样本检测。本发明以纯化的PVS病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗PVS的特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测PVS的高通量的血清学方法及试剂盒，从而为我国马铃薯S病毒的检测和诊断、流行病学的调查、无毒种薯的生产、病毒基因组功能的分析及其科学防控体系的建立提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗马铃薯S病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗马铃薯S病毒单抗的杂交瘤细胞株16C10，它能分泌抗马铃薯S病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12002。

一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯S病毒单抗，抗马铃薯S病毒单抗腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与马铃薯S病毒34KDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染PVS病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释(w/v,g/mL)。

抗马铃薯S病毒单抗能与马铃薯S病毒有特异性反应，而不与马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒和健康的马铃薯叶片粗提液反应。

抗马铃薯S病毒单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法及免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗马铃薯S病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue blot-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测马铃薯S病毒；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测马铃薯S病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体可有效地用于田间马铃薯S病毒的检测和诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、脱毒种薯生产、抗性育种、科学防控等方面。

附图说明

图1 dot-ELISA方法检测PVS的特异性分析；

图2 dot-ELISA方法检测PVS的灵敏度分析；

图3 dot-ELISA田间检测PVS代表性结果；

图4 RT-PCR对田间疑似发病马铃薯样品检测结果；

图5 Tissue blot-ELISA田间检测PVS代表性结果。

生物保藏

杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCCNo.12002,分类命名为分泌抗马铃薯S病毒(PVS)单抗杂交瘤细胞。

具体实施方式

分泌抗马铃薯S病毒单抗的杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12002，它能分泌抗马铃薯S病毒的单抗。

一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯S病毒单抗，抗马铃薯S病毒单抗腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗能与马铃薯S病毒34KDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染PVS病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释(w/v,g/mL)。

抗马铃薯S病毒单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗马铃薯S病毒单抗，且该细胞株分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测PVS的高通量的血清学方法可成功应用于田间PVS的检测，从而为我国马铃薯S病毒病检测和诊断、脱毒种薯的生产、科学防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

用下面的操作步骤提纯病毒粒子：

1)将组织匀浆器在冰上预冷；

2)称取马铃薯组织200g，每100g组织加入200mL 0.5M磷酸盐缓冲液即PB缓冲液(含0.01M Na-EDTA和0.1％巯基乙醇，pH 7.5)，在组织匀浆器中匀浆5-10min使马铃薯组织充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6 000rpm离心20min去除植物残渣；

3)所得的上清液在搅拌中加至终浓度为2.5％Triton X-100、4％PEG(分子量为6000)和0.1M NaCl，然后4℃搅拌4h以上；

4)11 000rpm离心15min去上清；

5)用pH 7.5的0.5M PB(含0.01M MgCl2和0.5M脲)将沉淀充分悬浮，6 000rpm离心15min后将上清收集于烧杯中于4℃放置，沉淀再悬浮、离心，重复3次；

6)将上述离心上清液合并，33 000rpm超速离心100min；

7)所得沉淀用PB悬浮后8 000rpm离心15min，收集上清液，沉淀再悬浮、离心，重复3次；

8)将合并上清液加到超离管中，用注射器针头吸取30％蔗糖加到超离管的底部形成蔗糖垫，33 000rpm超速离心100min；

9)所得沉淀用适量pH 7.5的0.01M PB(含0.01M MgCl2)悬浮，33 000rpm超速离心100min，去除蔗糖垫；

10)所得沉淀用0.01M PB悬浮，所得悬浮液即为病毒提纯液；

11)病毒提纯液经3％磷钨酸(pH 6.7)负染后，置于JEOL JEM-1200EX电镜下观察发现大量高纯度的PVS粒子。

2.免疫动物

用提纯的PVS病毒粒子免疫8周龄BALB/c雌性小鼠：PVS病毒粒子100μL/只与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后经腹部皮下多点注射0.2mL每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2mL每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3d后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按7:1的比例在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1 500rpm离心5min后去除培养基，含有细胞的离心管在37℃水浴中加入1mL 50％PEG(分子量1500)融合剂，融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1 500rpm离心5min，吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5d后，用HAT培养基换液一次，第10d用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-20％时，以感染PVS的马铃薯病叶粗提液为包被抗原用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获264个阳性孔。对264个孔进行特异性分析，筛选出12个呈特异性的细胞株，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗PVS特异性单抗的杂交瘤细胞株16C10。经4个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体腹水制备及纯化

8周龄左右BALB/c小鼠腹腔注射0.3mL降植烷，7-10d后腹腔注入约7×10⁵个杂交瘤细胞，7-10d后可见小鼠腹部明显膨大，用针头采取腹水，8 000rpm离心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。

取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，室温下边加边搅拌加辛酸(30μl/mL腹水)，4℃澄清1h，12 000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3 000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃透析24h后即获纯化的单抗，-70℃保存。

6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体进行双抗夹心酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)，结果发现16C10单抗抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链。以提纯的病毒粒子为抗原，用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，分析结果表明单抗腹水效价达10^-7。

7.单克隆抗体的特异性分析

用感染马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)的病叶粗提液包被ELISA板，以马铃薯健康叶片粗提液作阴性对照，以感染PVS的马铃薯病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA方法分析单抗的特异性。ACP-ELISA方法的步骤：上述病毒感染的病叶和健康叶片分别在研钵中研磨，按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆，5 000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h；PBST洗涤3次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入1:5 000倍稀释的单抗100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤3次后加:1:10 000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色30-60min，2M氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，与阴性OD值比值大于2.1的样品为阳性。结果发现，16C10单抗对PVS有强阳性免疫反应，而与感染PVA、PVX、PVY和PLRV的病叶和健康马铃薯组织粗提液均无任何免疫反应。

二、检测PVS免疫学方法及其试剂盒的建立

1.检测PVS的ACP-ELISA检测方法

1.1 ACP-ELISA方法的步骤：

1)叶片在研钵中研磨后按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆，5 000rpm离心3min后上清100μL/孔包被聚苯乙烯板，以感染PVS的马铃薯叶片组织作为阳性对照，以健康马铃薯叶片组织作阴性对照，4℃过夜或37℃2h；

2)PBST洗板3次，每次3min，每孔加入250μL含3％脱脂奶粉的PBST封闭液，37℃封闭0.5h；

3)PBST洗涤3次后用封闭液适当稀释的单抗腹水100μL/孔，37℃1-2h；

4)PBST洗涤3次后加入适当稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃1-2h；

5)PBST洗涤4次后加PNPP底物于室温显色30-60min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或2M氢氧化钠终止反应后用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N>2.1作为阳性判断标准。

1.2 ACP-ELISA检测方法的建立：

采用方阵试验确定ACP-ELISA方法中抗体的最适工作浓度，即用1:20倍稀释的(w/v,g/mL)PVS病叶粗提液作为抗原包被ELISA板；ELISA板纵向从上而下加入用抗体稀释液从1:100至1:12 800倍比稀释的PVS检测单抗，纵向从左到右加入用抗体稀释液从1:1 000至1:512 000倍比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗，健康马铃薯植物稀释粗提液作为阴性对照，每个处理设3次重复，以P/N>2.1作为阳性判断标准，确定ACP-ELISA的最适抗体工作浓度，结果显示16C10单抗以1:6 000倍稀释，而AP标记的羊抗鼠IgG二抗以1:8 000倍稀释为最适工作浓度，根据最适工作浓度建立检测PVS的ACP-ELISA方法。

1.3 ACP-ELISA方法检灵敏度和特异性的确定

在抗体最适工作浓度下，将感染PVS病叶粗提液用ELISA包被液倍比稀释后进行ACP-ELISA测定，结果表明，ACP-ELISA检测感染PVS病叶的灵敏度达到81 920倍稀释(w/v,g/mL)，说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。该方法检测PVS病叶粗提液呈很强的阳性反应，检测感染PVA、PVX、PVY和PLRV的病叶组织和健康的马铃薯组织呈阴性反应，且阴阳性结果对比差异极显著，说明该建立的检测方法和单抗的特异性很好。

2.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

2.1 dot-ELISA检测马铃薯中PVS方法的建立及其田间样品检测

dot-ELISA检测马铃薯植物中PVS方法的步骤：将称重后将马铃薯植物组织在研钵中研磨后按1:10-30(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后匀浆；匀浆液5000rpm离心3min；取2.5μL上清点到硝酸纤维素膜(NC)上，同时设置健康和感染PVS的马铃薯叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20min；NC膜浸入到含3％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果，待阳性对照显色明显而阴性没有任何显色时在自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

用常规方阵试验确定dot-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明16C10单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5 000和1:8 000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测病叶中PVS的dot-ELISA方法。特异性分析表明，该方法检测PVS呈特异性阳性反应，而检测感染PVA、PVX、PVY、PLRV病叶和健康的马铃薯叶片均呈阴性反应(图1)。灵敏度分析表明，当感染PVS马铃薯病叶粗提液稀释到1:10 240倍(w/v,g/mL)时，用建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:10 240倍稀释(图2)。

用建立的dot-ELISA方法对2015年采自云南的田间疑似发病马铃薯样品进行检测，结果发现，22个马铃薯检测样品中有14个样品产生紫色的阳性斑点(图3)。样品同时用RT-PCR方法进行分析，结果表明所有dot-ELISA阳性样品中均扩增到PVS特异性的基因片段，而所有dot-ELISA检测阴性的样品中均未扩增到基因片段(图4)，PCR产物核酸测序表明阳性样品确实感染PVS。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于马铃薯样品中马铃薯S病毒的检测。

3.检测PVS的Tissue blot-ELISA方法的建立及其田间样品检测

3.1 Tissue blot-ELISA操作步骤:

1)样品准备：取马铃薯的叶片或茎，将嫩叶卷成圆筒状用刀片切一个横断面，嫩茎直接切成横断面；

2)点样：将横断面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染PVS组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；

3)封闭：NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭1h；

4)一抗孵育：NC膜放入适当稀释的PVS单抗中室温孵育1h；

5)二抗孵育：用PBST洗膜3次后NC膜放入适当稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG中室温孵育1h；

6)PBST洗膜4-5次，每次3min；

7)加底物显色：10ml显色缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中加入66μl NBT和33μl BCIP底物(Promega)混匀，将膜浸入显色液中进行显色反应，直至特异性斑点显色明显、阴性对照没有背景时将膜在去离子水中漂洗终止反应，记录显色结果。

3.2 Tissue blot-ELISA最适抗体工作浓度的确定及其田间样品检测

通过常规方阵实验确定单抗和酶标二抗的最适工作浓度。选择检测灵敏度和特异性最高时一抗、酶标二抗稀释度组合为Tissue blot-ELISA的最适工作浓度。结果发现单抗16C10和AP标记的羊抗鼠二抗分别稀释1:5000和1:7000倍时Tissue blot-ELISA方法的检测灵敏度和特异性最佳，根据抗体最适工作浓度建立Tissue blot-ELISA方法，并利用该方法对2015年采自云南的田间疑似发病马铃薯样品进行检测，结果发现，22个马铃薯检测样品中有14个样品产生紫色的阳性斑点(图5)，样品进一步用RT-PCR检测，结果表明所有dot-ELISA检测阳性样品均扩增到PVS特异性PCR产物，而所有dot-ELISA检测阴性样品均为扩增到任何特异性PCR产物(图4)。PCR产物核酸测序表明阳性样品确实感染PVS，说明该Tissueblot-ELISA方法能准确、可靠地用于马铃薯样品中马铃薯S病毒的检测。

4.马铃薯S病毒dot-ELISA检测试剂盒

1)试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃

硝酸纤维素膜(NC)10张

2)检测马铃薯样品的操作步骤：

a.马铃薯植物组织称重、在研钵中研磨，按1:10-30比例(w/v,g/mL)加入0.01MPBS(pH7.4)后匀浆；

b.匀浆液5 000rpm离心3min；

c.取2.5μl上清点样于NC膜上，同时设置健康和感染PVS的马铃薯植物组织分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；

e.NC膜放入1:4 000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

f.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:5 000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；

g.PBST洗膜4-5次，每次3min；

h.66μl NBT和33μl BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

3)保存及有效期：

于2-8℃避光保存，有效期12个月。

4)缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)：

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000mL

ELISA洗涤液(0.01M PBST)：1000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20

ELISA封闭液：0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v,g/mL)。

Claims

1.一种分泌抗马铃薯S病毒单抗杂交瘤细胞株16C10，其特征在于能分泌抗马铃薯S病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12002。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯S病毒单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与马铃薯S病毒34Kda的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释。

3.一种如权利要求2所述的抗马铃薯S病毒单抗在马铃薯S病毒检测上的应用，其特征在于以单抗为核心建立各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。