CN105950563A - 杂交瘤细胞株7e3及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用 - Google Patents
杂交瘤细胞株7e3及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种能持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株7E3，并由该细胞株分泌得到单克隆抗体7E3anti及其应用。本发明的单克隆抗体能够特异性地识别口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒，可用于双抗体夹心法检测口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒抗原浓度；或者用于竞争法检测口蹄疫A型病毒抗体水平，灵敏度高、特异性好，可用于疫苗生产、产品质检中对口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒抗原的检测或口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒疫苗免疫后抗体水平的评价。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域中的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用，特别是涉及口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株以及该抗体在检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒中的应用。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的传染病。FMDV目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)七个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。近十几年以来，全世界口蹄疫的流行态势发生了一些新的变化。一方面未消灭口蹄疫的国家和地区，口蹄疫继续流行，而另一方面已控制和消灭口蹄疫的国家和地区，也出现口蹄疫的发生和流行。从FAO/OIE口蹄疫参考实验室报告的资料来看，在1990-2002年之间，口蹄疫在世界范围内的流行还是非常严重的，七个型的口蹄疫均有流行，其中以O、A和Asia1型的流行较为严重。
FMDV属于微核糖核酸病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(aphthavirus)的成员。感染FMDV的细胞培养液，在电镜下观察有四种粒子。第一种，即最大粒子为完整病毒，直径23±2nm，沉降系数为146S，具有感染性，呈圆形或六角形，正二十面体对称，分子量6.9×106Da，无囊膜，在氯化艳中的浮密度为1.43g/mL，病毒由中央的核糖核酸核芯和周围的蛋白壳体所组成，成熟病毒粒子约含30％的RNA，其余70％为蛋白质。第二种为不含有RNA的空衣壳，直径21nm，沉降系数为75S，没有感染性，有型特异性和免疫原性。第三种为衣壳蛋白亚单位，其直径为7nm，沉降系数为12S-14S，无RNA，无感染性，有抗原性。第四种为病毒感染相关抗原(Virusinfection-associated antigen，VIA抗原)，沉降系数为4.5S，为病毒的非结构蛋白(病毒RNA聚合酶)，能诱发动物产生群特异抗体，无型特异性，在琼脂扩散试验中对各型口蹄疫病毒的抗体都呈现反应，可以应用VIA抗原检测各型口蹄疫病毒感染动物的血清抗体。
Re-A/WH/09病毒是口蹄疫A型的一个毒株，该毒株是由中国农业科学院兰州兽医研究所在A/WH/CHA/09毒株基础上通过反向遗传构建技术制备而来的，在BHK21细胞上遗传稳定，免疫原性好，疫苗的交叉保护性高，每毫升抗原表达量可达2μg以上，每毫升TCID50可达107.5以上。疫苗接种是目前特异性预防FMDV的可靠和有效手段。疫苗企业为提高疫苗的免疫保护作用，往往会把口蹄疫病毒多种血清型病毒毒株混合制成多价疫苗，比如金宇保灵生物药品有限公司生产的口蹄疫O、A、亚1三价疫苗，该疫苗中含有口蹄疫O型毒株(O/Mya98/XJ/2010)、口蹄疫A型毒株(Re-A/WH/09)和口蹄疫亚洲1型毒株(JSL/06)。疫苗中病毒含量的准确控制及免疫后抗体水平的有效监测是成功免疫的保障。
蔗糖密度梯度离心法是目前疫苗生产过程中对FMDV病毒浓度常用的定量方法，但是，该方法操作复杂，需时较长，一般3天左右，并且只能根据沉降系数对蛋白进行定量，同样沉降系数的蛋白或病毒无法区分，因此口蹄疫多价疫苗中每种毒株的含量无法单独测量。PCR方法(专利公开号CN104195268A、CN104212916A)是一个高灵敏的方法，但是对实验环境和人员的要求较高，且不用于疫苗生产过程中的定量检测。中国农业科学院兰州兽医研究所公布了一种采用多克隆抗体定量检测口蹄疫A型病毒的ELISA方法(公开号CN103091490A)。ELISA方法对实验环境和操作人员的要求较为简单，一般只需要一台酶标仪和水浴锅即可。中国农业科学院兰州兽医研究所公布的试剂盒采用了口蹄疫A型的兔抗血清和豚鼠抗血清两种多克隆抗体制成。虽然专利申请说明书中显示该方法具有较好的特异性，能够区分O型和亚洲1型，但是由于多克隆抗体往往针对多个抗原位点，且多克隆抗体生产时批间变异较大，因此，如采用特异性和重复性更好的单克隆抗体，效果可能会更佳。研制基于高灵敏度、高特异性的抗Re-A/WH/09毒株的单克隆抗体的ELISA检测试剂，不仅可用于疫苗生产过程中抗原的定量，也可用于口蹄疫多价疫苗中Re-A/WH/09病毒毒株的单独含量检测，且不受多价疫苗中口蹄疫其它毒株的干扰，这正是本发明所期望并能够达到的。
偶蹄动物免疫口蹄疫疫苗后，常通过检测口蹄疫抗体水平来评价疫苗的保护效果。对口蹄疫抗体水平的检测常采用竞争ELISA法或液相阻断ELISA法，市场上常见的产品有中国农业科学院兰州兽医研究所的液相阻断ELISA试剂盒和韩国进口竞争法ELISA试剂盒。广西壮族自治区动物疫病预防控制中心中公布了一种基于口蹄疫A型病毒VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法(专利文献公开号CN103554234A)，该方法采用了单克隆抗体，与液相阻断ELISA检测试剂盒比，符合率为95.8％，暂时不能从公开的信息确定抗体的特异性状况。胶体金免疫纸层析是一种基于抗原抗体的快速检测方法，可以在10-20分钟内完成检测，不需要大型的仪器设备，非常适合于现场检测，它可通过目测进行定性检测，也可配套小型的仪器实现定量检测。如能以单克隆抗体实现胶体金竞争法快速测量疫苗免疫后抗体的水平，在现场、野外或小规模的养殖场将会有很大的用途和意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种分泌口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体。
本发明以口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒为免疫原免疫小鼠，获得持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为7E3，该细胞株已于2016年6月24日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12674。
由杂交瘤细胞株7E3分泌的单克隆抗体命名为7E3anti，来源于小鼠属小鼠(Musmusculus)，也属于本发明的保护范围。
7E3anti的重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽；轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽。
序列表中的SEQ ID No：1由134个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID No：2由105个氨基酸残基组成。
编码单克隆抗体7E3anti的基因(7E3anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：4的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID No：3由402个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID No：4由315个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因7E3anti的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增本发明基因7E3anti中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
获得本发明的杂交瘤细胞株7E3的方法，可包括以下步骤：
1)用口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒作为免疫原免疫动物；
2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；
3)筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株7E3。
获得本发明单克隆抗体7E3anti的方法，在上述步骤的基础上增加以下步骤：
4)从杂交瘤细胞株7E3的培养液或接种杂交瘤细胞株7E3的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体7E3anti。
在上述方法中，步骤1)中的口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒可为活病毒或灭活病毒，优选为灭活病毒，浓度为10-1000μg/mL；用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。
步骤2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。
步骤3)中可以在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。
步骤4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒单克隆抗体7E3anti的杂交瘤细胞株7E3，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体7E3anti。
本发明的第二个目的是提供一种应用单克隆抗体7E3anti定量检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原的ELISA试剂盒，包括用7E3anti作为包被抗体包被的微孔板和用7E3anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。
所述用7E3anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用10mM pH7.2-7.6PBS将单克隆抗体7E3anti稀释成0.5-10μg/mL，加入微孔板中，100μl/孔，置于2-8℃过夜；拍干后，加入含0.5％(W/V)酪蛋白的10mM pH 7.2-7.6PBS，300μl/孔，置于2-8℃过夜(16-24小时)；拍干、干燥后真空装入铝箔袋中备用。
所述酶标抗体可用辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体7E3anti，然后用酶标记抗体稀释液(Na2HPO4·12H2O 3.23g，NaH2PO4·2H2O 0.15g，NaCl 8.75g，Proclin 3001.0mL，酪蛋白5g，胎牛血清100mL，酶稳定剂2.5g，Tween-20 0.25mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2-7.6)稀释成工作液，工作液的浓度为0.1-1.0μg/mL。
所述试剂盒还可包括显色液A液、显色液B液和终止液，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液，所述终止液为H2SO4溶液。
此外，为方便检测，所述试剂盒还可包括：稀释液，如pH 7.2-7.6 10mM PBS含蛋白的缓冲液；洗涤液，如PBST等常规的洗涤试剂。
为便于观测结果，所述试剂盒还可包括口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒阳性对照(阳性对照)，可用稀释液作为阴性对照使用。
用上述ELISA试剂盒定量检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原的方法，可包括以下步骤：
1)用单克隆抗体7E3anti包被微孔板，封闭经包被的微孔板；
2)加待测样品，洗板；
3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体7E3anti，洗板；
4)加底物显色；
5)终止反应；
6)测定OD450值。
上述检测方法中的反应条件及试剂均可按照常规方法进行选择。
步骤3)中可通过戊二醛法或过碘酸钠法将酶交联在单克隆抗体7E3anti上。
上述检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的ELISA试剂盒在口蹄疫疫苗生产过程中的应用也属于本发明，该应用是用所述ELISA试剂盒检测样品中口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原浓度，样品包括口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒疫苗生产原料、灭活液、浓缩液，或含有口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的多价疫苗(即对口蹄疫多价疫苗中Re-A/WH/09病毒毒株的单独含量检测)
本发明的第三个目的是提供一种检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体的胶体金试纸或检测卡、试纸盒。
用于检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体的胶体金试纸由样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜组成，硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，单克隆抗体7E3anti包被检测线，结合物释放垫上包被有用胶体金标记的口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原。原则上，可采用下面两种方式中的任何一种检测待测样品中的抗体水平：
1)以7E3anti包被硝酸纤维素膜，以口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原标记胶体金，此时与待测样品中的抗体形成竞争法检测模式；或者
2)以口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原包被硝酸纤维素膜，以7E3anti抗体标记胶体金，此时同样会与待测样品中的抗体形成竞争法检测模式。
其中，优选的是第一种方式，具体优选的胶体金试纸的制备方法包括以下步骤：
1、包被硝酸纤维素膜
用浓度为1-5mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白(购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)，用浓度为1-5mg/mL的单克隆抗体7E3anti包被检测线(T线)。操作：用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体7E3anti和羊抗兔免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，检测线和质控线间距为0.3-0.8cm，通常选择0.5cm，37℃干燥6-24小时后备用。
2、结合物释放垫的制备
2.1用胶体金标记口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原，方法为：在磁力搅拌下，向三角瓶中加入400mL纯化水，煮沸。加入1％(W/V)四氯化金溶液3.5mL，煮沸，再加入1％柠檬酸三钠溶液6mL，煮沸5分钟，冷却后保存于2-8℃；取1毫升胶体金溶液于离心管中，加入5-15μl 0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min，加入10μl浓度为100-1000μg/mL的口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原，混匀后静置30min，加入10μl20％(W/V)酪蛋白溶液，平衡5min，加入10μl 20％(W/V)PEG20000溶液，平衡30min，10000rpm离心10min，弃上清，加入100μl金标复溶液(含有2％(W/V)蔗糖、0.5％(W/V)酪蛋白、0.5％(W/V)BSA、0.1Triton X100和0.1％(W/V)SDS的硼酸缓冲液)，复溶后备用；按照同样程序制备兔IgG胶体金标记物。
2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上喷有胶体金标记的口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原和兔IgG，将复溶后的两种胶体金标记物按1:2-1:8的比例稀释后1:1混匀，然后按照6μl/cm的速度喷膜，37℃下放置2-6小时干燥，备用。
3、制备胶体金试纸
在PVC背板上先粘贴硝酸纤维素膜，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端粘贴吸水垫，在靠近检测线一端粘贴结合物释放垫和样品垫，得到用于检测口蹄疫A型病毒抗体的胶体金试纸，然后可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。
如将上述步骤制备的试纸装入塑料卡中，制成检测卡，并可进一步组装成试纸盒，该试纸盒对应于样品垫的部位设有加样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。配合免疫层析记录分析仪可实现定量/半定量检测。
以上所述胶体金试纸、检测卡或试纸盒在检测含有口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒疫苗免疫后抗体水平中的应用也属于本发明。该应用是采用竞争法原理检测标本中的口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体水平，检测过程包括：将待检样品滴在样品口位置，观测检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带，可以通过与临界值质控血清颜色深浅比较来判断阴、阳性，或通过仪器检测T线颜色深浅来定量测量口蹄疫A型抗体效价水平。
综上，本发明使用可以诱发机体产生免疫反应的口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒作为免疫原，采用常规杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株7E3，并由该细胞株分泌得到单克隆抗体7E3anti。本发明的单克隆抗体能够特异性地识别口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒，可用于双抗体夹心法检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原含量；或者用于竞争法检测口蹄疫A型病毒抗体的水平。实验证明，本发明的单克隆抗体特异性好，不与口蹄疫O型(O/GX/09-7)、O型(O/Mya98/XJ/2010)、O型(O/JMS/2000)、O型(OZK/93)、亚洲1型(JSL/06)病毒发生交叉反应。本发明基于高灵敏度、高特异性的抗Re-A/WH/09毒株的单克隆抗体的ELISA检测试剂，不仅可用于疫苗生产过程中对样品中病毒抗原的定量检测以监控生产原料、中间物和疫苗成品，也可用于口蹄疫多价疫苗中Re-A/WH/09病毒毒株的单独含量检测，且不受多价疫苗中口蹄疫其它毒株的干扰，将在口蹄疫病毒疫苗生产过程中对A型(Re-A/WH/09)病毒含量的检测以及包含口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒疫苗免疫后抗体水平的检测中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为单克隆抗体7E3anti的SDS-PAGE(8％)电泳检测结果；
图2为单克隆抗体7E3anti的亚型鉴定结果；
图3为双抗体夹心ELISA检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原的标准曲线；
图4为胶体金纸层析试纸条正面结构图和组装示意图；
图5为胶体金竞争法检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、获得持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞株7E3的获得方法，包括以下步骤：
1、动物免疫
以口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒灭活纯化液(由金宇保灵生物药品有限公司提供)作为免疫原，采用蔗糖密度梯度离心法测定浓度为293μg/mL，纯度≥85％。抗原与福氏完全佐剂(购于Sigma公司)等体积混合并充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只BalB/c小鼠(8-12周龄，雌性，SPF级动物培养，购自军事医学科学院实验动物中心)每次注射量为50μg。间隔两周后，等量抗原与福氏不完全佐剂(购于Sigma公司)等体积混合后腹腔注射进行第二次免疫。两周后，重复一次。一周后，尾静脉采血测抗体效价，选取抗体效价最高的小鼠于融合前三天，腹腔注射含100μg抗原的生理盐水溶液，以进一步增强免疫效果。
2、杂交瘤细胞的融合和筛选
用常规方法无菌收集小鼠的脾细胞，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞按5:1的比例在500g/L PEG4000(融合剂，购于Sigma公司)的诱导下进行融合。用HAT(购自Sigma公司)选择性培养液培养，培养条件为5％CO2、37℃。融合后10-15天取上清，采用间接ELISA法筛选分泌抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的杂交瘤细胞株。
间接ELISA法的操作步骤为：用100μL浓度为1.0μg/mL的口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒包板，拍干后，用0.5％酪蛋白封闭液(100mL pH 7.2-7.6 10mMPBS中加入0.5g酪蛋白，酪蛋白购于Sigma公司)封闭。以免疫小鼠血清1:1000为阳性对照，以细胞培养基和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG(购自美国ABCAM公司)100μL，最后测定450nm OD值，以OD450nm值大于阴性对照2倍为阳性判断依据。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆，具体方法如下：
1)将细胞悬液于HT(购自Sigma公司)培养液中计数细胞浓度，然后用该培养液稀释至每毫升分别含5、10和50个细胞的细胞悬液。
2)将上述稀释的细胞悬液分别加入含有饲养细胞的96孔培养板的小孔中，100μl/孔，使每孔分别含有0.5、1和5个细胞。
3)培养板在5％CO2 37℃下培养，每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。
4)克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3-1/2时，通过间接ELISA法测培养液上清抗体，选择阳性克隆。
5)再重复亚克隆步骤3次。
3、杂交瘤细胞的培养上清的特异性验证
经过亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株针对口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并根据克隆产生位置分别编号为7E3、3A9、5B2、4D6、6E8。
用间接ELISA法(方法见步骤2)检测上述杂交瘤细胞上清的特异性，即分别采用口蹄疫不同的毒株包被微孔板，将培养上清用pH7.2 10mM PBS稀释5倍后检测。结果如表1所示，其中特异性抗体为7E3克隆，另外四种为非特异性抗体。故选择7E3anti用于ELISA试剂盒和胶体金检测试剂的开发和制备。
表1杂交瘤细胞培养上清的特异性验证
4、杂交瘤细胞的传代培养及保存
将7E3杂交瘤细胞在含有10％胎牛血清的DMEM高糖(含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中继续进行培养、传代，培养到第10代后，杂交瘤细胞株7E3仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:200以上，表明获得了能够稳定传代，并可以持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞。7E3细胞按照常规哺乳动物细胞保存的方法保存，具体方法如下：
1)去掉细胞培养瓶中旧的培养液，加入含有10％(V/V)胎牛血清的DMEM高糖培养基，使细胞悬浮。
2)1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用细胞冻存液(二甲基亚砜：胎牛血清：DMEM高糖＝1：4：5)复溶制成悬液，浓度5.0×105细胞/mL。
3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。具体方法包括以下步骤：
配制0.4％(W/V)台盼兰溶液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100mL，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用pH 7.2-7.6 10mM PBS稀释至0.4％(W/V)。制备单细胞悬液，并作适当稀释。将细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀(终浓度0.04％)。在3分钟内，镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。计算活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。
4)将细胞无菌分装至1.8mL细胞冻存管(购自浙江拱东医疗科技有限公司)，每瓶0.5mL-1.0mL，拧紧瓶盖。
5)细胞冻存：4℃放置2小时，然后-20℃再放置2小时，之后液氮罐气态部分(-70℃)放置2小时，最后转入液氮长期保存。
按以上方法，以口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒为免疫原免疫小鼠，获得了持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为7E3。该细胞株已于2016年6月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12674。
实施例2、制备7E3单克隆抗体及抗体可变区测序
一、单克隆抗体的大量制备及纯化
1、腹水制备：选择10-12周龄BALB/c雌性小鼠，腹腔接种液体石蜡(购自Sigma)，每只小鼠0.5mL。7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞7E3，每只小鼠1×106-3×106个。间隔7-14天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水。
2、抗体纯化：将腹水离心(10000r/min 30分钟)，除去细胞成分和其它的沉淀物，收集上清。按照常规蛋白G亲和纯化方法纯化抗体，具体方法如下：
2.1将上清用10倍体积的pH 7.2-7.6 10mM PBS(Na2HPO4·12H2O 3.23g，NaH2PO4·2H2O 0.15g，NaCl 8.75g，双蒸水定溶至1000mL，调整pH值为7.2-7.6)稀释。
2.2用平衡液(pH 7.2-7.6 10mM的PBS缓冲液)平衡Protein G亲和层析柱(GE公司，货号为17-0404-03)进行亲和纯化，至少3倍柱体积。
2.3以每分钟1/5-1/10柱体积的流速上样，然后用平衡液冲洗层析柱5-10倍柱体积，使OD值回到基点。
2.4用洗脱液(pH 3.0浓度为0.1M的柠檬酸缓冲液，一水柠檬酸21g加入1000mL去离子水中，用5M NaOH或4M HCl调整pH值至3.0)洗脱，洗脱下来的抗体尽快用1M pH 9.6Tris·HCl调整pH值至中性，得到抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的单克隆抗体，命名为7E3anti。
2.5测量OD280nm处的吸光度，计算抗体浓度(mg/mL)＝OD280nm*稀释倍数/1.48。
2.6亲和层析柱的回收与保存。
二、抗体鉴定
1、抗体纯度鉴定
对7E3anti进行SDS-PAGE(8％)电泳鉴定。
结果如图1所示，泳道1为BSA(66KD)，泳道2为单克隆抗体7E3anti，泳道M为蛋白分子量标准(kDa)。泳道2出现两条带，分别为抗体的重链和轻链，无其它杂带。该图显示单克隆抗体7E3anti的纯度在85％以上，表明该纯度良好，可以满足需求。
2、抗体类及亚类鉴定
采用北京五康新兴科技有限公司生产的胶体金测试卡检测7E3anti类型和IgG亚型，结果如图2所示，单克隆抗体7E3anti为IgG1。
采用Bio-rad公司生产的抗体亚型鉴定试剂盒(ELISA方法)检测抗体亚型，结果显示抗体重链为IgG1型，轻链为Kappa型。原始OD值数据见表2。
表2 ELISA方法亚型鉴定结果
两种方法检测结果一致，均显示该抗体为IgG1型。
三、单克隆抗体7E3anti的可变区序列测定
提取杂交瘤细胞7E3的mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR扩增片段插入到T载体内进行DNA序列测定。DNA序列测定结果：编码单克隆抗体7E3anti的基因(7E3anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：4的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。将获得的DNA序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。7E3anti的重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽。上述序列在NCBI数据库进行比对后未显示有相同序列。
实施例3、用单克隆抗体7E3anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原
一、用单克隆抗体7E3anti及ELISA双抗体夹心法检测蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原
本发明以单克隆抗体7E3anti既为包被抗体又为酶标记抗体来检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原。检测方法包括以下步骤：
1、包被微孔板：将单克隆抗体7E3anti用pH 7.2-7.6 10mM PBS稀释成4μg/mL，在微孔板的每孔加100μL，4℃下包被过夜(16-24小时)；倾去包被液，拍干，然后在每孔中加入300μL 0.5％酪蛋白(在pH 7.2-7.6 10mM PBS缓冲溶液中)，放入4℃封闭过夜后，拍干，干燥，真空包装后备用。
2、与待检样品反应：向包被板中分别加入口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒梯度稀释液100μL/孔，37℃温育1小时。
3、洗板：用PBST洗液(Na2HPO4·12H2O 64.6g，NaH2PO4·2H2O 3.0g，NaCl 175g，Tween-20 5.0mL，Proclin 300 1.0mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2-7.6；使用前用双蒸水稀释20倍)洗板5次后，在吸水纸上拍干。
4、加入酶标记抗体：向微孔板中加入7E3-HRP(1:1000-1:8000稀释)100μL/孔，37℃温育半小时。
采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP)，具体方法为：4mg纯化单克隆抗体7E3anti装入透析袋中，对0.05M pH 9.5的碳酸盐缓冲液透析3次，每次不少于6小时。于HRP中加入0.18mL新配的0.1M NaIO4溶液，轻轻混匀，4℃下放置30分钟。取出后加入0.16M乙二醇水溶液(10mL H2O+0.09mL乙二醇)0.3mL，轻轻混匀，室温放置30min。将HRP加入到抗体中，继续对0.05mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液透析2次，每次不少于100倍体积的透析液，每次时间不少于6小时。取出标记产物，加入NaBH4溶液(5mg/mL)0.12mL，轻轻混匀，置4℃2小时。装入透析袋中，对10mM PBS pH 7.2-7.6的溶液透析过夜，体积不少于100倍，时间不少于6小时。取出后加入等体积甘油，轻轻混匀后分装，-20℃保存，即为7E3-HRP。用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释即为酶标记抗体工作液。酶标记抗体稀释液的配方为：Na2HPO4·12H2O 3.23g，NaH2PO4·2H2O 0.15g，NaCl 8.75g，Proclin 300 1.0mL，酪蛋白5g，胎牛血清100mL，酶稳定剂(购自上海西宝生物科技有限公司)2.5g，Tween-20 0.25mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2-7.6。
5、洗板与显色：用PBST洗板5次后，加入显色液A(配方为：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定容至1000mL。)、显色液B(配方为：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na 0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.50g，用双蒸水定溶至1000mL。)各50μL/孔，进行显色，37℃温育15min。
6、终止反应与测量：加入终止液(1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL。)，50μL/孔，读数OD450。
检测结果如表3所示，可以看出该试剂盒能够检测15.6-500ng/mL范围的病毒抗原，检测低限可到15.6ng/mL，灵敏度高。口蹄疫A型(Re-A/WH/09)在疫苗生产过程中，各种培养液中病毒浓度一般在1000ng/ml以上水平，将其稀释后均可用于检测，该试剂盒的检测范围可以满足需要。
表3用单克隆抗体7E3anti及ELISA双抗体夹心法
检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的结果
| 试验组 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 病毒浓度ng/mL | 500 | 250 | 125 | 62.5 | 31.3 | 15.6 | 7.8 | 阴性对照 | 空白对照 |
| OD450 | 2.472 | 1.625 | 0.787 | 0.352 | 0.183 | 0.096 | 0.051 | 0.023 | 0.031 |
对上述数据做标准曲线，如图3所示，横坐标表示以10为底的浓度的对数，纵坐标表示以10为底的OD值的对数，线性相关系数R2＝0.9966，表明该试剂盒具有较好的线性，说明能够用于定量检测抗原的浓度。
二、特异性评价
用单克隆抗体7E3anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒、口蹄疫O型(O/GX/09-7)、口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)、口蹄疫O型(O/JMS)/2000)、口蹄疫O型(OZK/93)和亚洲1型(JSL/06)病毒(病毒均用稀释液稀释成4000ng/mL)以确定检测方法的特异性。其中样品稀释液配方为：Na2HPO4·12H2O3.23g，NaH2PO4·2H2O 0.15g，NaCl 8.75g，Proclin 300 1.0mL，酪蛋白5g，胎牛血清100mL，硫酸庆大霉素2支(8万单位/支)，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2-7.6。过滤除菌，2-8℃保存。检测步骤与上面相同。
检测结果见表4，口蹄疫O型(O/GX/09-7)、口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)、口蹄疫O型(O/JMS)/2000)、口蹄疫O型(OZK/93)和亚洲1型(JSL/06)病毒检测结果呈阴性，无交叉反应，口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒检测结果呈阳性，说明以单克隆抗体7E3anti同时为包被抗体和标记抗体，采用ELISA双抗体夹心法能够特异性地识别口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原，与口蹄疫O型(O/GX/09-7)、口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)、口蹄疫O型(O/JMS/2000)、口蹄疫O型(OZK/93)和亚洲1型(JSL/06)病毒无反应。换言之，在含有A型病毒(Re-A/WH/09)的口蹄疫多价疫苗中，涉及到的口蹄疫病毒其它毒株将不干扰A型病毒(Re-A/WH/09)的检测。表4中，猪口蹄疫O型双组份疫苗(来自金宇保灵生物药品有限公司，该疫苗包含O/GX/09-7和O/Mya98/XJ/2010两种毒株)结果为阴性，再次验证了本实验结论。
表4 7E3anti双抗体夹心法ELISA试剂盒特异性验证
| 复孔1 | 复孔2 | 平均值 | 结论 | |
| Re-A/WH/09 | >3.0 | >3.0 | >3.0 | 阳性 |
| O/GX/09-7 | 0.030 | 0.010 | 0.020 | 阴性 |
| O/Mya98/XJ/2010 | 0.023 | 0.013 | 0.018 | 阴性 |
| O/JMS/2000 | 0.025 | 0.036 | 0.031 | 阴性 |
| OZK/93 | 0.029 | 0.017 | 0.023 | 阴性 |
| JSL/06 | 0.017 | 0.033 | 0.020 | 阴性 |
| 阴性对照(样品稀释液) | 0.020 | 0.039 | 0.030 | 阴性 |
| 猪口蹄疫O型双组份疫苗 | 0.030 | 0.021 | 0.026 | 阴性 |
三、制备双抗体夹心法口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原ELISA检测试剂盒以单克隆抗体7E3anti作为包被抗体和标记抗体，用ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原的试剂盒包括以下试剂：
1、预包被微孔板：预先用单克隆抗体7E3anti按照4μg/mL的浓度预先包被、封闭，并密封保存在真空铝箔袋中，每个试剂盒一块96孔的微孔板；
2、酶标记抗体工作液：预先用辣根过氧化物酶(HRP)标记的7E3anti抗体，并用酶标记抗体稀释液稀释成合适浓度作为工作液，通常为0.1-1.0μg/mL，每个试剂盒10.5mL。
酶标记抗体稀释液配方为：Na2HPO4·12H2O 3.23g，NaH2PO4·2H2O 0.15g，NaCl 8.75g，Proclin 300 1.0mL，酪蛋白5g，胎牛血清100mL，酶稳定剂(购自上海西宝生物科技有限公司)2.5g，Tween-20 0.25mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2-7.6。
3、稀释液：用于标准品和待测样品的稀释，其配方为Na2HPO4·12H2O 3.23g，NaH2PO4·2H2O 0.15g，NaCl 8.75g，Proclin 300 1.0mL，酪蛋白5g，胎牛血清100mL，硫酸庆大霉素2支(8万单位/支)，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2-7.6。过滤除菌，2-8℃保存。每个试剂盒1瓶，25mL/瓶。可作为阴性质控使用。
4、洗涤液：为20倍的浓缩洗液，用前稀释。其配方为：Na2HPO4·12H2O 64.6g，NaH2PO4·2H2O 3.0g，NaCl 175g，Tween-20 5.0mL，Proclin 300 1.0mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2-7.6。每个试剂盒1瓶，25mL/瓶。
5、显色液A：每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。配方为：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定容至1000mL。
6、显色液B：每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。显色液B配方为：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.50g，用双蒸水定容至1000mL。
7、终止液：每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。配方为：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL。
8、口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒阳性质控：每个试剂盒1瓶，1mL/瓶。
四、样品中口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原检测
利用该ELISA试剂盒对口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)疫苗生产过程中的灭活液、浓缩液以及含有口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)疫苗的成品疫苗(多价疫苗)样品中的A型病毒(Re-A/WH/09)抗原进行检测，检测步骤同上，具体结果见表5。其中，成品疫苗在检测前先进行破乳，破乳方法如下：取疫苗100ml，缓慢加入分析纯的正戊醇10ml。充分混匀30秒，置于2-8℃,30分钟。5000rpm离心5分钟，可见油、水分离，取下层水相检测。
表5 7E3anti双抗体夹心法ELISA试剂盒
检测口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原的含量(ng/ml)
表5中，成品疫苗为口蹄疫三价疫苗(金宇保灵生物药品有限公司提供)，含有口蹄疫A型病毒、O型病毒和亚洲1型病毒三种。蔗糖密度梯度离心法是目前口蹄疫疫苗生产商常用的定量方法，该法无法区分不同血清型的口蹄疫病毒，故在本实验中发明人未用蔗糖密度梯度离心法检测成品疫苗(口蹄疫三价疫苗)，但根据金宇保灵生物药品有限公司提供的信息显示，该疫苗中含A型病毒4500ng/ml，本发明用7E3anti双抗体夹心法ELISA试剂检测结果与其一致。从另外2份样品看，本发明的ELISA试剂测量结果与对照方法基本一致，且操作简单、快速，显示本发明试剂盒的使用价值。
实施例4、用单克隆抗体7E3anti制备的胶体金试纸或检测卡竞争法检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒疫苗免疫后的抗体水平
1、制备胶体金试纸
如图4(胶体金纸层析试纸正面结构图(左)和组装示意图(右))所示，用于检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体的胶体金试纸由PVC背板①、吸水垫②、硝酸纤维素膜③、样品垫④、结合物释放垫⑤共五部分组成，硝酸纤维素膜③上设有检测线(T线)⑥和质控线(C线)⑦。
胶体金试纸的制备方法包括以下步骤：
1)包被硝酸纤维素膜③
用浓度为1-5mg/mL的单克隆抗体7E3anti包被检测线(T线)；用浓度为1-5mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白(购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)。操作：用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体7E3anti和羊抗兔免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜(购自Millipore公司)③上，形成相互分离的检测线⑥和质控线⑦，质控线和检测线间距一般为0.3-0.8cm，优选0.5cm，37℃干燥6-24小时，备用。
2)结合物释放垫⑤的制备
2.1用胶体金标记口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原，方法为：在磁力搅拌下，向三角瓶中加入400mL纯化水，煮沸。加入1％(W/V)四氯化金溶液3.5mL，煮沸。再加入1％(W/V)柠檬酸三钠溶液6mL，煮沸5分钟。冷却后保存于2-8℃。取1毫升胶体金溶液于离心管中。加入5-15μl 0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min。加入10μl浓度为100-1000μg/mL的抗原，混匀后静置30min。加入10μl 20％(W/V)酪蛋白溶液，平衡5min。加入10μl 20％(W/V)PEG20000溶液，平衡30min，10000rpm离心10min，弃上清。加入100μl金标复溶液(含有2％(W/V)蔗糖、0.5％(W/V)酪蛋白、0.5％(W/V)BSA、0.1Triton X100、0.1％SDS的硼酸缓冲液)，复溶后备用。按照同样程序制备兔IgG胶体金标记物。
2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上喷有胶体金标记的口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原和兔IgG。将复溶后的两种胶体金标记物1:2-1:8稀释后1:1混匀，然后按照6μl/cm的速量喷膜，37℃下放置2-6小时干燥，备用。
3)制备胶体金试纸和检测卡、试纸盒
在PVC背板①上先粘贴硝酸纤维素膜③，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端粘贴吸水垫②，在靠近检测线一端粘贴结合物释放垫⑤和样品垫④，得到用于检测口蹄疫A型病毒抗体的胶体金试纸，然后可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。
如将上述步骤制备的试纸装入塑料卡中，制成检测卡，并组装成试纸盒，该试纸盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗(图4)。
2、胶体金试纸和检测卡的使用
胶体金试纸的使用方法：将样品垫端浸入样品中，样品垫④即吸取液体向上端移动，流经结合物释放垫⑤时使干片上的胶体金标记物复溶，并带动其向硝酸纤维膜③渗移。若样本中无待测抗体，胶体金标记的口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原会与固定在检测线⑥上的7E3anti抗体结合，形成红色的检测线，胶体金标记的兔IgG继续前行，至质控线⑦与羊抗兔免疫球蛋白(固相二抗)结合，而显出红色质控线条(C线)。如待测样品中含有口蹄疫A型抗体，则会与检测线上的固相抗体7E3anti竞争结合胶体金标记的口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原。随着待测样品中抗体水平的增加，竞争会越来越剧烈，直至检测线不显色，只有质控线(C线)显色。任何时候若质控线不显色，均表示胶体金试纸(卡)失效。
胶体金检测卡和试纸盒的使用方法：检测时，取待检样品2滴，滴在检测卡的点样口，根据观测窗内的检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带以及色带颜色深浅来确定样品中是否存在口蹄疫A型病毒抗体。如配合商品化的免疫层析分析记录仪(如北京快锐读科技有限公司生产的KRD-100型号的免疫层析分析记录仪)，来读取检测线的灰度值，则可进行定量检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体的效价水平。
3、口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体胶体金竞争法试纸盒检测实际样品
收集用含有口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)的疫苗免疫过的猪血清，分别用本产品和中国农业科学院兰州兽医研究所的液相阻断ELISA试剂盒检测。
1)以1:64为临界值定性评价两种检测方法的符合率
共收集168份血清样品，其中大部分样品采集于注射口蹄疫疫苗1个月以上的时间。口蹄疫疫苗免疫后抗体效价达到1:64及以上时被认为具有较好的保护作用，因此专利发明人以1:64为临界值判断抗体阴阳性。其中抗体效价低于1:64判为阴性；高于或等于1:64判为阳性。
检测前，首先确定抗体效价为1:64的血清在本发明检测卡上显示的检测线的颜色深浅。选择10份口蹄疫A型抗体阳性血清(液相阻断ELISA方法检测抗体效价＞1:64且＜1:128)等体积混合。然后用液相阻断ELISA方法检测抗体效价，为准确确定该混合样品抗体效价水平，检测时采用更密集的稀释方法稀释，比如1:65、1:70、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:105、1:110、1:115、1:120、1:125。根据ELISA结果选择一个合适的稀释比例1：M，使1:M为阳性，1：(M+5)为阴性。计算该混合血清的准确效价＝1：(M+2.5)。用10mM pH 7.2-7.6的PBS稀释成1:64效价的抗体样品，稀释倍数为(M+2.5)/64。以稀释后的样品抗体效价为1:64。用胶体金测试卡检测该样品，其颜色深浅代表着临界值的颜色深浅。若待测样品检测线的颜色比临界值的颜色深，说明其抗体效价低于1:64；否则高于1:64。本发明涉及到的1:64的临界值血清，可统一制备，然后分装成小份，保存于-20℃，每次取用一支，作为临界值的质控血清样品。
采用该方法定性检测收集到的168份样品，统计分析两种方法的阴性符合率和阳性符合率，结果见表6。表6显示，本发明胶体金检测与液相阻断ELISA方法总体符合率高，具有应用价值。
表6用7E3anti制成的胶体金检测结果
与兰州兽医研究所液相阻断ELISA检测结果的比较
| 胶体金/液相阻断ELISA | 临界值 | |
| 阳性符合率 | 89.6％ | 1:64 |
| 阴性符合率 | 97.5％ | 1:64 |
| 总符合率 | 92.9％ | 1:64 |
2)胶体金定量检测
从上面实验中随机选择阳性样品10份，用胶体金试纸盒检测并用读卡仪(北京快锐读科技有限公司生产的KRD-100型号的免疫层析分析记录仪)进行定量测量，同时与中国农业科学院兰州兽医研究所生产的液相阻断ELISA试剂盒对照，结果见表7。胶体金定量检测标准曲线见图5(四参数模型，X轴为抗体效价的倒数，Y轴为信号值)，FMDV-Ab竞争方程为：y＝(399.8093+3.5365)/[1+(x/15.1455)^0.9395]–3.5365。
表7用7E3anti制成的胶体金检测试剂(定量法)
与兰州兽医研究所液相阻断ELISA检测试剂的比较
检测结果显示，胶体金配套读卡仪能够准确测量口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的抗体水平(通常情况下，液相阻断ELISA方法只能提供一个抗体水平的范围，如上表)，与液相阻断ELLISA试剂盒检测结果在抗体效价高低水平上基本保持一致，并且操作简单、快速、方便。因此本产品将在口蹄疫疫苗免疫效果评价上具有非常广泛的用途。
4、用单克隆抗体7E3anti制成的口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体胶体金试剂盒与中国农业科学院兰州兽医研究所液相阻断ELISA方法比较
结果见表8，可以看出胶体金方法操作简单、快速，储存、运输方便，非常适合快速、简便、准确的评价疫苗免疫后抗体水平的检测。
表8胶体金法与液相阻断ELISA方法比较
| 胶体金 | 液相阻断ELISA | |
| 检测时间 | 20分钟 | 不少于120分钟 |
| 检测步骤 | 三步操作，样品不需要稀释 | 操作复杂，常需做多个稀释度 |
| 试剂效期 | 通常18个月 | 通常6个月 |
| 试剂储存、运输 | 2-30℃避光保存，2-30℃运输 | 2-8℃低温保存，2-8℃冷链运输 |
| 是否定量 | 定量/定性 | 半定量/定性 |
| 配套仪器成本 | 成本低、便携，可适用于现场和野外 | 成本略高，笨重 |
Claims (10)
1.杂交瘤细胞株7E3，保藏编号为CGMCC No.12674，是以口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株7E3CGMCC No.12674分泌的单克隆抗体7E3anti。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体7E3anti，其特征在于：所述单克隆抗体7E3anti的重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中的SEQ IDNo：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽。
4.编码权利要求2或3所述单克隆抗体7E3anti的基因(7E3anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：4的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.一种检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原的ELISA试剂盒，包括用7E3anti作为包被抗体包被的微孔板和用7E3anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。
6.根据权利要求5所述检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原的ELISA试剂盒，其特征在于：
所述用7E3anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用10mM pH7.2-7.6PBS将7E3anti稀释成0.5-10μg/mL，加入微孔板中，100μl/孔，置于2-8℃过夜；拍干后，加入含0.5％酪蛋白的10mM pH7.2-7.6PBS，300μl/孔，置于2-8℃过夜；拍干、干燥后真空装入铝箔袋中备用；
所述酶标抗体可用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体，然后用酶标记抗体稀释液(Na2HPO4·12H2O 3.23g，NaH2PO4·2H2O 0.15g，NaCl 8.75g，Proclin 300 1.0mL，酪蛋白5g，胎牛血清100mL，酶稳定剂2.5g，Tween-20 0.25mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2-7.6)稀释成工作液，工作液的浓度为0.1-1.0μg/mL。
7.权利要求5或6所述的检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的ELISA试剂盒在口蹄疫疫苗生产过程中的应用，其特征在于，用所述ELISA试剂盒检测样品(样品包括疫苗生产原料、灭活液、浓缩液、疫苗成品或多价疫苗)中口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原的浓度，检测包括以下步骤：
1)用单克隆抗体7E3anti包被微孔板，封闭经包被的微孔板；
2)加待测样品，洗板；
3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体7E3anti，洗板；
4)加底物显色；
5)终止反应；
6)测定OD450值。
8.一种检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体的胶体金试纸，由玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜组成，硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，其中：用权利要求2至5任一项中提及的单克隆抗体7E3anti包被检测线，结合物释放垫上包被有用胶体金标记的口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)抗原。
9.检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体的胶体金试纸盒，其特征在于：将权利要求8所述胶体金试纸裁切后，装入塑料卡中制成检测卡，并组装成试纸盒，该试纸盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
10.权利要求8所述的胶体金试纸或权利要求9所述的试纸盒在检测含有口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒疫苗免疫后抗体水平中的应用，其特征在于，采用竞争法原理检测标本中的口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗体水平，检测过程包括：将待检样品滴在样品口位置，观测检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带，通过与临界值质控血清颜色深浅比较来判断阴、阳性，或通过仪器检测T线颜色深浅来定量测量口蹄疫A型抗体效价水平。
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