CN111679075A - Akt-ⅲ株口蹄疫抗原夹心elisa检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种A/AKT‑Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：单域抗体sdAb‑A；单克隆抗体9C10，封闭液；金标二抗；和支持介质。通过将特异性单域抗体包被在支持介质上，与待检抗原和单克隆抗体9C10形成夹心组合，通过金标的马抗小鼠IgG检测，在检测样品时只需要加入待检样品与单抗9C10孵育1h，即可加入金标二抗进行10min的显色，洗涤后即可度值，操作简单、诊断快速。本发明的竞争ELISA检测试剂盒检测灵敏度高，所用的抗体特异性非常高，可用于口蹄疫不同血清型间的分型，也可以区分A型不同毒株，且146S检测结果与传统蔗糖密度梯度离心法测定146S结果相符，而检测速度与检测样品数量更快更多。

Description

AKT-Ⅲ株口蹄疫抗原夹心ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫测定法和相应的生物物质领域，具体涉及一种口蹄疫病毒抗原的检测方法及应用。
背景技术
口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的一种感染偶蹄目动物的急性、热性、接触传染性动物疫病。FMD是国际兽医局规定的必报传染病，也被中国认定为一类传染病。口蹄疫致死率很低，但病毒可以在体内长期存活，患畜持续排毒，成为重要的传染源，会给畜牧业生产和进出口贸易造成巨大的经济损失，该病不仅严重影响畜牧业的发展，也对人类健康构成很大威胁。目前，口蹄疫的防控措施主要是以广泛的大面积免疫预防为主，配合以扑杀疫区内的病畜和易感动物,并在周围10公里范围内进行环形预防注射。疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段，制备安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD灭活疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，FMD疫苗有效抗原含量是评价该疫苗的重要标准，在生产过程中快速高通量的测定FMD疫苗中有效抗原含量，对生产工作起着尤为关键的技术支持作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括：单域抗体sdAb-A，所述单域抗体sdAb-A序列如SEQ ID NO.1所示；单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCC No.17081；封闭液；金标二抗；以及包被所述单域抗体sdAb-A的支持介质。本发明通过特定的单域抗体sdAb-A和单克隆抗体9C10使得检测的灵敏度高，本试剂盒所用的抗体特异性非常高，完全可用于口蹄疫不同血清型间的分型，即可将A型与O型和亚洲1型区分开，也可以区分A型不同毒株，即可将A/AKT-Ⅲ株与A型的其他毒株区分开,且146S检测结果与传统蔗糖密度梯度离心法测定146S结果相符，而检测速度与检测样品数量更快更多。
本发明以口蹄疫的A型单域抗体作为包被抗体，建立一种检测AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒。由于二抗一般为多抗，因此一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时一个二抗分子上可以标记多个金颗粒，所有当待检抗体为多抗时，信号经过放大，最终提高了检测的灵敏度。另外由于二抗制备比较容易，所有无需将一抗进行标记，大大缩减了工作量。为该病检验检疫提供有效实用的检测方法。
A/AKT-Ⅲ株FMDV株可商业上获得，例如可购自新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所商购。
作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，单域抗体sdAb-A包被浓度为1.3μg/mL。
作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述封闭液为5％脱脂乳。
作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述A/AKT-Ⅲ株FMDV单克隆抗体9C10检测浓度为1.5μg/mL。作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，所述金标二体浓度为0.025μg/mL。
作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述支持介质为酶标板。
作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述试剂盒还包括阴阳性对照及已确定146S含量的灭活的A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原标准品，所述阴性对照为FMDV病毒接种前细胞培养基，所述阳性对照为灭活的A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原。
本发明还提供了所述A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒在非诊断目的的检测A/AKT-Ⅲ株抗原及含量中的应用。
A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测，具有快速、简便、准确、稳定等特点，可用于口蹄疫的快速、批量抗原检测。
本发明还提供了所述A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒的检测方法，通过将单域抗体sdAb-A包被在支持介质上，待检抗原，单克隆抗体9C10形成夹心，通过金标的马抗小鼠IgG进行检测。
本发明还涉及一种所述A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒的检测方法，其中，所述方法包括：步骤(1)用所述单域抗体sdAb-A包被酶标板；步骤(2)用所述封闭液封闭所述步骤(1)包被的酶标板；步骤(3)将待检抗原样品加入到所述步骤(2)封闭的酶标板，孵育，洗涤；步骤(4)将所述单克隆抗体9C10加入到所述步骤(3)的所述酶标板，孵育，洗涤；步骤(5)将所述金标二抗加入到所述步骤(4)的所述酶标板，孵育，洗涤；以及步骤(6)酶标仪在波长540nm处读数，判断阴阳性。
优选地，所述单域抗体sdAb-A包被浓度为1.3μg/mL。
优选地，所述单域抗体sdAb-A包被条件为4℃包被过夜。
优选地，在所述支持介质上包被单域抗体sdAb-A后进行封闭，所述封闭液为5％脱脂乳。
优选地，所述封闭液封闭时间为37℃1h。
优选地，所述待检抗原样品作用时间40min。
优选地，所述单克隆抗体9C10浓度为1.5μg/mL。
优选地，所述单克隆抗体9C10作用条件、时间为37℃孵育30min。
优选地，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，金标二抗浓度为0.025μg/mL。
优选地，所述金标二抗作用时间为室温10min。
优选地，所述支持介质为酶标板。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
实施例1单抗的制备
1.1口蹄疫抗原(A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原)为实验室保存。
1.2免疫脾细胞的制备
取纯化好的抗原与等体积的佐剂充分混匀，注入小鼠体内，每只每次注射剂量为1ml，经过一免、二免、三免和增强免后，测小鼠血清中抗体滴度，将显示有足够抗体滴度(1:108)(ELISA效价)的小鼠作为免疫脾细胞的来源。测定抗体滴度的方法为ELISA检测方法。
1.3骨髓瘤细胞的制备
骨髓瘤细胞SP2/0细胞为实验室所保存。
1.4细胞融合
1.4.1饲养层细胞的制备：
1.4.1.1准备：在进行细胞融合前2天，挑选健康BALB/c小鼠，放入单独的鼠笼中饥饿4h。选择培养液HAT(32mL，每板10mL，3块板/只鼠)37℃预热30min。鼠架、剪刀、镊子紫外照射消毒30min。
1.4.1.2暴露腹膜：饥饿4h后的Balb/c小鼠被脱颈处死后，用75％酒精浸泡5min，对小鼠体表进行消毒。将小鼠固定在鼠架上，用镊子和剪刀将小鼠的皮肤和腹膜分离，腹膜完全暴露。
1.4.1.3腹腔内细胞采集：将预热的32mL选择培养液HAT放入灭菌的平皿中，10mL注射器中吸入8mL培养液，用镊子夹起腹膜，针头刺入腹膜，镊子夹住针头，伸入腹腔，注射器缓慢的抽吸数次，待注射器中的液体呈微黄色后，注射器针头退出腹腔，摘下针头后将液体缓慢注入平皿中。处理小鼠，消毒操作台。
1.4.1.4铺板：取3块96孔细胞培养板，用8道移液器将1.4.1.3制备的细胞悬液加入细胞培养板中，100μL/孔。
1.4.2SP2/0骨髓瘤细胞的制备：
1.4.2.1融合前36～48h，将SP2/0细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。
1.4.2.2融合当天，选取浑圆透亮、大小均一、排列整齐的细胞。用DMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，置于50mL无菌离心管内，800r/min离心10min。用DMEM基础培养液将细胞沉淀重悬，混匀。取少量骨髓瘤细胞悬液，进行台盼蓝染色计数，备用等待下一步细胞融合实验。
1.4.3免疫Balb/c小鼠脾细胞的制备：
1.4.3.1融合前，用弯头镊子摘除经加强免疫后3天的Balb/c小鼠眼球，收集血液经低速离心分离血清，该血清即为间接ELISA中的阳性对照。将小鼠颈部脱臼致死，并浸泡于75％酒精中对小鼠体表进行灭菌，5min后放于超净台内，将小鼠夹在鼠架上。
1.4.3.2无菌打开腹腔，取出脾脏去除结缔组织，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mL DMEM基础培养液的平皿中，用尖头镊子夹起脾脏，10mL注射器换上1mL注射器的针头吸取10mL DMEM基础培养液，针头经镊子中间刺入脾脏，缓慢的将培养液注入脾脏，使脾细胞随培养液流出，全部通过网孔进入平皿中，可反复几次直到脾脏成空囊且没有红色区域。
1.4.3.3将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM基础培养液大约至30mL，混匀。800r/min离心8min，弃上清。用DMEM基础培养液将细胞沉淀轻柔重悬并混匀。取细胞悬液，进行台盼蓝染色计数，备用等待下一步细胞融合实验。
1.4.4细胞融合
将1.2中足够抗体滴度的小鼠进行脾脏分离，并制备脾淋巴细胞悬液。通过细胞计数，使脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以1：10的数量比进行混合，以800r/min离心5min后尽可能的弃净上清，向50mL离心管沉淀中缓慢加入37℃预温的促融剂(PEG1450)进行融合，融合后，800r/min离心5min后弃上清，向离心管中加入50mL选择培养基HAT(15％胎牛血清，1％HAT，1％双抗，1％谷氨酰胺)将融合后的细胞轻轻的重悬混匀后，铺入事先制备好的生长饲养层细胞的96孔细胞培养板内，每孔100μL，放入37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱中培养。每隔三天用选择培养液HAT进行半换液，直到孔内细胞克隆长至底面积1/4～1/3时，更换新的培养液培养2～3天后，取培养上清进行检测。
将融合细胞按100μL/孔加入到96孔培养板中，每孔中再加入100μL用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。将上述培养孔置于浓度为5％的CO2培养箱中，培养温度为37℃。第三天开始，每隔2-3天用每孔原培养液一半的量的HAT培养液换液一次。
当观察培养孔中出现杂交细胞集落时，先取培养上清液，然后再在每孔加入半量HAT培养液。再用间接ELISA检测抗A型口蹄疫抗体及滴度。当检测表明其与对照相比有明显的升高时即视为合格。
将上述已测定的杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株。通过经有限稀释该杂交瘤细胞使每一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法，挑取单一杂交瘤细胞。选择单一杂交瘤细胞命名为分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17081，保藏日期为2018年12月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
1.5单克隆抗体的制备
用常规培养液培养1.4中得到的杂交瘤细胞株9C10。大量生产单克隆抗体，可采用体外(细胞培养)或体内(小鼠腹腔注射)培养法。当注射到腹腔内，2-3周后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液中含有口蹄疫病毒单克隆抗体。采用辛酸-硫酸铵法进一步纯化单克隆抗体9C10。
实施例2特异性单域抗体sdAb-A的制备
A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原免疫双峰驼，分离外周血淋巴细胞后提取总RNA，通过RT-PCR合成cDNA，再用单域抗体特异性引物(上游引物：CTTGGTCTCTGATGTGCAGCTGGTGGAGTC下游引物：CTCGGATCCTCATGAGGAGACGGTGACCTGG)进行三次扩增得到VHH基因。构建了抗A型口蹄疫病毒的单域抗体噬菌体展示免疫文库。经测定，文库容量为1.2×108。经过四轮淘选，测序得到A型FMDV单域抗体序列，命名为sdAb-A。目的片段扩增后经过酶切与pSMK载体连接，构建pSMK-sdAb-A原核表达载体，转化大肠杆菌BL21。经SDS-PAGE检测,重组sd Ab-A得到了表达。重组蛋白使用树脂亲和层析方法进行纯化。酶联免疫吸附实验结果显示这株抗体对A型口蹄疫病毒具有特异性结合的能力，由此获得了口蹄疫病毒A型特异性单域抗体sdAb-A。经测序，单域抗体sdAb-A序列如SEQ.ID.NO.1所示。将抗A型口蹄疫灭活病毒抗原包被于酶标板上，用单域抗体sdAb-A与A型口蹄疫病毒抗体进行竞争ELISA试验，结果显示具有高度的血清型特异性，不与其他血清型发生交叉反应，可用于制备检测A型口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒。
实施例3二抗的制备与标记
3.1多抗的制备
选取健康、营养良好的小鼠为免疫对象进行免疫，首先进行基础免疫，将病毒液注入小鼠体内待痊愈后进行高免，经过高免后的小鼠经心脏采血，分离血清，灭活后进行纯化；将纯化后的血清对马进行免疫，采集血清，纯化二抗IgG。
3.2标记制备好的马抗鼠IgG
3.2.1将1g氯金酸配制成1％的氯金酸溶液，4℃避光保存，用0.22μm滤器过滤。
3.2.2将1g柠檬酸三钠配制成1％的柠檬酸三钠溶液，4℃保存。
3.2.3取100mL蒸馏水加热至100℃，沸腾，加入1mL 1％氯金酸大约1min，快速加入1mL 1％柠檬酸三钠，计时3min，并将温度调低，计时12min。室温冷却约30min，不可剧烈晃动。
3.2.4将配制好的金溶液取20mL放入烧杯中，加入96μL 0.1M的K2CO3溶液在恒温磁力搅拌器上搅拌，计时3min，再加入纯化好的二抗IgG 200μL，计时15min，再加入10％的BSA200μL，4℃12000rmp离心30min，收集沉淀，即为标记好的二抗。
3.2.5利用分光光度计测其OD540的吸光度值，选择金标二抗最佳工作OD540值，计算二抗的相对浓度。
实施例4ELISA操作流程
ELISA基本操作流程：单域抗体sdAb-A(1.3μg/mL)100μL包被酶标板，4℃过夜包被；用PBST洗板3次，封闭液37℃孵育封闭1h；用PBST洗板3次，吸取100μL待检抗原样品加入到96孔酶标板中，(如果需要检测抗原含量，需要将已知浓度的标准品与检测品进行连续2倍稀释，进行检测，并绘制标准曲线，如不检测抗原含量无需进行上述操作)，37℃孵育40min，用PBST洗板3次；加入l00μL实施例1制备的单抗(1.5μg/mL)，37℃孵育30min，用PBST洗板3次；金颗粒标记的马抗鼠IgG，室温孵育10min，用PBST洗板3次；加入50μLPBS缓冲液，用酶标仪在波长540nm处读数，判定结果：OD540值大于0.180为阳性，小于0.167为阴性，之间为可疑。阴性对照与阳性对照比值大于2.1。以抗原标准品检测孔各稀释度OD 540nm值和阴性样品OD 540nm值作为X轴，以已知蛋白浓度为Y轴，采用EXCEL程序，→“插入”→“散点图”，选择“散点图”→“趋势线”→选中“线性”→“显示公式”和“显示R平方值”。通常R 2值≥0.98表明标准曲线可信(其中应舍弃OD过高或者过低的点)。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。根据线性公式，样品孔在线性范围内的OD 540nm值带入公式，并乘以对应的稀释倍数，即可计算样品中146S抗原浓度。
4.1最佳单域抗体sdAb-A包被浓度和单克隆抗体检测浓度的确定
为研究单域抗体包被浓度和单克隆抗体对检测灵敏度的影响，调整单域抗体sdAb-A的包被浓度与单克隆抗体9C10的检测浓度，进行下列实验：由表1可知，单域抗体sdAb-A稀释度为1:25600(终浓度为1.3μg/mL)时，单克隆抗体9C10稀释度为1:6400(终浓度为1.5μg/mL)，此时P/N值可达3.03，阳性与阴性抗原的OD540值为0.493与0.162。因此，单域抗体最佳包被浓度为1.3μg/mL，单克隆抗体9C10最佳检测浓度为1.5μg/mL。
表1单域抗体sdAb-A与单克隆抗体检测最佳浓度的确定结果
Figure BDA0002456094780000091
4.2单域抗体最佳包被条件的确定
在ELISA操作过程中将单域抗体分别在4℃过夜、37℃2h、37℃分别孵育1、2、3h后在4℃过夜，其余其余反应条件不变，测定OD540值并计算P/N值。
由表2可知，4℃过夜包被较佳，此时阳性血清和阴性血清的OD540值比值较大且考虑工作的时间成本，因此最佳的包被条件是4℃过夜包被。
表2单域抗体最佳包被条件确定结果
Figure BDA0002456094780000092
4.3最佳封闭液的确定
为选择最佳封闭液，封闭液分别选择1％鱼明胶、2％鱼明胶、5％鱼明胶、1％脱脂乳、2％脱脂乳、5％脱脂乳，37℃孵育1h其余反应条件不变，按照ELISA操作流程测定OD540值并计算P/N值。
由表3可知，当采用5％脱脂乳进行封闭时，P/N值最大，效果最好，故选择5％脱脂乳作为封闭液。
表3最佳封闭液的确定结果
Figure BDA0002456094780000101
4.4封闭时间的确定
将封闭时间分别设置为37℃1h、37℃2h、37℃3h，37℃4h，其余反应条件不变，按照ELISA操作流程测定OD540值并计算P/N值。
由表4可知，封闭时间为37℃1h时，此时P/N最大，因此最佳的封闭条件为37℃1h。
表4封闭条件的确定结果
项目 37℃1h 37℃2h 37℃3h 37℃4h
阳性 1.228 1.234 1.245 1.255
阴性 0.143 0.152 0.155 0.158
P/N值 8.587 8.118 8.032 7.943
4.5最佳检测抗原与单域抗体sdAb-A作用时间的确定
为研究检测抗原作用时间对检测的影响，调整抗原作用时间，进行下列实验：由表5可知，当抗原作用40min时，P/N值最大，效果最好。
表5抗原最佳作用时间的确定
Figure BDA0002456094780000102
4.6一抗(单克隆抗体9C10)作用条件、时间的确定
为研究一抗9C10作用条件、时间对检测的影响，调整一抗9C10条件、作用时间，进行下列实验：由表6可知，一抗9C10作用条件为37℃孵育30min时阳性抗原和阴性抗原OD540值的比值最大，试验效果最佳。
表6一抗9C10作用时间的优化结果
项目 0.5h 1h 1.5h 2h
阳性 1.121 1.083 1.18 1.116
阴性 0.116 0.114 0.128 0.134
P/N值 9.664 9.5 9.219 8.328
4.7金标抗体(二抗)稀释浓度的确定
按照上述优化好的包被条件、封闭条件、一抗作用时间，在ELISA反应过程中，将金标抗体分别稀释成5OD，10OD，20OD，40OD，60OD，80OD，100OD其余反应条件不变，按照ELISA操作流程测定OD540值并计算P/N值。
由表7可知，当金标抗体(马抗鼠IgG)稀释后，OD540值等于5时，称为5OD(此时抗体浓度为0.025μg/mL)浓度稀释时，阳性血清OD540值在接近1的情况下P/N值最大，因此金标抗体的最佳工作浓度为5OD浓度，对应的抗体浓度为0.025μg/mL。
表7金标二抗稀释浓度的优化结果
项目 5OD 10OD 20OD 40OD 60OD 80OD 100OD
阳性 1.106 1.014 0.948 0.924 0.881 0.784 0.739
阴性 0.122 0.136 0.134 0.129 0.121 0.118 0.125
P/N值 9.066 7.456 7.0746 7.163 7.281 6.644 5.912
4.8金标抗体作用时间的确定
按照上述优化好的包被条件、封闭条件、一抗作用时间、金标抗体浓度，在ELISA反应过程中，将金标抗体作用时间分别设置为室温10min、室温20min、室温30min、室温40min，其余反应条件不变，按照ELISA操作流程测定OD540值并计算P/N值。
由表8可知，当金标二抗作用时间为室温10min时效果最佳。
表8金标抗体作用时间的优化结果
项目 10min 20min 30min 40min
阳性 1.198 1.015 1.134 1.232
阴性 0.123 0.124 0.131 0.162
P/N值 9.740 8.185 8.656 7.605
实施例5
5.1特异性试验结果
由表9可知，用建立好的方法去检测小鼠水疱疹病毒抗原和小鼠水疱性口炎病毒抗原，BHK21细胞宿主蛋白，O型口蹄疫病毒抗原，包括OHM/02株、ONXC/92株、O/Mya98/XJ/2010株、O/GX/09-7株，OZK/93株，OR/80株；亚洲1型Asia1 KZ/03株，Asia1/JSL株FMDV抗原(内蒙古必威安泰生物技术有限公司生产)；A型口蹄疫病毒抗原Re-A/WH/09株，O型口蹄疫病毒抗原O/MYA98/BY/2010株(来自金宇保灵生物药品有限公司口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(O/MYA98/BY/2010株+Re-A/WH/09株)；A型口蹄疫病毒抗原AF/72株，O型口蹄疫病毒抗原O/HB/HK/99株(来自中牧实业股份有限公司口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(O/HB/HK/99株+AF/72株))同时设立阴阳性对照，阴性对照为FMDV病毒接种前细胞培养基，阳性对照为灭活的A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原。
如表9所示，阴阳性对照都成立条件下，上述样品检测结果均为阴性。试验结果表明建立的ELISA检测方法其特异性良好，完全可用于口蹄疫不同血清型间的分型，即可将A型与O型和亚洲1型区分开，也可以区分A型不同毒株，即可将A/AKT-Ⅲ株与A型的其他毒株区分开，并且BHK21细胞宿主蛋白是疫苗中总蛋白的主要成分，BHK21细胞宿主蛋白的检测结果为阴性，证明建立的该方法不受总蛋白含量影响。
表9特异性试验结果
抗原种类 OD<sub>540</sub>
小鼠水疱疹病毒抗原 0.086
小鼠水疱性口炎病毒抗原 0.079
BHK21细胞宿主蛋白 0.062
OHM/02株FMDV抗原 0.067
ONXC/92株FMDV抗原 0.059
O/Mya98/XJ/2010株FMDV抗原 0.078
O/GX/09-7株FMDV抗原 0.071
OZK/93株FMDV抗原 0.069
OR/80株FMDV抗原 0.082
Asia1 KZ/03株FMDV抗原 0.058
JSL株FMDV抗原 0.08
O/MYA98/BY/2010株+Re-A/WH/09株FMDV抗原 0.077
O/HB/HK/99株+AF/72株FMDV抗原 0.081
阳性 1.103
阴性 0.121
5.2重复性试验结果
用建立的A/AKT-ⅢFMDV夹心ELISA方法检测A/AKT-Ⅲ株口蹄疫抗原样品，使用不同批次的酶标板，在一块板上进行批内重复实验，在不同板上进行批间重复试验，测定值,计算变异系数。变异系数<10％，说明试剂盒重复性和稳定性好。3个不同批次的酶标板，批内和批间检测结果一致，变异系数均<5％，结果见表10，说明试剂盒重复性很好。
A/AKT-Ⅲ株11-14批的标准曲线的线性方程为Y＝11.769x-1.105，R2＝0.9927。A/AKT-Ⅲ株11-29批的标准曲线的线性方程为Y＝8.7256x-1.3713，R2＝0.9891。
表10夹心ELISA检测A/AKT-Ⅲ株重复性实验结果
Figure BDA0002456094780000141
5.3灵敏度试验
选用3批试剂盒，用样品稀释液对检测标准品进行连续稀释，100μL/孔，重复8孔，按照实施例4的检测方法进行检测，判定结果：OD540值大于0.180为阳性，小于0.167为阴性，之间为可疑。阴性对照与阳性对照比值大于2.1。计算其平均值(X)+3×标准差(SD)即为本试剂盒的检测灵敏度，
以其中最大值作为本方法的灵敏度
表11灵敏度检测结果
批次 最低检测剂量的平均值 标准差(SD) X+3SD
1 0.095 0.089 0.362
2 1.21 0.058 1.384
3 1.13 0.101 1.433
经3次重复试验结果表11显示，本试剂盒的灵敏度为1.433ng/mL，但低于该灵敏度也可用本试剂盒检测出。
5.4与其他试剂盒和蔗糖密度梯度离心方法的比较试验
为了验证本发明专利检测结果的准确性与便捷性，现与蔗糖密度梯度离心方法和其他厂家相关试剂盒(1号厂家试剂盒：北京艾然生物技术有限公司，百奥莱博,猪口蹄疫A型抗原FMD-A-AgELISA试剂盒。2号厂家试剂盒：上海江莱生物科技有限公司口蹄疫A型FMD-A检测试剂盒。3号厂家试剂盒：兰州兽医研究所，口蹄疫亚洲1型/O型/A型病毒抗原定量ELISA试剂盒)进行比较试验。
用本发明专利试剂盒和蔗糖密度梯度离心同时检测5份A/AKT-Ⅲ株的半成品样品。检测结果见表12所示，两种检测方法符合率较高，用EXCEL进行拟合趋势线，Y＝11.769x-1.105，R2＝0.9927。
表12本试剂盒与蔗糖密度梯度离心方法和其他厂家相关试剂盒的比较试验结果
Figure BDA0002456094780000151
同时，在操作便捷性方面，本试剂盒整个操作仅需80min，最多可检测88份样品，且不需要昂贵的仪器设备，而蔗糖密度梯度离心方法则需要72小时，而每台超速离心机只能进行5份检测样品的离心，影响口蹄疫146S抗原定量检测的速率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古必威安泰生物科技有限公司
<120> AKT-Ⅲ株口蹄疫抗原夹心ELISA检测试剂盒
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 双峰驼（bactrian camel ）
<400> 1
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Ser Tyr Gly Thr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gly Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Pro Gly Arg Pro Ser Leu Gln Val Asp Phe Arg Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Ile Val Ser Ser
115 120

Claims (8)

1.一种A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
单域抗体sdAb-A，所述单域抗体sdAb-A序列如SEQ ID NO.1所示；
单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCC No.17081；
封闭液；
金标二抗；
包被所述单域抗体sdAb-A的支持介质。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述单域抗体sdAb-A包被浓度为1.3μg/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5％脱脂乳。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述A/AKT-Ⅲ株FMDV单克隆抗体9C10检测浓度为1.5μg/mL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，所述金标二抗浓度为0.025μg/mL。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述支持介质为酶标板。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴阳性对照及已确定146S含量的灭活的A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原标准品，所述阴性对照为FMDV病毒接种前细胞培养基，所述阳性对照为灭活的A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原，所述标准品为已知146S含量的灭活的A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原。
8.根据权利要求1～7所述A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒在非诊断目的的检测A/AKT-Ⅲ株口蹄疫及测定其抗原含量中的应用。
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