CN103076451A - 一种o型口蹄疫146s抗原定量elisa检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒及其使用方法，包括酶标板；O型口蹄疫标准对照抗原；破乳剂；口蹄疫O型兔抗血清；口蹄疫O型豚鼠抗血清；兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物；豚鼠抗血清稀释液；25倍PBST浓缩液；碳酸盐缓冲液胶囊；柠檬酸-磷酸盐缓冲液片剂；OPD片剂；终止液；封板膜；移液槽；96孔U型稀释板。本发明是蔗糖密度梯度离心、间接夹心ELISA方法的有机结合体，是集二者之长而去其不足，其操作简单、稳定性好、适合于批量检测，能区分血清型，是抗原定量和疫苗效力检验替代的理想方法。

Description

一种O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，具体地，涉及一种O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）是猪、牛、羊等主要家畜和其它偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的传染病，我国也将其列为一类动物传染病之首。

口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，有七个血清型：O型、A型、亚洲Ⅰ型、C型以及南非1、2、3型。各血清型之间没有交叉保护。现阶段我国主要流行O型、A型和亚洲Ⅰ型。

疫苗接种是预防、控制口蹄疫的有效手段之一。在我国，口蹄疫灭活疫苗使用最为广泛；为确保它安全有效，对其质量进行严格的控制极为必要。目前，国际上通用的疫苗效力检测方法是本动物攻毒保护试验，或采用PD₅₀测定法（欧洲）：即用疫苗50%动物保护剂量( PD₅₀)来评价疫苗免疫效果，常规疫苗需至少达到3个PD₅₀，紧急接种疫苗需至少达到6个PD₅₀；或采用（PGP）测定法（南美）：即用疫苗保护百分率（PGP）来评价疫苗免疫效果，PGP达到75%以上，该疫苗合格，PGP为62.5%～68.8%，需要进行重复检验，PGP小于62%，该疫苗不合格。本动物攻毒保护试验的动物必须是来自无口蹄疫地区、无口蹄疫病毒中和抗体的非疫苗免疫本动物。由于我国采取强制免疫手段控制口蹄疫的流行和暴发，所以筛选试验动物相当困难；另外，这种方法的成本高、周期长、重复性较差，且需要高安全动物舍，不易操作。

为此，研究者开展了多种检验方法的研究，尝试替代本动物攻毒保护试验。这些研究主要分为三类：血清学替代法、试验动物替代法和疫苗抗原定量法。

口蹄疫血清学效力检测替代方法是通过检测疫苗免疫后的抗体滴度水平来评价疫苗免疫效力，主要包括病毒中和试验和液相阻断ELISA试验。1968年，Stellman等提出了用中和抗体滴度分析疫苗效力的统计学方法；到1976年，Pay等根据中和抗体滴度和疫苗效力的关系建立了疫苗的抗原剂量、中和抗体滴度和保护率的相关公式。马军武等通过液相阻断ELISA检测疫苗免疫抗体与攻毒保护分析确定了牛、羊、猪等口蹄疫免疫抗体与攻毒保护的关系。疫苗免疫血清抗体效价检测须用非口蹄疫疫苗免疫动物，无法从根本上取代本动物的使用，动物的选择仍存在困难。

试验动物替代法是用试验动物（如小鼠、豚鼠等）代替本动物，进行疫苗效力检验。研究发现，用豚鼠进行牛口蹄疫灭活疫苗的效力试验，与本动物效力检验的 PD50之间有较好的相关性 (Eissner等1976; Terpstra等1976)， 也可用小鼠或BALB/c小鼠替代牛间接评价了口蹄疫灭活疫苗的效力（Sutmoller等 1980；DusSantos等2000）。替代性试验动物适合规模养殖，均一性容易控制，试验动物与本动物攻毒后的PD50呈一定的正相关关系，但替代性试验动物的与本动物的免疫反应有一定差别，而且替代性试验动物人工感染病毒时使用的是试验株，与天然感染在株系和感染途经上存在区别。

口蹄疫病毒在蔗糖密度梯度离心时，根据沉降系数不同，可以分为完整病毒粒子（146S或140S）、空衣壳（76S）、病毒感染相关肽（45S）、12 S蛋白亚单位（12S）。研究发现，完整病毒粒子（146S或140S）是口蹄疫灭活疫苗中诱导动物机体产生保护性免疫应答的主要成分，因此疫苗中完整病毒粒子含量与疫苗的免疫保护效力具有明显相关性。FMD疫苗抗原定量的各种方法也是据此研发的，主要包括蔗糖密度梯度离心法、单抗夹心ELISA法和尺寸排阻层析法。

1971年，Fayet等建立了用紫外光定量检测蔗糖梯度中口蹄疫完整病毒粒子（146S或140S）的方法；随后，Barteling and Meloen（1974）和Doel等对其进一步完善，并于1982年向OIE正式推荐。在此后的三十多年中，该方法一直作为口蹄疫疫苗抗原定量的经典方法被世界各国的口蹄疫疫苗研究者和供应商广泛使用。但这种方法也有其缺点：操作复杂、仪器昂贵、重复性较差、不适合大量样品检测，还不能区分血清型。

与之相比，Van Maanen等（1990年）和Crowther等（1995）建立的单抗夹心ELISA方法更具优势：操作简单、省时省力、稳定性好、适合于批量检测，且能区分血清型（在检测双价苗和多价苗尤为重要）。他们以针对VP1线性表位的中和性单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，建立了能检测146S 抗原的双抗夹心ELISA，且不受12 S蛋白亚单位存在的影响。但这样的单克隆抗体不容易分离到，限制了其广泛应用。

尺寸排阻色谱法，又称为凝胶过滤色谱，或分子筛色谱法，是一种液相色谱分离技术。主要用于大分子物质如蛋白质的分离。这一技术也被用于 FMD病毒粒子的分离、定量（Spitteler 等，2011），先将口蹄疫抗原用分子筛分离，再用紫外光测定（254nm），计算口蹄疫完整病毒粒子（140S）的含量。据报道，这种方法的检测结果与蔗糖密度梯度离心法的符合性很好，操作也较后者简单；但它同后者一样，不能区分血清型。

口蹄疫灭活疫苗本动物效力检验替代方法的探索是国内外面临和亟待解决的一个问题，有效的替代方法应该具有很好的特异性、敏感性和重复性，而且要易于标准化。

本研究以经典定量口蹄疫完整病毒粒子146S抗原的蔗糖密度梯度离心法为对照，建立了用间接夹心ELISA检测口蹄疫病毒细胞培养物及成品疫苗中完整病毒粒子146S抗原的方法。这种方法既保持了蔗糖密度梯度离心法的优势（国际公认），又具有ELISA方法的特长，因此，它敏感、特异、操作简单、省时省力、稳定性好、适合于批量检测，且能区分血清型，既可用于O型口蹄疫疫苗生产中半成品的在线监测，又可优化疫苗生产工艺，还可作为口蹄疫成品疫苗体外检验技术，评估疫苗的质量，替代本动物的效力试验。。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法及其试剂盒，它是蔗糖密度梯度离心、间接夹心ELISA方法的有机结合体，是集二者之长而去其不足。本发明操作简单、稳定性好、适合于批量检测，能区分血清型，是抗原定量和疫苗效力检验替代的理想方法。

本发明的基本原理是先用蔗糖密度梯度离心法对O型口蹄疫抗原进行定量（平行3次），以它为标准对照抗原，对其它样品进行ELISA检测。先用口蹄疫O型兔血清包被微孔板，制成固相抗体，依次加入抗原样品、口蹄疫O型豚鼠血清、辣根过氧物酶标记的抗豚鼠Ig G，形成包被抗体-抗原-第二抗体-酶标抗体复合物，再加底物溶液显色、加酸终止。颜色的深浅和样品中的O型口蹄疫146S抗原浓度呈正相关。用酶标仪在490nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中O型口蹄疫抗原的浓度。

O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒，主要包括以下组分： 

⑴ 酶标板（5块，规格96孔，未包被）；

⑵ O型口蹄疫标准对照抗原（5管，5 ml/管，浓度1.48μg/ml）；

⑶ 破乳剂（2ml）；

⑷ 口蹄疫O型兔抗血清（1管，70μl/管，工作浓度（1:1000））；

⑸ 口蹄疫O型豚鼠抗血清（1管，70μl/管，工作浓度（1:1000））；

⑹ 兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物（1管，120μl/管，工作浓度（1:500）；

⑺ 豚鼠抗血清稀释液；

⑻ 25倍PBST浓缩液（25×PBST，3瓶，60 ml/瓶）；

⑼ 碳酸盐缓冲液胶囊；

⑽ 柠檬酸-磷酸盐缓冲液片剂；

⑾ OPD片剂；

⑿ 终止液（1瓶，60ml/瓶）；

⒀ 封板膜；

⒁ 移液槽；

⒂ 96孔U型稀释板。

O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

A 、O型口蹄疫标准对照抗原的储备；

B、O型口蹄疫标准对照抗原146S的纯化：

利用蔗糖密度梯度法（45%、35%、25%、15%），获得146S抗原1.48μg/ml；

C、O型口蹄疫间接夹心ELISA方法的建立：

（1）包被ELISA板：用碳酸盐包被缓冲液稀释口蹄疫O型兔抗血清至工作浓度(1:1000)，混匀，每孔加50μl于底部，尽量不触及孔壁，轻轻震荡2-3分钟，使液体铺满孔底；用封板膜封板或置湿盒中室温过夜；

（2）洗涤ELISA板：小心揭掉封板膜，弃去液体，每孔加满洗涤液（1×PBST，磷酸盐吐温缓冲液），静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干；

（3）加样：用1×PBST将对照抗原和被检抗原（均平行加2列）从1:2（50μl抗原加50μl PBST）开始做2倍连续稀释至1:256；每孔加50μl，37℃，温育1小时；用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

（4）加二抗：用豚鼠抗血清稀释液稀释（含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST）口蹄疫O型豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000），每孔加50μl，封板，37℃，温育1小时；用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

（5）加酶：用1×PBST稀释兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度（1:500），每孔加50μl，37℃温育1小时；用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

（6）显色：每孔加50μl底物溶液（20mmol/L OPD，0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H2O2）），37℃温育15分钟；

（7）终止：每孔再加50 μl 终止液（1.25% H₂SO₄）终止反应；

（8）测定：在490nm 波长下读取光吸收值（OD490nm）；

D、标准对照抗原标准曲线的绘制：

以标准对照抗原的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线；

E、被检测抗原有效抗原含量的测定：

根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度；

F、敏感性和特异性的测定：

方法步骤E相同，将146S抗原作系列稀释，用标准对照抗原的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式的最小抗原含量；

特异性检测，将其它型的口蹄疫抗原作为被检抗原时，反应OD值小于标准对照抗原的敏感性检测值。

O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在口蹄疫抗原的含量测定和抗原分型中的应用。

以下为本发明所用试剂和材料的来源：

1、本试验中所用试剂由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

2、 146S纯化用抗原和被检抗原样品均有中农威特生物股份有效公司提供。

3、 Sigma公司: 辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG、OPD、碳酸盐缓冲液胶囊、柠檬酸磷酸盐片剂、PEG6000。ELISA板为costar公司生产，抗原稀释板由深圳金灿公司生产。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明建立了抗原定量的间接夹心ELISA方法，重点解决了O型口蹄疫抗原定量和疫苗效力检验替代问题。

2、本方法测定口蹄疫抗原的含量，既能计算出抗原含量，又能对抗原进行分型。本发明将在抗原生产在线监测、疫苗工艺优化、疫苗质量评估、疫苗效力检验等方面发挥重要作用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒使用方法示意图。

具体实施方式

产品及使用方法实施例：

O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒，主要包括以下组分：

⑴ 酶标板（5块，规格96孔，未包被）；

⑵ O型口蹄疫标准对照抗原（5管，5 ml/管，浓度1.48μg/ml）；

⑶ 破乳剂（2ml）；

⑷ 口蹄疫O型兔抗血清（1管，70μl/管，工作浓度（1:1000））；

⑸ 口蹄疫O型豚鼠抗血清（1管，70μl/管，工作浓度（1:1000））；

⑹ 兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物（1管，120μl/管，工作浓度（1:500）；

⑺ 豚鼠抗血清稀释液；

⑻ 25倍PBST浓缩液（25×PBST，3瓶，60 ml/瓶）；

⑼ 碳酸盐缓冲液胶囊；

⑽ 柠檬酸-磷酸盐缓冲液片剂；

⑾ OPD片剂；

⑿ 终止液（1瓶，60ml/瓶）；

⒀ 封板膜；

⒁ 移液槽；

⒂ 96孔U型稀释板。

本发明的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

A 、O型口蹄疫标准对照抗原的储备；

B、O型口蹄疫标准对照抗原146S的纯化：

利用蔗糖密度梯度法（45%、35%、25%、15%），获得146S抗原1.48μg/ml；

C、O型口蹄疫间接夹心ELISA方法的建立：

（1）包被ELISA板：用碳酸盐包被缓冲液稀释口蹄疫O型兔抗血清至工作浓度(1:1000)，混匀，每孔加50μl于底部，尽量不触及孔壁，轻轻震荡2-3分钟，使液体铺满孔底；用封板膜封板或置湿盒中室温过夜；

（2）洗涤ELISA板：小心揭掉封板膜，弃去液体，每孔加满洗涤液（1×PBST，磷酸盐吐温缓冲液），静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干；

（3）加样：用1×PBST将对照抗原和被检抗原（均平行加2列）从1:2（50μl抗原加50μl PBST）开始做2倍连续稀释至1:256；每孔加50μl，37℃，温育1小时；用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

（4）加二抗：用豚鼠抗血清稀释液稀释（含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST）口蹄疫O型豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000），每孔加50μl，封板，37℃，温育1小时；用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

（5）加酶：用1×PBST稀释兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度（1:500），每孔加50μl，37℃温育1小时；用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

（6）显色：每孔加50μl底物溶液（20mmol/L OPD，0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H2O2）），37℃温育15分钟；

（7）终止：每孔再加50 μl 终止液（1.25% H₂SO₄）终止反应；

（8）测定：在490nm 波长下读取光吸收值（OD490nm）；

D、标准对照抗原标准曲线的绘制：

以标准对照抗原的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线；

E、被检测抗原有效抗原含量的测定：

根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度；

F、敏感性和特异性的测定：

方法步骤E相同，将146S抗原作系列稀释，用标准对照抗原的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式的最小抗原含量；

特异性检测，将其它型的口蹄疫抗原作为被检抗原时，反应OD值小于标准对照抗原的敏感性检测值。

应用实施例

实施例1：O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在O型口蹄疫抗原定量中的应用。

用O型口蹄疫间接夹心ELISA方法对5份O型口蹄疫病毒146s抗原含量进行测定四次，结果稳定、重复性好（见表1）。

实施例2： O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在O型口蹄疫疫苗评估中的应用。

用O型口蹄疫间接夹心ELISA方法对3份O型口蹄疫灭活疫苗146s抗原含量进行测定（注：成品疫苗先用破乳剂（正丁醇）破乳，离心（4℃，5000rpm  20min），吸出抗原部分，再用ELISA方法检测）检测四次，结果稳定、重复性好（见表2）。

实施例3. O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在O型口蹄疫抗原和疫苗分型中的应用：

用O型口蹄疫间接夹心ELISA方法对其它型口蹄疫灭活疫苗（亚洲1型和A型）146s抗原含量进行测定，结果均低于其敏感性范围，表明该发明的特异性好（见表3）。

。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (4)

1.一种O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒，其特征在于，主要包括以下组分：

⑴ 酶标板（5块，规格96孔，未包被）；

⑵ O型口蹄疫标准对照抗原（5管，5 ml/管，浓度1.48μg/ml）；

⑶ 破乳剂（2ml）；

⑷ 口蹄疫O型兔抗血清（1管，70μl/管，工作浓度（1:1000））；

⑸ 口蹄疫O型豚鼠抗血清（1管，70μl/管，工作浓度（1:1000））；

⑹ 兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物（1管，120μl/管，工作浓度（1:500）；

⑺ 豚鼠抗血清稀释液；

⑻ 25倍PBST浓缩液（25×PBST，3瓶，60 ml/瓶）；

⑼ 碳酸盐缓冲液胶囊；

⑽ 柠檬酸-磷酸盐缓冲液片剂；

⑾ OPD片剂；

⑿ 终止液（1瓶，60ml/瓶）；

⒀ 封板膜；

⒁ 移液槽；

⒂ 96孔U型稀释板。

2.权利要求1所述的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下A-F的步骤：

A 、O型口蹄疫标准对照抗原的储备；

B、O型口蹄疫标准对照抗原146S的纯化：

利用蔗糖密度梯度法（45%、35%、25%、15%），获得146S抗原1.48μg/ml；

C、O型口蹄疫间接夹心ELISA方法的建立：

（1）包被ELISA板：用碳酸盐包被缓冲液稀释口蹄疫O型兔抗血清至工作浓度(1:1000)，混匀，每孔加50μl于底部，尽量不触及孔壁，轻轻震荡2-3分钟，使液体铺满孔底；用封板膜封板或置湿盒中室温过夜；

（2）洗涤ELISA板：小心揭掉封板膜，弃去液体，每孔加满洗涤液（1×PBST，磷酸盐吐温缓冲液），静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干；

（3）加样：用1×PBST将对照抗原和被检抗原（均平行加2列）从1:2（50μl抗原加50μl PBST）开始做2倍连续稀释至1:256；每孔加50μl，37℃，温育1小时；用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

（4）加二抗：用豚鼠抗血清稀释液稀释（含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST）口蹄疫O型豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000），每孔加50μl，封板，37℃，温育1小时；用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

（5）加酶：用1×PBST稀释兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度（1:500），每孔加50μl，37℃温育1小时；用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

（6）显色：每孔加50μl底物溶液（20mmol/L OPD，0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H2O2）），37℃温育15分钟；

（7）终止：每孔再加50 μl 终止液（1.25% H₂SO₄）终止反应；

（8）测定：在490nm 波长下读取光吸收值（OD490nm）；

D、标准对照抗原标准曲线的绘制：

以标准对照抗原的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线；

E、被检测抗原有效抗原含量的测定：

根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度；

F、敏感性和特异性的测定：

方法步骤E相同，将146S抗原作系列稀释，用标准对照抗原的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式的最小抗原含量；

特异性检测，将其它型的口蹄疫抗原作为被检抗原时，反应OD值小于标准对照抗原的敏感性检测值。

3.权利要求1所述的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在口蹄疫抗原的含量测定和抗原分型中的应用。

4.权利要求1所述的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在O型口蹄疫抗疫苗效力评估中的应用。

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