CN104478998A - 猪口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

猪口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体酶联免疫检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒。它包括口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽。本试剂盒使用化学合成非结构蛋白3ABC抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在口蹄疫病毒感染。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。

Description

猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，特别是猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
口蹄疫(foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种烈性传染病。口蹄疫的致死率很低，但是感染率很高。发病的主要症状为：口腔粘膜、舌、唇、鼻镜、蹄叉、乳头等部位发生水疱，破溃形成烂斑，病畜蹄痛卧地、严重者蹄壳边缘溃裂或脱壳。不同动物的症状稍有不同，妊娠母牛可能流产，而后导致繁殖力降低；猪则以破蹄为最主要症状；山羊和绵羊的症状通常比牛温和。口蹄疫传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严重危害畜牧业的发展和畜产品的生产供应。由于其在世界范围内广泛分布，能感染70多种家养和野生动物，且发病率极高(约为100％)，严重影响畜牧业生产和国际贸易，因而受到各国的高度重视。国际兽医局(OIE)在1984年修订的动物传染病分类中将口蹄疫列为A类传染病之首。
口蹄疫病毒(FMDV)是小RNA病毒科(picornavi-ridae)，口蹄疫病毒属(aphthovirus)的成员，由一条长约8500个核苷酸的单股、正链RNA和衣壳蛋白组成。病毒衣壳由4种结构蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成，其中VP1和VP3是主要免疫性抗原。口蹄疫病毒(FMDV)具有多型性、易变性等特点，具有7个血清型，分别为A、O、C、SATI、SATII、SATIII及AsiaI型，每个型又可分为若干个亚型，目前发现的亚型有70多个。由于不断发生抗原漂移，因此并不能严格区分亚型。血清型间几乎无交叉免疫反应，同一型内部不同毒株之间抗原性也有一定变化，这就给口蹄疫的诊断和防治工作带来很大难度。
口蹄疫病毒基因所编码产生的非结构蛋白有L、2A、2BC、3AB、3ABC、3D等，其中L蛋白的免疫原性比其他非结构蛋白弱，感染动物不一定能产生抗体，即使产生抗体，维持的时间也比较短。病毒感染动物可产生抗2B抗体，但这种抗体在ELISA反应中重复性不好，不能作为检测抗体。2C抗体由于消退的比3ABC快，且免疫牛中可检测到2C抗体，因此也不能作为检测指标。3D又称病毒感染相关抗原，没有型特异性，检测其抗体水平是评价动物是否接触过抗原的重要指标，也是国际贸易必检项目。目前认为仅检测3D抗体不能区分感染动物与免疫动物，因为疫苗中往往含有痕量的非结构抗原，经过多次免疫后，在免疫动物体内也能检测到3D抗体。3ABC聚蛋白中，3A免疫原性最强，3C免疫原性较弱。许多资料认为3ABC作为感染的标志可信度较大。检测3ABC抗体是确诊感染的重要指标。现在各国学者已达成共识，检测非结构蛋白3ABC或者3AB抗体是确认疫苗免疫动物是否感染FMD的最佳方法。
口蹄疫的防控主要是疫苗免疫及屠宰感染和可疑畜群。我国对口蹄疫施行强制性免疫，每年春秋进行一次集中免疫，两次之间对新补栏家畜及时进行补免。在实际生产中如何鉴别诊断易感动物是进行了疫苗免疫还是感染了口蹄疫病毒对口蹄疫防疫体系的建立、检验检疫都是十分重要的。用于口蹄疫诊断的血清学技术有补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(VNT)、间接血凝试验(IHA)等，其中ELISA是最常用的方法。ELISA的基本原理是将抗原或者抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，通过底物显色后用肉眼或者分光光度计判定结果。ELISA方法具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点，且能自动化操作，并能迅速的检测大量样品，在FMD的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测易感动物猪、牛等是否疫苗免疫或感染病毒的常规方法之一。
间接ELISA方法过程简单易于操作，并且有较高的敏感性。1997年意大利的De等建立了基于FMDV3ABC非结构蛋白的间接捕获ELISA技术，这种ELISA用单抗来捕获在大肠杆菌中表达的FMDV3ABC非结构蛋白。用此ELISA检测了大量疫苗免疫动物和感染动物，所有经过攻毒试验的动物其ELISA试验的OD值都大于0.2，超过99％的经过疫苗免疫动物ELISA结果为阴性(即小于0.2)，因此将OD值小于0.2的样品判为阴性。以上数据显示该方法敏感性很高。后经特异性试验证实，该方法的特异性超过99.5％。此方法可在免疫后8天测出3ABC非结构蛋白抗体，1年后仍能测出此抗体。2003年朱彩珠等建立了一种用于区分FMDV感染动物和疫苗免疫动物的间接ELISA，这种ELISA利用大肠杆菌表达的FMDV3ABC非结构蛋白作为抗原。试验结果证明，该ELISA方法的准确性比病毒感染相关抗原琼脂糖凝胶免疫扩散试验(VIAAAGID)高。2010年张润祥等为建立牛口蹄疫抗体的检测方法，将FMDV的VP2基因通过pPROEXTMHTb表达载体在大肠杆菌DH5α中表达，获得大小为35ku的重组VP2蛋白(rVP2)。以纯化rVP2为抗原建立了FMDV-rVP2间接ELISA方法。重复性实验证实批内、批间变异系数均小于10％。检测非免疫无口蹄疫国家牛阴性血清的特异性为100％；检测感染血清敏感性为97.3％；检测O-Asia Ⅰ二价苗免疫牛血清，与4种商品化试剂盒比较，其符合率分别为69.0％、95.0％、90.4％和86.8％，符合率较高，说明这种ELISA有良好的应用价值。
口蹄疫是关系到国家经济安全的重大动物疫病，相关关键技术应该牢牢掌握在自己手里。一旦我们拥有自主知识产权，将利于保障我国的经济安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的用于口蹄疫易感动物猪疫苗免疫与病毒感染的鉴别诊断的酶联免疫检测试剂盒。
本发明的猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒，包括猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽。
所涉及的包被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含有猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的主要抗原位点多肽，可与口蹄疫病毒感染后产生的非结构蛋白3ABC抗体特异结合。
所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG；所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体。
所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为化学人工合成得到。
本发明通过以下方式实现：采用猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的人工化学合成多肽包被的可拆96孔聚苯乙烯酶联反应板。同时，试剂盒中含有以辣根过氧化物酶标记的兔抗猪的IgG多克隆抗体酶结合物，阴性对照血清，阳性对照血清，样品稀释液，TMB底物溶液，20×浓缩洗涤液和终止液等组分。以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测样品中的3ABC蛋白抗体。
所涉及的酶联反应板的最佳制备条件是：包被时将多肽抗原溶于pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng抗原，在37℃放置2～4h，再4～8℃下放置过夜(8～12h)使多肽抗原与酶联反应板充分结合。然后按照300μl/孔加入含1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(pH＝7.4)，37℃封闭处理2～3h，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后密封4℃保存。
所述试剂盒中含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.06％(g/ml)过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；使用时两者以1：1的比例混合。当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无口蹄疫抗体的正常猪血清；所述阳性对照血清为以所述口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为免疫原免疫猪得到的血清；
所涉及的阳性对照血清具体是以人工化学合成的非结构蛋白3ABC抗原表位多肽作为免疫原，免疫25～35日龄无特定病源体(SPF)猪，制备高免血清，加入1000U/ml链霉素和青霉素，过滤径为0.2μm的滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。
所涉及的阴性对照血清具体是用无口蹄疫抗体的正常猪血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过滤径为0.2μm的滤膜除菌，作为试剂盒阴性血清。
所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液(过滤径为0.45μm滤膜)；所述浓缩洗涤液为0.01M，pH7.4，含有0.5％(ml/ml)Tween-20的磷酸盐缓冲液(经过滤径为0.2μm的滤膜除菌)。
本发明试剂盒的检测程序为：
1.平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min后使用，液体试剂用前混匀。
2.配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用。
3.设定：留1个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4.待测标本预稀释：往稀释板孔内每孔加100μl样本稀释液，分别加入5μl待测样本。
5.加样：空白孔不加样；3个阴性对照孔各加100μl阴性对照，2个阳性对照孔各加100μl阳性对照；其余孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6.温育：震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。
7.洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤液300μl，浸泡15s，甩弃洗液。连续洗板4次后拍干。
8.加酶：空白孔不加酶；其余各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体(艳红色)。
9.温育：置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。
10.洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液。连续洗板5次后拍干。
11.显色：每孔(包括空白对照孔)依次加入显色底物液A、显色底物液B各50μl，震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，显色15min。
12.终止：每孔(包括空白对照孔)加入显色终止液各50μl，振荡混匀终止反应。
13.测定：用空白对照孔调零后测定各孔450nm的OD值。也可用双波长450nm/630nm测定各孔OD值。
本发明试剂盒的检测结果的判定：
1.阴性对照OD平均值应该≤0.2，否则无效。
2.阳性对照每个检测值应该在0.5到2.0之间，否则无效。
3.临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照平均OD值。
4.结果判定：样本测定OD值≥临界值者判为阳性；样本测定OD值<临界值者判为阴性(建议对OD值<临界值，≥0.5倍临界值的样本跟踪观察)。
本发明的上述试剂盒，可以用于检测所述口蹄疫病毒病，具体可以为猪口蹄疫病毒引起的猪口蹄疫病毒病。
本发明的积极效果在于：本发明采用生物信息学方法对非结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从3ABC蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段。该肽段集中了抗原表位，具有灵敏性高、特异性强的优点。
同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板以及制备试剂盒中的阳性对照血清。
另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一步提高检测口蹄疫非结构蛋白抗体的效率，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒。
总之，本试剂盒采用化学合成3ABC抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地鉴别口蹄疫易感动物猪是感染了病毒还是接受了疫苗免疫。同时可以根据结果进行免疫效果的评价。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。实验结果表明，试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。可以有效地检测口蹄疫病毒感染后产生的非结构蛋白抗体，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
本发明所涉及的猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒用于口蹄疫易感动物猪、牛等疫苗免疫与病毒感染的鉴别诊断，有利于减少我国口蹄疫爆发所带来的损失，也有利于我国口蹄疫防控体系的建立。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原制备
本发明采用生物信息学方法对非结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从3ABC蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段，即口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽，其序列如序列表中序列1所示。将该多肽作为本发明试剂盒的包被原制备猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒。
本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink AmideMBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：
一、包被抗原固相合成
1、合成试剂的准备
合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自NOVA公司)，加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称取树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100％的NMP、3％的AIM(已酰咪唑)、35％的PIP(哌啶)、100％的MeOH(甲醇)等放置到相对应的试剂瓶中。
2、合成仪状态的检测
检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常(433A正常表压10.2psi)。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu—Module Test—按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求(具体检测要求见下表1)。
表1.多肽合成仪流速检测标准表
试剂 瓶号 Module 标准范围
35％Piperidine 1 A 1.0～1.2ml
3％AIM 4 D 1.0～1.2ml
100％MeOH 9 I 3.5～4.0ml
DIC 8 I 0.45～0.55g
100％NMP 10 A 2.6～2.8ml
3、包被抗原合成开始
在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc1.0SolDIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry是否为Std Fmoc1.0Sol DIC90；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。
Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。
4、包被抗原合成进行
Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应时用哌啶(PIP)进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出“－NH2”基团以进行合成反应。然后加入活化的下一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，HOBT)至反应器内。
如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断地重复合成步骤(合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2)。期间观察记录试剂用量及运行情况。
表2.包被抗原合成循环步骤
5、包被抗原合成结束
包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂(肽现在还连接在树脂上)基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。
二、包被抗原的裂解及鉴定
1、多肽抗原的裂解
经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保护基。
步骤如下：
从冰箱内取出合成的多肽树酯(指肽还连接在树脂上)，放入一只2L的圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸(Trifluoroaceticacid,TFA)、10ml的三丙基硅烷(TIS)和磁搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120min除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到包被抗原。
2、包被抗原的鉴定
多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法(MODAL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。
3、包被抗原纯化
将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤(用PALL公司生产的Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。
4、包被抗原冷冻干燥
为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的包被抗原。包装后贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。
实施例2、猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒的组成
猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒包括：
(1)包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。
(2)辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体(购自sigma公司，货号A5670)，2瓶(各12ml)。
(3)阳性对照血清：是以实施例1中人工化学合成的包被抗原作为免疫原，免疫25-35日龄无特定病源体(SPF)猪制备的高免血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。1管(1ml)。
(4)阴性对照血清：是用无口蹄疫抗体的正常猪血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清。1管(1.5ml)。
(5)底物显色液：由两种溶液混合组成，底物显色溶液A为含0.06％(g/ml)过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓液；底物显色溶液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液；使用时两者以1：1的比例混合。
(6)浓缩洗涤液(20×)：含有0.5％(ml/ml)Tween-20的0.01M的PBS缓冲液，pH为7.4，后经过0.2μm滤膜除菌。
(7)显色终止液：2mol/L的硫酸溶液。1瓶(12ml)。
(8)样品稀释液：含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液，过0.45μm滤膜。2瓶(各12ml)。
根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板2块(96孔)，用于血清样品的梯度稀释。
其中，包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：将实施例1制备的多肽抗原溶于pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng抗原，在37℃放置2～4h，再4～8℃下放置过夜使多肽抗原与酶联反应板充分结合。然后按照300μl/孔加入含1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(pH＝7.4)，37℃封闭2～3h，用洗涤缓冲液(浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液)洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
实施例3、猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒的检测方法
1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min后使用，液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用。
3、设定：留1个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：往稀释板孔内每孔加100μl样本稀释液，分别加入5μl待测样本。
5、加样：空白孔不加样；3个阴性对照孔各加100μl阴性对照，2个阳性对照孔各加100μl阳性对照；其余孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。
7、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤液300μl，浸泡15s，甩弃洗液。连续洗板4次后拍干。
8、加酶：空白孔不加酶；其余各孔加100μl兔抗猪IgG抗体辣根酶结合物(艳红色)。
9、温育：置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液。连续洗板5次后拍干。
11、显色：每孔(包括空白对照孔)依次加入显色底物液A、显色底物液B各50μl，震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，显色15min。
12、终止：每孔(包括空白对照孔)加入显色终止液各50μl，振荡混匀终止反应。
13、测定：用空白对照孔调零后测定各孔450nm的OD值。也可用双波长450nm/630nm测定各孔OD值。
本发明试剂盒的检测结果的判定：
(1)阴性对照OD平均值应该≤0.2，否则无效。
(2)阳性对照每个检测值应该在0.5到2.0之间，否则无效。
(3)临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照平均OD值。
结果判定：样本测定OD值≥临界值者判为阳性；样本测定OD值<临界值者判为阴性(建议对OD值<临界值，≥0.5倍临界值的样本跟踪观察)。
实施例4、猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒敏感性试验
使用实施例2制备的三批猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒(批次号ZM2013001、ZM2013002、ZM2013003)，依照实施例3中猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法，对218份猪口蹄疫病毒感染血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)检测敏感性试验。检测结果见表3。
表3.猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒敏感性检测结果
实施例5、猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒最低检测限量试验
对猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒3个批次(批次号ZM2013001、ZM2013002、ZM2013003)进行最低检测限量的测定。检测阳性参考血清(猪口蹄疫O型病毒OR/80毒株感染猪血清)，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。检测阴性参考血清，即健康猪血清，中牧实业股份有限公司保山厂提供。
将阳性参考血清和阴性参考血清分别进行1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280和1:2560倍稀释后，用猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒进行检测，以此确定本试剂盒的最低检测限量。
猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒的最低检测限量试验结果如下表(表4、5和6)所示。结果显示，猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒能够检测阳性参考血清的最大稀释倍数为320倍。
表4、ZM2013001试剂盒的最低检测限量试验
表5.ZM2013002试剂盒的最低检测限量试验
表6.ZM2013003试剂盒的最低检测限量试验
实施例6、猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒的特异性试验
使用实施例4中的三批试剂盒依照实施例3中所述的猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法对300份健康猪血清(中牧实业股份有限公司保山厂和兰州生物药厂提供)、2份猪瘟(HC)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、2份猪水泡病(SVD)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、2份猪圆环病毒(PCV)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、2份猪PRRS病毒阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、分别进行检测。
试剂盒的特异性检测结果如下表(表7)显示，对300份健康猪血清的检测结果显示，ZM2013001试剂盒的特异性为98.7％，ZM2013002试剂盒的特异性为99.0％，ZM2013003试剂盒的特异性为99.3％。对2份猪瘟(HC)阳性血清、2份猪水泡病(SVD)阳性血清、2份猪圆环病毒(PCV)阳性血清、2份猪PRRS病毒阳性血清检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒对这8份阳性血清检测的特异性均为100％。
表7.猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒特异性检测结果
实施例7、猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒保存期试验
猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒的实际保存期试验操作如下：
本研究用实验室试制的3批猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒，每批随机抽取6个试剂盒，置2～8℃保存，分别于0、3、6、9、12和15个月取出进行检测。结果表明：试剂盒在2～8℃保存0、3、6、9、12和15个月后试剂盒性状和无菌检验符合试剂盒检验标准；试剂盒敏感性检验符合标准；特异性检测20份特异性质控血清均为阴性。考虑到实际应用中的不确定因素，为保证试剂盒能够达到最佳使用效果，因而将试剂盒的保存期暂定为2～8℃保存12个月。
批号ZM2013001试剂盒的检测结果(表8)显示，血清样本组S-1到S-4(阳性血清组)呈现大于1的吸收值/临界值(S/C)比值，与预期的血清样本组可接受的S/C值范围100％相符合；而阴性反应血清样本组S-5及S-6则呈现小于1的S/C比值，与预期的血清样本组可接受的S/C值范围100％相符合。因此本试剂盒在2～8℃的稳定性可维持15个月以上。
表8.批号ZM2013001的实际保存期试验结果(S/C值)(2-8℃)
批号ZM2013002试剂盒的检测结果(表9)显示，血清样本组S-1到S-4(阳性血清组)呈现大于1的吸收值/临界值(S/C)比值，与预期的血清样本组可接受的S/C值范围100％相符合；而阴性反应血清样本组S-5及S-6则呈现小于1的S/C比值，与预期的血清样本组可接受的S/C值范围100％相符合。因此本试剂盒在2-8℃的稳定性可维持15个月以上。
表9.批号ZM2013002的实际保存期试验结果(S/C值)(2-8℃)
批号ZM2013003试剂盒的检测结果(表10)显示，血清样本组S-1到S-4(阳性血清组)呈现大于1的吸收值/临界值(S/C)比值，与预期的血清样本组可接受的S/C值范围100％相符合；而阴性反应血清样本组S-5及S-6则呈现小于1的S/C比值，与预期的血清样本组可接受的S/C值范围100％相符合。因此本试剂盒在2-8℃的稳定性可维持15个月以上。
表10.批号ZM2013003的实际保存期试验结果(S/C值)(2-8℃)

Claims (9)

1.一种多肽，为序列表中序列1所示。
2.一种猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒，包括猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为序列表中序列1所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG，所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为化学人工合成得到。
5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶联反应板的获得方法是将所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng抗原，在37℃放置2～4小时，再4-8℃下放置8～12小时使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1g/100ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.06％(g/ml)过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无口蹄疫抗体的正常猪血清；所述阳性对照血清为以所述口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为免疫原免疫猪得到的血清。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5％(g/100ml)酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液；所述浓缩洗涤液为0.01M，pH 7.4，含有0.5％(ml/ml)Tween-20的磷酸盐缓冲液。
9.权利要求1所述的多肽在制备检测是否感染动物口蹄疫病毒病的试剂盒中的应用；其中，动物口蹄疫病毒病为猪口蹄疫病毒病。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106397546A (zh) * 2016-10-31 2017-02-15 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用
CN106596932A (zh) * 2016-11-25 2017-04-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪口蹄疫3abc和2c抗体化学发光检测试剂盒
CN108226494A (zh) * 2018-01-17 2018-06-29 郑州中道生物技术有限公司 猪繁殖与呼吸综合征病毒elisa抗体检测试剂盒
CN108872576A (zh) * 2018-07-12 2018-11-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于塞尼卡谷病毒非结构蛋白3abc抗体检测的化学发光免疫分析试剂盒
CN111273036A (zh) * 2020-03-06 2020-06-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测口蹄疫非结构蛋白抗体的单抗竞争化学发光试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101226193A (zh) * 2007-12-24 2008-07-23 浙江大学 鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的elisa试剂盒
CN103864906A (zh) * 2014-03-13 2014-06-18 中牧实业股份有限公司 口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101226193A (zh) * 2007-12-24 2008-07-23 浙江大学 鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的elisa试剂盒
CN103864906A (zh) * 2014-03-13 2014-06-18 中牧实业股份有限公司 口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENTTINA-JUDITH HOHLICH: "Identification of foot-and-mouth disease virus-specific linear B-cell epitopes to differentiate between infected and vaccinated cattle", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
F. SHEN ET AL.: "Differentiation of convalescent animals from those vaccinated against foot-and-mouth disease by a peptide ELISA", 《VACCINE》 *
JAE KU OEM ET AL.: "Development of an epitope-bloking-enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate animals infected with and vaccinated against foot-and-mouth disease virus", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106397546A (zh) * 2016-10-31 2017-02-15 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用
CN106397546B (zh) * 2016-10-31 2020-07-31 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用
CN106596932A (zh) * 2016-11-25 2017-04-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪口蹄疫3abc和2c抗体化学发光检测试剂盒
CN108226494A (zh) * 2018-01-17 2018-06-29 郑州中道生物技术有限公司 猪繁殖与呼吸综合征病毒elisa抗体检测试剂盒
CN108226494B (zh) * 2018-01-17 2020-07-24 郑州中道生物技术有限公司 猪繁殖与呼吸综合征病毒elisa抗体检测试剂盒
CN108872576A (zh) * 2018-07-12 2018-11-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于塞尼卡谷病毒非结构蛋白3abc抗体检测的化学发光免疫分析试剂盒
CN111273036A (zh) * 2020-03-06 2020-06-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测口蹄疫非结构蛋白抗体的单抗竞争化学发光试剂盒
CN111273036B (zh) * 2020-03-06 2021-06-15 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测口蹄疫非结构蛋白抗体的单抗竞争化学发光试剂盒

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