CN105527423B

CN105527423B - 一种检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试剂盒及定量检测方法

Info

Publication number: CN105527423B
Application number: CN201510923250.7A
Authority: CN
Inventors: 冯霞; 马军武; 孙世琪; 靳野; 郭慧琛; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2035-12-14
Also published as: CN105527423A

Abstract

本发明提供一种定量检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括猪水泡病毒标准抗原、猪水泡病毒特异性第一抗体、猪水泡病毒特异性第二抗体和酶标抗体。本发明还提供上述酶联免疫试剂盒在定量检测猪水泡病毒抗原中的应用。本发明是蔗糖密度梯度离心、ELISA方法的有机结合体，是集二者之长而去其不足。本发明操作简单、稳定性好、适合于批量样品检测，是抗原定量和疫苗中有效抗原含量检验的理想方法。因此，本发明的方法在SVDV抗原生产、实时监测、疫苗质量评估等方面能够发挥重要作用。

Description

一种检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试剂盒及定量检测方法

技术领域

本发明属于酶联免疫技术领域，具体涉及一种检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试剂盒及定量检测方法。

背景技术

猪水泡病（Swine Vesicular Disease,SVD）是由小RNA病毒科肠道病毒属的病毒引起的一种高度接触性传染病。它通过与感染猪的直接接触或污染的环境迅速传播，猪在污染的环境中只需一天，就能产生病毒血症。潜伏期为2-7天。本病的临床症状与口蹄疫极其相似，均以口、鼻黏膜和蹄部、乳头部出现水疱或溃烂为特征。与口蹄疫一样，也属于A类传染病。该病最早发现于意大利（1966年），曾在我国大陆肆略一时，欧亚的许多国家也有爆发流行。目前，其大规模流行已得到控制；但近些年，台湾、香港、意大利和葡萄牙等国有过爆发。由于它与口蹄疫、水泡性口炎等疾病在临床症状上无法区分，必需进行实验室诊断，所以对该病的技术储备必不可少。

猪水泡病病毒（SVDV）为单股正链RNA，约7400核苷酸组成。基因组含一个单一的开放阅读框，编码一个多聚蛋白前体，后者在感染细胞的胞浆中进一步加工，产生不同的病毒聚多肽：第一次剪切产生P1、P2和P3，再次加工后，P1产生了结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4），P2和P3产生非结构蛋白。在成熟的病毒粒子中，VP1、VP2和VP3蛋白（分别为33、32和29kDa）位于外表面，形成一个致密的蛋白外壳；相反，VP4（约7.5 kDa）位于衣壳的内部，与病毒RNA分子相互作用。

SVDV是人源病毒柯萨奇B5（CV B5）的猪体变种，二者在分子结构和抗原性上的关系暗示在1945-1965年的某个时间，CV B5跨越种间屏障，从人的病原变为一种猪的病原。

在密度梯度离心时，SVDV完整病毒粒子的沉降系数为156S。其表面有5-7个中和位点，还至少有7个抗原区，是猪水泡病灭活疫苗中诱导动物机体产生保护性免疫应答的主要成分，其含量与抗原的免疫原性及疫苗的免疫保护效力明显相关。

1984年，Ferris et al.建立了用紫外光定量检测蔗糖梯度中猪水泡病完整病毒粒子（156S）的方法。此后，该方法作为SVDV抗原定量的经典方法被大家广泛使用。但其缺点是：仪器昂贵、操作复杂、重复性较差、不适合大批量样品检测。而且操作者的熟练程度及对关键步骤的处理对实验结果影响很大，很难标准化。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种定量检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试剂盒及猪水泡病毒抗原的定量检测方法，它以定量SVDV 完整病毒粒子156S抗原的蔗糖密度梯度离心法为对照，建立了用多抗间接夹心ELISA检测SVDV细胞培养物及疫苗中完整病毒粒子156S抗原的方法。这种方法既保留了密度梯度离心法的优势，又具有ELISA的特长：敏感、特异、快速、简单、稳定性好、适合于批量检测，既可用于SVDV抗原增殖时的在线监测，又可作为SVDV成品疫苗体外检验技术，评估疫苗的质量。

本发明提供一种定量检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括猪水泡病毒标准抗原、猪水泡病毒特异性第一抗体、猪水泡病毒特异性第二抗体和酶标抗体；

所述猪水泡病毒标准抗原的制备与赋值：将猪水泡病毒株进行病毒的复壮、繁殖和灭活，得到灭活后的猪水泡病毒抗原，此即为标准抗原，将标准抗原用改进的蔗糖密度梯度离心法进行纯化和定量，得到猪水泡病毒标准抗原的含量；

所述改进的蔗糖密度梯度离心法的步骤如下：

（1）在灭活的猪水泡病毒抗原中加入等体积的三氯乙烯振摇，离心，取上层水相进行超速离心；

（2）将沉淀用缓冲液重悬，加入NP40混匀；

（3）将不同浓度的蔗糖按浓度从大到小依次加入到离心管中，平衡以形成密度梯度；（4）取步骤（2）中的重悬液加入到步骤（3）的离心管上层，超速离心，收集梯度液，在波长260nm紫外分光光度仪检测，收取156S峰值处样品，计算出其含量；

所述猪水泡病毒特异性第一抗体的制备方法为：将猪水泡病毒抗原用蔗糖密度梯度离心法纯化，调整浓度，加入弗氏完全佐剂乳化，用其免疫兔子，免疫后采血分离血清，得到猪水泡病毒特异性第一抗体；

所述猪水泡病毒特异性第二抗体的制备方法为：将猪水泡病毒抗原用蔗糖密度梯度离心法纯化，调整浓度，加入弗氏完全佐剂乳化，用其免疫豚鼠，免疫后采血分离血清，得到猪水泡病毒特异性第二抗体。

作为优选，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠抗体。

作为优选，所述试剂盒还包括用于稀释猪水泡病毒特异性第二抗体的阻断稀释液，所述阻断稀释液为：含体积百分比为10%正常牛血清和含体积百分比为5%健康兔血清的PBST。

本发明还提供上述酶联免疫试剂盒的使用方法，是用猪水泡病毒特异性第一抗体包被ELISA板，制成固相抗体，依次加入标准抗原或待检抗原样品、猪水泡病毒特异性第二抗体、酶标抗体，再加底物溶液显色，加酸终止，测定OD₄₉₀nm值。

本发明还提供上述酶联免疫试剂盒在定量检测猪水泡病毒抗原和猪水泡病毒疫苗156S抗原中的应用。

本发明还提供一种定量检测猪水泡病毒抗原的方法，用猪水泡病毒特异性第一抗体包被ELISA板，制成固相抗体，依次加入不同浓度的标准抗原或待检抗原样品、猪水泡病毒特异性第二抗体、酶标抗体，再加底物溶液显色，加酸终止，测定OD₄₉₀nm值；根据测定吸光度值和标准抗原浓度绘制标准曲线方程，根据标准曲线方程和待检抗原样品的吸光度值来计算待检抗原样品的浓度。

作为优选，所述猪水泡病毒标准抗原的制备与赋值制备方法为：用猪水泡病毒株进行病毒的复壮、繁殖和灭活，得到标准抗原；将标准抗原用改进的蔗糖密度梯度离心法进行纯化和定量，得到猪水泡病毒标准抗原的含量；

所述改进的蔗糖密度梯度离心法的步骤如下：

（2）将沉淀用缓冲液重悬，加入NP40混匀；

所述猪水泡病毒特异性第一抗体的制备方法为：将猪水泡病毒抗原用蔗糖密度梯度离心法纯化，调整浓度，加入弗氏完全佐剂乳化，用其免疫兔子，免疫后采血分离血清，得到猪水泡病毒特异性第一抗体。

作为优选，所述猪水泡病毒特异性第二抗体是用阻断稀释液稀释的，所述阻断稀释液为：含质量百分比为10%正常牛血清和含质量百分比为5%健康兔血清的PBST。

本发明还提供一种定量检测猪水泡病毒疫苗156S抗原的方法，将猪水泡病毒疫苗先用正戊醇破乳，4℃，3000rpm 10min离心，吸出抗原部分，再用ELISA方法检测；所述ELISA方法检测的具体方法为：

用猪水泡病毒特异性第一抗体包被ELISA板，制成固相抗体，依次加入不同浓度的标准抗原或待检抗原样品、猪水泡病毒特异性第二抗体、酶标抗体，再加底物溶液显色，加酸终止，测定OD₄₉₀nm值；根据测定吸光度值和标准抗原浓度绘制标准曲线方程，根据标准曲线方程和待检抗原样品的吸光度值来计算待检抗原样品的浓度；

作为优选，所述猪水泡病毒标准抗原的制备与赋值：用猪水泡病毒株进行病毒的复壮、繁殖和灭活，得到标准抗原；将标准抗原用改进的蔗糖密度梯度离心法进行纯化和定量，得到猪水泡病毒标准抗原的含量；

所述改进的蔗糖密度梯度离心法的步骤如下：

（2）将沉淀用缓冲液重悬，加入NP40混匀；

本发明先对SVDV抗原进行增殖、灭活，再用蔗糖密度梯度离心法对SVDV抗原进行定量（平行4-5次，保证至少有3次的结果接近），以它为标准抗原，对其它样品进行ELISA检测；用156S抗原免疫实验动物制备检测血清；然后进行间接夹心ELISA检测，其步骤如下：用SVDV特异性第一抗体包被ELISA板，制成固相抗体，依次加入标准抗原和待检抗原样品、SVDV特异性第二抗体、辣根过氧物酶标记的Ig G，形成第一抗体-抗原-第二抗体-酶标抗体复合物，再加底物溶液显色、加酸终止。颜色的深浅和样品中的猪水泡病156S抗原浓度遵循一定的数学公式。用酶标仪在490nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线（即二者之间的数学公式）计算样品中猪水泡病156S抗原的含量。

本发明是蔗糖密度梯度离心、ELISA方法的有机结合体，是集二者之长而去其不足。本发明操作简单、稳定性好、适合于批量样品检测，是抗原定量和疫苗中有效抗原含量检验的理想方法。因此，本发明的方法在SVDV抗原生产、实时监测、疫苗质量评估等方面能够发挥重要作用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为将SVDV间接夹心ELISA方法检测的156S抗原OD₄₉₀输入EXCEL表格，并求出“标准抗原平均值”；

图2为以CurveExpert软件绘制“标准抗原平均值”的标准曲线，寻找最佳标准曲线方程；

图3为将最佳标准曲线方程输入EXCEL表格：不同系数分别拷贝到固定单元格，输入浓度计算公式（编辑栏）；

图4为按照标准曲线方程确定被检样品抗原含量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

材料或试剂：

SVDV毒株由国家口蹄疫参考实验室馈赠。

辣根过氧化物酶标记的IgG、OPD、碳酸盐缓冲液胶囊、柠檬酸磷酸盐片剂、无RNA酶DNA酶的蔗糖、PEG 6000 等均为Sigma公司产品。ELISA板为costar公司生产，抗原稀释板由深圳金灿公司生产。

实施例1

1、SVDV抗原的增殖：用生产性能好、特异性强、免疫原性高的SVDV毒株进行病毒的复壮、繁殖、免疫。用传代猪肾细胞IB-RS-2增殖培养SVDV（这种繁殖、复制SVDV的方法是DeCastro于1964年提出的），在IB-RS-2细胞培养约40h、细胞融合度达70-75%时接种病毒，至细胞病变到达90-95%收获病毒，-30℃保存（半数感染量TCID₅₀应≥10^-7.5）。待收集的病毒液达到3 000-5 000mL时，反复冻融4次，释放出SVDV，然后按《OIE疫苗手册 2008》程序进行灭活、阻断。4℃保存备用。

2、SVDV标准抗原的储备：将已经灭活的SVDV抗原或按2mL /支分装，或按 5×90mL分装，均于-80℃保存。前者作为ELISA检测时的标准抗原，后者进行156S抗原纯化、定量，计算出SVDV标准抗原中156S抗原含量（保证可进行4-5次试验，至少有三次的结果相近）。

3、SVDV 156S抗原的纯化、定量：

（1）免疫用156S抗原的纯化、定量

取3 000ml灭活的SVDV抗原加入240g聚乙二醇6000和120g氯化钠在冰浴中搅拌6小时，4℃静置过夜；5 000g 4℃离心55min，弃上清液。沉淀物用“研磨重悬装置”（专利号：201420465197.1）进行研磨重悬，缓冲液为pH 7.6 的Tris-HCl，悬浮至100ml，然后加入三氯乙烯振摇25 min，4℃离心15 min，取出水相；在超速离心机上140 000g 4℃离心150min，再用4ml pH 7.6 的Tris-HCl缓冲液重悬（分3次），按体积百分比1%的量加入NP40混匀，4℃过夜；制备20%、30%、40%、50%蔗糖，按浓度从大到小依次加入离心管中，4℃平衡过夜以形成密度梯度；取1ml SVDV重悬液加入梯度管上层，150 000g 4℃离心120 min，0.65ml从上至下收集梯度液，在波长260nm紫外分光光度仪检测，收取156S峰值处样品，计算出其含量。备用。

（2）SVDV标准抗原的纯化、定量

取3 000ml灭活的SVDV抗原，加入等体积预冷的三氯乙烯振摇20min，5 000g 4℃离心 20min,取上层水相，直接进行超速离心（140 000g 4℃离心150min)，将病毒沉淀下来；再用4ml pH 7.6 的Tris-HCl缓冲液重悬（分3次），按体积百分比1%的量加入NP40混匀，4℃过夜；制备20%、30%、40%、50%蔗糖，按浓度从大到小依次加入离心管中，4℃平衡过夜以形成密度梯度；取1ml SVDV重悬液加入梯度管上层，150 000g 4℃离心120 min，0.65ml从上至下收集梯度液，在波长260nm紫外分光光度仪检测，收取156S峰值处样品，计算出其含量。使用“研磨重悬装置”（专利号：201420465197.1）对离心沉淀物进行研磨重悬。该装置可有效避免常规操作时156S 抗原的降解，提高纯化产量。平行3次以上，求得SVDV标准抗原156S含量为2.56μg/mL。

本发明对SVDV标准抗原的纯化、定量方法加以改进，舍弃聚乙二醇6000沉淀的程序，直接进行三氯乙烯脱脂处理，从而减少了用聚乙二醇6000沉淀所丢失的156S抗原，降低损失至少达到15%。

4、SVDV特异性检测血清的制备：

用30%蔗糖调步骤3-（1）中纯化的SVDV 156S 抗原浓度，使其含量为200μg/mL。加入等体积弗式完全佐剂乳化（Sigma公司产品），至抗原与佐剂完全均匀混合（滴入水中1min不会扩散），用它免疫兔子（5只）和豚鼠（20只）：兔子每只颈背皮下分6-8点注射1mL乳化物，即100μg 156S 抗原/只；豚鼠每只两后腿肌肉分6-8点注射0.3mL乳化物，即30μg 156S 抗原/只。28天后，用等量乳化物进行二次免疫，注射部位及方式与第一次相同。兔子二次免疫后10天颈动脉采血，分离血清（混合）。豚鼠二次免疫后20天心脏采血，分离血清（混合）；将上述得到的血清分别在56℃水浴灭活30min，加入1‰ ProClin 300 (SUPELCO,BELLEFONTE, PA ,USA)，分成小份， 5mL/瓶，-80℃冻存，备用。用ELISA方法检测二者的效价，SVDV特异性兔血清为1:6000，SVDV特异性豚鼠血清为1:4000。

5、SVDV间接夹心ELISA方法的建立

反应体系50μl。

① 第一抗体包被：以SVDV特异性兔血清为第一抗体。用包被缓冲液稀释第一抗体至工作浓度(1:6000，首先配制成60倍的贮存液，使用时再进行1:100的稀释)，混匀，ELISA板的每孔加50μl于底部，尽量不触及孔壁，轻轻震荡2-3分钟，使液体铺满孔底。用封板盖覆盖，37℃，温育40min。

② 洗涤ELISA板：取封板盖，弃去液体，每孔加200μL洗涤液（1×PBST），弃去，如此重复4次，拍干（可使用酶标板拍干包，专利号201520326507.6，也可以人工拍干）。

③ 加抗原：用1×PBST将标准抗原和被检抗原（均平行加2列）从1:2（50μl抗原加50μl PBST）开始做2倍连续稀释至1:256。每孔加50μl，37℃，温育40 min。用PBST洗涤ELISA板4次，拍干。

④ 加第二抗体：以SVDV特异性豚鼠血清为第二抗体。用阻断稀释液稀释（含体积百分比为10%正常牛血清，体积百分比为5%健康兔血清的PBST，应用阻断稀释液可以有效降低非特异性吸附，减小背景值）第二抗体至工作浓度（1:4000，首先配制成40倍的贮存液，使用时再进行1:100的稀释），每孔加50μl，封板，37℃，温育30 min。用PBST洗涤ELISA板4次，拍干。

⑤ 加酶：用1×PBST稀释兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度（1:500），每孔加50μl，37℃温育30 min。用PBST洗涤ELISA板4次，拍干。

⑥ 显色：每孔加50μl底物溶液（20mmol/L OPD，0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H₂O₂），37℃温育15分钟。

⑦ 终止：每孔再加50 μl 终止液（1.25% H₂SO₄）终止反应。

⑧ 测定：在490nm 波长下读取光吸收值（OD₄₉₀nm）。

6. 标准曲线的绘制及样品抗原含量的计算

以标准抗原的浓度为纵坐标（蔗糖密度梯度离心法测得），OD值为横坐标（ELISA获得），绘制标准曲线，由标准曲线查出检测样品的OD值对应的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度（更为稳定、准确）。具体如下：

① 将SVDV间接夹心ELISA方法检测的156S抗原OD₄₉₀输入EXCEL表格，并求出“标准抗原平均值”（图1）；

② 以CurveExpert软件绘制“标准抗原平均值”的标准曲线，寻找最佳标准曲线方程（图2）；以标准抗原的浓度为纵坐标，OD值为横坐标；得到最佳标准曲线方程为：

其中，在本次实验中，a= -0.0047128895，b=0.0335441830，c= -0.2445601400，d=-0.0350758910，x为吸光度值，y为待测抗原浓度，单位为μg/ml；

③ 采用“单元格”直接应用方式，将最佳标准曲线方程输入EXCEL表格：不同系数分别拷贝到固定单元格，输入浓度计算公式（编辑栏）（图3）；

④ 按标准曲线方程计算每一OD₄₉₀对应的被检样品抗原含量；

⑤ 确定被检样品抗原含量：将步骤④ 计算得到的抗原含量乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。比较同一份样品、不同倍数稀释时所推算出原液中的抗原含量，就会发现这些值很接近（一般有3-6个稀释度的值会非常接近），取它们的平均数作为该样品的156S抗原含量（图4中41行数据），将同一样品平行2列的平均数作为最终报告数值（图4中43行数据）；本发明可对大量数据同时进行处理（96个），非常适合于大批量抗原数据的计算与比较。

实施例2

1、用本发明的试剂盒对5份 SVDV灭活抗原 156S抗原含量进行测定四次，结果稳定、重复性好（变异系数CV%不超过8%）（见表1）。

表1 对5份SVDV灭活抗原 156S抗原含量测定结果(μg/mL)

2、用本发明的试剂盒对3份SVDV灭活疫苗156S抗原含量进行测定四次，结果稳定、重复性好（见表2）。检测前，疫苗需先用正戊醇破乳，离心（4℃，3000rpm 10min），吸出抗原部分，再用ELISA方法检测。

表2 对3份 SVDV灭活疫苗156S抗原含量测定结果(μg/mL)

3、用本发明的试剂盒对其它类似症状的抗原如口蹄疫灭活抗原（O型和A型）进行测定，结果均低于其敏感性范围，表明本发明的方法特异性好（见表3）。

表3间接ELISA对4份其口蹄疫灭活抗原测定结果

。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种定量检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：包括猪水泡病毒标准抗原、猪水泡病毒特异性第一抗体、猪水泡病毒特异性第二抗体和酶标抗体的制备；

所述改进的蔗糖密度梯度离心法的步骤如下：

（2）将沉淀用缓冲液重悬，加入NP40混匀；

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠抗体。

3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述试剂盒还包括用于稀释猪水泡病毒特异性第二抗体的阻断稀释液，所述阻断稀释液为：含体积百分比为10%正常牛血清和含体积百分比为5%健康兔血清的PBST。