CN107427572A - 新的猪正呼肠孤病毒的疫苗和诊断 - Google Patents

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Abstract

本文提供的是诊断和疫苗，来鉴定、控制和预防新的猪正呼肠孤病毒3型(POV3)，其分离自三个州的爆发的仔猪腹泻粪便和来自多个来源的环干燥猪血粉。

Description

新的猪正呼肠孤病毒的疫苗和诊断
相关申请的交叉引用
本申请要求基于2014年11月17日提交的美国临时申请系列号No.62/080462的优先权，通过引用将其全部合并在本文中。
电子提交的序列表的参考
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸件，通过引用合并在说明书中。含有序列表的文本文件的名称是SequenceListing.txt。该文本文件为213千字节，于2015年11月16日创建，通过EFS-Web电子地提交。
发明领域
本发明一般地涉及用于新近出现的哺乳动物正呼肠孤病毒(orthoreoviruses)的组合物和诊断方法和预防性疫苗，所述正呼肠孤病毒在养猪场中引起相当大的死亡和发病。
发明背景
不限制本发明的范围，与猪群体中新近暴发的流行性腹泻一起描述本发明的背景。在2013年5月，在美国的养猪场中发生仔猪的流行性腹泻的毁灭性暴发，引起极大的经济关注。在小于10天龄的仔猪中死亡率可以达到100％，自2013年起记录了至少八百万新生猪的损失。从这些爆发中分离并表征了肠道冠状病毒，例如，猪肠道冠状病毒(SECoVs)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)(PDCoV)。然而，尽管在许多农场中采用了密集的生物安全措施来防止SECoV的传播，并使用了两种美国农业部(USDA)有条件地批准的针对PEDV的疫苗，爆发仍然继续，现在波及许多其他国家，包括美洲的墨西哥、秘鲁、多米尼加共和国、加拿大、哥伦比亚和厄瓜多尔以及乌克兰。还报告了在早先感染了PEDV的同一农场中重复的暴发。2014年6月，USDA发布联邦命令，以报告、监测和控制猪肠道冠状病毒疾病(SECD)。
已知猪正呼肠孤病毒也导致猪群体中的腹泻，已经在中国和韩国报道了暴发，但在美国没有。呼肠孤病毒(reoviridae)科包括双链RNA(dsRNA)病毒的15个属。正呼肠孤病毒是呼肠孤病毒科之内刺突呼肠孤病毒(Spinareovirinae)亚科中的属。正呼肠孤病毒属内有5个种，哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian ortheoreovirus，MRV)是模式种。该病毒物种的特征在于处在具有双重衣壳结构的非包膜二十面体病毒粒子(virion)中的片段的双链RNA基因组。片段的MRV基因组具有10个离散的RNA片段，其已经从各种各样的动物物种中分离，包括蝙蝠、麝猫、禽类、爬行动物、猪和人。大多数正呼肠孤病毒被认为引起人类、兽类和禽类中的呼吸道感染、胃肠炎、肝炎、心肌炎和中枢神经系统疾病。正呼肠孤病毒基因组易于遗传重整和基因内重排。病毒之间的RNA片段交换可以产生分子多样性和病毒的进化，具有提高的毒力和宿主范围。MRV血清型1到3与全世界的猪、包括中国和韩国的猪中的肠炎、肺炎或脑炎相关。最近报道了MRV3的人畜共患可能性。然而，猪的猪正呼肠孤病毒感染在美国以前是未知的。
从上文可以看出，本发明人认为暴发中可能涉及新的传染原(infectiousagent)。本文提供的是引起猪中流行性腹泻的新传染原的发现以及检测分析和预防性疫苗。
发明内容
本发明涉及新的猪正呼肠孤病毒3型(POV3-VT)的诊断分析和预防，本发明人确认其是三个州的仔猪腹泻暴发的病原体。该病原体在多个来源的环干燥猪血粉(ring-driedswine blood meal)中鉴定出。为了对抗这种新的病原体，本发明人开发了用于检测多种样品中的病毒的方法，针对猪群体中的病毒的抗体，以及用于预防疾病的疫苗。
在某些实施方式中，提供了赋予对POV3-VT的免疫性的疫苗，其包括免疫原性数量的一种或多种类型特异性POV3-VT蛋白(type specific POV3-VT proteins)或其免疫原性部分。在某些实施方式中，所述类型特异性POV3-VT蛋白选自由σ1、σ1s、μ1和μ2蛋白以及其免疫原性部分组成的组。免疫原性蛋白可以以多种不同的方式存在，包括通过活的减毒病毒疫苗、灭活病毒疫苗和亚单位疫苗(subunit vaccine)。优选的亚单位疫苗是通过免疫原性蛋白在细菌或杆状病毒细胞中的体外生产来产生的。
还提供的是赋予对POV3-VT的免疫性的疫苗，其包括免疫原性的MRV3σ1蛋白或其免疫原性多肽部分，其中所述MRV3σ1蛋白与SEQ ID NO：20的氨基酸残基1到455具有至少92％的同一性。
提供了减毒的活病毒疫苗，其中所述疫苗是通过POV3-VT病毒在非猪宿主中传代直到传代的病毒在接种给猪时能赋予免疫性而不引起流行性腹泻而开发的。
在某些实施方式中，提供了检测动物的POV3-VT病毒感染的方法，包括提供来自所述动物的样品，检测所述样品中特异性结合多肽的抗体的存在或缺乏，所述多肽包含POV3-VTtσ1蛋白、或其免疫原性多肽部分(SEQ ID NO：20)，其中检测所述样品中特异性结合所述多肽的抗体的存在或缺乏包括使用能够检测抗体与蛋白的特异性结合的基于抗体的技术，所述样品中抗体与所述多肽的特异性结合的检测检测到动物被POV3-VT病毒感染。所述方法可以是免疫组织化学分析、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、夹心免疫分析、免疫辐射计量分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫分析、蛋白质印迹(Westernblot)、沉淀反应、凝集分析、补体结合分析、免疫荧光分析、蛋白A分析和免疫电泳分析。
在其他实施方式中，提供了检测生物样品中的POV3-VT的方法，包括在适合于聚合酶链式反应的条件下、使用与POV3-VT的S1片段内的区域同源的正向和反向引物扩增POV3-VT S1片段核苷酸序列来产生扩增产物，并测量所述扩增产物来检测所述生物样品中的POV3-VT。在其他实施方式中，检测生物样品中的POV3-VT的方法包括，通过在适合于聚合酶链式反应的条件下扩增多个靶标产生扩增产物，所述靶标包括POV3-VT S1片段和选自由S2、S3、S4、L1、L2、L3、M1、M2和M3片段组成的组的至少一个其他的POV3-VT片段，每个扩增使用与每个相应的POV3-VT片段内的区域同源的正向和反向引物；以及检测所述扩增产物来检测所述生物样品中的POV3-VT。
在某些实施方式中，所述POV3-VT在饲料补充剂(feed supplement)中、通过检测饲料补充剂中所述病毒的存在来检测，通过拒绝使用污染的补充剂、或通过进一步测试所述增补剂来确定是否存在活病毒而可以避免活病毒的污染。敏感测试病毒DNA/RNA的存在与进一步选择性测试活病毒的组合不仅容许避免污染的饲料，还容许开发能够完全灭活可能被污染的饲料补充剂的技术。
本文还提供的是用于检测POV3-VT病毒核酸的探针，其包含与POV3-VT的独特的S1片段(SEQ ID NO：19)具有至少98％的序列同源性的核苷酸序列以及标签。所述探针因而可以是被放射性标记的、荧光标记的、生物素标记的、酶学标记的、或化学标记的。POV3-VT病毒核酸可以被扩增用于通过聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时逆转录酶-聚合酶链式反应(rt RT-PCR)、连接酶链式反应、或转录介导的扩增(TMA)来检测。
附图说明
为了更完整地理解本发明，包括特征和优点，现在参考发明的详细说明和附图：
图1A显示了在7.5％SDS-PAGE凝胶上新的FS03和BM100美国的猪MRV3(“POV3”)基因组片段的RNA谱。图1B描绘了在7.5％SDS-PAGE凝胶上FS03纯化病毒的蛋白质谱(proteinprofile)。图1C显示了POV3分离物FS03和BM100的温度敏感性。在不同温度(34、37、56、80和90℃)下处理之后的TCID50病毒滴度(平均值±标准偏差)与未处理的病毒对照(VC)一起标绘。通过双尾t检验来评估滴度的差异，标出了FS03($)和BM100(*)的统计学上显著的(P<0.05)滴度。
图2A显示了本文公开的POV3在BHK-21细胞中诱导合胞体。图2A显示了模拟感染的BHK-21细胞，而图2B显示了用T3/Swine/FS03/USA/2014(FS03)病毒感染的BHK-21细胞在48hpi显示合胞体(箭头)。图2C显示了感染的Vero细胞的透射电子显微镜(TEM)分析，其中没有细胞器的病毒颗粒的次晶阵列(paracrystalline array)的存在以及细胞质中的病毒工厂(viral factories)是明显的。负染色的病毒粒子显示了二十面体的、非包膜的、双层的均匀大小的颗粒，使人想起呼肠孤病毒科的成员。病毒颗粒的平均直径是82nm(图2C插图)，颗粒大小从80到85nm。
图3提供了与T3Dearing、T3/Bat/Germany、TIL(Lang)和T2J(Jones)分离物相比，FS03和BM100POV3的S1片段编码的σ1蛋白氨基酸序列的比对。与T3/Bat/Germany和其他MRV原型相比，新的FS03和BM100POV3病毒在σ1和σ1s蛋白中具有31个和11个独特的氨基酸取代。σ1蛋白的推断的氨基酸序列分析显示，唾液酸结合结构域(NLAIRLP)和蛋白酶抗性(249I)和向神经性(340D和419E)残基在美国的猪正呼肠孤病毒(POV3)毒株中是保守的。
图4提供了与T3Dearing、/Bat/Germany、TIL(Lang)和T2(Jones)相比较，FS03和BM100POV3的M2片段编码的μ1蛋白氨基酸序列的比对。μ1蛋白的序列比对表明，与T3/Bat/Germany、T3D、TIL和T2J分离物相比，6个氨基酸取代是这些分离物独特的。
图5提供了与T3Dearing、T3/Bat/Germany、TIL和T2J相比，FS03和BM100POV3的M1片段编码的μ2蛋白氨基酸序列的比对。μ2蛋白比对显示，与T3/Bat/Germany、T3D、TIL和TILT2J序列相比有15个独特的氨基酸取代，与T3/Dearing相比有S208P突变。
图6A显示了使用1mM BEI的随时间的POV3灭活。图6B显示了使用2.5mM BEI的随时间的POV3灭活。
图7A显示了按2Log标度标绘的450份样品的HI滴度。
图7B描绘了来自俄亥俄州2014年暴发的随机地选择的59份未知猪血清样品获得的ELISA结果，图中呈现了来自2008年的31份已知的阴性猪血清样品。
图8显示了POV3特异性引物的PT_PCR结果。对于S1和L2基因片段，扩增的长度分别是424bp和537bp。M：1Kb+阶梯，泳道1-2：POV3-粪便样品(S1靶标)，泳道3：POV3-血粉(S1靶标)，泳道4：无模板阴性对照，泳道5：POV3-粪便样品(L1靶标)，泳道6：POV3-血粉(L1靶标)。
图9A、B显示了来自靶向POV3 S1基因、组织匀浆的RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。图9A：实验感染的仔猪的脑组织匀浆的基于S1片段的RT-PCR：泳道M：1Kb+阶梯，泳道1-9：实验感染的仔猪的脑组织匀浆的RT-PCR，泳道10:模拟感染的脑组织匀浆的RT-PCR，泳道11：POV3病毒阳性对照。图9B：实验感染的仔猪的肺组织匀浆的基于S1片段的RT-PCR：泳道M：1Kb+阶梯，泳道1-9：实验感染的仔猪的脑组织匀浆的RT-PCR，泳道10:模拟感染的脑组织匀浆的RT-PCR。
图10A-D描绘了从POV3cDNA的S1片段的RT-PCR扩增。图10A：细胞培养物衍生的POV3的cDNA稀释度(10-1到10-6)的扩增图；图10B：S1扩增的PCR产物的熔融曲线分析，显示了82.5℃处的熔融峰；图10C：S1扩增的PCR产物的解离曲线。图10D：ct值vs.cDNA稀释度的线性曲线。
图11A-C显示了POV3的基于L1的qRT-PCR扩增。图11A：细胞培养物衍生的POV3的L1基因片段产物的扩增图；图11B：L1扩增的PCR产物的熔融曲线分析，显示了79.5℃处的熔融峰；图11C：L1扩增的PCR产物的解离曲线。
具体实施方式
本文公开的是新的猪正呼肠孤病毒3型(POV3)，分离自三个州的爆发的仔猪腹泻粪便以及来自多个来源的环干燥猪血粉。两种POV3分离物的遗传学和系统发生分析(phylogenetic analyses)显示，它们相同但显著不同于美国流行的非致病性哺乳动物正呼肠孤病毒。本文提供的是诊断和疫苗，以鉴定、控制和预防这种新的传染原，包括通过检测和灭活猪血液制品中的病毒。
尽管针对猪肠道冠状病毒有严格的生物安全和疫苗接种措施，本发明人鉴定出的疾病继续传播到美国的至少32个州和其他国家，包括美洲的墨西哥、秘鲁、多米尼加共和国、加拿大、哥伦比亚和厄瓜多尔以及乌克兰，反复爆发。如本文公开的，本发明人证明了猪正呼肠孤病毒3型(POV3)与猪中的这些爆发的相关性和致病性。如本文使用的，新的病毒分离物也被称为POV3-VT(Virginia Tech)，其包括分离物FS03和BM100、以及具有与σ1衣壳蛋白(SEQ ID NO：20)有98％序列同源性的σ1衣壳蛋白的POV3毒株，所述σ1衣壳蛋白(SEQ IDNO：20)由片段S1以及编码与SEQ ID NO：20的σ1衣壳蛋白有98％的序列同源性的蛋白质的核酸编码。
如本文公开的，本发明人分离和表征了来自流行型仔猪腹泻病例的粪便样品的新的猪POV3，并显示了在新生猪中这些新的POV3毒株的高致病性引起致死性肠道疾病。我们还从猪血粉中分离了这些新的POV3毒株，这是屠宰产业的副产物，被用作家畜饮食的蛋白质来源。血粉的氯仿提取物以及来自同一样品的病毒在实验猪中引起相似的疾病，表明血粉是传染源。实际上，我们发现超过80％的环干燥血粉饲料补充剂是新的POV3病毒阳性的。重要的是，尽管世界动物卫生办公室的国际兽疫局(International des Epizooties，OIE)猪流行性腹泻病毒(PEDV)专案小组最近得出结论，污染的猪血液制品，包括喷雾干燥的血浆，不是传染性PEDV的可能来源，因为喷雾干燥通常灭活包膜冠状病毒。与PEDV相比，本文公开的新的POV3病毒是特别耐热的，因而，如存在于猪血液制品中，根据标准程序它将不会被适当地灭活。
我们的结果显示，POV3分离物是热稳定的和胰蛋白酶抗性的，杀死发育中的鸡胚，在BHK-21细胞中而不在Vero细胞中产生合胞体。融合型正呼肠孤病毒，包括MRV，编码融合相关的小的跨膜(FAST)蛋白，其负责合胞发生(syncytiogenesis)。然而，本文鉴定的POV3毒株缺乏这种蛋白，尽管如此在感染的BHK-21细胞或肠上皮中产生合胞体。病毒粒子是双层的，平均直径82nm，与MRV的报道的大小相符，但是大于蝙蝠正呼肠孤病毒的报道的70到72nm的大小。已经报道了MRV颗粒形式如病毒粒子、中间亚病毒粒子(ISVP)和核心颗粒中的大小差异。在感染的Vero细胞中病毒粒子的次晶阵列的病毒工厂是这些毒株的重要特征，与T3D型毒株中看到的管状病毒工厂不同。我们的结果表明，除了细胞裂解之外，POV3可以利用肠微绒毛来释放作为阵列的完整的病毒粒子。
纯化的细胞培养物或发育中的鸡胚分离物的深度测序分析显示了新的POV3序列。来自两种选定的猪POV3分离物(各来自粪便和血粉)的测序数据显示了高度序列同源性，因而强烈地暗示血粉是其他未确定的方式之中可能的传播方式。这些POV3毒株在56、80和90℃下1小时的热稳定性进一步证明了这一观点。血粉的环干燥需要通过加热到90℃来凝结血液，这可能不足以灭活这些耐热的POV3毒株。当前用于猪饲料用猪血液制品的欧盟法规(EU483/2014)要求在80℃处理并在室温下保存2周来灭活PEDV，似乎不足以灭活本文公开的新的POV3。
本文公开的毒株的10片段的基因组序列显示了独特的和新组合的令人感兴趣的特征。例如，它们在σ1蛋白中带有特定的突变，其将赋予胰蛋白酶抗性和向神经性，在μ2蛋白中带有突变用于干扰素拮抗，在σ1s蛋白中具有多个碱性残基用于血原性播散。在σ1蛋白上观察到的九个独特的氨基酸取代可能在为这些毒株赋予热稳定性方面起到作用，已经发现这些与T3型毒株中的热稳定性相关。
虽然MRV在引起家畜的严重疾病暴发方面一般是不常见的，已经从中国和韩国的腹泻猪中分离出猪MRV的几种毒株。类似地，已经报道了来自患有临床疾病的欧洲的蝙蝠，以及来自欧洲的带有蝙蝠来源的非融合MRV3的儿童的某些MRV3毒株。所有这些研究和我们的结果确认了，本文报道的新的POV3毒株是致病性的。在尸检中，所有感染的仔猪具有肠道的液体积累。在用分离的POV3在实验上感染仔猪中，伴有死亡的严重腹泻和临床疾病的重现确认了这些毒株的致病性。绒毛钝化是受新生儿腹泻综合征影响的仔猪的一致的特征。肾小管中观察到的蛋白管状物和轻微的肝脏脂沉积可以归于代谢失调。与减弱毒力的地方性T3D型毒株中的胰蛋白酶敏感性σ1蛋白(249处为苏氨酸)相比，位置239处异亮氨酸的存在可能阻止σ1蛋白被肠腔的蛋白酶裂解，允许高效的病毒生长和迁移到其他组织。
本文提供的是能够检测病毒感染和传染性材料包括动物衍生的蛋白增补剂的诊断方法。在某些实施方式中，检测表2列出的片段表达的蛋白质。蛋白质表达可以通过任何适合的方法来检测。在某些实施方式中，蛋白质通过免疫组织化学来检测。在其他实施方式中，蛋白质通过它们与针对所述蛋白质产生的抗体的结合来检测。抗体结合通过本领域已知的技术来检测(例如，放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、“夹心”免疫分析、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫分析(例如，使用胶体金、酶或放射性同位素标签)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集分析(例如，凝胶凝集分析、血细胞凝集分析，等)、补体结合分析、免疫荧光分析、蛋白A分析和免疫电泳分析，等。
在某些实施方式中，抗体结合通过检测初级抗体上的标签来检测。在另一个实施方式中，所述初级抗体通过检测二次抗体或试剂与所述初级抗体的结合来检测。在进一步的实施方式中，所述二次抗体是被标记的。用于在免疫分析中检测结合的许多方法是本领域已知的，在本发明的范围之内。
对于用于检测病毒抗原的ELISA分析来说，本文提供的是有用的诊断试剂，用于利用纯化自天然宿主的抗体检测POV3感染，例如，通过用猪TTV或本发明的免疫原性组合物以有效的免疫原性数量接种猪来产生病毒感染，并从感染的猪的血清中回收抗体。做为选择，所述抗体可以在实验动物中针对天然的或合成的多肽来产生，所述多肽衍生自或表达自氨基酸序列、或由分离的POV3的核苷酸序列编码的免疫原性片段。例如，可以根据本领域已知的程序产生针对分离的新POV3的抗原的单克隆抗体。
在其他实施方式中，表达POV3蛋白并用于免疫检测分析来检测POV3特异性抗体的存在。特别地，利用POV3特异性血细胞凝集-抑制和ELISA分析的血清测试提供了精确的和简单的工具，来揭示这种新的病毒感染与疾病的相关性。用于检测针对纯化或部分纯化的培养物衍生的vPOV3-VT的抗体的分析也可以通过本领域已知的技术来检测(例如，放射免疫分析、“夹心”免疫分析、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀试验反应、免疫扩散分析、原位免疫分析(例如，使用胶体金、酶或放射性同位素标签)、蛋白质印迹、沉淀反应、补体结合分析、免疫荧光分析、蛋白A分析和免疫电泳分析，等。
在其他实施方式中，采用分子分析来检测猪群体中以及饲料补充剂中微小数量的病毒的存在。根据本发明的一个实施方式，使用POV3特异性引物的实时PCR被具体用于检测饲料补充剂中美国猪POV3的存在。在其他实施方式中，在PCR应用之后，采用基于芯片的杂交分析来测试多个批次的饲料补充剂。在检测时，饲料补充剂可以被隔离并进一步测试活病毒的存在。特别地，根据本发明人的令人惊讶的发现，本文公开的POV3是特别耐热的，因而容许活病毒在当前用于产生环干燥猪血粉的热处理中存活。通过本文公开的诊断，处理猪血粉的方法被调整以提供对美国的猪MRV3(“POV3”)的完全灭活。
本文还提供的是用于预防疾病的疫苗。这样的疫苗包括灭活病毒疫苗、减毒活病毒疫苗以及亚单位疫苗。还包括在本发明的范围内的是核酸疫苗。接种的猪被保护免于病毒感染和由美国的猪POV3感染引起的相关疾病。通过向猪施用免疫有效量的根据本发明的疫苗，例如，包含免疫原性数量的传染性POV3RNA的疫苗、含有POV3的传染性DNA克隆的质粒或病毒载体、重组POV3DNA、多肽表达产物、细胞表达的或杆状病毒表达的纯化的重组蛋白等，所述方法保护了需要保护对抗病毒感染的猪。其他抗原例如其他传染性猪病原体和免疫刺激剂可以同时给予猪来提供针对病毒感染的广谱保护。
疫苗包含，例如，传染性的病毒的和分子的核酸克隆、处于适合的质粒或载体中的克隆的POV3传染性DNA基因组片段、无毒力的活病毒、钝化的病毒、表达的重组衣壳亚单位疫苗等，与无毒的、生理学可接受的载体，以及任选的一种或多种佐剂组合。做为选择，DNA(其编码一种或多种衣壳蛋白，并衍生自分离的POV3的片段的RNA)可以被插入活的载体中，例如，痘病毒或腺病毒，并用作疫苗。
可以与本发明的疫苗一起施用的佐剂是提高猪对疫苗的免疫学反应的物质。所述佐剂可以与疫苗在同时和在同一部位施用，或在不同的时间施用，例如，作为强化。按照与施用疫苗的方式或部位不同的方式或部位，佐剂也可以有益地施用给猪。适合的佐剂包括但不限于氢氧化铝(白矾)、免疫刺激复合物(ISCOMS)、非离子的嵌段聚合物或共聚物、细胞因子、皂角苷、单磷酰基脂质A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)，等。其他适合的佐剂包括，例如，硫酸铝钾、分离自大肠杆菌的热不稳定的或热稳定的肠毒素、霍乱毒素或其B亚基、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、弗氏不完全或完全佐剂，等。基于毒素的佐剂，例如白喉毒素、破伤风毒素和百日咳毒素可以在使用之前灭活，例如，通过用甲醛处理。
本发明的新疫苗不局限于任何特定的类型或制备方法。克隆的病毒疫苗包括但不限于传染性DNA疫苗(例如，使用质粒、载体或其他常规的载体来将DNA直接注射到猪中)、活疫苗、修饰的活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、减毒疫苗、遗传工程化的疫苗，等。这些疫苗通过本领域已知的标准方法来制备。
在本发明中期望的其他遗传工程化的疫苗通过本领域已知的技术来产生。这样的技术涉及，但不限于，进一步的重组DNA操作、对重组蛋白质的氨基酸序列的修饰或取代，等。
例如，通过鉴定可选择的病毒基因的部分，所述部分编码负责诱导猪中更强的免疫或保护性反应的蛋白质(例如，衍生自本文公开的新病毒的独特部分的蛋白质)，来制备基于重组DNA技术的遗传工程化的疫苗。如此鉴定的基因或免疫显性片段可以克隆到标准的蛋白表达载体中，例如，杆状病毒载体，并用于感染适当的宿主细胞(参见，例如，"Baculovirus Expression Vectors:A Lab Manual,"Freeman&Co.,1992)。培养宿主细胞，从而表达期望的疫苗蛋白质，其可以被纯化到期望的程度并配制成适合的疫苗产品。在一个实施方式中，重组亚单位疫苗是基于本文公开的新的POV3毒株的细菌表达的或杆状病毒表达的衣壳蛋白质。
如果克隆保留了任何不期望的引起疾病的天然能力，还可以定位病毒基因组中对任何残余的毒力负责的核苷酸序列，并通过例如定点诱变来将病毒遗传工程化为无毒力的。定点诱变能够添加、删除或改变一个或更多个核苷酸(参见，例如，Zoller et al.,DNA3:479-488,1984)。合成含有期望的突变的寡核苷酸并与一部分单链病毒DNA退火。由这一程序产生的杂交分子被用于转化细菌。然后，分离的含有适当突变的双链DNA，通过连接到后者的限制性片断，用于产生全长DNA，随后转染到适合的细胞培养物中。通过本领域普通技术人员已知的任何标准技术，可以实现基因组向用于转移的适合载体中的连接。载体至用于产生病毒子代的宿主细胞中的转染，可以使用任何常规方法来进行，例如，磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、原生质体融合和其他公知的技术(例如，Sambrook etal.,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,"Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)。克隆的病毒然后展现了期望的突变。
免疫有效量的本发明的疫苗施用给需要保护对抗病毒感染的猪。接种猪的免疫有效量或免疫原性数量可以容易地确定，或通过常规测试容易地滴定。有效量是一种数量，在此数量下获得对疫苗的足够的免疫学反应来保护暴露于POV3的猪。优选地，所述猪被保护到一定程度，其中所述病毒疾病的一种到所有的有害生理学症状或效应被显著降低、改善或完全防止。
所述疫苗可以以单次剂量或以重复剂量施用。剂量可以是，例如，约1微克到约1000微克含传染性嵌合DNA基因组的质粒DNA(取决于疫苗的免疫活性成分的浓度)，但是不应含有足以引起不良反应或病毒感染的生理学症状的数量的基于病毒的抗原。测定或滴定适合剂量的活性抗原试剂的方法是本领域已知的，以根据猪的体重、抗原的浓度和其他典型因素来找到最小有效剂量。在某些实施方式中，传染性的病毒DNA克隆被用作疫苗，或者活的传染性病毒可以体外产生，然后所述活病毒被用作疫苗。在那种情况下，例如，约50到约10,000倍的50％组织培养感染剂量(TCID50)的活病毒可以给予猪。
活疫苗的优点是所有可能的免疫反应在疫苗的接受者中被激活，包括全身性的、局部的、体液和细胞介导的免疫反应。活病毒疫苗的缺点可能超过优点，在于潜在的活体外源性病毒剂的污染或病毒可能在现场恢复毒力的风险。
例如，为了制备灭活病毒疫苗，病毒增殖和病毒生产可以在培养的猪细胞系中进行，例如，无限制地，PK-15细胞以及BHK-21细胞、Vero细胞，等。然后通过本领域普通技术人员一般已知的方案，或优选地，通过本文描述的方法来优化病毒灭活。可以通过用灭活试剂例如福尔马林或疏水性溶剂、酸等处理病毒，或通过用紫外光或X射线辐照，通过加热，等，来制备灭活病毒疫苗。灭活按照本领域理解的方式进行。例如，在化学灭活中，使用足够数量或浓度的灭活试剂、以足够高的(或低的，取决于灭活试剂)温度或pH值，处理适合的病毒样品或含有病毒的血清样品足够长的时间，来灭活病毒。考虑到本文公开的病毒的特别的热稳定性，通过加热灭活在一定温度下进行，持续足以灭活所述病毒的时间。使用光的波长或其他能量来源进行辐射灭活，持续足以灭活所述病毒的时间。如果不能感染对感染敏感的细胞，病毒被认为是灭活的。
通过在宿主中连续传代来制备减毒疫苗，其影响病毒在猪中的毒力，使得病毒能够在猪中复制并产生完全的免疫应答，而不引起显著的发病。例如，可以通过本发明的技术来制备减毒病毒，其涉及通过有胚鸡蛋的新的连续传代。
亚单位疫苗的制备一般不同于修改的活疫苗或灭活疫苗的制备。在制备亚单位疫苗之前，必须鉴定疫苗的保护性或抗原性成分。在细菌宿主例如E.coli或其他表达系统例如杆状病毒表达系统中，编码抗原成分的DNA被克隆、表达并纯化，用作亚单位重组衣壳疫苗。这样的保护性或抗原性成分包括某些氨基酸片段或病毒衣壳蛋白的片段，其在猪中产生特别强的保护性或免疫学反应；单个或多个病毒衣壳蛋白自身，其寡聚物，或病毒衣壳蛋白的高级缔合，其形成病毒亚结构、或这种亚结构的可鉴定部分或单元；存在于或靠近病毒的表面、或在病毒亚结构中的寡糖苷、糖脂或糖蛋白，例如脂蛋白或与病毒缔合的脂质基团，等。这些免疫原性成分可以通过本领域已知的方法容易地鉴定。一旦被鉴定，病毒的保护性或抗原性部分(即“亚单位”)随后通过本领域已知的程序进行纯化和/或克隆。
如果通过重组遗传技术产生亚单位疫苗，例如，克隆的亚单位基因的表达可以通过上文提供的方法来表达，也可以通过本领域技术人员已知的方法来优化(参见，例如Maniatis et al.,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,"Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,Mass.(1989))。
在本发明中也是期望的遗传工程化的疫苗通过本领域已知的技术来产生。这样的技术涉及，但不限于，使用RNA、重组DNA、重组蛋白质、活病毒，等。例如，在疫苗中有用的遗传工程化的蛋白可以在昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。可以通过常规方法纯化或分离的遗传工程化蛋白，可以直接接种到猪或哺乳动物物种中来提供保护。
对于杆状病毒表达，昆虫细胞系(例如sf9、sf21或HIGH-FIVE)用含有获自病毒的遗传材料的转移载体转化，所述遗传材料编码所述病毒的一种或多种独特的或免疫显性蛋白。
所述疫苗可以以单次剂量或以重复剂量施用。剂量可以含有，例如，1到1000微克基于病毒的抗原(取决于疫苗的免疫活性成分的浓度)，但是不含有足以引起不良反应或病毒感染的生理学症状的数量的基于病毒的抗原。根据禽类或哺乳动物的体重、抗原的浓度和其他典型因素，测定或滴定适合剂量的活性抗原试剂的方法是本领域已知的。理想地，疫苗被直接施用给尚未暴露于病毒的猪或其他哺乳动物物种。所述疫苗可以方便地口服地、口腔内地、鼻内地、透皮地、胃肠外地施用，等。胃肠外的施用途径包括但不限于肌肉内的、静脉内的、腹膜内的和皮下的途径。
当作为液体施用时，当前的疫苗可以制备为水性溶液、糖浆、酏剂、酊剂等的形式。这样的制剂是本领域已知的，一般通过将抗原和其他典型的添加物溶解在适当的载体或溶剂系统中来制备。适合的载体或溶剂包括，但不限于，水、盐水、乙醇、乙二醇、甘油，等。典型的添加物有，例如，经认证的染料、调味剂、甜味剂和抗微生物防腐剂，例如硫柳汞(乙基汞硫代水杨酸钠)。通过添加部分水解的明胶、山梨醇或细胞培养介质，这样的溶液可以被稳定化，可以使用本领域已知的试剂，例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、其混合物等通过常规方法来缓冲。
液体制剂还可包括悬浮液和乳液，其含有与其它标准助剂(co-formulant)组合的悬浮剂或乳化剂。这些液体制剂类型可以通过常规方法制备。例如，悬浮液可以使用胶体磨来制备。例如，乳液可以使用均质器来制备。
设计用于注射到体液系统中的肠胃外制剂需要适当的等渗性和pH缓冲至哺乳动物体液的相应水平。根据需要可以用氯化钠和其他盐适当调整等渗性。可以使用合适的溶剂，例如乙醇或丙二醇来提高成分在制剂中的溶解度和液体制剂的稳定性。可用于当前的疫苗的其它添加剂包括但不限于葡萄糖、常规抗氧化剂和常规螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)。肠胃外剂型也必须在使用前灭菌。
虽然在下文详细讨论了本发明的各种实施方式的制作和使用，应当理解的是，本发明提供了许多可应用的发明构思，其可以用于各种各样的特定场景中。本文讨论的具体实施方式仅仅是制造和使用本发明的具体方式的说明，不限定本发明的范围。
为了公开的完整性和说明制造本发明的组合物和复合物的方法、以及呈现所述组合物的某些特征，包括以下实施例。这些实施例无论如何不意图限定本公开的范围或教导。
实施例1:从猪的腹泻粪便和环干燥猪血粉中分离新的MRV3
来自不同生产源的11份环干燥猪血粉(RDSB)样品中的9份(82％)，以及来自北卡罗来纳、明尼苏达和衣阿华州有流行性腹泻暴发的农场的新生猪的48份粪便样品中的18份(37％)，用正呼肠孤病毒类群特异性的引物扩增326-bp的S1片段。在18份正呼肠孤病毒阳性粪便样品中，11份样品使用MRV3-S1基因特异性引物进一步序列验证，扩增了424bp的片段。在用粪便和血粉的氯仿提取的样品接种的BHK-21细胞中，在感染后48小时(hpi)，包括合胞体形成和个体细胞的圆化的CPE是明显的(图2A-B)。到72至96hpi，感染的细胞单层完全脱离。在通过绒毛尿囊膜(CAM)途径接种之后，发育的鸡胚在接种后(dpi)2到5天死亡。感染的鸡胚显示了身体的出血(“樱红外观”)和/或矮化生长(“矮小”)。使用针对MRV3σ1蛋白的单克隆抗体克隆2Q2048，在感染的BHK-21细胞中检测到MRV3抗原。通过逆转录-PCR(RT-PCR)和测序，进一步确认了来自感染的BHK-21细胞或鸡胚的病毒分离物是MRV3。获得了八个病毒分离物，两种代表性的分离物(T3/Swine/FS03/USA/2014和T3/Swine/BM100/USA/2014)用于进一步研究。
为了确定正常的健康猪是否携带正呼肠孤病毒，从不同州(印地安那州、俄亥俄州、衣阿华州和伊利诺斯州)的有或没有PEDV暴发的农场获得36份粪便样品和匹配的血浆样品。六份粪便和血浆的样品获自印地安那州和俄亥俄州的未感染的农场，12份粪便和血浆的样品获自伊利诺斯州的农场、流行性腹泻后6周采集，12份粪便和血浆样品获自衣阿华州的农场、流行性腹泻后6个月采集。通过RT-PCR，这些样品都没有发现正呼肠孤病毒阳性。此外，来自几个随机选择的MRV3阴性样品的粪便的氯仿提取物在BHK-21细胞上盲传代2次，没有观察到CPE。
病毒RNA分离。使用QIAmp RNA试剂盒(Qiagen，United States)从粪便和环干燥猪血粉样品分离病毒RNA，使用MRV3-S1基因特异性引物进行逆转录-PCR(RT-PCR)。使用以下MRV3 S1片段特异性引物(D.Lelli et al,Identification of Mammalian orthoreovirustype 3in Italian bats.Zoonoses and public health 60,84-92(2013))：
S1 Fwd:5'-338TGG GAC AAC TTG AGA CAG GA 357-3',SEQ.ID.NO.1和S1 Rev:5'-644CTG AAG TCC ACC RTT TTG WA 663-3',R＝A/G,W＝A/T,SEQ.ID.NO.2。
扩增的PCR产物在1.5％(wt/vol)琼脂糖凝胶上电泳分析，纯化PCR产物并直接测序。
病毒分离。对RT-PCR阳性粪便和血粉样品进行病毒分离。将20％粪便悬浮液和10％环干燥血粉样品的氯仿提取物通过0.2μm-孔膜滤器(Millipore，美国)过滤，并接种到9至11天龄、无特异性病原体(SPF)的发育中的鸡胚(通过绒毛尿囊膜[CAM]途径)和BHK-21细胞。胚胎和细胞分别在37℃孵育5天，每天监视死亡和细胞病变效应(cytopathiceffects，CPE)。在感染后5天(dpi)，从卵中收集尿囊液和CAM，从BHK-21培养物中收集细胞培养上清液，氯仿提取，分别进一步在SPF鸡胚或BHK-21细胞中传代。使用MRV3 S1片段特异性引物通过RT-PCR检测病毒RNA。扩增的MRV3-S1 PCR产物进行测序来确认病毒基因组。使用间接免疫荧光分析(IFA)进一步确认从BHK-21细胞获得的病毒分离物，使用针对3型正呼肠孤病毒σ1蛋白的小鼠单克隆抗体(克隆2Q2048；Abcam，美国)。
病毒纯化。在T-175烧瓶中生长的BHK-21细胞单层在含有1％胎牛血清(FCS)的Dulbecco's修改的Eagle's培养基(DMEM)中以0.1的感染复数(MOI)用POV3分离物感染。在3dpi收获细胞，进行三次冻融循环。细胞碎屑通过在4℃3,700×g离心来澄清。使用SW-28转子(Beckman Coulter，US)在66,000×g超速离心2h从澄清的上清液中团化(pelleted)粗病毒。病毒团粒(virus pellet)重悬浮在1ml TN缓冲液(20mM Tris，400mM NaCl，0.01％N-月桂酰肌氨酸[pH 7.4])中。病毒悬浮液然后平铺在15％到45％(wt/vol)不连续蔗糖梯度上，使用SW-41Ti摇摆外转子(Beckman Coulter，US)在4℃以92,300×g离心2h。采集分界面处的病毒带，用于表征和基因组研究。
实施例2:形态学和生物学特性
新的猪正呼肠孤病毒在形态学和生物学特性上是独特的。来自蔗糖密度梯度纯化的病毒粒子的基因组RNA对S1核酸酶处理有抗性，确认了病毒基因组的双链性质。SDS-PAGE表明病毒基因组由10个片段组成(图1A)。病毒的蛋白质谱与λ、μ和σ蛋白质以及它们的子类一致(图1B)。病毒粒子在56℃是稳定的，没有感染性的显著损失，在暴露于80℃或90℃1h后保持存活(图1C)。负染色病毒粒子的透射电子显微镜(TEM)分析显示了二十面体的、非包膜的双层均匀大小的颗粒，使人想起呼肠孤病毒科的成员(图2C)。
在感染的Vero细胞中，没有细胞器的病毒颗粒的次晶阵列的存在以及细胞质中的病毒工厂是明显的。病毒颗粒的平均直径是82nm(图2C插图)，颗粒大小从80到85nm。POV3分离物(FS03和BM100)在BHK-21细胞中有效地复制，平均组织培养感染剂量(TCID50)为6.7log10/ml。在用TPCK胰蛋白酶处理之后对BHK-21细胞的病毒感染性提高(6.7到7.7log10/ml)，表明胰蛋白酶抗性。POV3毒株能够使猪红血球凝聚，这种性质可以被MRV3抗σ1单克隆抗体特异性地抑制。
病毒表征。进行了血细胞凝集(Hemagglutination，HA)和血细胞凝集抑制(hemagglutination inhibition，HI)分析。简要地，病毒在96孔V形底微量滴定板(Corning-Costar，US)中的50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS[pH 7.4])中连续稀释，随后是50μl的1％猪红血球(Lampire Biological Laboratories，US)。平板在37℃孵育2h来记录HA滴度。使用针对3型正呼肠孤病毒_1蛋白的小鼠单克隆抗体(克隆2Q2048；Abeam，US)和4HA单位的病毒进行HI分析。HI分析平板最初在37℃孵育1h，然后在4℃过夜，之后计分。对于电子显微镜检查，病毒感染的BHK-21细胞(3dpi)、实验感染的猪的肠、或纯化的病毒粒子的超薄切片置于Formvar-碳包被电子显微镜格栅上，用2％(wt/vol)醋酸铀酰(uranyl acetate)或1％磷钨酸钠负染色30s。样本然后在80kVA的加速电压下在JEOL 1400透射电子显微镜(JEOL，US)中检查。
为了测定温度敏感性，病毒毒株在34℃、37℃、56℃、80℃和90℃经受五种不同的温度处理持续1h。然后在DMEM中制备病毒的连续稀释，然后在BHK-21细胞中滴定感染性。对于胰蛋白酶敏感性，病毒在DMEM中在37℃下与1μg/ml甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮(tosylphenylalanyl chloromethyl ketone，TPCK)胰蛋白酶孵育1h，在BHK-21细胞中滴定感染性。为了证明病毒基因组的双链特征，从纯化的病毒粒子提取的总RNA经历S1核酸酶消化、7.5％SDS-PAGE和硝酸银染色。对于蛋白质谱(protein profiling)，纯化的病毒在蛋白质样品缓冲液中变性，通过标准的7.5％SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色来分析。
实施例3:与突变相关的毒力
来自两种选定的POV3分离物(FS03来自猪粪便样品，BM100来自猪血粉)的纯化的病毒RNA的深度测序(MiSeq)确认了它们与MRV3的基因组同一性。在深度序列数据中没有检出其他污染病毒序列。FS03与BM100序列之间高水平的序列同一性验证了我们的免疫荧光、凝胶电泳和病毒蛋白质谱数据。猪正呼肠孤病毒基因组的总长度是23,561个核苷酸(nt)。两种猪分离物在5'和3'末端具有与其他MRV类似的共有基因组末端。5'非翻译区(URT)长度从12到31nt，3'UTR长度从32到80nt，与原型MRV3T3D有偏离(表1)。POV3 FS03和BM100的5'UTR在L1中都有6-nt删除，在L2和S4片段中各有1-nt删除。此外，注意到M2片段开放阅读框(ORF)中的3nt删除。这些新病毒的基因组含有来自其他MRV的重整的基因片段。
表1：美国正呼肠孤病毒毒株("POV3")显示了改变的URT
a美国猪毒株FS03和BM100的5’和3’非翻译区(UTR)显示了在M2、S1和S2片段上的突变。保守的末端序列以黑体显示，突变是斜体的。
类似于正呼肠孤病毒的已知成员的10个片段编码的不同蛋白质的预测功能在下文表2中显示：
表2：正呼肠孤病毒蛋白质功能
POV3 FS03和BM100的推断的氨基酸序列是同源的，除了σ1蛋白，它们之间有1个氨基酸(aa)改变。这两种病毒编码的每种不同蛋白质与原型MRV1-4的同源性百分比在下文的表3中提供：
表3：与原型MRV 1-4的同源性百分比
在比较推断的氨基酸时，看起来L类片段的蛋白质中，λ2蛋白与MRV1同源，而λ1和λ3蛋白分别高度相似于MRV 1和3原型、Tl-Lang(TIL)和T3/Dearing(T3D)。在M类蛋白质中，仅μNS相同于T3D，而μ1和μ2与TIL相同。如图4中所示，M2片段编码的μ1蛋白的序列比对显示，与T3/Dearing(SEQ ID NO：48)、T3/Bat/Germany、TIL和T2J分离物相比，6个氨基酸取代是这些分离物独特的。如图5中所示，M1片段编码的μ2蛋白比对显示了与T3/Dearing(SEQID NO：49)、T3/Bat/Germany、T3D、TIL和T2J序列相比15个独特的氨基酸取代，并具有与T3D相比的S208P突变。在S类蛋白质中，看起来它们所有的都来源于欧洲蝙蝠(MRV3)病毒，在氨基酸水平有88％到98％的同一性。
对于S1片段编码的σ1蛋白，在所有蛋白质中观察到最高的差异，与T3/Bat/Germany病毒有最接近的同源性(91％)。σ1蛋白的推断的氨基酸序列分析显示，唾液酸结合结构域(NLAIRLP)和蛋白酶抗性(249I)和向神经性(340D和419E)残基在美国猪正呼肠孤病毒毒株中是保守的。如图3中描述的，根据T3/Dearing(SEQ ID NO：47)的比对，与T3/Bat/Germany和其他MRV原型相比，新的POV3病毒在σ1和σ1s蛋白中具有31个和11个独特的氨基酸取代。σ1s蛋白是通过S1片段的渗漏扫描(leaky scanning)产生的。在渗漏扫描现象中，mRNA上的弱起始密码子三联体可能在翻译起始时被核蛋白体亚单位跳过。核蛋白体亚单位继续扫描到下一个起始密码子。弱起始密码子可以是ACG，或在弱Kozak共有上下文(Kozakconsensus context)中是ATG。如果AUG不在阅读框中，从渗漏扫描产生的mRNA可能编码几种不同的蛋白质了；或如果AUG在同一阅读框中，编码具有不同N-末端的蛋白质。
从分离自粪便样品的FS03和分离自猪环干燥血粉的BM100两种纯化病毒分离的双链RNA(dsRNA)进行NextGen基因组测序。Illumina的NEBNextUltr定向RNA文库制备试剂盒(目录号e74205；NEB)用于制备具有某些修饰的RNA文库。使用标准方案，在94℃10分钟，100ng病毒RNA片段化为250个核苷酸。在接头连接之后，使用Pippin Prep(Sage Science，美国)选择350-bp到375-bp的文库(250-bp到275-bp的插入物)。带有接头的模板分子通过12轮PCR富集来产生最终的文库。使用Agilent 2100生物分析仪验证产生的文库，使用Quant-iT dsDNA H.S.试剂盒(Invitrogen)和定量PCR(qPCR)来测定。合并两个单独编码的文库(FS03病毒为A006-GCCAAT，BM100病毒为A012-CTTGTA)并在Illumina MiSeq上测序。简要地，将单独的文库以等摩尔的数量合并，变性，加载到MiSeq上。使用MiSeq试剂盒V2在500次循环(MS-102-2003)上，将合并的文库掺入5％phiX并在MiSeq上测序至2×250配对末端读取结果(PE)以产生2400万个PE。
基因组组装。基于参考的作图和重新组装(de novo assembly)方法应用于原始数据，用于组装成病毒基因组。通过使用CLC Genomics Workbench软件(版本7.0.4；CLC Bio，丹麦)，针对哺乳动物正呼肠孤病毒基因组进行基于参考的作图。重新组装使用以下的重叠设置进行：错配罚分2，插入罚分3，最小contig长度1,000bp，相似性0.8，修整质量分值0.05。这种组装产生了3,444个contigs，使用Blast2Go程序根据基因本体(Gene Ontology)术语对其进行注释，通过针对UniprotKB/Swiss-Prot数据库以le-05的截断E值作图，将其作为CLC的插件来执行。此外，为了确定推定的基因描述，通过使用tBLASTx算法查询NCBI数据库进行同源性检索。重新组装的序列用于确认基于参考的序列组装的有效性。重新组装和基于参考的作图产生了相同的序列。
核苷酸序列登录号。本文提供了病毒FS03和BM100的完整基因组序列，以登录号KM820744到KM820763保存于GenBank，如下文表4所示。在表格中，在图3-5中提供比对的蛋白质是高亮的。
表4:美国猪正呼肠孤病毒(POV3)分离物和使用的原型序列的GenBank登录号
实施例4:新的美国猪正呼肠孤病毒是与MRV3进化相关的。
FS03和BM100 POV3分离物的系统发生分析显示了与MRV3毒株的强的进化关系。L1、S1、S2、S3和S4片段的核苷酸序列的ORF被用于构建系统发生树。基于S1系统发生，两种分离物与蝙蝠来源的MRV3是单源的(monophyletic)(图3)，与谱系3的蝙蝠毒株以及与人类、牛、鼠和蝙蝠毒株一起形成了明显的谱系，该蝙蝠毒株与德国和意大利蝙蝠MRV3 S1序列有很近的进化距离。片段S2的系统发生分析表明，新的POV3分离物与人类T3D、TIL和中国的猪T1毒株是单源的。S3系统发生表明，美国POV3毒株与TIL和中国的猪的和欧洲蝙蝠的MRV3毒株是紧密相关的。S4片段系统发生树的拓扑结构显示，美国猪的MRV3(POV3)分离物与中国T1和T3猪分离物是紧密相关的。L1片段系统发生显示了与中国的猪T3毒株的紧密关系。S2、S3和S4片段的序列多样性不与宿主物种、地理位置或分离年份相关，表明它们的来源来自人类、猪和蝙蝠的不同进化的不同毒株，是通过自然中的MRV重整获得的。
系统发生分析。使用BioEdit序列比对编辑器软件(版本7.0.0；BioEdit，IbisBiosciences,Carlsbad，CA)，将L1和S类片段(S1，S2，S3和S4)的核苷酸和推断的氨基酸序列与其他紧密相关的正呼肠孤病毒的序列进行比较。根据Mega 6.06中对S2、S3、S4和L1片段的JTT w/freq模型，或CLC workbench 7.0.4中S1片段的“WAG”(即，Whelan和Goldman模型)蛋白质取代的Jukes-Cantor进化模型，在测试了它们对最佳拟合的适用性之后，使用最大相似方法，推断出病毒毒株的系统发生进化史。从1000次重复推断出的自引共有树(bootstrap consensus tree)被用来表示所分析的分类群(taxa)的进化史。
实施例5:新的美国猪正呼肠孤病毒(POV3-VT)在猪中是高度致病的
通过RT-PCR筛查实验新生猪的猪德尔塔冠状病毒、PEDV、嵴病毒(Kobuvirus)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒和正呼肠孤病毒，发现是阴性的，除了嵴病毒阳性的三头猪之外，其致病性还有待确立。用纯化的病毒FS03、BM100、T3/Swine/103/USA/2014(103)或血粉100的氯仿提取物(CBM100)口服接种的新生猪在全部感染的动物中发生临床疾病(100％)，伴有身体活动丧失、严重腹泻和体重降低。与模拟感染的组相比，感染的动物具有显著高的平均临床评分(P<0.01)。早在1dpi，用FS03和103感染的仔猪具有最高的临床评分，其在3dpi达到峰值。模拟感染组中的三头猪从胃肠外麻醉剂中缓慢恢复，在前2天具有提高的平均临床评分，但是之后恢复正常。在所有感染的动物中观察到可视病变(Grosslesion)，如卡他性肠炎和肠套叠。在dpi第4天，FS03和103的累积宏观病变评分高于其他组。与模拟感染的猪相比，病毒感染的猪的小肠显示了轻度到重度的绒毛钝化和融合(隐窝/绒毛比例1:1到1:4)，偶见的绒毛上皮合胞体细胞，具有颗粒状细胞质的肿胀上皮细胞，以及粘膜上皮的多病灶坏死，和肠上皮细胞中的圆形到椭圆形液泡。在少数猪中，还见到肾小管中的蛋白质管状物、最小到轻微的肝脏脂沉积和肝细胞液泡改变，轻度到减轻的化脓性支气管肺炎。
超微结构检查显示了具有细胞凋亡的核的多核细胞，在某些细胞中见到类似于应激颗粒的暗色的颗粒体。病毒颗粒定位于缺乏典型的胞质细胞器的细胞质区域。大量的病毒颗粒通过细胞裂解释出，或作为来自感染的绒毛上皮细胞的微绒毛的珠串进入肠腔。具有通过微绒毛释出的病毒粒子的多核细胞是明显的。病毒粒子在释放之前破坏微绒毛，并仍然被微绒毛的细胞膜围绕，在释放之后在肠腔中没有膜。
还通过细胞培养物中的病毒分离和通过S1片段特异性RT-PCR确认了感染猪中的肠内病毒复制和粪便病毒脱落。通过RT-PCR，在80％的感染仔猪中的肠内容物有POV3病毒，表明肠中的病毒复制与肠细胞内病毒复制的电子显微镜发现是一致的。
新生猪中的致病性研究。所有动物研究均按照弗吉尼亚理工学院动物保护和使用委员会(IACUC no.14-105-CVM，2014年6月5日)的批准进行。从Virginia Tech SwineCenter购买的三十五只2日龄仔猪在HEPA过滤的2级生物安全设施中以7只动物/组饲养。
在实验开始之前，使用特异性引物(可根据要求提供引物序列)通过粪便样品的RT-PCR测试猪的大多数常见的肠道RNA病毒，例如轮状病毒、PEDV、猪德尔塔冠状病毒、嵴病毒和TGEV。在1.5％(wt/vol)琼脂糖凝胶上通过电泳分析扩增的PCR产物。
在使得服水土(驯化)一天后，麻醉动物，2ml 5×105TCID50/ml的每种病毒毒株、或10％血粉悬浮液的氯仿提取物(2.5g环干燥血粉)在12.5ml DMEM中均质化来得到20％溶液，其用等体积的氯仿提取。用等体积的DMEM稀释得到的上层水相，使终浓度为10％，并使用5ml注射器口服接种仔猪。模拟感染的动物接受口服的2ml DMEM。每天对动物进行两次监测：直肠温度，体重，基于身体外观、活动、呼吸、胃肠道和全身体征的临床等分以0到3的尺度来记录。每天采集粪便拭子，悬浮在1ml含10×抗生素溶液(Hy-Clone，美国)的DMEM中，剧烈混合，孵育1h，保存在-80℃直到测试。在4dpi，或当它们到达临床终点时，将所有动物安乐死。由对实验组盲目的认证的兽医病理学家对可视的和显微镜的病变评分。使用实验感染的仔猪的肠内容物，进行S1基因特异性RT-PCR来确定肠中正呼肠孤病毒的产生。
统计分析。计算概括统计量来评估数据的总体质量。变异量分析(ANOVA)用于评估平均临床得分和显微镜病变得分。显著性水平设置为<0.01的P值和95％置信区间。使用GraphPad Prism软件(版本6.0；Graph Pad Software,Inc.,San Diego,CA)进行统计分析。
实施例6:HI滴度与病毒中和抗体之间的差异
为了鉴定这种新的正呼肠孤病毒的发病率和地理分布，在2014-2015年间采集自24个州的1067份血清样品以及来自2008年的28份血清样品进行回顾性血清学监测。通过在BHK21细胞中用斑块纯化的猪正呼肠孤病毒3型(POV3)对猪红血球的血细胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)，来测试样品。在2014-2015年间POV3特异性HI抗体的发生是非常高的，但是2008年的样品是阴性的。针对POV3的HI滴度从2到4096，88.37％的样品高于1：8的截断滴度(cut-off titer)。仅从衣阿华州、北卡罗来纳州、宾夕法尼亚州、德克萨斯州、南达科他州、俄克拉荷马州、蒙大拿州、密歇根州、乔治亚州和科罗拉多州采集的猪血清样品记录到高HI抗体滴度(2048和更高)。对于猪的年龄(1-56州)，在HI滴度方面没有显著差异。然而，200份随机选取的样本上的血清中和反应分析显示了低水平的VN抗体(<1:10)。高滴度HI抗体和低水平VH抗体的流行证明需要立即开发针对这种致病性POV3的疫苗，如本文所示。
实施例7:通过猪正呼肠孤病毒的双乙烯亚胺(BEI)灭活的灭活猪正呼肠孤病毒疫 苗
灭活病毒疫苗的一个实例是通过双乙烯亚胺(Binary Ethyleneimin，BEI)灭活产生的。称为POV3-BM100的病毒毒株最初分离自猪环干燥血粉。该病毒首先在BHK-21培养物中增殖三次，然后斑块纯化。第2号病毒斑块进一步增殖，并在BHK-21细胞中扩增两次，来产生主种子病毒(Master Seed virus)。病毒的滴度通过TCID50分析来测定。细胞培养物在补充有10％FCS和Hyclone IX青霉素-链霉素溶液(Thermo，USA cat no V30010)抗生素和抗真菌溶液的Dulbecco修饰的最小必需培养基(Hyclone DMEM/High Glucose Thermo.USA，cat no：SH30243.02)中生长。对于维持培养基(maintenance medium)，血清浓度降低至1％，并将胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)以lμg/mL的浓度加入到维持培养基中以促进病毒感染性。在37℃、5％CO2中在T-175烧瓶中生长到80-90％汇合的BHK-21细胞用于病毒感染。移除生长培养基。在冰上解冻种子病毒。在无菌PBS中洗涤细胞单层三次。添加足够的病毒以达到0.01的最小感染复数(MOI)。在感染后72小时收获液体和细胞材料，分配并在-80℃冷冻。病毒的工作种子批次进行超声，或3-4次冻融循环(-80℃)来释放细胞内病毒粒子用于灭活。病毒悬浮液在4℃3000rpm离心20分钟，收获上清液。使用TCID50方法或斑块分析一式三份地测定灭活前的病毒滴度。如上所述产生的非冷冻的猪正呼肠孤病毒可以使用双乙烯亚胺(BEI)进一步灭活。
BEI灭活：从0.2N NaOH(Sigma，USA)溶液中的0.1M 2-溴-乙胺氢溴酸盐(2-BEA，Aero Organics,USA,目录号2576-47-8)制备BEI，BEA溶液在37℃水浴中处理1小时用于环化反应，其将BEA转化为BEI(0.1M BEI贮备溶液)。0.1M BEI的溶液进一步使用0.22微米注射滤器过滤灭菌，立即用于病毒灭活。在三种不同的浓度下使用BEI，即1mM、2.5mM和5mM。收获样品来评估灭活过程。还保留了对照样品用于对比(模拟感染的细胞培养物上清液)。使用无菌技术在生物安全柜内采集样品。在每个时间点(潜伏期(incubation period))结束时，加入2％v/v的无菌1M硫代硫酸钠溶液以确保BEI的中和。将中和的样品在涡旋混合器上充分混合并储存在-80℃直到用于测试。
在不同的时间点(Oh，6h，12h，24h，48h和72h)采集样品，并用适量体积的1M硫代硫酸钠中和并在-80度深度冷冻机中冷冻。在完全灭活期结束时，使用TCID50法测定每个时间点的病毒滴度。绘制回归曲线以研究灭活动力学。从病毒灭活动力学研究结果可以看出，如图6A和B所示，确定2.5mM BEI可在37℃在48小时内完全灭活POV3-BM100病毒。
灭活验证：在灭活期间采集的样品，原始病毒对照(保持在-80℃)和保持在37℃48小时的未处理的病毒对照在适合的稀释剂中稀释(从纯净到10-8)，根据标准确定的技术在96孔微孔中滴定来测定每种样品的TCID50滴度。每种样品接种四个副本。将细胞培养物孵育规定时间，并根据CPE或其他已建立的方法，例如免疫荧光或免疫过氧化物酶染色来读取滴定。
实施例8:修改的减毒活疫苗(MLV)
在一个实施方式中，从新的病毒分离物中产生修改的减毒活病毒。病毒已经在Vero细胞和BHK-21细胞以及鸡胚中增殖，正在进行连续传代来产生修改的减毒活疫苗(MLV)。通过在非猪的宿主细胞中连续传代，病毒的毒力逐渐受影响，直到病毒丧失在成年和少年猪中引起显著发病的能力。
实施例9:筛选猪血清的POV3抗体的血细胞凝集抑制分析
血细胞凝集抑制(HI)分析是评估针对猪正呼肠孤病毒血凝素(HA)的免疫反应的有效方法。猪正呼肠孤病毒/MRV的表面上的HA蛋白凝集红血球。抗体与HA分子上的抗原位点的特异性附着干扰了病毒HA与红血球上的受体之间的结合。这种效应抑制血细胞凝集并且是HI分析的基础。一般地，标准化的数量的HA抗原(4HA单位)与连续稀释的血清样品混合，添加猪红血细胞(swine red blood cells，sRBCs)来检测抗体与HA分子的特异性结合。特异性抗HA抗体的存在将抑制凝集，否则凝集将在病毒和RBC之间发生。在用马RBC吸附期间，非特异性病毒抑制物可能被导入血清，其将导致使用猪RBC的HI分析中的假阳性结果。这样的非特异性抑制物可以通过受体破坏酶(RDE)处理来消除。
组合的材料包括：1)猪正呼肠孤病毒(POV3)/哺乳动物正呼肠孤病毒3(MRV3)，2)猪血清样品(血清样品不应重复冻融，但是理想地等分并保存在-20到-70℃)，3)PBS中的猪RBC(Alsever's溶液中的猪RBC可从Lampire Biological或等效的来源获得，在PBS+0.5％BSA中以1.0％的浓度使用)，4)Alsever's溶液中的马血细胞(尽可能新鲜的)，5)磷酸盐缓冲盐水(PBS)(0.01M PBS，pH 7.2)，保存在4℃，使用期间保持在冰上，6)受体破坏酶(RDE)，7)96孔、V形底、聚苯乙烯微量滴定板(Nunc,cat.#249570)。
为了确定测试病毒的HA滴度，以1.0％(v/v)制备猪RBC。为了开始包装的RBC的制备，使用10ml移液管从瓶子底部小心地采集5-7ml的猪RBC。从容器的底部移除马RBC以最小化细胞碎片的污染。通过无菌棉纱垫(cotton gauze pad)过滤到50ml锥形离心管中。用冷的PBS轻轻地填充锥形管，在4℃下以800×g离心5分钟。使用10ml移液管吸出上清液，小心不扰动RBC的团粒。用冷PBS轻轻地填充锥形管，倒置缓慢混合，然后在4℃下以800×g离心5分钟。使用10ml移液管吸出上清液，小心不扰动RBC的团粒。再小心地重复冷PBS洗涤一次，总共三次PBS洗涤来防止溶血，始终轻轻地操作RBC，将PBS保持在冰上或4℃，洗涤不超过3次。对于最终的包装的RBC，用P1000微升移液管吸出其余上清液，将包装的RBC保持在冰上。制备RBC的1.0％v/v悬浮液。例如，在500ml玻璃瓶(使用前用PBS清洗)中添加2.5ml包装的、洗涤到247.5ml的冷PBS+0.5％BSA。通过漩涡轻轻地混合。对于HA滴度测定，用要测试的病毒名称标记V底平板。一式两份测试病毒。向A和B行的反应孔2到12添加50μl的冷PBS。如果超过1种病毒，按需要使用其余的行。向整个H行添加50μl冷PBS。这一行充当RBC对照。在即将从小瓶移除病毒之前，使用三次快速脉冲轻轻地涡旋病毒的小瓶。然后向反应孔A1和B1添加要测试的100μl病毒。通过从反应孔1连续传递50μl直到反应孔12，制得连续的2倍稀释度。从反应孔12丢弃50μl。添加50μl 1.0％猪RBC悬浮液到平板的A、B(如果超过1种病毒，其他行)和H行的所有反应孔中。轻轻地敲打平板来混合。堆叠平板并用空平板覆盖，在室温下孵育60分钟。通过45到60°角倾斜平板来读取病毒HA滴度。由于重力，H行中沉积的RBC应当开始“跑动”并形成泪珠形状。等待直到这些RBC结束“跑动”，然后将RBC按钮标记在“跑动”的病毒滴定中。这些RBC不展现血细胞凝集。引起完全血细胞凝集的最高的病毒稀释度被认为是HA滴定终点。HA滴度是具有完全血细胞凝集的最后一个反应孔中的病毒稀释度的倒数。在冷PBS中稀释病毒来产生含有8HAU/50μl的工作溶液。通过如上所述进行第二次HA测试，验证稀释的病毒含有8HAU每50μl。病毒的滴度应当是8。如果不是8，如果<8HAU通过添加病毒、如果>8HAU通过添加冷PBS来调整病毒浓度。在冰上保存病毒的工作稀释度，在同一天内使用。
使用猪RBC的HI分析。
1.在室温下解冻血清，在56度加热灭活30分钟，然后在使用期间保持在冰上。
2.用平板编号和根据实验设计的病毒名称标记V底平板。
3.所有平板的列12都可以保存为RBC对照。阳性和阴性对照血清以及反滴定可以在独立的平板中进行，或添加到平板的现有列中。
4.如果使用稀释板/滴定管，对于一种病毒的重复测试，通过在A行1-11列中的滴定管中加入110μl处理过的血清(1:10)，产生连续2倍稀释的处理的血清。
5.向B-H行、1-11列的滴定管添加55μl的冷PBS。
6.使用P200多通道移液管从行到行(A->B->C...H)转移55μl血清来制成连续的2倍稀释物。
7.在混合后从H行丢弃55μl。
8.具有适当起始稀释度的阳性和阴性对照应当按照上文相同的程序连续稀释。
9.从H行开始直到A行，将25μl每个稀释的血清样品从稀释平板转移到V形底平板。如果从最高稀释度(H行)转移到最低稀释度(A行)，不需要更换尖头(change tips)。关键的是，在开始吸移下一组血清样品之前必需更换尖头。
10.如果没有稀释板，可以直接在平板上进行血清样品的连续稀释。对于一种病毒的重复测试，首先，向V形底平板的B-H行、1-11列添加25μl的冷PBS。第二，向A行、1-11列添加50μl的热灭活的血清。然后，从行到行(A->B->C...H)转移25μl RDE处理的血清来制得连续的2倍稀释物。在混合后从H行丢弃25μl。
11.在含有血清的孔中加入25ul含4HAU的标准化的病毒。注意这与含有8HAU的50μl是相同的。
12.轻轻地敲打平板来混合。堆叠平板并用空的平板来覆盖。
13.在室温下(22℃到25℃)孵育病毒和血清一小时。
14.向12列添加50μl PBS。这将充当RBC对照。
15.向每个孔中添加50μl的1.0％猪RBC悬浮液。
16.轻轻地敲打平板来混合。堆叠平板并用空的平板来覆盖。
17.在室温下孵育一小时。
18.通过45到60°角倾斜平板来记录一小时孵育之后血清的HI滴度。由于重力，12列中沉积的RBC应当开始“拉动”或“跑动”并形成泪珠形状。等待直到这些RBC结束“拉动”，然后读取以同样的方法“跑动”或“细流”的RBC按钮。具有完全的血细胞凝集抑制的反应孔看起来将与RBC对照一样。血清HI滴度是具有完全的血细胞凝集抑制的最后一个反应孔中血清稀释度的倒数。
为了确定这种新的正呼肠孤病毒的流行和地理分布，使用猪红血球的上述血细胞凝集抑制(HI)分析，用斑块纯化的MRV3作为血细胞凝集素，我们对2014-2015年从24个州收集的1067份血清样品和2008年的28份血清样品进行回顾性血清学监测。确定的是，在1-56周龄的测试的动物中，猪的年龄对于HI滴度没有显著影响。在2014-2015年间POV3特异性HI抗体的发生是非常高的，但是2008年的样品是阴性的。针对POV3的HI滴度从2到4096，88.37％的样品高于1：8的截断滴度。仅从衣阿华州、北卡罗来纳州、宾夕法尼亚州、德克萨斯州、南达科他州、俄克拉荷马州、蒙大拿州、密歇根州、乔治亚州和科罗拉多州采集的猪血清样品记录到高HI抗体滴度(2048和更高)。在图7A中描绘了2Log标度的450份样品的HI滴度。
实施例10:使用间接ELISA，筛查猪血清样品的POV3特异性IgG
开发了间接ELISA方案，用于筛查猪或任何其他物种血清样品中存在或不存在POV3特异性IgG，使用超纯化的全病毒或POV3病毒的重组蛋白用于血清监测POV3感染。一般地，将猪血清的稀释物添加到纯化的POV3包被的微量滴定板中，特异于POV3的抗体结合至微量滴定板。使用标记的抗猪Ig，例如碱性磷酸酶标记的抗体，随后用对硝基苯基磷酸盐底物，检测与平板结合的抗体。有色终产物的光密度与血清中存在的POV3特异性抗体的数量成比例。
在进行的一个实施例中，保存在-80℃的纯化的POV3(1mg/mL)冷冻等分量在室温下解冻。用无菌的抗原包被缓冲液(1X PBS/0.02％NaN3)将病毒抗原稀释到预定浓度(一般2.5μg/ml)。100μl等分量的抗原移液到微量滴定板的每个反应孔中，在4℃覆盖孵育过夜。在室温下将反应孔用PBS(Thermo Scientific，USA，目录号：37515)中的300uL/孔SuperBlock Blocking缓冲液封闭1小时，并将平板保存在保持在4℃的湿润的室中。如果使用叠氮化钠，包被的平板可以在4℃下储存几个月，条件是储存条件适合于防止封闭溶液(Blocking solution)的蒸发和污染。制备的其它试剂包括底物终止溶液：3M NaOH[1升]，2M硫酸/终止溶液[200ml]和包被缓冲液10X(10X PBS/0.2％NaN3[1L]：NaCl-80g，KH2PO4-3.14g，Na2HPO4-7H2O-20.61g，KCl-1.6g，NaN3-2g)。当稀释时，1X包被缓冲液的pH值应当是7.2±0.2。
制备血清稀释缓冲液10X：10X PBS/0.2％NaN3/0.5％Tween-20[1L]：NaCl 80g，KH2PO4 3.14g，Na2HPO4·7H2O 20.61g，KCl 1.60g，NaN3 2g。将800ml试剂等级的水添加到置于磁性搅拌器上的2升烧杯中。称取上文列出的干燥的化学品，将它们添加到水中。溶解所述化学品，用试剂等级的水将体积调至1L。添加5mL Tween-20。当稀释时，1X血清稀释缓冲液的pH值应当是7.2±0.2。洗涤缓冲液是1×PBS/0.05％Tween-20，pH 7.2±0.2。
测试具有未知的抗POV3抗体浓度的猪血清的程序。取回冷冻保存的所有血清样品、对照和参考血清(reference sera)，将它们置于室温下解冻(～30分钟)。样品不应冷冻/解冻超过3次。根据需要用稀释缓冲液进行连续稀释(通常2倍或3倍)，在室温下孵育稀释的样品30分钟。用洗涤缓冲液洗涤抗原包被的微量滴定板5次。在第一次洗涤期间，在填充反应孔之后容许洗涤缓冲液在平板上浸泡30秒到1分钟。使用多通道移液器，从稀释平板转移50μl的每个血清稀释到洗涤的抗原包被的平板。向每个平板的两个反应孔仅添加抗体缓冲液充当空白。用盖子盖上平板，在室温下孵育2小时。在使用前15分钟，在抗体缓冲液中制备适当稀释度的抗猪Ig轭合物。用洗涤缓冲液洗涤平板5次。在第一次洗涤期间，在填充反应孔之后容许洗涤缓冲液在平板上浸泡30秒到1分钟。向所有的微量滴定板反应孔添加100μl稀释的酶轭合物。用盖子盖上平板，在室温下孵育1小时。在需要之前15分钟，在二乙醇胺底物缓冲液中制备对硝基苯基磷酸盐的1mg/ml溶液。在摇动器上混合底物溶液，用纸巾包住避免光照。用洗涤缓冲液洗涤平板5次。在第一次洗涤期间，在填充反应孔之后容许洗涤缓冲液在平板上浸泡30秒到1分钟。向所有微量滴定板反应孔添加100μl的底物溶液。将盖子放于平板上，在室温下孵育2小时。向所有反应孔添加50μl的3M NaOH来停止酶反应。等待至少5分钟，之后在450nm下在微量滴定板读取器上读取平板的光密度。图7B描绘了来自俄亥俄州2014年暴发的随机地选择的59份未知猪血清样品获得的结果，图中呈现了来自2008年的31份已知的阴性猪血清样品。
为了证明POV3纯化的病毒抗原产生可比较的结果以及使用真阳性猪血清样品的可比较的检测下限，用不同稀释度的抗原和抗体进行棋盘滴定。以逐渐升高的浓度将抗原吸附在微量滴定平板的表面。整个平板以一个稀释度添加参考血清，使用已知的POV3特异性抗体完成ELISA。抗原批次的最佳包被浓度通过检查光密度值vs.抗原浓度来确定。如早先描述的，使用三种不同浓度的纯化的POV3病毒，1.25μg/mL、2.5μg/mL和5μl/mL，测试了已知的阳性血清样品的八种不同的稀释度(1:1000到1:128000)。标绘获得的结果，抗体的浓度(Y轴)对比OD值(X轴)。在一个测试的制品中，用于包被的纯化病毒的最佳浓度被确定为2.5μg/mL。使用抗MRV S1单克隆抗体作为阳性对照，使用2.5μg/mL包被的纯化POV3通过1:100到1:51200稀释的已知的阳性和阴性血清样品的棋盘滴定，可以确定用于ELISA的血清稀释度的敏感性/下限。
实施例11:开发基于RT-PCR的分析用于检测来自临床样品的致病性猪正呼肠孤病 毒-3(POV3)
为了检测粪便和组织样品和血粉样品中的POV3，开发了简单的RT-PCR，靶向致病性猪正呼肠孤病毒的S1和L2基因。根据计算机分析并选择本发明人表征的致病性POV3-VT猪正呼肠孤病毒上存在的独特区域来设计引物。使用ABI第一链合成试剂盒，采用随机引物/反引物，从样本提取的RNA进行cDNA合成。在70℃将RNA热变性10分钟，急速冷却(snapcooled)，与cDNA主混合物混合，在25℃孵育10分钟用于引物结合。在37℃进行RT反应2小时，在85℃RT-灭活5分钟。使用如下的S1特异性或L1特异性引物进行PCR来扩增cDNA：POV3_VT_Sl Fwd(KM820760):
5'-138 CAC TCT GAT ACA ATC CTT AGG ATC ACT CAA GG 169-3'，SEQ.ID.NO.3
POV3_VT_Sl Rev(KM820760):
5'-573 CCA TCG TCA TAC GAT TGT TAT TGA TTG CCA 544-3'，SEQ.ID.NO.4
POV3 L1 Fwd:
5'-1541 CTA TAC TAG CTG ACA CTT CGA TGG GAT TGC 1570-3'，SEQ.ID.NO.5
POV3 L1 Rev:
5'-3129 CGT CTC ATC CAT TTC TGC CAG CTC TT 3104-3'，SEQ.ID.NO.6
94℃初始变性5分钟；由94℃30秒的变性、58℃30秒的引物退火和72℃30秒的延伸组成的40个循环。最后在72℃延伸10分钟。如图8所示，对于S1和L2基因片段，扩增的长度分别是424bp和537bp。靶向POV3 S1和L1基因的RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳：M：1Kb+阶梯，泳道1-2：POV3-粪便样品(S1靶标)，泳道3：POV3-血粉(S1靶标)，泳道4：无模板阴性对照，泳道5：POV3-粪便样品(L1靶标)，泳道6：POV3-血粉(L1靶标)。
在实验感染的仔猪的脑和肺组织中进行POV3的RT-PCR筛查。为了检测组织样品中的POV3，从实验感染的仔猪中选择肺和脑样品。根据厂家的建议，RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,USA)用于从新鲜的、冷冻的或RNA后稳定化组织(达到30mg，取决于组织类型)提取RNA。使用ABI第一链合成试剂盒，采用随机引物/反引物，RNA进行cDNA合成。RNA在70℃热变性10分钟，急速冷却，与cDNA主混合物混合，在25℃孵育10分钟用于引物结合。RT反应在37℃进行2小时，在85℃下RT灭活5分钟。使用S1特异性正向和反向引物，使用PCR扩增cDNA，94℃初始变性5分钟；由94℃30秒的变性、58℃30秒的引物退火和72℃30秒的延伸组成的40个循环。最后在72℃延伸10分钟。扩增的长度是424bp。如图9A和B中所见的，在两种组织类型中，据此的RT-PCR成功地扩增了424bp的部分S1基因片段。在图中，显示了靶向POV3 S1基因、组织匀浆的RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。图9A：实验感染的仔猪的脑组织匀浆的基于S1片段的RT-PCR：泳道M：1Kb+阶梯，泳道1-9：实验感染的仔猪的脑组织匀浆的RT-PCR，泳道10:模拟感染的脑组织匀浆的RT-PCR，泳道11：POV3病毒阳性对照。图9B：实验感染的仔猪的肺组织匀浆的基于S1片段的RT-PCR：泳道M：1Kb+阶梯，泳道1-9：实验感染的仔猪的脑组织匀浆的RT-PCR，泳道10:模拟感染的脑组织匀浆的RT-PCR。
实施例12:基于SYBR绿的定量实时PCR分析用于检测新的猪POV3
提供了检测猪生物样品中存在还是缺乏POV3的方法的另一个实例。由于POV3病毒是片段的RNA病毒，所述方法包括逆转录步骤和cDNA扩增循环，使用POV3 S1或L1基因特异性引物来产生扩增产物，如果样品中存在POV3核酸分子的话。作为本文描述的方法的结果，目标核酸的扩增和随后的检测是可能的。使用POV3 RNA作为模板，用以下的引物组合进行实时PCR分析。引物组合S1：POV3_VT_Sl Fwd，SEQ.ID.3以及POV3_VT_Sl Rev,SEQ.ID.4。引物组合L1:POV3 L1 fwd，SEQ.ID.5以及POV3 L1 rev，SEQ.ID.6。
根据以下参数设置PCR反应。进行两组反应。使用Biorad i循环仪进行以下循环条件——55℃5分钟，60℃5分钟和65℃5分钟。之后是45个循环的：94℃5分钟和60℃40秒。每个反应进行两份。如果CT值低于40，POV3信号的测试被认为是阳性的。
在实时PCR分析中，通过荧光信号的积累来检测阳性反应。CT值(循环阈值)被定义为荧光信号与超过背景的阈值交叉所需的循环数。CT水平反比于样品中目标核酸的数量，CT水平越低，样品中的目标核酸数量越高。
该分析适合于诊断POV3 S1片段和L1片段。如图10A中所示，衍生自细胞培养物扩增的POV3的不同稀释度的cDNA被用于检查线性。如图10B中所示，在熔融曲线分析中，扩增自S1特异性引物的所有扩增的PCR产物具有相同的熔融曲线，峰值在82.5℃。相比之下，L1扩增的PCR产物的熔融峰在79.5℃(图11)。在qRT-PCR中使用双靶标(S1和L1)容许细胞培养衍生的病毒、粪便样品、血粉和感染的组织匀浆中POV3存在的辩别诊断。
图10A：细胞培养物衍生的POV3的cDNA稀释度(101到106)的扩增图；图10B：S1扩增的PCR产物的熔融曲线分析，显示了82.5℃出的熔融峰；图10C：S1扩增的PCR产物的解离曲线。图10D：ct值vs.cDNA稀释度的线性曲线。
图11A-C显示了POV3的基于L1的qRT-PCR扩增。图11A：来自细胞培养物衍生的POV3的L1基因片段产物的扩增图；图11B：L1扩增的PCR产物的熔融曲线分析，显示了79.5℃处的熔融峰；图11C：L1扩增的PCR产物的解离曲线。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同在本文中完整阐述它们。虽然参考说明性的实施方式描述了本发明，这些描述不希望以限制性方式来解释。本发明的说明性实施方式以及其他实施方式的各种修改和组合，在参考说明书时，对于本领域的技术人员而言是显而易见的。因此期望的是附随的权利要求涵盖了这些修改和增强。
序列表
<110> 弗吉尼亚暨州立大学知识产权公司
<120> 新的猪正呼肠弧病毒的疫苗和诊断
<130> 124617-00411
<150> 62/080462
<151> 2014-11-17
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒 S1
<400> 1
tgggacaact tgagacagga 20
<210> 2
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<212> DNA
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ctgaagtcca ccrttttgwa 20
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<211> 32
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<400> 3
cactctgata caatccttag gatcactcaa gg 32
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒 S1
<400> 4
ccatcgtcat acgattgtta ttgattgcca 30
<210> 5
<211> 30
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<213> 正呼肠孤病毒
<400> 5
ctatactagc tgacacttcg atgggattgc 30
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<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 6
cgtctcatcc atttctgcca gctctt 26
<210> 7
<211> 3854
<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 7
gctacacgtt ccacgacaat gtcatccatg atactgactc agtttggacc gttcattgaa 60
agcatctcag gtatcactga ccaatcgaac gacgtgtttg aagatgcagc aaaagcattc 120
tctacgttta ctcgcagcga cgtctataag gcgctggatg agataccttt ctctgatgac 180
gcgatgcttc ccatccctcc aactatatat accaaaccat ctcacgattc atattattac 240
atagatgctc taaaccgcgt acgtcgtaaa acatatcagg gccctgatga cgtgtacgta 300
cctaattgtt ccatcgttga attgctagag ccgcatgaga ctctgacatc ttatgggcgt 360
ttgtctgaag cgattgagaa tcgtgccaag gatggagaca gccaagccag aattgcgaca 420
acatacggta gaatcgctga gtctcaggct agacagatta aggctccatt ggagaagttt 480
gtgttggcac tattggtgtc cgaagcgggg ggttctctat atgacccagt tttgcagaag 540
tatgatgaga ttccagatct atcgcataat tgccctttat ggtgttttag agaaatctgt 600
cgtcacatat ctggtccatt accagatcga gcaccttatc tttacttatc ggcaggggtt 660
ttctggttaa tgtcaccacg gatgacgtct gcgatccctc cgttattatc tgatcttgtt 720
aatttagcta tcttacaaca gactgcaggt ttagatccat cattagtgaa attgggagtg 780
cagatatgtc ttcacgcagc agctagttcg agttatgcat ggtttatcct aaagactaag 840
tctatttttc ctcaaaacac gttacatagt atgtatgagt ctctagaagg agggtactgt 900
cctaacctag aatggttaga gcctagatcg gactataaat ttatgtacat gggagtcatg 960
ccattgtcca ctaaatatgc taggtcggca ccatccaacg aaaagaaagc gcgggaactt 1020
ggtgagaaat atggattgag ttcagttgtc agtgagcttc gtaaacggac aatggcttat 1080
gttaaacatg actttgcttc ggtaaggtac attcgtgacg ccatggcatg tactagcggc 1140
atttttctgg taagaacacc caccgagacg gtattgcaag aatataccca aagtccggag 1200
attaaggttc ccatccccca caaagactgg acaggcccag taggtgaaat cagaattcta 1260
aaagatacaa ccagctccat cgcgcgctac ttgtatagaa catggtactt agcagcggca 1320
agaatggcgg ctcagccacg cacgtgggat ccattgttcc aggcgattat gagatctcaa 1380
tacgtgacag ctaggggtgg gtctggcgca gcactccgcg aatctctgta tgcaattaat 1440
gtgtcgttac ctgattttaa gggcttacca gtgaaggcag caactaagat atttcaggcg 1500
gcacaattag cgaacctgcc gttctcacac acatcagtgg ctatactagc tgacacttcg 1560
atgggattgc gaaaccaggt gcagaggcga ccacgatcca tcatgccctt aaatgtgccc 1620
caacagcagg tttcggcgcc tcatacattg accgctgatt atatcaatta tcacatgaat 1680
ctatcgacta cgtctggtag cgcggtcatt gagaaagtga ttcctttagg tgtatacgct 1740
tcaagccctc ctaaccaatc gattaacatt gacatatctg cgtgcgacgc aagtattact 1800
tgggacttct ttctatccgt gattatggcg gctatacacg aaggtgtcgc tagtagctcc 1860
attggaaaac cgttcatggg agttcctgca tccatcgtaa atgatgagtc tgtcgttgga 1920
gtgagagctg ctaggccgat atcgggaatg cagaacatgg ttcagcatct atcaaaactg 1980
tacaaacgtg gattttcata tagagtgaac gactcttttt ctccaggcaa cgattttact 2040
catatgacta ccactttccc gtcaggttca acagccactt ctactgagca tactgccaat 2100
aatagtacga tgatggaaac tttcctgaca gtatggggac ccgaacatac tgacgacccc 2160
gacgtcttac gtctaatgaa gtctttgact attcaaagga attacgtgtg tcaaggtgat 2220
gatggattga tgattatcga tgggaatact gctggtaagg tgaaaagtga aactgttcag 2280
aagatgttgg agttaatctc aaaatatggt gaggagtttg gatggaaata tgacatagcg 2340
tacgatggga ctgccgagta cctaaagctg tacttcatat ttggctgtcg aattccaaat 2400
cttagccgtc atccaattgt tggaaaagaa cgggcgaatt cttcagcaga ggagccatgg 2460
ccagcaattt tagatcagat tatgggtatc ttctttaatg gcgttcatga cgggttgcag 2520
tggcagcggt ggatacgtta ttcatgggct ctatgctgtg ctttctcacg ccaaaggaca 2580
atgattggcg agagcgtggg ttacattcaa tatcctatgt ggtcatttgt ctactgggga 2640
ttaccattgg taaaagtgtt cgggtcagac ccatggatat tctcttggta catgccgact 2700
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aaatgtttca atgagattaa attatatcaa gggtattata tggcacaatt gcccaggaat 2880
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tctgattatc tgatgcaaaa tccagaactg aagtcacgtg tgctacgtgg tcgtagtgag 3000
tgggagaagt atggagccgg gataattcac aaccctccat cattattcga tgtcccccat 3060
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ggagttgctg tcgacatata tctggaggat atacacggtg gtggtcgatc acttggacag 3780
agattcatga cttggatgcg gcaggaagga cggtcagcgt gagtctacca tgggtcgtgg 3840
tgcgtcaact catc 3854
<210> 8
<211> 1267
<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 8
Met Ser Ser Met Ile Leu Thr Gln Phe Gly Pro Phe Ile Glu Ser Ile
1 5 10 15
Ser Gly Ile Thr Asp Gln Ser Asn Asp Val Phe Glu Asp Ala Ala Lys
20 25 30
Ala Phe Ser Thr Phe Thr Arg Ser Asp Val Tyr Lys Ala Leu Asp Glu
35 40 45
Ile Pro Phe Ser Asp Asp Ala Met Leu Pro Ile Pro Pro Thr Ile Tyr
50 55 60
Thr Lys Pro Ser His Asp Ser Tyr Tyr Tyr Ile Asp Ala Leu Asn Arg
65 70 75 80
Val Arg Arg Lys Thr Tyr Gln Gly Pro Asp Asp Val Tyr Val Pro Asn
85 90 95
Cys Ser Ile Val Glu Leu Leu Glu Pro His Glu Thr Leu Thr Ser Tyr
100 105 110
Gly Arg Leu Ser Glu Ala Ile Glu Asn Arg Ala Lys Asp Gly Asp Ser
115 120 125
Gln Ala Arg Ile Ala Thr Thr Tyr Gly Arg Ile Ala Glu Ser Gln Ala
130 135 140
Arg Gln Ile Lys Ala Pro Leu Glu Lys Phe Val Leu Ala Leu Leu Val
145 150 155 160
Ser Glu Ala Gly Gly Ser Leu Tyr Asp Pro Val Leu Gln Lys Tyr Asp
165 170 175
Glu Ile Pro Asp Leu Ser His Asn Cys Pro Leu Trp Cys Phe Arg Glu
180 185 190
Ile Cys Arg His Ile Ser Gly Pro Leu Pro Asp Arg Ala Pro Tyr Leu
195 200 205
Tyr Leu Ser Ala Gly Val Phe Trp Leu Met Ser Pro Arg Met Thr Ser
210 215 220
Ala Ile Pro Pro Leu Leu Ser Asp Leu Val Asn Leu Ala Ile Leu Gln
225 230 235 240
Gln Thr Ala Gly Leu Asp Pro Ser Leu Val Lys Leu Gly Val Gln Ile
245 250 255
Cys Leu His Ala Ala Ala Ser Ser Ser Tyr Ala Trp Phe Ile Leu Lys
260 265 270
Thr Lys Ser Ile Phe Pro Gln Asn Thr Leu His Ser Met Tyr Glu Ser
275 280 285
Leu Glu Gly Gly Tyr Cys Pro Asn Leu Glu Trp Leu Glu Pro Arg Ser
290 295 300
Asp Tyr Lys Phe Met Tyr Met Gly Val Met Pro Leu Ser Thr Lys Tyr
305 310 315 320
Ala Arg Ser Ala Pro Ser Asn Glu Lys Lys Ala Arg Glu Leu Gly Glu
325 330 335
Lys Tyr Gly Leu Ser Ser Val Val Ser Glu Leu Arg Lys Arg Thr Met
340 345 350
Ala Tyr Val Lys His Asp Phe Ala Ser Val Arg Tyr Ile Arg Asp Ala
355 360 365
Met Ala Cys Thr Ser Gly Ile Phe Leu Val Arg Thr Pro Thr Glu Thr
370 375 380
Val Leu Gln Glu Tyr Thr Gln Ser Pro Glu Ile Lys Val Pro Ile Pro
385 390 395 400
His Lys Asp Trp Thr Gly Pro Val Gly Glu Ile Arg Ile Leu Lys Asp
405 410 415
Thr Thr Ser Ser Ile Ala Arg Tyr Leu Tyr Arg Thr Trp Tyr Leu Ala
420 425 430
Ala Ala Arg Met Ala Ala Gln Pro Arg Thr Trp Asp Pro Leu Phe Gln
435 440 445
Ala Ile Met Arg Ser Gln Tyr Val Thr Ala Arg Gly Gly Ser Gly Ala
450 455 460
Ala Leu Arg Glu Ser Leu Tyr Ala Ile Asn Val Ser Leu Pro Asp Phe
465 470 475 480
Lys Gly Leu Pro Val Lys Ala Ala Thr Lys Ile Phe Gln Ala Ala Gln
485 490 495
Leu Ala Asn Leu Pro Phe Ser His Thr Ser Val Ala Ile Leu Ala Asp
500 505 510
Thr Ser Met Gly Leu Arg Asn Gln Val Gln Arg Arg Pro Arg Ser Ile
515 520 525
Met Pro Leu Asn Val Pro Gln Gln Gln Val Ser Ala Pro His Thr Leu
530 535 540
Thr Ala Asp Tyr Ile Asn Tyr His Met Asn Leu Ser Thr Thr Ser Gly
545 550 555 560
Ser Ala Val Ile Glu Lys Val Ile Pro Leu Gly Val Tyr Ala Ser Ser
565 570 575
Pro Pro Asn Gln Ser Ile Asn Ile Asp Ile Ser Ala Cys Asp Ala Ser
580 585 590
Ile Thr Trp Asp Phe Phe Leu Ser Val Ile Met Ala Ala Ile His Glu
595 600 605
Gly Val Ala Ser Ser Ser Ile Gly Lys Pro Phe Met Gly Val Pro Ala
610 615 620
Ser Ile Val Asn Asp Glu Ser Val Val Gly Val Arg Ala Ala Arg Pro
625 630 635 640
Ile Ser Gly Met Gln Asn Met Val Gln His Leu Ser Lys Leu Tyr Lys
645 650 655
Arg Gly Phe Ser Tyr Arg Val Asn Asp Ser Phe Ser Pro Gly Asn Asp
660 665 670
Phe Thr His Met Thr Thr Thr Phe Pro Ser Gly Ser Thr Ala Thr Ser
675 680 685
Thr Glu His Thr Ala Asn Asn Ser Thr Met Met Glu Thr Phe Leu Thr
690 695 700
Val Trp Gly Pro Glu His Thr Asp Asp Pro Asp Val Leu Arg Leu Met
705 710 715 720
Lys Ser Leu Thr Ile Gln Arg Asn Tyr Val Cys Gln Gly Asp Asp Gly
725 730 735
Leu Met Ile Ile Asp Gly Asn Thr Ala Gly Lys Val Lys Ser Glu Thr
740 745 750
Val Gln Lys Met Leu Glu Leu Ile Ser Lys Tyr Gly Glu Glu Phe Gly
755 760 765
Trp Lys Tyr Asp Ile Ala Tyr Asp Gly Thr Ala Glu Tyr Leu Lys Leu
770 775 780
Tyr Phe Ile Phe Gly Cys Arg Ile Pro Asn Leu Ser Arg His Pro Ile
785 790 795 800
Val Gly Lys Glu Arg Ala Asn Ser Ser Ala Glu Glu Pro Trp Pro Ala
805 810 815
Ile Leu Asp Gln Ile Met Gly Ile Phe Phe Asn Gly Val His Asp Gly
820 825 830
Leu Gln Trp Gln Arg Trp Ile Arg Tyr Ser Trp Ala Leu Cys Cys Ala
835 840 845
Phe Ser Arg Gln Arg Thr Met Ile Gly Glu Ser Val Gly Tyr Ile Gln
850 855 860
Tyr Pro Met Trp Ser Phe Val Tyr Trp Gly Leu Pro Leu Val Lys Val
865 870 875 880
Phe Gly Ser Asp Pro Trp Ile Phe Ser Trp Tyr Met Pro Thr Gly Asp
885 890 895
Leu Gly Met Tyr Ser Trp Ile Ser Leu Ile Arg Pro Leu Met Thr Arg
900 905 910
Trp Met Val Ala Asn Gly Tyr Val Thr Asp Lys Cys Ser Pro Val Phe
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Gly Asn Ala Asp Tyr Arg Lys Cys Phe Asn Glu Ile Lys Leu Tyr Gln
930 935 940
Gly Tyr Tyr Met Ala Gln Leu Pro Arg Asn Pro Thr Lys Ser Gly Arg
945 950 955 960
Ala Ala Pro Arg Glu Val Arg Glu Gln Phe Thr Gln Ala Leu Ser Asp
965 970 975
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980 985 990
Ser Glu Trp Glu Lys Tyr Gly Ala Gly Ile Ile His Asn Pro Pro Ser
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Leu Phe Asp Val Pro His Lys Trp Tyr Gln Gly Ala Gln Glu Ala
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Ala Thr Ala Thr Arg Glu Glu Leu Ala Glu Met Asp Glu Thr Leu
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Ile Arg Ala Arg Arg His Ser Tyr Ser Ser Phe Ser Lys Leu Leu
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Glu Ala Tyr Leu Leu Val Lys Trp Arg Met Cys Glu Ala Arg Glu
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Pro Ser Val Asp Leu Arg Leu Pro Leu Cys Ala Gly Ile Asp Pro
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Leu Asn Ser Asp Pro Phe Leu Lys Met Val Ser Val Gly Pro Met
1085 1090 1095
Leu Gln Ser Thr Arg Lys Tyr Phe Ala Gln Thr Leu Phe Met Ala
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Lys Thr Val Ser Gly Leu Asp Val Asn Ala Ile Asp Ser Ala Leu
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Ala Gly Lys Ile Met Leu Gln Asp Val Ser Thr Val Gln Leu Ala
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Arg Val Val Asn Leu Ala Val Pro Asp Thr Trp Met Ser Leu Asp
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<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
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tcaccgtctg tagtcgacgg agctacgcac tatggttatg ttaggagaaa tcagttgcgg 1140
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Glu Ala Lys Asp Glu Ala Asp Glu Ala Thr Lys Lys Gln Ala Lys Asp
100 105 110
Thr Asp Lys Ser Lys Ala Gln Val Thr Tyr Ser Asp Thr Gly Ile Asn
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Asn Ala Asn Glu Leu Ser Arg Ser Gly Asn Val Asp Asn Glu Gly Gly
130 135 140
Ser Asn Gln Lys Pro Met Ser Thr Arg Ile Ala Glu Ala Thr Ser Ala
145 150 155 160
Ile Val Ser Lys His Pro Ala Arg Val Gly Leu Pro Pro Thr Ala Ser
165 170 175
Ser Gly His Gly Tyr Gln Cys His Val Cys Ser Ala Val Leu Phe Ser
180 185 190
Pro Leu Asp Leu Asp Ala His Val Ala Ser His Gly Leu His Gly Asn
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Met Thr Leu Thr Ser Ser Glu Ile Gln Arg His Ile Thr Glu Phe Ile
210 215 220
Ser Ser Trp Gln Asn His Pro Ile Val Gln Val Ser Ala Asp Val Glu
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Asn Lys Lys Thr Ala Gln Leu Leu His Ala Asp Thr Pro Arg Leu Val
245 250 255
Thr Trp Asp Ala Gly Leu Cys Thr Ser Phe Lys Ile Val Pro Ile Val
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Pro Ala Gln Val Pro Gln Asp Val Leu Ala Tyr Thr Phe Phe Thr Ser
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Ser Tyr Ala Ile Gln Ser Pro Phe Pro Glu Ala Ala Val Ser Arg Ile
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Val Val His Thr Arg Trp Ala Ser Asn Val Asp Phe Asp Arg Asp Ser
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Asn Leu Tyr Leu Asn Arg His Thr Gly Phe Ser Gln Asp His Thr Pro
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<210> 13
<211> 2304
<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 13
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atcaactcta tcatttacta tgactaagtg catcattccg tttggcaaag aggtgggccg 600
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taaaatgtat gctactagcg cgcagcctaa atggtttgga tcattattgc gattgttaat 1800
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<210> 14
<211> 736
<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 14
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Ser Gln Leu Leu Glu Tyr Trp Lys Ser Asn Pro Ser Ala Ile Pro Asp
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Ala Ala Gln Leu Met His Leu Pro Tyr His Val Lys Arg Gly Ala Ser
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His Thr Val Pro Val Cys Ile Leu Glu Met Leu Gly Ile Glu Ile Ala
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450 455 460
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Gln Ala Phe Leu Pro Leu Ala Lys Asp Leu Leu Ala Pro Met Ala Arg
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Leu Thr Thr Lys Tyr Glu Met Arg Leu Ser Cys Gly His Ser Thr Gly
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<210> 15
<211> 2205
<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 15
tgctaatctg ctgaccgtta ctctgcaaag atggggaacg cttcctctat tgttcagacg 60
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cagttggcta tttctcaact tgagactggg tatggtgtac ggatattcaa ttctaaggga 1800
attctttcga aaatcgcgtc cagagctatg caggctttta tcggtgatcc aagcacaatt 1860
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<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 16
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Gly Tyr Thr Arg
705
<210> 17
<211> 2241
<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 17
gctaaagtga ccgtggtcat ggcttcgttc aagggattct ccgccaacac tgttccagtt 60
tccaaggcca aacgtgacat atcatccctt gctgctactc ctggatttca ttcacaatcc 120
tttactccgt ctgtggatat gtctcaatcg cgtgaattcc tcacaaaagc aatcgagcag 180
gggtccatgt ctatacctta tcagcatgtg aatgtaccga aagttgatcg taaagttgtc 240
agcttggtag tgcggccttt ttcttcaggt gctttctcta tctctggagt gatttcgcca 300
gcccatgcct atctgctaga ttgtctacct cagcttgagc aggcaatggc ttttgttgct 360
tcacccgagt ctttccaggc ttcagatgtt gcaaagcgtt ttgctataaa gccaggtatg 420
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gtgactcgtc agaattttga tgttattgta gctgagatcg agaggcttgc ttcaaccagc 540
gtgtctgtca ggactgagga agcgaaggtt gctgatgagg agctgatgtt attcgggcta 600
gatcacagag ggccacagca gttggatatt tctgacgcta aagggataac gaaggctgct 660
gacattcaga caactcatga tgttcatctg gcacccggcg ttggtaatat tgaccctgaa 720
atctataacg aagggcggtt catgttcatg cagcacaaac cacttgcggc ggatcaatcg 780
tactttacct tagagactgc ggattatttc aagatttatc caacatatga cgaacatgat 840
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gctgagcaaa ctatatttaa actggacgct cccgacgaca aaactgttca tctgttagat 960
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acgcaagtga tttccattac ctccgccgct ctgaagtggg tggttaaaca tggcgtgtct 1140
gatggaattg tgaataggaa gaatgtcaaa gtgtgtgttg gttttgaccc tttatacact 1200
ctgtccacgc ataacggaat atctctgtgt gccctgttga tggatgagaa gctttcggtg 1260
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gcacacagag cttttcagcg agtcctttct caaggatacg catcgttaat gtgctattat 1380
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gtagatggga tcaagctaca gttggacgca tccagacatt gtcatgaatg tcctgtgttg 1500
cagcagaaag tggttgaatt ggaaaaacag atcgtcatgc aaaagtcgat tcagtcagac 1560
cctaccccaa tggcactgca accactgttg tctcagttgc gtgagctatc cagcgaagtt 1620
actaggctgc agatggagtt gagtagggct caatctttga atgcccagtt ggaggcggat 1680
gtcaaatcag ctcaatcatg cagcctggat atgtatctga gacaccacac ttgcattaat 1740
ggtcatgcta aagaggatga attgcttgat gctgtgcgtg tcgcaccgga tgtgaggagg 1800
caaatcatgg aaaggaggag tgaagtgaga aagggatggt gtgaacgtat ttctaaggaa 1860
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gtgagtacca tcacccaaaa ccagatgact tatcagcaag agttacaagc cttagtagcg 2040
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tctcttctat cagtcactcc taccgattca gttgatggcg ctgctgacct aatcgatttc 2160
tctgttccga ctgatgagct gtaaatgatc cgtgatgcag tgttgtccta atcccttaag 2220
ccttcccgac ccccattcat c 2241
<210> 18
<211> 721
<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 18
Met Ala Ser Phe Lys Gly Phe Ser Ala Asn Thr Val Pro Val Ser Lys
1 5 10 15
Ala Lys Arg Asp Ile Ser Ser Leu Ala Ala Thr Pro Gly Phe His Ser
20 25 30
Gln Ser Phe Thr Pro Ser Val Asp Met Ser Gln Ser Arg Glu Phe Leu
35 40 45
Thr Lys Ala Ile Glu Gln Gly Ser Met Ser Ile Pro Tyr Gln His Val
50 55 60
Asn Val Pro Lys Val Asp Arg Lys Val Val Ser Leu Val Val Arg Pro
65 70 75 80
Phe Ser Ser Gly Ala Phe Ser Ile Ser Gly Val Ile Ser Pro Ala His
85 90 95
Ala Tyr Leu Leu Asp Cys Leu Pro Gln Leu Glu Gln Ala Met Ala Phe
100 105 110
Val Ala Ser Pro Glu Ser Phe Gln Ala Ser Asp Val Ala Lys Arg Phe
115 120 125
Ala Ile Lys Pro Gly Met Ser Leu Gln Asp Ala Ile Thr Ala Phe Ile
130 135 140
Asn Phe Val Ser Ala Met Leu Lys Met Thr Val Thr Arg Gln Asn Phe
145 150 155 160
Asp Val Ile Val Ala Glu Ile Glu Arg Leu Ala Ser Thr Ser Val Ser
165 170 175
Val Arg Thr Glu Glu Ala Lys Val Ala Asp Glu Glu Leu Met Leu Phe
180 185 190
Gly Leu Asp His Arg Gly Pro Gln Gln Leu Asp Ile Ser Asp Ala Lys
195 200 205
Gly Ile Thr Lys Ala Ala Asp Ile Gln Thr Thr His Asp Val His Leu
210 215 220
Ala Pro Gly Val Gly Asn Ile Asp Pro Glu Ile Tyr Asn Glu Gly Arg
225 230 235 240
Phe Met Phe Met Gln His Lys Pro Leu Ala Ala Asp Gln Ser Tyr Phe
245 250 255
Thr Leu Glu Thr Ala Asp Tyr Phe Lys Ile Tyr Pro Thr Tyr Asp Glu
260 265 270
His Asp Gly Arg Met Ala Asp Gln Lys Gln Ser Gly Leu Ile Leu Cys
275 280 285
Thr Lys Asp Glu Val Leu Ala Glu Gln Thr Ile Phe Lys Leu Asp Ala
290 295 300
Pro Asp Asp Lys Thr Val His Leu Leu Asp Arg Asp Asp Asp His Val
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Val Ala Arg Phe Thr Lys Val Phe Ile Glu Asp Val Ala Pro Gly His
325 330 335
His Ala Ala Gln Arg Ser Gly Gln Arg Ser Val Leu Asp Asp Leu Tyr
340 345 350
Ala Asn Thr Gln Val Ile Ser Ile Thr Ser Ala Ala Leu Lys Trp Val
355 360 365
Val Lys His Gly Val Ser Asp Gly Ile Val Asn Arg Lys Asn Val Lys
370 375 380
Val Cys Val Gly Phe Asp Pro Leu Tyr Thr Leu Ser Thr His Asn Gly
385 390 395 400
Ile Ser Leu Cys Ala Leu Leu Met Asp Glu Lys Leu Ser Val Leu Asn
405 410 415
Ser Ala Cys Arg Met Thr Leu Arg Ser Leu Met Lys Thr Gly Arg Asp
420 425 430
Ala Asp Ala His Arg Ala Phe Gln Arg Val Leu Ser Gln Gly Tyr Ala
435 440 445
Ser Leu Met Cys Tyr Tyr His Pro Ser Arg Lys Leu Ala Tyr Gly Glu
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Val Leu Leu Pro Glu Arg Ser Asn Asp Val Val Asp Gly Ile Lys Leu
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Gln Leu Asp Ala Ser Arg His Cys His Glu Cys Pro Val Leu Gln Gln
485 490 495
Lys Val Val Glu Leu Glu Lys Gln Ile Val Met Gln Lys Ser Ile Gln
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Ser Asp Pro Thr Pro Met Ala Leu Gln Pro Leu Leu Ser Gln Leu Arg
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Glu Leu Ser Ser Glu Val Thr Arg Leu Gln Met Glu Leu Ser Arg Ala
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Gln Ser Leu Asn Ala Gln Leu Glu Ala Asp Val Lys Ser Ala Gln Ser
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Cys Ser Leu Asp Met Tyr Leu Arg His His Thr Cys Ile Asn Gly His
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Ala Lys Glu Asp Glu Leu Leu Asp Ala Val Arg Val Ala Pro Asp Val
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Arg Arg Gln Ile Met Glu Arg Arg Ser Glu Val Arg Lys Gly Trp Cys
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Glu Arg Ile Ser Lys Glu Ala Ser Ala Glu Cys Gln Asn Val Ile Asp
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Arg Asp Ser Ala Glu Ser Tyr Glu Lys Gln Ile Ala Glu Leu Val Ser
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Val Ala Lys Asn Val Glu Leu Asp Thr Leu Asn Gln Arg Gln Ala Arg
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Ser Leu Arg Ile Thr Pro Ser Leu Leu Ser Val Thr Pro Thr Asp Ser
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Val Asp Gly Ala Ala Asp Leu Ile Asp Phe Ser Val Pro Thr Asp Glu
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Leu
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<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 19
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<210> 20
<211> 455
<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 20
Met Asp Pro Gln Leu Arg Glu Glu Val Val Arg Leu Ile Ile Ala Leu
1 5 10 15
Thr Ser Asp Asn Gly Ala Val Leu Ser Lys Glu Leu Gly Ser Arg Val
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Thr Ala Leu Glu Lys Thr Ser Gln Ile His Ser Asp Thr Ile Leu Arg
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Ile Thr Gln Gly Leu Glu Asp Ala Asn Lys Arg Ile Ser Ala Leu Glu
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Gln Ser Arg Asp Gly Leu Val Ala Ser Val Ser Asp Ala Gln Leu Ala
65 70 75 80
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Ala Val Gly Val Leu Gln Thr Thr Val Asn
85 90 95
Gly Leu Asp Ser Ser Val Thr Gln Leu Gly Gly Arg Val Gly Gln Leu
100 105 110
Glu Thr Gly Phe Ala Gly Leu Arg Asn Asp Tyr Ser Ser Leu Ser Thr
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Ala Thr Leu Thr Leu Arg Val Thr Ser Ile Gln Ser Asp Phe Glu Ser
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Arg Val Ser Thr Leu Glu Arg Thr Ala Val Thr Ser Ala Ala Ala Pro
165 170 175
Leu Ala Ile Asn Asn Asn Arg Met Thr Met Gly Leu Asn Asp Gly Leu
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Thr Leu Ser Gly Asn Asn Leu Ala Ile Arg Leu Pro Gly Asn Thr Gly
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Leu Ser Ile Gln Asn Gly Gly Leu Gln Phe Arg Phe Asn Thr Asn Gln
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Phe Gln Ile Val Asn Asn Arg Leu Thr Leu Lys Thr Thr Val Phe Asp
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Pro Leu Asn Ser Arg Val Ser Thr Ile Glu Gln Ser Tyr Val Ala Ser
245 250 255
Ala Val Ala Pro Leu Arg Leu Asp Gly Ser Thr Lys Val Leu Asp Met
260 265 270
Leu Ile Asp Ser Ser Thr Leu Glu Ile Asn Ala Asn Gly Gln Leu Ala
275 280 285
Val Lys Ser Thr Ser Pro Asn Leu Arg Tyr Pro Ile Ala Asp Ile Ser
290 295 300
Gly Ser Ile Gly Met Ser Pro Asn Tyr Arg Phe Arg Arg Ser Met Trp
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Ile Gly Leu Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Gly Leu Ser Trp Arg Ile Gln
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Val Asn Ser Asp Val Phe Ile Val Asp Asp Tyr Ile His Ile Cys Leu
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Pro Ala Phe Asn Gly Phe Thr Ile Ala Asp Gly Gly Asp Leu Ser Leu
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Gly Gly Met Ile Thr His Ser Asn Ser Lys Trp Pro Ala Ile Thr Val
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Ser Tyr Pro Arg Ser Phe Thr
450 455
<210> 21
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<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 21
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<400> 22
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Gln Ser Val Pro Ile Asn Asp Glu Leu Ser Ser His Leu Leu Arg Ala
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Val Gly Val Ile His Gln Gln Asn Thr Tyr Arg Thr Phe Tyr Phe Gln
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Cys Asn Arg Arg Gly Asp Ala Ala Glu Val Trp Ile Leu Ser Cys Ser
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Gly Arg Ala Gly Asn Gln Leu His Gly Phe Gln Val Arg Arg Met Val
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<212> DNA
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<400> 23
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Met Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ala Ile Ser Lys Ile Lys Arg Asp Asp
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Cys Ser Tyr Phe Lys Val Asp His Ala Asp Gly Leu Lys Tyr Ile Pro
115 120 125
Met Asp Glu Arg Tyr Ser Pro Ser Ser Leu Ala Arg Leu Phe Thr Met
130 135 140
Gly Met Ala Gly Leu His Ile Thr Thr Glu Pro Ser Tyr Lys Arg Val
145 150 155 160
Pro Ile Met His Leu Ala Ala Asp Leu Asp Cys Met Thr Leu Ala Leu
165 170 175
Pro Tyr Met Ile Thr Leu Asp Gly Asp Thr Val Val Pro Val Ala Pro
180 185 190
Thr Leu Ser Ala Glu Gln Leu Leu Asp Asp Gly Leu Lys Gly Leu Ala
195 200 205
Cys Met Asp Ile Ser Tyr Gly Cys Glu Val Asp Ala Asn Asn Arg Ser
210 215 220
Ala Gly Asp Gln Ser Met Asp Ser Ser Arg Cys Ile Asn Glu Leu Tyr
225 230 235 240
Cys Glu Glu Thr Ala Glu Ala Ile Cys Val Leu Lys Thr Cys Leu Val
245 250 255
Leu Asn Cys Met Gln Phe Lys Leu Glu Met Asp Asp Leu Ala His Asn
260 265 270
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275 280 285
Val Phe Arg Met Ala Ser Ala Phe Ala Thr Ile Asp Ala Gln Cys Phe
290 295 300
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Glu Thr Met Arg Leu Trp Thr Arg Ser Ala Leu Asp Asp Ser Val Ala
325 330 335
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340 345 350
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<211> 1196
<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
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aaggatggga taagacaatc tcagctcagc ctgatatgat ggtgtgtggt agcgctgttg 180
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tgaacgatgt gacacctgag gagcttgaaa gagtgagaac tgatggtggc atcttggctg 420
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<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 26
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1 5 10 15
Asn Ala Phe Glu Gly Arg Val Ser Ile Tyr Ser Ala Gln Gln Gly Trp
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Val Val Cys Met His Cys Leu Gly Val Val Gly Ser Leu Gln Arg Lys
50 55 60
Leu Asn His Leu Pro His His Lys Cys Asn Gln Gln Leu Arg Glu Gln
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Asp Tyr Val Asp Leu Gln Phe Ala Asp Arg Val Thr Ala His Trp Lys
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Arg Gly Met Leu Ser Phe Val Ser Gln Met His Ala Ile Met Asn Asp
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Val Thr Pro Glu Glu Leu Glu Arg Val Arg Thr Asp Gly Gly Ile Leu
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130 135 140
Ile His Ser Asn Trp Thr Asp Pro Leu Gln Val Val Glu Asp Leu Asp
145 150 155 160
Thr Gln Leu Asp Arg Tyr Trp Thr Ala Leu Asn Leu Met Ile Asp Ser
165 170 175
Ser Asp Leu Val Pro Asn Phe Met Met Arg Asp Pro Ser His Ala Phe
180 185 190
Asn Gly Val Lys Leu Glu Gly Glu Ala Arg Gln Thr Gln Phe Pro Arg
195 200 205
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Tyr Ser Glu Leu Glu Gly Asp Ser Gln Lys Gly Arg Ser Tyr Arg Arg
225 230 235 240
Glu Ile Val Thr Pro Ala Lys Asp Phe Gly His Phe Gly Leu Ser His
245 250 255
Tyr Ser Arg Ala Thr Thr Pro Ile Leu Gly Lys Met Pro Ala Val Phe
260 265 270
Ser Gly Met Leu Thr Gly Asn Cys Lys Met Tyr Pro Phe Ile Lys Gly
275 280 285
Thr Ala Lys Leu Lys Thr Val Lys Lys Leu Val Asp Ala Val Asn Tyr
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<210> 27
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<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 27
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gcaatgcttc ccatcccccc aactatatat accaaaccat ctcacgattc atattattac 240
atagatgctc taaaccgcgt acgtcgtaaa acatatcagg gccctgatga cgtgtacgta 300
cctaattgtt ccatcgttga attgctagag ccgcatgaga ctctgacatc ttatgggcgt 360
ttgtctgaag cgattgagaa tcgtgccaag gatggagaca gccaagccag aattgcgaca 420
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gtgttggcac tattggtgtc cgaagcgggg ggttctctat atgacccagt tttgcagaag 540
tatgatgaga ttccagatct atcgcataat tgccctttat ggtgttttag agaaatctgt 600
cgtcacatat ctggtccatt accagatcga gcaccttatc tttacttatc ggcaggggtt 660
ttctggttaa tgtcaccacg gatgacgtct gcgatccctc cgttattatc tgatcttgtt 720
aatttagcta tcttacaaca gactgcgggt ttagatccat cattagtgaa actgggagtg 780
cagatatgcc ttcacgcggc agctagctca agttatgcat ggtttatcct aaagactaag 840
tctatttttc ctcaaaacac gttacatagt atgtatgagt ctctagaagg agggtactgt 900
cctaacctag aatggttaga gcctagatcg gactataaat ttatgtacat gggagtcatg 960
ccattgtcca ctaaatatgc taggtcggca ccatccaacg aaaagaaagc gcgggaactt 1020
ggtgagaaat atggattgag ttcagttgtc agtgagcttc gtaaacggac aatggcttat 1080
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tacaaacgtg gattttcata tagagtgaac gactcttttt ctccaggcaa cgattttact 2040
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<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 33
gctcttcgcg gtcatggctt acatcgcagt tcctgcggtg gtggattcac gttcgagtga 60
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atatcaagat catgactatg tgttggatca gttacagtat atgttagatg ggtatgaggc 180
tggtgacgtc atcgatgcac tcgtccacaa gaattggtta catcattctg tctattgctt 240
gttgccaccc aaaagtcaac tactagagta ttggaaaagt aacccttcag cgataccgga 300
caacgttgat cgtcggcttc gtaaacggct aatgctaaag aaagatctca gaaaagatga 360
tgagtacaat caattggcgc gtgctttcaa gatatcggat gtctacgcac cactcatctc 420
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atcaactcta tcatttacta tgactaagtg catcattccg tttggcaaag aggtgggccg 600
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catgataaac agaaagcgtt tgcgtgttca tactccatca gatcgtcgag ccgcgcaact 840
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cgacgtcatg cctgacacat acgacttcat taaacccatt ggtgctgtgc tgcctaaggg 1260
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cgcaaattac tttggtcatt tactgcgact aaaaatacca tatattacag aggttaattt 1680
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<210> 34
<211> 736
<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 34
Met Ala Tyr Ile Ala Val Pro Ala Val Val Asp Ser Arg Ser Ser Glu
1 5 10 15
Ala Ile Gly Leu Leu Glu Ser Phe Gly Val Asp Ala Gly Ala Asp Val
20 25 30
Asn Asp Val Ser Tyr Gln Asp His Asp Tyr Val Leu Asp Gln Leu Gln
35 40 45
Tyr Met Leu Asp Gly Tyr Glu Ala Gly Asp Val Ile Asp Ala Leu Val
50 55 60
His Lys Asn Trp Leu His His Ser Val Tyr Cys Leu Leu Pro Pro Lys
65 70 75 80
Ser Gln Leu Leu Glu Tyr Trp Lys Ser Asn Pro Ser Ala Ile Pro Asp
85 90 95
Asn Val Asp Arg Arg Leu Arg Lys Arg Leu Met Leu Lys Lys Asp Leu
100 105 110
Arg Lys Asp Asp Glu Tyr Asn Gln Leu Ala Arg Ala Phe Lys Ile Ser
115 120 125
Asp Val Tyr Ala Pro Leu Ile Ser Ser Thr Thr Ser Pro Met Thr Met
130 135 140
Ile Gln Asn Leu Asn Gln Gly Glu Ile Val Tyr Thr Thr Thr Asp Arg
145 150 155 160
Val Ile Gly Ala Arg Ile Leu Leu Tyr Ala Pro Arg Lys Tyr Tyr Ala
165 170 175
Ser Thr Leu Ser Phe Thr Met Thr Lys Cys Ile Ile Pro Phe Gly Lys
180 185 190
Glu Val Gly Arg Ala Pro His Ser Arg Phe Asn Val Gly Thr Phe Pro
195 200 205
Ser Ile Ala Thr Pro Lys Cys Phe Val Met Ser Gly Val Asp Ile Glu
210 215 220
Ser Ile Pro Asn Glu Phe Ile Lys Leu Phe Tyr Gln Arg Val Lys Ser
225 230 235 240
Val His Ala Asn Ile Leu Asn Asp Ile Ser Pro Gln Ile Leu Ser Asp
245 250 255
Met Ile Asn Arg Lys Arg Leu Arg Val His Thr Pro Ser Asp Arg Arg
260 265 270
Ala Ala Gln Leu Met His Leu Pro Tyr His Val Lys Arg Gly Ala Ser
275 280 285
His Val Asp Val Tyr Lys Val Asp Val Val Asp Val Leu Phe Glu Val
290 295 300
Val Asp Val Ala Asp Gly Leu Arg Asn Val Ser Arg Lys Leu Thr Met
305 310 315 320
His Thr Val Pro Val Cys Ile Leu Glu Met Leu Gly Ile Glu Ile Ala
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Asp Tyr Cys Val Arg Arg Glu Asp Gly Met Phe Thr Asp Trp Phe Leu
340 345 350
Leu Leu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Thr Asp Arg Arg Thr Arg Cys
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Gln Tyr Leu Ile Asn Pro Ser Ser Val Pro Pro Asp Val Ile Leu Asn
370 375 380
Ile Ser Ile Thr Gly Phe Ile Asn Arg His Thr Ile Asp Val Met Pro
385 390 395 400
Asp Thr Tyr Asp Phe Ile Lys Pro Ile Gly Ala Val Leu Pro Lys Gly
405 410 415
Ser Phe Lys Ser Thr Ile Met Arg Val Leu Asp Ser Ile Ser Ile Leu
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Gly Val Gln Ile Met Pro Arg Thr His Val Val Asp Ser Asp Glu Val
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Gly Glu Gln Met Glu Pro Thr Phe Glu His Ala Val Met Glu Ile Tyr
450 455 460
Arg Gly Ile Ala Gly Val Asp Ser Leu Asp Asp Leu Ile Arg Trp Val
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Leu Asn Ser Asp Leu Ile Pro Tyr Asp Asp Arg Leu Gly Gln Leu Phe
485 490 495
Gln Ala Phe Leu Pro Leu Ala Lys Asp Leu Leu Ala Pro Met Ala Arg
500 505 510
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515 520 525
His Ala Asp Ser Glu Leu Leu Asn Ala Asn Tyr Phe Gly His Leu Leu
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Asn Arg Glu Gly Gly Glu Leu Phe Gln Leu Val Leu Ser His Leu Tyr
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Lys Met Tyr Ala Thr Ser Ala Gln Pro Lys Trp Phe Gly Ser Leu Leu
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Arg Leu Leu Ile Cys Pro Trp Leu His Met Glu Lys Leu Ile Gly Glu
595 600 605
Ala Asp Pro Ala Ser Thr Ser Ala Glu Ile Gly Trp Tyr Ile Ser Arg
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Pro Tyr Ile Ser Ile Arg Ala Pro Lys Leu Val Ile Glu Glu Leu Met
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Glu Lys Asn Trp Gly Gln Tyr His Ala Gln Val Ile Ile Thr Asp Arg
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<212> DNA
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 35
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<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 36
Met Gly Asn Ala Ser Ser Ile Val Gln Thr Ile Asn Val Thr Gly Asp
1 5 10 15
Gly Asn Val Phe Lys Pro Ser Ala Glu Thr Ser Ser Thr Ala Val Pro
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Ala Lys Arg Asn Gly Gly Ile Gln Trp Met Asp Val Ser Glu Gly Thr
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Ser Ala Ser Ser Pro Pro Leu Glu Glu Lys Ser Lys Leu Thr Glu Gln
275 280 285
Ala Met Asp Leu Val Thr Ala Ala Glu Pro Glu Ile Val Ala Ser Leu
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Tyr Asn Val Arg Thr Leu Lys Ile Asp Glu Ala Thr Trp Leu Arg Met
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Asn Tyr Tyr Leu Leu Ala Thr Phe Ile Asp Ser Ala Ala Ile Thr Pro
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<213> 正呼肠孤病毒
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<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 38
Met Ala Ser Phe Lys Gly Phe Ser Ala Asn Thr Val Pro Val Ser Lys
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Ala Lys Arg Asp Ile Ser Ser Leu Ala Ala Thr Pro Gly Phe His Ser
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Asp Val Ile Val Ala Glu Ile Glu Arg Leu Ala Ser Thr Ser Val Ser
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Val Arg Thr Glu Glu Ala Lys Val Ala Asp Glu Glu Leu Met Leu Phe
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Gly Leu Asp His Arg Gly Pro Gln Gln Leu Asp Ile Ser Asp Ala Lys
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Gly Ile Thr Lys Ala Ala Asp Ile Gln Thr Thr His Asp Val His Leu
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545 550 555 560
Cys Ser Leu Asp Met Tyr Leu Arg His His Thr Cys Ile Asn Gly His
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Ala Lys Glu Asp Glu Leu Leu Asp Ala Val Arg Val Ala Pro Asp Val
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Arg Arg Gln Ile Met Glu Arg Arg Ser Glu Val Arg Lys Gly Trp Cys
595 600 605
Glu Arg Ile Ser Lys Glu Ala Ser Ala Glu Cys Gln Asn Val Ile Asp
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Asp Leu Thr Leu Met Asn Gly Lys Gln Ala Gln Glu Ile Arg Glu Leu
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Arg Asp Ser Ala Glu Ser Tyr Glu Lys Gln Ile Ala Glu Leu Val Ser
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Thr Ile Thr Gln Asn Gln Met Thr Tyr Gln Gln Glu Leu Gln Ala Leu
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Val Ala Lys Asn Val Glu Leu Asp Thr Leu Asn Gln Arg Gln Ala Arg
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Ser Leu Arg Ile Thr Pro Ser Leu Leu Ser Val Thr Pro Thr Asp Ser
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Val Asp Gly Ala Ala Asp Leu Ile Asp Phe Ser Val Pro Thr Asp Glu
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Leu
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<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
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<213> 正呼肠孤病毒
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Arg Val Leu Ser Val Ser Pro Lys Tyr Ser Asp Leu Leu Ile Tyr Val
130 135 140
Asp Cys Tyr Val Gly Val Ser Ala Arg Gln Ala Leu Asn Asn Phe Gln
145 150 155 160
Lys Gln Val Pro Val Ile Thr Pro Thr Arg Gln Thr Met Tyr Val Asp
165 170 175
Ser Ile Gln Ala Ala Leu Lys Ala Leu Glu Lys Trp Glu Ile Asp Leu
180 185 190
Arg Val Ala Gln Thr Leu Leu Pro Thr Asn Val Pro Ile Gly Glu Val
195 200 205
Ser Cys Pro Met Gln Ser Val Val Lys Leu Leu Asp Asp Gln Leu Pro
210 215 220
Asp Asp Ser Leu Ile Arg Arg Tyr Pro Lys Glu Ala Ala Val Ala Leu
225 230 235 240
Ala Lys Arg Asn Gly Gly Ile Gln Trp Met Asp Val Ser Glu Gly Thr
245 250 255
Val Met Asn Glu Ala Val Asn Ala Val Ala Ala Ser Ala Leu Ala Pro
260 265 270
Ser Ala Ser Ala Pro Pro Leu Glu Glu Lys Ser Lys Leu Thr Glu Gln
275 280 285
Ala Met Asp Leu Val Thr Ala Ala Glu Pro Glu Ile Ile Ala Ser Leu
290 295 300
Ala Pro Val Pro Ala Pro Val Phe Ala Ile Pro Pro Lys Pro Ala Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Val Arg Thr Leu Arg Ile Asp Glu Ala Thr Trp Leu Arg Met
325 330 335
Ile Pro Lys Ser Met Asn Thr Pro Phe Gln Ile Gln Val Thr Asp Asn
340 345 350
Thr Gly Thr Asn Trp His Leu Asn Leu Arg Gly Gly Thr Arg Val Val
355 360 365
Asn Leu Asp Gln Ile Ala Pro Met Arg Phe Val Leu Asp Leu Gly Gly
370 375 380
Lys Ser Tyr Lys Glu Thr Ser Trp Asp Pro Asn Gly Lys Lys Val Gly
385 390 395 400
Phe Ile Val Phe Gln Ser Lys Ile Pro Phe Glu Leu Trp Thr Ala Ala
405 410 415
Ser Gln Ile Gly Gln Ala Thr Val Val Asn Tyr Val Gln Leu Tyr Ala
420 425 430
Glu Asp Ser Ser Phe Thr Arg Val Met Ser Ile Ile Ala Thr Thr Ser
435 440 445
Leu Ala Tyr Asn Tyr Glu Pro Glu Gln Leu Asn Lys Thr Asp Pro Glu
450 455 460
Met Asn Tyr Tyr Leu Leu Ala Thr Phe Ile Asp Ser Ala Ala Ile Thr
465 470 475 480
Pro Thr Asn Met Thr Gln Pro Asp Val Trp Asp Ala Leu Leu Thr Met
485 490 495
Ser Pro Leu Ser Ala Gly Glu Val Thr Val Lys Gly Ala Val Val Ser
500 505 510
Glu Val Val Pro Ala Asp Leu Ile Gly Ser Tyr Thr Pro Glu Ser Leu
515 520 525
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530 535 540
Ser Lys Ile Ala Glu Ala Ile Lys Ile Asp Asp Asp Ala Gly Pro Asp
545 550 555 560
Glu Tyr Ser Pro Asn Ser Val Pro Ile Gln Gly Gln Leu Ala Ile Ser
565 570 575
Gln Leu Glu Thr Gly Tyr Gly Val Arg Ile Phe Asn Pro Lys Gly Ile
580 585 590
Leu Ser Lys Ile Ala Ser Arg Ala Met Gln Ala Phe Ile Gly Asp Pro
595 600 605
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610 615 620
Trp Ile Ala Leu Ala Gln Gly Val Lys Thr Ser Leu Arg Thr Lys Ser
625 630 635 640
Leu Ser Ala Gly Val Lys Thr Ala Val Ser Lys Leu Ser Ser Ser Glu
645 650 655
Ser Ile Gln Asn Trp Thr Gln Gly Phe Leu Asp Lys Val Ser Ala His
660 665 670
Phe Pro Ala Pro Lys Pro Asp Cys Pro Thr Ser Gly Asp Ser Gly Glu
675 680 685
Ser Ser Asn Arg Arg Val Lys Arg Asp Ser Tyr Ala Gly Val Val Lys
690 695 700
Arg Gly Tyr Thr Arg
705
<210> 49
<211> 736
<212> PRT
<213> 正呼肠孤病毒
<400> 49
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1 5 10 15
Ala Ile Gly Leu Leu Glu Ser Phe Gly Val Asp Ala Gly Ala Asp Ala
20 25 30
Asn Asp Val Ser Tyr Gln Asp His Asp Tyr Val Leu Asp Gln Leu Gln
35 40 45
Tyr Met Leu Asp Gly Tyr Glu Ala Gly Asp Val Ile Asp Ala Leu Val
50 55 60
His Lys Asn Trp Leu His His Ser Val Tyr Cys Leu Leu Pro Pro Lys
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Arg Lys Asp Asp Glu Tyr Asn Gln Leu Val Arg Ala Phe Lys Ile Ser
115 120 125
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130 135 140
Ile Gln Asn Leu Asn Gln Gly Glu Ile Val Tyr Thr Thr Thr Asp Arg
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Val Ile Gly Ala Arg Ile Leu Leu Tyr Ala Pro Arg Lys Tyr Tyr Ala
165 170 175
Ser Thr Leu Ser Phe Thr Met Thr Lys Cys Ile Ile Pro Phe Gly Lys
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195 200 205
Ser Ile Ala Thr Pro Lys Cys Phe Val Met Ser Gly Val Asp Ile Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Val His Ala Asn Ile Leu Asn Asp Ile Ser Pro Gln Ile Val Ser Asp
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705 710 715 720
Arg Gly Ala Ala Tyr Ser Ala Arg Leu Ala Phe Arg Ser Asp Leu Ala
725 730 735

Claims (25)

1.一种赋予对POV3-VT的免疫性的疫苗，其包含免疫原性数量的一种或多种类型特异性POV3-VT蛋白或其免疫原性部分。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述类型特异性POV3-VT蛋白选自由σ1、σ1s、μ1和μ2蛋白以及其免疫原性部分组成的组。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述一种或多种类型特异性POV3-VT蛋白或其免疫原性部分处于减毒活病毒疫苗中。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述一种或多种类型特异性POV3-VT蛋白或其免疫原性部分存在于灭活病毒疫苗中。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述一种或多种类型特异性POV3-VT蛋白或其免疫原性部分存在于亚单位疫苗中。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述一种或多种类型特异性POV3-VT蛋白或其免疫原性部分是在细菌或杆状病毒表达系统中生产的。
7.一种赋予对POV3-VT的免疫性的疫苗，其包含MRV3σ1蛋白或其免疫原性多肽部分，其中所述MRV3σ1蛋白与SEQ ID NO：20的氨基酸残基1到455具有至少92％的同一性。
8.一种减毒的POV3-VT活病毒疫苗，其中所述疫苗是通过POV3-VT病毒在非猪宿主中传代直到传代的病毒在接种给猪时能赋予免疫性而不引起流行性腹泻而开发的。
9.一种使猪对POV3-VT病毒感染免疫的方法，其包括向所述猪施用免疫有效量的根据权利要求1-8中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗组合物包含有效量的至少一种类型特异性POV3-VT抗原。
10.一种检测动物的POV3-VT病毒感染的方法，其包括提供来自所述动物的样品，以及检测所述样品中特异性结合至多肽的抗体的存在或缺乏，所述多肽包含POV3-VTtσ1蛋白、或其免疫原性多肽部分(SEQ ID NO：20)，其中检测所述样品中特异性结合所述多肽的抗体的存在或缺乏包括，使用能够检测抗体与蛋白的特异性结合的基于抗体的技术，所述样品中的抗体与所述多肽的特异性结合的检测检测到所述动物被POV3-VT病毒感染。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述能够检测抗体与蛋白的特异性结合的基于抗体的技术包括选自由以下组成的组的技术：免疫组织化学分析、放射免疫分析、酶联免疫吸附分析ELISA、夹心免疫分析、免疫辐射计量分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫分析、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集分析、补体结合分析、免疫荧光分析、蛋白A分析和免疫电泳分析。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述凝集分析包括血细胞凝集抑制分析。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述能够检测抗体与蛋白的特异性结合的基于抗体的技术包括酶联免疫吸附分析ELISA。
14.一种检测生物样品中的POV3-VT的方法，其包括：在适合于聚合酶链式反应的条件下，使用与POV3-VT的S1片段内的区域同源的正向和反向引物扩增POV3-VT S1片段核苷酸序列来产生扩增产物；并测量所述扩增产物来检测所述生物样品中的POV3-VT。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述正向S1引物是具有序列5'-CAC TCT GATACA ATC CTT AGG ATC ACT CAA GG 3'(SEQ ID NO：3)的分离的核苷酸。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述反向S1引物是具有序列5'-CCA TCG TCATAC GAT TGT TAT TGA TTG CCA 3'(SEQ ID NO：4)的分离的核苷酸。
17.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括在适合于聚合酶链式反应的条件下扩增POV3-VT的L1片段；并测量所述扩增产物来检测所述生物样品中的POV3-VT。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述正向L1引物是具有序列5'-CTA TAC TAGCTG ACA CTT CGA TGG GAT TGC 3'(SEQ ID NO：5)的分离的核苷酸。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述反向L1引物是具有序列5'-CGT CTC ATCCAT TTC TGC CAG CTC TT 3'(SEQ ID NO：5)的分离的核苷酸。
20.一种检测生物样品中的POV3-VT的方法，其包括：通过在适合于聚合酶链式反应的条件下扩增多个靶标产生扩增产物，所述靶标包括：POV3-VT S1片段和选自由S2、S3、S4、L1、L2、L3、M1、M2和M3片段组成的组的至少一个其他的POV3-VT片段，每个扩增使用与POV3-VT的每个相应片段内的区域同源的正向和反向引物；并检测所述扩增产物来检测所述生物样品中的POV3-VT。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述生物样品是饲料补充剂。
22.一种用于检测POV3-VT病毒核酸的探针，其中所述探针包含与SEQ ID NO：19具有至少98％的序列同源性的核苷酸序列和标签。
23.根据权利要求22所述的探针，其中所述探针是被放射性标记的、荧光标记的、生物素标记的、酶学标记的、或化学标记的。
24.一种检测样品中的POV3-VT核酸的方法，其包括：用根据权利要求22所述的探针接触所述样品；检测所述POV3-VT病毒核酸与所述探针之间的杂交；以及当检测到所述POV3-VT核酸与所述探针之间的杂交时，确定所述POV3-VT病毒核酸存在于所述样品中。
25.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括通过聚合酶链式反应PCR、实时PCR、逆转录酶-聚合酶链式反应RT-PCR、实时逆转录酶-聚合酶链式反应rt RT-PCR、连接酶链式反应、或转录介导的扩增TMA来扩增所述POV3-VT病毒核酸。
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