本发明涉及一种用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗,其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒。在本发明的一个实施方案中,这种标记疫苗的特征在于,编码TAV-表位的病毒核苷酸序列和/或TAV-表位的氨基酸序列包含与疾病相关性猪瘟病毒不同的序列,从而可以通过血清学和/或基因组分析方法,将显示疾病相关性猪瘟病毒感染的受试者与用本发明标记疫苗接种的受试者区分。
发明简述
鉴于现有技术,作为本发明基础的技术问题是为家养猪和野生猪提供一种标记疫苗,所述标记疫苗提供免遭经典猪瘟病毒影响的保护,能够区分接种动物和感染动物,优选地通过常规技术产生。在一个优选实施方案中,这种标记疫苗不通过重组基因修饰技术产生。
这个问题由独立权利要求的特征解决。本发明的优选实施方案由从属权利要求提供。
本发明因此涉及一种用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗,其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒。
在一个优选实施方案中,本发明还涉及一种用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗,其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒,特征在于E2蛋白的TAV-表位的病毒氨基酸序列包含与野生型经典猪瘟病毒不同的序列,
由此所述病毒氨基酸序列显示以下置换的至少一种:
-氨基酸830置换为缬氨酸,
-氨基酸833置换为丝氨酸,
-氨基酸839置换为甘氨酸。
在一个优选实施方案中,本发明的标记疫苗的特征在于修饰的病毒不显示重组的核苷酸序列。
在一个优选实施方案中,本发明的标记疫苗的特征在于病毒的核苷酸序列显示一种或多种以下置换:
-在核苷酸位置2862处置换为T,
-在核苷酸位置2870处置换为T,
-在核苷酸位置2889处置换为G。
在一个优选实施方案中,本发明的标记疫苗的特征在于病毒的氨基酸序列显示一种或多种以下置换:
-在蛋白质ERNS中氨基酸426置换为缬氨酸,
-在蛋白质E1中氨基酸576置换为组氨酸,
-在蛋白质E1中氨基酸583置换为谷氨酸,
-在蛋白质E2中氨基酸951置换;为异亮氨酸。
在一个优选实施方案中,本发明的标记疫苗的特征在于病毒的核苷酸序列显示一种或多种以下置换:
-在核苷酸位置1649处置换为G,
-在核苷酸位置2099处置换为C,
-在核苷酸位置2122处置换为G,
-在核苷酸位置3225处置换为T。
在一个优选实施方案中,本发明的标记疫苗的特征在于TAV-表位的病毒氨基酸序列包含根据SEQIDNO.3或SEQIDNO.4的序列。
在一个优选实施方案中,本发明的标记疫苗的特征在于病毒的核苷酸序列包含根据SEQIDNO.1的序列。
在另一个实施方案中,本发明的标记疫苗的特征在于,用如本文所述的疫苗治疗的受试者与被疾病相关性猪瘟病毒感染受试者,可以通过使用血清学和/或基因组分析方法分析从所述受试者获得的生物学样品来将区分。
在另一个实施方案中,本发明的标记疫苗的特征在于基因组分析方法基于聚合酶链反应(PCR)、优选地基于实时PCR,由此使用识别修饰的和/或疾病相关的病毒核苷酸序列的引物和/或探针。
在另一个实施方案中,本发明的标记疫苗的特征在于血清学分析方法基于酶免疫测定(EIA)、优选地基于酶联免疫吸附测定(ELISA),由此使用与修饰的和/或疾病相关的TAV-表位特异性结合的抗体。
本发明的又一个方面涉及一种标记疫苗,优选地如本文所述的标记疫苗,其可通过施加抗体压力而生成疾病相关性或其他已知的猪瘟病毒株的病毒逃逸突变体来获得。
本发明的又一个方面涉及一种制造修饰的减毒活经典猪瘟病毒疫苗株、优选地如本文所述的疫苗株的方法,所述方法包括通过施加抗体压力而生成疾病相关性或其他已知的猪瘟病毒株的逃逸突变体。
在一个优选实施方案中,如本文所述的制造方法特征在于所述方法包括:
-在细胞培养下多次传代被疾病相关性猪瘟病毒感染的细胞,优选仔猪胚肾细胞,和
-同时施加针对疾病相关性猪瘟病毒E2蛋白的TAV-表位的抗体和/或CTAVSPTTLRTEVVK-肽免疫的兔的多克隆血清。
本发明还涉及一种药物组合物,其包含如本文所述的标记疫苗连同可药用载体。
本发明的又一个方面涉及如本文所述的标记疫苗,作为药物用于经典猪瘟的预防性治疗(接种)中,优选地通过肌内注射或口服施加。
本发明的又一个方面涉及一种用于预防性治疗(接种)经典猪瘟的方法,所述方法包括将如本文所述的标记疫苗施用至、优选地通过肌内注射或口服施加至受试者,优选地是猪。
经典猪瘟需要接种疫苗的另一个常见情况对应于在猪群中检测野毒感染。当猪的感染发生,以至于经典猪瘟病毒在野生猪或家养猪中存在时,需要对周围和/或相邻猪群紧急接种。随后在周围区域内对直至1岁至2岁全部猪(无论野生或家养)实施接种,目的是避免猪瘟病毒的暴发或大规模感染。本发明的标记疫苗理想地适用于猪瘟检测或暴发情况下的紧急接种。除注射之外,这种标记疫苗还便于通过口服途径快速和有效施用,并且允许区分被野毒(发热相关性)和疫苗感染的动物。
发明详述
本发明疫苗的开发不基于基因修饰方法,反而基于以下原理:当置于选择性抗体压力下之时,病毒将以适应性方式自我修饰。本发明因此涉及非基因修饰的活疫苗,所述活疫苗提供对抗强毒CSFV的保护,显示全部标记疫苗的要求(血清学上和遗传上不同)。这种标记疫苗是通过施加选择性抗体压力至细胞培养下的不同C-株进行工程化制造。产生的变体优选地拥有在E2TAV表位中的3个氨基酸交换和在E1蛋白中的两个补偿性交换。这些变体的稳定性通过在转瓶中多于10次细胞培养传代而得到证明,并且例如,肌内接种猪导致针对高度毒力的攻毒株的完全保护。另外,通过血清学和/或遗传技术,例如通过区分性免疫荧光染色和实时逆转录聚合酶链反应(rRT-PCR)系统,能够进行直接DIVA(differentiatinginfectedfromvaccinatedanimal,区分免疫和感染动物)。另外,通过优化商业E2-ELISA(例如通过改变临界值)或开发TAV特异性肽ELISA系统,间接DIVA可能是可实现的。因此,提出了一种针对CSFV的非基因修饰的活的标记疫苗。
本发明疫苗的产生如下进行。
通过将C-株病毒在细胞培养系统(IFN仔猪胚肾细胞)中施加E2-TAV特异性抗体和CTAVSPTTLRTEVVK-肽免疫的兔的多克隆血清期间传代,选择天然存在的C-株“Riems”逃逸突变体。
除肽处理的多克隆兔血清中所含有的抗体之外还施加的抗体特异性识别CSF病毒E2蛋白中的TAV-表位,并且通过与这个表位结合而中和CSF(C-株)病毒。CSFV因其RNA本质而显示高突变率。在提供中和抗体的选择性压力下,选出在与抗体结合的表位(在此情况下,TAV-表位)发生突变的病毒,由此未改变的野生型病毒被中和。通过在多种的抗体和兔血清的浓度以及混合物下多次传代,可以选出多个突变的病毒分离株。
首先选出带有TAV-表位中置换的病毒。通过在多种类型的抗体压力下这些病毒的进一步传代,选出一种分离株,其显示在TAV-表位中的2个置换和E1蛋白中的单个补偿性置换(E1和E2之间的相互作用对于病毒结构是重要的)。将这些病毒置于其他抗体压力下,这导致分离出除E1蛋白中的两个补偿性置换还在TAV-表位中带有3个置换的病毒。所得到的病毒(C-株“Riems”Q7、C-株“Riems”S10和C-株“Riems”O11)还显示在E2蛋白中位置2862、2870和2889、3225处的置换,此外还有在ERNS蛋白中位置1649处的置换,还有在E1蛋白位置2099和2122处的变化。
表1:TAV逃逸突变体的进一步信息
核苷酸序列中的变化使得实时RT-PCR系统能够进行,其可以区分变体(Q7、S10、O11)和野外分离株。
氨基酸序列中的变化使得能够基于抗体结合来区分变体(Q7、S10、O11)和野外分离株,由此用于中和(A18抗体)的抗体不再与这些变体结合,但是确实结合全部野外分离株,原因在于CSFV中高度保守的TAV表位。针对修饰的TAV肽序列(显示本发明的突变)而产生的抗体也可以用于区分感染性病毒和疫苗,由此针对这些变体的抗体将结合本发明的修饰的病毒疫苗并且提供接种动物的阳性鉴定,但是将不结合野外分离株。
表2:本发明的序列:
本发明涉及一种修饰的猪瘟病毒,它可以包含本文中公开的突变和置换的任何或全部可能的组合。本文提供的实施例和实验支持表明,产生了仅显示表1中所列全部置换的子集的毒株。除能够用作标记之外,这些毒株还显示保护性效果,因此满足本发明的目的。本发明的优选毒株涉及包含所公开的置换的子集的毒株,还有显示全部所公开的置换的那些毒株。
完全令人惊讶的是,一种或多种特定基因修饰(因抗体压力源自天然过程)的组合将导致如本文所述的标记疫苗的有益特性。现有技术揭示一些相似的修饰,但是已知本领域从未提示,本发明中修饰的特定残基将提供特别有效的免遭CSFV感染的保护。它们的独特组合导致所述的一组特性,这些特性使得本发明能够充当能区分感染动物和接种动物的疫苗。
如本申请通过抗体处理所施加的这类选择性压力将导致本文所述的精确修饰,这是以往不知道的。如本文所述的基因修饰的组合一起发挥作用,提供维持蛋白结构的补偿性突变的协同效应,同时允许TAV残基突变并且因此提供本发明任务所需要的标记特征。
术语“基因工程”涉及生物基因组的基因修饰或操作,例如通过将外来核酸物质,如DNA或RNA,或合成性核酸序列导入宿主基因组中。这项技术也称作重组DNA技术。
术语“减毒病毒”指病毒,它已经以任何方式受到修饰以致这种病毒与野生型(疾病相关性)病毒相比损害性更小和/或毒力更小。例如,与野生型病毒相比,较少的疾病相关性症状在减毒病毒感染的受试者中出现。
就本发明而言,术语“抗体压力”或“选择性抗体压力”涉及在细胞培养期间、优选地在多次传代期间施加针对病毒的一个或多个特异性表位的抗体。这类抗体可以是本领域已知的任何种类的抗体,无论是单克隆或多克隆的,或可以包含于用目的肽(例如靶表位)处理过的动物的血清中。这类抗体经常称作中和抗体。在提供中和抗体的选择性压力下,与抗体结合的表位(在此情况下,TAV-表位)中经历突变的病毒由于生长优势而被选出,这是因为抗体不再与所述表位结合并因此不再提供限制或中和作用,由此未改变的野生型病毒被抗体中和并且随后在培养中选择性地处于劣势。
与抗体结合的表位(在此情况下,TAV-表位)中经历突变的那些病毒常称作逃逸突变体。这些变体是本发明的主题,并且在遗传上和血清学上不同于野生型病毒。
术语“多次传代”指经过许多次传代(也称作继代培养或分割细胞)的细胞培养操作,由此将少数细胞转移至新容器,优选地含有新鲜的培养基,或通过多次将细胞培养物稀释入新的培养基,从而允许细胞培养物在没有培养时高细胞密度相关影响的情况下继续生长。
根据这种标记疫苗,本发明也可以涉及由一个发明构思关联起来的一组联合发明(unifiedgroupofinventions)。这种标记疫苗、病毒本身及其药物组合物、它们在治疗动物用于接种方面的用途和用于产生病毒的方法均属于本发明的基本构思。本文所述的有新颖性和创造性的标记疫苗能够实现和联合本发明的全部方面,从而本文所述的多种实施方案落在单个统一的发明范围内。
在本申请中提供核苷酸序列的情况下,序列表意在包括相应的RNA序列和DNA序列。虽然一些核苷酸序列作为DNA序列提供,但是本发明意在包括相应的RNA序列(例如其中病毒基因组显示RNA分子)。本发明的核苷酸序列也包括所列出的那些核苷酸序列的互补序列,例如能通过Watson-Crick碱基配对作用与所列序列结合的互补序列。关于相应的互补RNA和/或DNA序列,不需要创造性努力就能将一种转化成另一种并且在本领域技术人员能力范围内是容易做到的。
用于本发明的病毒疫苗、本发明组合物如药物组合物、免疫学组合物、抗原性组合物或疫苗组合物或治疗性组合物的施用方法可以通过肠胃外途径施用,如皮内、肌内或皮下施加方法。这种施用使全身性免疫应答或体液免疫应答或细胞介导免疫应答成为可能。本发明的疫苗也可以通过口服途径施用,如掺入动物饲料中,从而能够对大群体(例如,欧洲野猪)进行简单和有效的免疫。
优选的施加方法涉及皮下施加或肌内施加,优选地通过注射,和口服施加。
更一般地,本发明的病毒疫苗组合物或治疗性组合物可以根据药学或兽医领域技术人员熟知的标准技术制备。
可以考虑此类因素如具体受试者的年龄、性别、重量、物种和状况以及施用途径,按照医学或兽医领域技术人员熟知的剂量和技术施用治疗有效量的此类组合物。这些组合物可以单独施用,或可以共施用或随后连同组合物(例如,连同“其他”免疫性、抗原性或疫苗或治疗性组合物)一起施用,从而提供本发明的多价或“鸡尾酒式”或联合组合物和使用它们的方法。再次地,可以在考虑此类因素如年龄、性别、重量、物种和具体受试者的状况以及施用途径的同时来决定成分和施用方式(依次或共施用)以及剂量。
本发明组合物的实例包括用于孔洞(例如,口服、经鼻、肛门的、阴道、经口(peroral)、胃内施用等)施用的液体制品,如混悬剂、糖浆剂或酏剂;和用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如,注射施用)的制品,如无菌混悬剂或乳剂。
在此类组合物中,CSFV变体可以与可药用的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合。也可以冻干这些组合物。组合物可以含有辅助物质,如润湿或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶化或粘度增强添加物、防腐剂、矫味剂、色料等,这取决于施用途径和所需的制品。
实施例
实验设计和方法
使用TAV肽免疫兔
两只8-10周龄兔(耳标304和305)根据以下方案使用匙孔槭血蓝蛋白(KLH)缀合的CTAVSPTTLRTEVVK-肽进行免疫,以便产生中和C-株的多克隆血清。实施免疫,随后进行6次强化免疫,各自以大约单月间隔进行。
分离C-株“Riems”病毒的E2逃逸突变体
为了制造在C-株“Riems”病毒糖蛋白E2中引起突变的抗体压力,用针对E2蛋白的TAV-表位的多种抗体,使用多种浓度处理病毒。随后将感染的细胞孵育并且多次传代。在本发明实验中施加的抗体是单克隆E2特异性抗体,它们可商业用于E2特异性CSFVELISA检测。
抗体:
A18I(IDEXX)
A18B(Bommeli)
A18C(Ceditest)
HC34(CRL,Hannover)
WH303和WH211(Weybridge,英国)
根据以下实施病毒培养物的孵育。将多种浓度和多种混合的抗体随多种量的病毒施加。孵育在室温进行2-6小时。将病毒-抗体悬液供于具有汇合细胞生长的细胞培养平板并且随后孵育。在这段时间期间,使病毒在37°C吸附入细胞中(PK15-细胞)1-2小时。最后,添加细胞培养培养基并且将平板在37°C和5%COT孵育72小时。
在72小时后,将细胞培养上清液分别分离并贮存。将平板随后固定并且使用免疫荧光染色法和(对来自CSFV的NS3蛋白特异的)C16-抗体来染色。细胞培养上清液弱阳性孔随后在如上文所述的进一步抗体压力下传代。来自单个阳性细胞或单个染色细胞蚀斑的孔中的细胞培养上清液随后在非常弱的抗体压力下或在没有抗体压力下传代1-2个代次,目的是增加病毒滴度。选择多份细胞培养上清液以便在E1区和E2区中测序。
使用免疫荧光染色法,以用来产生逃逸突变体的C16抗体或A18抗体实施逃逸突变体病毒的控制。不再显示TAV-表位变化的病毒变体可以使用A18抗体染色。
传代史
表3:C-株“Riems”逃逸病毒的传代史
逃逸突变体B5/2、I16、Q7、S10和O11的表征
对分离的逃逸突变体在E1和E2蛋白区域内测序。使用抗体A18-idexx、A18-bommeli、A18-ceditest和C16抗体实施多种免疫荧光染色。除转瓶培养(Q7、S10、O11)之外,将逃逸突变体在两个细胞培养瓶中传代(全部)并且随后测序、差异性染色和滴定。
Q7特异性实时RT-PCR
为了检验病毒的遗传特征并且因此检验疫苗的标记特性之一,使用能够区分源自C-株“Riems”和CSFV野外分离株的逃逸突变体的引物和探针在用逃逸突变体免疫后实施病毒RNA的检测。
动物研究27/09—检验C-株Riems突变体B5/2-P6和I16-P2的免疫应答
在本发明动物研究中,3头仔猪各自通过肌内施加用2ml病毒悬液(细胞培养上清液)免疫。如下进行动物分组:组A(B5/2)、组B(I16)和对照组C-株Riems(Riemser猪瘟疫苗)。对每个组实施免疫应答的血清学检验。
动物研究06/10—检验逃逸突变体Q7、S10和O11
实施以下动物研究,目的是检验哪一种逃逸突变体在受体猪中就肌内施加后不存在危险效应和有效而言是最有前景的。
本研究中使用21头8-9周龄仔猪(大约15-20kg)。每头仔猪用2×105.0KID50/ml肌内免疫。
检验5个组:
组1(5头猪):C-株变体的突变体Q7-P7(105.0KID50/ml)
组2(5头猪):C-株变体的突变体S10-P8(105.0KID50/ml)
组3(5头猪):C-株变体的突变体O11-P8(105.0KID50/ml)
组4(3头猪):Riemser猪瘟疫苗(原始病毒)
组5(3头猪):未免疫的对照组
免疫和血液采样:
0dpv血液采样(EDTA和血清),免疫
7dpv血液采样(EDTA)
14dpv血液采样(EDTA和血清)
21dpv血液采样(EDTA和血清)
每日获得关于体温和临床症状的数据。
攻毒:
28dpv血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
攻毒-用高度毒力KSPV株Koslov(1×106.5KID50)感染
4dpi血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
7dpi血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
10dpi血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
14dpi血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
21dpi血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
28dpi血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
动物研究24/10—检验逃逸突变体S10和O11;口服免疫后的保护
为了检验口服施加的有效性,实施以下动物研究。使用15头仔猪作为试验动物,它们8-10周龄(大约15-20kg)。
组1(6头猪):突变体AC-株变体S10
组2(6头猪):突变体BC-株变体O11
组3(3头猪):感染性对照(未接种)
免疫和血液采样:
0dpv血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
14dpv血液采样
28dpv血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
4dpi.血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
7dpi.血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
10dpi血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
14dpi血液采样(EDTA和血清),鼻拭子
21dpi血液采样
28dpi血液采样
每日获得关于体温和临床症状的数据。
实验结果
用TAV-肽免疫兔
在第三次强化免疫处理后(在第一次免疫后大约12周),两种兔血清(304和305)在商业可获得的E2-ELISA试验中均为阳性。在病毒中和试验中,在第三次强化免疫后大约3周,两份血清检验呈阳性。中和试验中的滴度低并且在第4-第6次强化免疫后进一步降低。
表4:TAV-肽免疫后兔血清304和305的表征
分离C-株Riems病毒的E2逃逸突变体
仅几次传代后,C-株Riem与E2特异性抗体的孵育导致分离到E2区内位置2870处显示1个置换的逃逸突变体。对于分离其他变体,重要的是在E1蛋白中位置2122还出现补偿性变化,例如,如分离株16P1中那样。如果两种变化同时出现,则在抗体和血清压力下,仅需要几次传代以便分离在E2蛋白中位置2889处额外地显示置换的其他变体。这些逃逸突变体的一些额外地显示在E2蛋白中位置2889处的变化。这种逃逸突变体的实例是分离株B5/2。
变体B5/2的TAV-表位的示意图:
野生型C-Stamm:CTAVSPTTLRTEVVK
突变体B5/2:CTAVSSTTLRTGVVK
在抗体压力下B5/2分离株的进一步传代导致CB32分离株的分离。除了E1蛋白中位置2899处的补偿性置换,这个分离株额外地显示E2蛋白中的又一个置换(核苷酸2862)。分离株CB32从变体B5/2与带有额外置换的新变体的混合物中产生。为了分离显示额外置换的新变体,将分离株CB32在抗体压力下传代持续多代。从后续和联合的传代H15中,分离出分离株Q7、S10和O11。
S10、O11和Q7突变体的TAV-表位的序列比较见图1。分离的逃逸突变体中核苷酸置换和氨基酸置换的概览见表1。
逃逸突变体B5/2、I16、Q7、S10和O11的表征
使用免疫荧光法,对逃逸突变体就多种E2特异性抗体的结合方面实施检验。表5:在E2蛋白中具有置换的所选择的E2逃逸突变体的间接免疫荧光染色
E2突变体 |
C16CSF-NS3B |
A18Bommeli CSF-E2
|
SNT |
阳性 |
阴性 |
16P1 |
阳性 |
阴性 |
25P3 |
阳性 |
阴性 |
60P3 |
阳性 |
阴性 |
12P5 |
阳性 |
阴性 |
34P5 |
阳性 |
阳性 |
50P5 |
阳性 |
阴性 |
51P5 |
阳性 |
阴性 |
5P6 |
阳性 |
阴性 |
48P6 |
阳性 |
阴性 |
59P7 |
阳性 |
阴性 |
60P7 |
阳性 |
阴性 |
C-Stamm |
阳性 |
阳性 |
Alfort |
阳性 |
阳性 |
在大部分情况下,当使用免疫荧光法采用A18Bommeli抗体时,TAV-表位中的单一氨基酸置换足以提供阴性信号。具有两个TAV突变的逃逸突变体(如B5/2)还对A18Bommeli和A18C抗体均显示阴性结果(图2)。
表7:特定代次的在TAV-表位显示3个置换的多种E2逃逸突变体的免疫荧光染色
对于A18染色,全部检验的分离株均对选择的代次显示阴性信号。然而在S10分离株的第8代,一个小集落是使用抗体WH303可染色的。这证实TAV-表位中置换的高稳定性。使用转瓶培养经10次额外传代,对Q7、S10和O11分离株实施进一步的稳定性试验。
表8:用抗体A18(idexx和bommeli)和WH303(VLA)对所选择传代物的差异性染色。NS3特异性抗体C16(EURL)用于对照目的
EZ=几个单一细胞
在第10代,不存在显示回复突变的病毒变体,从而仅可能用C16染色。变体Q7对全部染色均是阴性直至第14代,因而,在第16代中也不能用C16抗体检测到。除测序PCR操作方案之外还使用RT-PCR证实了这些研究结果。因此显而易见,在第16代没有病毒存在,从而也可以排除传代差错。然而使用A18(idexx)抗体,可以将一些细胞在S10分离株的第14和第16代中染色。对于突变体O11,在可以使用A18(bommeli)和WH303抗体将一些单细胞染色之前实施16次传代。这些结果显示如本文所述的病毒疫苗的血清学特征的高度稳定性。
通过E1和E2的测序表征逃逸突变体
表9:对较早的分离株测序显示出E2蛋白的TAV-表位中的置换
在位置2870处的置换在全部分离株中在10次传代后维持,看来它十分稳定。这支持以下结论;这种特定的置换对蛋白质结构没有大影响,因此,回复突变成野生型序列没有提供优点。
表10:对E2TAV-表位中具有3个置换的分离株的测序
分离株O11、S10和Q7中序列的变化对于检验的全部代次(14-17)均是稳定的。
表11:对转瓶培养下多次传代后的分离株Q7、S10和O11测序
这3个变体的全部测序的病毒传代物均在E1和E2蛋白中含有已经由免疫压力引起的置换。没能对Q7第16次传代物测序,这可能因为细胞培养上清液中没有留下病毒(见上文)。在回复突变型病毒确实出现(基于图2中的多种染色不能排除这一点)的情况下,就测定的百分比而言,它们是仅通过测序可检测的。然而,病毒的绝大部分不回复突变并且保持是置换的。不能通过测序检测到单一独立回复突变的病毒。
Q7特异性实时RT-PCR
为了在接种动物和感染动物之间区分,使用RT-PCR系统。因为TAV-表位是在全部CSF病毒中高度保守的,所以使用TAV-表位中的置换作为实时PCR测定法中引物和探针的基础。
表13:实时RT-PCR用来控制病毒负荷。使用以下PCR系统:CSFMix1(CSFV特异性,识别全部毒株)、Q7-TAV(对变体特异)和C-株-TAVMix(C-株野生型,在低得多的灵敏度下也可以检测到)。结果作为Ct值提供(循环阈值)。
使用实时RT-PCR确定病毒载量。CSF-Mix1系统识别全部CSFV毒株并且不区分C-株野生型和新的逃逸突变体。Q7-TAV系统特异性识别全部3种逃逸突变体。C-株-TAV系统仅识别C-株野生型(没有一个逃逸突变体),Ct值大约14。
Q7-TAVRT-PCR系统和C-株系统之间的Ct值差异随传代次数渐增而非常小的缩小为高传代次数后非常少量的回复体提供了有力证据。通常,这两个系统之间14Ct值的差异代表大约1:8000的突变体对回复体比率,由此Ct值10代表1∶1000的比率。
动物研究27/09—检验C-株Riems突变体B5/2-P6和I16-P2的免疫应答
用3头仔猪实施肌内免疫,由此每头仔猪接受2ml病毒悬液(细胞培养上清液)。组A用B5/2处理,组B用I16处理,对照组用Riemser猪瘟疫苗处理。这些研究提供了免疫后免疫应答的分析,检验接种在调节的免疫应答后的标记特性(ELISA),并且检验病毒在接种动物中的特性(遗传稳定性和复制特性)。
所施加病毒的返滴定提供以下结果:
B5/2-P6:病毒滴度104.25病毒/ml
I16-P2:病毒滴度104.75病毒/ml
动物对疫苗的耐受性
处理后的猪在免疫后没有明显症状(无发热或疾病症状)。白细胞数在免疫后前7日没有增加高于正常。
不能从血液中分离病毒。从免疫后4日和7日血样分离的RNA用于RT-PCR分析。然而,这种PCR产物不适于接下来的测序。这表明病毒在动物中十分低的复制速率。
动物研究06/10—检验逃逸突变体Q7、S10和O11
返滴定揭示在实验中使用的以下病毒浓度:
在免疫后,不存在体温变化,也没有发现猪瘟的常见疾病症状。
攻毒感染后的临床分析
发热定义为至少连续2日大于40°C的肛温。
检验5个组:
组1(5头猪):C-株变体的突变体Q7-P7(105.0KID50/ml)
组2(5头猪):C-株变体的突变体S10-P8(105.0KID50/ml)
组3(5头猪):C-株变体的突变体O11-P8(105.0KID50/ml)
组4(3头猪):Riemser猪瘟疫苗(原始病毒)
组5(3头猪):未免疫的对照组
在组1中,在攻毒感染后第3日和第13日之间温度量值零星增加,然而,这与动物受试者健康的任何其他肉眼可见损害不相关。仅第4号动物在4日期间显示发热。
组2显示3头处理的动物中温度零星增加,而第9号动物显示明显的高温。
在组3中,仅第14号动物显示体温增加,在攻毒感染后第4日和第5日发热。
组4的动物没有显示发热,而在2头处理的动物中测量到零星的温度增加。
组5的全部动物在感染后第2日和第7日之间均显示发热。归因于明显的猪瘟症状,感染后7日处死组5的全部动物。最常见症状是对中枢神经系统的影响(后腿轻瘫和共济失调、腹泻、结膜炎和嗜睡)。一头动物显示皮肤血肿。
没能从免疫动物的鼻拭子分离到病毒,而未免疫的对照动物在感染后7日检验呈阳性。
采用血清样品时的RT-PCR结果
RT-PCR结果显示,当检验强毒疾病相关性病毒的存在时,感染后14日后,仅从免疫的动物获得非常弱的信号。然而,未接种的对照动物显示强阳性信号,感染后3日的正Ct值是30或更小。来自未接种动物的Ct值在7日后降至17。
来自鼻拭子的RT-PCR
来自免疫动物的RT-PCR结果是唯一阴性的。然而,未接种的对照动物显示强阳性信号,感染后7日的Ct值在25和28之间。
采用CSFV毒株Alfort的病毒中和试验
病毒中和试验涉及确定(接种或未接种的)动物是否显示能够中和强毒病毒的抗体。全部免疫组在免疫后21日均显示中和抗体。感染后7日,全部免疫组中,针对Alfort的病毒中和试验滴度是640ND50或更大。O11免疫组中的一头动物和C-株对照组中的一头动物显示滴度480。未免疫的对照动物在VNT中不显示针对Alfort的滴度。
采用CSFV 的病毒中和试验(VNT)对于采用CSFV毒株的VNT,见图3。
在免疫后3周,全部动物除S10组中的一只动物和O11组团中的一只动物之外均显示中和抗体。感染后7日,免疫的动物通常显示640或更大的VNT滴度。最低滴度是320,由TAV突变体免疫组中的一只动物显示。未免疫的对照动物在VNT中不显示针对的滴度。
E2-ELISA(idexx)
E2-ELISA是用于检验经典猪瘟存在的市售ELISA-试剂盒。平均而言,C-株免疫的动物在免疫后21日在E2-ELISA中显示阳性结果。用TAV突变体免疫的动物也在7日后在idexxE2-ELISA中显示阳性结果。未免疫的对照组在感染后未显示可检测的抗体。
对于采用猪血清的IdexxE2-ELISA,见图4。
在E2-ELISA中,TAV突变体在感染之前的结果是阳性的,但不是强阳性的,而在感染后,这个结果变成强阳性,这表明强烈的强化剂作用(boostereffect)。C-株免疫的对照动物在感染之前在E2-ELISA中是强阳性的。
用TAV突变体免疫的动物的结果是与用C-株对照组免疫的动物可比较的。感染后病毒的分离是阴性的,并且RT-PCR结果可疑或是弱阳性的,这也在C-株对照组中显示出现。除之外,全部动物还在还针对Alfort的病毒中和试验中显示高滴度。全部免疫的动物均在肌内免疫后4周显示对抗感染性病毒毒株Koslov的完全保护。
动物研究24/10-检验逃逸突变体S10和O11;口服免疫后的保护
为了检验口服施加的有效性,实施以下动物研究。使用15头仔猪作为试验动物,它们8-10周龄(大约15-20kg)。
接种剂量和实验设计:
组1(6头猪):突变体AC-株变体S10(105KID50/ml)
组2(6头猪):突变体BC-株变体O11(104KID50/ml)
组3(3头猪):感染性对照(未接种)
组1:这个组的全部动物在攻毒感染之前均完全受到保护。没有检测到疾病相关性症状。全部动物均显示中和抗体,所述中和抗体是通过VNT和ELISA试验可检测到的。
组2:组2中的动物显示保护和感染的混杂状态。2头动物显示疾病症状,如高发热和其他典型的猪瘟症状。将患病的动物安乐死。受保护的动物显示中和抗体,所述中和抗体是通过VNT和ELISA试验可检测到的。
组3:全部动物均感染并且显示疾病症状。将患病的动物安乐死。
口服免疫研究显示,口服免疫,尤其使用S10突变体时,导致免遭感染的有效保护。考虑到接种剂量与施用的S10病毒相比减少,O11分离株也显示有益的结果。
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