CN110029195A - 一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量pcr检测引物和探针 - Google Patents

一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量pcr检测引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针，属于病毒检测技术领域。上述检测引物的核苷酸序列为：上游引物：5’‑CAGCGTCAGCTTCTATAG‑3’；下游引物：5’‑GTCAGGATTCCACACTTTAGCTA‑3’；所述探针的核苷酸序列为：5’‑TCCACTACGATACATAATACCGCA‑3’；其中，所述探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光猝灭基团。本发明能提高PEDV灭活检测的效率，检测周期能由5‑6天缩短为1‑2天，检测周期短，提升了灭活检测的敏感性和客观性的同时提高了疫苗生产的效率和疫苗成品的安全性。

Description

一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体是提供一种猪猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针及使用其进行猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性的，高度传染性的，以严重水样呕吐和腹泻及脱水为特征的肠道病毒性疾病，主要危害新生仔猪，死亡率高达100％。
猪流行性腹泻病毒灭活检验是灭活疫苗制备中重要的一环，但传统病毒灭活检测方法是通过细胞盲传3代，观察每代细胞是否出现CPE(致细胞病变效应)，整个过程约需9-10d左右的时间，大大延长了疫苗生产周期，降低了疫苗的生产效率；同时细胞盲传病变检测主观性强，结果随不同检测人员和不同检测条件而有所差异。因此急需建立一种猪流行性腹泻病毒灭活快速、客观检验方法。实时荧光定量PCR技术在病毒检测方面具有灵敏性高、精确性好、特异性强和安全快速等优点。但该技术未应用于猪流行性腹泻病毒灭活检验，主要技术难点在于从猪流行性腹泻病毒基因序列中挑选未彻底灭活病毒的靶标基因，需要设计特异性引物并进行筛选。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针及使用其进行猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，该方法可以显著缩短疫苗生产灭活检测周期，而且灭活检验结果判读更客观，灵敏性更高，特异性更强，且精确性更好。可显著提高疫苗的生产效率。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针，所述检测引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-CAGCGTCAGCTTCTATAG-3’；
下游引物：5’-GTCAGGATTCCACACTTTAGCTA-3’；
所述探针的核苷酸序列为：5’-TCCACTACGATACATAATACCGCA-3’；
其中，所述探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光猝灭基团。
进一步的，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ。
另一方面，本发明提供一种上述猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的应用。
再一方面，本发明提供一种包含上述猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针的试剂盒，及上述试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒中的应用。
再一方面，本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，包括：
步骤1：靶标基因筛选；
步骤2：靶标基因拷贝数荧光定量PCR检测方法建立；
步骤3：基于病毒RNA荧光定量PCR检测方法建立。
进一步的，所述步骤1具体为：
11)根据已有的PEDV基因组序列，选取病毒组装相关的若干个病毒ORF，应用DNASTART软件设计特异性引物和探针；
12)用TRIzol Reagent提取PEDV未灭活半成品以及灭活半成品总RNA；
13)使用反转录试剂盒进行总RNA的反转录，得到cDNA模板；
14)采用qPCR试剂盒检测上述基因的表达量
反应体系为Mix 10μL、ROX 0.4μL、10μmol/L的引物PEDV-FP和PEDV-RP各0.4μL、10μmol/L的探针PEDVprobe 0.4μL、cDNA模板2μL、补水至20μL；
5)荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s、56℃延伸40s，40个循环，于56℃时采集荧光信号；
6)荧光定量RT-PCR检测，选取在PEDV半成品灭活前被检出，灭活后不被检出的基因作为靶标基因。
进一步的，所述步骤2具体为：
21)以猪流行性腹泻病毒基因组cDNA为模板，采用权利要求1所述的上、下游引物进行PCR反应，扩增目标片段，将获得的目标片段分别连接克隆载体，构建包含目标片段的阳性质粒；
22)标准曲线的建立
测定其浓度，根据阳性质粒的浓度计算拷贝数，并将阳性质粒做10倍系列梯度稀释，然后分别以每一稀释浓度的重组质粒作为质粒标准品，进行荧光定量PCR，生成猪流行性腹泻病毒的质粒拷贝数-CT值的标准工作曲线。
进一步的，所述步骤3具体为：将待测样品的CT值带入标准工作曲线中，即可判断样品中猪流行性腹泻病毒的病毒含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于猪流行性腹泻病毒基因设计出特异的荧光探针序列，同时提供一种应用实时荧光定量PCR技术进行猪流行性腹泻病毒灭活检验的方法，该方法可以显著缩短疫苗生产灭活检测周期，而且灭活检验结果判读更客观，灵敏性更高，特异性更强，且精确性更好，可显著提高疫苗的生产效率。
附图说明
图1为本发明实施例2的阳性质粒pMD-ORF1的各稀释度样品进行荧光定量PCR检测图；其中，质粒拷贝数分别为1：3×1010、2：3×109、3：3×108、4：3×107、5：3×106、6：3×105、7：3×104、8：3×103、9：3×102、10：3×101、11：3×100拷贝/μL，12：阴性对照；
图2为本发明实施例2的阳性质粒pMD-ORF1拷贝数同一次实验内30个平行样品扩增曲线；
图3为本发明实施例3的猪流行性腹泻病毒RNA荧光定量PCR检测方法的流程框图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明中，除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备均为本领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明使用的样品、试剂和试剂盒均为市购。
实施例1：
一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针，首先进行靶标基因筛选，确定靶标基因：
1)根据已有的PEDV基因组序列，选取病毒组装最相关的4个病毒ORF，应用DNASTART软件设计特异性引物和探针(见表1)。
2)用TRIzol Reagent提取PEDV未灭活半成品以及灭活半成品总RNA；
3)使用反转录试剂盒进行总RNA的反转录，得到cDNA模板；
4)采用qPCR试剂盒检测这些基因的表达量；反应体系：Mix 10μL、ROX 0.4μL、10μmol/L的引物PEDV-FP和PEDV-RP各0.4μL、10μmol/L的探针PEDVprobe 0.4μL、cDNA模板2μL、补水至20μL；阴性对照组以去离子水代替待测样品；
5)荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s、56℃延伸40s，40个循环，于56℃时采集荧光信号；
6)荧光定量RT-PCR检测结果显示，经过100次试验验证，ORF1基因在PEDV半成品灭活前均可被检出，灭活后均不被检出，且Ct值均小于28，可认为其作为灭活检验的靶标基因具有较高的灵敏度，因此选择PEDV-ORF1基因作为灭活快速检验靶基因。
得到检测引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-CAGCGTCAGCTTCTATAG-3’，(SEQ ID NO：1)；
下游引物：5’-GTCAGGATTCCACACTTTAGCTA-3’，(SEQ ID NO：2)；
探针的核苷酸序列为：5’-TCCACTACGATACATAATACCGCA-3’，(SEQ ID NO：3)；
其中，所述探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光猝灭基团。
表1
实施例2：
一种靶标基因拷贝数荧光定量PCR检测方法的构建，包括：
1)标准品的制备：
以PEDV基因组cDNA为模板，使用PEDV–ORF1(F)、PEDV–ORF1(R)引物(表2)PCR扩增产物为145bp的PEDV-ORF1基因部分片段(SEQ ID NO：4)，与pMD18-T载体连接，构建包含目标片段的阳性质粒
pMD-ORF1，测序结果无突变；
2)标准曲线的建立:
将3×1010拷贝/μL阳性质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为3×1010-3×100拷贝/μL，作为标准品模板，参照“靶标基因筛选”中反应体系和条件进行荧光定量PCR，扩增拷贝数(x)与CT的函数为CT＝-3.52lgx+38.405，R2＝0.999，表明相关性较好；
3)荧光定量PCR方法的敏感性和重复性实验
将3×1010拷贝/μL阳性质粒进行10倍梯度稀释，使浓度依次为3×1010-3×100拷贝/μL，以此作为标准品模板用于qPCR反应进行敏感性测试，每个样品设置3个重复。通过对阳性质粒pMD-ORF1各稀释度样品进行荧光定量PCR检测，结果显示，最低可检测到3个病毒核酸分子拷贝数，见图1，具有较高的灵敏性。
重复性实验结果显示，取3×105拷贝/μL的阳性质粒在1次实验中重复30次，重复实验3次，通过组内和组间的CT值变异系数(标准偏差/重复值平均数)来评估该方法的重复性，结果显示同一次实验内30个平行样品扩增曲线在阈值线附近基本重合(图2)，组间及组内变异系数均小于2％(表2)，表明具有较高的稳定性和重复性，可用于PEDV-ORF1基因的定量分析。
表2
实施例3：
一种基于猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测方法的构建，包括：
1)用TRIzol Reagent提取PEDV半成品总RNA；
2)反转录使用反转录试剂盒总RNA的反转录，获取cDNA；
3)敏感性验证
将PEDV半成品液梯度稀释至100、101、102、103拷贝/mL，按照上述方法制备cDNA模板，采用实施例2中建立的荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定该方法检测PEDV RNA的灵敏度和最低检测限在3×101拷贝/mL，说明该方法具有极高的灵敏度。
4)重复性验证
取PEDV的cDNA在1次实验中重复30次，重复实验3次，通过组内和组间的Ct值变异系数来评估该方法的重复性。通过对PEDV cDNA样品进行荧光定量RT-PCR检测，结果显示组间及组内变异系数均小于2％(表3)，重复性好，可稳定检测PEDV-ORF1基因。
表3
5)特异性验证
用建立的荧光定量RT-PCR方法分别检测猪流行性腹泻病毒的cDNA、猪传染性胃肠炎病毒的cDNA、猪轮状病毒的cDNA、猪细小病毒DNA、猪流感病毒的cDNA、猪繁殖与呼吸综合症病毒的cDNA、猪伪狂犬病毒DNA、猪瘟病毒的cDNA，检测结果显示建立的该方法检测猪流行性腹泻病毒的cDNA有扩增曲线，而对仅含有其他被检病原体的cDNA/DNA中均未有扩增曲线，证明该方法特异性良好。
6)检测方法的验证
采用3个浓度梯度(0.05％、0.1％、0.2％)的甲醛在37℃下灭活的PEDV24h后制备样品，对本研究建立的PEDV灭活快速检验方法进行验证：取以上疫苗灭活半成品5-10mL分别提取总RNA并进行反转录，按照本研究的方法“靶标基因转录本荧光定量RT-PCR检测方法建立”中所示制备模板进行荧光定量RT-PCR反应检测病毒靶标RNA，同时进行细胞盲传检测。对比结果显示：0.2％甲醛灭活PEDV 24h后的灭活半成品检测不出病毒基因RNA，细胞盲传3代均未出现CPE，说明PEDV在此条件下被完全灭活；0.05％终浓度甲醛灭活PEDV 24h后灭活半成品可检测出病毒基因mRNA，细胞盲传至第3代时出现CPE表明此样品未灭活全；0.1％终浓度甲醛灭活PEDV 24h后的灭活半成品可检测出病毒基因mRNA，但细胞盲传3代未出现CPE，表明本研究建立的病毒灭活快速检验方法比细胞盲传法具有更高的灵敏度(表4)，且根据实施例2中建立的标准曲线方程以及所有的细胞阴性实验结果认为Ct>36时为阴性。
表4
实施例4
一种基于猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测方法，流程见图3，包括：
(1)取PEDV灭活半成品10批，每批次各5-10mL；
(2)用TRIzol Reagent提取10个批次样品总RNA；
(3)使用反转录试剂盒总RNA的反转录，获取10个批次样品cDNA模板；
(4)荧光定量PCR检测：
1)采用Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)试剂盒检测ORF1基因的表达量；反应体系：依次加入Mix 10μL、ROX 0.4μL、10μmol/L的引物PEDV-FP和PEDV-RP各0.4μL、10μmol/L的探针PEDV probe 0.4μL、cDNA模板2μL、补水至20μL；阴性对照组以去离子水代替待测样品。
2)荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s、56℃延伸40s，40个循环，于56℃时采集荧光信号；
(5)PEDV灭活检测结果判定：
批次 荧光定量RT-PCR检测结果
1 –
2 –
3 +
4 –
5 –
6 –
7 –
8 –
9 –
10 –
由上表可知，本申请检测绝大多数呈阴性，仅1批检测时阳性，检出率为90％，精确性好。
综上可知，本发明一种应用实时荧光定量PCR技术进行猪流行性腹泻病毒灭活检验的方法，该方法可以显著缩短疫苗生产灭活检测周期，而且灭活检验结果判读更客观，灵敏性更高，特异性更强，且精确性更好，可显著提高疫苗的生产效率。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物制品有限公司
<120> 一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针
<130> 2019
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 1
cagcgtcagc ttctatag 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 2
gtcaggattc cacactttag cta 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 3
tccactacga tacataatac cgca 24
<210> 4
<211> 145
<212> DNA
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 4
agcttcgtga gctggacgtc acttcctagt agctgcacgg caacatggtc gtggcagtta 60
tggctaccgg ttaattactg aatcctgaca tgagctagcg caacgcttgt catcgagctg 120
atgacatagt actttggaac aatac 145

Claims (9)

1.一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，所述检测引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-CAGCGTCAGCTTCTATAG-3’；
下游引物：5’-GTCAGGATTCCACACTTTAGCTA-3’；
所述探针的核苷酸序列为：5’-TCCACTACGATACATAATACCGCA-3’；
其中，所述探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ。
3.权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的应用。
4.一种包含权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针的试剂盒。
5.权利要求4所述的试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒中的应用。
6.一种猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，其特征在于，包括：
步骤1：靶标基因筛选；
步骤2：靶标基因拷贝数荧光定量PCR检测方法建立；
步骤3：基于病毒RNA荧光定量PCR检测方法建立。
7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
11)根据已有的PEDV基因组序列，选取病毒组装相关的若干个病毒ORF，应用DNASTART软件设计特异性引物和探针；
12)用TRIzol Reagent提取PEDV未灭活半成品以及灭活半成品总RNA；
13)使用反转录试剂盒进行总RNA的反转录，得到cDNA模板；
14)采用qPCR试剂盒检测上述基因的表达量
反应体系为Mix 10μL、ROX 0.4μL、10μmol/L的引物PEDV-FP和PEDV-RP各0.4μL、10μmol/L的探针PEDVprobe 0.4μL、cDNA模板2μL、补水至20μL；
5)荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s、56℃延伸40s，40个循环，于56℃时采集荧光信号；
6)荧光定量RT-PCR检测结，选取在PEDV半成品灭活前被检出，灭活后不被检出的基因作为靶标基因。
8.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：
21)以猪流行性腹泻病毒基因组cDNA为模板，采用权利要求1所述的上、下游引物进行PCR反应，扩增目标片段，将获得的目标片段分别连接克隆载体，构建包含目标片段的阳性质粒；
22)标准曲线的建立
测定其浓度，根据阳性质粒的浓度计算拷贝数，并将阳性质粒做10倍系列梯度稀释，然后分别以每一稀释浓度的重组质粒作为质粒标准品，进行荧光定量PCR，生成猪流行性腹泻病毒的质粒拷贝数-CT值的标准工作曲线。
9.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，其特征在于，所述步骤3具体为：将待测样品的CT值带入标准工作曲线中，即可判断样品中猪流行性腹泻病毒的病毒含量。
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