CN103805712A - 一种用于检测猪流行性腹泻病毒的方法 - Google Patents

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张文利
张晓杰
李爽
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Abstract

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的RT-PCR引物及检测方法，该方法通过设计猪流行性腹泻病毒基因的特异引物，建立猪流行性腹泻病毒的RT-PCR方法，为方便、快速、有效地检测该病毒。本发明的引物特异性高，鉴定速度快，整个RT-PCR过程可以在2.5-3小时完成，不需要经过测序公司测序就能快速准确的鉴定PEDV，为临床检测节省大量时间。

Description

一种用于检测猪流行性腹泻病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种猪病毒的检测方法，属于生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒的PCR检测引物及检测方法。 
背景技术
猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐和脱水为特征的猪肠道传染病。该病多发生在冬春寒冷季节，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各年龄段均可发病，但哺乳仔猪发病和死亡最为严重。20世纪80年代后该病在中国流行面逐渐扩大，并多与猪传染性胃肠炎、轮状病毒等其他肠道病原混合感染，给养猪业造成严重经济损失。 
该病的流行特点、临诊症状和病理变化都与猪传染性胃肠炎(TGE)非常相似，为了及时预防和治疗该病毒导致的腹泻，需要快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒的特异方法，因此建立PEDV的RT-PCR检测方法具有重要的意义。 
发明内容
本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的RT-PCR引物及检测方法，该方法通过设计猪流行性腹泻病毒基因的特异引物，建立猪流行性腹泻病毒的RT-PCR方法，为方便、快速、有效地检测该病毒打下基础。 
1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒的方法，包含RT-PCR的检测PED病毒，其特征在于：所述RT-PCR引物： 
PEDVF：AACGGTTCTATTCCCGTTGATG 
PEDVR：TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC 
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于：PED病毒RT-PCR的检测方法首先提取待检样的RNA，通过反转录形成cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，建立PEDV的RT-PCR检测，RT-PCR的产物为663bp。 
3.根据权利要求2所述的PEDV的RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的RT-PCR检测方法具体包括以下步骤： 
(1)待检样RNA的提取； 
(2)将提取的RNA通过反转录成cDNA，反应程序和反应体系如下： 
取总RNA5.75ul、反向引物RNA1ul、10mmol／L dNTPs0.5ul、5×Buffer2ul、100U／ul反转录酶AMV0.5ul、RNA酶抑制剂0.25ul，总体积10ul，50℃反应1h，95℃灭活5min，即得cDNA。 
(3)将获得的反转录产物进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下： 
取RT产物1ul，2×Mix12.5ul，正向引物和反向引物各1ul，高压灭菌水9.5ul，总体积25ul，置入PCR 仪，反应条件：94℃30second，56℃30second，72℃20second，35个循环，即得扩增产物。 
(4)RT-PCR产物的检测结果：根据琼脂糖凝胶电泳检测的DNA图谱，若扩增出分子量为663bp的特异DNA条带则标记为携带PED病毒，若未扩增出特异DNA条带则表示未携带PED病毒。 
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 
本发明的引物特异性高，鉴定速度快，整个RT-PCR过程可以在2.5-3小时完成，不需要经过测序公司测序就能快速准确的鉴定PEDV，为临床检测节省大量时间。 
附图说明
图1PEDVPCR扩增电泳结果 
图2PEDV RT-PCR特异性电泳图结果 
图3PEDVRT-PCR敏感性电泳图结果 
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 
实施例猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法建立。 
1引物设计：在GenBank中查找多个毒株，对其进行同源性分析，利用Primer5对上述保守区进行引物设计，对设计出来的病毒检测引物进行引物二聚体分析，以避免引物之间形成稳定的引物二聚体，从而确定该病毒的引物序列，见表1。 
表1 
Figure DEST_PATH_GSB0000123716620000021
2、RT-PCR反应条件优化 
利用商品化的RNA提取试剂盒提取疑似PEDV致死仔猪的肠及其内容物，提取方法参照RNA提取试剂盒操作说明进行。 
将提取的PEDV通过反转录成cDNA，反转录反应体系：在PCR管中加入5.25ul的总RAN、反向引物RNA1ul、10mmol／L dNTPs0.5ul、5×Buffer2ul、100U／ul反转录酶AMV0.5ul、RNA酶抑制剂0.25ul，总体积10ul。放置PCR仪上，50℃反应1h，95℃灭活5min，即得到反转录的cDNA。 
以反转录的cDNA为模板，建立PEDV的RT-PCR检测。PCR扩增体系为：取RT产物1ul，2×Mix12.5ul，正向引物和反向引物各1ul，高压灭菌水9.5ul，总体积25ul。PCR反应条件：94℃30second，56℃30second，72℃20second，35个循环。 
实验结果：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得的目的条带符合预期大小(图1)，说明该样品 内含有PEDV，检测试验成立。 
3、特异性检测 
检测上述涉及的PCR反应的引物PEDVF和PEDVR的特异性，方法如下： 
分别提取PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)、CSFV(猪瘟病毒)、BVDV(牛病毒性腹泻病毒)、RV(猪轮状病毒)、TEGV(猪传染性胃肠炎病毒)、PEDV(猪流行性腹泻病毒)的RNA，反转录得到PRRSV的cDNA、CSFV的cDNA、BVDV的cDNA、RV的cDNA、TEGV的的cDNA、PEDV的cDNA；提取PCV2(猪圆环病毒2型)、PPV(猪细小病毒)、PRV(猪伪狂犬病毒)的DNA，得到PPVDNA、PCV2DNA和PRV DNA；分别以得到的cDNA和DNA为模板，以PEDVF和PEDVR为引物，按照步骤2中的PCR扩增体系和程序进行扩增，结果如图2的1-9所示，其中1为PPV，2为PRRSV，3为CSFV，4为BVDV，5为RV，6为TEGV，7PRV为，8为PCV2，9为PEDV，可以看出，只有PEDV有目的条带，为663bp，其他均未见非特异性带，说明该引物特异性高，详见图2。 
4、敏感性检测 
用紫外分光光度计测得提取的PEDV阳性病料的RNA D260nm／D280nm为3.81，含量约为10μg／μL(30μLDEPC水所溶)。将模板作10倍系列稀释，取不同稀释度的模板cDNA各1μL分别进行PCR扩增。结果10-4稀释的模板仍能扩增出清晰的663bp条带，10-5稀释的模板几乎看不到663bp条带，而10-6稀释的模板不能扩增出条带。说明该RT-PCR扩增可以检测到1ng的PEDV模板cDNA(图3) 
5、重复性 
对PEDV RT-PCR方法进行多次重复试验实验结果稳定。 
6临床样本检测 
利用本实验建立PEDV RT-PCR检测方法，对从辽宁6个县市腹泻严重的猪场采集到的13份猪腹泻粪便进行猪流行性腹泻病原的检测，同时设阴阳性对照。检测结果为：PEDV阳性10份，阳性率为76.92％。 
Figure ISA0000099644290000011
Figure ISA0000099644290000021

Claims (3)

1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒的方法，包含RT-PCR的检测PED病毒，其特征在于：所述RT-PCR引物： 
PEDVF：AACGGTTCTATTCCCGTTGATG 
PEDVR：TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC 。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于：PED病毒RT-PCR的检测方法首先提取待检样的RNA，通过反转录形成cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，建立PEDV的RT-PCR检测，RT-PCR的产物为663bp。 
3.根据权利要求2所述的PEDV的RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的RT-PCR检测方法具体包括以下步骤： 
(1)待检样RNA的提取； 
(2)将提取的RNA通过反转录成cDNA，反应程序和反应体系如下： 
取总RNA5.75ul、反向引物RNA1ul、10mmol/L dNTPs0.5ul、5×Buffer2ul、100U/ul反转录酶AMV0.5ul、RNA酶抑制剂0.25ul，总体积10ul，50℃反应1h，95℃灭活5min，即得cDNA。 
(3)将获得的反转录产物进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下： 
取RT产物1ul，2×Mix12.5ul，正向引物和反向引物各1ul，高压灭菌水9.5ul，总体积25ul，置入PCR仪，反应条件：94℃30second，56℃30second，72℃20second，35个循环，即得扩增产物。 
(4)RT-PCR产物的检测结果：根据琼脂糖凝胶电泳检测的DNA图谱，若扩增出分子量为663bp的特异DNA条带则标记为携带PED病毒，若未扩增出特异DNA条带则表示未携带PED病毒。 
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