JPH02291273A - ネコ伝染性腹膜炎ウイルスの診断手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，組換えＤＮＡ技術およびウィルス疾患の免疫
予防法の分野におけるものである。さらに詳しくは．本
発明は，ネコ伝染性腹膜炎（ＰＩＦ）　，組換え技術で
製造されたＦＩＰウィルスのタンパク．および診断法と
予防法とにおけるこれらタンパクの使用に関する。

（従来の技術） ネコ伝染性腹膜炎は，腎臓，肝臓，およびＣＮＳ（非滲
出性もしくは「乾燥」形）を含む種々の器官の化膿肉芽
腫性病巣の形成，あるいはフイブリン腹膜炎右よび／ま
たはフィブリン胸膜炎（滲出性もしくは「湿潤」形）の
発生，あるいは両方の特性の組合わせを特徴とするネコ
の疾患である〔１９８４年８月．　　Ｖｅｔ　Ｃｌｉｎ
　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ：　Ａｎｉｍ　Ｐｒａｃｔ，１４　
（５）　：　９７５−９８４　；　　Ｂａｒｌｏｕｇｈ
およびＳｔｏｄｄａｒｔ（１９８６Ｌ　Ｃｏｎｔｅｍｐ
ｏｒａｒｙ　Ｉｓｓｕｅｓ　ｉｎ　Ｓｍａｌｌ　Ａｎｉ
ｍａｌＰｒａｃｔｉｃｅ　　　Ｖｏｌ．３　　Ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｕｓ　　ロｉｓｅａｓｅｓ　　（Ｆ．　　Ｗ．
Ｓｃｏｔｔ編）　Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓ
Ｌｏｎｅ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｐ，９３−１０８］。

その病原はまだ充分には判明していないが．この疾患は
，免疫に関連がある疾患であり，その一次病変は．血管
内にアルチェス様（Ａｒｔｈｕｓ−１ｉｋｅ）免疫複合
体が沈積することが原因で起こる脈管炎および脈管周囲
炎である。

ネコ伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ）は，　ＰＩＦの
病因学的因子である。ＦＩＰＶウィルス抗原，　　ｆｇ
Ｇ，″Ｊ６よび補体第３成分（Ｃ３）は．免疫蛍光法に
よってＦＩＰ病巣内に存在することが示されており，持
続性のｐｔｐｖ感染は．感染したネコのマクロファージ
と神経根内皮系の細胞とに確認されている。血清反応陰
性の小ネコが攻撃される場合に比べて，　ＦＩＰＶ抗体
を有する小ネコが病原性のＦＩＰＶで攻撃される場合の
方が，より劇症のＰＩＦが起こる。

ＦＩＰＶは，ゲノムの極性が陽性の一本ＩＲＮ＾ウィル
ス（コロナウィルス科）である。そのＲＮ＾ゲノムから
，７〜９個のｍＲＮＡからなる入れ子集合（ｎｅｓｔｅ
ｄ−ｓｅｔ）が産生されるが，これらはすべてゲノムの
３゜末端で終止する。このウィルスがコードする主な構
造タンパクには．　４５ｋＤの非グリコシル化ヌクレオ
キャブシド（Ｎ）　．　２６ｋＤの外皮糖タンパク（Ｅ
ｌ），および表面ペプロマー（ε２）を構成する２１０
ｋＤの糖タンパクが含まれる。さらに，他のゴロナウィ
ルス類と同様に，　ＰＩＰＶに感染した細胞中で発現す
るが．　ｐｔｐｖのビリオンには取り込まれない非構造
タンパク（ＮＳＩおよびＮＳ２）をコードするオープン
リーディングフレームが存在する。

３種の原型ワクチンが開発されている。第１のワクチン
では，抗原的に関連する（しかし，ネコに対しては無発
病性の）コロナウィルスを生ワクチンとして用い．中和
抗体の力価が刺激される。

これらのワクチンには．ブタの伝播性胃腸炎ウィルス（
ＴＧＢＶ）および犬のイヌコロナウィルス（ＣＣＶ）が
含まれている。これらの研究の結果，ほとんど感作が生
じないかまたは全く感作が起こらず．したがって全く防
御作用を示さないことが分かった（Ｂａｒｌｏｕｇｈ　
ら．　　（１９８４）　Ｌａｂ　Ａｎｉｍ　Ｓｃｉ，　
　３４　（６）　：５９２−５９７　；　Ｗｏｏｄｓお
よびＰｅｄｅｒｓｅｎ，　（１９７９）　ＶｅｔＭｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ，　　４　　：１１−１６）。

第２の原型ワクチンでは，生きた相同ＰＩＦウィルスが
用いられる（Ｐｅｄｅｒｓｅｎおよび旧ａｃｋ．　　（
１９８３）７　　：　１００１−１０１１）。試験の結
果，防御作用が全くないことが分かり．ほとんどの場合
，ネコは感作されるが，次いで病原性のウィルスに攻撃
されるとＦＩＰが悪化する。

第３の原型ワクチンは，　　ＰＣＴ出願公開ＷＯ　８７
／０４６２４に開示されているが，特異的な株の弱毒Ｐ
ＩＰウィルス（７９−１１４６）が用いられる。この株
は，生ワクチンとして用いた場合に．防御を行うが，感
作を起こさないと述べられている。

別の方法も試みられているが，　ＰＩＦに対して有効な
ワクチンの開発はｆｆ１ｍされていない。現在まで．充
分に特性が決定された唯一のＦＩＰＶ構造タンパクはε
２もしくはペプロマーの糖タンパクである。

Ｅ２をコードするｃＯＮＡ配列はクローン化され．　Ｄ
ｅＧｒｏｏｔら．　　（１９８７）　　Ｊ　　Ｇｅｎ　
Ｖｉｒｏｌ，　　６８　：　２６３９−２６４６に発表
されているが．欧州特許第２６４．　９７９号にも，　
８２ｃＤＮ＾配列のクローン化が開示され，　ＦＩＰに
対するワクチンとして利用することが述べられている。

（発明の要旨） 本発明は．ネコ伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ）の構
造タンパクおよび非構造タンパクの合成および模作に用
いられる手段を提供するものである。

これらのタンパクは，動物のＦＩＰＶに対するＱＮもし
くはＦＩＰＶに対する感染性を診断するのに有用であり
．サブユニットのワクチンとしても有用である。

ある局面では．本発明は．　ＦＩＰＶの構造タンパクお
よ゛び非構造タンパクをコードする組換え体核酸列に関
する。特に，これらの配列には，　Ｎ，　Ｅｌ，ＮＳＩ
，　　およびＮＳ２，ならびにその生物学的誘導体の配
列が含まれる。すなわち，　Ｂｌ．　Ｎ，　ＮＳＩ．お
よびＮＳ２からなる群から選択されるＦＩＰＶの構造タ
ンパクまたは非構造タンパクをコードする，単離された
．クローン化組換え体の，もしくは合成の核酸列が含ま
れる他の局面では，本発明は，細胞を形質転換させるの
に使用できる上記の核酸列を有する組換え体ベクター，
およびこれらの形質転換細胞によって産生される組換え
体タンパクに関する。さらに他の局面では．本発明は．
組換え技術を用いてこれらのＦＩＰＶタンパクを製造す
る方法に関する。該製造方法は，上記の形質転換細胞を
，タンパクの発現に適した条件下で培養すること．およ
び発現されたタンパクを回収することを包含する。さら
に他の局面では，本発明は，　Ｆ［ＰＶに対するネコ被
検体の曝露を診断する方法に関する。該診断方法は．（
ａ）被検体の血清試料を，ａ識されたＦＩＰＶポリペプ
チドと共にインキュベートすること；およびｂ）標識さ
れたＦＩＰＶポリペプチドと抗血清との間で免疫複合体
が形成されているかどうかを決定すること；を包含する
。ＦＩＰＶに対するネコ被検体の曝露を診断する本発明
の他の方法は．（ａ）被検体の細胞溶解物試料を，　Ｆ
ＩＰＶ抗体と共にインキコベートすること；および（ｂ
）細胞溶解物とＦＩＰＶ抗血清との間で免疫複合体が形
成されているかどうかを決定すること；を包含する。

（発明の構成） Ａ．定義 本願で用いる場合．　　ｒＦＩＰＶタンパク」もしくは
ｒＦＩＰＶボリペプチド」という用語は，４５Ｋのヌク
レオキャプシドタンパク（Ｎ）．２５Ｋ〜３５Ｋのトラ
ンスメンプラン糖タンパク（ロｌ）および２１０Ｋのペ
プロマー糖タンパク（Ｂ２）を包含するＦＩＰＶビリオ
ンの構造タンパク；他のコロナウィルス類でコードされ
るタンパクと類似し，　ＦＩＰＶゲノム内のオープンリ
ーディングフレームで予示される非構造タンパクであっ
て，第１図に示すＯＮ八配列でコードされ．ここではＮ
ＳＩおよびＮＳ２と命名されるタンパクを包含する非構
造タンパク；および上記のウィルスタンパクの組換え体
と合成物との免疫原性フラグメント，を意味する。ｒＦ
ＩＰＶ遺伝子」という用語は．　ＦＩＰＶタンパクをコ
ードする核酸列として定義される。これらの用語は，い
ずれのサブグループもしくは株にも限定されない。

「生物学的誘導体」には．　ＦＩＰＶの構造タンパクも
しくは非構造タンパクに対して少なくとも９５％の相同
性を有するＦＩＰＶの構造タンパクおよび非構造タンパ
クの突然変異体，およびＦＩＰＶ抗血清との反応性で証
明されるＦＩＰＶの免疫原性領域を包含する組換え体も
しくは合成物のべブチド類が含まれる。

「作動可能に連結された」という用語は，その成分が通
常の機能を実施するような形態に並置されていることを
意味する。したがって，コード配列に作動可能に連結さ
れた制御配列もしくはプロモーターは，コード配列の発
現を行うことができる。

「制御配列」は，所望のコード配列に適切に連結された
場合に，このような配列との適合性を有する宿主内で発
現を行い得る単一もしくは複数のＤＮＡ配列を意味する
。このような制御配列は，真核宿主内および原核宿主内
の両方に少なくともプロモーターを有し，また必要に応
じて転写終結シグナルを有する。発現を行うのに必要も
しくは有益な他の因子も固定することができる。本願で
用いる場合．「制御配列」という用語は，単に．使用さ
れる特定の宿主内で発現を行うのに必要などんなＤＮＡ
配列をも意味する。

本願で用いる「挿入ベクター」という用語には．ウィル
スのゲノムに対して相同的な組換えを媒介することがで
きるプラスミド．コスミド．もしくはファージが含まれ
，組換えにより得られた組換え体ウィルスによって．非
相同的な核酸列が安定に保持される。本発明のある実施
態様では，ワクシニアウィルスＤＮＡから構築されたプ
ラスミドが用いられる。

「発現ベクター」という用語には，上記ベクターによっ
て保持される各組換え体遺伝子によってコードされるタ
ンパクを合成することができるブラスミド，コスミド，
もしくはファージが含まれる。このようなベクターは，
独立して，適切な宿主細胞の染色体内で複製されるか，
または該染色体に組込むことができ，所望のタンパクを
発現する。

Ｂ．　ＦＩＰＶ遺伝子のクローン化 ＦｒＰＶの構造遺伝子および非構造遺伝子は，合成もし
くは天然またはその組合わせであってもよい。

天然のＦＩＰＶ遺伝子（または，そのタンパク）は，Ｆ
ＩＰＶ　ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーを調製し
，次いでウィルス遺伝子の存在についてスクリーニング
することによって得ることができる。メッセンジャーＲ
ＮＡ群からｃＤＮＡライブラリーを調製することは周知
であり，　ｌｕｙｎｈら（１９８４）が．　ＤＮＡ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ｖａｔ　１　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　（Ｄ，　Ｇｌｏｖｅｒ編）．ｐ
ｐ．４９−７８．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｏｘｆｏｒ
ｄに詳細に記載している。一般に，ライブラリーが，ヌ
クレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションに
よってスクリーニングされなければならない場合には，
いずれの挿入ベクターも適切であるが，λｇｔｌＯは，
非組換え体ファージに対して直接選択ができるので好ま
しい。ライブラリーが抗体ブローブを用いてスクリーニ
ングされなげればならない場合には，最も普通に用いら
れる発現ベクターは，λｇｔｌｌである。この発現ベク
ターでは，クローン化されたコード配列がβ−ガラクト
シダーゼのコード配列に融合されている。

スクリーニングは，ポリペブチドに対して特異的な標識
されたＤＮＡプローブ，または遺伝子産物に対する抗体
を用いて行われる。両方の方法は，いずれも普通の方法
であり．文献には詳細に記載されている。適切な抗体は
，精製したＦＩＰＶから調製することができる。適切な
ＤＮＡプローブは，　ＦＩＰＶ　Ｂ２構造タンパクのア
ミノ酸配列，または第１図や下記の実験の項で例示され
るＥｌ，　　Ｎ，　　ＮＳＩ，およびＮＳ２のポリペプ
チドに対するヌクレオチド配列に基づいて得ることがで
きる。

合成のヌクレ才チド配列を調製する場合には，天然のヌ
クレオチド配列を修飾することが望ましい。例えば．所
望の宿主によって優先的に認識されるコドンを使用する
ことが好ましいことが多い。

場合によっては，さらに，そのヌクレオチド配列を変更
して制限部位を創製するかもしくは除去して．例えば便
利な発現ベクターへの遺伝子配列の挿入を促進させるか
，または得られたポリベプチド中の１つまたはそれ以上
のアミノ酸を置換することによって安定性を増大させる
ことが望ましい。

合成のオリゴヌクレオチドは，　Ｅｄｇｅら，　Ｎａｔ
ｕｒｅ（前出）およびＤｕｃｋｗｏｒｔｈら，　　（１
９８１）　　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　　
９　　：　１６９１に記載のホスホトリエステル法；ま
たはＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ．　　
（１９８１）Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔｓ，　２２　：　１８５
９およびＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ
．　　（１９８１）　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ，　
１０３　：　３１８５に記載のホスホアミダイト法によ
って調製される。

また．市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調
製することもできる。

（以下余白》 Ｃ．組換え体ウィルスワクチン Ｍｏｓｓらは，　　１９８３年発行のＭｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　　３
巻．　Ｅｌｓｅｒｖｉｅｒ−Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌｌａｎ
ｄ，　２０２〜２１３，および１９８４年発行のＪ　Ｖ
ｉｒｏ１　４９：８５７〜８６４に，非相同遺伝子をワ
タシニアウィルスのゲノムに挿入することを記載してい
る。これらの遺伝子は，次いで宿主内でウィルスの複製
中に発現されて，これらの遺伝子産物やワタシニアに免
疫応答する。この方法を用いて，インフルエンザ（Ｓｍ
ｉｔｈら，　　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ
，ＩＪＳＡ，８０：７１５５−７１５９（１９８３）；
Ｂｅｎｎｉｎｋら，　Ｎａｔｕｒｅ，　３１１，　５７
８　（１９８４）），単純ヘルペス（（：ｒｅｍａｒら
，　Ｓｃ＋ｅｎｃｅ．　２２８．７３７〜７４０　（１
９８５））；Ｂ型肝炎（Ｍｏｓｓら，　Ｎａｔｕｒｅ，
　３１１．　６７−６９　（１９８４））．およびプラ
スモジウム・クノウレシ−（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｋｎ
ｏｗｌｅｓｉ）　　（Ｓｒｎｉｃｈら，　　Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，　　２２４．　　３９７〜３９９（１９８４））
を含む各種病原体からの攻撃に対する，重要な免疫学的
応答および／または防御が例示されている。

この技術には．ワタシニアウィルスのプロモーターの下
流に非相同のＦＩＰＶ遺伝子を有するプラスミド挿入ベ
クターの構築法が含まれ，前記のワタシニアウィルスの
プロモーターはすべて，該挿入ベクター内のワタシニア
チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子に挿入される。　ワタ
シニアウィルスに感染した細胞に対する。ワタシニアＤ
ＮＡと挿入ベクタートノコトランスフエクション（ｃｏ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって，ウィルスＤＮＡ
内のＴＫ配列とプラスミド間の相同組み換えが可能にな
り，その結果．非相同のＦＩＰＶ遺伝子がワタシニアゲ
ノムに挿入され，ウィルスｔｋ遺伝子が中断される。組
換え体ウィルスは，そのｔｋ一表現型によって容易に選
択することができる。

Ｄ．ワタシニアウィルスのベクター ＦＩＰＶタンパクのコード配列は，組換え体ワタシニア
ウィルスを生成させるために，ワタシニアウィルスプラ
スミド挿入ベクターに挿入することができる。その結果
，　ＰＩＰＶワクシニア組換え体は，（１）それぞれの
ＦＩＰＶタンパクの発現と分析．　（２）ＦＩＰＶ抗体
の産生，（３）組織培養物中での死菌免疫原もしくは不
活性化免疫原としてネコに用いるＦＩＰＶタンバクの産
生．または（４）生きているウィルス免疫原としてネコ
に用いるのに利用することができる。

本発明では．ブラスミドのｐｓｃ１１とｐＵＶ１を，　
ＰＩＰｖタンパクの発現と，　ＰＩＰＶワクシニア組換
え体の生成に用いた。ＮＳＩ，　ＮＳ２．　Ｉｌｌおよ
びＮのコード配列を含有するプラスミドで形質転換され
たＥ，Ｃｏｌｉの試料は，ブタペスト条約に基づいて，
米国，メリーランド州，ロックビル．パークローンドラ
イブ１２３０１にあるアメリカンタイプ力ルチャーコレ
クション（ＡＴＣＣ）に１９８８年８月３０日に寄託し
た。

３種のブラスミトノ名称１；！．　ｐ６４−ＦＩＰＶ６
．　ｐＢＲ３２９−ＦＩＰＶ９．およびｐＢＲ３２９−
Ｅ２＃２テあり，それぞれ６７７８４．６７７８３およ
び６７７８２という受託番号が与えられた。

第１図に示す．これらのプラスミドは以下のヌクレオチ
ド配列を含む：すなわち．　ｐＢＲ３２９−８２＄２（
１２７８４）；　ｐＢＲ３２９−ＦＩＰＶ９（２０４９
−３８９６）；およびＦＩＰＶ６（３６７３−５１３０
＞である。

ＦＩＰＶ組換え体を産生ずるために．２種のワクシニア
ウィルス挿入ベクターｐｓｃｔｉ　（Ｃｈａｋｒａｂａ
ｒｔｉら．Ｆａｌｋｎｅｒ，　Ｆ，　Ｇ，ら，　　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８７
）１５．　７１９２）を用いた。両ベクターはともに，
第２図八に示す共挿入（ｃｏ−ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）種
に属する。これらのベクターは，２つのワタシニアウィ
ルスプロモーターを有する。その一方のプロモーター（
Ｐ１）は選択可能なマーカー遺伝子の発現を駆動するの
に用いられる（この場合β−ガラクトシダーゼ）。

他方のプロモーター（Ｐ２）は非相同性のＦＩＰＶ　ｃ
ＤＮ八挿入体の発現を駆動するのに用いられる。両者に
は，野生型ワタシニアウィルスゲノムへの相同組換えを
促進し，選択機構（　ｔｋ−ウィルスの生成》を提供す
るワタシニアウィルスＤＮＡ　（中断されたチミジンキ
ナーゼ（ｔｋ）遺伝子）が隣接している。ｐｓｃ１１ベ
クター（第２図Ｂ）は，ワタシニア初期一後期プロモー
ター（Ｐ７．　５）を利用して非相同遺伝子の発現を駆
動し，単一のＳｍａ　ｒクローン部位を有する。

ｐ［ＩＶｌベクター（第２図Ｃ）は，ワタシニア後期プ
ロモーター（Ｐｌｌ）を利用して非相同遺伝子の発現を
駆動し．　Ｐｌｌ後期遺伝子のＡＴＧの後の融合タンパ
クを発現させるよう設計されている。すべての場合，　
ＦＩＰＶ−ｐＵＶＩ　ＣＤ構築物は，天然ノＦＩＰＶタ
：／バク配列に追加のアミノ末端アミノ酸が導入される
ことを回避するために，最も５゛末端側（ＡＴＧの後）
のクローン部位（ＩＥｃｏＲＩ）を利用して行った。

ロ．組換え体発現ベクターと宿主 当業者に理解されるように，本願に記載されているＦＩ
ＰＶ遺伝子を発現するのに．真核系と原核系の両者を用
いることができる。原核生物としては，Ｂ．ｃｏｌｉの
各種菌株が提示される場合が最も多いが，他の微生物の
閑株も使用できる。宿主と適合しうる種由来の複製部位
，選択可能なマーカーおよび制御配列を有するプラスミ
ドベクターが使用される。例えば，　Ｂ，ｃｏｌｉは，
一般に．　ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら，　Ｇｅｎ
ｅ，　２．　９５　（１９７７）による，　Ｅ，ｃｏｌ
ｉの種由来のプラスミド）の誘導体を用いて形質転模さ
れる。

ｐ［ｌＲ３２２は，アンビシリンとテトラサイクリンに
耐性の遺伝子を有し，その結果．所望のベクターを構築
する際に，残しておくか，または破壊することができる
多重の選択可能なマーカーを提供する。

通常用いられる原核制御配列は，本願では．リポソーム
結合部位配列とともに，任意にオペレーターと．転写を
開始するプラスミドとを含有すると定義されている。こ
の原核制御配列には，β−ラクタマーゼ（ペニシリナー
ゼ）とラクトース　（Ｉａｃ）のプロモーター系（Ｃｈ
ａｎｇら，　Ｎａｔｕｒｅ，　１９８．　１０５６（１
９７７））．　｝リプトフ７　：／　（ｔｒｐ）プロモ
ーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　　８．４０５７（１９８０）），
ラムダ由来のＰＬプロモーター（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら
，　Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１２８　（１９８１））．
　Ｎ遺伝子リポソーム結合部位およびｔｒｐ−１ａｃ（
ｔｒｃ）プロモーター系（ＡｍａｎｎとＢｒｏｓｉｕｓ
，Ｇｅｎｅ，　４０，　　１８３，（１９８５））のよ
うな通常用いられるプロモーターを包含する。

細菌に加えて，酵母のような真核微生物も宿主として使
用できる。サツ力ロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の実験室菌株
である製パン用酵母が最もよく使用されるが，他の多数
の菌株もしくは種も通常利用できる。例えば，Ｂｒｏａ
ｃｈ，　Ｍｅｔｈ　［Ｅｎｚ，　　１０１，　３０７　
（１９８３）の，２ミクロンの複製起源，または他の酵
母に適合しつる複製起源（例えば，　Ｓｔｉｎｃｈｃｏ
ｏ＋ｂら．　Ｎａｔｕｒｅ，　２８２．３９（１９７９
）；Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒら，　　Ｇｅｎｅ，　　１０，
　　１５７　（１９８０）；およびＣｌａｒｋｅら，　
Ｍｅｔｈ　Ｂｎｚ　１０１．３００　（１９８３）参照
）を使用するベクターを用いることができる。酵母ベク
ターの制御配列は，解糖酵素合成のプロモーする。当該
技術分野で知られている別のプロモーターには．３−ホ
スホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（旧ｔｚｅｍ
ａｎら，　Ｊ　Ｒｉｏｔ　Ｃｈｅｍ，　２５５．　　２
０７３（１９８０））が包含されている。増殖条件およ
び／または遺伝背景によって制御される転写の別の利点
を有する他のプロモーターは，アルコールデヒドロゲナ
ーゼ２，イソシトクロムＣ，　Ｒ性ホソファターゼ．窒
素代謝と関連のある分解酵素頚，およびマルトースとガ
ラクトースの利用に関与するα因子系と酵素のプロモー
ター領域である。ターミネーター配列は，コード配列の
３゜末端の位置にあるこ止が望ましいと考えられる。こ
のようなターミネーターは，酵母由来の遺伝子のコード
配列に続く３゜側の非翻訳領域に見出される。

もちろん．多細胞生物由来の真核宿主細胞培養物中で，
ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることも可
能である（例えばＡｘｅ　Ｉらの米国特許第４．　３９
９，　２６１号参照）。これらの系は，追加の利点とし
て，イントロンをスプライスする能力を有するので．ゲ
ノムフラグメントを直接発現するのに用いることができ
る。有用な宿主細胞系には．ＶＢＲＯ．　ｔｌｅＬａ，
ベビーハムスターの腎１１ｔｉ　（ＢＨＫ）．　ＣＶ−
１．ＣＯＳ，　ＭＤＣκ，　ＮＩＨ　３Ｔ３．　Ｌ．お
よびチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＤ）細胞が包
含される。有用なネコ宿主細胞としては，クランドール
（Ｃｒａｎｄｏｌｌ）ネコ腎臓細胞（Ｃ’ＲＦＫ）とネ
コ全胎児（Ｆ［ＷＦ）が挙げられる。このような細胞の
発現ベクターには．サルウィルス４０　（ＳＶ４０）　
（Ｆｉｒｅｓら，　　Ｎａｔｕｒｅ，　　２７３．１１
３（１９７８））由来の通常用いられる初期と後期のプ
ロモーター，マタはポリオーマ，ヘルペスウィルス，ア
デノウィルス２，ネコ白血病ウィルス由来のネコレトロ
ウィルスＬＴＲ．　　ウシ乳頭腫ウィルスもしくはトリ
肉腫ウィルス由来の他のウィルスプロモーターなどの噛
乳類細胞と適合しうる，プロモーター類と制御配列が一
般に含まれている。制御可能なプロモーターであるｈＭ
ＴＩＩ　　（Ｋａｒｉｎら，　Ｎａｔｕｒｅ，２９９，
　７９７〜８０２　（１９８７）　）も使用できる。浦
乳類の細胞宿主系の形質転換の一般的な態様はＡｘｅｌ
の前記文献に記載されている。

昆虫の発現系もＦＩＰＶ遺伝子を発現するのに利用する
ことができる。例えば，バキュロウィルス多角体遺伝子
が，非相同タンパクの高レベルの発現に利用されている
（Ｓｍｉｔｈら，　Ｍｏｌ　［：ｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，　
　３（１２）．　　２１５６〜２１６５（１９８３）；
　Ｓｕｍｍｅｒｓら，“ＧｅｎｅｔｉｃＢｎｇｉ−ｎｅ
ｅｒｉｎｇ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｇｅｎｏｍｅ　　ｏ
ｆ　　ｔｈｅ　　八ｕｔｏｇｒａｐｈａＣａｌｊ−ｆｏ
ｒｎｉｃａ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉ
ｓ　Ｖｉｒｕ”ＢａｎｂｕｒｙＲｅｐｏｒｔ：　　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃａｌｌｙ　　八ｌｔｅｒｅｄ　　Ｖｉｒｕｓ
ｅｓ　　＋ｎ　　ｔｈｅＢｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．２２
．　　３１９−３３９．　（１９８５）．　　Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ１１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）。

Ｆ．安定して転写された細胞系の生成 ワタシニア中で発現されたＦＩＰＶｃＤＮＡクローンも
．ＦＩＰＶサブユニットタンパクを発現する，安定にト
ランスフェクトされた細胞系を生成させるのに使用でき
る。一般に，これらの細胞系は．２つの発現プラスミド
の一つを最初に構築することによって生成される。両発
現プラスミド、には，選択可能なマーカーが，　ＳＶ４
０初期プロモーター．それ自身のプロモーターを含む細
菌カナマイシン耐性遺伝子，　ＳＶ４０の介在配列，お
よび初期領域由来のＳＶ４０ポリアデニル化部位で構成
された６４１８ネオマイシン発現力セツ｝　（ｎｅｏ）
によって与えられる。第１の発現プラスミドでは，　Ｆ
ＩＰＶｃＤＮＡクローン化部位には，５゜末端には，　
ＳＶ４０エンハンサーで修飾された，ヒトメタ口チオネ
イン遺伝子プロモーターであるｐＭｔＩＩａが隣接し．
３′末端には初期領域由来のＳＶ４０ポリアデニル化部
位が隣接している。第２の発現構造では．　ＦＩＰＶ　
ｃＤＮＡクローン化部位には，５゜末端に．特にネコの
細胞中で機能するプロモーター機能を与えるネコ白血病
ウィルス（ＰｅＬＶ）の長い末端繰返し配列化ＴＲ）が
隣接し，３゜末端には，ＳＶ４０初期領域もしくはβ−
アクチン遺伝子の配列のような，有用なポリアデニル化
部位をコードする配列が隣接している。

上記の各ベクターは，特に限定はないが，下記実施例に
記載したような噛乳類の細胞系に．リン酸カルシウム−
ＤＮＡ共沈降法もしくはエレクトロボレーション法（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によって形質転換する
ことができる。１日後に，細胞をｌｍｇ／一の６４１８
で処理し６４１８耐性コロニーのプールを得る。成功裏
に得られた形質転換体は．発現構築物中に含まれている
ＦＩＰＶ　ｃＤＮＡを安定に継承し，次に低密度にプレ
ートしてクローン単離物を精製する。クローン単離物を
．所望のＦＩＰＶタンパクの最大産生量について分析し
．高生産性のクローンをワクチン種として役立つように
増殖させる。

Ｇ．診断用途 ＦＩＰＶタンパク，またはこのタンパク由来の免疫原性
ペプチドセグメントは，ネコが以前にＦＩＰＶに暴露さ
れたか否かを決定する診断試薬として用いることができ
，またネコのその疾病に対する感染性を決定する手段を
提供する。このことは，多数のネコの生体試料を検定す
ることによって行うことができる。第１に，ネコの血清
は．　ＦＩＰＶ抗体の存在を検定することができる。第
２１４，ネコから得た細胞溶解物もしくは全固定細胞は
，　ＦＩＰＶタンパクが発現されているか否かを決定す
る検定を行うことができる。第１の場合，　ＦＩＰＶタ
ンパクが診断手段である。第２の場合．　ＦＩＰＶタン
パクに対する抗体が診断手段である。

本発明のＦＩＰＶタンパクに対する抗体を調製するのに
．標準のプロトコルを用いることができる。

ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両者の製造
法は，当該技術分野では公知である。簡単に述べれば，
ポリクローナル抗体は，ウサギもしくはマウスのような
動物に．　ＦＩＰＶタンパクをアジュバントと共に注射
することによって調製される。

ＦＩＰＶタンパクは，カルボジイミド，グルタルアルデ
ヒドまたは他の架橋剤を用いる化学的方法を利用してウ
シ血清アルブミンもしくはキイホール・リンベット・ヘ
マシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍａ
（ｙａｎｉｎ）のような担体タンパクに接合する必要が
ある。あるいはこのタンパクは担体タンパクに接合せず
に投与してもよい。ＰＩＰＶタンパクを発現しているワ
タシニア組換え体も，抗体を調製するのに利用できる。

動物は，最初に免疫化してから数週間後に追加免疫を行
う。１０日〜２週間後，動物から採血し，抗血清を集め
て，力価を分析する。

モノクローナル抗体は，ポリクローナル抗体を形成して
いる動物のＢ−リンパ球と，不死化された骨髄腫細胞系
とを，適切な条件下で融合させることによって，一般に
調製される。Ｂ−Ｕンパ球は，ＶＲ．ｖＡ細胞もしくは
末梢血液のリンパ球であってもよい。融合法は，当該技
術分野で公知であり，般に．細胞をポリエチレングリコ
ールのような融合剤と混合することを包含する。成功裏
にハイブリドーマが生成したことを検定し，例えばＩＩ
ＡＴ培地のような標準法で選択される。成功裏に得られ
たハイブリドーマから．所望の抗体を分泌するものの存
在について培養媒体を検定することによって，所望の抗
体を分泌するものをクリーニングする。

ＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙ＞，　　ＲＩＡ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙ），　　ＩＦＡ法（ｉｍｍｕｎｏｆ　Ｉ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ）およびウエスタン・
プロット分析法のような標準の免疫学的方法は，当該技
術分野では公知であり，　ＰＩＰＶの診断スクリーニン
グに利用できる。

基本的な検定原理の各種改変については，莫大な文献か
現在存在しているが，その検定原理は，単に，標的被分
析物が抗体と特異的に結合しなければならず，その結合
が定性的におよび／または定，量的に検出できるという
ことだけである。螢光，酵素もしくは放射性の標識が一
般に用いられる。

一般的な装置は　ｌｆｉ識をつけた抗原（例えばＦＩＰ
Ｖタンパク）と被分析物との，抗体に対する競合を利用
し，次いで結合画分と未結合画分を物理的に分離する。

被分析物は，標識を付けた抗原の結合に対して競合し，
その結果，多量の被分析物が存在すれば，多量の標識が
未結合画分に残る。競合結合型検定法では，試料は，公
知の力価の標識を付けたＦＩＰＶタンパクとＦＩＰＶタ
ンパク抗体とともに培養される。次いで抗体一タンパク
複合体を，公知の方法を用いて，複合体になっていない
試薬から分離し，複合体化した物質中の標識の量を，例
えばラジオイムノアッセイの場合はガンマ線を計数し，
または酵素イムノアッセイの場合は光度を測定すること
によって測定する。試料中のＦＩＰＶタンパクの量は．
いずれにしろ．標識の測定■と標準曲線との比較によっ
て決定される。この基本原理の他の態様には，ＰＡ識を
つけた抗体そのものの使用；被分析物，抗一被分析物抗
体および抗一抗体間の３系複合体を用い，これら成分の
一つが標識をもっているサンドイッチアッセイ；および
免疫吸着剤を用いて結合画分と非結合画分とを分離する
分離法が含まれる。目視可能な沈澱が生じる凝集検定法
も利用できる（Ｌｉｍｅｔら，　Ｊ　［：Ｉｉｎ　Ｃｈ
ｅｍＣｌｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　　２０．　１４２　〜
１４７　（１９８２）。

さらに，抗血清を，ウィルスの伝染性を中和する能力に
ついて試験する。ＦＩＰＶ読取り枠の産物もしくは機能
が未知の遺伝子に対して生成する抗血清は．免疫応答を
中和する潜在的な標的を同定するのに利用できる。この
中和応答は，このような抗血清を動物検体に注射し，次
いでＦＩＰＶで攻撃して応答を観察することによって検
定できる。

このタンパクもしくはヌクレオチドのプローブは，自然
に感染したＦＩＰＶ疾患のネコを．ザブユニットワクチ
ンで免疫化され，それ故全ＦＩＰＶタンパクに対する抗
血清を産生じないネコから識別する診断手段をも提供す
る。

（以下余白） Ｈ．投与法と製剤法 本発明の方法によって創製された伝染性組換え体のウィ
ルスもしくは細胞系はＦＩＰＶワクチンとして有用であ
る。特に，本発明者らは．　Ｆ［ＰＶのＮタンパクに対
する機能性ＯＮ八挿入部を有するワクシニアウィルスか
らなる生菌ウィルスをネコに接種すると，その後のＦＩ
ＰＶによる攻撃に対して免疫効果があることを例証した
。非構造タンパクのＮＳＩとＮＳ２の一つもしくは両方
を発現する組換え体のウィルスもしくは細胞系をワクチ
ンとして利用して，ネコをＦＩＰＶに対して免疫化する
ことは本発明の範囲内に考慮される。Ｎ，　Ｅｌ．　Ｅ
２．　ＮＳＩおよびＮＳ２のタンパクの組合わせを発現
するか．その組合わせからなる組換え体のウィルスもし
くは細胞系が，ＦＩＰＶワクチンとして使用されること
も考慮されている。本発明のＦＩＰＶワクチンには，上
記のタンパクもしくはタンパクの組合わせ，または上記
定義のその生物学的誘導体の免疫原性ペブチドのセグメ
ントを含有するものが，さらに考慮されている。

ワクチンは種々の経路で投与され得る。例えば，非経口
（皮下．皮膚内，腹腔内，筋肉内，胸骨内など），鼻腔
内エアゾール，または経口による方法がある。予防接種
に用いられる投与量と投与の方法は，動物の年齢と体重
，投与モードおよび処方物中のアジュバントの存在によ
って変えられ得る。個々の投与量は，通常１００ｎｇ＝
　１　ｍｇの範囲内の免疫原である。さらに．１つ以上
のＦ［ＰＶタンパクは，投与用の単一処方物に組合わせ
得る。先に示したように．ワクチン処方物は，免疫応答
を開始させるのに用いるのが好ましく，次に死んだウィ
ルスもしくは亜感染量の生菌ウィルスを注射する。予防
接種は，一般に．一年目およびそれ以上にわたって周期
的に追加免疫の接種を行う。本願で用いる場合，「免疫
原量」という用語は上記のような投与量を含むものとす
る。

以下の実施例は，本発明をさらに例示するものであり，
本発明を限定するものではない。

（実施例） 細胞を形質転換し，ベクトルを構築し，メッセンジャー
ＲＮ＾を抽出し，　ｃＤＮ＾ライブラリーを作製し，免
疫検定を行うなどに用いる技術のほとんどは，当該技術
分野で広く実施されており，ほとんどの当業者は．特定
の条件や方法が記載されている標準法の資料に精通して
いる。実施例は．このような知見に基づいて記載され，
当該技術分野で一般的であると考えられる方法が援用さ
れる。

実施例１ ２つのｃＤＮ＾ライブラリーを，異なるウィルス源から
構築した。第１ライブラリーは．フオート・ドッジ■型
ＦＩＰＶ　（Ｆｏｒｔ　Ｄｏｄｇｅ　Ｔｙｐｅ　Ｕ　Ｆ
ＩＰＶ，　［ｌＩａｃｋ，Ｖｅｔ　　Ｍｅｄ／Ｓｍａｌ
ｌ　　八ｎｉｍａｌ　　Ｃｌｉｎ，　　ｐｐ．８１１〜
８１４．　　１９８０年５月）に感染させた細胞由来の
ポＩＪ　（Ａ）”ＲＮ八を用い，一方第２ライブラリー
は．そのポリ（Ａ）”ＲＮＡ源としてＦ［ＰＶの７９〜
１１４６単離物に感染させた細胞を用いた。二本釦ｃＤ
ＮＡは，　　ＲＮＡｓｅ　Ｈ法の改変法（Ｄ゜＾ｌｅｓ
ｓｉｏら，　Ｆｏｃｕｓ　９　（１）　：　１　〜４　
（１９８７））によって合成された。一般に．この改変
法によって，単一チューブ反応による第１鎖と第２鎖の
ｃＤＮ八の合成が行われる。

第１鎖の合成は．　１０μβの５ｘ反応緩衝液（２５０
ｍＭ｝リスー塩酸緩衝剤ｐＨ　８．　３　；　３７５ｍ
Ｍ　ＫＣｉ７　；　５０ｍＭＤＴＴ　；および１５ｍＭ
　ＭｇＣＩｚ），　２。５μβのｌＯｍＭ　ｄＮＴＰ，
５μβのｌｍｇ／ｒｒＬ！！オリゴーｄＴ，　　２９ｔ
ｔｌのＲＮＡ十水，２．５μｌの４００Ｕ／μｌモロニ
ーウィルス逆転写酵素（ＢＲＬ），　　および１μｆの
ＬＵ／ｔｔｌのＲＮＡｓｉｎ（ＢＲＬ）を用いて行った
。第ｌのｃＤＮＡライブラリーについては，８．４μｇ
のボ！Ｊ　（Ａ）”ＲＮＡを鋳型として用い．そして６
．５μｇのポリ（Ａ）”ＲＮＡは第２ライブラリーを生
成させるのに用いられた。そのＲＮＡは６８℃で３分間
熱処理された後９反応混合物に添加された。反応混合物
を３７℃で１時間インキュベートした。

第２鎖の合成には．４５ｔｔｌの上記ｍＲＮＡ　：　ｃ
ＤＮＡハイブリッド反応混合物を，６４μｌの５ｘ第２
鎖緩衝液（９５ｍＭ　｝リスー塩酸緩衝剤ｐＨ８．３　
；　４５５ｍＭ　ＫＣＩ；２５ｍＭ　ＭｇＣＩｚ　；お
よび２０ｍＭ　ＤＴＴ）　．　６、４ｔｔｌｌの１０ｍ
ＭｄＮＴＰ．　１０μｌの”Ｐ−ｄＣＴＰ，　１６８μ
ｌの水，１６μｌの１　ｍｇ／ｒｎｌ．ＢＳＡ，　　８
　ｐ　ｌのＩＯＵ／μｌＤＮＡポリメラーゼＩ　（ＮＥ
Ｂ）および２　Ｕ／μ１２　ＲＮＡｓｅ　Ｈ　（［ｌＲ
Ｌ）に直接添加した。この反応生成物を，１６℃で２時
間インキコベートシ．次いでＢＤＴＡを５ｍＭ添加する
ことによって反応を停止させた。ｃＤＮＡをフェノール
／［：ＨＣ１．で１回抽出し，次いで［：ＨＣ１３で抽
出し．そしてエタノールで沈澱させた。

次にｃＤＮ八がメチル化され，平滑末端処理されて．Ｐ
ｒｅｓｓ　］の方法によってＥｃｏＲＩＩＪンカーが添
加された。ＥｃｏＲ　Ｉ　　制御酵素で消化した後，　
ｃＤＮ八を，ＢｃｏＲ　Ｉで浄化してホスホターゼで処
理したλｇｔｌＯの両アームに連結した（Ｈｕｙｎｈら
．　　（１９８４），　ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，　　ｖ
ｏｌ．１　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ　（Ｄ，Ｇｌｏｖｅｒ編）．　ｐｐ．４９〜７８．
　　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　オックス７オ−｝’）。

連結混合物を伝染性ファージ粒子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）内に充填し．次いで充填されたファージを，　Ｂ，
ｃｏｌｉ（Ｃ６００　ｈｆｌＡ）上で増殖させた。

第１０ＤＮＡライブラリーを，　「サブトラクテッドブ
ローブ（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ　ｐｒｏｂｅ）」でスク
リーニングした。このブローブは，第１鎖ｃＤＮＡをＦ
ＩＰＶに感染させた細胞由来のＲＮＡから合成し．鋳型
のＲＮＡをＮａＯＨ処理で除き，そして得られたｃＤＮ
Ａを未感染の細胞から調製した過剰のＲＮＡと雑種形成
させることによって生成させた。この雑種形成に続いて
，ｃＤＮ八を，ブローブを煮沸することなしにフィルタ
ーに添加した。ウィルスに特異的でそのため過剰のＲＮ
Ａに結合しないｃＤＮＡだけが，フィルターのプラーク
との結合に利用され得る。

プローブのｃＤＮＡは，１０μｌの５Ｘ反応緩衝液，２
．５μｌｌのｌＯｍＭ　ｄＡＴＰ，　ＴＴＰ，　ｄＧＴ
Ｐ，　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ．５ｔｔｌの”Ｐ−ｄＣＴ
Ｐ，　　５　μｌのＲＮＡｓｉｎおよび２．５ｔｔｌの
モロニーウィルス逆転写酵素（４００単位／μβ，ＢＲ
Ｌから入手）を混合することによって合成された。上記
混合物に，水中のＲＮＡ　（０．５μｇ）を２４μｌト
，６５℃で１５分間加熱した５μｌのランダムプライマ
−（水中で５０ｍｇ／　一，　Ｐｈａｒｍａｃｉａから
人手）とを添加した。反応混合物を３７℃で１時間反応
させ，次いでＢＤＴ八を１０ｍＭ添加して反応を停止さ
せた。

Ｎａ０１１を０．２Ｍ添加し．反応混合物を６５℃で１
時間インキュベートしてＲＮＡの鋳型を加水分解した。

反応液に，トリスー塩酸ｐＨ８を０．２Ｍ添加して中和
し，次いでＩＭＨｃＩを添加してｐ＋を７に調整した。

次に，１０μｇの酵母ｔＲＮＡを添加し，次いでＮＨ．
Ｏ八Ｃを用いてＣＤＮＡを沈澱させた。得られたｃＯＮ
Ａを「サブトラクションＲＮＡ　（ｓｕｂｔｒａｃｔｉ
ｏｎ　ＲＮＡ）　Ｊとバナジルリボヌクレオシド複合体
（ロＲＬから入手したＶＲＣ）を１０ｍＭの最終濃度ま
で添加した水中で可溶化させた。この溶液を，６５℃で
５分間加熱し，次に，雑ａ形成溶液（７５μｆｆｌ（Ｄ
２０ＸＳＳＣ，　　３０μｉ！ノ０．５Ｍ　ＨＢＰＢＳ
ρＨ６．９．　　１２０μβのホルムアミド，１５μｌ
の２００ｍＭ　ＶＲＣ，および６０μｌのサブトラクシ
ョンＲＮＡ，　　ｃＤＮＡおよび水）に添加した。後者
の溶液を一夜４２℃でインキュベ＝トシ．次いでｃＤＮ
Ａをフィルターに添加した。

フィルターを．　　５’Ｘ　ＳＳＰ８．　４０％ホルム
アミド，０．５％脱脂乾燥牛乳，０．１％ＳＯＳおよび
１０μｇ／ｍｌ．のｔＲＮＡの中で，３７℃で一夜雑種
形成させ，　　０．２ＸＳＳＣ内で５０℃にて洗浄した
後，フィルムに暴露させた。

２．ｃＤＮＡの分析 サブトラクテッドプローブで同定された８個のクローン
を，標準の方法に従ってブラークで精製した。ファージ
ＤＮＡを調製し，　［ＥｃｏＲＩによる消化を行った。

最大の挿入部を有する２つのクローンを次の試験をする
のに選んだ。ＦＩＰＶ　＃６ｃ　ＤＮＡは長さが約１．
６ｋｂ　テ．　ＦＩＰＶ　＃９　ｃＤＮＡは約３．ｌｋ
ｂの長さである。

クローン＃６からの最初の配列は，　ＴＧＥＶ配列に対
して相同性を示した。クローン＃９はＴＧＢＶ配列に重
なり，かつ延出しており，　ＦＩＰＶのＮＳＩとＮの遺
伝子の全配列を誘導するために利用された。これらの遺
伝子の配列を第１図に示す。クローン＃９は，Ｅ１遺伝
子の５゛末端まで完全には延出しなかったので．第１０
ＤＮＡライブラリーを．クローン＃９のアミノ末端配列
由来のオリゴヌクレ才チド（５゜−ＴＣＧＴＡＡＧＣＧ
［’ＴＡＧＡＡＣＡ＾−３゛）でスクリーニングした。

そのオリゴヌクレオチドを．標準法にしたがって３２Ｐ
ＡＴＰを用いてキナーゼ処理を行い．次に６ＸＳＳＰＢ
，　　ｌｍｇ／ｍｆヘバリン，０．５％脱脂乾燥牛乳お
よび０．１％ＳＯＳ中で雑種成形を行った。フィルター
を３７℃で一夜雑種形成させ，次いで．　５０℃にてＧ
ｘ　ｓｓｃ内で洗浄してからフィルムに暴露させた。

Ｂｌ配列の５゜末端からさらに２００ｂｐ延出したクロ
ーンを単離した（＄３ａ−２）。このようにして完成し
たＢ１配列を得た。ＦＩＰＶクローン＃９と＃３ａ−２
が，　Ｂｌ遺伝子とＮ遺伝子の全配列をコードするフラ
グメントを生成させるために用いられた。クローン＃３
ａ−２を標準条件下でＢｃｏＲ　ＩとＳｓｐ　Ｉの制限
酵素で消化して，約２００ｂｐのＢｃｏＲ　Ｉ　−Ｓｓ
ｐ　Ｉフラグメントを単離した。クローン＃９を類似の
条件下で，　ＥｃｏＲ　Ｉ　．Ｓｓｐ　ＩおよびＳｐｈ
　Ｉ制限酵素を用いて消化した。約１，　７ｋｂのＳｓ
ｐ　Ｉ　−Ｓｐｈ　Ｉフラグメントを，上記の消化生成
物から単離し，そしてクローン＃３ａ−２から単離した
約２００ｂｐのＥｃｏＲ　Ｉ　−Ｓｓｐ　Ｉフラグメン
トに連結した。Ｂ１遺伝子とＮ遺伝子の全コード配列を
含む上記の連結されたＢｃｏＲ　Ｉ　−Ｓｐｈ　Ｉフラ
グメントを，　ＢｃｏＲＩとｓｐｈ　Ｉで消化させたｐ
Ｕｃ１８にサブクローン化し．得られたクローンをｐＵ
ｃ１８　：　８１−Ｎと命名した。フラグメントの単離
．連結およびブラスミドへのサブクローニングの標準方
法が本実験例を通じて適用された。正し＜　Ｉ！１−Ｎ
の構築が行われているかは，ミニブレップドＤＮＡ（ｍ
ｉｎｉ−ｐｒｅｐｐｅｄＤＮＡ）を増殖させ，次に得ら
れたブラスミドＤＮＡを制限酵素で消化することによっ
てｍ認した。

実施例２ Ｅ２とＮＳ２のｃＤＮＡの単離 Ｉｌｉ２をコードするｃＤＮＡ配列を単離するために第
２ライブラリーを用いた。下記表１に示すオリゴヌクレ
オチドブローブは，　Ｂ２についてすでに刊行されてい
る配列（ｄｅＧｒｏｏｔら，前出）から設計した。

（以下余白） 表ｌ Ｂ２のオリゴ 雑種形成の条件は，オリゴヌクレオチドのスクリーニン
グについて記載したのと同様である。各々．長さ６ｋｂ
のーＮＡ挿入部を有する２つのｃＤＮＡクローンを単離
し，　ＰＢＲ３２９にサブクローン化し，これらをｐ３
２９（８８）　；　Ｅ２＃１およびｐ３２９（８８）　
：　Ｅ２＄２と命名した。後者プラスミドはｐＢＲ３２
９−８２＄２と命名した。ヌクレオチドの配列とサザン
プロット法の実験結果からみて．これらのクローンは．
刊行されたＢ２配列の４６３ヌクレオチドから始まり．
　Ｂ２の末端まで延出し，次いでＮＳ２とＥｌに続いて
いる。

実施例３ ５つの各ＦＩＰｖタンハクをコードするＦＩＰＶ　ｃＤ
ＮＡをもっている組換え体ワクシニアウィルスをＭａｃ
ｋｅｔｔおよびＳｍｉｔｈの（Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ
．　６７　：　２０６７−２０８２．（１９８６）で総
説されている）標準法で生成させた。

この文献を参考として，ここに引用する。第２図に示す
２つの共挿入ベクターのうちの１つくもしくは両者を）
各ｃＤＮ八に用いた。ｐＳ（：１１ベクターは，ｃＤＮ
Ａ挿入部で与えられた八ＴＧを有する単一の平滑末端ク
ローン化部位（Ｓｍａ　Ｉ　）を有する。ｐＵＶＩベク
ターは，多数のクローン化部位を備え，これらはすべて
ワタシニアＰｌｌプロモーターのＡＴＧの後に生成して
いる。それ故に，ずべてのｐＵＶ１−ＦＩＰＶの構築物
には，　ＦＩｆ’Ｖのコード配列が．　ｐｌｌのＡＴＧ
とのフレーム内に位置している必要がある。各構築物の
詳細は次のと右りである。

ｐｓｃ１１−ＮＳ２　： ＮＳ２をコードする配列　（ｎ．ｔ．６４１−８５３）
を，　ｐＳＣ１１のＳｍａ　Ｉ部位にサブクローン化さ
れた，平滑末端Ｘｍｎ　Ｉ　（ｎ．ｔ．５９９）　−Ｐ
ｖｕ　ＩＩ　（ｎ．ｔ，　２１２４）フラグメントとし
て．　ｐＢＲ３２９−Ｂ２＃２から単離した。ｎ，　ｔ
，　６４１に位置するＮＳ２のＡＴＧは，クローニング
部位の３”側に出合う最初の開始コドンである。

ｐ［ＩＶ１−ＮＳ２　： ＮＳ２をコードする配列を，　Ｔｔｈｌｌｌ　Ｉ　（ｎ
，　ｔ，　６４８）−Ｐｖｕ　ＩＩ　（ｎ，　ｔ．　２
１２４）フラグメントとして，　　ｐＢＲ３２９−Ｂ２
＃２から単離した。Ｔｔｈｌｌｌ　Ｉ部位に突き出てい
る単一の塩基対はクレノウ試薬で充填された。ｐＵＶ１
ベクターは，ｆＥｃｏＲＩによる消化とクレノウ試薬に
よる充填によって調製した。次に，平滑末端とされたＮ
Ｓ２フラグメントを．ρ１１の八ＴＧの後（こｐＵＶ１
の平滑末端とされたＢｃｏＲ　Ｉ部位にサブクローン化
した。その結果，　ＰＩＰＶ−ＮＳ２のアミノ末端が，
　　ｒｍｅｔ−ａｓｐ−ｉ１ｅ−ｖａｌ−１ｙｓ−」か
らｒ　ｍｅｔ−ａｓｎ−ｐｈｅ−ｖａ　１−１ｙｓ・・
・」に変化する。この変形残基にはアンダーラインをつ
けている。

ｐｓｃｌ１−Ｂｌ　： Ｂ１をコードする配列（ｎ．ｔ．１９５４−２７３９）
を，クレノウ試薬によってＥｃｏＲ　Ｉ部位を平滑末端
化したＥｃｏＲ　Ｉ（ｎ，　ｔ．　１９２１）−Ｂａｔ
　１　（ｎ，　ｔ，　２７５９）フラグメントとして，
ｐＵ［：１８　：　Ｂ１−Ｎ　（実施例１参照）から単
離した。このＢｃｏＲ　Ｉ部位が第１図の配列に存在し
ないのは，それかもとのラムダクローンの１つ（＃３ａ
−２　；実施例１参照）に存在するリンカ一部位であっ
たからである。この部位の位置は．第１図に’［Ｂｃｏ
ＲＩ］で示してある。平滑末Ｑ％ｆ［ＥｃｏＲ　Ｉ　−
Ｂａｌ　Ｉ　　Ｅｌフラグメントをｐｓｃ１１のＳｍａ
　Ｉ部位にサブクローン化した。

ロ．ｔ．１９５４に位置するＥ１のＡＴＧは，クローニ
ング部位の３゛側に出会う最初の開始コドンである。

ρＳｌｌ−Ｎ　： Ｎをコードする配列（ｎ，　ｔ．　２７５５−３８８５
）を．　　ｐｕｃ１８　：　Ｅｌ−ＮからＭｌｕ　Ｉ　
（ｎ，　ｔ，　２７７３）−Ｓｐｈ　ｒ　（ｎ．ｔ，　
３８９６）フラグメントとして単離した。Ｓｍａ　Ｉ　
−Ｍｌｕ　Ｉリンカーを，５′末端に付加して，Ｓｍａ
ｌクローン化部位を与え，ＮのＡＴＧと．旧ｕＩ部位の
５゛側に生じるコード配列とを元の位置にもどした。Ｓ
ｐｈ　Ｉ　−Ｓｍａ　ｒリンカーを３゛末端に付加した
。得られたＳｍａ　Ｉ　Ｎフーラグメントを．　ｐｓｃ
１１のＳｒｎａ　Ｉ部位にサブクローン化した。

ｐＵＶ１−Ｎ　： ■フラグメントとしてｐ［Ｉｃ１８　：　Ｂｌ−Ｎから
単離した。

１１ｉｎｄｌｌＩ部位は，　　ｐｔｌｃ１８ポＩＪ　Ｉ
Ｊンカー領域によって供給された。この旧ｎｄＩＩＩ部
位はクレノウ試薬に」よって充填された。得られた平滑
末端とされたＮフラグメントを．ｐ１１のＡＴＧの後の
ｐＵＶ１の平滑末端とされたＢｃｏＲ　Ｉ部位にサブク
ローン化した。

このサブクローン化法によって，アミノ酸末端のＮ配列
が，　　ｒｍｅｔ−ａｌａ−ｔｈｒ−ｇｌｕ・４からｒ
　ｍｅｔ−ａｓｎｓｅｒ−ｔｈｒ−ｇｌｕ・・・」に変
化する。その変形もしくは付加残基にはアンダーライン
を付けてある。

ｐｓｃ１１−ＮＳＩ　： ＮＳＩをコードする配列（ｎＪ，　３８９３−４１９５
＞を，Ｓｐｈ　Ｉ　（ｎ．ｔ，　３８９６）−ＢｃｏＲ
　Ｉ　（ｎ，　ｔ，　５１２６）　７ラグメントとして
ｐ６４−ＦｒＰＶ６から単離した。リンカーをそのＳｐ
ｈ　ｒ部位に付加して，　ＮＳＩのＡＴＧを戻し．５゜
ＢｃｏＲ　Ｉクローン化部位を与えた。５′と３′側の
ＢｃｏＲ　Ｉ部位にクレノウ試薬を充填し，平滑末端の
ＮフラグメントをρＳＣｌｌのＳｍａ　Ｉ部位にサブク
ローン化した。

（以下余白） 劇謀Ｌが迂： 上記の（リンカーを付加した後）　ＥｃｏＲＩ　ＮＳＬ
フラグメントを，　ｐＵＶ１のＥｃｏＲ１部位に直接サ
ブクローン化した。その結果，アミノ末端のＮＳＩ残基
が，ｍｅｔ−１ｅｕ−ｖａｌ−ｐｈｅ　＝−“から”ｍ
ｅｔ−ａｓｎ−ｓｅｒ−ｍｅｔ−Ｉｅｕ−ｖａｌ−ｐｈ
ｅ・・・”に変化する。付加した残基はアンダーライン
をしてある。

迎呈Ｌ眺二壮： ＦＩＰＶ　ｃＤＮＡクローンｐ３２９　（８８）　：　
Ｅ２＃２　（実施例２参照）は，　Ｅ２タンパクのカル
ボキシ末端までの約９０％をコードするＥ２配列の３８
９３個のヌクレオチドを有している。この配列は，　ｄ
ｅＧｒｏｏｔらの配列（前記文献）のｎ．ｔ．４６３の
位置に位置するＥｃｏＲ１部位から始まる（Ｅ２タンパ
クの終止コドンは，第１図のｎ，ｔ．５７２に生じる）
。ｐＵＶ１挿入プラスミドの構築は，上記のＥ２配列を
含む３９２１ｎ．　ｔ．ＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩ（第１図
のｎ．ｔ．５９９）フラグメントを精製し，得られたフ
ラグメントを，　ｐＵＶ１ポリリン力一のＥｃｏＲＩ−
Ｓｍａ１部位にサブクローン化する（第２Ｃ図参照）こ
とによって行った。その結果，　Ｅ２タンパク配列がｐ
ｕのＡＴＧとのフレームに位置し，第１残基が″ｍｅｔ
ａｓｎ−ｓｅｒ・・・”になっている。ｄｅＧｒｏｏｔ
らの正しいＥ２配列は″ａｓｎ−ｓｅｒ．．−”残基で
始まる。

郵ｊ上ｔレ ５゜Ｅ２　ｃＤＮＡ配列は，ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓ
ａｋｉら，　１９８８年，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　眺ユヲ
，　４８７−４９１頁，およびＳｔｏｆｌｅｔｃ０．　
１９８８年，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ηユヲ．　４９１−
４９４頁）を利用して，　ＦＩＰＶ１１４６　ＲＮＡ　
（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，　ＡｍＪ　Ｖｅｔ　Ｒｅｓ，　
４５（１２），　２５８０−２５８５頁，　１９８４年
）から生成させた。平滑クローニング部位を，変性して
いないＥ２のＡＴＧの５゛側に構築して．全Ｅ２フラグ
メントが，５”側平滑部位と，　ｐＵＶ１−ＩＥ２　５
’の構築実施例で述べた３”側Ｘｍｎ　ｒ部位とを用い
て，　ｐｓｃ１１のＳｍａ　ｒ部位にプラントすること
ができるようにした。

１刀二肥： 部位試行突然変異誘発法を用いて，　ＥｃｏＲ１部位を
変性していないＥ２のＡＴＧＯ後に挿入して，　ｎ．ｔ
．４６３までの５゜Ｅ２配列を，　ＥｃｏＲＩフラグメ
ントとして単離することが可能になり，次いでこのフラ
グメントをｐＵＶ１−Ｅ２　５’構築物のＥｃｏＲＩ部
位に挿入する。得られた構築物は，　　ｐｌｌ開始コド
ンの後に完全なＥ２配列を有する。そのアミノ末端のＥ
２配列“ｍｅｔ−ｉ１ｅ−ｖａｌ−１ｅｕ−ｖａｌ−・
・”は”ｍｅｔ−ａｓｎ−ｓｅｒ−　１ｅｕ−ｖａｌ・
・・”になる。変異残基にはアンダーラインをしてある
。

実施例３に記載のワタシニア挿入ベクターを用いて，以
下のようにしてＦＩＰＶ−ワタシニア組換え体ウィルス
を生成した。

ＦＩＰＶ−　クシニアウィルス　　え　の６０ｍｍの皿
内のＣＶ−１細胞の集密的細胞単層に，ワタシニアウィ
ルス〔ウィス株（Ｗｙｅｔｈ　ｓｔｒａｉｎ）　］を，
　０．０５ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ｍｏｉニモイ）
で感染させた。感染させてから２時間後，細胞に，　１
０μｇの挿入プラスミドＤＮＡと０．５μｇの野生型ワ
タシニアウィルスロＮ＾をリン酸カルシウム沈降法でト
ランスフェクションさせた。細胞を完全培地に入れ，３
７゜Ｃで２日間インキュベートした。単層を集めて，　
ＴＫ−ワタシニアウィルスを，２５μｓ／ｄの５−プロ
モデオキシウリジン（ＢｕｄＲ）の存在下ＴＫ−１４３
細胞上で選択した。感染させてから４８時間後，単層を
，３００μｇ７ｍｌの５−プロモー４−クロロ＝３−イ
ンドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘｇａｌ）を
含有する１％のアガロースで覆った。４〜６時間後，青
色のプラークを採取し，さらにＢｕｄＲとＸｇａｌの存
在下でプラークの精製を２回追加して行った。ＰＩＰν
−ワクシニア組換え体ウィルスの株をＴＫ１４３，　Ｃ
Ｖ−１　もし《はＶＥＲＯの細胞内に作製した。組換え
体ウィルスＤＮＡを各株から作製し，サザーンプロット
分析した結果，適切なＦＩＰＶ　　ｃＤＮＡ挿入部を有
し，野生型または自然のＴＫ−ワクシニアで汚染されて
いないことが分かった。

定 ＦＩＰＶ　Ｉ型とＦＩＰＶＩＩ型を感染させたＦＣＷＦ
もしくはＣＲＦＫの組織培養細胞由来のＦｉｌ”Ｖ構造
タンパク　（Ｎ，Ｅ１およびＥ２）を特異的に免疫沈降
させたネコの腹水の試薬はすでに同定された。ＣＶ−１
細胞に，ワクシニアーＦｒＰＶのＥｌ，　Ｎ　もしくは
Ｅ２の組換え体を，５〜１０のモイで感染させて（：ｌ
Ｓｓ　）メチオニンで放射能標識をつけると，惑染細胞
溶解物を調製することができ，予想される分子量のＦＩ
ＰＶ特異的ポリペブチドをネコの腹水の試薬で免疫沈降
させることができる（ＰＡＧＥ分析法による）。ＮＳｌ
とＮＳ２との組換え体の場合には，これらのまだ同定さ
れていないＦＩＰＶでコードされたタンパクを認識する
免疫学的試薬は入手できなかった。しかし，　ＮＳＩと
ＮＳ２との組換え体に対してラビットに生じた抗血清は
，　ＦＩＰＶウィルスを感染させた細胞から新規なポリ
ベプチドを特異的に免疫沈降させて，模擬感染させた細
胞からは沈降させないようにするのに用いることができ
る。このようにして非構造組換え体は，　ＦＩＰＶがコ
ードするタンパクを作っていることを証明できる。

上記の組換え体ウィルス株は，生きた免疫原として用い
られるか，またはＦＩＰＶサブユニントタンパクが次に
発現される，感染可能な細胞の単層に感染させるのに用
いられる。次にワタシニアで発現された組換え体ＦＴＰ
Ｖタンパクを含有する単層を採集し，死菌免疫原として
用いるために不活性化する。

特に限定はないが．クランドール（Ｃｒａｎｄａｌｌ）
ネコ腎臓細胞（ＣＲＦＫ），　ウッド（讐００ｄ）のネ
コ細胞系（ＦＣ），ネコ胎児の全胎児（ＦＣＷＦ）　，
犬の腎臓細胞系（ＤＫ）　，マジン・ダービー・キャニ
ン（Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙ　Ｃａｎｉｎｅ）の腎臓細
胞（ＭＤＣＫ）　，ベビーハムスターの腎臓細胞（ＢＩ
ＩＫ）．アフリカ緑ザルの腎臓細胞（ＶＥＲＯ）のよう
な咄乳類の細胞培養物の１００％の集密的細胞単層に，
組織培養惑染量（ＴＣＩＤＳ。）もし《はプラーク形成
単位（ｐｆｕ）で測定して，ウィルス対細胞の比率を１
　：　１０，０００〜１：１０，好ましくは１：５００
０〜１：　１００．　　さらに好ましくは１：ｌ５００
〜１：５００にして，　　ＦＩＰＶ−ワタシニア組換え
体ウィルスを接種した。最適に接種するには，細胞は，
増殖容器内に　接種後約１２〜４８時間以内，好ましく
は２４時間以内に，少なくとも１００，　０００〜１，
０００，０００細胞数／ｃｉ，好ましくは１５０，００
０〜５００，　０００細胞数／Ｃ艷細胞単層を形成する
のに充分な量が存在していなければならない。ウィルス
を，細胞に，２８〜３８゜Ｃにて，少なくとも６０分間
しかし３００分間未満，好ましくは９０〜２４０分間で
吸着させ，次に容器に維持培養液を再供給する。

ＴＣＩＤ，。で測定して少なくとも１０００粒子である
が通常５００　，　０００　，　０００未満で，一般に
５，０００，０００粒子であり，また細胞培養物におい
て８０％を上まわる細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す採集
可能なウィルス力価を，接種してから２４〜９６時間後
に得ることができる。細胞単層を多重凍結融解法で取出
し，超音波処理し次いで不活性化あるいは凍結保存する
。

特殊な例では，１０個の８５０ｃ＋ｆｌのローラービン
すなわちＶＥＲＯ細胞を洗い流し，各ローラービンに，
５．２１１ｏｇＴＣＩＤｓｏ／ｍｊ！の力価を有するＦ
ＩＰＶ−ワタシニアの種を添加した。各ローラービンに
は１５０，０００，０００の集密ＶＥＲＯ細胞が入って
おり．ウィルス対細胞の比率のモイ値は１：１００であ
った。ウィルスを，５０戚のＭＥＭに３時間吸着させ，
次いで維持用のＭＥＭを再度供給した。ウィルス液を接
種してから７２時間後に採集したが，ウィルスの力価は
．　６．２５１ｏｇＴＣＩＤＳ。／成であった。４０　
Ｘ　ＰＥＧで濃縮後（以下参照），ウィルスの力価は８
　１ｏｇＴｃＩＤｓ。７ｍｌであった。

生きた免疫原として使用されるウィルス製剤も，１０ｂ
〜１０’ｐｆｕ／投与の接触濃度を達成するよう濃縮さ
れる。このような粗製ウィルス株は，動物を直接免疫化
するのに用いてもよく，または凍結乾燥し次いで適当な
希釈剤で再構成してもよい。

死んだ免疫原として使用されるウィルス製剤は，不活性
化され，濃縮され，ついで標準のプロトコルでアジュバ
ントが加えられる。

構造上ＦＩＰＶタンパクを発現する安定な細胞系を，８
５０　ｃｉのローラービンに１００％の集密度で増殖さ
せる。細胞が最大密度に達した後．細胞を，凍結融解を
３回行って採集し，ウィルス液について記載したのと同
様にして濃縮する。細胞系の液を不活性化し，濃縮し，
次いで標準のプロトコルを用いてアジュバントを加える
。

プロモエチルアミン臭化水素酸塩の０．２モル溶液と水
酸化ナトリウムの０．４モル溶液とを同体積混合し，約
３７゜Ｃで６０分間培養する。得られた環化不活性化剤
は，パイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）であり，ウィ
ルス液もしくは細胞系液に０．５〜４％（Ｖ／Ｖ）で添
加される。不活性化中のウィルス液もしくは細胞系液は
，周期的に撹拌しながら，４〜３７゛Ｃで２４〜７２時
間保持される。

不活性化されたウィルス液もしくは細胞系液は，細胞培
養を３回行い，特異的ウィルスの増殖量を検査して完全
な不活性化について試験する。

ウィルス　もしくは　　　　の′ ウィルス液もしくは細胞系液は，アミコン（Ａｍｉｃｏ
ｎ）　＋ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）　（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ社）の濃縮装置のような有効な技術；塩化アン
モニウムもしくポリエチレングリコールなどによる沈降
法；カーボワックス液もしくはワックスを用いて透析管
による濃縮法．またはリン酸アルミニウムのようなアジ
ュバント濃縮法のいくつかを用いて，・２〜５０倍濃縮
される。ＰＥＧによる濃縮法では，　８０ｍｌの５０％
ＰＥＧを１２のウィルス液もしくは細胞系液に加え，次
いで一昼夜４゜Ｃで混合する。翌日ＰＥＧ−ウィルス液
を２５０ＯＲＰＭを上まわる回転数で遠心分離し，上澄
液を廃棄し，得られたＰＥＧ−ウィルスのペレットを，
正しい体積培地に再度懸濁させて所望の濃度とする。

ウィルス　もし　は　　　　へのアジュハント以下のア
ジュバントを．動物の皮膚硬化反応とアジュバントの混
合適合性によって，単独もしくは２種以上組み合わせて
用いてもよい。

水中に１％（Ｗ／Ｖ）の濃度で調製した，エチレンマレ
イン酸無水物（ＥＭＡ）を．不活性化したウィルス液も
しくは細胞系液に，　０．０１〜６％（Ｖ／Ｖ）添加し
た（単独もしくは他のアジュバントと組み合わせて濃縮
）。得られた液のｐｌｌを，　ＩＮの水酸化ナトリウム
溶液を添加して７．１〜７．７に調節する。

ネオクリールＡ６４０　（Ｎｅｏｃｒｙｌ　Ａ６４０）
　とは，　（スチレンと，アクリル酸とメタクリル酸と
の混合物との）コポリマーのラテックスエマルジョンの
商品名である。ネオクリールＡ６４０は，スチレンを含
有する，非融合性の水性アクリルコポリマーであり，　
ｐＨは７．５，粘度が１００ｃｐｓ　（Ｂｒｏｏｋｆｉ
ｅｌｄ　２５”Ｃ　）であり，１ガロン当りの重量は，
　４０重量％固形分および３８容量％固形分で供給され
た場合，８．６ポンドである。Ａ６４０という数字はそ
のグレードを示す．他の有用なネオクリールのグレード
は５２０，　６２５および９６６である。以下に用いら
れるｒＣＳＭＡＪという用語はスチレンと，アクリル酸
とメタクリル酸との混合物とのコボリマーを意味する。

５０％（Ｖ／Ｖ）の水中懸濁液として調製されたＣＳＭ
Ａを，不活性化したウィルス液もくしは細胞系液に，０
．２〜１０容量％で，単独もしくは他のアジュバントと
組み合わせて添加する。ＣＳＭＡは中性ｐｌｌであるか
ら一般にｐｌ＋を調節する必要はない。

最近の家畜用製品で（Ｏｍａｋａ，　ＮＥ）＋小動物用
のエマルシゲン（Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ）アジュバントは
，水中油滴型エマルジョンで，ウィルス液もしくは細胞
系液に１〜２０％（Ｖ／Ｖ）で単独もしくは他のアジュ
バントと組み合わせて用いられる。

アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）が，　　５　〜３０ｍ
ｇ／投与で単独もしくは他のアジュバントと組み合わせ
て用いられる。２．４■のアブリジンを１８ｒｎ１の無
水エチルアルコールに溶解し，次に１．８　ｒｄのＴｗ
ｅｅｎ−８０を添加し，得られた混合物を０．２　ミク
ロンフィルターで濾過する。次に２０．２ｄの脂質内大
豆油を上記のアブリジンに無菌で添加する。次いで，こ
のアジュバントを，ウィルス液もしくは細胞系液に７〜
５０％（Ｖ／Ｖ）で添加する。

サポニンが，　０．０１ｍｇ〜５■／投与の量で単独も
しくは他のアジュバントと組み合わせて使用される。サ
ポニンは．　２００　ｍｇ／ｍｆｌの濃度で調製され，
フィルター滅菌され．次にウィルス液もしくは細胞系液
に，　０．０１〜５０％（Ｖ／Ｖ）で添加される。

０．０１〜５■／投与のリン酸アルミニウムまたは０．
５〜２０■／投与の水酸化アルミニウムも，単独もしく
は他のアジュバントと組み合わせて用いられる。

ＩＬ！ｆ２２とウィルスの１殖！音上 ワクチン製造時に，細胞を，ビタミン類，非必須アミノ
酸，ピルビン酸ナトリウム１　重炭酸ナトリウムおよび
Ｌ−グルタミンを補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で
増殖させた。３０μｇ／ｍβのゲンタマイシンを，上記
培地に，防腐剤として添加し，ウシ血清を，細胞増殖の
ために１０％まで，維持培地として１％まで添加した。

，ｕｉ！ｉ　Ｍり−６１− ネコによる一　　二　クチンの 予防接種されたネコに対する病毒性ＰＩＰＶの攻撃の効
果を観察することによって，効力もしくは免疫防御性を
評価しうる。免疫化させたネコの免疫状態評価する際に
，血清中のサブユニット特異的抗体もしくは中和抗体の
力価を決定することはほとんど価値がない。従来，特異
的抗体の力価と，防御性との間には相関がなかった。実
際に，（中和性もしくは非中和性の）高力価のＦＩＰν
特異的抗体をもったネコは，一般にウィルスの攻撃によ
り病気にかかりやすくなったり，疾病に敏感になり病状
が悪化しやすい。しかし，免疫化したネコの血清学的プ
ロフィルを得ることは，特にＦＩＰＶ　Ｉ型ＦＩＰＶｎ
型間の交差防御性を評価する際に有用である。ネコにワ
クチンの試験を実施する方法は次のとおりである。

ネコは，３週間の間隔をあけて０日目と２１日前に候補
のワクチンを１　ｍｌ投与量ずつ２回予防接種される。

不活性化ワクチンの場合，アジュバントが，各投与量の
ｌＯ〜５０％を占める。不活性化ワクチンは筋肉内に投
与される。生ワクチンは，乱切法，筋肉内法などで投与
される。予防接種されたネコと対照のネコは，３５日目
に，経口／鼻腔内ルートで，　　１　：ｉｏ，ｏｏｏに
希釈されたＦＴＰＶ７９−１１４６　（７）５　ｍｌで
攻撃され，熱と腹水について監視される。

３５日目の攻撃された日から，研究が終わるまで，ネコ
は，ネコどうしが接触しないように別々のかごにいれて
ある。ネコは，　　０，　　７，　１４，　２Ｌ　２Ｂ
３５，　４２，　４９，　５６，　７０．　７？．　８
４，　９Ｌ　１０５および１１２日目に，■型と■型に
対するＩＦＡ，　　Ｉ型と■型に対するＳＮ，ならびに
抗ＦＩＰνサブユニット（タンパク，またはワクチンの
組合せによる）の抗体の測定用に採血した。生き残った
被検体に対する第２の攻撃は，第１の攻撃をしてから５
〜６週間後に行った。

（以下余白） 表２ ワクチン 死亡率 各カテゴリーのランキングは，連続する相対順位で決定
した。例えば最低の死亡率，死亡開始前の期間が最長の
もの，および防御性が最大のものにはｌのランクを与え
た。合計のランクは．各カテゴリーの個々のランクを合
計して計算した。

平均のランクは．カテゴリーの合計数の３で割り算する
ことによって計算した。

ｌ》死亡率／日は，死亡率対攻撃後の日数のプロットの
直線回帰分析によって得られた直線の勾配から決定した
。

２）死亡開始の日は．攻撃後の日数対死亡率の直線回帰
分析によって生成したＹ軸の切片から決定した。

“Ｆ［ＰＶタンパク”という用語は．一般にＩ　Ｎｌ　
ロｌ，ＮＳＩおよびＮＳ２から選択された各タンパクを
含めて包括的な意味で用いられる。実施例７と８の診断
検定法に上記タンパクのいずれも用いることができる。

実施例７ 実施例５のＦＩＰＶタンパクを，標準のタンパク精製法
を用いて精製する。５ｍｇの精製Ｆ［ＰＶタンパクを．
２段階の工程でカルボジイミドを用いて，キーホール・
リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合させる。タ
ンパクと５ｍｇのカルボジイミド゛とを．１艷のｌｍＭ
ＨｃＩ中で，４℃にて１５分間インキュベートする。９
−の１　ｍＭ　ＮａＯＨ（２５℃）を上記混合物に添加
し．次いで５■のＫＬ｝ｌを添加する。反応混合物を一
夜２１℃で振盪し，次いで１０ｍＭ　ＮａＨ−ＰＯ．，
１５０　ｍＭ　ＮａＣ１　（ｐＨＴ．　４）に対して２
日間透析する。得られたＦＩＰＶタンパク／ＫＬＨ接合
体を，４：６の比率で．完全７口イントアジュバントを
用いて乳化させ．　２５０ｌｉｇのタンパクを，　５ｋ
ｇの雄のダッチベルテッドラビットの，皮下の多数の部
位または直接鼠膜部のリンパ節に注射する。これらラビ
ットの後足に，３週間後，同じ製剤１．Ｍ，を注射して
追加免疫を行う。ｌＯ日後，動物から採血し，抗血清を
収集して分析する。標準のエンザイムーリンクドイムノ
ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ法）　（Ｂ．Ｅｎｇｖ
ａ　ｌ　Ｉ，　Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ，　１０９：１２９
　（１９７２））を用いて，抗タンパクと対照の抗血清
とが種々の抗原に結合する性質を試験する。

７Ｂ．放射線免疫検定法 実施例５のＦＩＰＶタンパクを，梗準の方法を用いて精
製し，標準のプロトコルを用いて下記のようにしてヨウ
素化する。Ｉｏｄｏｇｅｎ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌＣｏ，　＄２８６６６）をクロロホルムに溶解
して１０μｇ／ｍｅの濃度とし，その１６０ｄを．１２
Ｘ７５のガラス管に入れ．乾燥窒素流下で蒸発させる。

６０扉の０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．　２）を
前記ガラス管に添加する。精製ＦＩＰＶタンパク（一般
に３■）をガラス管に添加して混合する。Ｎａ＋２５１
の２倍モル過剰量を添加して反応を開始させる。１５分
間，室温でインキュベートした後，６０扉の０．１％の
メタ重亜硫酸ナトリウムと３０Ｊｉ１．の０．　１ｍＭ
のヨウ化カリウムを添加して反応を停止させる。得られ
た反応混合物を，　Ｇ−５０セファデックス力ラム（ロ
．■一の吸着床容積，リン酸緩衝塩水で平衡化する）に
移し入れて．通過液を収集する。ＴＣＡ沈澱性カウント
数（Ｔ［：Ａ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｂｌｅ　ｃｏｕｎｔ
ｓ）を測定し，その放射リガンドを−７０℃で貯蔵する
。

放射線免疫検定法については，　Ｆ［ＰＶの．精製タン
パク標準品またはネコ由来の白血球溶解物の試料１００
扉をレプリケートガラス管に小分けする。

各管に．　１５０ｃｐｍ／ｍを含むように希釈されたヨ
ウ素化ＦＩＰＶタンパク（前記のようにして調製したも
の）の３００ｄと．前記７Ａ項で調製し１／３０００に
希釈されたポリクローナルＦＩＰＶ抗体１００Ｊｉを添
加する。全試薬は，　ＲＩＡ緩衡液（５０ｍＭリン酸ナ
トリウムｐｔｌ？，　４　．　　５　ｍＭ塩化ナトリウ
ムおよび２ｍＭアジ化ナトリウム）で希釈される。得ら
れた反応混合物を．一夜室温でインキコベートする。翌
日，　ＲＩＡ緩衝液で１／１０に希釈されたヤギ抗ラビ
ッ｝　Ｉｇ６　　２００μを，反応混合物に加え．一夜
室温でインキコベートする。次の日，各管を４００Ｏｒ
ｐｍで３０分間遠心分離し，上澄み液を吸引し，得られ
たペレットをガンマーカウンターでカウントした。カウ
ント数の多い試料は．その中心にごく少量のＦＩＰＶの
タンパクしか含有していないが，一方．カウント数の少
ない試料はかなりの量のＦＩＰＶタンパクを含有してい
る。所望により，標準曲線を描いて，それを試料中のＦ
ＩＰＶの量を決定するのに用いることができる。

実施例８ 実施例５のＦＩＰＶタンパクを，標準のタンパク精製法
を用いて精製する。８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを．必
要に応じて接合させ．アジュバントで乳化させた精製Ｆ
ＩＰＶタンパクのｉｏｏ．を皮下注射および腹腔内注射
して免疫化する。マウスは，充分な抗血清の力価が達成
されるまで．２〜３週間の間隔で，５０ｌｌｇのＦＩＰ
Ｖタンパクとアジュバントで追加免疫化を行う。最後の
追加免疫を行ってから３日後，マウスを殺し．胛臓を取
出す。その肺臓を，　Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｍａｎら，　
　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ，　　５＋　
　２６３〜２６９　　（１９７９）に記載された　（ａ
　２＋と血清を含有しない培地（ＣＳＦ）中ですすぎ．
単一細胞懸濁液を調製する。得られたｇ濁液をｌ０００
Ｘｇで１０分間遠心分離し（ロｅｃｋｍａｎＴＪ−６）
　，得られたペレットを，３０−のＣＳＦ中で３回洗浄
する。

並行して．２Ｘｌ０５細胞数／ｍｌ．の密度まで増殖さ
せたＳＰ２／０骨髄腫細胞１００ｍｊｌ！を．　１００
０ＸｇでｌＯ分間遠心分離にかけて採集する。２Ｘ１０
’の全細胞ペレットを３０ＩｎＩ！ＣＳＦで３回洗浄し
．再度ペレット化する。最後に，上記のようにして得た
膵臓細胞と，　ＳＰ２／０骨髄腫細胞を合わせて遠心分
離によってペレット化する。ＣＳＦ中３７％（Ｖ／Ｖ）
の濃度のポリエチレングリコール（ＰＢＧ，　ＭＷ＝１
５００．　Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔしａｂｏｒａｔｏｒ　
ｉｅｓ，ハーバーヒル．英国》　１−を，上記の混合し
たべレフトに．９０秒間かけて，融合を促進するため連
続的に攪拌しながら添加する。次に１０ｍｌ！のＣＳＦ
を徐々に添加することにより上記のＰＢＧを希釈し．細
胞を再ベレット化し．　ＣＳＦ中で洗浄する。得られた
細胞のペレットを｝ＩＡＴ選択培地中で再懸濁させる。

この培地は，　ＲＰＭ１　１６４０　．　２０％ウシ胎
児血清．ヒポキサンチン，アミノプテリンおよびチミジ
ンを含有する化ｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，　Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１４５：７０９（１９６４））。得られた細胞を．
１０Ｘ９６ウエルのマイクロタイタープレートにプレー
トし．７％ｃｏ２雰囲気中３７℃でインキュベートした
。骨髄腫細胞は．　｝ＩＰＲＴ酵素を欠いているので．
ｐｍ細胞（この酵素を有している）とうまく融合したＳ
Ｐ２／Ｏ細胞だけが．前記の選択培地中に生存する。細
胞には，次の１０日間に２回．選択培地が再供給される
。

培養物が，マイクロタイターウエル表面の７５〜１００
％を覆う細胞密度に到達した後に，そのハイブリドーマ
からの培地を，固定プレート結合検定法（ｉｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄ　ｐｌａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ
）　（Ｒ，　Ｈ．　Ｋｅｎｎｅｔｔら編集，　　Ｍｏｎ
ｏｃ１ｏｎａｌ　＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９８０）．
　　ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ニューヨーク》を用いて
，抗ＦＩＰＶ抗体の存在に対してスクリーニングする。

５０ｍＭの重炭酸ナトリウム（１１１８．３）で希釈し
た精製ＦｆＰＶタンパクの１■を，フレキシブルマイク
ロタイタープレートのウエルでインキュベートする。３
７℃で３時間インキュベートした後．ウエルを洗浄し．
Ｔグロブロリンを含有しない２０％のウマ血清を添加し
て，非特異的タンパク結合部位をふさぐ。ハイブリドー
マを含有するウエルからの培地を加え，そのウエルを３
７℃で２時間インキュベートし，特異的な抗ＦＩＰＶ抗
体と結合させる。そのウエルを再度洗浄した後，そのウ
エル中で１２５１ヒツジ抗マウスＩｇＧを３７℃で２時
間インキュベートすることによって．特異的に結合した
モノクローナル抗体を検出する。

洗浄したウエルをプレートから切取り，結合した放射能
をカウントする。対照の結合量の３倍もしくはそれを越
える比率を陽性とみなす。ハイブリドーマが分泌するＦ
ＩＰＶ特異的抗体をサブクローン化シ．プロテインＡセ
ファロースによって，分泌されたモノクローナル抗体の
生産と精製のために増殖させる。

上記８Ａ項で調製したモノクローナル抗体を１０ｐｇ／
ｍｌ含有する５０ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．
３＞の１００ＪＩＩ！づつで，９６ウエルマイクロタイ
タープレートの各ウエルを被覆する。３７℃で９０分間
．または４℃で１８時間インキ二ベートを行い，ウエル
を緩衝液Ａ（この緩衝液Ａは．１％卵アルブミンと０．
１％トウィーン２０を含有するリン酸緩衝塩水である）
で４回洗浄する。ネコの白血球の溶解物（１：ＩＯに希
釈）もしくは精製ＦＩＰＶタンパクの標準品を９０〜９
５扉の緩衝液八に添加し，前記ウエルを．この混合物と
ともに室温で９０分間インキュベートする。ウエルを緩
衝液八で再度４回洗浄し．上記実施例７Ａで調製したラ
ビット抗ＦＩＰνの緩衝液八で１／５０００に希釈した
希釈液１００４で処理する。室温で９０分間保持した後
．各ウエルを緩衝液Ａで再度４回洗浄する。この洗浄後
，ヤギ抗ラビッ｝ＩｇＧベルオキシダーゼ接合体（Ｃｏ
ｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の緩衝液Ａによ
る１／３０００希釈液１００ＡＩｆ！．を各ウエルに添
加し，そのプレートを上記のようにしてインキュベート
して洗浄する。２００Ｊ１１の基質（０−フェニレンジ
アミン十■２０２含有のクエン酸リン酸緩衝液，ｐ｝１
５）を各ウエルに加えて，結合した抗体を検出する。３
０分後．５０４の４Ｎ硫酸を添加して呈色反応を停止さ
せる。４９０ｎｍ波長光の吸光度をＢＬＩＳＡ読取り装
置で読取る。溶解物中のＦＩＰＶタンパクの濃度は，標
準曲線と比較して決定する。

本発明を実施する上記態様を変更したもので．免疫学，
組換えＤＮＡ技術および／または獣医学の分野の当業者
にとって自明なものは，上記の特許請求の範囲に含まれ
るものとする。

（発明の要約） 本発明は．ネコ伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ）に対
する動物のＱ露あるいはＦＩＰＶに対する感受性を診断
するために有用な手段を提供する。この診断手役は，構
造ＦＩＰＶタンパク及び非構造Ｉ’ｌＰＶタンパクをコ
ードする核酸列と，　ＦＩＰＶタンパクに対して生成さ
れる抗体とを包含する。ＦＩＰＶタンパクはサブユニッ
トワクチンとしても有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は．　ＮＳ２．　（Ｅｌ，　ＮおよびＮＳｌの各
ペブチドのヌクレオチドの配列と推定アミノ酸の配列を
示す図である。各種のタンパクをコードする遺伝子，の
特異的ＤＮＡ配列は次のとおりである。ＮＳ２＝６４１
〜８５３ヌクレオチド；Ｂｌ　＝　１９５４〜２７３９
ヌクレオチド；Ｎ＝２７５５〜３８８５ヌクレオチド；
およびＮＳ１＝３８９３〜４ｌ９５ヌクレオチドである
。 第２図は．共挿入ベクターであるｐｓｃ１１とｐＵＶ１
を表わす図である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｅ１、Ｎ、ＮＳ１、およびＮＳ２からなる群から選
   択されるネコ伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ）の構造
   タンパクまたは非構造タンパクをコードする、単離され
   た、クローン化組換え体の、もしくは合成の核酸配列。 ２、ＦＩＰＶのＥ１基質糖タンパクをコードする、請求
   項１に記載の核酸配列。 ３、ＦＩＰＶのＮ核タンパクをコードする、請求項１に
   記載の核酸列。 ４、ＦＩＰＶのＮＳ１タンパクをコードする、請求項１
   に記載の核酸配列。 ５、ＦＩＰＶのＮＳ２タンパクをコードする、請求項１
   に記載の核酸配列。 ６、発現の制御配列に作動可能に連結されている、請求
   項１〜５のいずれかに記載の核酸配列。 ７、前記制御配列が、ヒトＭＴ−１１プロモーター、ヒ
   トβ−アクチンプロモーター、およびワクシニア由来の
   制御配列の少なくとも１つを有する、請求項６に記載の
   核酸配列。 ８、請求項６の核酸配列で形質転換された組換え体宿主
   細胞。 ９、請求項８の形質転換細胞を、タンパクの発現に適し
   た条件下で培養すること、および発現されたタンパクを
   回収することを包含する、ＦＩＰＶタンパクの製造方法
   。 １０、Ｅ１、Ｎ、ＮＳ１、およびＮＳ２からなる群から
   選択されるネコ伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ）の構
   造タンパクまたは非構造タンパクの核酸配列によってコ
   ードされる、単離されたタンパク。 １１、請求項１０のタンパクに対する抗体。 １２、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ）に対する
   ネコ被検体の曝露を診断する方法であって、（ａ）被検
   体の血清試料を、標識されたＦＩＰＶポリペプチドと共
   にインキュベートすること；および（ｂ）標識されたＦ
   ＩＰＶポリペプチドと抗血清との間で免疫複合体が形成
   されているかどうかを決定すること； を包含する診断方法。 １３、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ）に対する
   ネコ被検体の曝露を診断する方法であって、（ａ）被検
   体の細胞溶解物試料を、ＦＩＰＶ抗体と共にインキュベ
   ートすること：および （ｂ）細胞溶解物とＦＩＰＶ抗血清との間で免疫複合体
   が形成されているかどうかを決定すること；を包含する
   診断方法。