KR20030052858A - 곤충세포 발현 재조합 3ａｂｃ 비구조단백질 항원 및단클론항체를 이용한 구제역 진단방법 - Google Patents
곤충세포 발현 재조합 3ａｂｃ 비구조단백질 항원 및단클론항체를 이용한 구제역 진단방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구제역 바이러스(Foot-and-Mouth Disease Virus; FMDV) O/SKR/2000 유래의 곤충세포 발현 재조합 3ABC 비구조단백질(Non-Structural Protein; NSP) 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 구제역의 진단방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 구제역 바이러스의 3ABC 비구조단백질을 코딩하는 유전자를 곤충세포에서 발현시켜 제조한 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 제조하여 이를 이용한 효소결합면역측정법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)을 실시함으로써 백신접종축과 야생감염축을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 구제역의 진단방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 구제역 바이러스(Foot-and-Mouth Disease Virus; FMDV) O/SKR/2000 유래의 곤충세포 발현 재조합 3ABC 비구조단백질(Non-Structural Protein; NSP) 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 구제역의 진단방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 구제역 바이러스의 3ABC 비구조단백질을 코딩하는 유전자를 곤충세포에서 발현시켜 제조한 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 제조하고 이를 이용한 효소결합면역측정법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)을 실시함으로써 백신접종축과 야외감염축을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는 구제역의 진단방법에 관한 것이다.
구제역(Foot-and-Mouth Disease)은 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 동물(우제류)에 감염되는 전염성이 매우 강한 질병으로, 최근 영국을 비롯하여 전세계적으로 발생하고 있는 질병이다. 감염 초기에는 입술, 혀, 잇몸, 코,발굽 사이에 수포가 생기고 체온이 급격히 상승하며 식욕이 저하되다가 결국 급성폐사에 이르게 된다. 구제역 바이러스는 치사율이 55%에 이르는 국제수역사무국(OIE) 분류 A급 질병으로서, 우리나라에서도 제 1종의 가축전염병이다. 특히, 구제역 바이러스에 대한 감수성 동물이 많고, 바이러스형이 많으면서도 서로간의 교차반응이 일어나지 않아, 신속한 진단 및 처치가 없으면 축산업에 막대한 피해를 준다. 따라서, 구제역 발생국의 경우 무역규제 대상국가가 되므로 구제역은 국가 경제에 막대한 피해를 일으키는 바이러스이다.
구제역에 대한 최초의 발병보고는 1514년 이태리의 수도승 히로니머스 프래카스토리우스(Hironymus Fracastorius)에 의하여 베로나(Verona) 지역의 소에서 발생하였으며, 전염성이 강한 질병으로 기록되어 있다.
뢰플러(Loeffler)와 프로쉬(Frosch)에 의하여 1897년 최초로 발견된 구제역 병인체인 구제역 바이러스(Foot-and-Mouth Disease Virus; FMDV)는 미생물 분류상 피코르나바이러스과(Family Picornaviridae), 아프토바이러스속(Genus Aphthovirus)에 속하고, O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1 등 7개 타입의 주요 혈청형이 있으며 70여 종의 아형이 알려져 있다. 구제역 바이러스는 약 7,800개의 염기로 구성된 (+) 단쇄 RNA 바이러스로서, pH7.4∼pH7.6에서는 안정하나, pH6 이하의 산성 또는 pH9.5 이상의 알칼리 조건에서는 급격히 파괴된다. 구제역 바이러스는 뉴클레오캡시드(neucleocapsid)를 구성하는 네 개의 주요한 구조단백질(Structural Protein; SP) VP1, VP2, VP3 및 VP4를 갖고 있으며, 중화항체의 생산을 유도하는 최소한 4개 이상의 주요 항원결정기(epitope)를 갖고 있음이 알려져 있다. 이 구조단백질 외에 감염세포내에서 주로 발현되는 폴리펩티드로 바이러스 증식에 보조적인 기능들을 수행하는 것으로 알려진[Gene,(1994)12(16):6587-6601] L, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D와 같은 비구조단백질(Non-Structural Protein; NSP)도 갖고 있다. 본 발명의 국내발생 구제역 바이러스 O/SKR/2000 역시 상기 구제역 바이러스의 일반적 특징을 공유하며 7813base의 염기로 구성된 바이러스이다.
한편, 구제역 바이러스를 세포배양한 후 뉴클레오캡시드인 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 상층액에서 정제하고 농축한 후 백신으로 사용하는 경우, 이에 대한 특이항체는 생산되나, 비구조단백질은 백신접종축에서는 검출되지 않고 야외감염축에 한하여 뉴클레오캡시드 단백질 생성으로부터 2∼5일 이후에 검출되는 것으로 보고되었다[Vaccine, (1998)16(5)446-459;Arch Virol, (1997)142:2021-2033;Arch Virol, (1998)143:1461-1476;Arch Virol, (2000)145:473-489]. 즉, 현재 사용중인 구제역 예방백신은 바이러스 입자만을 정제한 후 사용하고 있어, 감염세포내에서 발현되는 비구조단백질은 함유하고 있지 않아 백신을 접종한 동물에서는 비구조단백질에 대한 항체가 생기지 않게 된다. 이러한 점 이외에도, 비구조 단백질은 구조단백질에 비해 훨씬 변이가 적어 여러 혈청형에서 동일한 항원 결정기를 가지고 있다는 장점 때문에, 구제역 비구조단백질을 베큘로바이러스 또는 기타 대장균 발현 시스템에서 발현시켜 이용함으로써 다양한 혈청형에서의 감염축 확인은 물론, 구제역 예방백신 접종축과 야외감염축을 감별할 수 있는 방법에 대한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다.
현재 구제역 바이러스의 진단법으로는 수포액, 수포형성 상피세포 또는 인후두부위 채취액 등을 검사시료로 하여 세포배양을 이용한 구제역 바이러스의 분리, 중합효소연쇄반응(PCR)법을 이용한 구제역 바이러스 특이 유전자 검출법 및 항원검출용 보체결합반응 또는 ELISA 검사법 등이 이용되고 있으며, 가검 동물의 혈액을 채취하여 혈청내에 구제역 바이러스에 대한 항체가 형성되었는지의 여부를 검출하는 항체 검사용 ELISA 검사법, 항체 중화시험 등도 이용되고 있다. 면역학적인 원리를 이용한 이와 같은 방법들은 빠른 시간내에 많은 수의 시료를 검색할 수 있다는 면에서 매우 유용하지만 불완전하여 보완이 절실히 필요하며, 구제역 야외감염축과 백신접종축을 정확하게 감별할 수 있는 국제적으로 공인된 검사방법은 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 특별한 기술없이 단시간내에 수행가능하고 특이성 및 민감성이 높은 진단법으로 알려진 효소결합면역측정법을 이용한 구제역의 진단방법에 대해 연구한 결과, 구제역 바이러스 혈청형에 따라 항원결정기의 변이가 심한 구조단백질 대신에 서로 다른 혈청형에서도 일정한 항원결정기를 갖는 3ABC 비구조단백질 코딩 유전자를 베큘로바이러스 발현 시스템에서 발현시켜 제조한 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 ELISA법으로 구제역을 진단할 경우, 백신접종축과 야외감염축을 손쉽고 정확하게 감별할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 곤충세포 발현 재조합 구제역 바이러스 3ABC 비구조단백질 항원 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 작성하고 이를 이용한 ELISA를 실시함으로써 특별한 시설 및 기술없이 구제역 야외감염축과 백신접종축을 감별하여 진단할 수 있는 구제역 진단방법을 제공하는데 있다.
도 1은 국내 발생 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 유전자 염기 서열이다.
도 2는 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 3ABC 비구조단백질 유전자가 클로닝된 베큘로바이러스의 발현 벡터 작성 모식도이다.
도 3은 유전자 재조합 베큘로바이러스에서 발현된 재조합 3ABC 비구조단백질을 구제역에 감염된 소의 혈청을 이용하여 형광 항체법으로 검출한 사진이다.
도 4는 웨스턴블럿팅(Western blotting)법으로 재조합 3ABC 비구조단백질을 확인한 사진이다.
레인 M : 단백질 분자량 크기 마커
레인 1∼2 : 재조합 3ABC 비구조단백질
도 5A는 구제역 바이러스 재조합 3ABC 비구조단백질을 이용한 본 발명 효소결합면역측정법(ELISA)의 수행 모식도이다.
도 5B는 본 발명 구제역 진단 플레이트상의 물질 반응 관계를 보여주는 개략도이다.
도 6A는 재조합 3ABC 비구조단백질과 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 본 발명 효소결합면역측정법(ELISA)의 수행 모식도이다.
도 6b는 본 발명 구제역 진단 플레이트상의 물질 반응 관계를 보여주는 개략도이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 구제역 진단방법은 곤충세포에서 발현된 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 ELISA법으로 구제역 바이러스에 대한 항체를 검출하여 구제역을 진단함을 특징으로 한다.
본 발명의 "3ABC 비구조단백질"은 구제역 바이러스 게놈상의 3A, 3B, 3C를 코딩하는 유전자가 통합 발현되어 나타나는 비구조단백질을 의미한다.
본 발명의 방법에 의하여, 구제역 바이러스에 대한 감염 여부의 진단은 보다 신속하고 정확하게 수행될 수 있으며, 특히 비구조단백질 항원을 검출에 이용함으로써 구제역 백신접종군과 야외감염군의 감별이 가능해진다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
효소결합면역측정법을 이용한 본 발명 구제역 진단방법은,
(1) 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 세척하여 제거하는 단계;
(3) 상기 (2)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;
(4) 상기 (3)에서 재조합 3ABC 비구조단백질 항원에 결합하지 않은 가검 혈청을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 효소, 방사선물질, 또는 형광물질 등이 부착되어 있고 상기 (3)의 가검 혈청 중의 구제역 바이러스에 대한 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;
(6) 상기 (5)에서 결합하지 않은 콘쥬게이트를 세척하여 제거하는 단계;
(7) 콘쥬게이트에 결합된 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고; 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계;
를 포함하여 구성되는 ELISA법으로 수행함을 특징으로 하는 구제역 진단방법이며, 상기의 과정은 도 5A에 모식화하였다. 이러한 ELISA법에 사용되는 실험과정, 시약 및 반응조건은 종래 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다.
상기의 방법 이외에도, 효소결합면역측정법을 이용한 본 발명 구제역 진단방법은;
(1) 3ABC 비구조단백질에 대한 단클론항체를 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계;
(3) 상기 (2)의 플레이트에 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 반응시키는 단계;
(4) 상기 (3)에서 부착되지 않은 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 상기 (4)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;
(6) 상기 (5)에서 제조합 3ABC 비구조단백질 항원에 결합하지 않은 가검 혈청을 세척하여 제거하는 단계;
(7) 효소, 방사선물질, 또는 형광물질 등이 부착되어 있고 상기 (5)의 가검 혈청 중의 구제역 바이러스에 대한 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;
(8) 상기 콘쥬게이트에 결합된 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고; 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계;
를 포함하여 구성되는 ELISA법으로 수행함을 특징으로 하는 구제역의 진단방법이며, 상기의 과정은 도 6A에 모식화하였다. 이러한 ELISA법에 사용되는 실험과정, 시약 및 반응조건은 종래 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다.
상기 방법의 단클론항체를 사용한 효소결합면역측정법은 항원에 특이적인 단클론항체를 작성하여 사용하기 때문에 그 민감도 및 정확도가 매우 뛰어나며, 항원으로 사용한 3ABC 단백질이 구제역 바이러스의 7가지 혈청형에 관계없이 공통으로 발현되는 비구조단백질이기 때문에 이를 항원으로 이용할 경우 각기 다른 혈청형의 구제역 바이러스에 대한 감염여부에 대하여 신속한 진단이 가능하다는 이점이 있다. 또한, 비구조단백질 항원에 대한 항체는 백신접종축에서는 발현되지 않고 야외감염된 경우에 한하여 발현되기 때문에 이를 이용할 경우 백신접종축과 야외감염축을 정확하게 감별할 수 있는 이점이 있다. 특히, 비구조단백질중 3ABC 단백질은 구제역 바이러스에 의한 야외 감염동물에서 강한 면역반응을 유도하는 것으로 보고되어 있다[Vaccine, (1998) 16(5)446-459].
본 발명에서는 한국에서의 구제역 검역을 효과적으로 수행하기 위하여, 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 유전자를 획득하고(Gene Bank Access number AF377945), 이 유전자를 주형으로 한 PCR을 실시하여 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 3ABC 비구조단백질 유전자를 획득하였다.
한국산 구제역 바이러스 O/SK/2000 유래의 재조합 3ABC 비구조단백질의 발현을 위하여, 상기 유전자를 대장균 또는 곤충세포 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 발현 벡터, 제한효소, 시약 및 반응조건은 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다.
3ABC 비구조단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 대장균 또는 곤충세포에서 발현시켜 구제역 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 작성할 수 있다.
대장균 발현 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 일반적인 동물에 면역하고 이로부터 분리한 면역 세포를 계속적인 세포증식을 위한 암세포종과 융합시킴으로써 하이브리도마 세포주를 작성하고 이로부터 발현되는 재조합 3ABC 비구조단백질 특이 단클론항체를 작성할 수 있다. 상기 하이브리도마는 당업계에 통상적인 방법에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 특이 단클론항체를생산하는 하이브리도마 세포주의 예로는, 생명공학 연구소 유전자은행에 2001년 12월 14일자로 기탁된 3F-11(KCTC 10138 BP)가 있다.
이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함됨을 밝혀둔다.
실시예 1 : 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 유전자 획득 및 서열분석
본 발명의 국내분리 구제역 바이러스 O/SKR/2000는 국내 감염우의 타액 및 조직에서 추출한 것을 사용하였고, 베큘로바이러스는 아우토그라파 캘리포니아 뉴클리어 폴리 헤드로시스 바이러스[Autographa californica nuclear polyhedrosis virus DNA (AcNPV, Clontech)]를 사용하였으며, 재조합 바이러스는 스포도프테라 프루지페라 [Spodoptera frugiperda; Sf-9 (Invitrogen)] 세포주에서 배양하여 사용하였다. Sf-9 세포주는 10% 태아송아지혈청 (Fetal Calf Serum; FCS)과 안티바이오틱-안티마이코틱(Antibiotic-antimycotic, Gibco)을 첨가한 그레이스 배지(Grace's media)에서 24∼27℃ 저온 항온기에서 배양한 후 사용하였다.
국내 발생한 감염우의 타액이나 수포액 혹은 상피조직을 균질화한 다음 구아니디움 티오시아네이트(guanidium thiocyanate;GTC)를 함유한 용해 완충액(lysis buffer) 0.9㎖에 0.1㎖의 비율로 혼합하였다. 10분간 상온에서 실리카(silica)로흡착한 다음 원심분리하여 상층액을 버리고 GTC를 함유한 세척액과 에탄올, 아세톤의 순서로 펠렛을 세척한 다음 56℃에서 건조시켰다. 이후에 RNase 억제제를 첨가한 정제수를 넣고 65℃에서 5분간 열을 가하여 RNA를 용출하였다.
상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 추출한 상기 RNA를 역 프라이머와 혼합하여 5분간 끓인 후, 즉시 얼음에 넣고 5분간 냉각시켜 10,000rpm에서 1분간 원심분리 하였다. First-strand cDNA는 1㎍의 전체 RNA, 40unit RNAsin (Promega), 50mM Tris-HCl pH8.3, 3mM MgCl2, 75mM KCl, 10mM DTT, 0.4mM dATP, 0.4mM dCTP, 0.4mM dTTP, 0.4mM dGTP 및 역 프라이머를 20㎕의 반응액에 넣고 42℃에서 2분간 반응시킨 다음, 2000unit의 역전사 효소(SUPERSCIPT II RNase H-Reverse Transcriptase, Gibco-BRL)를 첨가하여 42℃에서 50분간 반응시켜 합성하였다.
PCR 프라이머는 유전자 은행[O1Kaufbeuren,Nucleic acid Res.,14(16) 6587-6601 (1984)]에서 검색한 구제역의 유전자 서열을 참고로 하여 작성하였다. cDNA는 상기 합성된 프라이머와 Tag polymerase(Takara)를 사용하여 Gene Amp PCR system 9600(Perkin Elmer)에서 95℃에서 5분간 변성(denature)시킨 후 50∼58℃ 1분, 72℃ 2∼5분, 92∼94℃ 1∼5분씩 30∼35회 순환 반응시킨 다음 50∼58℃ 1∼5분, 72℃ 2∼5분간 반응하여 증폭하였다. PCR을 이용하여 증폭된 DNA 단편은 제한효소 처리없이 바로 pGEM-T Easy 벡터(Promega)에 클로닝하였고, 염기서열 분석법은 디데옥시-체인 dye terminator cycle sequencing-kit(PE-Bio-system)을 이용하였으며, 반응 후 유전자 자동염기서열분석기(ABI)를 사용하여 분석하였다. 뉴클레오티드 서열은 양 방향으로 2∼3회 실시하여 판독하고 Gene Bank에 Access number AF377945로 등록하였다. 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 염기 및 아미노산 서열 판독 결과를 도 1에 나타하였다.
실시예 2 : FMDV O/SKR/2000의 3ABC 비구조단백질 발현을 위한 재조합 베큘로바이러스 발현 벡터의 작성
상기 판독한 FMDV O/SKR/2000의 염기서열(도 1 참조)을 주형 DNA로 하여 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 3ABC 비구조단백질을 코딩하는 419개의 아미노산 유전자 부위를 5' 말단에 단백질 발현코돈인 NcoI 제한효소 부위 즉, 단백질 발현에 필요한 ATG를 함유한 프라이머(5'-CCATGGTGTCGAGCCACATTTTCAA-3', Bioneer)를 이용하여 PCR로 증폭하였다(서열 번호 1). 증폭된 DNA를 pGEMT-Easy 벡터(Promega)에 클로닝한 다음 NcoI와 Klenow 효소를 차례로 처리한 후 EcoRI을 처리하여 클로닝 벡터를 준비하였다. 한편, pBacPAK9 벡터는 BamHI 처리 후 Klenow 효소를 처리하여 정제한 다음 다시 EcoRI로 처리하고 상기의 클로닝 벡터와 라이게이션(ligation)하여 재조합 곤충세포 발현벡터인 pBacBAK9 NSP를 작성하였다. 재조합 발현벡터는 pBacPAK9 벡터 내 NSP의 EcoRI 제한효소작용 부위의 후반에 위치한 XbaI 작용 부위의 정지 서열(stop sequence, 5'-tcTAGa-3')에서 NSP 단백질 발현이 종료하게끔 작성하였다. FMDV O/SKR/2000의 3ABC 비구조단백질 유전자가 클로닝된 재조합 베큘로바이러스 발현벡터 pBacBAK9 NSP의 작성과정을 도 2에 나타내었다.
실시예 3 : 재조합 베큘로바이러스 작성
제 1단계. 공동형질감염(cotransfection)을 통한 재조합 베큘로바이러스의 작성
크론텍(Clontech,USA)사의 BacPAK6 베큘로바이러스 DNA 0.5㎍(Bsu36I 처리), 상기 재조합 베큘로바이러스 발현벡터 pBacPAK9 NSP의 플라즈마 DNA 5㎍이 포함된 무혈청 그레이스 배지 100㎕ 및 동량의 리포펙틴(lipofectin, 0.1㎎/㎖, Gibco)을 혼합하여 공동형질감염 혼합물(cotransfection mixture)을 제조한 후 실온에서 15분간 방치하였다. 이를 35㎜ 페트리디쉬에 미리 준비된 Sf-9 세포(1.5x105cells)에 첨가하여 25∼27℃에서 5시간 배양한 상층액을 제거한 후 10% FCS(Fetal Calf Serum)가 함유된 새 그레이스배지를 5㎖ 첨가하고 27℃에서 4∼6일간 배양한 후 세포변성효과(CPE)가 관찰될 때 수확하여 재조합 베큘로바이러스를 작성하였다.
제 2단계. FMDV O/SKR/2000 3ABC 비구조단백질 발현 재조합 베큘로바이러스의 확인
상기 재조합 베큘로바이러스로 3일간 감염시킨 Sf-9 세포를 100% 냉아세톤으로 10분간 고정한 후, FMDV에 야외감염된 소의 양성혈청 및 FITC conjugated anti-bovine Ig(KPL)를 반응시킴으로써, 특이반응을 나타내는 재조합 3ABC 비구조단백질의 발현을 형광항체법으로 검출하여 확인할 수 있었다(도 3). 이렇게 확인된 본 발명 재조합 베큘로바이러스를 O/SKR/2000 NSP로 명명하였다.
실시예 4 : 곤충세포 발현 재조합 3ABC 비구조단백질 제조
정상 Sf-9 세포를 음성 대조군으로 하여 상기 본 발명 재조합 베큘로바이러스 O/SKR/2000 NSP를 감염시킨 Sf-9 세포의 추출액을 SDS-PAGE하였다. 전개된 겔을 니트로셀룰로오스 필터에 전이한 후 본 발명에서 자체 제조한 단클론항체인 3F-11을 이용하여 재조합 FMDV인 O/SKR/2000 NSP가 재조합 3ABC 비구조단백질을 생성함을 확인하였다. 재조합 3ABC 비구조 단백질의 분자량은 약 45-48kDa로 확인되었다(도 4).
실시예 5 : 단클론항체 작성을 위한 잡종세포(hybridoma)의 생산
제 1단계. 면역
대장균에서 발현한 재조합 3ABC 비구조 단백질 항원을 인산 완충액(PBS; Phosphate Buffered Saline)으로 희석(200㎍/250㎕)한 후 인컴플리트 프로운드 에쥬벤트(Incomplete Freund's Adjuvant)와 1:1의 비율로 균질하게 섞어서 7주령 발브시 마우스(Balb/c mouse)의 발바닥에 0.05㎖씩 접종하였다.
제 2단계. 세포의 융합
상기 면역 후 14일 째에 마우스로부터 양쪽 슬와림프절을 무균적으로 채취하여 마쇄한 후 무혈청 배지(SFM, Serum Free DMEM)로 세척하여 림프구만을 회수하였다. 림프구와 종양세포(SP2/O-Ag14 mouse myeloma cell line)를 5:1의 비율로 섞은 후 PEG 1500(50%)를 사용하여 융합을 실시하였다. 융합 후 HAT(hypoxanthine aminopterin thymidine) 증식배지(SFM에 10% FBS 함유)에 부유시킨 후 피더(feeder)세포가 들어 있는 96공 마이크로플레이트(96well microplate)에 100㎕씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다. 피더 세포는 동종 마우스의 복강에서 대식세포(macrophage)를 HAT 증식배지로 수거하여 융합 하루 전날 배양한 후 사용하였다.
제 3단계. 잡종(hybrid) 세포의 선택
잡종 세포가 증식한 배양 상층액을 수거하여 간접 ELISA 방법으로 스크리닝을 실시하여 양성을 보이는 잡종 세포를 well당 1∼0.5개의 세포가 포함되도록 희석한 후 세포 집단을 형성할 때까지 약 2주일간 배양하였다. 구제역 재조합 3ABC 비구조단백질 항원에 대한 항체를 생성하면서 단 하나의 클론(Clone)만을 형성한 세포 집단을 선발하여 배양용 플라스크(Culture Flask)에 대량배양한 후 동종 발브시 마우스에서 선발된 잡종 세포에 접종하여 복수를 생성하여 이를 실험에 사용하였다. 본 실험에서 선발된 구제역 비구조단백질 항원 특이 단클론 항체 생산 세포주의 특성은 표 1과 같다.
| 원인체 | 면역 항원 | Isotyping | 응용범위 |
| 구제역 O1국내 발생 O/SKR/2000주 | 대장균 발현재조합 3ABC비구조단백질 | IgG2bκor λ chain | 효소면역법(ELISA),형광항체법(FA),면역크로마토그래피법(Immunochromatography) 등 |
실시예 6 : 재조합 3ABC 비구조단백질을 이용한 효소결합면역측정법
상기 실시예 4에서 제조한 곤충세포 발현 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 이용한 효소결합면역측정법을 실시하였다.
상기 재조합 구제역 바이러스 베큘로바이러스 O/SKR/2000 NSP를 감염시킨 세포 파쇄액을 8M Urea 코팅 완충용액으로 각각 200배로 희석하여 이뮤노플레이트(Nunc사)에 100㎕씩 분주한 후 4℃에서 16시간 정도 흡착하였다. 가검 혈청을 1% 세포 파쇄액이 포함된 계면활성제인 트윈을 함유한 인산완충용액(Phosphate buffered saline containing Tween 20, PBST)에 100배 희석한 후 30분간 상온에서 흔들어주며 흡착시킨다. 냉장 보관된 플레이트를 PBST로3회 세척하고 흡습지에 깨끗이 털어준 후 앞서 희석한 혈청을 시료당 재조합 세포 파쇄액이 코팅된 웰에 2 반복, 대조군으로 정상 바큘로바이러스를 감염시킨 세포 파쇄액이 코팅된 웰에 2 반복으로 하여 각 웰에 100㎕씩 분주하였다, 이때 양성혈청과 음성혈청을 모든 플레이트에 함께 반응시켜 평가 기준으로 삼았다. 플레이트를 20∼22℃에서 30분간 방치한 후, PBST로 3회 세척하고 흡습지에 깨끗이 털어준 후 퍼옥시다아제가 결합된 콘쥬게이트를 스킴밀크가 5% 포함된 PBST에 3000배 희석하여 웰당 100㎕씩 분주하였다. 20∼22℃에서 30분간 방치한 후 PBST로 3회 세척하고 ABTS(2.2'-azino-di[3-ethyl-benzthiazolineslfonate], Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. 1 component)를 웰당 100㎕씩 분주하고 22℃에서 30분간 가볍게 흔들어 주며 발색시켰다. 30분 후에 1% SDS액을 100㎕ 첨가하여 반응을 정지시킨 후 ELISA 판독기를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 7 : 재조합 3ABC 비구조 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 효소결합면역측정법
상기 제조한 단클론항체를 코팅 완충용액으로 3,000배 희석한 다음 냉장 조건에서 하루동안 방치하였다. PBST로 5분간 3회 세척한 후 블러킹 용액을 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 다시 PBST로 세척한 후 항원으로 준비된 세포펠렛을 파쇄하여 10배의 희석배수로 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이때 -70℃에 보관된 세포 펠렛을 Tris 완충용액(Nacl, EDTA, PMSF, NP40 등을 함유)에 희석시킨 후 초음파기로 세포를 파쇄하고 원심분리를 12,000rpm에서 5분간 실시한 다음 상층액만을 취하여 이를 항원으로 사용하였다. 항원을 반응시킨 후 세척하고 가검혈청과 표준혈청을 100㎕씩 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 세척하고 콘쥬게이트를 반응시켰다. 세척 후 페옥시다아제의 기질로 TMB(3,3',5,5'-tetramethylben-zidine; KPL, 1component)를 넣고 30분 후에 반응정지 용액을 첨가한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
베큘로바이러스 발현시스템을 이용한 효소결합면역측정법의 상기 본 발명의구제역 바이러스 항체 진단법과 미국과 이태리에서 입수한 3ABC 진단법의 구제역 비구조단백질 항체 검출 효율을 다음과 같이 비교하였다.
비교예 1. FMDV 재조합 3ABC 비구조단백질을 이용한 효소결합면역측정법 비교
초기 스크리닝 단계에서 미국산 NSP ELISA를 적용하였을 때, 청정 지역과 백신 접종지역의 개체에서 50% 이상의 양성반응을 보인 개체를 대상으로 이태리 ELISA와 본 발명 ELISA를 비교하였다(표 2). 발생 농가에서의 개체에 대한 양성 일치율이 92%이고 백신 접종 개체와 청정지역에서의 특이도는 본 발명의 검사법이 49/50(98%)이고 이태리 ELISA는 48/50(96%)으로 검사 효율에 있어서 동등함을 입증하였다. 발생 지역 개체의 양성 일치율은 12/13(92%), 비감염 지역 개체 음성 일치율은 47/48(98%)이다.
| 지역 | 계 | 본 발명 ELISA | 이태리산 ELISA(검사결과 일치갯수) | ||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | ||
| 구제역 감염지역 | 15 | 12 | 3 | 13(12) | 2 |
| 구제역 청정 지역 | 2 | 0 | 2 | 0 | 2(2) |
| 백신접종지역 | 48 | 1 | 47 | 2 | 46(45) |
비교예 2 . FMDV 재조합 3ABC 비구조단백질 및 단클론항체를 이용한 효소결합면역측정법 비교
1. 청정지역과 백신접종지역 개체의 경우 미국 ELISA에서 양성으로 나온 개체 (실제로는 중합효소결과를 토대로 볼 때 음성으로 판정된 것임)를 대상으로 본 발명의 ELISA와 이태리 ELISA를 수행한 결과, 각각 41/45(91%) 및 44/48(92%)의 음성 결과가 나타났다.
| 지역 | 양성 판정의 개수/시험 혈청 갯수 | ||
| 미국산 ELISA | 본 발명 ELISA | 이태리산 ELISA | |
| 실험 접종 | 2/2 | 2/2 | 2/2 |
| 구제역 감염 농가 | 17/54 | 14/54 | 13/37(17) |
| 구제역 청정 지역 | 4**/197 | 0/101(2)* | 0/2(2)* |
| 백신 접종 지역 | 50**/4898 | 4/173(43)* | 4/52(46)* |
| [주] * : 미국 ELISA 적용 결과 양성의 개수** : 프로방 시료를 이용한 연쇄 중합효소반응을 실시한 결과 음성으로 판정됨 |
2. 미국산 NSP ELISA와 본 발명의 ELISA를 비교한 바, 음성 혈청으로 판정된 백신접종개체군과 청정지역개체군에 있어서 본 발명의 검사법은 262/266(98.5%), 미국산 ELISA는 221/266(83%)의 결과를 나타내었다. 본 발명의 검사법이 특이도 면에서 우수함을 확인할 수 있었다.
| 지역 | 시료수 | 본 발명 ELISA | 미국산 ELISA(검사결과 일치갯수) | ||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | ||
| 구제역 감염지역 | 54 | 14 | 40 | 17(13) | 36(36) |
| 백신접종지역 | 172 | 4* | 168 | 43*(3) | 129(128) |
| 구제역청정 지역 | 94 | 0 | 94 | 2* | 92(92) |
| [주] * : 프로방을 통한 연쇄중합반응을 실시한 결과 음성으로 판정됨 |
3. 이태리에서 입수한 ELISA와 비교한 바, 발생 농가에서의 개체에 대한 양성 일치율이 92%이고 백신접종개체에서의 특이도는 본 발명 검사법이 45/49(92%)이고 이태리 ELISA는 46/49(94%)이며 음성 일치율은 93.5%로 나타났다.
| 지역 | 시료수 | 본 발명 ELISA | 이태리산 ELISA(검사결과 일치갯수) | ||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | ||
| 구제역 감염지역 | 37 | 14 | 23 | 13(12) | 24(22) |
| 백신접종지역 | 49* | 4 | 45 | 3(1) | 46(43) |
| [주] * : 49두 중 43두에서 미국산 NSP ELISA을 적용한 결과 양성을 나타내었으나,프로방을 통한 연쇄중합효소반응을 실시한 결과 음성으로 판정됨 |
이상의 실시예 및 비교예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 개발한 구제역 바이러스 유래의 곤충세포 발현 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 구제역의 진단방법은 구제역 백신접종축과 야외감염축을 유의성 높게 감별할 수 있으며, 구제역 바이러스의 모든 혈청형의 공통부위인 비구조단백질을 이용하기 때문에 각 혈청형에 대해서 한번의 검사로 판정이 가능하므로 보다 간편하고 신속하게 이용할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로,백신접종 정책을 실시하고 있는 지역에서의 가축사후관리 및 구제역 예방 및 확산 억제에 기여하며, 구제역 바이러스를 신속하게 진단할 수 있는 진단 킷트가 개발되어 있지 않은 국내 축산업 및 진단키트수출산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (10)
- 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 3ABC 비구조단백질을 코딩함을 특징으로 하는 서열 번호 1에 기재된 유전자.
- 상기 제 1항 기재의 한국산 구제역 바이러스 O/SK/2000 유래의 3ABC 비구조단백질 코딩 유전자를 곤충세포 발현 벡터에 클로닝하여 작성함을 특징으로 하는 곤충세포 발현 재조합 벡터.
- 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 3ABC 비구조단백질 코딩 유전자를 클로닝하여 작성한 상기 제 2항 기재의 곤충세포 발현 재조합 벡터를 공동형질감염시켜 작성함을 특징으로 하는 곤충세포 발현 재조합 베큘로바이러스.
- 상기 제 3항 기재의 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시켜 발현함을 특징으로 하는 곤충세포 발현 재조합 3ABC 비구조단백질.
- 대장균 세포에서 발현한 재조합 3ABC 비구조단백질을 동물에 접종하고 이로부터 채취한 면역 세포를 암세포와 융합하여 제조함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주 3F-11 (KCTC 10138 BP).
- 상기 제 5항 기재의 하이브리도마 세포주로부터 발현됨을 특징으로 하는 3ABC 비구조단백질 특이 단클론항체.
- 구제역 바이러스 유래의 비구조단백질 항원을 이용한 구제역 진단방법에 있어서,(1) 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;(2) 상기 (1)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;(3) 효소, 방사선물질, 또는 형광물질 등이 부착되어 있고 상기 (2)의 가검 혈청 중의 구제역 바이러스에 대한 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;(4) 콘쥬게이트에 결합한 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고, 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.
- 구제역 바이러스 유래의 비구조단백질 항원 및 이에 대한 단클론항체를 이용한 구제역 진단방법에 있어서,(1) 3ABC 비구조단백질에 대한 단클론항체를 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;(2) 상기 (1)의 플레이트에 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 반응시키는 단계;(3) 상기 (2)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;(4) 효소, 방사선물질, 또는 형광물질 등이 부착되어 있고 상기 (2)의 가검 혈청 중의 구제역 바이러스에 대한 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;(5) 상기 콘쥬게이트에 결합된 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고; 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.
- 제 7항 또는 8항에 있어서, 상기 재조합 3ABC 비구조단백질이 제 4항 기재의 곤충세포 발현 재조합 3ABC 비구조단백질임을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.
- 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 3ABC 비구조단백질에 대한 단클론항체가 상기 제 6항 기재의 대장균 발현 재조합 구제역 3ABC 비구조단백질 특이 단클론항체임을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-0082976A KR100430934B1 (ko) | 2001-12-21 | 2001-12-21 | 곤충세포 발현 재조합 3ａｂｃ 비구조단백질 항원 및 단클론항체를 이용한 구제역 진단방법 |
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