KR100522086B1 - 아프리카 마역 바이러스의 ｖｐ7 항원 및 그에 대한모노클로날 항체를 이용하는 아프리카 마역의 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아프리카 마역 바이러스를 검출하여, 아프리카 마역을 진단하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아프리카 마역바이러스에 감염된 혈청 내에 존재하는 VP7에 대한 항체를 아프리카 마역바이러스의 VP7 항원 및 상기 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 이용하는 ELISA법으로 아프리카 마역 항체를 검출함으로써, 아프리카 마역을 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

아프리카 마역 바이러스의 ＶＰ7 항원 및 그에 대한 모노클로날 항체를 이용하는 아프리카 마역의 진단방법{A method for diagnosing African Horsesickness using VP7 antigen of African Horsesickness Virus and monoclonal antibody }

본 발명은 아프리카 마역 바이러스를 검출하여, 아프리카 마역을 조기에 진단하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아프리카 마역바이러스에 감염된 혈청 내에 존재하는 VP7 항원에 대한 항체를 아프리카 마역 바이러스의 재조합 VP7 항원 및 상기 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 ELISA법으로 검출하여 아프리카 마역 바이러스를 검출함으로써, 아프리카 마역을 조기에 진단하는 방법에 관한 것이다.

아프리카 마역(African Horse Sickness ; AHS)은 아프리카 마역 바이러스 (African Horse Sickness Virus ; AHSV)에 의해 발생하는 가축성 질병으로서, 1719년에 남아프리카에서 처음 발견되었으며, 주로 아프리카 지역에서만 발생하였으나, 중동(1959-1961) 및 유럽(스페인; 1966, 1987-1990, 포르투갈; 1989)에서도 발견된 보고가 있다.

아프리카 마역 바이러스는 주로 말, 당나귀, 노새 등을 감염시키며, 쿨리코이데스 종(Culicoides species)의 모기에 의하여 전파되는 것으로 알려져 있지만, 동물에서 동물로 직접 전염되지는 않는다. 아프리카 마역에 걸린 가축에서 나타나는 주요증상은 고열, 호흡 촉박, 폐염 증상, 기침이며, 폐 및 피하의 부종을 일으키는 경우나 코에서 거품을 나타내는 경우도 있다. 잠복기는 7∼9일이며, 치사율은 감염 바이러스의 독성에 따라 90-25%의 범위를 나타낸다.

아프리카 마역 바이러스는 미생물 분류학적으로 리오비리데과(Family Reoviridae), 오비바이러스속 (Genus Orbivirus)에 속한다. 또한, 아프리카 마역 바이러스는 9개의 혈청형으로 구분되며, 그들 게놈의 일반적인 구조를 보면 10개의 이중나선 RNA 조각들로 이루어져 있고, 7개의 구조 단백질(VP1∼7)과 3개의 비구조 단백질(NS1, NS2, NS3)로 이루어져 있다. 이중에서, VP2와 VP5는 외부 구조 단백질이고, 혈청형 별로 특이적인 구조를 나타낸다. VP1, 3, 4, 6 및 7은 내부 구조 단백질이며, 이중에서 VP3과 VP7이 주된 내부 구조 단백질을 구성한다.

국내에서는 상기의 질병이 현재까지 확인되어 있지 않기 때문에, 해외전염병으로 구분되어있다. 현재 개발된 치료제는 없고, 아프리카 마역의 유입을 방지하기 위하여, 그의 감염지역으로부터 말 수입이 우선적으로 금지되어야 한다. 감염이 빈번한 지역에서는 감수성 동물인 말, 당나귀에 대한 예방접종을 실시하여야 한다. 또한, 감염지역으로부터 질병의 전파매개체인 모기의 유입에 대한 구제도 예방대책으로서 수행되어야 한다.

따라서, 이러한 아프리카 마역의 유입을 방지하기 위해서는, 필수적으로 말 수입시 아프리카 마역 바이러스를 조기에 진단하여, 예방대책을 수립하는 것이 필요하다.

아프리카 마역 바이러스를 검출하기 위한 방법에는, 크게 항원을 진단하는 방법과 항체를 검출하는 방법으로 대별한다. 항원을 진단하는 방법에는 폴리클로날 항체 혹은 모노클로날 항체를 이용한 효소면역검사법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay : ELISA), 효소중합연쇄반응법(Polymerase chain reaction; PCR) 및 세포배양을 통한 바이러스 분리 혹은 마우스에 접종하여 바이러스를 분리하는 방법 등이 알려져 있다.

그러나, 현재 국제적으로 아프리카 마역 바이러스에 대한 표준 진단법이 개발되어있지 않는 상태이고, 다만 국제적인 표준 혈청을 가지고서 여러 실험실에서 아프리카 마역 바이러스의 항원과 항체를 검출하기 위한 연구를 수행한 결과, 항원 검출을 위한 간접 샌드위치 ELISA 방법 (J. Virol. Methods, 31, 285-292, J. Virol. Methods, 38, 229-242)과 항체를 검출하기 위한 간접 혹은 경쟁적인 ELISA 방법(Epidemiol.Infect., 104, 303-312)이 개발되었다(Arch. Virol (suppl.), 14, 311-315). 그러나, 간접 샌드위치 ELISA 방법의 경우, 직접 바이러스를 갖고 실험을 수행하기 때문에 실험자의 주의를 요하며, 위험 부담이 따른다. 그러므로, 아프리카 마역 바이러스의 여러 유전자중에서 중화항원을 나타내는 부위만을 선택적으로 발현하여, 항체 검출을 위한 ELISA에 적용한다면, 상기의 문제점을 해결할 수 있다. 따라서, 아프리카 마역 바이러스의 아홉 가지의 혈청형들 중에서 가장 공통적인 부위를 나타내는 VP7 유전자만을 재조합 단백질로 만들어 ELISA에 적용하여 항체 진단법으로 사용하기도 하였다(J. Virol. Methods, 45, 179-188). 그러나, 상기 방법은 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원을 ELISA 검출용 플레이트에 직접 부착시키고, VP7에 대한 항체를 포함하는 혈청을 직접 반응시키기 때문에, 비특이적인 결합의 발생으로 부정확한 결과가 얻어지며, 정확한 항체가의 측정이 어려워진다. 따라서, 아프리카 마역 바이러스를 보다 정확하고 신속하게 검출하여, 가축에게서 아프리카 마역의 감염을 정확하게 진단하기 위한 새로운 ELISA 방법에 대한 요구가 당업계에서 지속되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 아프리카 마역 바이러스를 보다 정확하고 신속하게 검출하기 위한 새로운 방법을 개발하기 위해 많은 연구를 수행한 결과, 아프리카 마역바이러스의 재조합 VP7 항원 및 상기 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 ELISA법을 수행함으로써, 아프리카 마역 바이러스를 정확하고 신속하게 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 아프리카 마역 바이러스감염를 정확하고 신속하게 검출하기 위한 ELISA법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 ELISA법에 사용하기 위한 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma) 세포를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 아프리카 마역 바이러스항체의 검출방법은, 아프리카 마역에 감염된 가축의 혈청 중에서 아프리카 마역 바이러스 VP7 항원에 대한 항체를 ELISA법으로 검출하는데 있어서, 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원에 대한 특이적인 모노클로날 항체와 아프리카 마역 바이러스 재조합 VP7 항원을 사용함을 특징으로 한다.

상기의 방법에 의해서, 아프리카 마역 바이러스감염의 검색은 보다 신속하고 정확하게 수행될 수 있으며, 이러한 검출을 통해 아프리카 마역의 정확한 조기진단이 가능해 진다.

여기에서, '항체검출용 항원'이라는 용어는, 검사시료 중의 항체에 결합할 수 있는 항원을 의미하며, 통상적으로 ELISA용 플레이트의 각 웰에 상기 항원검출용 항원을 코팅함으로써, 항체 검출을 위한 ELISA법이 수행된다.

이러한 항체검출용 항원으로는, 국제적인 표준 항원을 이용할 수도 있으며, 도 2에 기재된 서열 및 그의 유사서열을 다양한 발현시스템들 중에서 임의의 하나를 선정하여 제작한 재조합 항원을 이용하여도 된다. 예를 들면, 도 2에 기재된 서열을 바큘로바이러스 발현시스템을 이용하여 재조합 시킨 항원을 이용할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

종래의 ELISA법을 이용하여 항체를 검출하는 방법은, 도 6A에서 보는 바와 같으며,

1) 항체검출용 항원을 고형지지체에 부착시키는 단계;

2) 검출하고자 하는 항체를 포함하고 있는 시료를 상기 단계 1)의 항체검출용 항원과 반응시키는 단계;

3) 효소, 방사선물질 또는 형광물질 등이 부착되어 있고, 상기 단계 2)에서 항체검출용 항원에 결합된 항체에 결합할 수 있는 이차항체를 부가하여 상기 단계 2)의 항체와 반응시키는 단계;

4) 이차항체에 결합된 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발생반응 등을 확인하고; 형광물질인 경우, 형광강도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 시료 중의 항체량을 측정하는 단계;

를 포함한다. 이러한 종래의 ELISA법에 사용되는 실험과정, 시약 및 반응조건에 대해서는 당업계에 통상적으로 알려져 있다.

본 발명에 따른 ELISA 방법은, 아프리카 마역 바이러스항체를 검출하여 아프리카 마역을 진단하기 위해서, 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체에 와 아프리카 마역 바이러스 재조합 VP7 항원을 사용함을 특징으로 한다.

즉, 본 발명에 따른 방법은,

1) 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 고형지지체에 부착시키는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 고형지지체에 부착된 모노클로날 항체에 VP7 항원을 결합시키는 단계;

3) VP7 단백질에 대한 항체를 포함하고 있는 시료를 상기 단계 2)의 VP7 항원과 반응시키는 단계;

4) 효소가 부착된 콘쥬게이트 항체(conjugate antibody), 방사선물질이 부착된 콘쥬게이트 항체 및 형광물질이 부착된 콘쥬게이트 항체 등의 당업계에서 통상적으로 이용되는 이차항체(secondary antibody)를 상기 단계 3)의 항체와 반응시키는 단계;

5) 시료 중의 항체량을 정량하는 단계;

를 포함함을 특징으로 한다. 이러한 방법에 대해서는 도 6B에 나타내었다.

여기에서, 단계 5)의 항체량 정량방법은 당업계에 통상적으로 알려져 있으며, 간단히 설명하면, 이차항체에 결합된 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 반응 등을 확인하고; 형광물질인 경우, 형광강도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 항체량의 정량을 수행할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 방법은 각 단계의 반응을 수행한 후, 반응에 참여하지 않은 잔여물은 당업계에 통상적인 방법을 이용하여 제거하는 단계를 선택적으로 더 포함할 수 있으며 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원은, 9종의 모든 아프리카 마역 바이러스에서 종간 변이 없이 공통적으로 발현되는 내부구조 단백질로서, 본 발명의 방법은 이러한 VP7 항원에 대한 항체를 검출함으로써, 그 바이러스의 혈청형 종류에 상관없이, 아프리카 마역의 감염을 정확하고, 신속하게 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에서 사용하는 VP7 항원은 통상적인 방법으로 천연에서 분리할 수 없으므로 아프리카 마역 바이러스의 VP7 유전자 부위를 클로닝한 후, 선택적으로 재조합 유전자를 구축하고, 이를 곤충세포 발현시스템에서 발현시켜 제조한 재조합 VP7 항원을 이용할 수 있다. 그러나, 여기에만 한정되지 않고, 당업계에 공지된 재조합 단백질의 발현시스템을 모두 이용할 수 있으며, 예를 들면 대장균 발현시스템, 효모 발현 시스템 등을 이용하여 재조합 VP7 항원을 제조할 수 있다.

한편, 본 발명의 방법은, 아프리카 마역에 감염된 가축의 혈청 중에서 아프리카 마역 바이러스 VP7 항원에 대한 항체를 ELISA법으로 검출하는데 있어서, 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체와 아프리카 마역 바이러스 재조합 VP7 항원을 사용함을 특징으로 한다. 이러한 모노클로날 항체의 사용으로, 야외혈청에 적용시 문제시되는 비특이적인 결합에 의한 결과의 오진 가능성을 최소화시킬 수 있다. 즉, 항체검출용 항원으로 모노클로날 항체에 결합된 재조합 VP7 항원이 사용되기 때문에, 교차결합이나 비특이적인 결합이 배제되어, 시료 중의 특정 항체만이 재조합 VP7 항원에 결합할 수 있어, 결과의 신뢰성을 높일 수 있다.

한편, 상기 모노클로날 항체는 일반적으로 재조합 VP7 항원을 동물에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역세포와 계속적인 세포증식을 위한 암세포의 융합세포, 즉 하이브리도마 세포에 의해서 생산될 수 있으며, 이러한 하이브리도마 세포는 당업계에 통상적인 방법에 의해서 제조될 수 있고, 예를 들면 HAT 선택법 등을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포들 중에서, 그들이 생산하는 모노클로날 항체의 항원에 대한 결합 능력 및 모노클로날 항체에 결합된 항원의 혈청 중 항체 검출능력을 평가하여, 가장 우수한 능력을 갖는 모노클로날 항체를 사용하는 하이브리도마 세포를 선택하여 사용할 수 있다. 그러한 하이브리도마 세포의 예로는, 대한민국 대전시에 위치한 한국생명공학연구소 유전자은행에 2001년 12월 14일자로 기탁된 기탁번호 KCTC 10136BP의 하이브리도마 세포주를 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 비교예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함된다.

[실시예 1] 바이러스 및 세포

재조합 VP7 항원을 코딩하는 유전자의 삽입을 위한 바큘로바이러스 발현벡터 DNA는 아우토그라파 캘리포니아 뉴클리어폴리헤드로시스 바이러스 DNA(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus; AcNPV)를 사용하였고, 재조합 바이러스는 스포도프테라 프루지페라(Spodoptera frugiperda; Sf-9, Clontek) 세포주에 형질감염시킨 후 배양하여 재조합 VP7 항원 단백질을 발현시켰다. Sf-9 세포주는 그레이스 배지(Grace's media, Gibco-BRL)에 10% 태아 송아지 혈청(fetal calf serum; FCS, Gibco-BRL 1600) 및 항생제-항균제(Antibioctic-antimycotic, Gibco-BRL 15240-062)를 첨가한 배지를 사용하여, 24℃∼27℃의 저온 항온기에서 배양하였다.

[실시예 2] 아프리카 마역 바이러스 cDNA합성, 유전자의 클로닝 및 DNA 염기서열 분석

아프리카 마역 바이러스에서 분리한 RNA로부터 VP7 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하는 방법은 도 1에서 보는 바와 같고, 보다 구체적으로 설명은 다음과 같다.

1. RNA 추출

RNA의 추출방법은 다음과 같다. 불활화 바이러스를 750㎕의 Trizol 용액(Gibco-BRL)에 넣고 혼합한 후, 상온에서 5분간 방치하였다. 여기에, 200㎕의 클로로포름을 넣고 혼합한 후, 상온에서 10분간 다시 방치하였다. 그런 다음, 12,000rpm으로 15분동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 새 튜브로 옮긴 다음, 이소프로판올 500㎕를 첨가한 후 혼합하였다. 상온에서 10분간 방치한 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리를 수행하였다. 상층액을 제거한 후, 펠렛 내에 포함된 RNA를 75% 에탄올 1㎖로 재현탁한 다음, 7,500rpm으로 5분동안 원심분리를 수행하였다. 상층액을 버리고, 침전물은 상온에서 건조시킨 후, RNase가 없는 증류수로 재현탁한 다음, 하기의 RT-PCR에 주형 RNA로 사용하였다.

2. RT-PCR

우선, 상기에서 분리된 전체 RNA 1㎍, 40 유닛 RNAsin (Promega), 50mM Tris-HCl(pH 8.3), 3mM MgCl₂, 75mM KCl, 10mM DTT, 0.4mM dATP, 0.4mM dCTP, 0.4mM dTTP, 0.4mM dGTP, 역전사용 올리고 dT-프라이머를 첨가하여 20㎕의 반응액을 제조한 다음, 42℃에서 2분간 반응시킨 후, 2,000 유닛의 역전사 효소(SUPERSCIPT II RNase H-Reverse Transcriptase, Gibco- BRL)를 첨가하고 42℃에서 50분간 반응시켜, 일차-쇄 cDNA (First-strand cDNA)를 합성하였다.

그런 다음, 국제유전자 은행(NCBI, Gene Bank) 등록번호 제 X56676호로 등록된 아프리카 마역 바이러스의 VP7 유전자 서열을 참고로 이용하여, 다음의 PCR용 프라이머를 제작하였다.

forward: 5'-CGGAATTCATGGACGCGATAGCAGCAAGA-3'

reverse: 5'-GCTCTAGACTAGTGGTAGGCTGGTAGCAC-3'

상기 프라이머 서열은, PCR 증폭산물 내에 VP7 유전자의 단백질 발현을 위한 단백질 번역 개시코돈으로서 5'-말단에 ATG 서열이 포함되며, 3'-말단에는 번역종결코돈으로서 TAG 서열이 포함되도록 작성되었다. 또한, 상기 프라이머 서열들은 이후의 바큘로바이러스 발현벡터를 작성하기 위하여 의도적으로 5'-말단의 ATG 서열 상류에 EcoRⅠ 제한효소 작용 부위가 삽입되도록 하였으며, 3'-말단의 TAG 서열 하류에 Xba I 제한효소 작용부위가 삽입되도록 하였다. 이러한 프라이머 서열을 이용한 PCR은 다음과 같은 방법에 의해서 수행하였다.

주형으로서 상기 역전사 반응에 의해 합성된 일차-쇄 cDNA, 상기 PCR용 프라이머 및 Taq 폴리머라아제(Takara)를 함유하는 PCR용 반응액을 제조하고, Gene Amp PCR system 9600 (Perkin Elmer)을 사용하여, 95℃에서 5분간 변성(denaturation)시킨 후, 55℃에서 1분 어닐링(anealing), 72℃에서 5분간 확장(extension) 및 94℃에서 5분간 변성의 사이클을 35회 반복한 다음, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분간 더 반응시켜, 상기 아프리카 마역바이러스 VP7 유전자를 포함하는 cDNA를 합성하였다.

3. cDNA 염기서열 확인

상기에서 합성된 cDNA 단편은 제한효소 처리 없이, 바로 pGEM-T Easy 벡터 (Promega)에 삽입하여 클로닝한 후, 염기서열을 분석함으로써, PCR 증폭된 cDNA를 확인하였다. 염기서열 분석은 dedeoxy chain dye terminator cycle sequencing kit(PE-Biosystem) 및 유전자 자동염기서열분석기(ABI)를 이용하여 수행되었으며, 뉴클레오티드 서열은 양쪽 방향 모두에서 2회 실시하여 검증하였다. 서열분석결과는 도 2에서 보는 바와 같고, 상기 pGEM-T Easy벡터는 하기의 바큘로바이러스 발현벡터를 제조하기 위한 전이벡터로서 이용하였다.

[실시예 3] 아프리카 마역 바이러스의 재조합 VP7 항원 유전자 cDNA를 포함하는 발현벡터 pBacPAK9-VP7의 작성

VP7 항원 단백질 유전자를 포함하는 바큘로바이러스 발현벡터의 제작방법은 도 3에서 보는 바와 같으며, 더욱 구체적인 설명은 다음과 같다.

상기 RT-PCR에 의해 합성된 VP7 항원 유전자를 포함하는 cDNA의 서열에는, 5'-말단 부위에 단백질 번역 개시코돈인 ATG 서열 및 그의 상류에 EcoRⅠ 제한효소 작용부위가 삽입되어 있고, 3'-말단에는 TAG 서열 및 그의 하류에 XbaⅠ 제한효소 작용부위가 삽입되어 있다.

이러한 cDNA를 포함하고 있는 전이벡터 pGEM-T Easy를 EcoRⅠ 및 XbaⅠ의 제한효소로 처리하여, 상기 벡터로부터 cDNA를 분리해낸 후, 동일한 제한효소들로 처리한 pBacPAK9 벡터(Clonteh, USA)에 라이게이션을 통해 삽입하여, 발현벡터 pBacBAK9-VP7을 제작하였다.

[실시예 4] 재조합 VP7 항원 단백질의 발현

재조합 바큘로바이러스 발현벡터로부터 재조합 VP7 항원 단백질은 다음과 같은 방법에 의해서 발현시켰다.

즉, Bsu36I로 처리된 BacPAK 6 바큘로바이러스 DNA(Clonteck, USA) 0.5㎍ 및 상기 실시예 3에서 제조한 발현벡터 pBacPAK9-VP7 DNA 5㎍을 무혈청 그레이스배지 100㎕에 혼합시키고, 0.1㎎/㎖의 리포펙틴(lipofectin, Gibco)을 동량 더 혼합한 후, 실온에서 15분간 방치하여 공형질감염 혼합물(cotransfection mixture)을 제조하였다.

그런 다음, 35㎜ 페트리디쉬에 미리 준비된 Sf-9 세포(1.5x10⁵ 세포수)를 상기 제조된 공형질감염 혼합물로 공형질감염시킨 다음, 25∼27℃의 온도에서 5시간 배양하였다. 배양 후, 상층액을 제거한 다음, 10% FCS가 함유된 새 그레이스배지 5㎖을 첨가하고, 27℃에서 4∼6일간 배양하여, 세포변성효과(cytopathic effect; CPE)가 관찰될 때, 재조합 바큘로바이러스를 분리한 다음 0.8% Seq plaque agarose (FMC, USA)를 이용 단독 재조합바이러스 크론을 선발 하였다.

발현된 재조합 VP7 항원 단백질의 분리는 다음과 같이 수행하였다.

우선, 감염된 Sf-9 세포를 세포막분해 완충액(1% NP-40, 10mM Tris, pH 7.5)으로 처리한 다음, 15∼35%의 칼륨 타르타레이트(Potassium tartarate; Sigma)을 함유하는 TEN 완충액(100mM Tris, 1mM EDTA, 150mM NaCl, pH 7.5)으로 재현탁한 후, 초원심분리기(Beckman, XL-90)를 이용하여, 25,000rpm(28 Ti)에서 90분간 원심분리하였다. 그런 다음, 생성된 단백질층을 주사기로 수확한 후, 투석망 (sigma, MW 12,000)으로 10mM Tris(pH 7.5)을 사용하여 16시간 투석하여 항원단백질을 제조하였다.

[실시예 5] 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제작

1. 면역

스페인 수의과학연구소(CISA-INIA, Madrid, Spain)에서 구입한 VP7 면역 항원을 PBS 완충액으로 희석(10∼100㎍/250㎕)한 후, 불완전 프로인트의 아쥬반트(Incomplete Freund's Adjuvant)와 1:1의 비율로 균질하게 혼합한 후, 혼합액 0.05㎖를 7주령 발브시 마우스(Balb/c mouse)의 발바닥에 접종하였다.

2. 융합

면역 후 14일 째에 마우스로부터 양쪽 슬과 림프절을 무균적으로 채취하여 마쇄한 후, 무혈청 배지(SFM, Serum Free DMEM)로 세척하고, 통상적인 방법으로 림프구만을 회수하였다. SP2/O-Ag14 마우스 골수종 세포주의 종양세포를 사용하여 세포융합을 수행하였다. 즉, 림프구와 종양세포를 5:1의 비율로 섞은 후, 50% PEG 1500을 첨가하여 세포융합을 실시하였다. 세포융합 후, HAT (hypoxanthine aminopterin thymidine) 증식배지 (10% FBS을 함유한 MEM 배지)에 부유시킨 후, 이를 피더(feeder) 세포가 들어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100㎕씩 분주한 다음, 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다. 피더 세포는 동종 마우스의 복강에서 분리한 대식세포 (macrophage)를 HAT 증식배지로 세포융합 전 하루동안 배양한 것을 사용하였다.

3. 하이브리도마 세포의 선별

하이브리도마 세포가 증식한 배양 상층액을 수거하여, 각 웰당 1∼0.5개의 세포가 포함되도록 희석한 후, 콜로니(colony)를 형성할 때까지 약 2주일간 배양하였다. 각 콜로니에 대하여 하기 실시예 6에 기재된 간접 ELISA방법으로 스크리닝하여 양성을 보이는 하이브리도마 세포를 선별하였다. 동종의 발브시(Balb/c) 마우스에서 분리한 복수를 이용하여, 선별된 클론을 배양용 플라스크(Culture Flask)에서 대량 배양하였다.

본 실시예에서 선별된 재조합 VP7 항원에 대한 특이 모노클로날 항체를 생산하는 세포주의 특성은 표 1과 같다.

Clone	Isotype	P/N (ELISA)
1B9	IgG 3	8.77
1C4	IgM	19.25
2C10	IgG 1	25.31
2F9	IgG 3	22.5
3A2	IgG 3	9.75

상기 클론들 중에서, 항체 생산능이 가장 우수한 클론은 2C10 클론이었으며, 이에 대하여 대한민국 대전시에 위치한 한국생명공학연구소 유전자은행에 이 클론을 기탁하였으며, 이 기관으로부터 2001년 12월 14일자로 KCTC 10136BP의 수탁번호를 부여받았다.

[실시예 6] 아프리카 마역 바이러스의 VP7 단크론 항체의 반응 확인

1. 간접형광항체법(IFA)을 이용 VP7 모노클로날 항체의 바이러스에 대한 반응확인

아프리카 마역바이러스 또는 츄잔(Chuzan) 바이러스를 베로(Vero) 세포에 감염시킨 후, 3일째에 감염세포를 100% 냉아세톤으로 10분간 고정하고, 아프리카 마역 바이러스에 감염된 야외분리 소의 양성 혈청 및 FITC-컨쥬게이트 항-소(anti-bovine) Ig 항체(KPL)를 이용한 형광항체법(indirect fluoresence assay; IFA)으로, 바이러스에 감염된 세포로부터 재조합 VP7 모노클로날 항체의 반응여부를 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 상기 바이러스에 감염된 베로 세포에서 형광이 검출되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는, 상기 바이러스가 감염된 베로 세포에서 아프리카 마역바이러스의 VP7 항원 단백질을 발현되고, 발현된 항원 단백질은 본 발명에 사용된 VP7 모노클로날 항체와 선택적으로 결합하여, 형광이 발현되는 것을 나타낸다.

2. 웨스턴 블랏팅을 이용한 재조합 VP7 항원의 발현확인

재조합 바큘로바이러스로 감염시킨 Sf-9 세포를 4∼6일간 배양한 후, 세포변성효과가 관찰될 때, 세포를 수확하였다. 그런 다음, 세포 파쇄액인 용해 완충액(10mM Tris (pH7.5), 300mM NaCl 0.5% NP-40)을 넣고, 초음파 파쇄(sonication; 파쇄기는 Brinkmann 사로부터 구입)를 1분간 수행한 다음, 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상청액을 분리하였다. 분리된 상층액에 대하여 SDS-PAGE 분석을 수행하기 위하여, 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 실시한 후, 겔을 니트로셀룰로오스 막에 트랜스퍼(transfer)하였다. 그런 다음, 10%의 탈지유(skimmed milk)를 함유한 블로킹 용액으로 니트로셀룰로오스 막을 처리한 다음, 상기에서 사용한 양성혈청을 막에 반응시켰다. 막을 세척한 다음, 말 항체에 대한 이차항체로서 콘쥬게이트를 반응시키고 세척하였다.

발색제로서 TMB (3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine, KPL)를 처리하여, 재조합 VP7 단백질의 존재여부를 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 약 36 KDa (분자량) 밴드에서 재조합 VP7 항원이 명확하게 검출되었다.

[실시예 7] 간접효소면역법을 이용한 재조합 VP7 항원 및 모노클로날 항체의 결합능력 확인

상기에서 분리한 아프리카 마역 바이러스의 재조합 VP7 항원을 코팅액으로서 탄산염 완충액(Carbonate buffer; pH9.6)으로 20배 희석하고, 이뮤노플레이트(Nunc사)에 50㎕씩 분주한 다음, 37℃에서 1시간동안 흡착시켰다. 이후, 플레이트를 세척액(0.05% Tween 20을 함유한 0.01M 인산완충액 (Phosphate buffered saline, 이하 'PBS 완충액'이라 함) (pH7.4)) 250㎕로 각각 3회 세척하고, 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물을 제거하였다. 블록킹 용액 (10% 탈지유(skimmed milk)를 함유한 0.01M PBS 완충액) 100㎕를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 세척액 250㎕로 각각 3회 세척하고, 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물을 제거하였다. 그런 다음, 상기 실시예 5에서 생산한하이브리도마 세포들이 생산하는 모노클로날 항체를 희석액 (0.05% Tween 20 및 10% 탈지유를 함유한 0.01M PBS 완충액 (pH7.4))으로 2,000배와 4,000배 각각 희석한 다음, 상기 이뮤노플레이트에 50㎕ 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액 250㎕로 각각 3회 세척하고, 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물을 제거하였다. 콘쥬게이트 (서양고추냉이 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항-마우스 Ig(Horseradish peroxidase conjugated anti-mouse IgG)를 상기와 동일한 희석액으로 5,000배 희석하여, 이뮤노플레이트의 각 웰에 50㎕ 씩 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액 250㎕로 각각 3회 세척하고 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물을 제거하였다. 그런 다음, TMB의 발색제 50㎕를 각 웰에 첨가한 후, 상온에서 30분간 반응시켰다. 그런 다음, 0.2N H₂SO₄용액을 50㎕ 첨가하여, 반응을 정지시키고, 이뮤노플레이트 자동 판독기를 이용하여, 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 한편, 스페인 수의과학연구소(CISA-INIA, Madrid, Spain)에서 구입한 아프리카 마역 VP7 항원에 대해서도 동일한 조건으로 반응시켜, 본 발명의 모노클로날 항체 검출능력을 검증하였다. 그 결과는 하기 표 2에서 보는 바와 같다.

본 발명의모노클로날 항체	발현 VP7 항원 정제군 (20배 희석)				스페인 도입 표준 VP7 항원(2000배 희석)
	1	2	3	4
3A2A	0.247	0.875	1.559	0.974	0.093
1B9	0.12	0.124	0.34	0.777	0.103
2C10	0.519	0.561	1.1	2.06	0.287

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 모노클로날 항체는 본 발명에서 제작한 재조합 VP7 항원 및 스페인 수의과학연구소에서 얻은 표준 VP7 항원과 공히 특이적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.

[실시예 8] 아프리카 마역바이러스에 대한 항체검출

1. 재조합 VP7 항원을 이용한 효소면역검사법

상기 실시예 4와 동일한 방법에 의해서 아프리카 마역 바이러스의 재조합 VP7 항원을 발현한 후 분리하여 효소면역 검사법에 이용할 항원 단백질을 얻어내었다. 그런 다음, 상기 분리된 항원 단백질을 코팅 완충액으로 40배 희석한 후, 이뮤노플레이트(Nunc사)에 100㎕씩 분주한 다음, -4℃ 냉장고에서 하룻밤(12시간) 동안 흡착시켰다. 냉장 보관된 플레이트를 세척액 (0.01M 0.05% Tween 20을 함유한 PBS 완충액(pH7.4)) 250㎕로 각각 3회 세척하고, 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물을 제거하였다. 여기에, 블록킹 용액 (5% 탈지유를 함유한 0.01M PBS 완충액) 200㎕를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 세척액 (0.05% Tween 20를 함유한 0.01M PBS 완충액) 250㎕로 각각 3회 세척하고, 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물을 제거하였다. 그런 다음, 희석액 (0.05% Tween 20 및 5% 탈지유를 함유한 0.01M PBS 완충액 (pH7.4))으로 1,000배 희석한 시험혈청 또는 표준혈청(양성혈청; 스페인 수의과학연구소에서 제공받음)을 100㎕씩 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 세척액 (0.05% Tween 20을 함유한 0.01M PBS 완충액) 250㎕로 각각 3회 세척하고, 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물을 제거하였다. 그런 다음, 희석액으로 3,000배 희석한 콘쥬게이트, 즉 서양고추냉이 퍼옥시다아제 콘쥬게이트 항-말 Ig를 이뮤노플레이트의 각웰에 100㎕씩 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 세척액 (0.05% Tween 20를 함유한 0.01M PBS 완충액) 250㎕로 각각 3회 세척하고, 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물을 제거하였다. 그런 다음, 상기 이뮤노플레이트에 발색제로서 ABTS (2.2'-아지노-디[3-에틸-벤즈티아졸린benzthiazolineslfonate]) 용액 (Kirkegaard &Perry Laboratories Inc.)을 각 웰에 100㎕씩 첨가한 후, 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응정지용액으로 1% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 용액을 100㎕씩 첨가한 후, 이뮤노플레이트 자동판독기를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

흡광도	마사회 혈청	미국 혈청	제주 혈청	양성혈청
<0.1	50	38	30	0
0.15	0	3	0	0
0.40	0	0	0	0
>1.00	0	0	0	4
합계	50	41	30	4

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 야외분리주인 말에 대해서는, 본 발명의 재조합 VP7 항원은 아프리카 마역 바이러스에 감염된 말에서 분리한 4종의 혈청에 대해서만 특이적으로 항체 검출능력을 갖고 있으며, 음성 혈청에 대해서는 전혀 양성반응이 나타나지 않았다. 이러한 결과는, 본 발명의 재조합 VP7 항원이 아프리카 마역 바이러스에 대한 항체를 검출하는데 유용하게 이용될 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 미국 혈청에서는 3마리의 말로부터 분리한 혈청에 대해서는, 아프리카 마역 바이러스에 감염되지 않은 혈청임에도 불구하고, 약간의 흡광도가 측정이 되어, 단순한 종래의 ELISA법만으로 항체를 검출하는 방법에는 검출 특이성의 면에서 약간의 문제가 있음을 알 수 있다.

2. 재조합 V7 항원 및 그의 모노클로날 항체를 이용한 효소면역검사법

상기 실시예 5에서 선발된 하이브리도마 세포이 분비하는 모노클로날 항체를 발브시 마우스 에 복강내 주사한 다음 2주후 복수를 수집하였다. 그런 다음, 수집된 모노클로날 항체를 코팅 완충용액으로 2,000배 희석한 다음 이뮤노플레이트의 각 웰에 첨가하고, 냉장조건에서 하루동안 방치하였다. 그런 다음, PBST로 5분간 3회 세척 후, 블로킹 용액으로서 10% 탈지유가 함유된 PBS 용액으로 현탁한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 후, 상기 실시예 5에서 정제한 재조합 VP7 항원을 20배의 희석배수로 50㎕씩 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그런 다음, PBST로 세척한 후, 시험 혈청 또는 표준혈청을 25배의 희석배수로 50㎕씩 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기와 동일한 방법으로 세척한 다음, 항-말 HRP 콘쥬게이트 항체(Anti-horse HRP, Sigma)를 반응시켰다. 세척 후, ABTS보다 5배이상 감도가 높은 TMB 발색제를 첨가하여 30분동안 반응시킨 후, 반응정지 용액인 황산을 첨가하고, 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

흡광도	마사회 혈청	미국 혈청	제주 혈청	양성 혈청
<0.1	50	41	30	0
0.15	0	0	0	0
0.40	0	0	0	0
>1.00	0	0	0	4
합계	50	41	30	4

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 종래의 방법에서와 같이 항원만으로 아프리카 마역 바이러스에 대한 항체를 검출하는 것에 비하여, 아프리카 마역 바이러스 VP7 항원단백질에 대한 모노클로날 항체를 결합시킨 항원을 이용하는 본원 발명은 간접반응방법보다 민감도도 높고 더욱 특이적으로 정확하게 아프리카 마역 바이러스 항체를 검출할 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 항체를 검출하기 위한 종래의 ELISA법에 비하여 본 발명은 더욱 정확하고, 특이적으로 아프리카 마역 바이러스에 대한 항체를 검출함으로써, 아프리카 마역을 정확하게 진단할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 아프리카 마역 바이러스항체의 검출방법은, 아프리카 마역에 감염된 가축의 혈청 중에서 아프리카 마역 바이러스 VP7 항원에 대한 항체를 ELISA법으로 검출하는데 있어서 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체와 발현된 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원을 사용함으로써, 바이러스를 직접 사용하지않고 보다 안전하게 아프리카 마역 바이러스의 항체검출을 수행할 수 있으며, 이러한 검출을 통해 아프리카 마역의 진단을 수행할 수 있다.

도 1은 아프리카 마역 바이러스 VP7 항원을 코딩하는 유전자의 클로닝 모식도이다.

도 2는 아프리카 마역 바이러스 VP7 유전자의 염기 및 아미노산 서열이다.

도 3은 아프리카 마역 바이러스 VP7 유전자를 발현시키기 위한 바큘로바이러스 발현벡터의 작성 모식도이다.

도 4는 아프리카 마역 바이러스와 츄잔바이러스를 감염시킨 세포에서 VP7 모노클로날 항체의 발응 여부를, 간접형광항체법(IFA: Indirect immuno fluoresence assay)으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

(도 4에서,

좌측 상단의 도면은 아프리카 마역 바이러스에 감염된 베로(Vero) 세포에 대하여 하이브리도마 세포 2C10가 생산하는 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 이용한 간접형광항체법으로 VP7 단백질 항원의 발현을 확인한 결과이며,

우측 상단의 도면은 아프리카 마역 바이러스 VP7항원과 교차면역원성을 갖는츄잔 바이러스에 감염된 베로 세포에 대하여 간접형광항체법(항체로서 하이브리도마 세포 2C10이 생산하는 모노클로날 항체를 이용)으로 검사한 결과이며,

좌측 하단의 도면은 아프리카 마역 바이러스에 감염된 베로(Vero) 세포에 대하여 하이브리도마 세포 3A2A가 생산하는 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 이용한 간접형광항체법으로 VP7 단백질 항원의 발현을 확인한 결과이며,

우측 하단의 도면은, 츄잔 바이러스에 감염된 베로 세포에 대하여 간접형광항체법(항체로서 하이브리도마 세포 3A2A가 생산하는 모노클로날 항체를 이용)으로 검사한 결과이다.)

도 5는 아프리카 마역 바이러스의 재조합 VP7 항원 단백질의 발현 여부를, VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 이용한 웨스턴 블랏 검사를 수행하여 확인한 도면이다 (도 5에서, M은 단백질 마커를 나타내며, '1'은 재조합 아프리카 마역 VP7 유전자를 발현한 세포 파쇄액을, '2'는 세포 파쇄액에서 정제한 VP7 단백질에 대한 실험 결과를 나타낸다.).

도 6은 종래의 ELISA법(A) 및 본 발명에 따른 ELISA법(B)을 비교한 도면이다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 아프리카 마역 바이러스에 감염된 가축의 혈청 중에서 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원에 대한 항체를 ELISA법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)으로 검출하는데 있어서,

   1) 기탁번호 KCTC 10136BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산된 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 고형지지체에 부착시키는 단계;

   2) 상기 단계 1)에서 고형지지체에 부착된 모노클로날 항체에 VP7 항원을 결합시키는 단계;

   3) VP7 단백질에 대한 항체를 포함하고 있는 시료를 상기 단계 2)의 VP7 항원과 반응시키는 단계;

   4) 효소가 부착된 콘쥬게이트 항체(conjugate antibody), 방사선물질이 부착된 콘쥬게이트 항체 및 형광물질이 부착된 콘쥬게이트 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 이차항체 (secondary antibody)를 상기 단계 3)의 항체와 반응시키는 단계;

   5) 시료 중의 항체량을 정량하는 단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 아프리카 마역 바이러스의 검출방법.
3. 삭제
4. 제 2항에 있어서, 상기 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원 단백질은 상기 도 2에 기재된 아미노산 서열을 갖음을 특징으로 하는 아프리카 마역 바이러스의 항체검출방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원 단백질은 바큘로바이러스 발현시스템을 이용하여 발현시킴을 특징으로 하는 아프리카 마역 바이러스의 항체검출방법.
6. 제 2항, 제 4항 및 제 5항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 이용하여 아프리카 마역 바이러스를 검출함으로써, 가축의 아프리카 마역을 진단함을 특징으로 하는 가축에 대한 아프리카 마역의 진단방법.
7. 아프리카 마역 바이러스의 VP7 항원에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 KCTC 10136BP 하이브리도마 세포.
8. 제 7항에 의한 KCTC 10136BP 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체.