JPS6356286A - ロタウイルスｓａ−１１の主な外部キヤプシドたん白に用いられる組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は一般にウィルス性たん白及び７ツセイ及びそれ
らを用いるワクチンに関しそして特にロタウィルスの主
な外部キャプシドたん白に関するたん白に関する。

〔従来の技術〕

ヒトのロタウィルスは乳児及び幼児の下痢をひき起す原
因であることが最近水されてきた。ロタウィルスは自然
にいたるところに存在しそして主な健康上の問題を世界
的に特に開発途上国（栄養欠乏の作用とともにそれらは
慢性病及び死亡を生じさせる）において主要な健康上の
問題を構成している。

ロタウィルスはウィルス科レオビリダニ（Ｒａｏｖｉｒ
ｉ−ｄａｓ）に属しそしてそれらの電気泳動の運動性の
差にょｐ同定される１１個のセグメントに分類される二
本鎖ＲＮＡゲノムｔ％徴とする。カピキアン（Ｋａｐｉ
ｋｉａ％）ら「ロタウィルスズ（Ｒｏｔａｖｉｒｓａｇ
ａ）Ｊ　　ｒライａａジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）Ｊ第３
７章、８６３〜９０６ページ、フィールズ（Ｆｊｓｊｄ
ａ）鳩、ラペン・プレス（Ｒａｗ−％Ｐｒａａａ）、ニ
ューヨーク（１９８５年）。ロタウィルス遺伝子セグメ
ントが内部キャプシド及び外部キャプシド層により囲ま
れている芯粒子に詰められていることをウルトラストラ
クチュア分析は示す。バルマー（Ｐαｊｍｖｒ）ら「ジ
ェー・ゼン・ライｔｘａ（Ｊ、Ｇａｓ、Ｖｉｒｏｌ、）
Ｊ　　３５．４０３〜４１４（１９７７）：パルマーラ
「ジェー・ゼン・ウィロロ、」す、１０５〜１１１（１
９８２）：バイキャン（Ｂｉｔ−ａｍ）ら「ジエー・ウ
ィロロ（Ｊ、Ｖ４デ・１）Ｊ４３．１１１３〜１１１７
（１９８２）。芯、内部及び外部キャプシドよりなるた
ん白は、現在充分に特徴が知られており特にサルロタウ
ィルス５Ａ−１１及びウシロタウィルスＵＫについてそ
うである。遺伝子コーディングアサインメントは、多く
のたん白について存在する。カビキアンら、同上。

ロタウィルスの４種のヒト血清型が記述されて電・る。

これらは各血清型のウィルスに対して製造された抗血清
の無能力により区別されて、プラーク減少アッセイにお
いて他の血清型のウィルスの無効性を中和する。これら
４種の血清型の原型け、タイプｌ　（Ｗα）、タイプ２
　（ＤＳ−１，Ｓ２　）、タイプ３（Ｍ、？）及びタイ
プ４（Ｓｔ、　　）−マス）、ワイアット（Ｗνａｔｅ
）ら［ジエー・タリノ・ミクロプ、（Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂ、）Ｊ　１８．３１０〜３１７
（１９８３）。

他の２種のヒト血清型を表わしうるウィルス単離物は、
又記述されている。マツノら「ジエー・ウイロロ、」５
４．６２３〜６２４（ｉ９８５）：アルバート（Ａｌｂ
−デｔ）「アクタ・ベニシアトル・スカンド、（Ａｃｔ
ａ　Ｐａａｄｉ−ａｔｒ、５ｃａｎｄ、）Ｊ　　７４．
９７５〜９７６（１９８５）；クラーク（Ｃ１ａｒｋ）
　　ら［アメリ、ンサ、フォア、ミクロブ、　（Ａｍａ
ｒ、　Ｓｅａ、　ｆｏｒ　Ｍｉｅｒｏｂ　）　Ｊ　１９
８６年大会、ワシントン、ｌ）Ｃ，アブストラクトＴ３
４゜４往のヒト血清型に加えて、３種の血清型力Ｋｉ己
志され、主としてブタ（タイプ５）、ウシ（タイプ６）
及びトリ（タイプ７）ロタウィルスを示す。ヒト血清型
の中の２種のウィルスは、又動物ロタウィルスと交差反
応する。サル（ＳＡ−１１，ＭＪ［７１８００６）及び
イヌ（ＣＵ−１）ロタウィルスは血清型３ヒトウイルス
と交差反応し、そしてブタロタウィルスの数種のものは
ヒト血清型４と交差反応する。カピキアンら、同上。

動物ロタウィルスとの組織培養中の生長に適合されない
ヒトロタウィルスをコインフエクトＣｃｏｉｎｆａｅｔ
）することＫより行われるゲノム再組合わせ（デａａａ
ａｏデｔａｕｔ）研究は、主要な外部キャプシドたん白
（１７Ｐ７）としてウィルス中和に関係のある本質的な
遺伝子生成物を同定した。

ＶＰ７は、再組合わせ研究及び生体外のほん訳にエフ血
清型に応じて遺伝子８又は９にエフコードされることが
示された。カピキアンら、同上。

ＶＰ７の大きさは不均一（３６〜３８キロダルトン）で
ありそして高マンノース炭水化物とグリコジル化される
。

エステスＣＥａｔｍａ）ら「ウイロロジー」１２２．８
〜１４（１９８２）；クラベラウスＣＫｏｕνｇｉｏｍ
ｓ）ら「ジエー・イン・ウイロロ、」６５．１２１１〜
１２１４　（１９８４）。

炭水化物部分の不存在は、ロタウィルスの無効性又はイ
ンフルエンスウィルス中和を阻害しない。ペトリエＣＰ
＃ｔｒｉａ）ら「ジエー・ウイロロ、」４６，２７０〜
２７４　（１９８３）；サバラ＜５ａｂａｒａ）　　ら
「ジエー・ウイロロ、」５３．５８〜６６（１９８５）
。

ＶＰ７（遺伝子８又は遺伝子９）についてコーディング
する遺伝子は、イー・コリにおいてｃＤＮＡコピーとし
てクローンされ、そしてヒトタイプ１（Ｗα）、ヒトタ
イプ２（ＩＩｓ−５）、　サルタイプ３（Ｓ、４−１１
）及びウシタイプ６　（ＵＫ、ＮＣＤＶ）ロタウィルス
にシーケンスされた。

グラス（Ｇｌａｓｓ）ら「ウイロロジーＪ１４１，２９
２〜２９８（１９８５）。推論されたアミノ酸シーケン
スの分析は、それぞれメチオニンコドン（ＡＴ　Ｇ　）
　カ先立つＶＰ７ＯＮ−末端の近くに２個のタンデム疎
水性ドメインを明らかにした。生体外のほん訳の研究は
、両刃のＡＴＧコドンがウィルス感染中に用いられるこ
とを示唆している。エリクソンＣＥｒｔｅａｏｓ）ら「
ウイロロジー」１２７．３２０〜３３２（１９８３）；
チャン（ＣＡａｓ）ら「ウィｏｏジー」１５１．２４３
〜２５２（１９８６）。

ロタウィルスタイプに関するＶＰ７の推論されたアミノ
酸シーケンスの比較は、シーケンスで特に変化しうる６
ａの領域を明らかにしている。これらの［高度に変化し
うる（ｈｙｐｇｒｖａｒｉａｂ　Ｊｇ）Ｊ領域は、ロタ
ウィルスのタイプ特異性を与えるエピトープとなりそう
なものと考えられる。

グラスら、同一ヒ。ペプチドはこれらの変化しうる領域
に作られそしてそれらの抗原性が評価される。ガンＣＧ
ｕｔｓ％）ら「ジエー・ウイロロ、」５４．７９１〜７
９７（１９８５）。

若干のペプチドは抗原的であるが、何れも中和する抗体
のレスポンスを誘い出し得なかった。これらのデータは
、ＶＰ７たん白の配座の特徴がウィルス中和に影響する
のに必須であることを示唆している。

ウィルス粒子からＶＰ７ｆ精製して、中和する免疫血清
を生じさせる試薬として用いる試みがなされた。等電フ
ォーカシングにより精製されるサブユニットＶＰ４を用
いて中和モノ特異的血清を生じさせる。マツノ及びイノ
ウニ「インフエク・アンド・イムニ、Ｃ１ｎｆｅｃ、ａ
ｎｄＩｍｍ１ｔ＊、）Ｊ３５１　１５５〜１５８（１９
８３）。変性□−−噌−□苧 ＶＰ７又はＶＰ７のたん自分解フラグメントヲ用いる同
様な研究は、たん白土の配座の特徴が中和抗体レスポン
スを引き出すのに重要であることを示している。パスタ
ルトＣＢａ５ｔａｒｄｏ”）ら「インフエク・アンド・
イムニ、」３４．６４１〜６４７（１９８１）；サバラ
ら「ジエー・ウイロロ、」５６．１０３７〜１０４０（
１９８５）；サバラら「ジエー・ウイロロ、」５３．５
８〜６６（１９８５）。

中和抗体を得るために抗原の源としてイー・コリ中にロ
タウィルスＶＰ７ｆ発現する試みは、成功しなかった。

ＶＰ７にコーディングする遺伝子の先端を切ることは種
々のベクター構成を用いてイー・コリに発現されている
妙ζポリペプチドの安定性は、恐らくイー・コリの毒性
により低収量とともに問題がある。このようなポリペプ
チドは抗原性であることが示されたが、恐らく不正確な
たん白の折り重ね（ｆｏｌｄｉｎｇ）にＬフロンウイル
スに対する中和抗体を生じない。

サルロタウィルス５Ａ−１１の遺伝子９は、ＳＶ４０ベ
クターを用いては乳動物細胞ＣＣ０８−７）に発現され
た。

一連の欠失が形成され、それは２個の疎水性ドメインに
近い両方のＡＴＧコドンがほん訳に用いられるが、天然
のたん白に似たＶＰ７たん白生成物は分泌されないこと
を示した。ポルチンスキー（Ｐｏｒｗｃｈ１１九５ｋｙ
）ら「ジエー・セル・バイオ口、（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　　Ｂ
ｉｏｌ、）」　１’隻１．２１９９〜２２０９（１９８
５）。

バキュロウィルスは、外米の遺伝子の発現のための系と
して開発された。スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら「モレキ・セ
ル・バイオｏ　（Ｍｏｌｚｃ、Ｃａ１ｌ　Ｂｔｏｌ、）
Ｊ３　、２１５６〜２１６５（１９８３）：ベンノック
（Ｐａｎｎｏｃｋ　）ら「モレキ・セル・バイオ口」ユ
、３９９〜４０６（１９８４）。若干のこれらの遺伝千
生Ｉｆ、物は、ｌｆｉ織培養培地へ分泌爆れることが分
った。スミスら、同上ニスミスら「フロン・ナッル・ア
カデ・サイ、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、５ｃ
ｉ）Ｊ　８２＋８４０４〜８４０８（１９８５）。−万
、他のものはそうではない。

ミャモトら「モレキ・セル・バイオ口、」Σ、２８６０
〜２８６５（１９８５）。多くの場合、生物学的活性が
維持されている。スミスら、同上；カルボネル（Ｃａｒ
ｂｏｎｇｌｌ）ら「ジエー・ウイロロ、」５６．１５３
〜１６０（１９８５）；マエダら「ネイチュア（Ｎａ４
ｕｒｇ）Ｊ３１５．５９ト５９４（１９８５）。バキュ
ロウィルス発現系は、最近ロタウィルス５Ａ−１１の王
な内部キャプシドたん白（ＶＰ７）の発現のために用い
られている。サマースＣ’ｈｂｍｍｅｒｓ）及びスミ人
「パンブリー・レプＣＥａｎｂ％ｒｙ　Ｒｔｐ、）Ｊ　
　２２．３１９〜３３９（１９８５）。

〔発明の概要〕

本発明は、ロタウィルス５Ａ−１１の主な外部キャプシ
ドたん白（ＶＰ７）の組換えサブユニット形を提供する
。

タン白は、バキュロウィルス発現系におけるロタウィル
ス５Ａ−１１遺伝子９の発現により生成さ４、そして天
然のたん白に予想されるのと一致する大きさの３４キロ
ダルトン（３４Ｋ）たん白の合成を可能にする。たん白
は、ウィルス感染中昆虫細胞から培養培地へ分泌される
。たん白は抗原的であり、そして抗ロタウィルス抗血清
を中和することにより認識され、そして診断薬として又
は能動又は受動ワクチンに対する抗原として有用である
。

本発明によるサンプル中の抗ロタウィルス抗体の存在全
検出するアッセイは、抗体全含むサンプルを本発明によ
る組換えたん白にさらす工程を含む。組換えたん白は支
持体′に結合し、サンプル中の抗体と免疫学的に反応し
そして支持体上にサンプル中の抗体全不動化する。サン
プル中の抗体と特異的に結合可能なしかもラベル（例え
ば酵素ラベル、螢光ラベル又は当業者に周卸の他のラベ
ル）と結合した第二の抗体は、テスト溶液に導入される
。支持体へ結合したラベル＋７）存在は、サンプル中の
ロタウィルスに対する抗体の存在を示す。

本発明による能動ワクチンは、免疫学上許容しうる希釈
剤、アジュバント又は担体及び本発明による組換えたん
白を含む。

本発明にエリポリクローナル抗体を生成する方法は、有
効量の本発明による組換えたん白により動物を免疫化ム
そして血清、コロストルムＣｅｏｌｌｏａｔｒｓｔｍ）
、乳又は動物の他の体液から抗ＶＰ７抗体を単離する工
程を含む。本発明は又この方法により得られる抗体を提
供する。

本発明によりモノクローナル抗体を生成する方法は、本
発明による組換えたん白に対して動物を免疫化し、動物
からの抗体生成細胞を黒色腫細胞へ融合し；媒体中でＶ
Ｐ７に対するモノクローナル抗体を生成する細胞系を単
離しそして媒体からＶＰ７に対するモノクローナル抗体
ｔ−精製する工程を含む。本発明は又この方法により生
成されるモノクローナル抗体を提供する。

第１図は、本発明によるｃＤＮＡのライブラリーの構成
の概略図であシ； 第２図は、本発明によるロタウィルスＳＡ−１１遺伝子
９ｃＤＮＡの部分的制限マツプであυ；第３図は、本発
明によるロタウィルス５Ａ−１１遺伝子９にじ１￥る核
酸シーケンスと発表されたシーケンスとの比較であシ； 第４図は、本発明によりバキュロウィルケゲノムにそう
人するための組換えたん白をコーディングする遺伝子を
含む構造の概略白である。

本発明によれば、ロタウィルス５Ａ−１１ＲＮＡ遺伝子
セグメントをテンプレートとして用いて、次にイー・コ
リのプラスミドベクターにクローンされるＤＮＡコピー
を合成する。５Ａ−１１遺伝子９のクローンされたＤＮ
ＡコピーをＤＮＡシーケンス合成により同定且確認して
、主な外部キャプシドたん白（ＶＰ７）の全たん臼コー
ディングシーケンスを含む。

５Ａ−１１遺伝子９クローンさｆ″したＤＮＡは、ポリ
へドリンプロモーターのコントロールの下に発現されて
、遺伝子９を含む組換えバキュロウィルスによる昆虫細
胞系の感染により、天然たん白に抗原的に同様なサブユ
ニットたん白を生ずる。得られた発現された遺伝子生成
物が、ロタウィルス粒子に対して誘導された中和ポリク
ローナル抗血清と反応することにより抗原的であること
が示された。

バキュロウィルス発現ＳＡ−１１遺伝子９たん白生成物
は、臨床上のサンプル中のロタウィルスに対する抗体を
検出する診断薬として、そしてロタウィルスの主な外部
キャプシドたん白に対するポリクローナル又はモノクロ
ーナル抗体を製造する免疫原として有用性を有する。バ
キュロウイルスにおける。Ｓ’Ａ−１１遺伝子９０発現
は、スフローンされた遺伝子９　　ＤＮＡの部位特異的
突然変異生成による組侯えＶＰ７たん日生底物の抗原決
定子の修飾を行わせる。

〔実施例］ 下記の実施例において、制限エンドヌクレアーゼは、二
ニー・イングランド・バイオラプス（＃ｇｓｏ　Ｅｓｇ
ｌα５ｄＢｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）　］により供給され
た。ＤＮＡポリメラーゼクレナウフラグメ／ト、ポリ（
Ａ）ポリメラーゼ及びＤＮＡＩ）ガーゼは、ベテスダ・
リサーチ・ラブ、ｒ：［Ｂｇｔ４ｇ−ａｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　Ｌａｂａ（ＢＲＬ）］ゲイザースバーグ（Ｇ
ａｉｔｈａｒａｂｕｒｇ）、メリーランドから購入され
た。逆転写酵素は、ライフ・サイエンスズ（Ｌｉｆｅ　
５ｃｉｅｎｃｅｓ）カら供給された。ＲＮＡリガーゼ及
び末端トランスフェラーゼはファルマシア・モレキュラ
ー・バイオロジカルス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｍｏｌ
ｅｃ％ｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｅａｌａ（ＰＭＢ）”
Ｊにより供給された。ニックはん訳試薬を含むＳＭｐラ
ベル試ＪＩｉ、二ニー・イングランド・ヌクレア（Ｎｅ
ｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮ％ｃｌｅａｒ（ＮＥＮ）〕から購
入された。ｓｓＳラベル試薬はアメルシアム（Ａｍ−デ
Ｈｋａｔｎ）から購入された。アガロース、アクリルア
ミド及び他の電気泳動試薬は、バイオ・ラッド（Ｂｔｏ
　Ｒａｄ　）により供給された。生長培地はディフコ（
Ｄｓ／ａｏ）から得られた。Ｘ−ガルは、ＥＲＬから購
入された。、９Ａ−１１０タウイルス及びＳｆ　９昆虫
細胞の生長用の培地及びバッファーは、グランド・アイ
ランド・バイオロジカＡ／−カンパニー（Ｇｒａｎｄ　
ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉ−ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎ
ｙ　　（ＧＩＥＣＯ）Ｅから得られた。

イー・コリ株ＪＭ８３、ＪＭ１０３及びＨＢ１０１反応
能細胞は、ＰＭＢ及びＢＲＬから得られた。クローニン
グ及び発現のためのプラスミド（ｐＵｃ９．ｐＵｃ１３
）は、ｐｕｎから購入された。Ｍ１３ベクター（ｍｐ８
．ｍｐ９）及びす／ガー（Ｓａｓｙｇｒ）シーケンシン
グ用のプライマーは、ＰＭＢから購入された。バキュロ
ウィルスイー・コリシャトルベクター（ｐＡｃ６１１）
は、マックス・ディ・サマース（ＭａｚＤ、Ｓｕｍｔｎ
ａｒｍ）、テキサス−！＋、７７ドｅエム・ユニパーシ
ティから得られた。

桧準の手順が以下のものについて用いられた。プラスミ
ド’＋Ｖ＝ａ、イー・コリの形質転換、小さなスケール
のプラスミドの製造、アガロースゲル電気泳動によるＤ
ＮＡの分析、Ｘ−ガルを用いるｍ換えコロニーのスクリ
ーニング及びコロニーのハイブリッド化しマニアチス（
Ｍａ　ｎ　ｔαＨａｉら；「モレキュラー・クロー二ン
グーア・ラホラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｇｃｓｌａ
ｒ　　Ｃｌｏｓｉｎｇ−Ａ　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｇｍａ　ｌ　）Ｊコールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スフリンク・ハ
ーバ−９二ニー・ヨーク（１９８２）］。

さらに］５ＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動ＰＡＧＥ
）によるたん日の分析〔レムリ（Ｌａａｍｌｉ）、　「
ネイテユア（＃ｃＬｔｕｒ’ｓ）Ｊ　　２２７　、６８
０〜６８５（１９７０））。

制限酵素（ＮＥＢ）、ＲＮＡリガーゼ（ＰＭＥ）、ポリ
（，４）ポリメラーゼ（ＢＲＬ）、末端トランスフェラ
ーゼ（ＢＲＬ）、ＤＮＡポリメラーゼクレナウフラグメ
７ト（ＢＲＬ）及びＤＮＡＩ）パーゼ（ＥＲＬ　）ｔｌ
！、製造者の勧告に従って用いられた。

下記の実施例は、本発明の詳細な説明する。実施例１は
、ロタウィルス５Ａ−１１ｃＤＮＡの合成及びイー・コ
リにおける七のクローニングを記述する。実施例２は、
５Ａ−１１遺伝子９クローンＤＮＡの同定及びマツピン
グを詳述する。実施例３において、５Ａ−１１遺伝子９
クローンＤＮＡのノーザン・プロット分机の結果が提供
される。実施例４は、５Ａ−１１遺伝子９クローンＤＮ
Ａのシーケンス分析を記述する。実施例５において、バ
キュロウィルスにおける発現のためのＳＡ−１１遺伝子
９ＤＮＡのテブクローニングの記述を提供する。実施例
６は、昆虫細胞系にＳけるトランスフェクションによる
５Ａ−１１遺伝子９のバキュロウィルスのそう人を詳述
している。実施例７Ｆｉ、バキュロウィルス・昆虫細胞
系におけるＳＡ−１１遺伝子９クローｙＤＮＡ生成物（
ＶＰ７）の合成及び生成物の見掛は分子せの測定？示し
ている。実施例８は、バキュロウィルス・昆虫細胞系で
発現されたＶＰ７の抗原性を示している。実施例９は、
バキュロウィルス・昆虫細胞系におけるＶＰ７の昆虫Ｍ
Ｈｆｌｆ＠＃＠地への分泌を詳述している。実施例１０
に、不発明による酵素結合免疫ｇ＆着アッセイを提供す
る。実施例１１において、ポリクローナル抗血清は本発
明に従って生成されそして本発明によるワクチンが記載
されている。実雄例１２にお−・てモノクローナル抗体
は本発明に従って生成される。

実施例１゜ ｓＡ−１ｉロタウイルスの増殖及び８ｉ製５Ａ−１１０
タウイルス〔ＡＴＣＣＡ６１１Ｂ８９９〕をエステス（
Ｅａｔｅａ　　）ら「ジエー・ウイロロＪ３１，８１０
〜８１５（１９７９）により指示されるようにローラー
ビン中でω合性ＭＡ１０４細胞ＣＭＡ、バイオプロダク
ツ（Ｂｉｏｐデｏｄ舊ｅｔａ）Ｅの感染により増殖する
が、ただし、トリプトースホス２エート及びゲンタマイ
シンは培地から除かれそしてホスフェートでバッファー
された塩水（ＰＢＳ。

ＧＩＢＣＯよシ入手）ヲ況浄バッファーとしてトリスで
バッファーされた塩水（ＴＢＳ）の代りに用いた。ウィ
ルスＹ　トＩＪプシン又はウシ胎児血清の不存在で増殖
させそして３７℃の２日間の培養の後に採取した。ＳＡ
−１１ストツクウイルスを、室温で１時間添容量のｌθ
倍組織培養グレードのトリプシン（ＧＩＢＣＯ）による
処理により感染前に活性化した。ウィルスを、感染した
細胞を２回冷凍・解凍を行ない次に５ｏｏｏｙ及び４℃
で２０分間遠心分離して細胞の残骸を除くことにより精
製した。８％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコールＭＷ６
０００（ＰＥＧ）を清明な上澄液に加えそして４℃で１
晩放置した。培地を次に５０００Ｆ（４℃）で２０分間
遠心分離してＰＥＧ沈でんＳＡ−１１ウイルスをペレッ
トとした。ウィルスを含むペレットを少容量の５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）バッファー中で可溶とし
そしてトリスバッファー（２０’Ｃ）中１７）１．４　
ｆ　／１７（Ｆ）　Ｃ５ＣＬ％１．３　ｔ　／ａｌノＣ
ａＣＬソＬ、テ４５　ｆｙ（）＄’／Ｉ／）シュクロー
スよシなる工程グラディエンドに適用された。サンプル
を１００．０００ｆ（２０℃）で３〜６時間振動パケッ
トローター中で遠心分離した。１．３〜１．４５Ｆ／Ｉ
ＲｔのＣ５ＣＬ間を移動する鮮明な青味がかったバンド
として見られるウィルス粒子を採取しそして５０ｍＭ）
リス−ＩＩＣＬ（ｐｌｉ　７．５　）に対して１晩透析
した。透析したウィルスは、ゲノムニ不鎖ＲＮ　Ａ　（
ｄａＲ，ＶＡ　）の単離又はウィルス的にコードされた
メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成用の精製した
原料として用いられる。

５Ａ−１１ｄａＲＮＡの単離及び３ｔｐ末端ラベうング
二本鎖ＲＮＡｔｋＣａＣＬＭ製５Ａ−１１ウイルスから
、等容量のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）バッファーで
飽和したフェノールを加えセして渦巻運動（フェノール
抽出）を行なうことにより抽出した。水性相に含まれた
二本ＰＡＲＮＡを０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＡａ）
及び２容危のエタノールによる沈でんにより濃縮し次に
使用１で一２０℃で貯蔵した。

Ｓ　Ａ　−１１ｄｓＲＮＡｆ末端ラベルして、アガロー
スゲル＊２旅動によりポリアデニル化ｄａＲＮＡ　　を
分割するときの大きさマーカーとして利用するか、又は
アクリルアミドゲル電気原動により分割きれたＳＡ−１
１ｄｓＲＮＡセグメントのノーザンプロット分析に利用
する。

二本鎖ＲＮＡは、製造者（Ｐ、’、ＩＢ）により記述さ
れた如＜ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡストランドの３
′−末端への５ａｐ−（：ｐ　（シトシンＳ／、　ａ／
−ジホスフェート）の付加にニジラベルされた。

第１図に示されるように１．Ｓ’Ａ−１に本領ＲＮＡ（
ｄａＲＮＡ）の１１セグメントの混合物を５Ａ−１１ウ
ィルス粒子から単離した。

ＳＡ−１１ｄａＲＮＡのポリアデニル化アデノシン残基
をＳＡ−１１ｄｓＲＮＡ（ポリ（，４）をテール（ｔａ
ｉｌ　）したｄａＲＮＡ）の３′−末端に付加して、逆
転写酵素を用いてｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成のためのテンプレ
ート結合部位をもたらす（’ＡＩ図）。標準の方法を用
いたが（即ちＥＲＬにより勧告されるように）、ただし
２．５Ｕ／ｓｄ、のＲＮアシン〔プロメガ・バイオチク
（Ｐｒｖｍａｇａ　Ｂｉｏｔａｃｈ　）　］をヌクレア
ーゼ阻害剤として加えた。５〜１０ミクログラム（ｍｙ
）のｄａＲＮＡ　を３７℃の２分間の反応でポリアデニ
ル化して、２０〜４０個のアデノシン残基の付加を生じ
サセタ。ｓＨ−ＡＴＰ　ヲ通ｘ　１０．０００　Ｃｊ／
−Ｔ＝＃ｒ反応に含ませて、ＲＮＡ９度を測定した。時
には、（アルファー”Ｐ　）　ＡＴＰ　（１０＝０００
　Ｃｓ／％／’）ヲ１　％７ｉｏ　−スゲル上の電気泳
動によりポリアデニル化（ポ！Ｊ　（Ａ）　）　ｄ　ａ
ＲＮＡの大きさの分析に加えた。３ＨをラベルしたポＩ
Ｊ　（，４）ｄａＥＮＡ　をｃＤＮＡ合成に用いられる
まで７０％エタノール（−２０℃）中に貯蔵した。

ポリ（Ａ）をテールした５Ａ−１１ｄａＲＮＡ（１〜２
ｗｆ）を凍結乾燥し次に５ｕｔの９０％ｎｕｓＯｃアル
ドリッチ（Ａｌｄｒｔｃ））、分子ｔ、測光グレード〕
中に再懸濁しそして３７℃で３０分間インキュベートす
ることにより鎖を分離した。鎖を分離したＲＮＡを最後
に加えて１００　ｕｔの下記のものを含む反応混合物を
充放させた。５０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７，５）、
１０ｍＡ／酢酸マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）、２ｍＭ　　ｄＡＴＰ、２惧ｙｄ　Ｇ　
Ｔ　Ｐ　、　　２　ｍｕ　ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ、　０．２　
ｓＭ　（アルファー３２Ｐ）ｄｃＴＰ（１０，０００Ｃ
ｉ／モｋ）、１００　ｓｆ／ｍｅ　、ｔリゴｄＴ（１２
−１８）（ＰＡ／Ｂ）（プライマーとシテ使用）、０．
６ｗＵ／Ｌ　ＲＮアシン及び０．４　Ｕ　／　ｕＬ逆転
写ｒ’ｐ％素（ライフ・サイエンスズ）。反応ｖＪを３
７℃で１時間インキュベートし、次に合成を等容量のト
リス−バッファー飽和フェノールの添加により停止させ
た。水性相を２０ｍＭＥＤＴＡ及びＱ、　２　Ｎ　Ｎａ
ＯＨで調節し、そして３７℃で１晩インキユベートして
テンプレートＲＮＡを除き、次に箸容廿のｏ、　２　Ｎ
ＨＣｔにより中和しそしてセファデックス（商標）Ｇ１
００カラム（ファルマシア）に適用して塩及び未反応ヌ
クレオ゛チドを除く。３２７）をラベルしたＳＡ−１１
ｅＤＮＡを含む両分を集めそしてＤＮＡｙａ：０２．’
ｌＮαＡｃ及び２倍容量のエタノールによる沈でんによ
り！Ｍした（−２０℃見一般に、０．１〜０．２　ｕｙ
のｅＤＮＡがテンブレー１−ｄ　５ＲＮＡ　１　マイク
ロ２当シ合成された。５Ａ−１１ｃＤＮＡの一体性は、
二次構造を除くための３０ｍＭ　ＮａＯＨ及び２　ｍｕ
　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む１％アルカリ性アガロースゲル
上の電気泳動により評価された。

アンニーリング及び５Ａ−１１ｃＤＮＡの二次類の合成
５Ａ−１１ｃＤＮＡ　を２０マイクｏＬＯ）５０ｍＭ　
　トリｘ　−１１ＣＬ（ｐＨ７，５）及び０．　Ｉ　Ｍ
　　ＮａＣ１甲に再懸濁し次に６５℃で５分間次に５５
℃で１時間加熱しそして徐冷して１目補ｃＤＮＡ鎖のア
ンニーリングを促進した。アンニールしたｃＤＮＡを次
に２容量のエタノールの添加により沈でん、させた（−
２０℃）。

アンニールしたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを逆転写酵素により再び
処理して丁べての残りの一本鎖末端を二本鎖にした（第
１図）。

０１〜０２ｔ？のアンニールした５Ａ−１１ｅＤＮＡを
、ｄｓＲＮＡ　のない第一の鎖合成に用いたそれと同じ
反応混合物へ加えた。反応を４２℃で３０分間行ない次
に等容量のトリスバッファー飽和フェノールの添加によ
り停止させた。フェノールによる抽出後、水性相を０．
２　Ａｆ　ＮａＡ　ｃ及び２容量のエタノールにより沈
でんさせた（−２０℃）。

３２ＰをラベルしたＳＡ−１に本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ乞、
標準の方法〔マニアチスラ「モレキュラー・クローニン
グーア・ラボラトリ・マニュアル」コールド・スプリン
グ−ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・
ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）：］を用いて、Ｔ
ＢＥバッファー（８９ｍＭ）リス−ベース、８９ｍＭは
う酸、２．５ｍＡｆＥＤＴＡ）を含む１％アガロースゲ
ル上の電気泳動により分割した。エンドヌクレアーゼＨ
４ｘｄｍにより分解されたＤＮＡ及びエンドヌクレアー
ゼＨａｇＮにまり分ＷＥされたＸＤＮＡをサイズ・マー
カーとして適用した。ゲルを００１チエチジウムブロミ
ド（ＥｔＢデ）により染めてサイズ・マーカーを肉眼で
見えるようにした。Ｘ線フィルム（コダックＸＡＲ−５
）上のゲルのオートラジオグラフィーにより肉眼により
見られそしてサイズ・マーカーにより判断される１００
０〜１１００ベース・ペアのサイズの範囲を移動するＳ
２ｐをラベルした遺伝子９　ＤＮＡをゲルから削シ取っ
た。

ゲルのスライスを０．１倍のＴＨＥバッファーを言む透
析バッグに入れ、ＤＮＡな０，１倍のＴＢＥ甲で１００
ボルトで４時間電気浴離した。溶離したＤＮＡを、製造
者の指令書に従ってエルチツフ（Ｅｔｕｔｉｐ）Ｃ登録
商標）−ｄカラム〔シュライヒヤー・アンド・シュウエ
ル（Ｓｅｈ１ｇｉｃｈｇｒαｎｄ　Ｓ＜ｈｕａＬｌ）〕
乞用いて濃縮且精製した。１１１製ししかもサイズを・
」択した５Ａ−１１ｃＤＮＡを、さらに用いるまでエタ
ノール甲に「１１代した（−２０℃）。

グ デオキシシチジンヌクンオチド（ｄＣ）を、第１図に示
す如く末端トランスフェラーゼ（ＰＡ（Ｂ）を用いて５
Ａ−１に本領６ＤＮＡ（Ｃ−テーリング）の３′末端に
付加した。０．０１〜０．１　ｕｙのｃＤＮＡ　’ｌ：
、１０　ｗＭ　３−”Ｉ　−ｄｃＴＰ（１００，０００
Ｃｉ１モル）を用（・て２０１４１−の反応物中で製造
者の勧告に従ってＣ−テールした。反応を３７℃で３分
間進行させて、ＤＮＡ３’末端当り１０〜２０個のｄＣ
残基の付加を行つγこ。反応を等容量のトリスバッファ
ーで飽和されたフェノールにより停止させた。フェノー
ル抽出後水性相で回収されたＣ−テールｃＤＮＡは、０
．２ＭＮαＡｃ及び２容量のエタノールにより沈でんし
た（−２０℃）。

膨つ ００１〜０．１ｕｙのＣ−テール５Ａ−１１ｃＤＮＡを
、５０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）、０．ＩＭ　ＮａＣ１
及び等数のピコモルのｐＵＣ９（Ｐｓ　ｔ　Ｉにより切
断されセしてＧ−テールされた（ＰＭＢ））中に懸濁し
、そして６５℃で５分間次に５５℃で１時間加熱しそし
て徐冷することによりアンニールさせた（第１図）。ア
ンニールされたＣＤＮＡ−７’ラスミドを２容量のエタ
ノールにより沈でんさせた（−２０°Ｃ）。

１００　ｓＬのイー・コｌＪ、７．Ｖ８３細胞を標準の
方法〔マニアチスら「モレキュラー・クローニングーア
・ラボラトリ−・マニュアル」コールド・スプリング・
ハーバ−・ラホラトリー、コールド・スプリング・ハー
バ−、ニューヨーク（１９８２））に従ってＣａＣＬ２
’に用いて活性化し、そして凍結乾燥した５Ａ−１１ｃ
ＤＮＡ−ｐＵＣ９ＤＮＡに加えた（０℃）。氷上で１時
間後、細胞を４２℃で２分間熱シヨツクさせ、３７℃で
１時間１ｄのＬＢ〔ルリア・プロスＣ１５ｂｒｉａ　Ｂ
ｒｏｔｈ）〕媒体中でインキュベートし、そしてアンピ
シリンＣＡｍｐ）及び色指示薬Ｘ−ガルを含むＬＥアガ
ー・プレートに適用した。ｐＵｃ９ｆ含むコロニーはＸ
−ガルを代謝して青色の表現型をもたらす〔マニアチス
ら「モレキュラー・クローニングーア・ラボラトリ−・
マニュアル」コールド・スプリング・ハーバ−・、５ボ
ラ）リー、コールドｅスプリング・ハーバ−、ニューヨ
ーク（１９８２））。ｐＵＣ９のｐすＺ′クシ−ンスが
インサートの存在により中断されるとき、白色のコロニ
ーが生ずる。白色のコロニーは、再びプレートされそし
てコロニーの交雑によりさらにアッセイされた。

実施例２゜ クローンｋ、Ｘ−ガルを含むアガープレート上の白色コ
ロニーの存在により初めにスクリーンされて、Ｓ、４−
１１ｅＤＮＡシーケンスを含むプラスミドを示した。ク
ローンを、プローブとしてラジオラベルされた遺伝子７
．８．９ｍＲＮＡ混合物を用いてコロニーの交雑化によ
り再びスクリーンした。遺伝子７．８．９　ｍ　ＲＮ　
Ａに積極的に交雑したコロニーは、インサートＤＮＡの
サイズ及び制限エンドヌクレアーゼによるマツプにより
さらに特徴づけられた。

３仲をラベルにした５Ａ−１１鴨ＲＮＡを、６０鴨Ｍト
リスーＨＣ１ＣｐＨ８，３）、６　ｍｕ　　ＭｇＣＡＣ
”ｈ、１１００ｔｎ　　ＮａＡｃ、　　２ｍＭ　　ＧＴ
Ｐ、０．１ｍＭ　　ＡＴＰ（１０，０００（ＩＩ’ゼ１
モル）、０．１惰Ｍ　　Ｃ７’Ｐ（１０，０００Ｃｉ１
モル）、０．１ｓＡｆ　　［７’ＰＣ１０，０００Ｃｆ
１モル）、１０ｍＭ　　Ｓ−アデノシルメチオニンＣ８
ＡＭ）、０．６Ｕ／ｗＬ　　ＲＮアシン及び１０ｓ４の
、５ＥＡ−１１ウイルスを含む１００　ｓｔの反応物中
のＣａＣＬ精製５Ａ−１１ウイルスから、プローブとし
て用いるために合成した。反応は３７℃で４時間行なわ
れ次に等容量のトリスバッファー飽和フェノールによる
抽出によって停止させた。３１ｐをラベルしたｍ　ＲＮ
　Ａ　ｔセファデックス（商標）Ｇ１００カラムに適用
して未処理又クレオチドを除去した。ｍＲＮＡｆ含むラ
ベルした画分をプールし、そして０．２Ｍ　　ＮａＡｃ
及び２容量のエタノールによる沈でんにより濃縮した（
−２０℃）。ｎｐ２ラベルした５Ａ−１１ｍＲＮＡ分子
Ｅバフファー（１８ｍＡｆ　　Ｈａ２ＨＰＯ，、２ｍＭ
　　Ｎ（ＬＨ２ＰＯ＜）並に６チホルムアルデヒド（変
性剤として）を含む１．５％アガロースゲル上の電気泳
動により分割した。メツセンジャーＲＮＡサンプルｅｌ
ｌ　ＡＩ’バッファー、６チホルムアルデヒド及び５０
％ホルムアミド中で６５℃で５分間加熱しそして氷上で
急冷することによりゲル上に加える前に変性した。

蕉Ω＞ｄｌｌにより分解された入ＤＮＡ及びＨａｍ　　
］Ｉ［により分解されたφＸ　　ＤＮＡｆサイズマーカ
ーとしてゲルに適用した。ゲル（ｉ７Ｑ、Ｑ１％エチジ
ウムプロミドＣＥｔＢｒ）により染めてＤＮＡマーカー
を肉眼で見られるようにした。遺伝子７．８．９　ｍＲ
ＮＡ　（１０００〜１１００ペースペアー）について予
想される移動度で移動するｍＲＮＡ分をゲルから削り取
り、ゲルのスライス’ｅ０．１倍ＴＨＥバッファーを含
む透析バッグにそう人し、そしてｍ　ＲＮ　Ａ　ｋ　Ｏ
，１倍ＴＢＥ中の１００ボルトで４時間電気溶離した。

溶離したｍＲＮＡを濃縮しそして製造者の指命書に従っ
てエルチップ（商標）−ｄ（シライヒヤー・ア／ド・シ
ュウエル）を用いて精製した。遺伝子７．８．９　ｍ　
ＲＮ　Ａ　ｋ、コロニーの交雑化のためのプローブとし
て用いる１で、エタノールに貯蔵した（−２０℃）。

イー・コリ菌株ＪＭ８３へ５Ａ−１１ａＤＮＡｋクロー
ンすることから誘導されたコロニー金、プローブとして
”Ｐ　ｆ　ラ−＜ルＩ、りＳ　Ａ　−１１遺伝子７．８
．９ｍＲＮＡｆ用いてコロニーの交雑化にニジ、遺伝子
９％異性ＤＮＡシーケンスの存在についてスクリーンし
た。コロニーの交ｌ化は、標準のプロトコールを用いて
グルンスタインＣＧｒ％ｎａｔｇｉｎ）及びホグネスＣ
Ｈｏｇｎｅａａ）の方法によ５行ｔ）れた。マニアチス
ら「モレキュラー・クロー二ンクーア・ラボラトリ−・
マニュアル」コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨー
ク（１９８２）。Ｘ線フィルム（コダックＸＡＲ−５）
のオートラジオグラフィーにより遺伝子７．８．９ｖｈ
ＲＮＡへ交雑化されて同定されるコロニーは、ＬＢ媒体
中で１晩インキユベーシヨンすることにより増殖された
。

遺伝子７．８．９ＤＮＡシーケンスを含むイー・コリ細
胞金ペレット化しそしてバーンボイムＣＢｔｒ％ｂｏｉ
ｍ）及びドリー（ｊ）ｏｊｙ）（マニアチスら、「モレ
キュラー・クローニングーア・ラホ５Ｘ）−・マニュア
ル」コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、
コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９
８２））の標準的方法に従って溶解した。細胞上澄液か
ら回収されたプラスミドＤＮＡｆ：Ｐａｔ１エンドヌク
レアーゼにより分解してインサートＤＮＡｔ採取した。

！ムリ切断プラスミドＤＮＡを、サイズテーカ−として
のＨ４＋％ｄ■により切断された入ＤＮＡ及びφＸＨａ
ａＴ！ｉ切断ＤＮＡとともＩ／Ｃ，ＴＥＥバッファー中
の１％アガロースゲル上の電気泳動により分割した。

遺伝子７．８．９ＤＮＡの見掛は上標準サイズのインサ
ートを含むプラスミドを、さらに’ＭＪ＠エンドヌクレ
アーゼによりマツプした。採取したインサートのサイズ
は、アガロースゲル電気泳動の移動度にエリ求められた
。

プラスミドｐＵＣ９に含まれる遺伝子７．８．９ＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼスル４、Ｃ１ａｌ　、　Ｎｅ
ｏｌ　、　ＢａｒｎＨｌ、Ｐｒｒ％ｎ及びＰｔｔｔｌに
よりマツプして、インサートＤＮＡのサイズをより工く
測定し、そしてボスＣＢｏｔｈ）ら「ブロン・ナツル・
アカデ・サイ、　（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）Ｊ８０．３０９１〜３０９５（
１９８３）及びエリアスＣＡｒ１ａａ）ら「ジエー・ウ
ィロロ、」５０．６５７〜６６１（１９８４）にエリ報
告された、公表された５Ａ−１１遺伝子９の制限部位と
比較した。第２図に示される得られた部分的な制限マツ
プは、５Ａ−１１遺伝子９　　ｃＤＮＡの標準サイズの
インサートの存在を確認する。

ｐＵＣ９（ｐＡＲ９１’）における遺伝子９ＤＮＡの配
向は、ｐＵＣ９の普偏的なりローニング部位内に含まれ
そして遺伝子９シーケンス内とともに遺伝子９ＤＮＡの
インサート部位に隣合っているＢａｔｎＨｌによる分解
により求められた。アガロースゲル電気泳動による制限
分解物の分析は、遺伝子９がｌａｃ　　プロモーターに
関して前方の配向にそう人されたことを示した。

実施例３゜ ｐＡＲ９１に、そう入されたＤＮＡが５Ａ−１１遺伝子
９であったことを確認するために、ラジオラベルしたプ
ローブをゲル精製インサー）ＤＮＡから製造しそしてア
クリルアミドゲル上の電気泳動により分解されしかもシ
ーンスクリーンＣＧａｓｇｓｃｒｔｒｍｔ）（登録商標
）膜（ＮＥＮ）にプロットされる５Ａ−１１ｄａＥＮＡ
の混合物に交雑化された。

ＳＡ−１１遺伝子９クローンＤＮＡｆＰｓｔｉエンドヌ
クレアーゼに１’）ＰＡＲ９１から採取し、次にＳＡ−
１１ｅＤＮＡの精製について前述した如く、ＴＥＥバッ
ファー中の１％アガロースゲル上の電気泳動、遺伝子９
フラグメントの採取、電気温雅及びエルチップ（登録商
標）−ｄ法による回収にエフ精製した。精製した遺伝子
９ＤＮＡを、製造者のプロトコール（ＮＥＮ）に従って
（アルファー”Ｐ）ｄＣＴＰｆ＜用いてニックはん訳反
応で５ｔｐｌ、ラベルした。ニックはん訳され次遺伝子
９ＤＮＡは、ノーザン・プロット技術により遺伝子９へ
の交雑化のための５ｔｐｆラベルしたプローブとして働
く。

サイズマーカーとして用いられるラベルされていない５
Ａ−１１ｄｓＲＮＡ及びｎｐ　　Ｃ，全ラベルしたｄ８
ＲＮＡｆＴＥＥバッファー中の５％アクリルアミドゲル
上の電気泳動により分割した。分割したＲＮＡｆｆ、ス
トリー）　Ｃ８ｔｒｇｇｔ）ら「ジエー・ウイロロ、」
４３．３６９〜３７８（１９８２）の方法を用いて室温
で１５分間０．１ＭＮα０ＨＶＣ処理し次にりん酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ５，５）により洗うことにより
７に性した。変性したＲＮＡ’（、プロッティングバッ
ファーとして２０倍ＳＳＣ，０，０２５ＭＨａ　ＪＰ（
）４　／ＮａＨ２ＰＯ２（ｐＨ６，５）　ｅ用い、ペフ
エロエン（Ｐげｇｒｏａｎ）らｒＦＥＢ！；−レターズ
（Ｌｒｔｔａｒｓ）Ｊ１４５．３６９〜３７２（１９８
２）の方法に従ってシーンスクリーン（登録商標）膜（
ＮＥＮ’）に真空プロットされた。

プロットされｆｃＲＮＡｋ標準の交雑化プロトコールを
用い５０％ホルムアミドにより遺伝子９　　ｓ２Ｐ’に
ラベルした゛　ニックはん訳されたプローブにより交雑
化した。マニアチスら「モレキュラー・クローニングー
ア・ラボラトリ−・マニュアル」コールド・スプリング
・ノ１−バー・ラボラトリ−、コールド・スフリング・
ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）。特異性５Ａ−１
１ｄｓＲＮＡシーケンスへの遺伝子９プローブの交雑化
は、Ｘ線フィルム（コダックＸＡＲ−５’ｌを用いるオ
ートラジオグラフィにより決定された。

ノーザン・プロットの分析は、クローンされｆＴニーＤ
ＮＡプローブはゲノムセグメント９へ特異的に交雑しそ
してインサートが遺伝子９　　ｄａＲＮＡのクローンさ
れ＊ＤＮＡコピーであることを確認することを示した。

実施例４゜ ＳＡ−１１遺伝子９のクローンされたＤＮＡは、下記の
如くＭ１３クローニングベクター及びブライマーを用い
てサンガー（Ｓａ＊ｇｇデ）〔サンガーら「プロン・ナ
ツル・アカデ・サイ」７４．５４６３〜５４６７（１９
７７）］の方法に従ってシーケンスされ友。

遺伝子９ｆＰｓｔｌに工り採取しそして低融点アガロー
ス〔シー・プラークＣ８ｇａ　ＰｌａｑＳｐ）〕全用い
るアガロースゲル電気泳動により精製し次にＮＡＣ３−
プレパック（Ｐｒｇｐａｅ）　（登録商標）カラムＣＢ
ＲＬ）に適用し、洗滌しそして溶離した。精製したＰｓ
ｔｌフラグメントヲ制限エンドヌクレアーゼＢａ毒ＨＬ
Ｃｌａｌ及びＰｖｗｆｉにより切断した。

得られたフラグメントを下記の如く相補性部位を含むＭ
１３クローニングベクター［ｍｐ８及び惧ｐ９−　（Ｐ
ＭＢ　）：１ヘリゲートした。

Ｐｓｔｌ、　ＰｓｔＩ、　Ａｃｅｌにより切断されＬ町
タヘリゲートした１００ベースペアＣｂｐ）Ｐす１１ｑ
幻１フラグメン）　；　Ａｔ　ｅ　ｌ、孕巴Ｈ１にニジ
切断され穴空ｐ８及び倶ア９にリゲートした３００ｂア
Ｃ１ａｌ、Ｂａｎｇ　　ＨＩ　７ラグメン）　；　Ｂａ
ｎ　ＨＩ、企！ｌにニジ切断され次ｍｐ　Ｆ３及びｒｎ
ｐ９　　にリゲートした３　１０　ｂｙ　Ｂａｎ　　Ｈ
ｌ　、Ｐｖｓｔｆｉフラグメント；担１、Ｐｓｔｌによ
り切断されたｍｐ８及びｍｐ９ヘリゲートした４　５０
　ｈｐエリツ■、ＬすＩフラグメント；Ｂａｒｎ　　Ｈ
Ｉ、　Ｐａｔｌにより切断されたｍｐＦ３及びｍｐ’？
ｓリゲートシた６６０ｂｐＬミＨＩ、ＰすＩフラグメン
ト。

すべてのリゲートされたフラグメント全イー・コリＪＭ
１０３菌株ヘクローンした。ファージプラークを採取し
そして増殖して、標準のプラスミド精製方法を用いシー
ケンシングのだめの一本鎖ＤＮＡテンプレートを得た。

マニアチスら同上。

テンプレートを、製造者（ＰＵＢ　）にエフ特定されて
いる標準のサンガ一方法によりＭＬ３オリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いてシーケンスした。

第３図に提供される５Ａ−１１クロー：ｙＤＮＡｆ）Ｄ
ＮＡシーケンスの分析は、全遺伝子”９シーケンスが存
在することを示した。ボスら「プロン・ナツル・アカデ
・サイ」８０．３０９１〜３０９５（１９８３）及びエ
リアスら「ジエー・ウイロロ、」５０．６５７〜６６１
　（１９８４）により報告されている他の公表さ八たシ
ーケンスと５Ａ−１１クローンＤＮＡのシーケンスとの
比較は、エリアスらのシーケンスと比べたとぎ１２ベー
スペアの差、そしてボスらに比べたとき４の差を示した
。ＤＮＡシーケンスから誘導される推論されるアミノ酸
シーケンスは、エリアスらのそれと比べて８の差そして
ボスらに比べて３の差を有する。このクローンにユニー
クなアミノ酸の中で、ただ二つのみが位置６５（Ｉ−４
’）で変化しそして位置１１０（Ｅ−Ｇ）は保存されな
い。

実施例５゜ 第４図に示される如く、遺伝子９ＤＮＡｆ制限ヌクレア
ーゼＣ１ａｌ及びＥｃｏＲ１ｋ用いてｐＡＲ９１から採
取しそしてそれは第一のイニシエターメチオニｙ及び第
一の疎水性ドメインとともにＤＮＡに隣接する５′末端
ホモポリマーｄＧｆ除去した。インサートＤＮＡｋ前述
の如くゲル電気泳動、電気溶離そしてエルテップ（商標
）−ｄ法によＶ精製した。インサートＤＮＡ’に供給者
の指命Ｖ（ＢＲＬ）に従ってＤＮＡリガーゼを用いてｐ
Ｕｃ１３に結合した。

プラグ、ミドｐｊ７（１’１３は、リゲーションの前に
Ａｃｅｌ及びＥｃｏＲｌに工９分解された。リゲートさ
れたＤＮＡ’（、市販されている能力のある細胞＜ＢＲ
Ｌ）ｋ用いて標準の方法に工りイー・コリ菌株ｆｆＢ１
０１ヘクローンした。マニアチスら「モレキュラー・ク
ロー二ングーア・ラボラトリ−・マニュアル」コールド
・スプリング・パーバー拳うボラトリ−、コールド・ス
プリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）。得ら
れ喪構造物ＣｐＡＲ９１ΔＣｔα■）はｌａｃプロモー
ターて関して前方の配向で遺伝子９全置き、そしてエン
ドヌクレアーゼＰｓｔｌによるインサートの採取をさせ
た。

遺伝子９は次にＰｓｔＩによりｐＡＲ９１ΔＣ１ａｌが
ら採取されそして前述の如くゲル精製された。精製され
たインサートは、Ｐｓｔｌにエフ予め分解されたイー・
コリ・バキ二ロウイルス・シャトル・ベクター（ｐＡｃ
６１１）にリゲートされ、そして製造者の勧告に従って
仔つシ腸ホスファターゼ（ペーリンガー）によりホスフ
ァターゼされ次。リゲートされたＤＮＡは、標準の方法
に工り能力のある細胞（ＢＲＬ　）’（用いてイー・コ
リ菌株ＨＢ１０１ヘクローンされてｐＡｃＲ９１ΔＣ１
σｌの構造を生ずる。マニアチスら、同上。

得られるたん白は、第１表に示されるアミノ酸シーケン
スを含む。

完全な遺伝子９のアミノ酸位置３０の内部メチオニンコ
ドンは、インサートシーケンスの５′済接ＡＴＧとして
のその位置により、バキュロウィルス発現系の開始コド
ンとして働く。コザク（ｆｆｏｇｃｓ＆）ｒヌク・アシ
ツヅ・レスＣＮｘｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｇｇ、）」１２，
８５７〜８７２　（１９８４）。

前述した如く、このコドンは、は乳動物の細胞中のウィ
ルス合成中に生体中で作用するものと思われる。それ故
、それはＶＰ７のほん訳のための真正な開始部位を表わ
す。

実施例６゜ バキュロウィルス・オートグラファ・カリホルニカＣＡ
ｓｔｏｇｒａｐｈｃＬ　ｃａｌイｆｏｒｎｉｃａ）ＣＡ
　ｅＮＰＶ　）ｔシロナヤガ・スボドプテラ・フルギペ
ルダＣ３ｐｏｄｏｐｔａデＧｆｒｕｇイｐｅｒｄα）の
昆虫細胞系Ｃ３ｆ９　）中に増殖した。昆虫細胞の保持
及びＡｃＮＰＶウィルスによる感染は、テキサスＡアン
ドＭ太学、カレッジ・ステーション、テキサス（１９８
６）から要求により入手しうるプラークＣ８ｕｍｔｎｇ
ｒａ）及びスミス（ＳｗｆｔＡ）ｒア・マニュアル・オ
プ・メソツズ・フォア・バキュロウィルス・ベクターズ
・アンド・インセクト・セル・カルチュア・プロシデュ
アーズＣＡ　ＭａｆＬｓα１０ｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆ
ｏｒ　Ｂａｅｓｌｏｖｉｒｓｓ　１／ａｃｔｏｒｓ　ａ
ｎｄＩ％５ｅｃｔ　Ｃａ１ｌ　Ｃｕ１ｔｓｒａａ　Ｐｒ
ｏｃｇｄｓｒｅｓ）Ｊにより記述された如く行われた。

手短かに、Ｓｆ９細胞を、１０％ウシ胎児血清〔ハーゼ
ルトン（ＨｅＬｇｓｊｔｏｓ））　を補給されたイース
トレートＣＤＩＦＣＯ）（ＴＮＭ−ＦＩＮ！地）及びラ
クトアルブミン加水分解物（ＤＩＦＣＯ）を含むグレー
スズ（Ｇデαｃ＃８）培地（ＧＩＢＣＯ）（完全培地）
に生長させた。

！胞’ｋ　７５　ａｎ”フラスコ（コーニング）に置き
、ＣＯ２ガスなしに２７℃に保ち、そして２日置きに細
胞を振盪してゆるくすることにより分けた。ウィルスを
、ウィルスストックを２７℃で１時間細胞全吸着させ、
新しい培地を加えそして感染全２〜３日続けることによ
り生長させた。ウィルス感染は、多面体状の包接体（ポ
リヘデラ）の外観の特徴ヲ有シた。ＡｃＮＰＶ　　ｆト
ランスフェクションにおけるウィルスＤＮＡの源として
用いた。

ＡｃＮＰＶは示された通り精製されたが、ただしシュク
ロース勾配精製工程を除いた。プラーク及びスミス、同
Ｌウィルスを感染した細胞をペレットとして残骸を除き
、次に上澄液画分を高速度（３０分、ｉ　ｏ　ｏ、ｏ　
ｏ　ｏ　ｔ　）で遠心分離しそしてウィルスペレットを
回収した。つ・イルスＤＮＡを、１０％サルコシルを含
むバッファー中でプロテナーゼＫによりウィルスを処理
し次にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル（２５：２４：１）により抽出することにニジ単離し
た。ＤＮＡｆエタノール沈でん物とじて回収した。

ＡｃＮＰＶウィルスＤＮＡ及びイー・コリーバキュロウ
ィルス・シャトル・ベクター（例えばｐＡｃ６１１、ｐ
ＡｃＲ９１ＣｌαＩ）を、方法■で示したトランスフェ
クション法（ただし超音波処理サケ精子ＤＮＡｋ仔ウシ
胸腺ＤＮＡの代りとした）により昆虫細胞に移した。プ
ラーク及びスミス、同上。ＡｃＮＰＶウィルスＤＮＡ及
び組換えプラスミドＤＮＡ’（ｌ−ＨＥＰＥＳ−ホスフ
ェートバッファーと混合した。

ＤＮＡｋＣａＣ１２の添加にエフ沈でんさせた。ＤＭＡ
沈でん物ヲ、グレースズ培地にエフカバーされる昆虫細
胞へ加えた。ウィルス感染は、４〜６日間のインキュベ
ーション中ポリへドラの出現にエフ観察されうる。

ウィルス感染物は、プラーク及びスミス、同上に工９示
される如きウィルスプラークアッセイ（ただし、昆虫細
胞をして感染前に完全培地中の６０１ｍのプレート〔ヌ
ンクＣＮｕｎｃ）〕へ付着させる）を用いて定量された
。手短かに、６０鰭のプレートへ付着したＳｆ９細胞に
、ＤＮＡトランスフェクション又は昆虫細胞のウィルス
感染から生ずるＡｅＮＰＶウィルスの連続希釈全かぶせ
た。１時間（２７℃）後、細胞全完全培地を含む１．５
％低融点アガロース（シー・プラーク）にエフカバーし
た。４〜６日後、プラークが肉眼で認められ、それはポ
リへドラの集りの外観によ＃）特徴付けられた。インキ
ュベーションは、湿気のあるプラスチック箱中で行った
。

組換え５Ａ−１１遺伝子９シーケンスを含むウィルスプ
ラークは、Ａｅｃｌ及びＣ１ａｌエンドヌクレアーゼに
ニジ切断された精製遺伝子９ＤＮＡから誘導された３ｔ
ｐをラベルしたニックはん訳プローブによるプラークＤ
ＮＡの交雑化にエフ見分けられた。サマース及びスミス
、同上。アガロースを重ねられたウィルスプラークを含
む６０■のプレート全２〜４時間乾燥した。アガロース
層を除きそして４℃で貯蔵した。ニトロセルロースフィ
ルターディスクを皿に置ぎ、湿めらせそして細胞に対し
てプレスした。フィルターディスクを除きそして細菌コ
ロニー交雑化についてグルンスタイン及びホグネスによ
り王として記述された如く処理した。マニアチス、同上
。遺伝子９ニツクはん訳されたプローブを製造者の勧告
ＣＮＥＮ）に従って作った。交雑化したプラークｆＸ線
フィルム（コダックＸＡＲ−５）”ｆ：。

用いてオートラジオグラフィにより同定した。遺伝子９
シーケンスを含むプラークを、組換えＡｃＮＰＶウィル
ス−遺伝子９プラークの位置をマークしたニトロセルロ
ースフィルターのオートラジオグラムを染料マーカーを
用いてアガロースの上層に並べ、次にアガロースからプ
ラークを取りそして完全培地に懸濁することにより回収
した。プラーク精製をさらに同じ方法により行った力ζ
ただレアガロースの栓状物は肉眼で調べそしてプラーク
を次の研究のためにポリへドラ全欠くように見える領域
から取った。組換えプラークは、一般に２回精製される
プラークであった。

プラーク精製組換えウィルスが野生型ＡｃＮＰＶウィル
スによる汚染をうけていないことを確めるために、組換
えウィルスを９６穴プｖ−）に生長した昆虫細胞に種付
けされ、そして２〜３日後日ソポリラの出現について肉
眼で調べた。

ポリへドラはないが細胞病理を示す細胞を含む穴をプラ
ーク精製包接物マイナス表現型（ｏｃ’ｉｉ）として数
えた。培地金穴から除きそして接種物として４℃で貯え
た。各大中の細胞ｆＮａＯＨ次にＨ４アセテートを用い
て溶解し、そしてドツト・プロット・マトリックス（シ
ュライヒヤー・アンド・シュウエル）に適用し次に前記
の如く交雑化した。

ｏｃＥとして数えられセしてＳ、４−１１遺伝子９プロ
ーブに交雑化されるウィルスプラークを次の研究のため
に増殖した。９６系プレートからのウィルス接種物を用
（・て、２４穴プレート、６穴プレートそして２５ｃｆ
ｎ”のフラスコ（コー二：ｙグ）に次々にＳｆ９細胞を
感染することにより、ウィルスプラークを増殖した。２
５ｍ２のフラスコからの感染した培地は、次の分祈のた
めのウィルスを提供した。

実施例７゜ ａｃｃとして数えられそして遺伝子９プローブへ交雑化
されたプラーク？＃製つィルス単唐物（Ｂ１１．３）を
次の特徴づけのために選択した。２５鍋２のフラス甲の
Ｓｆ９細胞（３Ｘ１０’）を、細胞１１固当りの０．０
１．０１．１．０及びプラーク形成単位（ＰＦＵ）の感
染の多重度（ｆｉｇｓ）で感染した。感染を２７℃で４
０時間行った。４０時間の感染後、１，０及び１０　Ｐ
　Ｆ　Ｕ　／　１ｌｉｌｊｌ胞は、最大の細胞変性効果
（ｃｐＥ）を示したが、ポリへドラは見られなかった。

培地を除き、そして細胞をメチオニンのないグレースズ
培地で洗った。′Ｓをラベルしたメチオニン（５０ｕＣ
ｉ／ｍｌを１．５１のメチオニンのないグレースズ培地
に加えそして２７℃で４時間感染した細胞に通用した。

細胞を次にフラスコから除ぎ、そして１０００？で５分
間遠心分離した。

培地を次の分析のため一２０℃で貯えた。細胞を次にフ
ラスコから除きそして１００（ｌで５分間遠心分離した
。培地を次の分桝のため一２０℃で貯蔵した。

細胞を、ＰＢＳバッファー中でぬい次にフラスコ１個当
り１００　ｘｔのＲＩＰＡバッファーＣＩ　５０　％Ｖ
　ＮａＣ１゜１０萌トリス−ＨＣＬ、　ｐＨ７，２，１
チＮαデオキシコレート、１％トリトンｚ−ｉｏｏｏ、
ｏ、ｘｓＤｓ、１％アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｔｎ
）　〕に細胞ペレットを再懸濁しそして１５分間氷上に
置くことによりさらに処理した。核を１０．０００９で
５分間遠心分離することにより除きそして一２０℃で貯
えた。残りの細胞５Ｍ画分をシトツルとした。

未感染Ｓｆ９細胞、ＡｃＮＰＶ感染細胞及びＢ１１．３
感染細胞からの３Ｊｙｔラベルしたシトツルを、レムリ
「ネイチュアＪ　２２７．６８０〜６８５（１９７０）
に記載された方法に従って４％スタッキングゲルを有す
る１０％ｓＤｓポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を
用いて電気泳動により、たん白生成物について分析した
。ラジオラベルしたたん白の露田ハ、ゲルをＥＮライト
ニング（ｌｉｇｈｔ％ｉｇ）（商標）（ＨＥＮ）により
処理し乾燥しそして一７０℃でクアンタ（Ｑ−ｕａｎｔ
ａ）　ＩＩＩ　（商標）増強スクリーン（デュポン）を
有する）Ｊフィルム（コダックＸＡＲ−５）０）下Ｖ’
。

置くことにより、増大てれた。

ゲル電気泳動による３Ｊをラベルしたたん白の分割は、
３４．０００キロダルトン（３４Ｋ）のたん日が８１１
．３感染細胞で合成され、それは未感染細胞には存在す
ることなく、セしてＡｃＮＰＶ感染細胞で合成畑れたポ
リヘトリンたん臼と同様な移旬度を有することを示した
。このたん日は、ＡｃＮＰＶ、ｆ、染料！胞中すボリヘ
ドリン定ん白とＩＩ？１様な口でシイツル中に存在する
ようであった。

実施例８゜ ＰＡＧＥにより既に分解された未感染＋ｖ（ＩＩ胞、Ａ
ｃＮＰＶ感染細胞でらに８１１．３感染ＩｗＩｌｌ泡か
らの３５８をラベルしたシトツルを、免役沈でんアッセ
イにおいて５Ａ−１１０タウイルス〔Ｍ、に、エステス
（Ｅｓｔｇｓ）、ベイロア（Ｂａｙｌｏｒ）大学、ヒユ
ーストン、テキサスから人手〕に対する中和抗血清と反
応するラベルしたたん白の能力について調べた。

ラベルしたシトツルは、メーｆソン（Ａｆαｓｏ？Ｓ）
ら「ウィロロジーＪ　３３．１１１〜１１２１（１９８
０）に従っり方法により、イＱ、０００甲和滴定（Ｍ、
に、エステス）を有することが既に示されて（・るＳ、
４−１１０メウイルスに対するモルモット抗血清、正常
のモルモット血清又は無血清の何れかと反応させられた
。免投コンプレックスたん白に、プロティンＡセファロ
ース（商標）−ＣＬ４Ｂ（ファルマシア）に結合し、そ
して未結合のたん日は、メイソンら、同上により示され
る如く除云された。プロティンＡ沈でんたん白は、レム
リら、同上の方法に促って４％スタッキングゲルを有す
る１０％ポリアクリルアミドゲル上（１）１ば気泳動に
より分割された。

給米は、未感染又はＡｃＮＰＶ感染ｍ１１１胞からの３
５３　　をラベルされたたん白は、免投沈でんによりテ
ストされる抗血清に対して反応しないことを明らかに示
−［。Ｂ１１．３シトンルからのユニークな３にたん日
は、モルモット抗ロタウイルス血清と反応性があるが、
正常なモルモット血清又は無血清では反応性がないこと
が分った。これらの結果は、初めて、ロタウィルス株（
ＳＡ−１１）の王な外部キャプシドたん白（ＶＰ７）に
ｆ以だサブユニットたん白が、抗原性生成物を生ずるバ
キュロウィルス発現系中でサブユニットたん臼として合
成されることを示す。

実肩例９゜ バキュロウィルス発現系中の発現中の理髪培地へのＶＰ
７の分泌 ３５ｇメチオニンによる４時間のラベリング後に採取さ
れたＡｃＮＰＶ感染及びＢ１１．３感染細胞からの組織
瑞養培地を、ラベルし１こたん白の存在について調べた
。４％スタッキングゲルを有する１０ポリアクリルアミ
ドゲル上の電気泳ｄ（レムリ、同上）による培地の分徘
に、ＡｃＮＰＶ感染細胞からでにないがＺ？１１．３感
染細胞から分泌される３４にのユニークなたん日を開示
した。ＡｅＮＰＶ　及びＺｉｊｌｌ、３感染細胞の両方
に見い出される２１１の他のたん白物のみが、かなりの
世で存在した。これらのデータは、任意の発現系中の分
泌しつる生成物として天然のロタウィルスの王な外部キ
ャプシドだん、白（ＬＰ７）に似たすてユニットの生成
の最初の証明である。ＴｆＦ？生成物の分泌は、特にも
し昆虫細胞がウィルス感染中無血清層地に保持されるな
らば、純度の高い形でたん白ケ回収することを非常に容
易にする。

実施例１゜ 酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を抗ロタウィ
ルス抗体の存在χ検出てるために開発した。アッセイに
おいて、ｆｉｉ熾培妥シトツルは、ラベルされて（・な
いメチオニンが培養壜地に存在することを除いて、実施
例７に記載された如く、未感染、ＡｃＮＰＶ　感染そし
てＢ１１．３感染細ｊ泡から誘導した。シトンルをＰＢ
Ｓバッファー中イ。、扇及びイ００希釈で９６穴プレー
トに適用し、４℃で１晩放置した。吸着しな（・シトン
ルをＰＢＳにより５回洗うことにより除（・た。ＰＢＳ
中の２％ＢＳＡ’ｌｌブロッキング剤として５口え、３
７℃で１時間インキュベートし、過剰のＥＳＡ　ｆＰＢ
Ｓにより５回洗うことにより除いた。次に、第一の抗体
（モルモット抗５Ａ−１１０タウィルス）をイ０゜０希
釈で加えすして３７−ｃで１時間インキュベートした。

穴’ｆｆＰＢｓにより５回洗いそして第二の抗体を加え
（ヒツジ抗モルモット）、３７℃で１時間イ。。。希釈
でホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＩ））に
結合させた。ＰＢＳで５回洗い、次に０２％過酸化水素
を含むくえん酸塩−ホスフ王−トバッファー希沢９勿甲
の０−フェニレンジアミン・２ＨＣ１（ＯＰＤ）よりな
る呈色／！ｒｌＰｒｍえた。呈色反応を室温で１５分間
発色させた。正の抗原・抗体反応が、プレートの穴でオ
レンジ色として見られた。反応は、１　／Ｖ　Ｈｔ　Ｓ
　０４の添加により停止された。色の強度は、イムノリ
ーダー（Ｉ濯ｍｕｎｏｒｍａｄａデ）ＮＪ−２０００分
元元度計〔イ／ターメツド（ｒａｔｅ慴ｔｇｄ）］上の
分九法によりＴ鍵された。

第２表は、ＥＬＩＳＡによるバキュロウイルス−昆虫細
胞系で発現された主な外部キャプシドたん白（ＶＰ７　
）の検出を示す。ＡｃＮＰＶ　の発現された遺伝子生成
′吻は、５Ａ−１１０タウイルスに対する中和抗血清に
対する反応性を比べて、未感染細胞について観察される
のとｌｒ１様なバックグラウンド数を与えた。逆に、組
換えＶＰ７を発現するＢ１１．３ｉ、ＥＬＩＳＡにより
再現しつる正のシグナル７生ずることが観察された。

第　　　２　　表 イｏ　　　　　　　Ｏ，１６２０，１０００，５８３イ
。　　　　　　０．２６６　　０．３３０　　　０．９
３フイ。。　　　　　０．３０５　　０．２７９　　０
．９４９このアッセイは、血液、唾液又は排泄物のサン
プル中のロタウィルス抗体の存在を検出するのに有用で
あり、その上ロタウィルス型特異性を決定する早いアッ
セイをもたらすだろう。

実施例１１゜ 不発明による組換えバキュロウイルス−遺伝子９Ｂ！５
染昆虫細胞からの単離物ば、カラム積置され、そして抗
血清又はワクチンを生成するのに用いられる場合がある
。

抗血清は、下記の叩く、不発明による精製された組換え
ＶＰ７たん白の注射によりウサギを免疫化することによ
り特異的に生成されるだろう。第一の移植物は、フロイ
ント（Ｆｒｍｓ♂ｄ）のに全なアトシュバントとともに
抗原を宮む。

次の移植物は、抗原及び７０インドの不完全なアトシュ
バントを営む。動物を出血させて血清を得る。ポリクロ
ーナル抗体をアフイニテイクロマトグラフイにより血清
から単離してもよい。これらのポリクローナル抗体は、
例えばアボット・ラボラトリーズ、ノース・シカゴ、イ
リノイから人手しうるロタチーム（Ｒｏｔａｚｙｍａ）
（商標）イムノアッセイの如きサンプル中すロタウイル
スの償出のための診断アッセイ中の試築として利用しつ
る。

受動ワクチンは、本発明によ／）精製した組換えＶＰ７
たん日の注射により動物を免疫化することにより生成さ
れよう。サブユニットＶＰ７に向けられるポリクローナ
ル抗体は、動物の血清、乳又は他の体液から単離される
。これらに、ざらに精製されそして治療又は予防の応用
に用（・られ本発明による能動ワクチン浴液は、免疫学
的に許容しつる希釈剤、アトシュバント及び担体中に本
発明による組換えＶＰ７を懸濁することにより製造され
る。ワクチン浴液の最初そしてブースター注射又は経口
投与は、免疫を与えるために用いられよう。

実施例１２、 本発明によるモノクローナル抗体は、グリーンバーブ（
Ｇｒａｇｎｂａｒｇ）ら「ジエー・ウイロロＪ４７，２
６７〜２７５（１９８３）の方法により製造される場合
があるが、ただしそこに用いられているロタウィルス該
組物の代りに不発明による組換えＶＰ７たん白の浴液を
用いる。グリーンバーブら框、木切１１ｋｌ”５におい
て参考文献として引用する。

基本的に、モノクローナル抗体に、実施例１１に記載さ
れたクロク免疫投与電の組換えＶＰ７たん白ｔマウスに
注射することにより生成てれる。牌は免疫化された動物
から除去され、セして牌ａ胞はポリエチレングリコール
を用いて骨髄腫細胞（例えばＮ５−１＃ｆＢ胞）に融合
される。モノクローナルを生成するハイブリドーマ細胞
をヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ
）培地中でスクリーニングすることにより選択する。Ｖ
Ｐ７組換えたん白に特異的なモノクローナル抗体は、こ
のようなノ・イブリドーマが培養きれた培地からアフイ
ニテイクロマトグラフイにより単離されよう。

本発明は好ましい態様について記述されているが、改変
及び改良に当業者に生ずるものと考えられる。例えば、
本発明によれば、バキュロウィルスに感染てれた昆虫ｍ
織培養に発現されたｍ換えＶＰ７たん白は、低コストで
多重に合成される。このような抗原は、又部位付異的突
然変異により修飾されて、診断用又はワクチン用例えば
高Ｔ止力又は広いスペクトルな有するワクチンとしての
優れた抗原性をイイする４ハ（］を提供する。

従って、特許請求の範閂に、本発明の範囲内に入るこの
ようＬ等しく・変化を含むことを目的とする。

【図面の簡単な説明】

第１図に、本発明によるｃＤＮＡのライブラリーの＄１
．ｉ成の紺略ヅであり、第２図は、不発Ｉす」によるロ
タウィルス５Ａ−１１遺伝子９ｃＤＮＡの部分的制限マ
ツプであり、第３図μ、本発明によるロタウィルス５Ａ
−１１遺伝子９に関する杉酸ンーダンスと発表されたシ
ーケンスとの比較であり、第４図は、不発明によりバキ
ュロウィルスゲノムに七う人するための組換えたん白を
コーディングする遺伝子を含む村造の概略図である。 Ｆｉｇ　　　に 一 ５’−ＧＧＧＧ３’ 図面の浄１）（内容に変更ない ぺ 八 よご 、Ｉ＼ 、ｇ） ！ 叶　町　陳　的　芝三　的　コ己　的　？ｊ　　’　３
　　職蒼　＝　コ　ヨ　ｉ；、：　　コ　ミ　ミ　＝　
ヨ’　　：　　＝　　、ｊ　　＝＊冒　９　シ　ョ　３
　こ３　　　　　＋（（（５ 譬　　ｇ　　　６　　ｗ；、　　　３　　　Ｑ　　　３
　　　ご　　８　　＝　　二ψ　　　１＋　　　の　　
　べ　　　Φ　　　リ　　　Φ　　　クー（＜１　　　
″　　　６　　　　ｍ　　　　′Ｊ　　　−。 ＝　　、　　。　　＆Ｊ　　ゆ　　　、　　−〇　　。 −ローロ　ベ　−　−イ　Ｑ　＝　曾　篭１　　二　　
３　　巳　　：　　　’ｕ　　　３　　　′：３　　　
イ　　。　　−；　　　＝ 茸　　：′　　乙　　；　　謔　　８　　＝　　；　　
８　　ロ　　−粍　５コ　闘　蛇　ｇ＜　　花　酔　緒
　闘　畦　■己　己　３　コ　ｉ　；　り　８Ｊ　　盲
　二　８０　　　　ベ　　　　−　　　　り　　　　υ
　　　　（ｖ−４４１＜　　　　　ｌ；、　　　　　罐
　　　　’ｊａ　　　　　ｕ　　　　　＋５　　　　＋
−ロ　　　　−　　　　（□　　　　ψ″Ｊ　　’Ｃ３
−ｄ　　　″　　嘗　　；　　　；　　　３　　５　　
　＋’（Ｑ　　　−べ　　　＜ａ＜ａａ　　　　ロ　　
　く＜−＜；

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）バキュロウイルス−昆虫細胞発現系で生ずる組換
   えロタウイルス外部キャプシドサブユニットたん白。
2. （２）該たん白が主な外部キャプシドたん白（ＶＰ７）
   である特許請求の範囲第（１）項記載の組換えロタウイ
   ルスサブユニットたん白。
3. （３）該たん白がロタウイルス血清型３に対する抗血清
   と特異的に反応しうるロタウイルスたん白である特許請
   求の範囲第（２）項記載の組換えロタウイルスサブユニ
   ットたん白。
4. （４）該たん白がロタウイルスＳＡ−１１たん白である
   特許請求の範囲第（３）項記載の組換えロタウイルスサ
   ブユニットたん白。
5. （５）イ−・コリ−バキュロウイルスシャトルベクター
   にそう入される特許請求の範囲第（１）項記載の組換え
   サブユニットたん白をエンコードする核酸。
6. （６）組換えサブユニットたん白が約３４キロダルトン
   の分子量を有しそしてロタウイルスＳＡ−１１に対する
   中和抗血清と反応しうる、バキュロウイルス−昆虫細胞
   発現系で生ずるロタウイルスＳＡ−１１の主な外部キャ
   プシドたん白（ＶＰ７）の組換えサブユニットたん白。
7. （７）抗ロタウイルス抗体を含むサンプルを特許請求の
   範囲第（１）項記載の組換えサブユニットたん白にさら
   し、たん白は支持体に結合しており； ラベルと結合した抗ロタウイルス抗体に対して特異的な
   抗体を導入し；そして 支持体に結合したラベルの存在を決定する工程よりなる
   サンプル中の抗ロタウイルス抗体の存在を検出するアッ
   セイ。
8. （８）免疫学的に許容しうる希釈剤、アジュバント又は
   担体及び特許請求の範囲第（１）項記載の組換えサブユ
   ニットたん白よりなるワクチン。
9. （９）有効量の特許請求の範囲第（１）項記載の組換え
   サブユニットたん白により動物を免疫にし；そして 抗ＶＰ７抗体を動物の血清、乳又は他の体液を単離する
   工程よりなる特許請求の範囲第（１）項記載の組換えサ
   ブユニットたん白に対するポリクローナル抗体を生成す
   る方法。
10. （１０）特許請求の範囲第（９）項記載の方法により生
    成したポリクローナル抗体。
11. （１１）有効量の特許請求の範囲第（１）項記載の組換
    えサブユニットたん白により動物を免疫にし； 動物からの抗体を生成する細胞と骨髄腫細胞とを融合し
    ；ＶＰ７に対するモノクローナル抗体を生成する培養媒
    体中でハイブリドーマを単離し；そして 培養媒体からモノクローナル抗体を精製する工程よりな
    る特許請求の範囲第（１）項記載の組換えサブユニット
    たん白に対するモノクローナル抗体を生成する方法。
12. （１２）特許請求の範囲第（１１）項記載の方法により
    生成されたモノクローナル抗体。
13. （１３）特許請求の範囲第（１０）項記載のポリクロー
    ナル抗体よりなる受動ワクチン。
14. （１４）特許請求の範囲第（１２）項記載のモノクロー
    ナル抗体よりなる受動ワクチン。