JPS63273478A - バクロウィルス発現系を使ったロタウィルス遺伝子の合成と免疫原性 - Google Patents
バクロウィルス発現系を使ったロタウィルス遺伝子の合成と免疫原性Info
- Publication number
- JPS63273478A JPS63273478A JP63000247A JP24788A JPS63273478A JP S63273478 A JPS63273478 A JP S63273478A JP 63000247 A JP63000247 A JP 63000247A JP 24788 A JP24788 A JP 24788A JP S63273478 A JPS63273478 A JP S63273478A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- rotavirus
- protein
- recombinant molecule
- proteins
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 title claims description 91
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 284
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 127
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 61
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 34
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 26
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 claims description 24
- 108700010850 rotavirus proteins Proteins 0.000 claims description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 claims description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 6
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 claims description 5
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710138767 Non-structural glycoprotein 4 Proteins 0.000 claims description 5
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 claims description 3
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 claims description 2
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 claims 3
- 101150000874 11 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101000701737 Banna virus (strain Indonesia/JKT-6423/1980) Spike protein VP9 Proteins 0.000 claims 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 claims 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 89
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108700020497 Nucleopolyhedrovirus polyhedrin Proteins 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101710136311 Protein VP6 Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000725302 Adult diarrheal rotavirus Species 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000796533 Arna Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000702673 Bovine rotavirus Species 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101710169873 Capsid protein G8P Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000617996 Human rotavirus Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 101710156564 Major tail protein Gp23 Proteins 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 101000666903 Naja atra Kunitz-type serine protease inhibitor NACI Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010036939 Occlusion Body Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001137860 Rotavirus A Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000702677 Simian rotavirus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O Chemical compound [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 244000000021 enteric pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011245 gel electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 230000036178 pleiotropy Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002637 putamen Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000010420 shell particle Substances 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006656 viral protein synthesis Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12111—Orbivirus, e.g. bluetongue virus
- C12N2720/12122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/826—Viruses
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
見匪座分立
本発明は一般的にいってバクロウィルス系でロタウィル
ス遺伝子の発現する方法に関する。
ス遺伝子の発現する方法に関する。
より特定すればこの発明はロタウィルスによって起こさ
れる消化器疾患の検出およびロタウィルス感染に対する
ワクチンの開発に使われる抗原の産生のためにバクロウ
ィルスベクターを使ったロタウィルス遺伝子の発現に関
する。
れる消化器疾患の検出およびロタウィルス感染に対する
ワクチンの開発に使われる抗原の産生のためにバクロウ
ィルスベクターを使ったロタウィルス遺伝子の発現に関
する。
見旦匹里見
ロタウィルスが致死性の小児下痢症の重要な原因物質で
あるという認識は、このウィルスを制御し病気を防ぐた
めに多大の努力を行わせてきた。〔エステス等、「ロタ
ウィルス抗原」。
あるという認識は、このウィルスを制御し病気を防ぐた
めに多大の努力を行わせてきた。〔エステス等、「ロタ
ウィルス抗原」。
アタッシ及びバックラッチ編「蛋白とペプチドの免疫学
−■」プレナム出版ニューヨーク２０１−１４頁（１９
８５年） ； Ａ、Ｚ、カピキアン等著、Ｂ、Ｎ、フィ
ールズ等編の「ウィルス学」ラーヴン出版ニューヨーク
、８６３−９０６頁（１９８５年）、〕口から水を与え
ることは下痢症による死亡率を減らすのに効果的な方法
であることが知られているが、他の方法が患者を減らし
おそらくはこの病気を撲滅するためには必要とされる。
−■」プレナム出版ニューヨーク２０１−１４頁（１９
８５年） ； Ａ、Ｚ、カピキアン等著、Ｂ、Ｎ、フィ
ールズ等編の「ウィルス学」ラーヴン出版ニューヨーク
、８６３−９０６頁（１９８５年）、〕口から水を与え
ることは下痢症による死亡率を減らすのに効果的な方法
であることが知られているが、他の方法が患者を減らし
おそらくはこの病気を撲滅するためには必要とされる。
この病気の撲滅には全地球上の人類の規模で免疫をする
ことが必要とされよう。この免疫は生きているが弱めら
れた病原体そのもの、または病気を中和して防ぐように
する（おそらくは抗体によって仲介されて）病原体に特
異的な抗原性蛋白が用いられる。ロタウィルスの遺伝子
構造を解明することはこの病気を撲滅するために大いに
役立てられよう。
ことが必要とされよう。この免疫は生きているが弱めら
れた病原体そのもの、または病気を中和して防ぐように
する（おそらくは抗体によって仲介されて）病原体に特
異的な抗原性蛋白が用いられる。ロタウィルスの遺伝子
構造を解明することはこの病気を撲滅するために大いに
役立てられよう。
生きたロタウィルスのワクチンを使う際には効果と安全
性に付随していくつかの問題がある。
性に付随していくつかの問題がある。
（１）この病気の「穏和」な症状を示すだけのワクチン
は消化器官に安全で効果的な免疫を提供しない、ウィル
スはその後の感染に対する抵抗をつけるのに比較的有効
であるけれども減弱したウィルス株で経口ワクチンとし
てもたらされる抵抗力は様々である。
は消化器官に安全で効果的な免疫を提供しない、ウィル
スはその後の感染に対する抵抗をつけるのに比較的有効
であるけれども減弱したウィルス株で経口ワクチンとし
てもたらされる抵抗力は様々である。
（２）減弱したウィルスがウィルス性をぶりかえす重大
な危険性がある。
な危険性がある。
（３）生ワクチンは文明国の子供に供試された場合には
効果的で安全であるけれども、同じワクチンが発展途上
国の子供に安全である保証はない。これは下痢症に対す
る感受性が未開発国の子供においては栄養不良やあるい
は他の病原体の合併感染のために高められるので重大な
関心事である。
効果的で安全であるけれども、同じワクチンが発展途上
国の子供に安全である保証はない。これは下痢症に対す
る感受性が未開発国の子供においては栄養不良やあるい
は他の病原体の合併感染のために高められるので重大な
関心事である。
（４）生産や安全性試験の費用や流通のコストがかかる
ために最も必要とされる発展途上国において生ワクチン
は避けられるだろう。
ために最も必要とされる発展途上国において生ワクチン
は避けられるだろう。
（５）最後に発展途上国では多数の腸内性病原体の合併
感染がワクチンの効果を防げるだろう。
感染がワクチンの効果を防げるだろう。
ロタウィルスの染色体は１１の断片の二重鎖ＲＮＡから
成っている。染色体のＲＮＡはＶＰｌとＶＰ９と呼ばれ
る構造タンパクから成る二重層の蛋白被殻の中に包まれ
ている。［Ｍ、にエステス等、「ロタウィルス抗原］、
アタツシ及びパックラッチ編「蛋白とペプチドの免疫学
−■」より、プレナム版ニューヨーク、 ２０１−１４
頁（１９８５年）〕夫々の染色体断片は少くとも１つの
蛋白をコードしている。［ｖ、に、チアン等、ウイロロ
ジー、１５１巻、２４３−２５２（１９３６年）、Ｂ、
Ｂメイソン等、ジャーナル・オブ・ウィロロジー、４６
巻、４１３−４２３頁、（１９３３年）〕。外殻の蛋白
のＶＰ６はウィルスによる血球凝集素として作用し、抗
体を中和する働きも示す。ＶＰ６は抗原抗体の中和をも
たらす外殻の糖蛋白である。ＶＰ６は全てに付着する蛋
白であると報告されている。
成っている。染色体のＲＮＡはＶＰｌとＶＰ９と呼ばれ
る構造タンパクから成る二重層の蛋白被殻の中に包まれ
ている。［Ｍ、にエステス等、「ロタウィルス抗原］、
アタツシ及びパックラッチ編「蛋白とペプチドの免疫学
−■」より、プレナム版ニューヨーク、 ２０１−１４
頁（１９８５年）〕夫々の染色体断片は少くとも１つの
蛋白をコードしている。［ｖ、に、チアン等、ウイロロ
ジー、１５１巻、２４３−２５２（１９３６年）、Ｂ、
Ｂメイソン等、ジャーナル・オブ・ウィロロジー、４６
巻、４１３−４２３頁、（１９３３年）〕。外殻の蛋白
のＶＰ６はウィルスによる血球凝集素として作用し、抗
体を中和する働きも示す。ＶＰ６は抗原抗体の中和をも
たらす外殻の糖蛋白である。ＶＰ６は全てに付着する蛋
白であると報告されている。
主要な殻蛋白のＶＰ６は内殻に存在している。
この蛋白はウィルスの粒子の蛋白体の８０％以上をなし
ており、サブグループの抗原（Ｓ抗原■Ｐ６）を含んで
いる。（Ｍ、に、エステス等著、「ロタウィルス抗原」
阿、ｚ、アタッシ等編、「蛋白とペプチドの免疫学−■
」より、ニューヨーク州プレナム出版、２０１−２１４
頁（１９８５年）〕。ウィルス粒子にＶＰ６が存在する
ことはウィルス性のポリメラーゼ活性と関連している〔
Ｐ、ビーカン等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、第６巻、１１１３−
１１１７頁（１９８２年）） 、 ｖｐ６は複製と集合
の間にウィルス蛋白と相互作用する。［Ｍ、に、エステ
ス等著、ｒロタウィルス抗原］に、Ｚ、アタッシ等編、
「蛋白とペプチドの免疫学−■」より、ニューヨーク州
プレナム出版、２０１−２０４頁（１９８５年）〕。こ
の相互作用は完全には理解されていないけれどこれはＲ
ＮＡ染色体の分離体または翻訳体に結合することに関与
している。ＶＰ６は寡量体の、おそらくは三量体の構造
をしている。〔阿、Ｃ，ゴルジグリア等、Ｊ、Ｇｅｎ。
ており、サブグループの抗原（Ｓ抗原■Ｐ６）を含んで
いる。（Ｍ、に、エステス等著、「ロタウィルス抗原」
阿、ｚ、アタッシ等編、「蛋白とペプチドの免疫学−■
」より、ニューヨーク州プレナム出版、２０１−２１４
頁（１９８５年）〕。ウィルス粒子にＶＰ６が存在する
ことはウィルス性のポリメラーゼ活性と関連している〔
Ｐ、ビーカン等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、第６巻、１１１３−
１１１７頁（１９８２年）） 、 ｖｐ６は複製と集合
の間にウィルス蛋白と相互作用する。［Ｍ、に、エステ
ス等著、ｒロタウィルス抗原］に、Ｚ、アタッシ等編、
「蛋白とペプチドの免疫学−■」より、ニューヨーク州
プレナム出版、２０１−２０４頁（１９８５年）〕。こ
の相互作用は完全には理解されていないけれどこれはＲ
ＮＡ染色体の分離体または翻訳体に結合することに関与
している。ＶＰ６は寡量体の、おそらくは三量体の構造
をしている。〔阿、Ｃ，ゴルジグリア等、Ｊ、Ｇｅｎ。
Ｖｉｒｏｌ 、 、第６６巻：１８８９−１９００頁（
１９８５年）〕。さらにＶＰ６は臨床検査的な酵素結合
免疫吸着分析法で検出される主要蛋白である。（Ｇ、Ｍ
、ベアード等、Ｊ、Ｃ１１ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
、第１９巻：２４８−２５４頁（１９８４年）〕、これ
を中和し保護する抗体は外殻のＶＰ６とＶＰ３抗原に対
して作られるが、その他の構成的蛋白であるＶＰＩ、２
，６，９の役割についての知見は感染を防ぐことにおい
てはわかっていない。その上、その他の遺伝子産物例え
ば非構成的な蛋白（ＮＳ３５ 、３４ 、２８）もロタ
ウィルス染色体によって合成される。
１９８５年）〕。さらにＶＰ６は臨床検査的な酵素結合
免疫吸着分析法で検出される主要蛋白である。（Ｇ、Ｍ
、ベアード等、Ｊ、Ｃ１１ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
、第１９巻：２４８−２５４頁（１９８４年）〕、これ
を中和し保護する抗体は外殻のＶＰ６とＶＰ３抗原に対
して作られるが、その他の構成的蛋白であるＶＰＩ、２
，６，９の役割についての知見は感染を防ぐことにおい
てはわかっていない。その上、その他の遺伝子産物例え
ば非構成的な蛋白（ＮＳ３５ 、３４ 、２８）もロタ
ウィルス染色体によって合成される。
発現ベクター系は昆虫のバクロウィルス〔（エウトグラ
ファ・カリフオルニカの該多面性ウィルス症のウィルス
（ＡｃＮＰＶ））からのものである。
ファ・カリフオルニカの該多面性ウィルス症のウィルス
（ＡｃＮＰＶ））からのものである。
ＡｃＮＰＶは約１３０キロの塩基数の二重鎖の環状ＤＮ
Ａの染色体をもっており、最も強力に研究されたバクロ
ウィルスである。（Ｌ、に、 ミラー、２０３−２７４
頁（１９８１年）〕。ＡｃＮＰＶは二相性の複製環をも
ち、その夫々の相の間に異なった形の感染性ウィルスを
形成する。感染後（Ｐ、ｉ、）１０〜２４時間の間に、
細胞外のウィルス″は細胞膜を通して核殻の出芽によっ
て生産されるｅ Ｐ−１−１５から１８時間後までに、
核殻は核の中に包みこまれ不完全結晶性の蛋白体の中に
埋蔵されるがこれはポリヘドリンと呼ばれる単一の主要
蛋白から作られる。感染されたスポトプテラ・フルギベ
ルダ（秋のアワヨトウ、鱗翅類）の細胞ではＡｃＮＰＶ
のポリヘドリンは多量に蓄積し細胞の中の全蛋白体の２
５％あるいはそれ以上になる。これはウィルスに感染し
た真核細胞中の他の蛋白よりも多量に合成されている。
Ａの染色体をもっており、最も強力に研究されたバクロ
ウィルスである。（Ｌ、に、 ミラー、２０３−２７４
頁（１９８１年）〕。ＡｃＮＰＶは二相性の複製環をも
ち、その夫々の相の間に異なった形の感染性ウィルスを
形成する。感染後（Ｐ、ｉ、）１０〜２４時間の間に、
細胞外のウィルス″は細胞膜を通して核殻の出芽によっ
て生産されるｅ Ｐ−１−１５から１８時間後までに、
核殻は核の中に包みこまれ不完全結晶性の蛋白体の中に
埋蔵されるがこれはポリヘドリンと呼ばれる単一の主要
蛋白から作られる。感染されたスポトプテラ・フルギベ
ルダ（秋のアワヨトウ、鱗翅類）の細胞ではＡｃＮＰＶ
のポリヘドリンは多量に蓄積し細胞の中の全蛋白体の２
５％あるいはそれ以上になる。これはウィルスに感染し
た真核細胞中の他の蛋白よりも多量に合成されている。
ポリヘドリンはウィルスによってコードされており、そ
の遺伝子は地図が描けており、配列もわかっている。ポ
リヘドリン遺伝子の存在または発現は感染性の細胞外ウ
ィルスの生産には必要とされない。脱落や挿入によって
ポリヘドリン遺伝子を不活性にすることで感染細胞に咬
合を産しない変異体を生じる。これらの咬合陰性のウィ
ルスは野生型のウィルスによって作られるプラークとは
異なるプラークを形成する。
の遺伝子は地図が描けており、配列もわかっている。ポ
リヘドリン遺伝子の存在または発現は感染性の細胞外ウ
ィルスの生産には必要とされない。脱落や挿入によって
ポリヘドリン遺伝子を不活性にすることで感染細胞に咬
合を産しない変異体を生じる。これらの咬合陰性のウィ
ルスは野生型のウィルスによって作られるプラークとは
異なるプラークを形成する。
その異なるプラークの型態をみることは形質転換したウ
ィルスをスクリーニングする手段として有用である。
ィルスをスクリーニングする手段として有用である。
見肌夏炎り
本発明の目的はバクロウィルスであるアウトクラファ・
カリフオルニカの核性多面性ウィルス症のウィルスのポ
リヘドリン遺伝子プロモーターとロタウィルスの構造遺
伝子を含む形質転換分子を産することである。
カリフオルニカの核性多面性ウィルス症のウィルスのポ
リヘドリン遺伝子プロモーターとロタウィルスの構造遺
伝子を含む形質転換分子を産することである。
本発明のもう一つの目的はロタウィルスの下痢症に対す
るワクチンを提供することである。
るワクチンを提供することである。
強力なポリヘドリン遺伝子プロモーターとロタウィルス
の外殻蛋白遺伝子を含む形質転換分子を作ることが本発
明の別の目的である。
の外殻蛋白遺伝子を含む形質転換分子を作ることが本発
明の別の目的である。
本発明のもう一つの目的は強力なポリヘドリン遺伝子の
プロモータとロタウィルスの内殻蛋白の遺伝子を含む形
質転換（組換え）分子を作ることである。
プロモータとロタウィルスの内殻蛋白の遺伝子を含む形
質転換（組換え）分子を作ることである。
その上に、強力なポリヘドリン遺伝子のプロモータとロ
タウィルスの非構造蛋白の遺伝子を含む組換え分子を作
ることが本発明の目的である。
タウィルスの非構造蛋白の遺伝子を含む組換え分子を作
ることが本発明の目的である。
強力なポリヘドリン遺伝子のプロモータと１つ以上のロ
タウィルス遺伝子を含む組換え分子を形成することが本
発明の付加的目的である。
タウィルス遺伝子を含む組換え分子を形成することが本
発明の付加的目的である。
それに加えて、ヒトや動物でロタウィルス感染の簡単な
検査法を提供することが本発明の目的である。
検査法を提供することが本発明の目的である。
本発明のもう一つの目的はロタウィルスの抗体を作るこ
とである。
とである。
本発明のもう一つの目的はその構造的特徴を明らかにす
るために十分な蛋白を提供することである。
るために十分な蛋白を提供することである。
本発明のもう一つの目的はその機能的特徴を明らかにす
るために十分な蛋白を提供することである。
るために十分な蛋白を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、文明国や開発途上国でロタ
ウィルス感染の検査ができる検査キットである。
ウィルス感染の検査ができる検査キットである。
本発明の一面はバクロウィルス遺伝子のプロモータ、少
くとも一つのロタウィルス遺伝子を含む組換え分子の提
供であり、そのプロモータは前記遺伝子に空間的に関連
（Ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎ）をもっていてそ
のためにロタウィルス遺伝子の発現を制御しているもの
である。好ましくはプロモータはバクロウィルスのポリ
ヘドリン遺伝子のプロモータで遺伝子がロタウィルスの
ジーンｌ （ｇｅｎｅｌ） ＋ジーン２．ジーン３．ジ
ーン４．ジーン５．ジーン６、ジーン７、ジーン８、ジ
ーン９．ジーン１０．ジーン１１及びそれらからの組合
せからなる遺伝子群から選ばれる。
くとも一つのロタウィルス遺伝子を含む組換え分子の提
供であり、そのプロモータは前記遺伝子に空間的に関連
（Ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎ）をもっていてそ
のためにロタウィルス遺伝子の発現を制御しているもの
である。好ましくはプロモータはバクロウィルスのポリ
ヘドリン遺伝子のプロモータで遺伝子がロタウィルスの
ジーンｌ （ｇｅｎｅｌ） ＋ジーン２．ジーン３．ジ
ーン４．ジーン５．ジーン６、ジーン７、ジーン８、ジ
ーン９．ジーン１０．ジーン１１及びそれらからの組合
せからなる遺伝子群から選ばれる。
特に選んだ実施例はサルの５ＡＩＬ遺伝子６，９゜１０
を夫々ＶＰ６． ＶＰ７． ＮＳ２８蛋白を作るために
用いた。遺伝子の発現の後、蛋白はそれらの生来の状態
で分離される。
を夫々ＶＰ６． ＶＰ７． ＮＳ２８蛋白を作るために
用いた。遺伝子の発現の後、蛋白はそれらの生来の状態
で分離される。
本発明のもう一つの面に従って、少くとも一つのロタウ
ィルス遺伝子をバクロウィルスの転移（ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ）ベクターに挿入し、バクロウィルス転移ベクター中
のロタウィルス遺伝子を、バクロウィルスのアウトグラ
ファ・力ＴフォルニｉＬ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核の多面性ウィルス症（ｐｏｌ
ｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のウィルス染色体Ｄ
ＮＡに野生型のアウトグラファ・カリフォルニカの核の
多面性ウィルス症のウィルスのＤＮＡをもったスポドプ
テラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇ
ｉｐａｒｄａ）細胞の共形質導入（ｃｏｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｉｏｎ）によって形質転換し、それから、咬合陰性
のプラーク（ｐｌａｑｕｅｓ）を含むウィルスを同定す
ることによって挿入したロタウィルスＤＮＡ分子を含む
組換えポリへドリンプロモーターロタウィルス遺伝子を
選択し、そして最後に、組換え分子ウィルス株を得るた
めにプラークを精製する方法が提供される。好しくは遺
伝子はジーン１゜ジーン２．ジーン３．ジーン４．ジー
ン５．ジーン６、ジーン７、ジーン８．ジーン９．ジー
ン１０．ジーン１１及びそれらの中での組合せたものか
ら成るロタウィルス遺伝子群から選択される。
ィルス遺伝子をバクロウィルスの転移（ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ）ベクターに挿入し、バクロウィルス転移ベクター中
のロタウィルス遺伝子を、バクロウィルスのアウトグラ
ファ・力ＴフォルニｉＬ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核の多面性ウィルス症（ｐｏｌ
ｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のウィルス染色体Ｄ
ＮＡに野生型のアウトグラファ・カリフォルニカの核の
多面性ウィルス症のウィルスのＤＮＡをもったスポドプ
テラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇ
ｉｐａｒｄａ）細胞の共形質導入（ｃｏｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｉｏｎ）によって形質転換し、それから、咬合陰性
のプラーク（ｐｌａｑｕｅｓ）を含むウィルスを同定す
ることによって挿入したロタウィルスＤＮＡ分子を含む
組換えポリへドリンプロモーターロタウィルス遺伝子を
選択し、そして最後に、組換え分子ウィルス株を得るた
めにプラークを精製する方法が提供される。好しくは遺
伝子はジーン１゜ジーン２．ジーン３．ジーン４．ジー
ン５．ジーン６、ジーン７、ジーン８．ジーン９．ジー
ン１０．ジーン１１及びそれらの中での組合せたものか
ら成るロタウィルス遺伝子群から選択される。
さらに本発明のもう一面は組換え分子をもっロタウィル
ス蛋白を合成し、それからその蛋白を宿主動物に筋肉内
注射、経口、あるいは腹腟内投与することで抗体を作り
、できた抗体を分離精製するステップを含む方法によっ
てロタウィルス蛋白に対して抗体を作ることである。
ス蛋白を合成し、それからその蛋白を宿主動物に筋肉内
注射、経口、あるいは腹腟内投与することで抗体を作り
、できた抗体を分離精製するステップを含む方法によっ
てロタウィルス蛋白に対して抗体を作ることである。
発明のもう一面は、生物検体を抗体と接触させることで
抗体とロタウィルスが結合して抗体−ロタウィルス複合
体を作り、この複合体の量を測定することで生物検体中
のロタウィルスの量を定量するステップを含む方法でヒ
トの生体試料中のロタウィルスを検出することである。
抗体とロタウィルスが結合して抗体−ロタウィルス複合
体を作り、この複合体の量を測定することで生物検体中
のロタウィルスの量を定量するステップを含む方法でヒ
トの生体試料中のロタウィルスを検出することである。
開発国でも未開発国でもロタウィルスの感染を測定する
ために抗体を使うことができるようにするために抗体と
生物試験を採取し分析するための適当な器具を入れた検
査用キットを調製した。実施例においてこの採取し分析
するための器具には便の採取容器、便を稀釈し検査する
ための全ての試薬と検査を進めるための適当な容器が含
まれている。
ために抗体を使うことができるようにするために抗体と
生物試験を採取し分析するための適当な器具を入れた検
査用キットを調製した。実施例においてこの採取し分析
するための器具には便の採取容器、便を稀釈し検査する
ための全ての試薬と検査を進めるための適当な容器が含
まれている。
さらにこの発明にはロタウィルスに対するワクチンがＶ
ＰＩ、 ＶＰ６． ＶＰ６． ＶＰ６． ＶＰ６． Ｖ
Ｐ６． ＶＰ６゜ＮＳ３５． ＮＳ３４． ＮＳ２Ｂ及
びそれらの中での組合せから成る蛋白群から作られてい
る。これらの蛋白は組換え分子から合成される。抗原が
組換え分子の遺伝子の共発現によって作られるかまたは
ｉｎ ｖｉｔｒｏで個々の蛋白をその蛋白のあとにまぜ
ることで合成することによって形成される混成抗原であ
りうる。
ＰＩ、 ＶＰ６． ＶＰ６． ＶＰ６． ＶＰ６． Ｖ
Ｐ６． ＶＰ６゜ＮＳ３５． ＮＳ３４． ＮＳ２Ｂ及
びそれらの中での組合せから成る蛋白群から作られてい
る。これらの蛋白は組換え分子から合成される。抗原が
組換え分子の遺伝子の共発現によって作られるかまたは
ｉｎ ｖｉｔｒｏで個々の蛋白をその蛋白のあとにまぜ
ることで合成することによって形成される混成抗原であ
りうる。
ロタウィルスによる消化器官症に対してヒトや動物を免
疫するかまたは予防することはワクチンの免疫学的に効
果的な量、またはロタウィルス感染の発生を遅らせたり
兆候を減じたりする量を非経口的または経口で投与する
ことで達成される。さらにワクチン接種を受ける者（幼
児、成人、動物）の能動免疫あるいは生前に母親を免疫
することで幼児や若い動物を受動的に免疫することで免
疫が達成される。
疫するかまたは予防することはワクチンの免疫学的に効
果的な量、またはロタウィルス感染の発生を遅らせたり
兆候を減じたりする量を非経口的または経口で投与する
ことで達成される。さらにワクチン接種を受ける者（幼
児、成人、動物）の能動免疫あるいは生前に母親を免疫
することで幼児や若い動物を受動的に免疫することで免
疫が達成される。
ロタウィルス蛋白の構造と機能は組換え分子からこの特
定のウィルス蛋白の構造解析、機能解析及び免疫応答の
解析等に十分な量のロタウィルス蛋白を産生ずることに
よって決められる。
定のウィルス蛋白の構造解析、機能解析及び免疫応答の
解析等に十分な量のロタウィルス蛋白を産生ずることに
よって決められる。
構造と機能の解析はロタウィルス症の免疫学的、生化学
的、病理学的効果についての我々の理解を増すだろう。
的、病理学的効果についての我々の理解を増すだろう。
本発明は個々の蛋白の産物のクローニングと発現を述べ
ている。発現した遺伝子産物の抗原性、機能、及び分子
的特性を解析することは夫々の遺伝産物の内在する機能
的な特性を検討することを可能にする。かくして本発明
はウィルスの構造と調製及び集合における個々の蛋白に
対する理解を増さしめる。さらに加えて、本発明は個々
の蛋白を高度に利用できるために特定のウィルス蛋白に
対する体液性及び細胞介在性の免疫応答を容易に直接理
解させる。その上、多量の免疫原性の構造蛋白はワクチ
ン試験や安価な診断試験法を生み出させる。
ている。発現した遺伝子産物の抗原性、機能、及び分子
的特性を解析することは夫々の遺伝産物の内在する機能
的な特性を検討することを可能にする。かくして本発明
はウィルスの構造と調製及び集合における個々の蛋白に
対する理解を増さしめる。さらに加えて、本発明は個々
の蛋白を高度に利用できるために特定のウィルス蛋白に
対する体液性及び細胞介在性の免疫応答を容易に直接理
解させる。その上、多量の免疫原性の構造蛋白はワクチ
ン試験や安価な診断試験法を生み出させる。
本発明はロタウィルス遺伝子またはバクロウィルスであ
るアウトグラファ・力！フ ル二カの核多面性ウィルス
症のウィルス（ＡｃＮＰＶ）の非常に活性の高いプロモ
ーターの下流の遺伝子を含む組換え分子の形成を記載し
ている。この発現ベクター系はす′ルのロタウィルスＳ
Ａｌｌの主要な蛋白を昆虫の細胞の中で合成することを
可能にする。このバクロウィルスの発現系はプロモータ
ー遺伝子とＲＮＡ染色体断片を含む組換え分子からＳＡ
ｌｌ蛋白を効率よく産生ずる。これには外殻、内殻の蛋
白及び非特異的な蛋白が含まれている。この発現系で作
られる主要な蛋白はＶＰ６、 ＶＰ６． ＮＳ２ｇであ
る。この分野の技術に精通する者はこうして作られるい
ろいろなりラスの蛋白があることを認識し、本発明が全
てのロタウィルス遺伝子の発現に利用できることを認め
るだろう。
るアウトグラファ・力！フ ル二カの核多面性ウィルス
症のウィルス（ＡｃＮＰＶ）の非常に活性の高いプロモ
ーターの下流の遺伝子を含む組換え分子の形成を記載し
ている。この発現ベクター系はす′ルのロタウィルスＳ
Ａｌｌの主要な蛋白を昆虫の細胞の中で合成することを
可能にする。このバクロウィルスの発現系はプロモータ
ー遺伝子とＲＮＡ染色体断片を含む組換え分子からＳＡ
ｌｌ蛋白を効率よく産生ずる。これには外殻、内殻の蛋
白及び非特異的な蛋白が含まれている。この発現系で作
られる主要な蛋白はＶＰ６、 ＶＰ６． ＮＳ２ｇであ
る。この分野の技術に精通する者はこうして作られるい
ろいろなりラスの蛋白があることを認識し、本発明が全
てのロタウィルス遺伝子の発現に利用できることを認め
るだろう。
免疫学的、生化学的解析によってバクロウィルスベクタ
ー系によって作られる蛋白は生来の抗原決定基（ａｎｔ
ｉｇａｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）と寡量体の
構造（ｏｌｉｊｏｍａｒｉｃ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏ
ｎ）を有していることが示されている。この技術に通じ
た者はこれらの蛋白を多量に利用できることばロタウィ
ルスの複製過程やウィルスの形態発生におけるこれら蛋
白の内在的生化学的及び機能的特性を決めることを可能
にしまたワクチンとしてのこれら蛋白の免疫原性を高め
ることができるということを認めるだろう。
ー系によって作られる蛋白は生来の抗原決定基（ａｎｔ
ｉｇａｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）と寡量体の
構造（ｏｌｉｊｏｍａｒｉｃ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏ
ｎ）を有していることが示されている。この技術に通じ
た者はこれらの蛋白を多量に利用できることばロタウィ
ルスの複製過程やウィルスの形態発生におけるこれら蛋
白の内在的生化学的及び機能的特性を決めることを可能
にしまたワクチンとしてのこれら蛋白の免疫原性を高め
ることができるということを認めるだろう。
バクロウィルスはクローン化した真核性の遺伝子に対す
る発現ベクターとして理想的に適しているいくつかの特
徴をもっている。それらは次のとおり （１）非必須のポリヘドリン遺伝子に挿入された外来Ｄ
ＮＡを多量に（ｌａｒｇｅ ｐｉｅｃｅｓ）含む自分自
身のウィルスＤＮＡを包みこむ能力をこの円筒形のウィ
ルスが持つこと。
る発現ベクターとして理想的に適しているいくつかの特
徴をもっている。それらは次のとおり （１）非必須のポリヘドリン遺伝子に挿入された外来Ｄ
ＮＡを多量に（ｌａｒｇｅ ｐｉｅｃｅｓ）含む自分自
身のウィルスＤＮＡを包みこむ能力をこの円筒形のウィ
ルスが持つこと。
（２）細胞外のウィルスが作られ、宿主−の遺伝子や殆
んどのウィルス遺伝子かはなされた後でも感染してから
ずっと直接翻訳しつづける非常に強力なプロモーターが
存在すること。従ってこのプロモータで制御される蛋白
はしばしば宿主のバックグラウンド蛋白と容易に区別で
きる。
んどのウィルス遺伝子かはなされた後でも感染してから
ずっと直接翻訳しつづける非常に強力なプロモーターが
存在すること。従ってこのプロモータで制御される蛋白
はしばしば宿主のバックグラウンド蛋白と容易に区別で
きる。
（３）このベクターとともに用いられる無背椎動物細胞
はヒトや動物の病気を媒介する昆虫ベクターと分けられ
ず、ヒトの病原体に感受性がなく、ガン遺伝子のような
望ましくない遺伝子は含まない。従ってこれらの株を用
いることはこのベクターを使った組換えＤＮＡ生物に対
する生物的安全性の試験法の費用を単純化する。
はヒトや動物の病気を媒介する昆虫ベクターと分けられ
ず、ヒトの病原体に感受性がなく、ガン遺伝子のような
望ましくない遺伝子は含まない。従ってこれらの株を用
いることはこのベクターを使った組換えＤＮＡ生物に対
する生物的安全性の試験法の費用を単純化する。
（４）このベクターをもつ株の宿主範囲は培養された鱗
翅類の細胞に限定される。
翅類の細胞に限定される。
（５） ＡｃＮＰＶは現在、ある鱗翅類や昆虫の害をコ
ントロールするためのウィルス性殺虫剤として農業用に
使われると考えられているので環境保護局によって必要
とされる全ての安全性試験は完全に行われズおり、この
ベクターはヒト用に保証されている。
ントロールするためのウィルス性殺虫剤として農業用に
使われると考えられているので環境保護局によって必要
とされる全ての安全性試験は完全に行われズおり、この
ベクターはヒト用に保証されている。
（６）組換えの所産のウィルスは咬合をできないプラー
クを産し、従って工学的に作られた組換体は容易に同定
される。
クを産し、従って工学的に作られた組換体は容易に同定
される。
（７）高い力価の組換えウィルス株は蛋白生産のために
容易に感染細胞に作られる。
容易に感染細胞に作られる。
この発現ベクターはβ−インターフェロン（１〜５ ｍ
ｇ／ Ｑの収量）やフロラムフェニコール・アセチルト
ランスフェラーゼ（５０〜１００ｍｇ／ Ｑの収量で）
を含むいくつかの外来の真核及び原核性の遺伝子を発現
するのに成功している。このベクター系で合成した蛋白
は正しく加工されていることか示されている。すなわち
β−インターフェロンは糖鎖がついており、アミノ末端
側のシグナル配列は正しく除れていた。糖鎖の有無に拘
らず蛋白産物は時々感染した細胞から培地中に分泌され
る。培地の組成はコントロールできるので求める遺伝子
産物を培地から精製することは簡単である。発酵工程で
大規模に生産することも使用している無背椎動物細胞が
浮遊培養で生育しうるので可能である。
ｇ／ Ｑの収量）やフロラムフェニコール・アセチルト
ランスフェラーゼ（５０〜１００ｍｇ／ Ｑの収量で）
を含むいくつかの外来の真核及び原核性の遺伝子を発現
するのに成功している。このベクター系で合成した蛋白
は正しく加工されていることか示されている。すなわち
β−インターフェロンは糖鎖がついており、アミノ末端
側のシグナル配列は正しく除れていた。糖鎖の有無に拘
らず蛋白産物は時々感染した細胞から培地中に分泌され
る。培地の組成はコントロールできるので求める遺伝子
産物を培地から精製することは簡単である。発酵工程で
大規模に生産することも使用している無背椎動物細胞が
浮遊培養で生育しうるので可能である。
粘膜表面で複製するのに対して効果的にするためにワク
チンは免疫防御に必要な局所抗体を入れるべきである。
チンは免疫防御に必要な局所抗体を入れるべきである。
この概念にもとづいて、いくつかの従来の第一世代の生
ワクチンが開発されている。これらの生ワクチンの処方
には減弱したヒトのロタウィルス株、動物のロタウィル
ス株あるいは動物とヒトの混合ウィルスの使用がある。
ワクチンが開発されている。これらの生ワクチンの処方
には減弱したヒトのロタウィルス株、動物のロタウィル
ス株あるいは動物とヒトの混合ウィルスの使用がある。
これらの生ワクチンに含まれるべきウィルス群の数やウ
ィルスの血清学的タイプなどは未決である。しかしもし
異種のウィルスがヒトや動物において防御反応を生むな
らばその数は限ることができよう。
ィルスの血清学的タイプなどは未決である。しかしもし
異種のウィルスがヒトや動物において防御反応を生むな
らばその数は限ることができよう。
本発明は減弱した生ウィルスに伴う諸問題を避けるワク
チンの改良法を明示している。この発明はロタウィルス
に特異的な蛋白をクローン化した遺伝子から作ることを
提示している。この発明は感染した昆虫の細胞中でバク
ロウィルスにクローン化したロタウィルス遺伝子から高
度に効率よくワクチンを作ることを明らかにしている。
チンの改良法を明示している。この発明はロタウィルス
に特異的な蛋白をクローン化した遺伝子から作ることを
提示している。この発明は感染した昆虫の細胞中でバク
ロウィルスにクローン化したロタウィルス遺伝子から高
度に効率よくワクチンを作ることを明らかにしている。
ウィルスの染色体でバクロウィルスのポリヘドリン遺伝
子の必須でない構造部分は欠失させ、クローン化したロ
タウィルス遺伝子を合成かウィルスのポリへドリンプロ
モータによって制御されるようにその領域に挿入される
。
子の必須でない構造部分は欠失させ、クローン化したロ
タウィルス遺伝子を合成かウィルスのポリへドリンプロ
モータによって制御されるようにその領域に挿入される
。
この技術に通じた者は適当な発現ベクターを使って細菌
、酵母、哺乳動物、昆虫細胞中で遺伝子工学でクローン
化された遺伝子が同様な遺伝子産物を生産することも容
易に認識しよう。
、酵母、哺乳動物、昆虫細胞中で遺伝子工学でクローン
化された遺伝子が同様な遺伝子産物を生産することも容
易に認識しよう。
しかしながら、最も効率的なのはバクロウィルスである
ようである。この効率は一部にはこの部分での高い活性
のあるプロモータ遺伝子のためである。
ようである。この効率は一部にはこの部分での高い活性
のあるプロモータ遺伝子のためである。
かくして、「第二世代ワクチン」を開発する最も直接的
で実際的な進め方は抗原として直接用いるために、原核
または真核性の発現系においてロタウィルス蛋白を作る
ことである。我々はロタウィルスのＳＡｌｌ遺伝子から
の蛋白をバクロウィルスのベクター系で作ることに成功
している。本発明の方法は開発国及び開発途上国相方で
免疫するためのワクチンを生産する生産性の高い方法で
合成したポリペプチドを産生じている。
で実際的な進め方は抗原として直接用いるために、原核
または真核性の発現系においてロタウィルス蛋白を作る
ことである。我々はロタウィルスのＳＡｌｌ遺伝子から
の蛋白をバクロウィルスのベクター系で作ることに成功
している。本発明の方法は開発国及び開発途上国相方で
免疫するためのワクチンを生産する生産性の高い方法で
合成したポリペプチドを産生じている。
我々はバクロウィルスの性質と同時に効率的なポリへド
リンプロモータの性質が遺伝子にあるロタウィルスの主
要外殻を高度に発現させることを見出した。さらに、バ
クロウィルス系は細菌での高濃度発現に伴う多くの問題
を克服した。例えば、大抵の細菌では、高濃度生産は不
溶性の産物をもたらす。これら蛋白をバクテリアから可
溶化するにはさらに精製が必要である。
リンプロモータの性質が遺伝子にあるロタウィルスの主
要外殻を高度に発現させることを見出した。さらに、バ
クロウィルス系は細菌での高濃度発現に伴う多くの問題
を克服した。例えば、大抵の細菌では、高濃度生産は不
溶性の産物をもたらす。これら蛋白をバクテリアから可
溶化するにはさらに精製が必要である。
ひきつづきワクチンとして蛋白を投与することは免疫原
性の著しい低下を招く。本システムでは、強いプロモー
ターが細胞から培地へ分泌される抗原を高濃度に産生ず
る。抗原は培地組成がコントロールできるので容易に精
製される。
性の著しい低下を招く。本システムでは、強いプロモー
ターが細胞から培地へ分泌される抗原を高濃度に産生ず
る。抗原は培地組成がコントロールできるので容易に精
製される。
それ故、可溶化、精製に伴う問題は最少である。
さらに加えて、容易な精製は本来の蛋白の状態を保持さ
せる。
せる。
この上の目的、特徴、利点は本発明の実施例として以下
の記載から明らかであろう。
の記載から明らかであろう。
ましい の な記゛ホ
ベクター系でクローン化された遺伝子から外来の蛋白を
うまく合成するための一般的な方法は発現ベクター中の
プロモータから下流に外来遺伝子を挿入することである
。従ってクローン化された遺伝子から蛋白の生産はメツ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳（ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎ）を指令するプロモーターを通して制御さ
れるだろう。
うまく合成するための一般的な方法は発現ベクター中の
プロモータから下流に外来遺伝子を挿入することである
。従ってクローン化された遺伝子から蛋白の生産はメツ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳（ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎ）を指令するプロモーターを通して制御さ
れるだろう。
この方法はロタウィルスから完全な長さをもった遺伝子
クローンを分離することを含んでいる。これらは多くの
ヒトや動物のウィルス株からよく知られた分子生物学的
技術によって分離される。クローン化されたｃＤＮＡは
染色体の二重鎖ＲＮＡ断片または内性のウィルスのＲＮ
Ａポリメラーゼでこれら断片から翻訳されたｍＲＮＡか
ら合成される。第一に鎖状のｃＤＮＡを逆転写酵素（ｒ
ｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）で合成し
二重鎖ｃＤＮＡが変性したｄｓＲＮＡから合成される相
補的なプラスとマイナス鎖をハイブリダイズするかまた
は逆転写またはクレノー断片（にｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ
＋＋＋ｅｎｔ）を使ってｄＣ端のｃＤＮＡを第二鎖とし
て合成することによって合成される。それから二重鎖ｃ
ＤＮＡはオリゴｄＧを末端に付けられ、 ｐＢＲ３２゜
２かあるいはその誘導体の１つのような細菌のプラスミ
ドのρ５ｔ−１部位に挿入される。ｃＤＮＡを増幅し、
その遺伝子の起源を同定し、十分な長さかどうかを決め
るためのシーフェンシングをした後、選択した遺伝子を
バクロウィルス転移ベクターにサブクローンし、組換体
として選択する過程をはじめる。各クローン化したロタ
ウィルス遺伝子をサブクローン化する正確な方法は遺伝
子の配列によってまちまちである。一般には元の細菌の
プラスミドから遺伝子を除くために制限エンドヌクレア
ーゼが用いられる。それからこの遺伝子断片がクローン
化され、バクロウィルス転移ベクターに挿入される。組
換えられた転移ベクターのＤＮＡは他の非組換体のプラ
スミドＤＮＡを除くために抗生物質耐性によって選抜し
、それから増幅しスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ＳＦ）細胞
中に転換するため精製した。標準のウィルスＤＮＡをス
ポドプテラ・フルギペルダ（ＳＦ）細胞に共に転換する
ために用いた１組換え分子を含んでいるそれらしい組換
えウィルスをこれら転換された単層培養からのウィルス
から分離した。ポリヘドリンの構造遺伝子は除かれてい
るので組換え体ウィルスを含むプラークは咬合体がない
ために容易に同定される。
クローンを分離することを含んでいる。これらは多くの
ヒトや動物のウィルス株からよく知られた分子生物学的
技術によって分離される。クローン化されたｃＤＮＡは
染色体の二重鎖ＲＮＡ断片または内性のウィルスのＲＮ
Ａポリメラーゼでこれら断片から翻訳されたｍＲＮＡか
ら合成される。第一に鎖状のｃＤＮＡを逆転写酵素（ｒ
ｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）で合成し
二重鎖ｃＤＮＡが変性したｄｓＲＮＡから合成される相
補的なプラスとマイナス鎖をハイブリダイズするかまた
は逆転写またはクレノー断片（にｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ
＋＋＋ｅｎｔ）を使ってｄＣ端のｃＤＮＡを第二鎖とし
て合成することによって合成される。それから二重鎖ｃ
ＤＮＡはオリゴｄＧを末端に付けられ、 ｐＢＲ３２゜
２かあるいはその誘導体の１つのような細菌のプラスミ
ドのρ５ｔ−１部位に挿入される。ｃＤＮＡを増幅し、
その遺伝子の起源を同定し、十分な長さかどうかを決め
るためのシーフェンシングをした後、選択した遺伝子を
バクロウィルス転移ベクターにサブクローンし、組換体
として選択する過程をはじめる。各クローン化したロタ
ウィルス遺伝子をサブクローン化する正確な方法は遺伝
子の配列によってまちまちである。一般には元の細菌の
プラスミドから遺伝子を除くために制限エンドヌクレア
ーゼが用いられる。それからこの遺伝子断片がクローン
化され、バクロウィルス転移ベクターに挿入される。組
換えられた転移ベクターのＤＮＡは他の非組換体のプラ
スミドＤＮＡを除くために抗生物質耐性によって選抜し
、それから増幅しスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ＳＦ）細胞
中に転換するため精製した。標準のウィルスＤＮＡをス
ポドプテラ・フルギペルダ（ＳＦ）細胞に共に転換する
ために用いた１組換え分子を含んでいるそれらしい組換
えウィルスをこれら転換された単層培養からのウィルス
から分離した。ポリヘドリンの構造遺伝子は除かれてい
るので組換え体ウィルスを含むプラークは咬合体がない
ために容易に同定される。
これらの組換体が望ましい遺伝子をもっていることの確
認は特異的な遺伝子プローブとハイブリダイズすること
によって行われる。
認は特異的な遺伝子プローブとハイブリダイズすること
によって行われる。
ロタウィルス蛋白の発現は組換えＤＮＡを含むウィルス
で感染させたＳＦ細胞または昆虫で測定した。ウィルス
性の蛋白合成を含む感染過程、ウィルスの集合及び部分
的な細胞溶解は感染後約７２時間までに完結するだろう
。これは蛋白に左右され従ってずっと早かったり遅かっ
たりする。感染された細胞に作られる蛋白は３５Ｓ−メ
チオニン、３Ｈ−ロイシン、または３Ｈ−マンノースで
放射性標識されそして細胞に付いたポリペプチドと細胞
外のポリペプチド相方をポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動することでその分子量を分析した。この産物の発
現は感染後細胞が溶解される前までいろいろな時期にテ
ストされている。
で感染させたＳＦ細胞または昆虫で測定した。ウィルス
性の蛋白合成を含む感染過程、ウィルスの集合及び部分
的な細胞溶解は感染後約７２時間までに完結するだろう
。これは蛋白に左右され従ってずっと早かったり遅かっ
たりする。感染された細胞に作られる蛋白は３５Ｓ−メ
チオニン、３Ｈ−ロイシン、または３Ｈ−マンノースで
放射性標識されそして細胞に付いたポリペプチドと細胞
外のポリペプチド相方をポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動することでその分子量を分析した。この産物の発
現は感染後細胞が溶解される前までいろいろな時期にテ
ストされている。
組換え体産物の免疫学的同定は直接免疫的沈殿法または
ウェスタンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ）に
よって調べられる。ウェスタンプロットとして、細胞に
付ずいする蛋白または培地中の蛋白をＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル上で分離しニトロセルロースフィルターに
移し、ロタウィルス特異性の蛋白またはポリヘドリンに
対する抗血清で同定した。特異的に結合した抗体はフィ
ルターを１２ｓ工標識したプロティンＡまたは酵素結合
抗・抗体とインキュベートし、次いで強調スクリーンを
使って一８０℃でＸ線フィルムに感光させるかまたは酵
素基質との発色反応を比色することで検出する。
ウェスタンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ）に
よって調べられる。ウェスタンプロットとして、細胞に
付ずいする蛋白または培地中の蛋白をＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル上で分離しニトロセルロースフィルターに
移し、ロタウィルス特異性の蛋白またはポリヘドリンに
対する抗血清で同定した。特異的に結合した抗体はフィ
ルターを１２ｓ工標識したプロティンＡまたは酵素結合
抗・抗体とインキュベートし、次いで強調スクリーンを
使って一８０℃でＸ線フィルムに感光させるかまたは酵
素基質との発色反応を比色することで検出する。
一方細胞結合タンパクと可溶性タンパクの抽出物をモノ
クローナル抗体と免疫沈殿するかまたは単一な特異性を
もつあるいはポリクローナルな抗ウイルス血清と免疫沈
殿するために使用しロタウィルス蛋白が作られているか
どうかを確める。この分析によって組換え体を感染させ
た昆虫の細胞の中に作られる蛋白が細胞のない状態での
翻訳系あるいはロタウィルス感染細胞の中で作られたも
のと大きさで同じかどうかが決められる。最後に、個々
の蛋白の量は蛋白精製の前及びその過程中室量される。
クローナル抗体と免疫沈殿するかまたは単一な特異性を
もつあるいはポリクローナルな抗ウイルス血清と免疫沈
殿するために使用しロタウィルス蛋白が作られているか
どうかを確める。この分析によって組換え体を感染させ
た昆虫の細胞の中に作られる蛋白が細胞のない状態での
翻訳系あるいはロタウィルス感染細胞の中で作られたも
のと大きさで同じかどうかが決められる。最後に、個々
の蛋白の量は蛋白精製の前及びその過程中室量される。
ロタウィルス遺伝子によって作られる産物はそれらが正
しく作られているかどうか（すなわちシグナルペプチド
が分解されまたそれらが正しく糖鎖が修飾されているか
どうか）を調べるために同様に分析される。
しく作られているかどうか（すなわちシグナルペプチド
が分解されまたそれらが正しく糖鎖が修飾されているか
どうか）を調べるために同様に分析される。
−たび蛋白を発現する組換えベクターが確立。
されれば組換え体をいろいろな組合せで細胞が感染され
る。これらのウィルス蛋白は被殻のサブユニットを形成
し、サブユニットとして感染細胞から遊離されるにちが
いない。ロタウィルスの粒子の形態発生と免疫原性につ
いての研究でウィルスのサブユニットが感染細胞で或い
は細胞のない条件でどう会合されるのかを予測すること
ができよう。
る。これらのウィルス蛋白は被殻のサブユニットを形成
し、サブユニットとして感染細胞から遊離されるにちが
いない。ロタウィルスの粒子の形態発生と免疫原性につ
いての研究でウィルスのサブユニットが感染細胞で或い
は細胞のない条件でどう会合されるのかを予測すること
ができよう。
次のステップはサブユニットのワクチンとして使用し評
価するために蛋白を精製することである。この発現系で
はロタウィルス蛋白はしばしば培地中に遊離される。こ
れらの感染した細胞から得た培地を濃縮し、蛋白を標準
的な方法で精製する。塩析、しよ糖密度遠心分離、クロ
マトグラフィー、高圧あるいは高速液体クロマトグラフ
ィー（）ＩＰＬｃあるいはＦＰＬＣ）は迅速で定量的で
大規模に蛋白を精製できるし、発現した蛋白を変性させ
ないので、これらの方法が使われる。かくして我々はそ
の抗原性を保持した蛋白を生産する非常に高い可能性を
獲得した。
価するために蛋白を精製することである。この発現系で
はロタウィルス蛋白はしばしば培地中に遊離される。こ
れらの感染した細胞から得た培地を濃縮し、蛋白を標準
的な方法で精製する。塩析、しよ糖密度遠心分離、クロ
マトグラフィー、高圧あるいは高速液体クロマトグラフ
ィー（）ＩＰＬｃあるいはＦＰＬＣ）は迅速で定量的で
大規模に蛋白を精製できるし、発現した蛋白を変性させ
ないので、これらの方法が使われる。かくして我々はそ
の抗原性を保持した蛋白を生産する非常に高い可能性を
獲得した。
希望する遺伝子産物の合成の効率は、次のような多数の
要因に左右される。（１）発現ベクター系の選択、（２
）＋ａＲＮＡ生産のための鋳型として細胞の中で利用さ
れるであろう遺伝子のコピー数、（３）プロモーターの
強さ、（４）＋ｎＲＮＡの安定性と構造、（５）イニシ
ェーションや翻訳のためのリポソームの結合の効率、（
６）遺伝子産物の安定性或いは宿主細胞に対する生産物
の致死性のような蛋白産物の性質、（７）蛋白を合成し
そして細胞からそれを採取するそれによってその後の分
析や精製使用を単純化するための系としての能力などで
ある。
要因に左右される。（１）発現ベクター系の選択、（２
）＋ａＲＮＡ生産のための鋳型として細胞の中で利用さ
れるであろう遺伝子のコピー数、（３）プロモーターの
強さ、（４）＋ｎＲＮＡの安定性と構造、（５）イニシ
ェーションや翻訳のためのリポソームの結合の効率、（
６）遺伝子産物の安定性或いは宿主細胞に対する生産物
の致死性のような蛋白産物の性質、（７）蛋白を合成し
そして細胞からそれを採取するそれによってその後の分
析や精製使用を単純化するための系としての能力などで
ある。
発現ベクター系から高収量でウィルス蛋白を生産するこ
とはウィルス蛋白の機能を研究し、診断のための検査法
やワクチンを開発するための新しい道を提供している。
とはウィルス蛋白の機能を研究し、診断のための検査法
やワクチンを開発するための新しい道を提供している。
この発明はサルのロタウィルスＳＡｌｌの主要な外殻蛋
白のＶＰ６と糖蛋白ＶＰ７及びバクロウィルス発現系を
使って作られる非構造的蛋白ＮＳ２８の抗原性及び分子
的性質を評価できることを明らかにし、またそれを指向
１ている。
白のＶＰ６と糖蛋白ＶＰ７及びバクロウィルス発現系を
使って作られる非構造的蛋白ＮＳ２８の抗原性及び分子
的性質を評価できることを明らかにし、またそれを指向
１ている。
発現されたロタウィルス蛋白を使っての本発明のいくつ
かの特性と利点はこの技術に精通した者にとっては容易
に明らかであろう。例えば（１）ＶＰ６は糖蛋白でなく
、５Ａ１１感染の哺乳動物細胞から培地中にみられるこ
とは知られていないが、バクロウィルスに形質転換して
感染した細胞からは培地中に存在する。ＶＰ６が培地中
に活性体として分泌されるかどうか、または細胞の溶解
の結果として分泌されるかどうかははっきりしていない
が培地中に高濃度にあるという性質はＶＰ６の精製を大
いに可能にしている。その他の糖のついていない蛋白で
あるβ−ガラクトシダーゼやクロラムフェニコールトラ
ンスフェラーゼなども同じバクロウィルス発現ベクター
で生産すると培地中にみられている。（２）他方、β−
インターフェロンは糖がついており組換え体で感染され
た細胞の培地の中にみられる。多くの種類の蛋白が培地
中にみることができ分離、精製を著しく単純化する。（
３）使用したモノクローナル抗体との反応性はバクロウ
ィルス発現ベクターを用いてＶＰ６． ＶＰ６及びＮＳ
２ｇが合成されたとき生来の免疫反応性決定基が保たれ
ていることを示唆していた。さらに、発現されそして精
製されたＶＰ６蛋白はウィルス感染細胞あるいはウィル
ス粒子で報告されたＶＰ６の構造である少量体（ｏｌｉ
ｇｏｍａｒ）の性質を示すという証明はベクター系での
合成で生来の立体構造が保たれていることを確めている
。この少量体を形成することにジスルフィド結合が関係
しておりＶＰ６のもって生まれた性質である。
かの特性と利点はこの技術に精通した者にとっては容易
に明らかであろう。例えば（１）ＶＰ６は糖蛋白でなく
、５Ａ１１感染の哺乳動物細胞から培地中にみられるこ
とは知られていないが、バクロウィルスに形質転換して
感染した細胞からは培地中に存在する。ＶＰ６が培地中
に活性体として分泌されるかどうか、または細胞の溶解
の結果として分泌されるかどうかははっきりしていない
が培地中に高濃度にあるという性質はＶＰ６の精製を大
いに可能にしている。その他の糖のついていない蛋白で
あるβ−ガラクトシダーゼやクロラムフェニコールトラ
ンスフェラーゼなども同じバクロウィルス発現ベクター
で生産すると培地中にみられている。（２）他方、β−
インターフェロンは糖がついており組換え体で感染され
た細胞の培地の中にみられる。多くの種類の蛋白が培地
中にみることができ分離、精製を著しく単純化する。（
３）使用したモノクローナル抗体との反応性はバクロウ
ィルス発現ベクターを用いてＶＰ６． ＶＰ６及びＮＳ
２ｇが合成されたとき生来の免疫反応性決定基が保たれ
ていることを示唆していた。さらに、発現されそして精
製されたＶＰ６蛋白はウィルス感染細胞あるいはウィル
ス粒子で報告されたＶＰ６の構造である少量体（ｏｌｉ
ｇｏｍａｒ）の性質を示すという証明はベクター系での
合成で生来の立体構造が保たれていることを確めている
。この少量体を形成することにジスルフィド結合が関係
しておりＶＰ６のもって生まれた性質である。
ロタウィルスには多くの培養株あるいは非培養株が知ら
れている。これらの株はヒトや動物に病気を起こすこと
が知られている。これらのいろいろな株に対するワクチ
ンはヒトや家畜やペットの動物の病気に対抗するのに有
用であろう。これらいろいろなウィルスの群に属する株
の例はサルのＳＡｌｌ、ＭＭｔｌ１８００６ ；イヌの
ＣＵ−１；ウマＨ２と旧；ブタのゴツトフリート（Ｇｏ
ｔｔｆｒｉｅｄ）、５Ｂ−１，５Ｂ−２，Ｏ２０，ＥＥ
、 Ａ３８０ ；ウシ（７）ＮＣＤＶ、 ＵＫ。
れている。これらの株はヒトや動物に病気を起こすこと
が知られている。これらのいろいろな株に対するワクチ
ンはヒトや家畜やペットの動物の病気に対抗するのに有
用であろう。これらいろいろなウィルスの群に属する株
の例はサルのＳＡｌｌ、ＭＭｔｌ１８００６ ；イヌの
ＣＵ−１；ウマＨ２と旧；ブタのゴツトフリート（Ｇｏ
ｔｔｆｒｉｅｄ）、５Ｂ−１，５Ｂ−２，Ｏ２０，ＥＥ
、 Ａ３８０ ；ウシ（７）ＮＣＤＶ、 ＵＫ。
Ｂ６４１． Ｂ７２０．８１４． ｌｌ−２，Ｂ２２３
；七面鳥のＴｙｌ。
；七面鳥のＴｙｌ。
ｒｙ３；ニワトリのｃｈｌ、 ヒトのりａ、 ＫＵ、
Ｋ８． ＤＳ。
Ｋ８． ＤＳ。
ＤＳ−１，Ｓ２． ＫＵＮ、 ＨＮ−１２６，３９０，
Ｍ、 Ｐ、 Ｙｏ、 １４゜１５、 ＭｃＭ２． ＭＯ
，Ｉｔｏ、 Ｎｅｍｏｔｏ、 Ｓｔ、 トーマス４゜ホ
チ（Ｈｏｃｈｉ） Ｔホソカワ（Ｈｏｓｏｋａｗａ）
、成人下痢症ロタライ／Ｌ／Ｘ（ＡＤＲＶ）、 ＰａＲ
Ｖ、 ＢＲＶＬＡがある。
Ｍ、 Ｐ、 Ｙｏ、 １４゜１５、 ＭｃＭ２． ＭＯ
，Ｉｔｏ、 Ｎｅｍｏｔｏ、 Ｓｔ、 トーマス４゜ホ
チ（Ｈｏｃｈｉ） Ｔホソカワ（Ｈｏｓｏｋａｗａ）
、成人下痢症ロタライ／Ｌ／Ｘ（ＡＤＲＶ）、 ＰａＲ
Ｖ、 ＢＲＶＬＡがある。
（Ｍ、に、エステス等、「ロタウィルスの抗原構造」（
「ウィルスの免疫化学」より）エルヤビア出版、３８９
−４０５頁（１９８５年）その記載は参考文献に入れら
れている、またＳ、ナカタ、Ｊ、 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕ
ｓＤｉｓｅａｓｅｓ、第１５４巻、４４８−４５５頁（
１９８６年）その記載は参考に入れられる〕どの株も組
換え体の分子を作るために遺伝子をベクターにくみこむ
のに使用されうる。
「ウィルスの免疫化学」より）エルヤビア出版、３８９
−４０５頁（１９８５年）その記載は参考文献に入れら
れている、またＳ、ナカタ、Ｊ、 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕ
ｓＤｉｓｅａｓｅｓ、第１５４巻、４４８−４５５頁（
１９８６年）その記載は参考に入れられる〕どの株も組
換え体の分子を作るために遺伝子をベクターにくみこむ
のに使用されうる。
詩遣！し１１匹
材且支方蒸
ｋ ’７ ＃ ／Ｌ／Δ：サルのロタウィルス５ＡＩＬ
が阿、に、エステス等によるＪ、 Ｖｉｒｏｌ、、第３
１巻：８１０−８１５頁（１９７９年）に述べられてい
るようにＨＡ １０４細胞の中で生育させた。（この記
述はここに参考にとり上げる）バクロウィルスのアウト
グラファ・カルフォルニ力（ＡｃＮＰＶ）と組換え体ウ
ィルスｐＡｃ４６１／ＳＡｌｌ−６がスポドプテラ・フ
ルギペンダ（ＳＦ） （ＩＰＬ８−５Ｆ２１−ＡＥ）細
胞を感染するために細胞当り１０プラ一グ形成単位の感
染増加率（ＭＯＩ）で用いた。ＳＦ細胞はＧ、Ｅ、スミ
ス等（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、。
が阿、に、エステス等によるＪ、 Ｖｉｒｏｌ、、第３
１巻：８１０−８１５頁（１９７９年）に述べられてい
るようにＨＡ １０４細胞の中で生育させた。（この記
述はここに参考にとり上げる）バクロウィルスのアウト
グラファ・カルフォルニ力（ＡｃＮＰＶ）と組換え体ウ
ィルスｐＡｃ４６１／ＳＡｌｌ−６がスポドプテラ・フ
ルギペンダ（ＳＦ） （ＩＰＬ８−５Ｆ２１−ＡＥ）細
胞を感染するために細胞当り１０プラ一グ形成単位の感
染増加率（ＭＯＩ）で用いた。ＳＦ細胞はＧ、Ｅ、スミ
ス等（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、。
第４６巻： ５８４＝５９３頁（１９８３年）〕が記し
ているように１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むヒ
ンク培地（Ｈｉｎｋ’ｓ ｎ＋ｅｄｉｕｍ）で培養し維
持された。（この記載を参考にとり入れる） バクロウィルスの組 え の構 と選択シーン６：５Ａ
１１のジーン６はもともとｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位
にあった。得られるクローンｐＳＡ１１−６をＡｈａ
ｍとＨｐａ Ｉｆで分解し、バクロウィルスの転移ベク
ターｐＡｃ４６１のＳｍａＩ部位にサブクローンした。
ているように１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むヒ
ンク培地（Ｈｉｎｋ’ｓ ｎ＋ｅｄｉｕｍ）で培養し維
持された。（この記載を参考にとり入れる） バクロウィルスの組 え の構 と選択シーン６：５Ａ
１１のジーン６はもともとｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位
にあった。得られるクローンｐＳＡ１１−６をＡｈａ
ｍとＨｐａ Ｉｆで分解し、バクロウィルスの転移ベク
ターｐＡｃ４６１のＳｍａＩ部位にサブクローンした。
プラスミドｐＡｃ４６１はＰＡＣ３１１からＢａｍＨＩ
とＫｐｎＩでの分解、Ｂａ１１３１ヌクレアーゼでの消
化、二本鎖末端とするためのＤＮＡポリメラーゼエ（ク
レノー断片）での処理、ＳｍａＩ （ＧＣＣＣＧＧＧＧ
Ｉ リンカ−の結合、Ｓｎ＋ａＩでの分解と再結合によ
って作り出された。プラスミドのｐＡｃ４６１はバクロ
ウィルスのポリヘドリン遺伝子において−７から＋６７
０番目の間に欠失部をもっている。エシェリキア・コリ
ー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏ１１）に形質導入し
た後、組換えられたアンピシリン耐性のコロニーのプラ
スミドを適切な導入方向に挿入されたものについて制限
酵素解析によって検索し、そしてその１つがｐＡｃ４６
１／５ＡＩＬ−６と名づけられた。
とＫｐｎＩでの分解、Ｂａ１１３１ヌクレアーゼでの消
化、二本鎖末端とするためのＤＮＡポリメラーゼエ（ク
レノー断片）での処理、ＳｍａＩ （ＧＣＣＣＧＧＧＧ
Ｉ リンカ−の結合、Ｓｎ＋ａＩでの分解と再結合によ
って作り出された。プラスミドのｐＡｃ４６１はバクロ
ウィルスのポリヘドリン遺伝子において−７から＋６７
０番目の間に欠失部をもっている。エシェリキア・コリ
ー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏ１１）に形質導入し
た後、組換えられたアンピシリン耐性のコロニーのプラ
スミドを適切な導入方向に挿入されたものについて制限
酵素解析によって検索し、そしてその１つがｐＡｃ４６
１／５ＡＩＬ−６と名づけられた。
ｐＡｃ４６１／ＳＡｌｌ−６は５ＡＩＬの６遺伝子（ジ
ーン６）の５′末端のはじめの７ヌクレオチドが失われ
ていて。
ーン６）の５′末端のはじめの７ヌクレオチドが失われ
ていて。
ρｂｒ３２２に最初にクローニングされる間に３′末端
に加えられた約７０個の余分の塩基対をもっている。こ
のベクターから５ＡＩＬジーン６のｃＤＮＡをＡｃＮＰ
Ｖ染色体ＤＮＡ Ａ、の転移はＧ、Ｅ、スミス等（Ｊ、
Ｖｉｒ剋よ、第４６巻： ５８４−５９３（１９８３
年）〕しこよって述べられているように燐酸カルシウム
沈殿法を使って野生型のＡｃＮＰＶのＤＮＡとＳＦ細胞
に共転移させることによって達せられた。ＡｃＮＰＶの
ＤＮＡ（１μｇ）を２μｇのｐＡｃ４６Ｌ／５ＡＩＬ−
６と混合し、ＨＥＲＢＳ／ＣＴ （０，１３７ＭのＮＡ
ＣＩ、６ａ＋ＭのＤ−グルコース、 ５ｍＭのＫＣＩ、
０．７ｍＭのＮａ、ＨＰＯ４・７Ｈ，０，２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、 １５μｇ／ｍｌの超音波処理した仔牛胸
腺（ｃＴ）のＤＮＡ、 ｐＨ７，１〕で９５０μｍにし
て十分に混合した。混合液をゆっくり撹拌しながら５０
μｍの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、３０分間、室温に
おいて沈殿を形成させる。
に加えられた約７０個の余分の塩基対をもっている。こ
のベクターから５ＡＩＬジーン６のｃＤＮＡをＡｃＮＰ
Ｖ染色体ＤＮＡ Ａ、の転移はＧ、Ｅ、スミス等（Ｊ、
Ｖｉｒ剋よ、第４６巻： ５８４−５９３（１９８３
年）〕しこよって述べられているように燐酸カルシウム
沈殿法を使って野生型のＡｃＮＰＶのＤＮＡとＳＦ細胞
に共転移させることによって達せられた。ＡｃＮＰＶの
ＤＮＡ（１μｇ）を２μｇのｐＡｃ４６Ｌ／５ＡＩＬ−
６と混合し、ＨＥＲＢＳ／ＣＴ （０，１３７ＭのＮＡ
ＣＩ、６ａ＋ＭのＤ−グルコース、 ５ｍＭのＫＣＩ、
０．７ｍＭのＮａ、ＨＰＯ４・７Ｈ，０，２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、 １５μｇ／ｍｌの超音波処理した仔牛胸
腺（ｃＴ）のＤＮＡ、 ｐＨ７，１〕で９５０μｍにし
て十分に混合した。混合液をゆっくり撹拌しながら５０
μｍの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、３０分間、室温に
おいて沈殿を形成させる。
沈殿したＤＮＡを２．５ Ｘ １０’個のＳＦ細胞を播
種した２５ｃＪフラスコで１０％ＦＢＳを加えたヒンク
ス培地２ｍｌに加えた。２７℃で４時間インキュベート
し、培地を取除き、単層を１０％ＦＢＳを含む新鮮なヒ
ンクス培地で洗滌し、そして１０％ＦＢＳを含むヒンク
ス培地を５＋ｏｌ加えた後、２７℃でインキュベートし
た。細胞を感染の兆候が表われたかどうか、倒立顕微鏡
で観察しそして感染の進んだとき（５日目に）細胞外の
ウィルスを集めてＳＦ細胞の単層でプラークにした。ポ
リヘドリン遺伝子が同質の形質転換によってポリヘドリ
ン・ＳＡＩ■−６転移ベクターＤＮＡにおきかえられて
いる形質転換体をＧ、Ｅ、スミス等が記載しているよう
にして（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、第４６巻：５８４−５９
３頁、（１９８３年）〕倒立型位相顕微鏡で咬合が陰性
のプラークをみつけることで選択した。咬合陰性のプラ
ークのウィルスを３回精製し、そしてウィルスの保存株
を増殖するために使った。
種した２５ｃＪフラスコで１０％ＦＢＳを加えたヒンク
ス培地２ｍｌに加えた。２７℃で４時間インキュベート
し、培地を取除き、単層を１０％ＦＢＳを含む新鮮なヒ
ンクス培地で洗滌し、そして１０％ＦＢＳを含むヒンク
ス培地を５＋ｏｌ加えた後、２７℃でインキュベートし
た。細胞を感染の兆候が表われたかどうか、倒立顕微鏡
で観察しそして感染の進んだとき（５日目に）細胞外の
ウィルスを集めてＳＦ細胞の単層でプラークにした。ポ
リヘドリン遺伝子が同質の形質転換によってポリヘドリ
ン・ＳＡＩ■−６転移ベクターＤＮＡにおきかえられて
いる形質転換体をＧ、Ｅ、スミス等が記載しているよう
にして（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、第４６巻：５８４−５９
３頁、（１９８３年）〕倒立型位相顕微鏡で咬合が陰性
のプラークをみつけることで選択した。咬合陰性のプラ
ークのウィルスを３回精製し、そしてウィルスの保存株
を増殖するために使った。
ジーン９：５Ａ１１の遺伝子９（ジーン９）のクローン
はシーン６クローンで用いられたと同じ方法で構築され
たく阿、に、エステス等Ｎｕｃ１． Ａｃ１ｄ展、第１
２巻： １８７５−１８８７頁（１９８４年）に記載さ
れており、この記載を参考としてとり入れる）。
はシーン６クローンで用いられたと同じ方法で構築され
たく阿、に、エステス等Ｎｕｃ１． Ａｃ１ｄ展、第１
２巻： １８７５−１８８７頁（１９８４年）に記載さ
れており、この記載を参考としてとり入れる）。
これらのクローンはジーン９に対するプローブを使って
ｃＤＮＡのライブラリーから選択された。
ｃＤＮＡのライブラリーから選択された。
これらクローンの同定はウサギの網赤血球とコムギ胚芽
抽出物から得られ無細胞翻訳系（ｃｅｌｌｆｒｅｅ ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で特定の蛋白が
作られるかどうかで確められた。そのような翻訳反応は
濾紙上に固定されたジーン９のｃＤＮＡにハイブリダイ
ズすることによって選択されたｍＲＮＡでプログラムさ
れていた。それからこれらのクローン個々の全塩基配列
をＳＡｌｌジーン９ ＤＮＡを含むバクロウィルスの形
質転換体を得るためにＳＦ細胞の形質転換に先立ってバ
クロウィルス転移ベクターに挿入した。ジーン９の構築
のために、ジーン９のｃＤＮＡはＰＢＲ３２２からＰｓ
ｔ １で処理し、このＤＮＡをゲルで精製し、ｐＡｃ４
６１バクロウィルス転移ベクターのＰｓｔ １部位に挿
入した。もう一つの別の方法はｐＡｃ４６１に挿入する
前に末端または他の配列部が修飾されたり欠失させたり
される。ジーン９の保存はジーン６に用いられた方法に
従って実施された。
抽出物から得られ無細胞翻訳系（ｃｅｌｌｆｒｅｅ ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で特定の蛋白が
作られるかどうかで確められた。そのような翻訳反応は
濾紙上に固定されたジーン９のｃＤＮＡにハイブリダイ
ズすることによって選択されたｍＲＮＡでプログラムさ
れていた。それからこれらのクローン個々の全塩基配列
をＳＡｌｌジーン９ ＤＮＡを含むバクロウィルスの形
質転換体を得るためにＳＦ細胞の形質転換に先立ってバ
クロウィルス転移ベクターに挿入した。ジーン９の構築
のために、ジーン９のｃＤＮＡはＰＢＲ３２２からＰｓ
ｔ １で処理し、このＤＮＡをゲルで精製し、ｐＡｃ４
６１バクロウィルス転移ベクターのＰｓｔ １部位に挿
入した。もう一つの別の方法はｐＡｃ４６１に挿入する
前に末端または他の配列部が修飾されたり欠失させたり
される。ジーン９の保存はジーン６に用いられた方法に
従って実施された。
ジー：／１０ ： ５ＡＩＬ（７）ジーン１０クローン
はＧ、１１゜ボス等の方法（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、第４
８巻： ３３５−３３９頁（１９８３年）〕を使って構
築された。これらクローンはジーンｌＯのプローブを使
ってｃＤＮＡのライブラリーから選択された。これらク
ローンの同定はウサギの網赤血球とコムギ胚芽抽出物か
ら得られる無細胞翻訳系で特定の蛋白が生産されるかど
うかで確められた。そのような翻訳反応は濾紙上に固定
されたジーン１ｏのｃＤＮＡにハイブリダイズすること
によって選択されるｍＲＮＡでプログラムされていた。
はＧ、１１゜ボス等の方法（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、第４
８巻： ３３５−３３９頁（１９８３年）〕を使って構
築された。これらクローンはジーンｌＯのプローブを使
ってｃＤＮＡのライブラリーから選択された。これらク
ローンの同定はウサギの網赤血球とコムギ胚芽抽出物か
ら得られる無細胞翻訳系で特定の蛋白が生産されるかど
うかで確められた。そのような翻訳反応は濾紙上に固定
されたジーン１ｏのｃＤＮＡにハイブリダイズすること
によって選択されるｍＲＮＡでプログラムされていた。
これらクローンの個々の全塩基配列を５ＡＩＬジーン１
０のＤＮＡを含むバクロウィルスの組換え体を得るため
にＳＦ細胞に形質導入するに先立ってバクロウィルス転
移ベクターに挿入した。ジーン１０の構築のためには、
ジーン１０のｃＤＮＡをジーン６についてのべられたよ
うにＡＨＡ ＩｎとＨｐａｎｌでｐＢＲ３２２から切り
出しジーン１０をバクロウィルス転移ベクターｐＡｃ４
６１のＳｍａＩ部位に挿入した。ジーンｌＯの保存はジ
ーン６について使われた方法によって得られた。
０のＤＮＡを含むバクロウィルスの組換え体を得るため
にＳＦ細胞に形質導入するに先立ってバクロウィルス転
移ベクターに挿入した。ジーン１０の構築のためには、
ジーン１０のｃＤＮＡをジーン６についてのべられたよ
うにＡＨＡ ＩｎとＨｐａｎｌでｐＢＲ３２２から切り
出しジーン１０をバクロウィルス転移ベクターｐＡｃ４
６１のＳｍａＩ部位に挿入した。ジーンｌＯの保存はジ
ーン６について使われた方法によって得られた。
形質転換体ＳＡｌｌ−６あるいは形質転換体ＳＡｌｌ−
９あるいは形質転換体５ＡＩＬ−１０または野生型のＡ
ｃＮＰｖを感染させたＳＦ細胞を感染後いろいろな時期
に１０％ＦＢＳを補填したメチオニン不含有ヒンクス培
地中で１５μＣｉ／ｍｌの３ＳＳ−メチオニンを加えて
放射能標識した。感染後４２時間で細胞と培地を採取し
、細胞は４℃で５分間１４００ｘｇで遠沈した。細胞の
ない上清を取り除き、検査のため保存し、一方細胞塊は
ＲＩＰＡ緩衝液（０，１５ＭのＮａＣ１，０，ＯＩＭの
トリス塩酸（ｐＨ７，２）、１％のトラシロール、１％
のデオキシロール酸ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００，０，１％のドテシル硫酸ナトリウム（ＳＯ
５））に懸濁した。この試料から蛋白をＷ、に、チェノ
等の方法（ｕ二旦旺、第１５１巻＝２４３−２５２頁、
１９８６年に記載参考にとりあげる）で免疫沈殿させた
。免疫沈殿に使われた抗血清は５ＡＩＬ（７）構造蛋白
（７）ＶＰ６，３，６，７と反応するポリクローナルの
モルモット抗ＳＡｌｌ血清（ｇｐαＳ＾１１）であった
。また、ＶＰ６ （ジーン６）のサブグループ■（α５
ＧＩ）またはサブグループ■（αＳＧ■）またはＶＰ６
上の共通抗原決定基（ａ ｃｏｍｍｏｎ）に対するモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を注射さ
れたマウスの腹水、ＶＰ６ （ジーン９）に対するモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体、ＮＳＺ８（ジー
ン１０）に対するモノクローナル抗体などが使われた。
９あるいは形質転換体５ＡＩＬ−１０または野生型のＡ
ｃＮＰｖを感染させたＳＦ細胞を感染後いろいろな時期
に１０％ＦＢＳを補填したメチオニン不含有ヒンクス培
地中で１５μＣｉ／ｍｌの３ＳＳ−メチオニンを加えて
放射能標識した。感染後４２時間で細胞と培地を採取し
、細胞は４℃で５分間１４００ｘｇで遠沈した。細胞の
ない上清を取り除き、検査のため保存し、一方細胞塊は
ＲＩＰＡ緩衝液（０，１５ＭのＮａＣ１，０，ＯＩＭの
トリス塩酸（ｐＨ７，２）、１％のトラシロール、１％
のデオキシロール酸ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００，０，１％のドテシル硫酸ナトリウム（ＳＯ
５））に懸濁した。この試料から蛋白をＷ、に、チェノ
等の方法（ｕ二旦旺、第１５１巻＝２４３−２５２頁、
１９８６年に記載参考にとりあげる）で免疫沈殿させた
。免疫沈殿に使われた抗血清は５ＡＩＬ（７）構造蛋白
（７）ＶＰ６，３，６，７と反応するポリクローナルの
モルモット抗ＳＡｌｌ血清（ｇｐαＳ＾１１）であった
。また、ＶＰ６ （ジーン６）のサブグループ■（α５
ＧＩ）またはサブグループ■（αＳＧ■）またはＶＰ６
上の共通抗原決定基（ａ ｃｏｍｍｏｎ）に対するモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を注射さ
れたマウスの腹水、ＶＰ６ （ジーン９）に対するモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体、ＮＳＺ８（ジー
ン１０）に対するモノクローナル抗体などが使われた。
ある場合には発現された蛋白の免疫反応が免疫的プロッ
ティング法でも解析された。
ティング法でも解析された。
されたロタウィルス （ＶＰ６ ＶＰ６ Ｎ針朴例皿
分椅聚例えば、ジーン６の形質転換体感染ＳＦ細胞をＦ
ＢＳのないヒンクス培地中で感染２８時間後に３″Ｓメ
チオニン（３０μＣｉ／ｍｌ、１２００Ｃｉ／ｍｌ１ａ
ｌｓ、アマ−ジャム社製）で標識した。細胞と培養液を
感染後いろいろな時期に、それぞれ細胞な培地中ではが
し、４℃で２０分間１０００ｒｐ■で遠心分離すること
によって細胞をペレット化して採取した。
分椅聚例えば、ジーン６の形質転換体感染ＳＦ細胞をＦ
ＢＳのないヒンクス培地中で感染２８時間後に３″Ｓメ
チオニン（３０μＣｉ／ｍｌ、１２００Ｃｉ／ｍｌ１ａ
ｌｓ、アマ−ジャム社製）で標識した。細胞と培養液を
感染後いろいろな時期に、それぞれ細胞な培地中ではが
し、４℃で２０分間１０００ｒｐ■で遠心分離すること
によって細胞をペレット化して採取した。
培地または細胞に付いた物質から蛋白が精製される１例
えば培養液からは３０分間１００，０００Ｘｇで遠心分
離して透明にした後、上清を５から２０％の連続したし
よ糖密度勾配にかけ１００，０００ Ｘ ｇで２３時間
遠心にかけた。牛血清アルブミンの混入のない発現蛋白
を含む両分を集め、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐ！
（７，５）に対して透析し、直接使用するかまたは凍結
乾燥した後使用した。
えば培養液からは３０分間１００，０００Ｘｇで遠心分
離して透明にした後、上清を５から２０％の連続したし
よ糖密度勾配にかけ１００，０００ Ｘ ｇで２３時間
遠心にかけた。牛血清アルブミンの混入のない発現蛋白
を含む両分を集め、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐ！
（７，５）に対して透析し、直接使用するかまたは凍結
乾燥した後使用した。
さらに、野生型のＡｃＮＰＶと組換え体の発現蛋白を同
じ感染条件と採取方法によったがそれ以上は精製せずに
調製をした。この場合には、感染細胞から培地を集め、
１ｏＬＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して
透析しそして直接使用するがまたは凍結乾燥後使用した
。蛋白の濃度は１２％のポリアクリルアミドゲル上での
電気泳動後回酸銀、またはコマシーブルー染色し定量的
にマーカー蛋白に対する蛋白の量と比較するがまたは定
量的なＥＬＩＳＡ法によって概算した。
じ感染条件と採取方法によったがそれ以上は精製せずに
調製をした。この場合には、感染細胞から培地を集め、
１ｏＬＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して
透析しそして直接使用するがまたは凍結乾燥後使用した
。蛋白の濃度は１２％のポリアクリルアミドゲル上での
電気泳動後回酸銀、またはコマシーブルー染色し定量的
にマーカー蛋白に対する蛋白の量と比較するがまたは定
量的なＥＬＩＳＡ法によって概算した。
のアフィニティ
ジメチルビメリミド・２塩酸を用いてモノクローナル抗
体の上澄液をゲルに結合させることによってプロティン
Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂのアフィニティーカラム（
ファルマシア社）を調製した。結合しなかった抗体を０
．ＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８，３）で洗うことによって
取除いた。適当な組換え体遺伝子を感染させたＳＦ細胞
の培養上澄液を免疫担体と混合し、室温で振とうしそし
て１分間１５００ＲＰＭで遠心分離した。それから免疫
担体ゲルをホウ酸緩衝液に懸濁し、使いすてのエコツカ
ラム（バイオランド社製）に注ぎ込んだ。
体の上澄液をゲルに結合させることによってプロティン
Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂのアフィニティーカラム（
ファルマシア社）を調製した。結合しなかった抗体を０
．ＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８，３）で洗うことによって
取除いた。適当な組換え体遺伝子を感染させたＳＦ細胞
の培養上澄液を免疫担体と混合し、室温で振とうしそし
て１分間１５００ＲＰＭで遠心分離した。それから免疫
担体ゲルをホウ酸緩衝液に懸濁し、使いすてのエコツカ
ラム（バイオランド社製）に注ぎ込んだ。
カラムを緩衝液Ａ ［０，５８ＮａＣ１，０，０５Ｍト
リス−塩酸（ｐＨ８，２）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％
ノニデットＰ−４０］、緩衝液Ｂ ［０，１５Ｍ Ｎａ
Ｃ１，０，０５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８，２）、０．
５％ノニデットＰ−４０，０，１％ＳＤＳコ。
リス−塩酸（ｐＨ８，２）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％
ノニデットＰ−４０］、緩衝液Ｂ ［０，１５Ｍ Ｎａ
Ｃ１，０，０５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８，２）、０．
５％ノニデットＰ−４０，０，１％ＳＤＳコ。
Ｂ荷液Ｃ［０，１５Ｍ ＮａＣ１，０，５％デオキシコ
ール酸ナトリウムコの各５０ｍ１で、また夫々の間には
ホウ酸緩衝液での洗浄を入れて順次洗った。ホウ酸緩衝
液で最後に洗った後、蛋白を０．１Ｍグリシン−塩酸（
ｐＨ２，５）で溶出し、この酸を中和するために２Ｍト
リス塩基を入れた試験管に受けた。
ール酸ナトリウムコの各５０ｍ１で、また夫々の間には
ホウ酸緩衝液での洗浄を入れて順次洗った。ホウ酸緩衝
液で最後に洗った後、蛋白を０．１Ｍグリシン−塩酸（
ｐＨ２，５）で溶出し、この酸を中和するために２Ｍト
リス塩基を入れた試験管に受けた。
溶出された蛋白を１２％ポリアクリルアミドゲル上にお
ける電気泳動で分析し、ＶＰ６． ＶＰ６またはＮＳ２
８蛋白の発現の変化と量を定量化するためにＥＬＩＳＡ
における標準として使った。限定するのでなく一例とし
てサブグループ■（α５ＧＩ）のモノクローナル抗体が
ＶＰ６の精製に使われる。この技術に通じる者はその他
のロタウィルス蛋白に対する特異的なモノクローナル抗
体がこれら蛋白の精製に使うことができることを容易に
認識しよう。
ける電気泳動で分析し、ＶＰ６． ＶＰ６またはＮＳ２
８蛋白の発現の変化と量を定量化するためにＥＬＩＳＡ
における標準として使った。限定するのでなく一例とし
てサブグループ■（α５ＧＩ）のモノクローナル抗体が
ＶＰ６の精製に使われる。この技術に通じる者はその他
のロタウィルス蛋白に対する特異的なモノクローナル抗
体がこれら蛋白の精製に使うことができることを容易に
認識しよう。
されだ に・する 血゛の生産
ロタウィルス抗体がないことが示されたモルモット（エ
ルムヒル育種農場産、マサチュセッッ州チェルムフォー
ド）が発現されたＶＰ６蛋白に対する抗血清の生産に用
いられた。阿、に、エステス等によって述べられた（Ｊ
、 Ｖｉｒｏｌ、、第３１巻：８１０−８１５頁、１９
７９年）ようにして３週間隔で２回モルモットに筋肉内
に投与された。用いられた抗原は部分精製した発現され
たＶＰ６、またはＡｃＮｐｖあるいはρＡＣ４６１／Ｓ
Ａｌｌ−６に感染したＳＦ細胞の培養上澄液から濃縮さ
れた蛋白であった。モルモットは抗原の投与２回目の後
１週間目に採血され、血清試料が免疫蛍光法、免疫沈殿
法、ＥＬＩＳＡ、免疫電子顕微鏡観察などによって抗体
の存在を検査した。ＶＰ６は例示としてであり同様な方
法がＶＰ６やＮＳＺ８を含む他のロタウィルス蛋白に対
する抗血清を生産するために使われる。
ルムヒル育種農場産、マサチュセッッ州チェルムフォー
ド）が発現されたＶＰ６蛋白に対する抗血清の生産に用
いられた。阿、に、エステス等によって述べられた（Ｊ
、 Ｖｉｒｏｌ、、第３１巻：８１０−８１５頁、１９
７９年）ようにして３週間隔で２回モルモットに筋肉内
に投与された。用いられた抗原は部分精製した発現され
たＶＰ６、またはＡｃＮｐｖあるいはρＡＣ４６１／Ｓ
Ａｌｌ−６に感染したＳＦ細胞の培養上澄液から濃縮さ
れた蛋白であった。モルモットは抗原の投与２回目の後
１週間目に採血され、血清試料が免疫蛍光法、免疫沈殿
法、ＥＬＩＳＡ、免疫電子顕微鏡観察などによって抗体
の存在を検査した。ＶＰ６は例示としてであり同様な方
法がＶＰ６やＮＳＺ８を含む他のロタウィルス蛋白に対
する抗血清を生産するために使われる。
５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電 ゛ 。
Ｗ、に、チェノ等（■匹旦旺＋第１５１巻： ２４３−
２５２頁１９８６年）が発表しているように１２％の分
離用ゲルと４％の濃縮用ゲルをもったレムリの方法の修
正法を使ったポリアクリルアミド平板ゲル電気泳動によ
って蛋白生産物を分析した。電気泳動前に、もし他に触
れなければ、試料は１％ＳＯＳ、１０％２−メ／Ｌ／カ
プトエタノール、０．５Ｍ尿素、０．０５Ｍ トＩＪ
Ｘ塩酸（ｐＨ６，８）、１０％グｌＪｔ’ｌ：Ｉ −／
Ｌ／、０．００２５％フェノールレッドを含む緩衝液中
で３分間煮沸することによって解離された。放射標識さ
れた蛋白はＢ、Ｂ、メイスン等の記載（ムＶｉｒｏ１．
第４６巻、４１３−４２３頁、１９８３年にあり。
２５２頁１９８６年）が発表しているように１２％の分
離用ゲルと４％の濃縮用ゲルをもったレムリの方法の修
正法を使ったポリアクリルアミド平板ゲル電気泳動によ
って蛋白生産物を分析した。電気泳動前に、もし他に触
れなければ、試料は１％ＳＯＳ、１０％２−メ／Ｌ／カ
プトエタノール、０．５Ｍ尿素、０．０５Ｍ トＩＪ
Ｘ塩酸（ｐＨ６，８）、１０％グｌＪｔ’ｌ：Ｉ −／
Ｌ／、０．００２５％フェノールレッドを含む緩衝液中
で３分間煮沸することによって解離された。放射標識さ
れた蛋白はＢ、Ｂ、メイスン等の記載（ムＶｉｒｏ１．
第４６巻、４１３−４２３頁、１９８３年にあり。
この記載を参考としてとりいれる）に従ってフルオログ
ラフィー（ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ）でゲル上で観察
された。
ラフィー（ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ）でゲル上で観察
された。
ＳＦ のＳＡｌｌ の
ＳＡｌｌのジーン６ ｃＤＮＡ挿入部をもつ３種のバク
ロウィルス形質転換体がまず同定され、ＳＦ細胞の感染
後にＳＡｌｌのＶＰ６を生産するカが調べられた。Ａｃ
ＮＰＶ ＊た１ｉｓＡ１１ジ一ン６形質転換体で感染し
た細胞中の３５８−メチオニン含有ポリペプチドは第１
図に示されている。形質転換体感染細胞には４１，００
０（＝４１Ｋ）の予想される分子量のところに新しいバ
ンドがみられたが、一方ＡｃＮＰＶ感染細胞にはポリヘ
ドリン蛋白しがみられなかった。この蛋白の合成におけ
る経時変化は感染後２２時間に放射標識されたＶＰ６が
はじめて検出されその合成は感染後１０５時間でなお検
出されることを示している。この技術分野に通じる者は
、早期に合成される蛋白（バクロウィルス）よりも、外
来蛋白（ロタウィルス）の同定、分離にとって遅く合成
される方が利点があることを認識しよう、遅く合成され
る方が利点があることを認識しよう、 ＶＰ６蛋白は例
示のためにのみ示したので限定ではない。他のロタウィ
ルスの遺伝子産物も同様にＳＦ細胞に発現し検出される
。
ロウィルス形質転換体がまず同定され、ＳＦ細胞の感染
後にＳＡｌｌのＶＰ６を生産するカが調べられた。Ａｃ
ＮＰＶ ＊た１ｉｓＡ１１ジ一ン６形質転換体で感染し
た細胞中の３５８−メチオニン含有ポリペプチドは第１
図に示されている。形質転換体感染細胞には４１，００
０（＝４１Ｋ）の予想される分子量のところに新しいバ
ンドがみられたが、一方ＡｃＮＰＶ感染細胞にはポリヘ
ドリン蛋白しがみられなかった。この蛋白の合成におけ
る経時変化は感染後２２時間に放射標識されたＶＰ６が
はじめて検出されその合成は感染後１０５時間でなお検
出されることを示している。この技術分野に通じる者は
、早期に合成される蛋白（バクロウィルス）よりも、外
来蛋白（ロタウィルス）の同定、分離にとって遅く合成
される方が利点があることを認識しよう、遅く合成され
る方が利点があることを認識しよう、 ＶＰ６蛋白は例
示のためにのみ示したので限定ではない。他のロタウィ
ルスの遺伝子産物も同様にＳＦ細胞に発現し検出される
。
された の とｐ注性
標準のＶＰ６としての４１にのバンドの同定はＳＡｌｌ
ウイルスに対して作られたポリクローナル抗血清と、Ｓ
ＡｌｌとＶＰ６にある２つのエピトープ（ｓｐｉｔｏｐ
ｅｓ） （ｒ共通」と「サブグループＩＪ）に対するモ
ノクローナル抗体について免疫反応が陽性であることで
示された（第２図）。これらの反応の特異性はサブグル
ープＨの抗体がＳＡｌｌの４１に蛋白と反応しないこと
、とＡｃＮＰＶ感染細胞の蛋白はこの範囲ではいかなる
蛋白とも全く反応しないことによって示された。同様な
結果が３つの全てのＶＰ６形質転換体でみられた。
ウイルスに対して作られたポリクローナル抗血清と、Ｓ
ＡｌｌとＶＰ６にある２つのエピトープ（ｓｐｉｔｏｐ
ｅｓ） （ｒ共通」と「サブグループＩＪ）に対するモ
ノクローナル抗体について免疫反応が陽性であることで
示された（第２図）。これらの反応の特異性はサブグル
ープＨの抗体がＳＡｌｌの４１に蛋白と反応しないこと
、とＡｃＮＰＶ感染細胞の蛋白はこの範囲ではいかなる
蛋白とも全く反応しないことによって示された。同様な
結果が３つの全てのＶＰ６形質転換体でみられた。
ＶＰ６は免疫蛍光法によって形質転換体感染細胞の細胞
質にみられた。そして、それは遠沈した培養上澄からも
細胞結合蛋白からも免疫沈澱した（第２図）。合成され
た蛋白量は免疫沈澱するＶＰ６を希釈法で分析すること
で定量される。
質にみられた。そして、それは遠沈した培養上澄からも
細胞結合蛋白からも免疫沈澱した（第２図）。合成され
た蛋白量は免疫沈澱するＶＰ６を希釈法で分析すること
で定量される。
第３図は免疫担体カラムから放射化学的、生化学的均一
度をもつまでに精製されたＶＰ６で標準化したＥＬＩＳ
Ａ法で定量した結果を示しており、免疫反応するＶＰ６
が感染後８時間はどで検出されることを示している。さ
らに培養液中にみられるＶＰ６の量も時間と共に増加し
た。細胞結合性のＶＰ６は１０６細胞／ｍｌの密度で２
０〜１５０ μｇ（７）量に感染細胞中に生産される。
度をもつまでに精製されたＶＰ６で標準化したＥＬＩＳ
Ａ法で定量した結果を示しており、免疫反応するＶＰ６
が感染後８時間はどで検出されることを示している。さ
らに培養液中にみられるＶＰ６の量も時間と共に増加し
た。細胞結合性のＶＰ６は１０６細胞／ｍｌの密度で２
０〜１５０ μｇ（７）量に感染細胞中に生産される。
培養上澄におけるこの収量は精製したＶＰ６を使った生
化学的、免疫学的研究をさらに行うのに十分である。Ｖ
Ｐ６の収量は細胞を１０％ＦＢＳを含む完全培地で生育
させれば最高となる。
化学的、免疫学的研究をさらに行うのに十分である。Ｖ
Ｐ６の収量は細胞を１０％ＦＢＳを含む完全培地で生育
させれば最高となる。
されたＶＰ６の構’ １Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａ
ｌ ｒｏ ｅｒｔｉｅｓ精製したウシのロタウィルス
から取り出された。あるいは感染細胞で分析されたＶＰ
６は少量体（オリゴマー）としておそらくは三量体の蛋
白として振舞っていることが知られている。本発明で合
成されたＶＰ６は既知のＶＰ６と同様の構造上の性質を
有していた。感染細胞から得た培地から精製したＶＰ６
は本来の少量体構造をもっており、モルモットに免疫原
性があり、形態学的なサブユニットにすぐに集合するこ
とができた。
ｌ ｒｏ ｅｒｔｉｅｓ精製したウシのロタウィルス
から取り出された。あるいは感染細胞で分析されたＶＰ
６は少量体（オリゴマー）としておそらくは三量体の蛋
白として振舞っていることが知られている。本発明で合
成されたＶＰ６は既知のＶＰ６と同様の構造上の性質を
有していた。感染細胞から得た培地から精製したＶＰ６
は本来の少量体構造をもっており、モルモットに免疫原
性があり、形態学的なサブユニットにすぐに集合するこ
とができた。
第４図はＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳
動後精製した単殻のウィルス中の３Ｓ３−メチオニン標
識された蛋白の様子がゲルにかける前にウィルスを加熱
するかしないかに左右されて異なることを示している。
動後精製した単殻のウィルス中の３Ｓ３−メチオニン標
識された蛋白の様子がゲルにかける前にウィルスを加熱
するかしないかに左右されて異なることを示している。
加熱をすると、ＶＰＩ（１２５Ｋ）、 ＶＰ６（９４Ｋ
）及びＶＰ６（４１Ｋ）を表わす特徴的なバンドがみら
れた。加熱をしないとＶＰ６のバンドは消え、ＶＰＩの
上に移動する新しいバンドが観察された。バクロウィル
ス発現のＶＰ６（Ｌ、よ糖密度勾配で部分精製したもの
）及び免疫アフィニティで精製したＶＰ６ででも同様な
解析を行いこれらの蛋白がやはり少量体を形成している
ことが示された（第４図）。還元剤（２−メルカプトエ
タノール）がない状態では、多くの少量体型として移動
する別のバンドがｗｔ察された０発現したＶＰ６の単量
体と少量体型がイムノプロット法を使ってもみられた。
）及びＶＰ６（４１Ｋ）を表わす特徴的なバンドがみら
れた。加熱をしないとＶＰ６のバンドは消え、ＶＰＩの
上に移動する新しいバンドが観察された。バクロウィル
ス発現のＶＰ６（Ｌ、よ糖密度勾配で部分精製したもの
）及び免疫アフィニティで精製したＶＰ６ででも同様な
解析を行いこれらの蛋白がやはり少量体を形成している
ことが示された（第４図）。還元剤（２−メルカプトエ
タノール）がない状態では、多くの少量体型として移動
する別のバンドがｗｔ察された０発現したＶＰ６の単量
体と少量体型がイムノプロット法を使ってもみられた。
この技術に通じた者はモノクローナル抗体による免疫沈
澱研究と構造的研究は発現したＶＰ６が本来の構造を有
し、さらに少量体構造がＶＰ６の本来的な性質であるこ
とを示していることを認識するだろう、第６図は形態学
的構造に自然に集合した発現ＶＰ６の電子顕微鏡写真を
示している。これらの発現ｖＰにある管状構造はロタウ
ィルスの内殻に典型的な六角形のサブユニット配列を示
している。第６図ＢはＶＰ６構造が５ＧＩ−全複合体で
ｍ識されることを示している。第６図ＣはＶＰ６＠造が
α−ＮＳ２８−全複合体と反応し、特異的結合はみられ
ないことを示している。このことはＶＰ６から集合した
管状構造に特異性があることを示している。
澱研究と構造的研究は発現したＶＰ６が本来の構造を有
し、さらに少量体構造がＶＰ６の本来的な性質であるこ
とを示していることを認識するだろう、第６図は形態学
的構造に自然に集合した発現ＶＰ６の電子顕微鏡写真を
示している。これらの発現ｖＰにある管状構造はロタウ
ィルスの内殻に典型的な六角形のサブユニット配列を示
している。第６図ＢはＶＰ６構造が５ＧＩ−全複合体で
ｍ識されることを示している。第６図ＣはＶＰ６＠造が
α−ＮＳ２８−全複合体と反応し、特異的結合はみられ
ないことを示している。このことはＶＰ６から集合した
管状構造に特異性があることを示している。
現した に対して られた 血′の
野生型のＡｃＮＰＶに感染したＳＦ細胞蛋白の濃縮物、
ＳＦ細胞中にジーン６形質転換体によって発現された蛋
白の濃縮物、及びしよ糖密度勾配遠心分離によって感染
ＳＦ細胞の培養上澄から部分精製されたＶＰ６、に対す
る抗血清がモルモットで作られた。 ＶＰ６を認識する
各抗血清の能力は免疫沈澱法で調べられた。第５図では
、免疫前の血清とＡｃＮＰＶ感染ＳＦ［白に対する抗血
清は５Ａ−１１感染ＭＡ１０４細胞可溶化物の細胞性蛋
白及びウィルス性蛋白のいずれとも反応しなかったが一
方、未精製および部分精製したＶＰ６に対する抗血清が
ＶＰ６と特異的に反応している。これらの抗血清はロタ
ウィルスを検出する作用についてさらに特徴づけられた
。抗ＶＰ６血清は既知のヒトの血清型とサブグループの
夫々を表わすロタウィルス株を免疫蛍光法とＥＬＩＳＡ
Ｉで検出した。
ＳＦ細胞中にジーン６形質転換体によって発現された蛋
白の濃縮物、及びしよ糖密度勾配遠心分離によって感染
ＳＦ細胞の培養上澄から部分精製されたＶＰ６、に対す
る抗血清がモルモットで作られた。 ＶＰ６を認識する
各抗血清の能力は免疫沈澱法で調べられた。第５図では
、免疫前の血清とＡｃＮＰＶ感染ＳＦ［白に対する抗血
清は５Ａ−１１感染ＭＡ１０４細胞可溶化物の細胞性蛋
白及びウィルス性蛋白のいずれとも反応しなかったが一
方、未精製および部分精製したＶＰ６に対する抗血清が
ＶＰ６と特異的に反応している。これらの抗血清はロタ
ウィルスを検出する作用についてさらに特徴づけられた
。抗ＶＰ６血清は既知のヒトの血清型とサブグループの
夫々を表わすロタウィルス株を免疫蛍光法とＥＬＩＳＡ
Ｉで検出した。
バクロウィルスの発 蛋白によるワクチンＶＰ６をマウ
スの腹腔内で母親免疫してワクチンとした。投与は３回
行いそれぞれ２０μｇのＶＰ６とアジュバントを含んで
いた。対照として、二重の殻をもったウィルス、単層の
殻のウィルスあるいはアジュバントだけで母親マウスを
免疫したにの親の生んだ子供全部にロタウィルスをチャ
レンジした。二重殻のウィルスを免疫した母親の子供は
全部病気から守られた。その母親がＶＰ６または単層殻
のウィルスで免疫された場合その子供は部分的に予防さ
れた。これらの子供は病気の発症がおくれたり症状が軽
かったりした。アジュバントを免疫した母親からの子供
は早く発症し、病気も重かった。この技術に通じた者は
ＶＰ６の免疫的な品質を認めるだろう。
スの腹腔内で母親免疫してワクチンとした。投与は３回
行いそれぞれ２０μｇのＶＰ６とアジュバントを含んで
いた。対照として、二重の殻をもったウィルス、単層の
殻のウィルスあるいはアジュバントだけで母親マウスを
免疫したにの親の生んだ子供全部にロタウィルスをチャ
レンジした。二重殻のウィルスを免疫した母親の子供は
全部病気から守られた。その母親がＶＰ６または単層殻
のウィルスで免疫された場合その子供は部分的に予防さ
れた。これらの子供は病気の発症がおくれたり症状が軽
かったりした。アジュバントを免疫した母親からの子供
は早く発症し、病気も重かった。この技術に通じた者は
ＶＰ６の免疫的な品質を認めるだろう。
このパターンは完全な予防のためには内殻と外殻の抗原
相方が必要とされることが示唆された。
相方が必要とされることが示唆された。
すなわちこの技術に通じた者はＶＰ６とＶＰ６の混合が
十分な免疫力を示すであろうということを認めるだろう
。他のロタウィルス蛋白が合成されるので、ロタウィル
ス感染に対して完全な免疫を提供するためにはさらに混
合物を作ることもできる。この技術に通じた者はこの混
合物を作るために、いくつかのやり方が使用できること
を認識しよう。
十分な免疫力を示すであろうということを認めるだろう
。他のロタウィルス蛋白が合成されるので、ロタウィル
ス感染に対して完全な免疫を提供するためにはさらに混
合物を作ることもできる。この技術に通じた者はこの混
合物を作るために、いくつかのやり方が使用できること
を認識しよう。
例えば、これらには一つ以上の組換え体でＳＦ細胞に同
時に感染させることを含みその場合にはＶＰ６とＶＰ６
の本来備わっている性質が自然に集合体を形成すること
に役立ちうる。ＶＰ６とＶＰ６を同時に感染したＳＦ細
胞における蛋白での実験でこの蛋白の少量体が作られる
ことを示唆した。
時に感染させることを含みその場合にはＶＰ６とＶＰ６
の本来備わっている性質が自然に集合体を形成すること
に役立ちうる。ＶＰ６とＶＰ６を同時に感染したＳＦ細
胞における蛋白での実験でこの蛋白の少量体が作られる
ことを示唆した。
単一で発現したＶＰ６は少量体として作られ、試験管内
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で形態学的なサブユニットで形成
するので、この技術に通じる者はＶＰ６とＶＰ６の共発
現は当然集合体すなわちウィルス株の（Ｓｕｂｖｉｒａ
ｌ）粒子を形成することを認識しよう。
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で形態学的なサブユニットで形成
するので、この技術に通じる者はＶＰ６とＶＰ６の共発
現は当然集合体すなわちウィルス株の（Ｓｕｂｖｉｒａ
ｌ）粒子を形成することを認識しよう。
ＶＰ６は細胞付着蛋白といわれており、これが集合体上
にあるこれらのエピトープの発現はサブユニットワクチ
ンが細胞に付着し潜在的な免疫源となりつる能力を高め
よう。いろいろな組合せのロタウィルス遺伝子蛋白（例
えば、ＳＦ中のＶＰ６． ＶＰ６． ＶＰ６． ＮＳ２
８等々）の共発現が天然の凝集体をもたらし、従って人
類全体の免疫のため混合して抗原を生産することができ
るようになるだろう。
にあるこれらのエピトープの発現はサブユニットワクチ
ンが細胞に付着し潜在的な免疫源となりつる能力を高め
よう。いろいろな組合せのロタウィルス遺伝子蛋白（例
えば、ＳＦ中のＶＰ６． ＶＰ６． ＶＰ６． ＮＳ２
８等々）の共発現が天然の凝集体をもたらし、従って人
類全体の免疫のため混合して抗原を生産することができ
るようになるだろう。
さらに、ロタウィルス蛋白をＳＦ細胞で別個に合成し、
そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで精製蛋白を混合することによ
ってワクチンを作ることもできる。その上混合の前ある
いは混合をしている間で可溶化することによってそのま
まの混合物以上に免疫原性を改善することができる。蛋
白の可溶化は混合した抗原をｉｎ ｖｉｔｒｏで凝集さ
せる。その凝集物はそれが天然の状態を模しているので
精製蛋白を単に混合したものよりよい免疫原となろう。
そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで精製蛋白を混合することによ
ってワクチンを作ることもできる。その上混合の前ある
いは混合をしている間で可溶化することによってそのま
まの混合物以上に免疫原性を改善することができる。蛋
白の可溶化は混合した抗原をｉｎ ｖｉｔｒｏで凝集さ
せる。その凝集物はそれが天然の状態を模しているので
精製蛋白を単に混合したものよりよい免疫原となろう。
共合酸や共発現を含む混合における他の手段は混合され
た抗原の免疫ワクチンを得るために等しく利用できるの
で上記の手段は単に一例にすぎない。
た抗原の免疫ワクチンを得るために等しく利用できるの
で上記の手段は単に一例にすぎない。
ＶＰ６はそれがＥＬＩＳＡあるいは免疫蛍光法で調べた
とき高い力価の抗血清をモルモットに導びく点で免疫原
性である。しかしながら、抗ＶＰ６血清それ自身は５０
プラ一ク形成単位のウィルスを使ってプラーク減少中和
法で調べるときＳＡｌｌの感染性を中和しなかった。従
ってこれはある試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の検査法
がＶＰ６蛋白の免疫原性を認識しないとしても、実際の
生物体内（ｉｎｖｉｖｏ）における免疫は達せられると
いう証拠である（マウスでのデータ）。発現したＶＰ６
が中和できる抗体を作ることができないことでこの蛋白
が感染や病気を予防するのに役割を果しているであろう
という考えを削除することはできない。それはロタウィ
ルス感染と発病を予防するのに決定的である免疫と非免
疫の機構に対する我々の理解が不完全であるからである
。ＶＰ６はインフルエンザウィルスの蛋白のそれと同じ
やり方でペテロタイプの免疫をもたらすといわれている
ような細胞介在性の免疫応答を刺激するのに重要なので
あろう。発現されたＶＰ６もそれに加えて発現された外
殻の蛋白を含むサブユニットワクチンでは有効な成分で
あろう。
とき高い力価の抗血清をモルモットに導びく点で免疫原
性である。しかしながら、抗ＶＰ６血清それ自身は５０
プラ一ク形成単位のウィルスを使ってプラーク減少中和
法で調べるときＳＡｌｌの感染性を中和しなかった。従
ってこれはある試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の検査法
がＶＰ６蛋白の免疫原性を認識しないとしても、実際の
生物体内（ｉｎｖｉｖｏ）における免疫は達せられると
いう証拠である（マウスでのデータ）。発現したＶＰ６
が中和できる抗体を作ることができないことでこの蛋白
が感染や病気を予防するのに役割を果しているであろう
という考えを削除することはできない。それはロタウィ
ルス感染と発病を予防するのに決定的である免疫と非免
疫の機構に対する我々の理解が不完全であるからである
。ＶＰ６はインフルエンザウィルスの蛋白のそれと同じ
やり方でペテロタイプの免疫をもたらすといわれている
ような細胞介在性の免疫応答を刺激するのに重要なので
あろう。発現されたＶＰ６もそれに加えて発現された外
殻の蛋白を含むサブユニットワクチンでは有効な成分で
あろう。
ロタウィルス検出のための診 キットの生産バクロウィ
ルスの発現蛋白に対して生産された抗血清はロタウィル
ス抗原またはロタウィルスに対する抗体の応答を検出す
るための診断キットを生産するのに利用できる。この技
術に通じた者はこの診断キットを作るのにいろいろな形
の処法を使うことができることを認めよう。
ルスの発現蛋白に対して生産された抗血清はロタウィル
ス抗原またはロタウィルスに対する抗体の応答を検出す
るための診断キットを生産するのに利用できる。この技
術に通じた者はこの診断キットを作るのにいろいろな形
の処法を使うことができることを認めよう。
抗原の検出にはバクロウィルスの発現したロタウィルス
蛋白の１つまたはそれ以上に対して作られた抗血清が臨
床標本にみられるウィルス粒子や可溶性の抗原の検出に
使われる。感染が消化器官にあるので糞便標本が望まし
い。ＶＰ６に対して作られた抗血清が広範囲に反応性が
あり、ヒトや動物のロタウィルスを検出する。そのよう
なキットは全ウィルス粒子あるいは他のバクロウィルス
の発現する蛋白に対して作られた抗血清の１つ以上をウ
ィルス抗原をとらえるために使うことができる。抗体の
検出のためにはバクロウィルスの発現する蛋白に対して
作られた抗血清がヒトや動物の血清試料中の抗体の検出
に使われるウィルス抗原をとらえるために使われること
ができる。
蛋白の１つまたはそれ以上に対して作られた抗血清が臨
床標本にみられるウィルス粒子や可溶性の抗原の検出に
使われる。感染が消化器官にあるので糞便標本が望まし
い。ＶＰ６に対して作られた抗血清が広範囲に反応性が
あり、ヒトや動物のロタウィルスを検出する。そのよう
なキットは全ウィルス粒子あるいは他のバクロウィルス
の発現する蛋白に対して作られた抗血清の１つ以上をウ
ィルス抗原をとらえるために使うことができる。抗体の
検出のためにはバクロウィルスの発現する蛋白に対して
作られた抗血清がヒトや動物の血清試料中の抗体の検出
に使われるウィルス抗原をとらえるために使われること
ができる。
別個に発現したＶＰ６は少量体を形成しそして電子顕微
鏡による分析によっても発現した三重量体のＶＰ６分子
が集合して単層の殻粒子にみられるものに特徴的な形態
学的サブユニットになることを示した。これらのサブユ
ニットはウィルスの粒子の内殻からＶＰ６を選択的に取
り出すことによってみることができる。それ故、他のウ
ィルス蛋白あるいはすでに形成している前ウィルス様（
Ｓｕｂｖｉｒａｌ）構造との蛋白−蛋白相互作用はサブ
ユニット形成には必要とされないだろう。多量の精製し
た外殻の蛋白を利用できるようになれば粒子の形態分化
を制御している因子を解明することができようし、ウィ
ルスの殻の自己集合をさせられよう。本発明の本来の構
造は真核性の蛋白を生産するためにこの系を使ってまた
それが利点であることと一致している。
鏡による分析によっても発現した三重量体のＶＰ６分子
が集合して単層の殻粒子にみられるものに特徴的な形態
学的サブユニットになることを示した。これらのサブユ
ニットはウィルスの粒子の内殻からＶＰ６を選択的に取
り出すことによってみることができる。それ故、他のウ
ィルス蛋白あるいはすでに形成している前ウィルス様（
Ｓｕｂｖｉｒａｌ）構造との蛋白−蛋白相互作用はサブ
ユニット形成には必要とされないだろう。多量の精製し
た外殻の蛋白を利用できるようになれば粒子の形態分化
を制御している因子を解明することができようし、ウィ
ルスの殻の自己集合をさせられよう。本発明の本来の構
造は真核性の蛋白を生産するためにこの系を使ってまた
それが利点であることと一致している。
この技術分野に推した者はロタウィルスに対する現行の
診断法を改良するためあるいはワクチンとしてこの発現
蛋白を他の用い方があることを認めるだろう。未精製の
、あるいは部分精製したＶＰ６に対する抗血清は免疫蛍
光法やＥＬＩＳＡ法によってＡ群のロタウィルスの全て
がもっている共通の抗原決定基を検出した。ＶＰ６はモ
ノクローナルにしろポリクローナルの抗血清にしろそれ
に基づいた市販の診断検査法で検出される主要な蛋白で
あるので、この分野の技術に通じる者にとって、バクロ
ウィルスの発現したＶＰ６を使ったこのような試薬を将
来生産することはこの蛋白を回転培養や単層培養、発酵
法などで培養した感染細胞から作ることのできることや
高収率であることのために、費用が効率的になることを
容易に明らかにされよう。
診断法を改良するためあるいはワクチンとしてこの発現
蛋白を他の用い方があることを認めるだろう。未精製の
、あるいは部分精製したＶＰ６に対する抗血清は免疫蛍
光法やＥＬＩＳＡ法によってＡ群のロタウィルスの全て
がもっている共通の抗原決定基を検出した。ＶＰ６はモ
ノクローナルにしろポリクローナルの抗血清にしろそれ
に基づいた市販の診断検査法で検出される主要な蛋白で
あるので、この分野の技術に通じる者にとって、バクロ
ウィルスの発現したＶＰ６を使ったこのような試薬を将
来生産することはこの蛋白を回転培養や単層培養、発酵
法などで培養した感染細胞から作ることのできることや
高収率であることのために、費用が効率的になることを
容易に明らかにされよう。
ここに選んだ実施例及び発明の実例は記載の目的のため
に出されたもので、本発明の精神の中に含まれ、添付し
た請求範囲で規定される変更や他の用途はこの分野の技
術に通じる者にとってはなされるであろう。
に出されたもので、本発明の精神の中に含まれ、添付し
た請求範囲で規定される変更や他の用途はこの分野の技
術に通じる者にとってはなされるであろう。
第１図
感染されたＳｆ細 でのＶＰ６ ム の動力８モ
ツク・（Ｍ）、野生型のバクロウィルス（ＡｃＮＰＶ）
またはバクロウィルスの組換え体を感染させたＳｆ細胞
で合成された蛋白は、示された時間（単位は時間）３３
Ｓ−メチオニン（３０μＣｉ／ｍ Ｑ ）で標識された
。２時間後集められた細胞中の蛋白は１２％ポリアクリ
ルアミドゲルで分析された。ポリヘドリンとＳＡｌｌ
ＶＰ６は左側及び右側の写真に夫々矢印で示されている
。 第２図 ＳＡｌｌ ＶＰ６（７１Ｓｆ細 テノ と ・
、゛−３８Ｓ−メチオニン標識された蛋白がＷｔまたは
５Ａ１１ジーン６組換え体で感染したＳｆ細胞中で合成
された。 ＡｃＮＰＶポリヘドリン（ト）と５ＡＩＬ（
７）ＶＰ６（ム）が示されている。これら蛋白のＳＡｌ
ｌ粒子（α５ＡＩＬ）に対する抗血清またはｓＡｏ Ｖ
Ｐ６上に存在するエピトープ（αＳＧＩ、αｃｏｗ）ま
たは存在しないエピトープ（α５ＧＩ）に対するモノク
ロ−ナル抗体との免疫反応が示されている。左側の写真
は細胞に関連したＶＰ６の反応性であるが一方右側の写
真は２つの別のジーン６組換え体で感染した細胞からの
ＶＰ６（ｃ）または培地上清からのＶＰ６（Ｓ）の反応
性を示している。図中、Ｃは細胞を意味し、Ｓは培養上
澄みを意味している。 第３図 ＥＬＩＳＡニよるｖＰ６ノノ ＥＬＩＳＡの結果は感染後足された時間に５ＡＩＬ感染
したＳｆ細胞中（＋）または培養液中に（＋）ＥＬＩＳ
Ａで検出されたＶＰ６の量を示している。いずれの時点
でもＶＰ６の量はアフィニティーで精製されたＶＰ６の
既知量の標準曲線ＯＤ値と５Ａ１１６．１−感染細胞試
料の吸光度（０，０）を直接比較することで定量した。 モックとνｔ ＡｃＮＰＶ感染細胞からバックグラウン
ドのＯＤ値（０，００１〜０．０１６）を差しひいた。 いくつかの感染でみられたＶＰ６の量の範囲も示されて
いる。 第４図 したＶＰ６と のＶＰ６のホ′ の比較単層で覆われ
た（ＳＳ）ＳＡ１１粒子またはバクロウィルスで発現し
たＶＰ６のポリペプチドを１００℃２分間かまたは３７
℃３０分間同一緩衝液中で２−メルカルプエタノール（
β−ＭＥ）の有り（＋）または無しく−）の状態で加熱
した後１２％ポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲル
をフルオログラフィーにかけて、放射能標識した蛋白を
検出するためにフィルム上に露光させるかまたは分離し
た蛋白を電気泳動的にニトロセルロース膜に移してそれ
からＳＧＩモノクローナル抗体を用いて検出した。第５
図 ５ＡＩＬ感染ＭＡ１０４細胞中の３５８−メチオニン標
識ポリペプチド（第１列）と野生型のバクロウィルス（
ＡｃＮＰＶ）感染Ｓｆ細胞から濃縮した蛋白（第５列）
に対して作られたモルモット抗血清で免疫沈澱した。組
換え体を感染させたＳｆ細胞から精製したＶＰ６（第６
列） 、５ＡＩＬ−６を感染させたＳｆ細胞から濃縮し
た（しかし精製していない）蛋白（第７列）、精製した
二重層殻の５ＡＩＬ（第８列）のもの。第９列はＶＰ６
上のＳＧＩエピトープに対するモノクローナル抗体で免
疫沈澱したＶＰ６を示している。全動物体から採った免
疫前血清はこれらの可溶化物から採った蛋白とは反応を
示さなかった（第２−４列）。二重層殻をもったウィル
スに対する抗血清と反応するウィルス性蛋白ＶＰ２．
ＶＰ３． ＶＰ６． ＶＰ６． ＶＰ６は第８列にみら
れる。 ＶＰ６は矢印で示されている。第２〜９列は夫々示され
ている血清をそのまままたは１：１０に稀釈して行った
分析を示している。 第６図 されたＶＰ６のキャプソメア ノ への へ発現された
ＶＰ６を部分精製しその構造を２％酢酸ウラニウムで染
めた後、電子顕微鏡で調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで集合
した管状の構造がＩ！察された。この構造はロタウィル
スの内殻に典型的な六角形のサブユニット配列を示して
いる。これらのサブユニットがＶＰ６を含む立体構造は
抗ＳＧ１血清と特異的な免疫的反応によって示されるが
抗ＮＳ２８血清では反応を示さない。抗血清は抗体反応
を見やすくするためコロイド金に結合されている。 特許出願人 ベイラー カレッジ オブメディシン 図面の、ｖ）書 第２図 Ｍｉ、ｆｆｊ、２．ｉｊ第３図 感染後の経過時間（時間） ＥＬＩＳＡによるシＰ６発現の検出 発現したｖｐ 抗血清のキ ５に対して作られたモルモット ヤラクタリゼーション
ツク・（Ｍ）、野生型のバクロウィルス（ＡｃＮＰＶ）
またはバクロウィルスの組換え体を感染させたＳｆ細胞
で合成された蛋白は、示された時間（単位は時間）３３
Ｓ−メチオニン（３０μＣｉ／ｍ Ｑ ）で標識された
。２時間後集められた細胞中の蛋白は１２％ポリアクリ
ルアミドゲルで分析された。ポリヘドリンとＳＡｌｌ
ＶＰ６は左側及び右側の写真に夫々矢印で示されている
。 第２図 ＳＡｌｌ ＶＰ６（７１Ｓｆ細 テノ と ・
、゛−３８Ｓ−メチオニン標識された蛋白がＷｔまたは
５Ａ１１ジーン６組換え体で感染したＳｆ細胞中で合成
された。 ＡｃＮＰＶポリヘドリン（ト）と５ＡＩＬ（
７）ＶＰ６（ム）が示されている。これら蛋白のＳＡｌ
ｌ粒子（α５ＡＩＬ）に対する抗血清またはｓＡｏ Ｖ
Ｐ６上に存在するエピトープ（αＳＧＩ、αｃｏｗ）ま
たは存在しないエピトープ（α５ＧＩ）に対するモノク
ロ−ナル抗体との免疫反応が示されている。左側の写真
は細胞に関連したＶＰ６の反応性であるが一方右側の写
真は２つの別のジーン６組換え体で感染した細胞からの
ＶＰ６（ｃ）または培地上清からのＶＰ６（Ｓ）の反応
性を示している。図中、Ｃは細胞を意味し、Ｓは培養上
澄みを意味している。 第３図 ＥＬＩＳＡニよるｖＰ６ノノ ＥＬＩＳＡの結果は感染後足された時間に５ＡＩＬ感染
したＳｆ細胞中（＋）または培養液中に（＋）ＥＬＩＳ
Ａで検出されたＶＰ６の量を示している。いずれの時点
でもＶＰ６の量はアフィニティーで精製されたＶＰ６の
既知量の標準曲線ＯＤ値と５Ａ１１６．１−感染細胞試
料の吸光度（０，０）を直接比較することで定量した。 モックとνｔ ＡｃＮＰＶ感染細胞からバックグラウン
ドのＯＤ値（０，００１〜０．０１６）を差しひいた。 いくつかの感染でみられたＶＰ６の量の範囲も示されて
いる。 第４図 したＶＰ６と のＶＰ６のホ′ の比較単層で覆われ
た（ＳＳ）ＳＡ１１粒子またはバクロウィルスで発現し
たＶＰ６のポリペプチドを１００℃２分間かまたは３７
℃３０分間同一緩衝液中で２−メルカルプエタノール（
β−ＭＥ）の有り（＋）または無しく−）の状態で加熱
した後１２％ポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲル
をフルオログラフィーにかけて、放射能標識した蛋白を
検出するためにフィルム上に露光させるかまたは分離し
た蛋白を電気泳動的にニトロセルロース膜に移してそれ
からＳＧＩモノクローナル抗体を用いて検出した。第５
図 ５ＡＩＬ感染ＭＡ１０４細胞中の３５８−メチオニン標
識ポリペプチド（第１列）と野生型のバクロウィルス（
ＡｃＮＰＶ）感染Ｓｆ細胞から濃縮した蛋白（第５列）
に対して作られたモルモット抗血清で免疫沈澱した。組
換え体を感染させたＳｆ細胞から精製したＶＰ６（第６
列） 、５ＡＩＬ−６を感染させたＳｆ細胞から濃縮し
た（しかし精製していない）蛋白（第７列）、精製した
二重層殻の５ＡＩＬ（第８列）のもの。第９列はＶＰ６
上のＳＧＩエピトープに対するモノクローナル抗体で免
疫沈澱したＶＰ６を示している。全動物体から採った免
疫前血清はこれらの可溶化物から採った蛋白とは反応を
示さなかった（第２−４列）。二重層殻をもったウィル
スに対する抗血清と反応するウィルス性蛋白ＶＰ２．
ＶＰ３． ＶＰ６． ＶＰ６． ＶＰ６は第８列にみら
れる。 ＶＰ６は矢印で示されている。第２〜９列は夫々示され
ている血清をそのまままたは１：１０に稀釈して行った
分析を示している。 第６図 されたＶＰ６のキャプソメア ノ への へ発現された
ＶＰ６を部分精製しその構造を２％酢酸ウラニウムで染
めた後、電子顕微鏡で調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで集合
した管状の構造がＩ！察された。この構造はロタウィル
スの内殻に典型的な六角形のサブユニット配列を示して
いる。これらのサブユニットがＶＰ６を含む立体構造は
抗ＳＧ１血清と特異的な免疫的反応によって示されるが
抗ＮＳ２８血清では反応を示さない。抗血清は抗体反応
を見やすくするためコロイド金に結合されている。 特許出願人 ベイラー カレッジ オブメディシン 図面の、ｖ）書 第２図 Ｍｉ、ｆｆｊ、２．ｉｊ第３図 感染後の経過時間（時間） ＥＬＩＳＡによるシＰ６発現の検出 発現したｖｐ 抗血清のキ ５に対して作られたモルモット ヤラクタリゼーション
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）バクロウィルス遺伝子のプロモーター； （ｂ）上記のプロモーターがロタウィルスの遺伝子の発
現を制御するために効果的なように、その遺伝子に関し
て空間的に位置している少くとも一つのロタウィルス遺
伝子； を含んでいる組換え分子。 ２、プロモーターがバクロウィルスのポリヘドリン遺伝
子のプロモーターであり、遺伝子が遺伝子ジーン１、ジ
ーン２、ジーン３、ジーン４、ジーン５、ジーン６、ジ
ーン７、ジーン８、ジーン９、ジーン１０、ジーン１１
及びそれらの任意の組み合わせである特許請求の範囲第
１項記載の組換え分子。 ３、ロタウィルス遺伝子がジーン６である特許請求の範
囲第２項記載の組換え分子。 ４、ロタウィルス遺伝子がジーン９である特許請求の範
囲第２項記載の組換え分子。 ５、ロタウィルス遺伝子がジーン１０である特許請求の
範囲第２項記載の組換え分子。 ６、バクロウィルス遺伝子プロモーターがバクロウィル
スである￥アウトグラファ・カリフォルニカ￥の核性多
角体病ウィルスからのもので、且つポリヘドリン遺伝子
プロモーターであり、ロタウィルス遺伝子がサルのＳＡ
ｌｌ遺伝子６でその遺伝子６はＶＰ６蛋白を合成してい
るものである特許請求の範囲第１項記載の組換え分子。 ７、ＶＰ６蛋白がその本来の構造（ｎａｔｕｒｅ ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ）で分離される特許請求の範囲第６項記
載の組換え分子。 ８、バクロウィルス遺伝子プロモータがバクロウィルス
の￥アウトグラファ・カリフォルニカ￥の核性多角体病
ウィルスからのもので、且つポリヘドリン遺伝子のプロ
モータで、ロタウィルス遺伝子がサルのＳＡｌｌ遺伝子
９でその遺伝子９がＶＰ７蛋白を合成するものである特
許請求の範囲第１項記載の組換え分子。 ９、ＶＰ７蛋白がその本来の構造で分離されている特許
請求の範囲第８項記載の組換え分子。 １０、バクロウィルス遺伝子のプロモータがバクロウィ
ルスの￥アウトグラファ・カリフォルニカ￥の核性多角
体病ウィルスからのもので、且つポリヘドリン遺伝子の
プロモータであり、ロタウィルスの遺伝子がサルのＳＡ
ｌｌ遺伝子１０でその遺伝子１０がＮＳ２８蛋白を合成
しているものである特許請求の範囲第１項記載の組換え
分子。 １１、ＮＳ２８蛋白がその本来の構造で分離されている
特許請求の範囲第１０項記載の組換え分子。 １２、（ａ）少くとも１つのロタウィルス遺伝子をバク
ロウィルス転移ベクターに挿入し； （ｂ）そのバクロウィルス転移ベクター中の前記ロタウ
ィルス遺伝子を野生型の￥アウトグラファ・カリフォル
ニカ￥の核性多角体病ウィルスＤＮＡをもった￥スポド
プテラ・フルギペルダ￥を共転移感染（ｃｏｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔｉｏｎ）させることによってバクロウィルスの
￥アウトグラファ・カリフォルニカ￥の核性多角体病ウ
ィルスの染色体ＤＮＡに移し； （ｃ）咬合陰性のプラークを同定することによるか、ま
たは特定の遺伝子プローブとハイブリダイズすることに
よるか、またはその両方の方法によって組換えられたポ
リヘドリンプロモーター−ロタウィルス遺伝子分子を選
択し； （ｄ）そのプラークを組換え分子を含むウィルス株を得
るために純化するステップを含む特許請求の範囲第１項
記載の組換え分子を生産する方法。 １３、遺伝子が遺伝子ジーン１、ジーン２、ジーン３、
ジーン４、ジーン５、ジーン６、ジーン７、ジーン８、
ジーン９、ジーン１０、ジーン１１及びそれらの任意の
組み合わせからなるロタウィルス遺伝子群から選ばれる
特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、（ａ）特許請求の範囲第１項記載の組換え分子で
ロタウィルス蛋白を合成し； （ｂ）その合成蛋白を抗体生産のために宿主動物に筋肉
内投与によって接種し； （ｃ）その宿主動物からその抗体を分離し； （ｄ）その抗体を純化する ステップを含むロタウィルス蛋白の抗体を生産する方法
。 １５、（ａ）特許請求の範囲第１４項記載の抗体を生体
標本と接触してロタウィルスと抗体を結合し； （ｂ）その生体標本中のロタウィルスの尺度として結合
した抗体量を測るステップを含むヒトあるいは動物の生
体標本中のロタウィルスを検出する方法。 １６、（ａ）特許請求の範囲第１４項記載の抗体； （ｂ）生体試料を採取する手段及び （ｃ）その生体試料を分析する手段 から成るヒトまたは動物の生体試料中のロタウィルス感
染の程度を評価するための検査キット。 １７、特許請求の範囲第１項記載の組換え分子から合成
されたロタウィルス抗原を含むロタウィルスのためのワ
クチン。 １８、抗原がＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６
、ＶＰ７、ＶＰ９、ＮＳ３５、ＮＳ３４、ＮＳ２８及び
これらの中の任意の組み合せから成る群から選ばれる特
許請求の範囲第１７項記載のワクチン。 １９、抗原が組み換え分子である共発現遺伝子（ｃｏ−
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ）によって作られる混
合抗原である特許請求の範囲第１７項記載のワクチン。 ２０、抗原が特許請求の範囲第１８項記載の抗原を別々
に合成され、その後イン・ヴィトロで合成された抗原を
混合することによって作られる混合抗原である特許請求
の範囲第１７項記載のワクチン。 ２１、抗原がＶＰ６である特許請求の範囲第１７項記載
のワクチン。 ２２、抗原がＶＰ７である特許請求の範囲第１７項記載
のワクチン。 ２３、抗原がＶＰ３である特許請求の範囲第１７項記載
のワクチン。 ２４、免疫学的に有効な量の特許請求の範囲第１７項記
載のワクチンを経口または非経口的に投与するステップ
を含むロタウィルス消化器官疾患に対してヒトを免疫す
る方法。 ２５、薬学的に有効な量の特許請求の範囲第１７項記載
のワクチンを、経口的に投与するステップを含むヒトま
たは動物におけるロタウィルス感染を予防する方法。 ２６、（ａ）ロタウィルス蛋白の構造解析に十分な量の
ロタウィルス蛋白を特許請求の範囲第１項記載の組換え
分子から生産し； （ｂ）その蛋白を構造的に解析する ステップを含むロタウィルス蛋白の構造を同定する方法
。 ２７、（ａ）ロタウィルス蛋白の機能解析に十分な量の
ロタウィルス蛋白を特許請求の範囲第１項記載の組換え
分子から生産し； （ｂ）その蛋白を機能的に解析する ステップを含むロタウィルス蛋白の機能を同定する方法
。 ２８、特許請求の範囲第１７項記載のワクチンで子供の
生前に母親を活性的に免疫するステップを含むロタウィ
ルス感染に対してヒトまたは動物の幼児を受動的に免疫
する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/947,773 US5186933A (en) | 1986-12-30 | 1986-12-30 | Synthesis and immunogenicity of rotavirus genes using a baculovirus expression system |
| US947773 | 1986-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63273478A true JPS63273478A (ja) | 1988-11-10 |
Family
ID=25486741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63000247A Pending JPS63273478A (ja) | 1986-12-30 | 1988-01-04 | バクロウィルス発現系を使ったロタウィルス遺伝子の合成と免疫原性 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5186933A (ja) |
| EP (1) | EP0273366B1 (ja) |
| JP (1) | JPS63273478A (ja) |
| AU (1) | AU618521B2 (ja) |
| CA (1) | CA1339732C (ja) |
| DE (1) | DE3751092T2 (ja) |
Families Citing this family (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5374426A (en) * | 1986-09-03 | 1994-12-20 | University Of Saskatchewan | Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions |
| CA1319101C (en) * | 1986-09-03 | 1993-06-15 | Marta Iris Sabara | Rotavirus nucleocapsid protein with or without binding peptides as immunologic carriers for macromolecules |
| AU621065B2 (en) * | 1987-08-10 | 1992-03-05 | University Of Melbourne, The | Molecular cloning of human rotavirus serotype 4 gene 9 encoding vp7, the major outer capsid neutralisation specific glycoprotein and expression of vp7 and fragments thereof for use in a vaccine |
| EP0402354A4 (en) * | 1987-08-10 | 1991-03-20 | The University Of Melbourne | Molecular cloning of human rotavirus serotype 4 gene 9 encoding vp7, the major outer capsid neutralisation specific glycoprotein and expression of vp7 and fragments thereof for use in a vaccine |
| GB9000143D0 (en) * | 1990-01-04 | 1990-03-07 | Natural Environment Res | Test kit and method for the diagnosis of bluetongue |
| US5298244A (en) * | 1990-10-25 | 1994-03-29 | University Of Saskatchewan | Assembled viral particles and their use in a vaccine to rotaviral disease |
| PT100090A (pt) * | 1991-02-04 | 1993-07-30 | Univ Saskatchewan | Metodo de preparacao de uma composicao capz de libertar um agente biologicamente activo para um alvo, e de encapsulacao do referido agente em esferas da proteina vp6 |
| EP0660723B1 (en) * | 1991-02-04 | 1996-08-21 | The University of Saskatchewan | Vp6 encapsulated drug delivery |
| US5431899A (en) * | 1991-02-04 | 1995-07-11 | University Of Saskatchewan | Rotavirus VP6 as a diagnostic and targeting agent |
| US5643578A (en) * | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
| US6165993A (en) * | 1992-03-23 | 2000-12-26 | University Of Massachusetts Medical Center | DNA vaccines against rotavirus infections |
| US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
| CA2144651A1 (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Timothy J. Miller | Immortalized cells and uses therefor |
| WO1995017515A1 (en) * | 1993-12-23 | 1995-06-29 | University Technologies International Inc. | Methods of expressing proteins in insect cells and methods of killing insects |
| US6673355B1 (en) | 1995-06-14 | 2004-01-06 | Baylor College Of Medicine | Rotavirus enterotoxin NSP4 and methods of using same |
| DE69629812T2 (de) | 1995-06-14 | 2004-04-01 | Baylor College Of Medicine, Houston | Impfstoff gegen rotavirus infektionen enthaltend peptide des viralenterotoxines nsp4 |
| US6270795B1 (en) * | 1995-11-09 | 2001-08-07 | Microbiological Research Authority | Method of making microencapsulated DNA for vaccination and gene therapy |
| EP1054990A2 (de) * | 1998-02-12 | 2000-11-29 | Aventis Research & Technologies GmbH & Co KG | Expressionsvektor zur herstellung von dead-proteinen |
| WO2002036172A2 (en) * | 2000-11-03 | 2002-05-10 | Baylor College Of Medicine | Rotavirus enterotoxin nsp4 and methods of using same |
| KR20030026654A (ko) * | 2001-09-26 | 2003-04-03 | 주식회사 씨트리 | 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체의 생산용 항원및 그의 제조방법과 이용 |
| WO2003072716A2 (en) * | 2002-02-27 | 2003-09-04 | The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Sequence analysis of the tetravalent rotavirus vaccine |
| AU2004210665A1 (en) * | 2003-02-05 | 2004-08-26 | Amphora Discovery Corporation | Topical delivery of cosmetic agents |
| US8906676B2 (en) | 2004-02-02 | 2014-12-09 | Ambrx, Inc. | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
| KR101699142B1 (ko) * | 2004-06-18 | 2017-01-23 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| JP2008507280A (ja) * | 2004-07-21 | 2008-03-13 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 非天然コードアミノ酸を用いた生合成ポリペプチド |
| CA2590429C (en) * | 2004-12-22 | 2014-10-07 | Ambrx, Inc. | Compositions of aminoacyl-trna synthetase and uses thereof |
| JP2008525473A (ja) | 2004-12-22 | 2008-07-17 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 修飾されたヒト成長ホルモン |
| SG158148A1 (en) | 2004-12-22 | 2010-01-29 | Ambrx Inc | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
| CN103520735B (zh) | 2004-12-22 | 2015-11-25 | Ambrx公司 | 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方 |
| MX2007007591A (es) | 2004-12-22 | 2007-07-25 | Ambrx Inc | Metodos para expresion y purificacion de hormona de crecimiento humano recombinante. |
| JP2008541769A (ja) * | 2005-06-03 | 2008-11-27 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 改善されたヒトインターフェロン分子及びそれらの使用 |
| CN102703446B (zh) | 2005-08-18 | 2014-05-28 | Ambrx公司 | tRNA组合物和其用途 |
| BRPI0504441A (pt) * | 2005-10-20 | 2007-06-26 | Fundacao Oswaldo Cruz | vetores de expressão plasmidial contendo regiões especìficas para a expressão de proteìnas ou epìtopos recombinantes de rotavìrus e astrovìrus, processo de produção dos insumos para geração de imunobiológicos para diagnóstico |
| PL1954710T3 (pl) * | 2005-11-08 | 2011-09-30 | Ambrx Inc | Przyspieszacze do modyfikacji aminokwasów niewystępujących w przyrodzie i polipeptydów zbudowanych z aminokwasów nie występujących w przyrodzie |
| PT2339014E (pt) * | 2005-11-16 | 2015-10-13 | Ambrx Inc | Métodos e composições compreendendo aminoácidos não-naturais |
| CA2882445A1 (en) * | 2005-12-14 | 2007-06-21 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
| ES2465473T3 (es) * | 2006-09-08 | 2014-06-05 | Ambrx, Inc. | Transcripción de arnt supresor en células de vertebrado |
| WO2008030613A2 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Ambrx, Inc. | Hybrid suppressor trna for vertebrate cells |
| KR20090060294A (ko) | 2006-09-08 | 2009-06-11 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 인간 혈장 폴리펩티드 또는 Ｆｃ 스캐폴드 및 그의 용도 |
| CN104163864B (zh) | 2007-03-30 | 2017-08-01 | Ambrx公司 | 经修饰fgf‑21多肽和其用途 |
| AU2008247815B2 (en) | 2007-05-02 | 2012-09-06 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| JP5547083B2 (ja) * | 2007-11-20 | 2014-07-09 | アンブルックス，インコーポレイテッド | 修飾されたインスリンポリペプチドおよびそれらの使用 |
| CN103694337B (zh) | 2008-02-08 | 2016-03-02 | Ambrx公司 | 经修饰瘦素多肽和其用途 |
| UA118536C2 (uk) | 2008-07-23 | 2019-02-11 | Амбркс, Інк. | Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування |
| KR101647164B1 (ko) | 2008-09-26 | 2016-08-09 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| NZ607477A (en) | 2008-09-26 | 2014-09-26 | Ambrx Inc | Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines |
| CN107056929A (zh) | 2009-12-21 | 2017-08-18 | Ambrx 公司 | 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途 |
| CN107674121A (zh) | 2009-12-21 | 2018-02-09 | Ambrx 公司 | 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途 |
| WO2011136506A2 (ko) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | 중앙대학교 산학협력단 | 로타바이러스 나노입자를 이용한 재조합 복합 항원의 제조방법 |
| US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
| MX346786B (es) | 2010-08-17 | 2017-03-31 | Ambrx Inc | Polipeptidos de relaxina modificados y sus usos. |
| AR083006A1 (es) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas |
| HUE033858T2 (en) | 2012-02-14 | 2018-01-29 | Merial Inc | Rotavirus unit vaccines and method for their preparation and use |
| PL3412302T3 (pl) | 2014-10-24 | 2021-11-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Zmodyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowania |
| CN110637027B (zh) | 2017-02-08 | 2024-08-30 | 百时美施贵宝公司 | 包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途 |
| CA3152665A1 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Tonix Pharma Limited | Modified tff2 polypeptides |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6356286A (ja) * | 1986-06-20 | 1988-03-10 | アボツト ラボラトリ−ズ | ロタウイルスｓａ−１１の主な外部キヤプシドたん白に用いられる組成物及び方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1339735C (en) * | 1984-04-27 | 1998-03-17 | Ian Hamilton Holmes. | Cloning and sequencing of the major outer capsid gylcoprotein gene of a human rotavirus |
| AU579242B2 (en) * | 1985-05-23 | 1988-11-17 | Comalco Aluminium Limited | Bauxite proppant |
| US4853333A (en) * | 1985-07-26 | 1989-08-01 | American Home Products Corporation | Production of rotavirus in yeast |
| US4861845A (en) * | 1988-03-10 | 1989-08-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polymerization of fluoroolefins |
-
1986
- 1986-12-30 US US06/947,773 patent/US5186933A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-12-18 CA CA000554887A patent/CA1339732C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-12-22 DE DE3751092T patent/DE3751092T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-12-22 EP EP87119055A patent/EP0273366B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-29 AU AU83108/87A patent/AU618521B2/en not_active Ceased
-
1988
- 1988-01-04 JP JP63000247A patent/JPS63273478A/ja active Pending
-
1995
- 1995-02-09 US US08/385,993 patent/US5891676A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/485,575 patent/US5843733A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/475,907 patent/US5827696A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6356286A (ja) * | 1986-06-20 | 1988-03-10 | アボツト ラボラトリ−ズ | ロタウイルスｓａ−１１の主な外部キヤプシドたん白に用いられる組成物及び方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU8310887A (en) | 1988-06-30 |
| US5843733A (en) | 1998-12-01 |
| DE3751092T2 (de) | 1995-06-14 |
| EP0273366B1 (en) | 1995-02-22 |
| US5827696A (en) | 1998-10-27 |
| US5891676A (en) | 1999-04-06 |
| CA1339732C (en) | 1998-03-17 |
| DE3751092D1 (de) | 1995-03-30 |
| EP0273366A1 (en) | 1988-07-06 |
| AU618521B2 (en) | 1992-01-02 |
| US5186933A (en) | 1993-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS63273478A (ja) | バクロウィルス発現系を使ったロタウィルス遺伝子の合成と免疫原性 | |
| US5597721A (en) | Preparation of antigens of and of vaccines for the virus of mystery disease, antigens and vaccines obtained for the prevention of this disease | |
| US6132732A (en) | Parvovirus capsids | |
| US5916563A (en) | Parvovirus protein presenting capsids | |
| Estes et al. | Synthesis and immunogenicity of the rotavirus major capsid antigen using a baculovirus expression system | |
| US5605827A (en) | Infectious bursal disease virus VP2 fusion protein expressed by baculovirus | |
| JPH08308577A (ja) | 同じ細胞中でのブタ再生性呼吸系症候群ウイルスポリペプチド類の発現 | |
| JPS63501125A (ja) | ヒトレトロウイルス遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルス | |
| CN111413499B (zh) | 一种检测禽腺病毒i群的间接免疫荧光试剂盒 | |
| CN110004178A (zh) | 一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备的制备方法 | |
| JPH06504190A (ja) | アセンブルしたウイルス粒子およびロタウイルス疾患ワクチンにおけるその使用 | |
| Granzow et al. | Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV): ultrastructure and biochemical studies of typical and core-like particles present in liver homogenates | |
| Dong et al. | Nanoparticles of conformation-stabilized canine distemper virus hemagglutinin are highly immunogenic and induce robust immunity | |
| US5916570A (en) | Multivalent bovine coronavirus vaccine and method of treating bovine coronavirus infection | |
| EP0117063A1 (en) | Methods and materials for development of parvovirus vaccine | |
| US6001371A (en) | Parvovirus capsids | |
| JPS6356286A (ja) | ロタウイルスｓａ−１１の主な外部キヤプシドたん白に用いられる組成物及び方法 | |
| US5077213A (en) | Recombinant vaccinia virus | |
| CN113425838A (zh) | 重组prrsv病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法 | |
| WO1998014585A1 (en) | Nucleocapsid gene of seoul virus r22, recombinant plasmid, transformed e. coli and diagnostic agent and vaccine for haemorrhagic fever with renal syndrome | |
| WO2020068540A1 (en) | Compositions and methods for making and using virus-like particles (vlps) | |
| US5106965A (en) | Detection of human adenovirus | |
| US5840541A (en) | Synthesis and immunogenicity of rotavirus genes using a baculovirus expression system | |
| AU667796B2 (en) | Production of antigens by self-assembly of polypeptide components | |
| US5686270A (en) | Production of antigens by self-assembly of polypeptide components |