KR20030026654A - 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체의 생산용 항원및 그의 제조방법과 이용 - Google Patents

인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체의 생산용 항원및 그의 제조방법과 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유아 및 소아 설사병의 원인 바이러스인 인간 로타바이러스 (Rotavirus)의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적인 항원을 대량으로 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 항원에 관한 것이며, 또한 이와 같이 제조한 항원을 이용하여 조류에 면역화함으로써 상기 바이러스에 대한 항체를 난황에 포함하는 조류의 알을 제조하는 방법 및 결과적으로 생성된 유아 및 소아 설사병 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알에 관한 것이다.

Description

인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체의 생산용 항원 및 그의 제조방법과 이용{An antigen for production of an antibody against human rotavirus, and a preparing method and a use thereof}
본 발명은 유아 및 소아 설사병의 원인 바이러스인 인간 로타바이러스(Rotavirus)의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적인 항원을 대량으로 제조하는 방법 및 이 방법에 의해 제조된 항원에 관한 것이며, 또한 이와 같이 제조한 항원을 이용하여 조류에 면역화함(immunization)으로써 상기 바이러스에 대한 항체를 난황에 포함하는 조류의 알을 제조하는 방법 및 결과적으로 생성된 어린이 설사병 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알에 관한 것이다.
인간 로타바이러스는 현재 전세계적으로 연간 약 60만명의 사망자를 발생케하는 유아 및 소아 설사병의 원인 바이러스로 알려져 있다. 로타바이러스는 이중가닥(double-stranded) RNA 바이러스로서, 형태는 외부 캡시드 (outer capsid)와 내부 캡시드 (inner capsid) 및 코어 (core)로 구성되어 있으며 코어 부분은 11개의 이중가닥 RNA을 감싸고 있다. 이 11개의 RNA는 6개의 구조적인 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7)과 5개의 비구조적인 단백질(NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5)을 발현하는 유전 정보를 가지고 있다.
이 바이러스에 의한 설사병은 구토와 설사를 약 3 내지 8 일간 동반하나, 현재 특별한 치료약이나 백신이 개발 되어 있지 않은 실정이다. 현재로는 탈수를 막기 위한 구강으로의 수분공급(oral rehydration therapy) 이외는 특별한 치료법이 없으며, 이 질병을 갖는 환자 40명중 1명은 병원 입원을 필요로 하고 있다. 지난 1998년 FDA(Food and Drug Administration)에서는 이 바이러스 질병에 대한 생백신(rotashield)의 판매를 승인한 바 있으나, ACIP(Advisory Committee on Immunization Practices)에서는 이 백신이 장중첩(intussusception)을 일으키는 부작용을 동반한다는 이유로 더 이상 사용하지 못하도록 권하고 있는 실정이다.
상기와 같은 부작용을 피하기 위해, 인간 로타바이러스에 대한 항체를 함유하는 계란을 제조하여 유아 및 소아 설사병의 예방 및 치료에 이용하는 방법들이 시도되고 있다. 이 방법들에서는 인간 로타바이러스 자체를 항원으로 이용하는 방법이 사용되었다.
그러나, 바이러스 자체를 항원으로 사용하여 제조된 항체는 전체 바이러스에 대한 모든 항체를 포함하여, 생성된 전체 항체의 양은 일정한데 바이러스에 반응할 때 불필요한 항체들을 다수 함유한다. 따라서, 인간 로타바이러스를 항원으로 사용하여 면역화된 닭으로부터 얻은 계란은 사실상 이 바이러스에 대한 면역반응의 효능이 미흡하다. 또한 바이러스를 세포주 (cell line)에서 지속적으로 배양해야 하는데 요구되는 시간 및 비용과 아울러 유해한 바이러스의 직접 배양에서의 위험성 등의 문제점 등도 있다.
본 발명은 유아 및 소아 설사병 원인 바이러스인 인간 로타바이러스 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원을 대량으로 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 특이적 항원을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 항원의 제조방법에 이용되는 특이적인 프라이머들을 제공한다.
또한 본 발명은 제조된 항원을 이용하여 조류에 면역화함으로써 인간 로타바이러스에 대한 항체를 난황에 포함하는 조류의 알을 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 인간 로타바이러스에 대한 항체를 난황에 포함하는 유아 및 소아 설사병 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 난황을 포함하는 유아 및 소아 설사병 치료 및 예방 작용을 갖는 기능성 식품을 제공한다.
도 1은 증폭된 PCR 산물을 1% 아가로오스 겔상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 조류로부터 유아 및 소아 설사병의 원인 바이러스인 인간 로타바이러스에 대한 항체를 생성하기 위하여, 유전자 재조합을 통하여 특정 유전자 만을 선택적으로 갖는 항원을 생산하는 방법으로, 본 발명의 항원 제조방법은
(a) 인간 로타바이러스의 게놈성 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 VP4 또는 VP7 항원 단백질을 코드화하는 유전자를 선택적으로 분리하는 단계;
(b) 분리된 유전자를 적절한 벡터에 삽입하여 이 벡터로 적절한 균주에서 형질전환하여 이 벡터를 증폭하여 벡터 DNA를 추출하는 단계;
(c) 추출된 벡터 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 상기 항원 단백질을 코드하는 유전자를 증폭하는 단계;
(d) 증폭된 유전자를 적절한 벡터에 클로닝하여 이 벡터로 적절한 숙주를 형질전환하는 단계; 및
(e) 숙주를 배양하여 항원 단백질을 과발현시켜 추출하는 단계.
본 발명의 항원 제조방법에서는 인간 로타바이러스의 게놈성 RNA중 VP4 또는 VP7 단백질을 코드화하는 유전자를 표적화하여 선택적으로 증폭하는 것을 특징으로 한다. 이 단백질을 항원으로 표적화한 근거는 다음과 같다.
VP4는 VP7에 의해 만들어진 성숙된 비리온의 외부층에 스파이크(spike)를 형성하여 이 두 가지 단백질이 바이러스의 외부 표피를 생성하는데 관여하고 있어 바이러스의 병원성 억제를 중요한 항원의 대상으로서, 중화 항체(neutralizing antibody)의 생산에 이용된다 (Hoshino, Y., M. M. Sereno, R. M. Chanock, and A. Z. Kapikian. (1985)Proc. Natl. Acad. SciUSA 82:8701-8704). 또한 VP4 와 VP7은 바이러스가 다른 세포에 침투하는데 결정적인 역할을 한다 (Estes, M. K., D. Y. Graham, E. M. Smith, and C. P. Gerba. (1979)J. Gen. Virol. 43:403-409). 또한 이 두가지 단백질은 생체외에서 바이러스에 대한 중화 항체를 생성하는 것으로 알려졌으며 (Offit, P. A., and G. Blavat. (1986)J. Virol. 57:376-378), 동물에서는 로타바이러스에서 유도되는 설사병을 이 단백질로 만들어진 항체를 사용하여 예방할 수 있다고 보고되어 있다 (Matsui, S. M., P. A. Offit, P. T. Vo, E. R. Mackow, D. A. Benfield, R. D. Shaw, L. Padilla-Noriega, and H. B. Greenberg. (1989)J. Clin. Microbiol. 27:780-782). 따라서 현재 VP7 과 VP4는 인간 로타바이러스에 대한 백신(항체)을 개발하는데 있어서 가장 중요한 표적이 될 수 있을 것이다.
본 발명의 항원 제조방법의 (a) 단계에서 사용된 로타바이러스의 게놈성 RNA는 당업계에서 널리 알려진 방법에 의해 바이러스에서 분리될 수 있으며 그 일례를 하기의 실시예에서 예시하고 있다. (a) 단계에서 사용된 RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 방법은 RNA를 유전정보로 가지고 있을 경우에 사용하는 것으로, 우선 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 만든 후 이 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 원하는 유전자만을 증폭하는 방법이다.
또한, (a) 단계에서 사용되는 특이적 프라이머들은 표적화하는 항원 단백질 즉, VP4 또는 VP7을 코드화하는 유전자 서열(Gene Bank 참조)을 토대로 고안하여 합성하여 사용한다. 본 발명의 실시예에서는 그 일례로 VP7을 코드화하는 유전자 서열의 PCR에 특이적인 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO.2의 프라이머들을 예시하고 있다.
단계 (b)에서, 적절한 벡터로는 플라즈미드이고, 가장 바람직하게는 pEZ-T 벡터이다. pEZ-T 벡터에는 양쪽으로 티민이 붙어 있는데 PCR을 수행하고 나면 증폭된 유전자의 양쪽 끝에 아데닌이 붙는다. 이런 원리를 이용하여 PCR을 수행한 유전자는 리가제를 이용하여 pEZ-T 벡터에 결찰하여야 안정적으로 유지될 뿐만 아니라 대장균에 형질전환시킬 수 있다. 또한, pEZ-T 벡터에 PCR 산물인 유전자가 삽입된 바로 양쪽에 EcoRI 제한 부위가 있어서, 결찰된 벡터 DNA는 EcoRI로 처리하여 인간 로터바이러스 유전자를 지니고 있는 pEZ-T 벡터를 확인할 수 있다.
증폭된 벡터 DNA의 추출은 통상적인 기술에 의하고, 그 일례를 하기 실시예에 예시하고 있다.
단계 (c)에서, PCR에 사용되는 특이적 프라이머들은 증폭된 벡터 DNA가 클로닝될 벡터(단계 (d))의 제한 부위를 고려하여 합성한다. 이때, 제한 효소 부위는 PCR산물에서 존재하는 제한 효소 부위가 아닌것을 선택해야 한다. 왜냐하면, 이와 같은 경우 PCR된 유전자가 절단될 수 있기 때문이다. 본 발명의 실시예에서는 VP7을 코드화하는 유전자 서열를 포함하는 중폭된 벡터 DNA와 클로닝될 벡터의 제한 부위를 고려하여 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO 4를 고안하여 사용하였다.
단계 (d)에서, 적절한 벡터로 가장 바람직한 것은 pET-28 벡터이다. pEZ-T 벡터는 벡터에 His가 붙어 있지 않아 원하는 단백질을 분리하기가 쉽지 않다. pET-28b 벡터에 원하는 유전자를 클로닝하여 발현되어 나오는 단백질에는 C-말단과 N-말단에 6개씩의 His가 붙어 있어 Ni+-NAT 친화성 크로마토그래피를 이용하여 클로닝하여 넣은 부분의 단백질 만을 쉽게 분리할 수 있는 이점이 있다. 이 단계에서 적절한 숙주로는 대장균이며, 가장 바람직한 숙주로는 BL212(DE3)pLysS 균주를 들 수있다. 클로닝 및 형질 전환은 당업계에 알려진 조건에 의해 행해질 수 있으며, 그 일례를 하기 실시예에서 예시하고 있다.
단계(e)에서, 숙주를 배양하여 항원 단백질을 과발현시켜 추출하는 것은 사용된 숙주의 특성에 따라 당업자가 용이하게 행할 수 있을 것이며, 그 일례를 하기 실시예에 예시하고 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기의 방법으로 제조한 항원을 조류에 면역시켜서 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체를 함유하는 조류의 알을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명에 의해 제조된 항원들을 조류에 면역주사하여 그 조류가 인간 로타바이러스의 활성을 억제하는 항체를 생성케하여, 결과적으로 그 조류가 생산한 알에도 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체가 포함되는 것이다. 본 발명에 이용될 수 있는 조류로는 닭, 오리, 기러기, 칠면조, 메추리 등을 들 수 있다.
한편, 본 발명의 알은 유아 및 소아 설사병의 예방 및 치료 목적으로 하는 기능성 식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 알을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들면 건강식품, 가공식품, 분말상 식품 등이 있다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예
인간 로타바이러스의 배양
원숭이 신장 세포주 (MA 104: ATCC CRL-2378)에 인간 로타바이스(ATCC VR-2018)를 접종한 후, 이 세포주를 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청이 포함된 이글의최소 필수배지(Gibco)에서 5% CO2를 공급하며 37 ℃에서 2 일간 배양하였다.
로타바이러스의 게놈 RNA의 분리
MA 104 세포주에서 배양된 인간 로타바이러스를 0.22㎛ 필터로 걸러서 바이러스만을 세포주로부터 단리하였다.
바이러스 RNA 미니 키트(Qiagen, Cat.52904)를 사용하여 단리된 바이러스로부터 RNA만을 분리하였다. 상술하면, 마이크로 원심분리 튜브에 560μl의 AVL 완충액(운반(carrier) RNA를 포함한 완충액)을 넣고 단리된 인간 로타바이러스 용액 140㎕을 넣어 펄스 볼텍싱(pulse-vortexing)을 15초 동안 실시한 후, 상온에서 15분안 배양하여 바이러스를 깨뜨렸다. 560㎕의 100% 에탄올을 상기 샘플에 넣고 15초간 펄스 볼텍싱했다. 결과적으로 생성되는 샘플 용액 630㎕을 칼럼(Qiagen spin column)에 넣고 6,000g에서 1분간 원심분리하여 RNA가 칼럼에 붙게 하고 필터된 용액은 버렸다. 그리고 나서, 완충액 AW1 500㎕을 이 칼럼에 넣고 6,000g에서 1분간 원심분리하고 다시 완충액 AW2 500㎕를 넣고 20,000g에서 3분간 원심분리하여 칼럼을 세척하였다. 그리고 나서, 완충액 AVE 60㎕를 칼럼에 넣고 1분간 상온에서 정치시킨 후 6,000g에서 1분간 원심분리하여 RNA 만을 용출하여 분리하였다.
RT-PCR을 통한 인간 로타바이러스의 VP7를 코드화하는 유전자의 분리
바이러스의 게놈 RNA를 주형으로 하여 VP7 유전자 전체 1,062bp를 RT-PCR 방법으로 선택적으로 분리를 하였다.
RT-PCR의 수행은 1단계 RT PCR 키트 (Qiagen 제품. Cat. 210210)을 사용하여수행하였다. 이때 RT-PCR을 수행하기 위하여 준비된 마스터 혼합물(Master mix)의 조성은 다음과 같다.
마스터 혼합물 부피 최종농도
RNase가 없는 물: 14 ㎕
5X QIAGEN RT-PCR 완충용액: 10 ㎕ 1X
dNTP 혼합물: 2 ㎕ 각각의 dNTP 마다 400μM
전위 프라이머: 1 ㎕ 0.6 μM
역위 프라이머: 1 ㎕ 0.6 μM
QIAGEN 효소 혼합물: 2 ㎕
주형 RNA (인간 로타바이러스 RNA): 20 ㎕ 2 ㎍
위에서 VP7 유전자 만을 선택적으로 분리하기 위하여 사용한 프라이머를 다음 표 1에 나타내었다.
프라이머 서열(3'-5') 크기 위치
센스가닥(전위) GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC (SEQ ID NO.1) 22 1-22
안티센스가닥(역위) GGTCACATCGAACAATTCT(SEQ ID NO.2) 19 1044-1062
PCR의 수행은 50℃에서 30분 동안 RNA에서 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 만들었으며, 95℃에서 15 분간 역전사 효소를 불활성화 하는 동시에TaqDNA 폴리머라제(열에 안정화된 DNA 증폭효소)를 활성화시켰다. 이 후 94℃에서 1분간 변성, 42℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분 동안 연장을 35회를 반복하여 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 증폭을 완료하여 총 1,062 bp의 유전자를 분리하였다.
위의 방법으로 증폭된 PCR 산물 (1,062 bp의 유전자)을 1% 아가로오스 겔을 통하여 전기영동하여 인간 로타바이러스의 VP7을 코드화하는 유전자임을 확인하였고, 그 결과의 사진을 도 1에 나타내었다.
벡터에 결찰(삽입)
증폭된 VP7를 코드화하는 유전자를 pEZ-T 벡터 (RNA.com 제품)에 넣어 결찰하였다. 이때 사용된 T4 리가제와 PCR 산물의 양은 다음과 같다.
PCR 산물 : 3 ㎕ (50ng)
10X 결찰 완충용액 : 1 ㎕
pET-T 벡터 : 1 ㎕
DEPC 물 : 4.5 ㎕
T4 DNA 리가제 : 0.5 ㎕
상기 혼합물을 4℃에서 12 시간 반응시켰다.
형질전환(Transformation)
상기에서 인간 로타바이러스의 VP7를 코드화하는 유전자가 pEZ-T 벡터에 결찰된 벡터(플라즈미드) DNA를 pEZ-T 벡터의 유전자의 증폭과 발현이 최적화되어 있는 JM 109 세포 (ATCC 53323)에 Cohen et al.(1972)의 염화칼슘을 사용하는 방법으로 형질전환시켰다.
상술하면, JM 109 세포를 LB 배지에 16시간, 37℃에서 배양한 후, 한 개의콜로니 만을 취하여 LB 브로스에서 3시간, 37 ℃에서 배양하여 세포수를 108세포s/ml 미만으로 만들었다. 배양된 세포를 빙조에 10분간 둔 후에 4℃, 4,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포만을 회수하고, 세포를 10ml의 0.1M CaCl2에 녹인 다음, 다시 4℃, 4,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 회수된 JM109 세포를 2ml의 0.1M CaCl2에 녹인 후 200㎕을 취하였다. 여기에 결찰된 DNA 10㎕를 넣고 빙조에 30분간 둔 후, 42℃에서 90초간 열처리하고 다시 빙조에 2분간 두었다. 그 리고 나서 결과적으로 생성되는 샘플에 800㎕의 LB 액체 배지를 넣은 후, 45분간 37 ℃에서 배양시켰다. 배양된 세포를 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드), IPTG(이소프로필티오-β-D-갈락토시드)와 앰피실린이 포함된 배지의 LB 플레이트에서 16시간 동안 37℃에서 배양하여 흰색 콜로니 만을 취하였다.
벡터 DNA 추출
벡터 DNA를 알카리 용균법을 이용한 플라즈미드 추출 키트(Bioneer 제품)를 사용하여 분리하였다.
상기 흰색 콜로니를 5ml의 LB 액체배지(앰피실린 20㎍/ml)에서 16시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양된 세포를 12,000rpm에서 원심분리하여 펠렛을 취한 후 250㎕의 재현탁 완충액(resuspend buffer)에 녹였다. 다시 250㎕의 용균 완충액(lysis buffer)을 넣고 상온에서 5분간 방치한 후, 여기에 350㎕의 중화 완충액을 넣은 다음, 4℃에서 5분간 배양하고, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 상등액만을 결합 칼럼에 넣은 후 12,000rpm에서 1 분간 원심분리하고 여과액은 버렸다. 그리고 나서 500㎕의 변성 완충액을 넣고 5 분간 방치한 다음, 12,000rpm에서 1분간 원심분리하고 여과액을 버렸다. 그리고 나서 700㎕의 80% 에탄올을 칼럼에 넣고 12,000rpm에서 1분간 원심분리하고 여과액은 버렸다. 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 에탄올을 완전히 제거한 후 100㎕의 용출 완충액을 칼럼에 넣고 1 분간 방치한 다음, 13,000rpm에서 원심분리하여 벡터 DNA를 얻었다.
얻은 벡터 DNA를 EcoRI으로 처리하여, 이 벡터 DNA가 인간 로타바이러스의 VP7를 코드화하는 유전자를 가지고 있는 것을 확인하였다.
클로닝을 위한 PCR
pET-28b 벡터 (Novagen Cat No. 60865-3)에 VP7을 코드화하는 유전자를 클로닝하기 위해 적절한 제한부위를 포함할 수 있도록 벡터 DNA를 주형으로 새로운 프라이머를 고안하여 새로운 PCR을 수행하였다.
pET-28b 벡터의 클로닝 위치 중에서 중복되지 않는 NcoI 및 Xho I부위를 제한효소 절단 부위로 선택하였다. 이들 제한효소 부위에 기초하여 표 2에서와 같은 프라이머를 사용하여 센스가닥 부분에는 Nco I(CCATGG)을 인식할 수 있는 부분을 붙이고, 안티센스가닥 부분에는 Xho I(CTCGAG)을 인식할 수 있는 있는 부분을 붙였다. 센스와 안티센스 부분의 3bp (CGC)는 제한효소가 인식하기 쉽게 붙였으며 센스 가닥 중 Nco I(CCATGG)에서 처음 두 개의 염기가 GG이므로 CGCCCAT만 붙였다.
프라이머 서열(5'-3') 크기
센스가닥 CGCCCATGGCTTTAAAAGAGAGAA(SEQ ID NO.3) 24
안티센스가닥 CGCCTCGAGGTCACATCGAACAAT(SEQ ID NO.4) 24
PCR의 수행은 94 ℃에서 1 분간 변성, 45 ℃에서 1 분간 어닐링, 72 ℃에서 2 분동안 연장을 35회 반복하여 수행하였으며, 마지막으로 72 ℃에서 10분동안 증폭을 완료하여 유전자를 분리한다.
벡터에 결찰, 형질전환, 추출등
증폭하여 제한효소를 인식할 수 있는 염기서열을 가지고 있는 VP7 유전자와 pET 28b (Novagen 69865-3)벡터를 같은 NcoI 과 XhoI으로 소화시킨 후, T4 리가제를 이용하여 결찰하였다. 이때 사용된 T4 리가제와 PCR 산물의 양은 다음과 같다.
PCR 산물 : 3 ㎕ ( 50ng)
10X 결찰 완충용액 : 1 ㎕
pE28b 벡터 : 1 ㎕
DEPC 물 : 4.5 ㎕
T4 DNA 리가제 : 0.5 ㎕
위의 반응 혼합물을 4 ℃에서 12시간 반응시켰다.
pET-28b 벡터에 결찰된 VP7를 코드화하는 유전자의 형질전환에는 pET-28b벡터의 증폭과 발현이 최적화 하도록 만들어진 BL212(DE3)pLysS균주(Novagen 70236)를 사용하였다. 그 외에는 상기에 언급된 PCR 산물의 pEZ-T벡터로의 결찰, 형질전환, 추출 등의 과정들과 동일한 방법으로 수행하였다.
단백질 발현
형질전환된 BL212(DE3) pLys 균주를 LB-한천 배지에서 앰피실린에 내성을 가진 균주만을 선별하여 LB 액체배지(5ml)에 37 ℃에서 12시간 배양한 후, 다시 앰피실린이 들어있는 1ℓ의 LB 액체배지에 옮겨 다시 37 ℃에서 배양하여 O.D.600이 약 0.7 정도 도달하였을 때 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 후 다시 5시간 배양하였다. 배양된 균주는 4℃, 5,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 침전물에 30ml의 음파처리 완충액(50mM Na-인산염 pH 7.8, 300 mM NaCl)에 현탁시켜 초음파 분쇄기로 세포를 깨뜨렸다. 위의 현탁액을 4 ℃, 12,000rpm에서 15 분간 원심분리하여 상등액 만을 취하였다. 상등액을 Ni+-NTA 친화성 칼럼에 넣었다. 그리고 나서 50ml의 음파처리 완충액과 세척 완충액(50 mM Na-인산염 pH 6.0, 300mM NaCl, 10 % 글리세롤)으로 씻어준 후 His-친화성 태그에 붙어있는 단백질을 50~300 mM의 이미다졸 용출 완충액을 사용하여 용출시켰다.
조류에서 항체 생성
추출된 재조합 단백질(100㎍)을 포함한 이미다졸 용출 완충액과 프로인드 완전 보조액을 1: 1 로 혼합한 후, 마리당 1ml 씩 산란계의 가슴에 1차 주사하였으며 2차와 3차는 2주 간격으로 동일한 단백질과 프로인드 불완전 보조액을 1:1 로 혼합하여 1 ml씩 가슴에 주사하였다.
항체 추출 방법
면역된 난황만을 같은 양의 물과 교반한 후, 난황의 4배 분량의 λ-카라기난 (Carrageenan, Sigma.)를 섞은 다음 상온에서 30분 방치한 후, 4℃, 10,000g에서 10 분간 원심분리하여 상등액만을 와트만 #2 여과지로 여과하여 수용성 단백질 만을 추출하였다.
본 발명의 항원제조법에 따르면 유아 및 소아 설사병의 원인균으로 알려진 인간 로타바이러스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원을 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 항원의 제조방법에 이용되는 특이적인 프라이머들을 제공한다. 본 발명의 항원 제조방법으로 제조된 항원은 전체 균주의 항원에 비하여 선택적으로 바이러스에 대한 중하항체를 형성하게 할 수 있는 표피 단백질인 VP4 또는 VP7 만을 항원으로 사용하여 인간 로타바이러스에 대항하여 작용할 수 있는 특이적 항체를 생산케 할 수 있다. 또한, 인간 로타바이러스에서 원하는 단백질 만을 추출하여 항원으로 사용할 경우의 정제에 상당한 비용과 시간이 요구되는 종래기술의 단점을 극복한 것이다.
본 발명의 항원 제조방법에 의해 제조된 항원을 조류의 면역화에 사용함으로써 유아 및 소아 설사병의 원인균으로 알려진 인간 로타바이러스에 대항하는 항체를 조류의 난황을 통해 용이하게 얻을 수 있다. 즉, 본 발명은 인간 로타바이러스에 대한 항체를 난황에 포함하는 유아 및 소아 설사병 예방 및 치료효과를 갖는 조류의 알을 제공한다. 아울러 본 발명은 상기 난황을 포함하는 유아 및 소아 설사병 치료 및 예방의 작용을 갖는 기능성 식품을 제공한다.

Claims (9)

  1. 유아 및 소아 설사병 원인균인 인간 로타바이러스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원을 대량으로 제조하는 방법으로, 상기 방법은
    (a) 인간 로타바이러스의 게놈성 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 VP7 항원 단백질을 코드화하는 유전자를 선택적으로 분리하는 단계;
    (b) 분리된 유전자를 적절한 벡터에 삽입하여 이 벡터로 적절한 균주에서 형질전환하여 이 벡터를 증폭하여 벡터 DNA를 추출하는 단계;
    (c) 추출된 벡터 DNA를 주형으로하여 PCR을 수행하여 상기 항원 단백질을 코드하는 유전자를 증폭하는 단계;
    (d) 증폭된 유전자를 적절한 벡터에 클로닝하여 이 벡터로 적절한 숙주를 형질전환하는 단계; 및
    (e) 숙주를 배양하여 항원 단백질을 과발현시켜 추출하는 단계로 이루어지는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 RT-PCR에서 사용되는 프라이머는 SEQ ID NO. 1 및 2인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 단계(c)의 PCR에서 사용되는 프라이머는 SEQ ID NO. 3 및4인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (b)에서 벡터는 pEZ-T 벡터이고, 대장균 균주는E. coliJM 109균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (d)에서 벡터는 pEZ-28b 벡터이고, 숙주는 BL212(DE3)pLys 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 인간 로타바이러스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원.
  7. 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체를 함유하는 조류의 알을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 제 6항에 따른 항원을 조류에 면역주사함에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항의 방법으로 제조된 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체를 함유하는 조류의 알.
  9. 제 8항에 따른 조류의 알의 난황을 포함하는 유아 및소아 설사병의 예방 및 치료작용을 갖는 기능성 식품.
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