KR20040079136A - 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체의 생산용 항원및 그의 제조방법과 이용 - Google Patents

인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체의 생산용 항원및 그의 제조방법과 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유아 및 소아 설사병의 원인 바이러스인 인간 로타바이러스 (Rotavirus)의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적인 항원을 대량으로 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 항원에 관한 것이며, 또한 이와 같이 제조한 항원을 이용하여 조류에 면역화함으로써 상기 바이러스에 대한 특이적인 항체를 난황에 포함하는 조류의 알을 제조하는 방법과 결과적으로 생성된 유아 및 소아 설사병 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알에 관한 것이다.

Description

인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체의 생산용 항원 및 그의 제조방법과 이용{An antigen and antigen preparation for the production of antibody against human rotavirus, and its utilization}
본 발명은 유아 및 소아 설사병의 원인 바이러스인 인간 로타바이러스 (Rotavirus)의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적인 항원을 대량으로 제조하는 방법 및 이 방법에 의해 제조된 항원에 관한 것이며, 또한 이와 같이 제조한 항원을 이용하여 조류에 면역화함(immunization)으로써 상기 바이러스에 대한 항체를 난황에 포함하는 조류의 알을 제조하는 방법 및 결과적으로 생성된 어린이 설사병 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알에 관한 것이다.
인간 로타바이러스는 현재 전세계적으로 연간 약 60만명의 사망자를 발생케하는 유아 및 소아 설사병의 원인 바이러스로 알려져 있다. 이 바이러스에 의한 설사병은 구토와 설사를 약 3 내지 8 일간 동반하나, 현재 특별한 치료약이나 백신이 개발되어 있지 않은 실정이다. 현재로는 탈수를 막기 위한 구강으로의 수분공급 (oral rehydration therapy) 이외는 특별한 치료법이 없으며, 이 질병을 갖는 환자 40명중 1명은 병원 입원을 필요로 하고 있다. 1998년 FDA(Food and Drug Administration)에서는 이 바이러스 질병에 대한 생백신 (rotashield)의 판매를 승인한 바 있으나, ACIP(Advisory Committee on Immunization Practices)에서는 이 백신이 장중첩(intussusception)을 일으키는 부작용을 동반한다는 이유로 더 이상 사용하지 못하도록 권하고 있는 실정이다.
상기와 같은 부작용을 피하기 위해, 인간 로타바이러스에 대한 항체를 함유하는 계란을 제조하여 유아 및 소아 설사병의 예방 및 치료에 이용하는 방법들이 시도되고 있다. 이 방법들에서는 인간 로타바이러스 자체를 항원으로 이용하는 방법이 사용되었다.
그러나, 바이러스 자체를 항원으로 사용하여 제조된 항체는 전체 바이러스에 대한 모든 항체를 포함하여, 생성된 전체 항체의 양은 일정한데 바이러스에 반응할 때 불필요한 항체들을 다수 함유한다. 따라서, 인간 로타바이러스를 항원으로 사용하여 면역화된 닭으로부터 얻은 계란은 사실상 이 바이러스에 대한 면역반응의 효능이 미흡하다. 또한 바이러스를 세포주 (cell line)에서 지속적으로 배양해야 하는데 요구되는 시간 및 비용과 아울러 유해한 바이러스의 직접 배양에서의 위험성 등의 문제점 등도 있다.
로타바이러스는 이중가닥 RNA 바이러스로서, 형태는 외부 캡시드와 내부 캡시드 및 코어 (core)로 구성되어 있으며 코어 부분은 11개의 이중가닥 RNA을 감싸고 있다. 이 11개의 RNA는 6개의 구조적인 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7)과 5개의 비구조적인 단백질(NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5)을 발현하는 유전 정보를 가지고 있다. 이들 단백질 중에서 로타바이러스가 숙주에 침투시에 VP4는 VP8 단백질과 VP5 단백질로 절단된다. 인간 로타바이러스에 대한 항체의 생산에 VP8 단백질을 항원으로 사용을 시험한 바 있으나 (Kovacs-Nolan J., Sasaki E., Yoo D. W., Mine Y., (2001) Biochemical and Biophysical Research Communications 262,1183-1188, : Cloning and Expression of Human Rotavirus Spike Protein, VP8*, in Escherichia coli), VP8 단백질 항원의 생산량이 미미하여 실험실 수준에 그쳤다.
본 발명자들은 오랜 기간동안 연구하여, 인간 로타바이러스 VP8 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 개발하여 상기에서 언급된 종래의 인간 로타바이러스에 대한 항체의 제조에 관련된 문제점을 해결하게 되었다.
본 발명은 유아 및 소아 설사병 원인 바이러스인 인간 로타바이러스 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 VP8 단백질 항원을 대량으로 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 VP8 단백질 항원을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 항원의 제조방법에 이용되는 특이적인 프라이머들을 제공한다.
또한 본 발명은 제조된 항원을 이용하여 조류에 면역화함으로써 인간 로타바이러스에 대한 항체를 난황에 포함하는 조류의 알을 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 인간 로타바이러스에 대한 항체를 난황에 포함하는 유아 및 소아 설사병 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 난황을 포함하는 유아 및 소아 설사병 치료 및 예방 작용을 갖는 기능성 식품을 제공한다.
도 1은 VP8 유전자를 증폭한 PCR 산물을 1% 아가로스 겔상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2은 VP8 유전자를 클로닝 벡터인 pEZ-T에 삽입한 것을 EcoRI의 제한 효소로 절단한 후 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 VP8 유전자가 삽입된 것을 확인한 사진이다.
도 3은 VP8 유전자를 발현 벡터인 pET29b에 클로닝된 것을 확인하기 위하여 플라스미드 유전자를 NcoI과 XhoI으로 처리하여 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 VP8 유전자가 삽입된 것을 확인한 사진이다.
도 4는 VP8 유전자 단백질을 락토스를 사용하여 과발현시켜 SDS 겔에서 전기 영동한 사진이다.
도 5는 Ni+-NTA 친화성 칼럼을 이용하여 분리·정제한 VP8 단백질 피크를 나타낸다.
도 6는 도 5에 나타낸 VP8 단백질 피크를 SDS 겔에서 전기영동한 사진이다.
도 7은 면역화된 알에서 추출한 항VP8 IgY에 대한 역가 측정결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 면역화된 알에서 추출한 항VP8 IgY의 중화 효능을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 조류로부터 유아 및 소아 설사병의 원인 바이러스인 인간 로타바이러스에 대한 항체를 생성하기 위하여, 유전자 재조합을 통하여 특정 유전자만을 선택적으로 갖는 항원을 대량으로 생산하는 방법으로, 본 발명의 항원 제조방법은
(a) 인간 로타바이러스의 게놈성 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 VP8 항원 단백질을 코드화하는 유전자를 선택적으로 분리하는 단계;
(b) 분리된 유전자를 적절한 벡터에 삽입하여 이 벡터로 적절한 균주에서 형질전환하여 이 벡터를 증폭하여 벡터 DNA를 추출하는 단계;
(c) 추출된 벡터 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 상기 항원 단백질을 코드하는 유전자를 증폭하는 단계;
(d) 증폭된 유전자를 pET-29b 발현 벡터에 클로닝하여 이 벡터로 적절한 대장균을 형질전환하는 단계; 및
(e) 대장균을 배양하여 VP8 항원 단백질을 과발현시켜서 Ni+-NTA 친화성 칼럼으로 분리·정제하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 항원 제조방법에서는 인간 로타바이러스의 게놈성 RNA중 VP8 단백질을 코드화하는 유전자를 표적화하여 선택적으로 증폭하는 것을 특징으로 한다. 로타바이러스의 숙주 침입시 VP8 단백질이 필수적이므로, 이 항원 단백질에 특이적인 항체는 로타바이러스의 활성을 효율적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 항원 제조방법의 (a)단계에서 사용된 로타바이러스의 게놈성 RNA는 당업계에서 널리 알려진 방법에 의해 바이러스에서 분리될 수 있으며 그 일례를 하기의 실시예에서 예시하고 있다. (a)단계에서 사용된 RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 방법은 RNA를 유전정보로 가지고 있을 경우에 사용하는 것으로, 우선 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 만든 후 이 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 원하는 유전자만을 증폭하는 방법이다.
또한, (a)단계에서 사용되는 특이적 프라이머들은 표적화하는 항원 단백질 즉, VP8을 코드화하는 유전자 서열(Gene Bank 참조)을 토대로 고안하여 합성하여 사용한다. 본 발명의 실시예에서는 그 일례로 VP8을 코드화하는 유전자 서열의 PCR에 특이적인 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO.2의 프라이머들을 예시하고 있다.
단계 (b)에서, 적절한 벡터로는 플라스미드이고, 가장 바람직하게는 pEZ-T 벡터에는 양쪽으로 티민이 붙어 있는데 PCR을 수행하고 나면 증폭된 유전자의 양쪽 끝에 아데닌이 붙는다. 이런 원리를 이용하여 PCR을 수행한 유전자는 리가제를 이용하여 pEZ-T 벡터에 결찰하여야 안정적으로 유지될 뿐만 아니라 대장균에 형질전환시킬 수 있다. 또한, pEZ-T 벡터에 PCR 산물인 유전자가 삽입될 경우 결찰된 벡터 DNA는 EcoRI로 처리할때 삽입된 VP8 유전자의 절단여부로 인간 로터바이러스 유전자를 지니고 있는 pEZ-T 벡터를 확인할 수 있다.
증폭된 벡터 DNA의 추출은 통상적인 기술에 의하고, 그 일례를 하기 실시예에 예시하고 있다.
단계 (c)에서, PCR에 사용되는 특이적 프라이머들은 증폭된 벡터 DNA가 클로닝될 발현 벡터(단계 (d))의 제한 부위를 고려하여 합성한다. 이때, 제한효소 부위는 PCR산물에서 존재하는 제한효소 부위가 아닌 것을 선택해야 한다. 왜냐하면, 이와 같은 경우 PCR된 유전자가 절단될 수 있기 때문이다. 본 발명의 실시예에서는 VP8 단백질을 코드화하는 유전자 서열를 포함하는 중폭된 벡터 DNA와 클로닝될 벡터의 제한 부위를 고려하여 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO 4를 고안하여 사용하였다.
단계 (d)에서, 사용되는 pET-29b 벡터는 원하는 유전자를 클로닝하여서 발현되어 나오는 단백질에는 N-말단에 6개의 His가 붙어 있어 Ni+-NAT 친화성 크로마토그래피를 이용하여 클로닝하여 넣은 부분의 단백질만을 쉽게 분리할 수 있는 이점이 있다. 이 단계에서 적절한 숙주로는 대장균이 사용되며, 가장 바람직한 대장균으로는 BL212(DE3)pLysS 균주를 들 수 있다. 클로닝 및 형질전환은 당업계에 알려진 조건에 의해 행해질 수 있으며, 그 일례를 하기 실시예에서 예시하고 있다.
단계(e)에서, 형질전환된 대장균을 배양하여 항원 단백질을 과발현시킨 후, Ni+-NAT 친화성 크로마토그래피를 사용하여 분리한다.
본 발명의 제조방법에 의하면, 유아 및 소아 설사병 원인 바이러스인 인간 로타바이러스 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 VP8 단백질 항원을 대량으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기의 방법으로 제조한 항원을 조류에 면역시켜서 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체를 함유하는 조류의 알을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명에 의해 제조된 항원들을 조류에 면역주사하여 그 조류가 인간 로타바이러스의 활성을 억제하는 항체를 생성케하여, 결과적으로 그 조류가 생산한알에도 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체가 포함되는 것이다. 본 발명에 이용될 수 있는 조류로는 닭, 오리, 기러기, 칠면조, 메추리 등을 들 수 있다.
한편, 본 발명의 알은 유아 및 소아 설사병의 예방 및 치료 목적으로 하는 기능성 식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 알을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들면 건강식품, 가공식품, 분말상 식품 등이 있다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예
인간 로타바이러스의 배양
원숭이 신장 세포주 (MA 104: ATCC CRL-2378)를 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청(Fetal Bovine serum)이 포함된 DMEM(Gibco) 배지에서 5% CO2를 공급하며 37 ℃에서 2~3일간 배양하였다. 단층으로 배양된 세포에 4% 트립신-DMEM으로 배지 교환한 후, 30분간 배양하고 Wa type 로타바이러스(ATCC VR-2018)를 접종한 후 세포 병변이 충분히 일어날 때까지 5~6일간 배양한다. 감염된 세포는 냉동, 해빙의 과정을 두 번 거친 후에 배지를 3800g, 4℃에서 30분간 원심분리하여 로타바이러스가 들어있는 상등액을 얻는다.
로타바이러스의 게놈 RNA의 분리
상기 상등액을 0.22㎛ 필터로 걸러서 MA 104 세포주에서 배양된 인간 로타바이러스를 바이러스만을 세포주로부터 단리하였다.
바이러스 RNA 미니 키트(Qiagen, Cat.52904)를 사용하여 단리된 바이러스로부터 RNA만을 분리하였다. 상술하면, 마이크로 원심분리 튜브에 560㎕의 AVL 완충액(운반(carrier) RNA를 포함한 완충액)을 넣고 단리된 인간 로타바이러스 용액 140㎕을 넣어 펄스 볼텍싱(pulse-vortexing)을 15초 동안 실시한 후, 상온에서 15분안 배양하여 바이러스를 깨뜨렸다. 560㎕의 100% 에탄올을 상기 샘플에 넣고 15초간 펄스 볼텍싱했다. 결과적으로 생성되는 샘플 용액 630㎕을 칼럼(Qiagen spin column)에 넣고 6,000g에서 1분간 원심분리하여 RNA가 칼럼에 붙게 하고 필터된 용액은 버렸다. 그리고 나서, 완충액 AW1 500㎕을 이 칼럼에 넣고 6,000g에서 1분간 원심분리하고 다시 완충액 AW2 500㎕를 넣고 20,000g에서 3분간 원심분리하여 칼럼을 세척하였다. 그리고 나서, 완충액 AVE 60㎕를 칼럼에 넣고 1분간 상온에서 정치시킨 후 6,000g에서 1분간 원심분리하여 RNA 만을 용출하여 분리하였다.
RT-PCR을 통한 인간 로타바이러스의 VP8를 코드화하는 유전자의 분리
바이러스의 게놈 RNA를 주형으로 하여 VP8 유전자 전체 750bp를 RT-PCR 방법으로 선택적으로 분리를 하였다.
RT-PCR의 수행은 1단계 RT-PCR 키트 (Qiagen 제품. Cat. 210210)을 사용하여 수행하였다. 이때 RT-PCR을 수행하기 위하여 준비된 마스터 혼합물(Master mix)의 조성은 다음과 같다.
마스터 혼합물 부피 최종농도
RNase가 없는 물: 14 ㎕
5X QIAGEN RT-PCR 완충용액: 10 ㎕ 1X
dNTP 혼합물: 2 ㎕ 각각의 dNTP 마다 400μM
전위 프라이머 1 ㎕ 0.6 μM
역위 프라이머 1 ㎕ 0.6 μM
QIAGEN 효소 혼합물: 2 ㎕
주형 RNA (인간 로타바이러스 RNA): 20 ㎕ 2 ㎍
위에서 VP8 유전자만을 선택적으로 분리하기 위하여 사용한 프라이머를 다음 표 1에 나타내었다.
표 1
프라이머 서열(5'-3') 크기 위치
센스 GGCTATAAAATGGCTTCACT (SEQID NO.1) 20 1-20
안티센스 TGCTCTCTTATACTGTATCGATCT (SEQID NO.2) 24 727-750
PCR의 수행은 50℃에서 30분 동안 RNA에서 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 만들었으며, 95℃에서 15분간 역전사 효소를 불활성화하는 동시에TaqDNA 폴리머라제(열에 안정화된 DNA 증폭효소)를 활성화시켰다. 이 후 94℃에서 30초간 변성, 43℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장을 35회를 반복하여 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 증폭을 완료하여 총 750bp의 유전자를 분리하였다.
위의 방법으로 증폭된 PCR 산물 (750 bp의 유전자)을 1% 아가로오스 겔을 통하여 전기영동하여 인간 로타바이러스의 VP8을 코드화하는 유전자임을 확인하였고, 그 결과의 사진을 도 1에 나타내었으며 이것은 서열화를 통하여 확인하였다.
벡터에 결찰(삽입)
증폭된 VP8를 코드화하는 유전자를 pEZ-T 벡터 (RNA.com 제품)에 넣어 결찰하였다. 이때 사용된 T4 리가제와 PCR 산물의 양은 다음과 같다.
PCR 산물 : 3 ㎕ (50ng)
10X 결찰 완충용액 : 1 ㎕
pET-T 벡터 : 1 ㎕
DEPC 물 : 4.5 ㎕
T4 DNA 리가제 : 0.5 ㎕
상기 혼합물을 4℃에서 12 시간 반응시켰다.
형질전환(Transformation)
상기에서 인간 로타바이러스의 VP8를 코드화하는 유전자가 pEZ-T 벡터에 결찰된 벡터(플라즈미드) DNA를 pEZ-T 벡터의 유전자의 증폭과 발현이 최적화되어 있는 JM 109 세포 (ATCC 53323)에 Cohen et al.(1972)의 염화칼슘을 사용하는 방법으로 형질전환시켰다.
상술하면, JM 109 세포를 LB 배지에 16시간, 37℃에서 배양한 후, 한 개의콜로니만을 취하여 LB 브로스에서 3시간, 37 ℃에서 배양하여 세포수를 108세포/ml 미만으로 만들었다. 배양된 세포를 빙조에 10분간 둔 후에 4℃, 4,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포만을 회수하고, 세포를 10ml의 0.1M CaCl2에 녹인 다음, 다시 4℃, 4,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 회수된 JM 109 세포를 2ml의 0.1M CaCl2에 녹인 후 200㎕을 취하였다. 여기에 결찰된 DNA 10㎕를 넣고 빙조에 30분간 둔 후, 42℃에서 90초간 열처리하고 다시 빙조에 2분간 두었다. 그리고 나서 결과적으로 생성되는 샘플에 800㎕의 LB 액체 배지를 넣은 후, 37 ℃에서 45분간 배양시켰다. 배양된 세포를 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드), IPTG(이소프로필티오-β-D-갈락토시드)와 앰피실린이 포함된 배지의 LB 플레이트에서 16시간 동안 37℃에서 배양하여 흰색 콜로니만을 취하였다.
벡터 DNA 추출
벡터 DNA를 알카리 용균법을 이용한 플라즈미드 추출 키트(Bioneer 제품)를 사용하여 분리하였다.
상기 흰색 콜로니를 5ml의 LB 액체배지(앰피실린 20㎍/ml)에서 16시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양된 세포를 12,000rpm에서 원심분리하여 펠렛을 취한 후 250㎕의 재현탁 완충액에 녹였다. 다시 250㎕의 용균 완충액을 넣고 상온에서 5분간 방치한 후, 여기에 350㎕의 중화 완충액을 넣은 다음, 4℃에서 5분간 배양하고, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 상등액만을 결합 칼럼에 넣은후 12,000rpm에서 1 분간 원심분리하고 여과액은 버렸다. 그리고 나서 500㎕의 변성 완충액을 넣고 5분간 방치한 다음, 12,000rpm에서 1분간 원심분리하고 여과액을 버렸다. 그리고 나서 700㎕의 80% 에탄올을 칼럼에 넣고 12,000rpm에서 1분간 원심분리하고 여과액은 버렸다. 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 에탄올을 완전히 제거한 후 100㎕의 용출 완충액을 칼럼에 넣고 1 분간 방치한 다음, 13,000rpm에서 원심분리하여 벡터 DNA를 얻었다.
얻은 벡터 DNA를 EcoRI으로 처리하여 1% 아가로스 겔에 전기영동하여, 이 벡터 DNA가 인간 로타바이러스의 VP8를 코드화하는 유전자를 가지고 있는 것을 확인하였으며 이 결과 사진을 도 2에 나타내었다.
발현벡터에 클로닝을 위한 PCR
pET-29b 벡터 (Novagen Cat No. 69872-3)에 VP8을 코드화하는 유전자를 클로닝하기 위해 적절한 제한부위를 포함할 수 있도록 벡터 DNA를 주형으로 새로운 프라이머를 고안하여 새로운 PCR을 수행하였다. 새로운 프라이머는 표 2에 나타내었다.
표 2
프라이머 서열(5'-3') 크기
센스가닥 CGCCCATGGCTTCACTCATTTATAGAC(SEQ ID NO.3) 27
안티센스가닥 GCGCTCGAGTGCTCTCTTATACTGTATCGA(SEQ ID NO.4) 30
pET-29b 벡터의 다중클로닝 부위 중에서 VP8 유전자 서열 내의 제한효소 부위와 중복되지 않는 NcoI 및 XhoI을 제한효소 절단 부위로 선택하였다. 이들 제한효소 부위에 기초하여 표 2에서와 같은 프라이머를 사용하여 센스가닥 부분에는 NcoI(CCATGG)을 인식할 수 있는 부분을 만들기 위하여 ATGG는 원래 가지고 있으므로 CC만을 붙였으며 앞의 3bp (CGC)는 제한효소가 인식하기 쉽게 붙였다. 안티센스가닥 부분에는 Xho I(CTCGAG)을 인식할 수 있는 있는 부분을 붙였으며 3bp (GCG)는 제한효소가 인식하기 쉽게 붙였다
PCR의 수행은 94℃에서 30초간 변성, 47℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 40초 동안 연장을 35회를 반복하여 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 증폭을 완료하여 유전자를 분리하였다.
벡터에 결찰, 형질전환, 추출등
증폭하여 제한효소를 인식할 수 있는 염기서열을 가지고 있는 VP8 유전자와 pET29b (Novagen 69872-3)벡터를 같은 NcoI과 XhoI으로 소화시킨 후, T4 리가제를 이용하여 결찰하였다. 이때 사용된 T4 리가제와 PCR 산물의 양은 다음과 같다.
PCR 산물 : 3 ㎕ ( 50ng)
10X 결찰 완충용액 : 1 ㎕
pE29b 벡터 : 1 ㎕
DEPC 물 : 4.5 ㎕
T4 DNA 리가제 : 0.5 ㎕
위의 반응 혼합물을 4 ℃에서 12시간 반응시켰다.
pET-29b 벡터에 결찰된 VP8를 코드화하는 유전자의 형질전환에는 pET-29b벡터의 증폭과 발현이 최적화하도록 만들어진 BL212(DE3)pLysS균주(Novagen 70236)를 사용하였다. 그 외에는 상기에 언급된 PCR 산물의 pEZ-T 벡터로의 결찰, 형질전환, 추출 등의 과정들과 동일한 방법으로 수행하였다. 생성된 pET29b를 NcoI과 XhoI으로 처리하여 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 VP8 유전자가 pET29b에 결찰된 것을 확인하였으며, 그 사진을 도 3에 나타내었다.
10L 발효기를 이용한 단백질 발현
형질전환된 BL212(DE3) pLys 균주를 LB-한천 배지에서 카나마이신에 내성을 가진 균주만을 선별하여 카나마이신이 포함된 LB 액체배지(5ml)에 37 ℃에서 12~15시간 배양한 후, 다시 카나마이신이 들어있는 LB 액체 배지(7ℓ)에 접종한다. 발효기를 이용하여 O.D.600이 약 0.4 정도 도달할때까지 37 ℃에서 400rpm으로 배양하고 단백질 발현을 유도하기 위하여 락토스를 최종농도가 20g/ℓ가 되도록 140g를 첨가한 후 다시 37 ℃에서 3시간 동안 배양하였다.
배양물을 10% SDS 겔에서 전기영동하여 VP8 유전자 단백질이 과발현되었음을 확인하였고, 그 사진을 도 4에 나타내었다.
AKTA Prime 단백질 분리정제기를 이용한 VP8 단백질의 분리 및 정제
배양된 균주는 4℃, 5,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 침전물에 음파처리 완충액(50mM Na-인산염 pH 8.0, 300 mM NaCl)에 현탁시켜 초음파 분쇄기로 세포를깨뜨렸다. 위의 현탁액을 4 ℃, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액 만을 취하였다. 상등액을 0.45㎛ 필터로 여과한 후에 AKTA Prime 단백질 분리 정제기 (Amershambiosciences)의 Ni+-NTA 친화성 칼럼(5ml Hitrap chelating)을 이용하여 히스티딘 태그된(tagged) VP8 단백질을 분리하였고, 약 10mg/ℓ의 VP8 단백질을 얻었다. 분리된 VP8 단백질 피크를 도 5에 나타내었다. 또한 이 분리된 단백질 피크를 10% SDS 겔에 전기영동하여 VP8 단백질임을 확인하고 그 사진을 도 6에 나타내었다.
조류에서 항체 생성을 위한 VP8 단백질의 면역화
분리한 재조합 단백질을 포함한 이미다졸 용출 완충액과 리하이드라 (rehydra) 겔 보조액을 3 : 1으로 혼합한 후, 이 혼합액 1ml(100㎍의 VP8 단백질 포함)를 산란계 (하이라인 품종)의 가슴에 1차 주사하였으며 2차와 3차는 2주 간격으로 동일한 VP8 단백질과 Montanide ISA 보조액을 3:1 로 혼합하여 1ml(100㎍의 VP8 단백질 포함)씩 산란계 가슴에 주사하였다.
면역화한 산란계의 난황에서 항체 추출 방법
산란계의 난황을 같은 양의 물과 교반한 후, 난황의 4배 분량의 0.1% λ-카라기난 (Carrageenan, Sigma.)를 섞은 다음 상온에서 30분 방치한 후, 4℃, 10,000g에서 10분간 원심분리하여 상등액만을 와트만 #2 여과지로 여과하여 수용성단백질 만을 추출하였다.
추출된 항체의 역가 측정 방법
분리 정제된 VP8 단백질을 96웰 플레이트에 100㎍/웰씩 코팅 버퍼(0.02M Tris, 0.15 NaCl, pH9.0) 100㎕와 함께 4℃에서 15시간 방치한 후 세정 버퍼 (0.02M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH7.4)로 코팅된 플레이트를 세정한 후, 위의 방법으로 추출된 로타바이러스의 VP8에 대한 항체를 포함하고 있는 수용성 단백질과 25℃에서 1시간동안 반응시킨다. 반응이 끝난 플레이트에 HRP (peroxidase)가 결합되어 있고 닭의 이뮤노글로불린에 대한 토끼의 항체(rabbit anti-chick IgG Antibody HRP)를 25℃에서 1시간 동안 결합시킨다. 다시 세정 버퍼로 3회 세정한 후, HRP의 기질인 TMBS 용액을 첨가하여 효소 반응을 진행한 후, 2N 황산으로 반응을 종료하고 450nm에서 OD를 측정하였다.
도 7에서 항원 주사 후 13일째되는 산란계의 알에서의 항VP8 IgY에 대한 역가 측정 결과를 나타내었다. 일반란 (대조구)과 면역화(접종)시킨 산란계의 알을 비교하였을 때 항VP8 IgY의 양이 면역화시킨 산란계의 알에서 많은 양 존재함이 관찰되었다.
추출된 항체의 생체외 중화 효능 시험
동결 건조된 난황 항체 0.1 g을 포스페이트 완충된 염수(PBS, pH 7.4) 20㎖에 녹이고(희석배수 1/200) 56℃에서, 30분간 항온하였다. 난황 항체를 0.5% 소 혈청 알부민이 함유된 DMEM으로 계대희석한 후, 각 난황 항체 200㎕와 로타바이러스 200 ㎕(8,000 ffu 함유)를 혼합하여 37℃, 1 시간 항온하였다. 항온 후 DMEM 1.6㎖를 혼합액에 가하여 5배 희석한 후, 700㎕를 24-웰 플레이트에서 배양된 MA104 세포에 접종하였으며 (700㎕/웰) MA104 세포는 접종전에 DMEM으로 2회 세척한 후 사용하였다. 1,000g에서 1시간 동안 원심분리한 후, DMEM-트립신(4㎍/㎖)으로 1회 세척하고 DMEM-트립신 (4㎍/㎖)을 웰당 700㎕를 가하였다. 37℃에서 15 시간 동안 배양한 후, -80 ℃에 보관하였다. 양성 대조군으로는 로타바이러스를 음성 대조군은 DMEM 배지를 사용하였다. 중화실험 결과는 도 8에 나타내었다. 도 8에서 알 수 있듯이, 항체가 포함된 수용성 단백질을 1:2300으로 희석하였을 때 세포내로 감염되는 로타바이러스를 60% 이상 저해하는 것을 보여주고 있다.
본 발명의 항원제조법에 따르면 유아 및 소아 설사병의 원인균으로 알려진 인간 로타바이러스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원을 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 항원의 제조방법에 이용되는 특이적인 프라이머들을 제공한다. 본 발명은 pET-29b 벡터 및 Ni+-NTA 친화성 칼럼 이용하여 VP8 항원 단백질을 대량으로 제조할 수 있는 방법을 제공한다. 이렇게 제조된 항원은 전체 바이러스를 항원으로 사용하여 생산된 항체에 비하여 선택적으로 바이러스의 감염에 관여하는 특정 부위에 결합함으로써 적은 양으로도 중화 항체의기능을 담당할 수 있게 된다. 또한 본 발명은 VP8을 항원으로 사용하여 인간 로타바이러스에 대한 특이적인 항체를 생산케 할 수 있다. 이러한 항체 생산 방법은 동물세포 배양을 통한 바이러스를 항원으로 사용하는 방법보다 매우 경제적인 방법이다.
본 발명의 항원 제조방법에 의해 제조된 항원을 조류의 면역화에 사용함으로써 유아 및 소아 설사병의 원인균으로 알려진 인간 로타바이러스에 대항하는 항체를 조류의 난황을 통해 용이하게 얻을 수 있다. 즉, 본 발명은 인간 로타바이러스에 대한 항체를 난황에 포함하는 유아 및 소아 설사병 예방 및 치료효과를 갖는 조류의 알을 제공한다. 아울러 본 발명은 상기 난황을 포함하는 유아 및 소아 설사병 치료 및 예방의 작용을 갖는 기능성 식품 및 의약품을 제공한다.
<110> C-TRI <120> An antigen for production of an antibody against Humanrotavirus, and a preparing method and a use thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ggctataaaa tggcttcact 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tgctctctta tactgtatcg atct 24 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cgcccatggc ttcactcatt tatagac 27 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gcgctcgagt gctctcttat actgtatcga 30

Claims (9)

  1. 유아 및 소아 설사병 원인균인 인간 로타바이러스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원을 대량으로 제조하는 방법으로, 상기 방법은
    (a) 인간 로타바이러스의 게놈성 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 VP8 항원 단백질을 코드화하는 유전자를 선택적으로 분리하는 단계;
    (b) 분리된 유전자를 적절한 벡터에 삽입하여 이 벡터로 적절한 균주에서 형질전환하여 이 벡터를 증폭하여 벡터 DNA를 추출하는 단계;
    (c) 추출된 벡터 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 상기 항원 단백질을 코드하는 유전자를 증폭하는 단계;
    (d) 증폭된 유전자를 pET-29b 발현 벡터에 클로닝하여 이 벡터로 적절한 대장균을 형질전환하는 단계; 및
    (e) 대장균을 배양하여 VP8 항원 단백질을 과발현시켜서 Ni+-NTA 친화성 칼럼으로 분리·정제하는 단계로 이루어지는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 RT-PCR에서 사용되는 프라이머는 SEQ ID NO. 1 또는 SEQ ID NO. 2의 서열을 포함하는 VP8 핵산 염기서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 단계(c)의 PCR에서 사용되는 프라이머는 SEQ ID NO. 3 및 4의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (b)에서 벡터는 pEZ-T 벡터을 포함하는 모든 PCR 벡터이고, 적절한 숙주는E. coliJM 109를 포함하는 모든 형질전환용 숙주로 사용되는 대장균 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (d)에서 대장균은 BL21(DE3)pLys 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 인간 로타바이러스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 VP8 항원 단백질.
  7. 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체를 함유하는 조류의 알을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 제 6항에 따른 항원을 조류에 면역주사함에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항의 방법으로 제조된 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체를 함유하는 조류의 알.
  9. 제 8항에 따른 조류의 알의 난황을 포함하는 유아 및 소아 설사병의 예방 및 치료작용을 갖는 기능성 식품 및 의약품
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