KR102542601B1

KR102542601B1 - 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102542601B1
Application number: KR1020210039494A
Authority: KR
Inventors: 신현진; 박재연
Original assignee: (주)셀엔백스
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2023-06-14
Also published as: KR20210120898A

Abstract

신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주; 상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 바이러스 유사입자를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물; 돼지 유행성 설사병 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이의 용도 {Novel porcine epidemic diarrhea virus isolate and use thereof}

신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주; 상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 바이러스 유사입자를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물; 및 돼지 유행성 설사병 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

돼지 유행성 설사병(porcine epidemic diarrhea: PED)은 원인체인 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV)의 감염에 의하여 연령에 관계없이 발생되는 돼지의 전염병으로 구토와 수양성 설사가 주요한 증상이다. 또한, 이 질병은 1992년 처음으로 국내에서 발생된 후 전국적으로 확산된 바 있으며, 포유자돈의 설사병 중 가장 큰 피해를 야기하는 질병으로서, 양돈 농가에 많은 경제적 피해를 주고 있다. 돼지 유행성 설사병을 일으키는 유행성 설사병 바이러스는 주로 소장 융모세포에 증식하여 융모 상피세포를 변성 또는 괴사시켜 융모의 위축과 탈락을 동반하고, 흡수장애를 초래하여 지속적인 수양성 설사를 일으킨다. 돼지의 연령에 상관없이 장염을 일으키며 심한 설사와 탈수현상을 동반하고 심지어 자돈에서의 치사율은 80~90%에 이른다.

이와 같은 돼지유행성 설사병 바이러스 감염으로 인한 피해를 막을 수 있는 가장 확실한 방법은 축산 관계자 및 축산 관련 차량의 철저한 소독과 차단이고, 두 번째는 적절한 백신 접종을 통한 예방에 있다. 이에, 우리나라에서는 돼지유행성 설사병을 법정 제3종 전염병으로 지정하여 관리하고 있으며, 현재 생백신과 불활화 백신 및 경구 백신이 상용화되어 농가에 보급하고 있다. 그러나, 해당 백신들은 주로 2000년대 초반에 만들어진 것이며, 코로나바이러스 속에 속하는 돼지유행성 설사병 바이러스는 RNA 바이러스로서, 그 변이율이 매우 높기 때문에 기존 백신의 효능은 미약할 가능성이 존재한다고 알려져 있다. 또한, 기존의 혈관에 주입시키는 주사 백신체제는 백신이 혈관 내 에서만 순환하고, 장내에는 영향을 미치지 못하기 때문에 장내 서식하여 돼지 유행성 설사병을 유발하는 돼지유행성 설사병 바이러스의 면역에는 효과가 없으며, 경구로 섭취하는 방식의 경구 백신 체제만이 돼지유행성 설사병 바이러스의 면역에는 효과가 있는 것으로 알려졌다. 따라서, 여전히 면역성이 우수하면서 안전하고 안정적인 돼지 유행성 설사병 백신에 대한 연구 및 개발이 필요한 실정이다.

그러나, PEDV의 동정은 매우 어려우며, 동정된 바이러스여도 수회의 세포 계대배양에서 그 감염성을 유지하는 것은 불가능하였다. 현재까지, 한국형 PEDV가 20계대까지 배양하였다는 것은 2차례 보고뿐이었으며, 이는 야외 PEDV와 유전적으로 상이한 것이었다 (Kweon et al., 1999; Song et al., 2003). 따라서 현재 유행하고 있는 야외주를 이용한 차세대 백신 개발이 시급한 상황이다. 하지만 실험실적으로 야외주 PED 바이러스 분리 및 배양이 어려워 야외주를 이용한 백신 개발에 난항을 겪고 있다.

이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 최근 국내에서 유행하고 있는 PEDV 야외주를 분리하는데 성공하였고, 분리된 PEDV 야외주의 유전자 분석을 수행한 결과, 기존에 동정된 PEDV와는 매우 다른 유전형을 나타냄을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 서열번호 1의 염기서열 코딩된 아미노산으로 이루어진 스파이크 단백질을 포함하는 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주를 제공한다.

다른 양상은 상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 항원, 또는 이를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

일 양상은 서열번호 1의 염기서열로 코딩된 아미노산으로 이루어진 스파이크 단백질을 포함하는 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주를 제공하는 것이다.

본 명세서에서 용어, "돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV: porcine epidemic diarrhea virus)"는 코로나바이러스과(coronaviridae)에 속하며 단일 가닥 RNA를 게놈(genome)으로 가지며 길이는 약 28Kb이고, 3개의 주요 구성 단백질인 스파이크 단백질(180-220KDa)과 막 단백질 또는 외피 단백질 (27-32KDa) 그리고 뉴클레오캡시드 단백질(55-58KDa)을 암호화 하고 있다 (Shenyang 2007). 이는 같은 종인 SARS 코로나 바이러스와 유사한 구조를 가지며 트립신이 첨가된 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(Vero cell)에서 배양된다(Kim 2003; Stadler 2003; 권 2009).

본 명세서에서 용어, "스파이크 단백질 (spike protein)"은 PEDV의 주요 구성 단백질로서, 목표 세포를 인식하고 바이러스와 세포막 (cellular membrane)를 융합시키는 생물학적으로 중요한 기능을 가지고 있다(Chang 2002).

상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주는 서열번호 1의 염기서열로 코딩된 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열과 98% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 분리주는 서열번호 1의 염기서열 서열과 바람직하게는 98%, 98,5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%의 동일성을 나타내는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 1의 염기서열과 98% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열은 서열번호 1의 염기서열로 코딩된 아미노산 서열과 동등 또는 상응하는 면역원성을 나타내는 것이 바람직하다.

상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주는 서열번호 2의 염기서열로 코딩된 아미노산 서열로 이루어진 막 단백질, 서열번호 3의 염기서열로 코딩된 아미노산 서열로 이루어진 외피 단백질, 및 서열번호 4의 염기서열로 코딩된 아미노산 서열로 이루어진 뉴클레오캡시드 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질을 더 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물을 제공하는 것이다. 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 등에 관한 내용은 전술한 바와 같다.

본 명세서에서 용어, “백신”은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.

본 명세서에서 용어, “면역원” 또는 “항원성 물질”은 상기 바이러스 유래의 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 바이러스 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다.

본 명세서에서 용어, “바이러스 유사 입자 (Virus-Like Particle: VLP)”는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 소단위체를 의미하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스 유사 입자는 바이러스와 유사한 형태를 띠고 있는 재조합 단백질을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 바이러스 유사 입자는 바이러스의 구조 단백질들간 결합을 통하여 실제 바이러스와 유사한 형태로 자가 조립(self-assembly)이 되지만, 조립 과정에서 바이러스의 유전자는 바이러스 유사 입자 내부로 포함되지 않는 것일 수 있다. 상기의 특성을 갖는 바이러스 유사 입자는 실제 바이러스와 매우 유사한 형태를 띄고 있어 체내 주입 시 높은 면역원성을 나타낼 수 있고, 바이러스의 유전자를 포함하고 있지 않으므로 체내에서 증식이 불가능한 안전한 항원으로 작용할 수 있다.

상기 바이러스 유사 입자는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 단백질, 막 단백질, 외피 단백질, 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 여기서, 스파이크 단백질은 바이러스 표면에 존재하며, 곤봉 모양의 돌기 형태로 이루어진 구조 단백질이다. 상기 단백질은 숙주세포의 당 단백질 수용체와 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이는 세포막과 바이러스 외막의 융합, 그리고, 중화 항체의 생성을 야기할 수 있다. 또한, 뉴클레오캡시드 단백질은 외피의 내부에 존재하며, 세포성 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, 상기 바이러스 유사 입자는 자연적으로 self-assembly가 되는 특성을 가진 바이러스 구조단백질로 만들어져서 병원체의 형태를 모방하게 된다. 상기 바이러스 유사 입자는 원래 병원체와 유사하거나 동일한 구조로 제조되고 고도의 반복성을 가진 형태의 항원성을 나타내는 에피토프를 제시한다. 이에 따라 B cell 면역글로불린 수용체가 crosslinking 되도록 하고 결국 B cell 활성화를 유도하게 된다. 외부에서 제공되는 항원(exogenous antigen)으로서 바이러스 유사 입자는 전문적인 항원 제시 세포들 특히 수지상세포(dendritic cell, DC) 등에 의해 효율적으로 세포내로 들어가게 되고 항원 processing을 거쳐서 MHC class II 분자에 의해 제시되고, co-stimulatory 분자와 사이토카인 생산의 증가에 의해 DC 활성화, 성숙화, CD4+ T helper cell의 자극에 의해 강력한 체액성과 세포성 면역을 유도하게 된다. 나아가 자연 상태의 바이러스와 유사하게 바이러스 유사 입자는 DC의 세포질 내에서 process되고 MHC class I 분자에 의해 세포표면에 제시된다. 그리고 cross-presentation mechanism에 의해 세포 살해성 CD8+T세포에 제시되어 강력한 세포 살해성 면역반응을 유도하게 된다.

일 구체예에서, 상기 스파이크 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있고, 상기 막 단백질은 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있고, 상기 외피 단백질은 서열번호 3의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있고, 상기 뉴클레오캡시드 단백질은 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열은 동일한 기능성을 발휘한다는 전제 하에서, 서열번호 1 , 2, 3, 및 4의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 염기서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인될 수 있다.

상기 바이러스 유사 입자는 돼지 유행성 바이러스의 구조를 모사한 것으로서, 예를 들어, 상기 멤브레인 단백질은 구형의 외피를 형성하고, 상기 스파이크 단백질은 상기 구형의 외피로부터 외향으로 돌출되어 있으며, 상기 뉴클레오캡시드 단백질은 상기 구형의 외피 내부에 위치하는 것일 수 있다. 또한 상기 바이러스 유사 입자는 숙주세포 내에서 자가 조립되어 형성되는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 구조 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 각각의 벡터를 사용하여, 이들을 숙주 세포에 형질감염시킨 경우, 상기 스파이크 단백질, 멤브레인 단백질, 엔벨로프 단백질, 및 뉴클레오캡시드 단백질은 숙주세포 내에서 모두 발현되고, 이들은 자가 조립되어 돼지 유행성 설사병 바이러스 유사 입자를 형성하여, 유효한 백신 효능을 나타냄을 확인하였다.

상기 바이러스 유사입자의 함량은 백신 조성물 총 중량에 대해서 1 내지 10 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 5% 중량 이내 일 수 있다.

상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

상기 백신은 다양한 형태로 개체에 주입될 수 있다. "주입"은 피하주사, 근육내 주사, 피하내 주사, 복막내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.

또한, 본 명세서에서 용어, "주사" 또는 "투여"는 투여대상의 나이, 성별, 체중 등에 따라 투여량이 달라질 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서도 백신의 투여량이 본 발명의 백신용 면역증강제는 비경구, 점막(경구 및 비강 등) 및 경피성 경로에 의한 백신 투여시 함께 사용할 수 있다.

상기 백신 조성물은 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 보조제 등을 포함할 수 있다. 적절한 보조제에는 펩티드, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 옥시드 및 Marcol 52 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일 및 하나 이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸세시틴, 다가 양이온, 다가 음이온 같은 표면 활성물질 등이 포함된다.

상기 백신 조성물은 1종 이상의 면역증강제를 추가로 포함할 수 있고, 바람직하게는 콜레라 톡신(CT: cholera toxin), 알루미늄하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 또는 생분해성(Biodegradable) 오일을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "면역증강제"란, 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 전통적인 백신들은 죽은 병원성 미생물의 비가공 제제로 구성되어, 병원성 미생물의 배양액과 관련된 불순물들은 면역 반응을 향상시키기 위한 면역증강제로서 작용할 수 있으나, 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제를 백신접종을 위한 항원으로서 사용하는 경우, 상기와 같은 항원에 의해 발동된 면역성은 불충분하여 면역증강제로서 일부 외래물질의 첨가가 필요해 진다. 면역증강제를 사용함으로써 면역 반응을 자극하는데 보다 적은 용량의 항원이 요구될 수 있으며, 이에 의해 백신 생산 비용이 절감될 수 있다. 이러한 면역증강제는 그 원료(미네랄, 세균, 식물)와 성분(유제현탁액)에 따라 분류된다. 상업적으로 이용되는 면역증강제는 알루미늄하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일(미네랄오일) 또는 생분해성(Biodegradable) 오일 등이 있다.

상기 백신은 생균백신 또는 사균백신일 수 있다. 생균백신 또는 생백신은 세균이나 바이러스를 병원성을 약하게 하여 동물에 투여되었을 때 질병의 임상적 증상이 없거나 감소되었음을 나타내는 바이러스를 의미하는 것으로, 본 발명의 약독화주는 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 바이러스의 계대배양을 통해 분리될 수 있다. 사균백신 또는 사독 백신은 세균이나 바이러스를 가열(56~60℃, 30~60분) 또는 포르말린이나 페놀 등의 화학약품에 의해서 면역원성을 잃지 않고 병원성을 불활성으로 한 것이다. 바이러스의 불활화는 당업계에 알려진 방법에 의할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 등에 관한 내용은 전술한 바와 같다.

본 명세서에서 용어, “예방”은 본 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 PEDV 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 명세서에서 용어, “치료”는 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 PEDV의 감염 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

상기 약학적 조성물은 예를 들면 사료 첨가제로 이용될 수 있다. 상기 사료는 본 발명에 따른 사료 첨가제를 유효성분으로 포함하는 한 당업계에 공지된 다양한 형태의 조성비로 당업자에 의해 적절하게 구성될 수 있으며, 바람직하게는 단백질 20%, 지방, 에테르 추출물 4.5%, 지방, 산 가수분해 5.4%, 조섬유질 4.7%, 회분 6%, 칼슘 0.80% 및 인산염 0.62%를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 생장 억제제를 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 바이러스의 생장 억제제는 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 항원에 대한 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연 추출물 및 화학물질 등일 수 있다. 바람직하게는 항체일 수 있다.

또 다른 양상은 상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 항원, 또는 이를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 등에 관한 내용은 전술한 바와 같다.

본 명세서에서 용어, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 특이적인 유전자의 발현 유무를 확인하여 돼지 유행성 설사병 바이러스에 의해 야기되는 질병의 발병 여부 및 발병 후 항바이러스 약제 치료과정에서의 예후를 확인하는 것을 의미할 수 있다.

상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 항원을 검출할 수 있는 제제는 바람직하게는 상기 바이러스, 상기 바이러스의 배양물 또는 이의 항원에 특이적인 항체일 수 있다.

본 명세서에서 용어, “항체”는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질로서, 면역글로불린이라고도 하며, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원 항체반응을 일으킨다. 항체가 특이적 항원에 대한 특이성을 나타내는 반면에, 면역글로불린은 항체, 및 항원 특이성이 결여된 항체 유사 물질모두를 포함한다. 후자의 폴리펩티드는 예컨대 림프계에서는 낮은 수준으로 생산되며 골수종에 의해서 증가된 수준으로 생산된다. 본 발명에서는 상기 PEDV 자체, 스파이크 단백질, 또는 이에 포함된 에피토프일 수 있다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다.

일 양상에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스는 기존에 분리된 돼지 유행성 설사병 바이러스 균주와 상이한 유전형을 나타내므로, 최근 국내에서 유행하는 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 유전형을 효과적으로 진단할 수 있는 항원, 또는 이를 효과적으로 예방할 수 있는 백신을 개발하는데 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 신규 분리한 한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주 CNU-P6에서 M 단백질 유전자의 존재 여부를 확인한 도면이다.
도 2는 본 발명의 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주 CNU-P6의 Vero 세포에의 감염성 여부를 검사한 결과이다.
도 3은 본 발명의 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주 CNU-P6의 Vero 세포에의 감염성 능력, 감염 정도 즉 바이러스 증식 여부를 검사한 결과이다.
도 4는 본 발명의 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주 CNU-P6의 Vero 세포에의 감염성 능력에 대한 확증한 결과이다.
도 5는 본 발명의 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주 CNU-P6의 Vero 세포에의 감염성 능력에 대한 확증 자료인 도 4의 결과를 200배 확대한 도면이다.
도 6은 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 유사 입자의 접종에 의한 실험동물 혈청 내 IgG 역가, 및 IgA 역가, 혈청 및 초유 내 중화 항체가를 확인한 결과이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리

본 발명자는 총 25개의 분변 및 20개의 장 분쇄물을 포함하는, PCR-양성 임상 샘플로부터 Vero 세포 상에 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV: porcine epidemic diarrhea virus)를 분리고자 하였다. 2019년 3월 20일경 수득한 충청남도에 위치한 농장으로부터 자연적으로 감염된 돼지의 분변으로부터, CNU-P6로 명명된 일 PEDV 분리주를 성공적으로 분리하였다. 분리 과정은 양성샘플을 분쇄기로 분쇄한 후, 샘플을 PBS로 다양한 희석 배수로 희석하여 높은 농도의 항생제와 반응하여 세균의 증식을 억제하고 세균의 오염을 방지하고자 노력하였다. 이 후 희석되고 항생체 처리된 샘플을 Vero 세포와 IPEC 세포에 교차 감염시키면서 세포주에 적응하도록 노력하였다. 지속적인 계대배양를 통해, 매 계대 마다 RT-PCR을 수행하여 PEDV의 증식이 유지되는지 확인하며 지속적인 노력으로 신규한 PEDV의 분리에 성공하였다.

실시예 2: 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 유전자 분석

PEDV의 구조 단백질 중에서도 스파이크 단백질 (S)은 세포 사멸에 기여하는 중요한 단백질로 알려져 있다. 이에, 상기 실시예 1에서 분리된 신규한 PEDV CNU-P6 분리주의 스파이크 단백질의 존재 여부를 확인하고, 이의 유전형을 분석하고자 하였다. 구체적으로, Ribospin?? vRD 키트(한국, (주)에코셀)를 이용하여 해당 키트의 프로토콜에 따라, 상기 바이러스 RNA를 추출하였다. 상기 추출된 바이러스 RNA로부터 BioFACT™ 2X RT Pre-Mix를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 랜덤 헥사머 프라이머 (random hexamer)를 프라이머로 이용하고, 25 ℃에서 5분, 50 ℃에서 1시간, 및 95℃에서 5분의 RT 반응을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 이후, PEDV 스파이크 프라이머를 이용하여 스파이크 단백질을 증폭시켰다. 사용된 PEDV 스파이크 프라이머의 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 기존에 동정된 PEDV 균주인 SM98을 양성 대조군으로 이용하였다.

약자	프라이머 서열(5'-3')	방향
Spike_Forward	5'-ATGAGGTCTTAAATTTAC-3'	정방향
Spike_Reverse	5'-ACCACCAAAAGCCGCAGAGACAGT-3'	역방향

도 1은 본 발명의 신규한 PEDV CNU-P6 분리주에서 M 단백질 유전자의 존재 여부를 확인한 도면이다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 분리된 신규한 PEDV CNU-P6 분리주는 양성 대조군인 PEDV 표준주인 SM98 유전자를 사용한 결과와 동일한 위치 및 크기의 PCR 밴드가 있음을 확인하였다.

또한, PEDV CNU-P6 분리주의 구조 단백질을 코딩하는 염기 서열을 분석한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 스파이크 단백질 (S), 서열번호 2의 염기서열로 코딩되는 막 단백질 (M), 서열번호 3의 염기서열로 코딩되는 외피 단백질 (E), 및 서열번호 4의 염기서열로 코딩되는 뉴클레오캡시드 단백질 (N)을 포함하며, 특히, 스파이크 단백질 (S)은 기존에 동정된 돼지 유행성 설사병 바이러스 균주와 상이함을 확인하였다.

구조 단백질	염기서열 (5'->3')	서열번호
스파이크 단백질 (S)	ATGAAGTCTTTAAATTACTTCTGGTTGTTCTTACCAGTACTTTCAACACTTAGTCTACCACAAGATGTCGCCAGGTGCACCGCTAATACTAATTTTAGGCGGTTCTTAACAAAATTTAATGTTCAGGCGCCTGCAATTGTTGTACTGGGCGGTTATCTACCTATTGGTGAAAATCAGGGTGTTAATTCAACTTGGTATTGTTACGGCCAACATCCAACTGCTAGTGGCGTTCATGGTATCTTTGTTAGCCATATTACAGGTGGTCATGGCTTTGAGATTGGCATTTCGCAAGAGCCTTTTGACCCTAGTGGTTACCAGCTTTATTTACATGCTACTAACGGTAACACTATAGCTACTGCGCGACTGCGCATTTGCCAGTTTCCTAGCATCAAAACATTGGGCCCCACTGCTAATAATGATGTTACAACAGGTCGTAATTGCCTATTTAACAAAGCAGTCCCAGCTCATATGAGTGAACATAGTGTTGTCGGCATAATACGGGATAATGATCGTGTCACTGTCTTTTCTGACAAGATCTATCATTTTTATTTTAAAAATGACTGGTCCCGTGTTGCCGAAAGTGTTACAACAGTGGAGGTTGTGCTATGCAATATGTTTACGAACCCACCTACTACACGCTTAATGTTACTAGTGCTGGTGAGGATGGCATTTCTTATCAACCCTGTACAGCTAATTGCATTCTTATGCTGCCAATGTATTTGATACTGAGCCCAATGGCCACATACCAGAAGGTTTTGGTTTTAATAATTGGTTCCTTTTGTCCAATCGTCCACTTTGGTGTAGGGTAAGGTATTTTCCAACCAACCATTGTTGGTTAATTGTCTTTTGGCCATATCTAAGATTTACGGACTAGGCCAATTTTTCTCCTTTAATCAAACGATGGATGGCGTTTGTAATGGAGCTGCTGTGCCGCGTGCCAGAGGCTCTGAGGATATTAATGACACCTCTGTCATTCTTGCTGAAGGCTCAATTGTACTTCATACTGCTTTAGGAACAAATCTTTCTTTTGTTTGCAGTAATTCTTCAGATCCTCATCTAGCTACCTTCGCCATACCTCTGGGTGCTTACCCTTATTATTGTTTTACCAAAGTGGATACTTACAACTCCACTGTTTATAAATTTTTGGCTGTTTTACCTCCTACCGTCAGGGAAATTGTCATCACCAAGTATGGTGATGTTTATGTCAATGGGTTTGGCTACTTGCATCTCGGTTTGTTGGATGCTGTCACAAAAATTTCACTGGTCATGGCACTGACGATGATGTTTCTGGTTAATGGACCATAGCACGAACTAATTTTGTTGATGACCTCATCGAAGTTCAAGGAACCGCCATTCAGCGTATTTTCTAGATTGTGATGATCCTGTTAGCCAACTCAAGTGTTGCCCAGGTTGCTTTTGACCTTGACGATGGTTTTTACCCTATTTCTTCTAGAAACCTTCTGAGTCACGAACAGCCCCTTTCTTTTGTTACTCTGCCATCATTTAATGATCATTCTTTTGTTAACATTACTGTATCTATCTTCTACGGGTGGTCATAGTGGTGCCAAATCTTATTGCATCTGACACTACTATCAACGGGTTTAGTTCTTTCTGTGAGCACACTAGACAATTTACCATTTCACTGTTTTATAACGTTACAAACAGTTATGGTTATGTGTCTAACTCACAAGATAAGTAATTGCCGGTTCACCTTGCAATCTGAAAATGATTACCTGTCTTTTAGCAAATAATGTGTTTACCCCAGCCTTAGGCTAGTGCCTGTACCATAGATCTTTTTGGTTACCCTGAGTTTGGTAGTGGTGTTAAGATTACGTCCCTTTACTTTCAATTCACAAAGCCCGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCACTTGAAGGTATCGGCGGCGAATTTCTTTTATGACTCTGTAGGTGTGTATTAAGTATACTATCTATGGCTTTAAAGGTGAGGGTATCATTACCCTTACAACTACAGCTTTTTGGCAGGTGTTTATTACACATCTGATTCTGGACAGTTGTTAGCCTTTAAGATAGTCACTAGTGGTGCTACCCTGTTACGCCATGTTCTTTTTCAGAGCACGGCTGCATATGTTGATGATGATATAGTGGGTGTTATTTCTAGTTTGTCTAGCTCCACTTTTAACACATCTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTCTACCATTATCTTGATGGCTCTATATTGTACAGAGCCAGAGTTGGTGTATAGTAACACAGTGTTTGTAAATCTGGTAGTATTGGCTACGTCCCACGACAGTCTGGCCAAGTCAAGATTGCACCCACGACCTGGGAATATTAGTATTCCCACCAACTTTAGTATGATTAAGAATATTTACAGCTTTACAACACGCCTGTTAACTTTGATTGTGTCACATATGGGTGTAATGGTAACTCTCGTTGTAAACAATTACTCACCCATACACTGCAGTATGTAAGACCATACCGTCAGCATTACAACTCAGCGCTAGGCTTGAATCTGAATTCCGTTAACTCTATGCTTACTATTTCCGAAGAGGCTCTACAGTTAGCCACCATTAGTTCGTTACGGTGGTGATGGATATAATTTTACTCGGTGCTGGGTGTTTCTGTGTATGATCCTACAAGTGGCAGGGTGGTACAAATTAGGTCTTCCTTGAAGACCTGCGGTTTAATAAAGTGGTTACTAATGGCCTTGGTACTGTTGATCGAGACTATAAGCGCTGTATACCTGGTCGCTCTGCGGCAGATCTAGCTGTGCACAGTATTACTCTGGTGTCATGGTACTACCTGATGGTTGTTGACGCTGAGAAGCTTCATATGTATAGTGCGTCTCTCATCGGTGGTATGGTGCTAGGAGGTTTTACTTCTACAGCGGCTTTGCCTTTTAGCTGTGCTGTTCAAGCTAGACTCAATTATCTTGCTCTACAGACGGATGTTCTACAGCGACCCATCAGCAATTGCTTGCTGAGTCTTTTAACTCTGCTATTGGTAATATAACTTCAGCCTTTGAGAGTGTTAAAGAGGCTATTTACTCAAACTTCTAGCGGTTTGAGCACTGTAGCCCATCGAGCTTACTAAGGTTCAAAGTGGTTGTTAGACTCGCAGGGTGCCGCTTTGACTCAACTTACCGTACGCTGCAACACAACTTCCAAGCCATTTCTAGTTCTATTGATGACATTTACTCTCGACTGGACATTCTTTCAGCCGATGTTCAGGTTGACCGTCTCATCACCGGCAGATTTACAGCACCAATGCTTAGGTGCTCAAACCCTCTACAAGTATACTGAGGTTCAGGCTAGCAGGAAGCAGCACAGCAAAAGGTTATTAGTGCGTTAAATCGCAATCTCAGCGTTATGGTTTTTGTGGTGGTGATGGCGAGCACATTAATCTCTCTGGTACAGGCAGCACCTCAGGGCCTGCTGTTTTTACATACAGTACTTGTACCGAGTGATTTTGTAGATGTTATTGCCATCGCTGGCTTTCACGTTAACGATGAAATTGCCTTGATTCTACGTGAGCCTGGCTTAGTCTTGTTTACGCATGAACTACTAAATCATACTGCGATTGAATATTTTGTTTCATCGCGACGTATGTTTGAACCTAGAAAACCTACCGTTAGTGATTTTGTTCAAATTGAGAGTTGTGTGGTCACCTATGTCAATTTGACTAGAGACCAACTACCAGATGTAATCCCAGATTACATCGATGTTAACAAAACACTTGATGAGATTTTAGCTTCTCTGCCCAATAGAACTGGTCCAAGTCTTCTATTAGATGTTTTTAATGCCACTTATCTTAATCTCACTGGTGAAATTGCAGATTTAGAGCAGCGTTCAGAGTTTCTCCGTAATACTACAGAGGATCTCAAAAGTCTTATATATAATATCAACAACACACTAGTTGACCTTGAGTGGCTCAACCGAGTTGAGACATACATCAAGTGGCCGTGGTGGGTTTGGTTGATTATTTTCATTGTTCTCATCTTTGTTGTGTCATTACTAGTGTTCTGCTGCATTTCCACGGGTTGTTGTGGATGCTGCGGCTGCTGCTGTGCTTGTTTCTCAGGTTGTTGTAGGGGTCCTAGACTTCAACCTTACGAAGTTTTTGAAAAGGTCCACGTGCAGTGA	1
막 단백질 (M)	ATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAATACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGTTAGCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTCAGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGGTCCAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTTCGGTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTC	2
외피 단백질 (E)	ATGCTACAATTAGTGAATGATAATGGTCTAGTAGTTAATGTTATACTTTGGCTTTTCGTACTCTTTTTCCTGCTTATTATAAGCATTACCTTCGTCCAATTGTTTAATCTGTGCTTCACTTGTCACCGGTTGTGTAATAGCGCAGTTTATACACCTATAGGGCGTCTGTATAGAGTTTATAAGTCTTACATGCGAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTA	3
뉴클레오캡시드 단백질 (N)	ATGGCTTCTGTCAGCTTTCAGGATCGTGGCCGCAAACGGGTGCCATTATCTCTCTATGCCCCTCTTAGGGTTACTAATGACAAGCCCCTTTCTAAGGTACTTGCAAACAACGCTGTACCCACTAACAAGGGGAATAAGGACCAGCAAATTGGGTACTGGAATGAGCAAATTCGCTGGCGCATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGGCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAATTTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATCATTCCAAAATTCTTTCAACAGCTCCCCAGTGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTGCAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAATAGGTCTAGATCTCCAAGTAACAACAGAGGCAATAACCAGTCCCGTGGCAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAATAACAGGAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGTGTAACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCACTTAAATCTTTGGGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGCATAAGCAACAGCAGAAGCCTAAGCAGGAAAAGTCTGACAACAGCGGCAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGAGGGGGCTTCAAAAACTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTTAGCACCAAATGTTGCAGCATTGCTCTTTGGTGGTAATGTGGCTGTTCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTACATACAACTATAAAATGACTGTGCCAAAGTCAGATCCAAATGTTGAGCTTCTTGTTTCACAGGTGGATGCATTTAAAACTGGGAATGCAAAACTCCAGAGAAAGAAGGAAAAGAAGAACAAGCGTGAAACCACGCTGCAGCAGCATGAAGAGGCCATCTACGATGATGTGGGTGCGCCATCTGATGTGACCCATGCCAATCTGGAATGGGACACAGCTGTTGATGATGGTGATACGGCCGTTGAAATTATCAACGAGATCTTCGATACAGGAAAT	4

실시예 3: 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 감염능 평가

상기 실시예 1에서 분리된 신규한 PEDV CNU-P6 분리주의 감염능을 확인하기 위해, 용균반 검사 (plaque assay)를 수행하였다. 구체적으로, 12 웰 플레이트 상에 Vero 세포를 1.5x10⁵로 시딩하고, 상기 실시예 1에서 분리된 PEDV CNU-P6 분리주를 상기 Vero 세포에 감염시켰다. 한편, 음성 대조군으로 Mock 감염, 및 양성 대조군으로 SM98 균주를 감염시켰다. 감염 24시간 후, 각 바이러스의 감염에 의한 세포의 변화를 관찰하였다.

도 2는 본 발명의 신규한 PEDV CNU-P6 분리주의 Vero 세포에의 감염성 여부를 검사한 결과이다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PEDV CNU-P6가 감염된 경우, Vero 세포에서의 PEDV 감염의 전형적인 세포 병변 (CPE: cytopathic effect)이 양성 대조군인 SM98 균주가 감염된 경우와 유사하게 형성됨을 확인하였다. 상기 결과로부터, PEDV CNU-P6은 PEDV 임이 입증될 수 있다.

또한, 6-웰 플레이트 상에 Vero 세포를 5x10⁵로 시딩하고, 상기 실시예 1에서 분리된 PEDV CNU-P6 분리주를 상기 Vero 세포에 각각 감염시켰다. 한편, 대조군으로 Mock 및 SM98 균주를 1시간 동안 감염시켰다. 이후, 상기 균주들의 감염액을 버리고, 최종 농도가 0.8% 되도록 조정하여 한천 확산 시험법(agar overlay)을 수행하였다. 3일 후에 4% 포르말린으로 1시간 동안 고정하였다. 이후, 포르말린을 제거한 후, 크리스탈 바이올렛 용액으로 이를 염색 하였다.

도 3은 본 발명의 신규한 PEDV CNU-P6 분리주의 Vero 세포에의 감염성 능력, 감염 정도를 나타낸 것으로서, 즉, 바이러스 증식 여부를 검사한 결과이다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PEDV CNU-P6가 감염된 경우, Vero 세포에서의 PEDV 감염의 전형적인 세포병변 (CPE)이 형성됨을 확인하고, 바이러스 감염 능력이 최소 10⁵배 희석한 샘플에서까지 CPE 형성능을 나타냄을 확인하였다.

이후, 상기 실시예 1에서 분리된 PEDV CNU-P6 분리주가 감염된 Vero 세포의 감염능을 보다 구체적으로 확증하기 위해, 면역형광분석 (IFA: Immunofluorescence assay)을 수행하였다. 구체적으로, 12 웰 플레이트에 Vero 세포를 1.5x10⁵로 시딩하고, 상기 실시예 1에서 분리된 PEDV CNU-P6 분리주를 각각 감염시키고 24시간이 지난 후에 면역형광분석을 진행하였다. 4% 포름알데하이드로 고정한 후, PBSt로 permeabilization하였다. 이후, ssRNA 단일클론 항체를 4 ℃에서 하룻밤 동안 처리하였다. 이후, Alexa Fluor 488, 및 Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색하였다. 도 4 및 도 5는 PEDV CNU-P6 분리주의 감염에 의한, Vero 세포 내에 존재하는 ssRNA를 면역형광의 분포를 관찰한 결과이다.

그 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규한 PEDV CNU-P6 분리주의 Vero 세포에의 감염능에 대해 다음과 같이 확증할 수 있다: CNU-P6 분리주가 감염된 Vero 세포에서의 감염 및 CPE 모양이 양성 대조군인 SM98 균주가 감염된 Vero 세포와 유사함 (도 4의 A); PEDV CNU-P6 분리주가 감염된 세포의 DAPI 염색을 통한 핵 염색을 관찰한 결과, PEDV는 전형적으로 세포질에 감염을 유발하기 때문에 핵에서의 변형이나 바이러스 존재 인정되지 않는 점을 고려하였을 때, PEDV CNU-P6 분리주가 감염된 Vero 세포의 경우에도 핵에서의 변형이나 PEDV의 존재가 관찰되지 않음 (도 4의 B); PEDV CNU-P6 분리주에 대한 PEDV 항체를 이용한 IFA 실험 결과, 바이러스가 전형적으로 세포질에 위치하고, 이는 양성 대조군인 SM98 균주에 대한 PEDV 항체를 이용한 IFA 실험 결과와 유사함 (도 4의 C-D, 및 도 5)을 확인하였다.

즉, 본 발명의 PEDV CNU-P6 분리주는 양성 대조군인 SM98 균주가 감염된 Vero 세포와 비교하였을 때, 감염되는 위치나 단백질 발현 정도가 유사하고, PEDV의 전형적인 감염 위치인 세포질에 위치함을 확인하였는바, 이로부터 본 발명의 PEDV CNU-P6 분리주는 Vero 세포에 감염 능력을 갖는 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스임을 확증할 수 있다.

실시예 4: 돼지 유행성 설사병 바이러스 유사 입자의 제조 및 면역원성 평가

돼지 유행성 설사병 바이러스 유사 입자의 제조를 위하여, 상기 실시예 2에서 돼지 유행성 설사병 바이러스의 구조 단백질인 스파이크, 막, 외피, 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 GenScript에서 수득 및 합성하였다. 상기 방법에 따라 합성한 유전자의 염기서열은 각각 서열번호 1 내지 4와 같다.

이후, 상기에서 합성된 유전자 각각을 백본(backbone) 벡터인 pCAGGS.MCS vector(Addgene)에 EcoRI (GAATTC)와 XhoI (CTCGAG)를 이용하여 각각 클로닝하였고, 상기 방법에 따라, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 유전자가 삽입된 pCAGGS-S 벡터, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 막 유전자가 삽입된 pCAGGS-M 벡터, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 외피 유전자가 삽입된 pCAGGS-E 벡터, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자가 삽입된 pCAGGS-N 벡터를 각각 수득하였다. 이후, EK293(5X10E6) 세포(ATCC)에 pCAGGS-S, pCAGGS-M, pCAGGS-E, pCAGGS-N 클론을 도입하였고, 구체적으로, 폴리 에틸렌이민(PEI)을 사용하여 DNA:PEI = 1:3의 비율로 transfection하였다. 24시간 후 세포의 배지를 갈아주고 96시간 동안 세포를 배양하였다. Transfection 48~96시간 동안 상층액을 수득하였다. 이후, 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 1000 xg, 4℃ 10 min로 원심분리하여 다시 상층액을 분리해내고, 상기 상층액을 다시 100,000xg, 4℃ 1h 조건으로 20% sucrose cushion을 포함하여 원심 분리함으로써, 돼지 유행성 설사병 바이러스 유사 입자만을 순수 분리하였다.

돼지 유행성 설사병 바이러스 유사 입자의 면역원성을 평가하기 위하여 실험 동물에 상기 제조된 돼지 유행성 설사병 바이러스 유사 입자를 2주 간격으로 2회 근육접종 하였다(투여용량 : 100 ul). 2차 접종 2주 후, 혈청을 채취하여 IgA, 및 IgG 역가를 측정하였으며, 돼지 유행성 설사병 바이러스 유사 입자를 이용한 ELISA와 중화능시험을 수행하여 혈청 및 초유 내 항체가를 검사하였다. 한편, 대조군으로 PBS를 첨가한 군을 사용하였으며, 비교군으로 불활화 백신인 ㈜ 코미팜 사의 PED-FC를 첨가한 군을 사용하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 바이러스 유사입자는 비교군에 비해 높은 수준의 IgA, IgG 역가를 보여주었으며, 혈청 및 초유 내 항체가 역시 상이와 동일한 경향성을 보였다. 상기 결과는 일 실시예에 따른 바이러스 및 이의 유사 입자는 돼지 유행성 설사병에 대한 백신 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있음을 나타내는 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Novel porcine epidemic diarrhea virus isolate and use thereof <130> PN138573KR <150> KR 10-2020-0037067 <151> 2020-03-26 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> porcine epidemic diarrhea virus_spike protein <400> 1 atgaagtctt taaattactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagtctacca 60 caagatgtcg ccaggtgcac cgctaatact aattttaggc ggttcttaac aaaatttaat 120 gttcaggcgc ctgcaattgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaatcagggt 180 gttaattcaa cttggtattg ttacggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240 tttgttagcc atattacagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300 gaccctagtg gttaccagct ttatttacat gctactaacg gtaacactat agctactgcg 360 cgactgcgca tttgccagtt tcctagcatc aaaacattgg gccccactgc taataatgat 420 gttacaacag gtcgtaattg cctatttaac aaagcagtcc cagctcatat gagtgaacat 480 agtgttgtcg gcataatacg ggataatgat cgtgtcactg tcttttctga caagatctat 540 catttttatt 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ttataggact cgtactgagg gtgttttctg ggttgctaaa 300 gaaggcgcaa agactgaacc cactaatttg ggtgtcagaa aggcgtctga aaagccaatc 360 attccaaaat tctttcaaca gctccccagt gtagttgaga ttgttgaacc taacacacct 420 cctgcttcac gtgcaaattc gcgtagcagg agtcgtggca atggcaacaa taggtctaga 480 tctccaagta acaacagagg caataaccag tcccgtggca attcacagaa tcgtggaaat 540 aaccagggtc gtggagcttc tcagaacaga ggaggcaata ataataacaa taacaagtct 600 cgtaaccagt ccaataacag gaaccagtca aatgaccgtg gtggtgtaac atcacgcgat 660 gatctggtgg ctgctgtcaa ggatgcactt aaatctttgg gtattggaga aaatcctgac 720 aggcataagc aacagcagaa gcctaagcag gaaaagtctg acaacagcgg caaaaataca 780 cctaagaaga acaaatccag ggccacttcg aaggaacgtg acctcaaaga catcccagag 840 tggaggagaa ttcccaaggg cgaaaatagc gtagcagctt gcttcggacc cagagggggc 900 ttcaaaaact ttggagatgc ggaatttgtc gaaaaaggtg ttgatgcgtc aggctatgct 960 cagatcgcca gtttagcacc aaatgttgca gcattgctct ttggtggtaa tgtggctgtt 1020 cgtgagctag cggactctta cgagattaca tacaactata aaatgactgt gccaaagtca 1080 gatccaaatg ttgagcttct tgtttcacag gtggatgcat ttaaaactgg gaatgcaaaa 1140 ctccagagaa agaaggaaaa gaagaacaag cgtgaaacca cgctgcagca gcatgaagag 1200 gccatctacg atgatgtggg tgcgccatct gatgtgaccc atgccaatct ggaatgggac 1260 acagctgttg atgatggtga tacggccgtt gaaattatca acgagatctt cgatacagga 1320 aat 1323 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spike_Forward primer <400> 5 atgaggtctt aaatttac 18 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spike_Reverse primer <400> 6 accaccaaaa gccgcagaga cagt 24

Claims

서열번호 1으로 이루어진 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV: Porcine Epidemic Diarrhea Virus) 스파이크(Spike) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 스파이크 발현용 재조합 벡터.
서열번호 1의 염기서열로 코딩된 아미노산으로 이루어진 스파이크 단백질, 서열번호 2의 염기서열로 코딩된 아미노산으로 이루어진 막(Membrane) 단백질, 서열번호 3의 염기서열로 코딩된 아미노산으로 이루어진 외피(Envelope) 단백질, 및 서열번호 4의 염기서열로 코딩된 아미노산으로 이루어지는 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 단백질,을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 유사입자.
청구항 3에 있어서, 상기 막 단백질, 및 외피 단백질은 구형의 외피를 형성하고, 상기 스파이크 단백질은 상기 구형의 외피로부터 외향으로 돌출되어 있으며, 상기 뉴클레오캡시드 단백질은 상기 구형의 외피 내부에 위치하는 것인, 돼지 유행성 설사병 바이러스 유사입자.
청구항 3의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 백신 조성물.
청구항 5의 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스 감염을 예방하는 방법.
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