KR20160132494A - 돼지 유행성 설사 바이러스 백신 - Google Patents

돼지 유행성 설사 바이러스 백신 Download PDF

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루이스 알레잔드로 헤르난데즈
아룬 브이. 이어
다이아나 엠. 머피 조단
애비 래 패터슨
마이클 비. 루프
에릭 마틴 본
조셉 길버트 빅토리아
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Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스와 관련된 질환에 대항하여 돼지를 보호하기 위한 백신에 관한 것이다. 백신은 통상적으로 불활성화/사멸 PEDV(예를 들면, 화학적으로 불활성화된 PED 바이러스), 및/또는 재조합 PEDV 항원 및 애쥬번트를 포함한다. PEDV 관련 질환에 대항하여 돼지를 보호하는 방법 및 돼지 유행성 설사 바이러스 백신을 생산하는 방법이 또한 제공된다.

Description

돼지 유행성 설사 바이러스 백신{PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS VACCINE}
서열 목록
본 출원은 37 C.F.R. 1.821 - 1.825에 따른 서열 목록을 포함한다. 본 발명에 수반된 서열 목록은 이의 전문이 본원에 참조로서 도입된다.
발명의 분야:
본 발명은 미국에서 현재 풍토성(endemic)인 단리물에 특이적인 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 백신에 관한 것이고, 이는 PEDV에 의해 야기된 질환의 임상적 징후를 감소시킬 수 있다. 생후 10일 미만인 새끼 돼지에서의 높은 사망률(100%까지) 때문에, 질환은 미국 돼지 산업에서 경제적 우려를 만든다.
관련 기술의 설명:
돼지 유행성 설사 바이러스는 돼지에서 급성 설사, 구토, 및 탈수를 야기하는 외피 보유, 양성-센스 단일-가닥 RNA 바이러스이다. 이는 유럽에서 처음으로 확인되었지만, 대한민국, 중국, 일본, 필리핀, 및 태국을 포함하는 다수의 아시아 국가에서 점점 더 문제가 되었다. 2013년 4월에, PEDV는 미국 중서부에서 돼지에서 출현하였고, 국가 전역에 신속하게 전파되었다. 2013년 10월에, PEDV는 18개 주에서 돼지 집단(herd)에서 검출되었다. PEDV 감염의 경제적인 영향은 이미 상당하였다. 북미 PEDV의 단리물은 확인되었고[참조: Huang, et al. 2013; Stevenson et al. 2013], 그러나 완전히 허가받은 백신은 미국에서 시판되지 않는다. 따라서, PEDV 관련 질환에 대항하여 돼지를 보호할 수 있는 백신을 개발해야 할 필요성이 지속된다. 점막 경로(경구 또는 비내)를 통해 뿐만 아니라 비경구 방법(예를 들면, 근육내, 피하로 또는 정맥내로)을 통해 투여될 수 있는 북미 PEDV 세포주 출현에 대항하여 효과적인 백신을 개발하는 것이 유리할 것이다.
PEDV는 알파코로나바이러스(Alphacoronavirus) 속의 코로나비리내(Coronavirinae) 아과의 구성원이고[참조: Bridgen et al. 1993], 1971년에 잉글랜드에서 첫번째로 확인되었고, 이후에 다른 나라, 예를 들면, 벨기에, 중국, 헝가리, 이탈리아, 일본, 대한민국, 및 태국에서 확인되었다[참조: Oldham J. 1972; Pensaert and De Bouck P. 1978; Chen et al. 2008; Nagy et al. 1996; Martelli et al. 2008; Takahashi et al. 1983; Chae et al. 2000; and Puranaveja et al. 2009]. 이러한 과의 다른 구성원은 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV), 혈구응집 뇌척수염 코로나바이러스(PHE), 및 전염성 위장염 바이러스(TGEV)를 포함한다. PEDV 및 TGEV 바이러스가 관련되고, 임상적 징후가 매우 유사하지만, 면역 교차-보호(immune cross-protection)는 없다.
PEDV는 5' cap 및 3' 폴리아데닐화 테일을 갖는 대략적으로 28 kb, 양성-센스, 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는 외피 보유 바이러스이다[참조: Pensaert and De Bouck P. 1978]. 게놈은 5' 비해석 영역(UTR), 3' UTR, 및 적어도 7개의 개방 판독 프레임(ORFs)을 포함하고, 4개의 구조 단백질(스파이크(S), 외피(E), 막(M), 및 뉴클레오캡시드(N)) 및 3개의 비-구조 단백질(리플리카제 1a 및 1b 및 ORF3)을 암호화하고; 이들은 게놈에서 순서 5'-리플리카제(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3'으로 배열된다[참조: Oldham J. 1972; and Bridgen et al. 1993]. 미네소타 MN(진뱅크: KF468752.1), 아이오와 IA1(GenBank: KF468753.1), 및 아이오와 IA2(진뱅크: KF468754.1)로 특성화된 첫번째 신생의 3가지 북미 PEDV 게놈 서열은 폴리아데노신 테일을 제외하고는 동일한 크기의 28,038개의 뉴클레오티드(nt)를 갖고, 원형 PEDV CV777 세포주(GenBank: AF353511.1)를 갖는 게놈 조직(organization)을 공유한다. 이들 3개의 북미 PEDV 서열은 99.8 내지 99.9% 뉴클레오티드 동일성을 공유하였다. 특히, 세포주 MN 및 IA2는 전체 게놈에 걸쳐서 단지 11개의 뉴클레오티드 차이를 가졌다.
PEDV S 단백질은 1,383 아미노산(aa)으로 구성되는 I형 당단백질이다. S 단백질은 다른 코로나바이러스의 S 단백질을 갖는 이의 상동성을 기초로 하여 S1(1-789 aa) 및 S2(790-1,383 aa) 도메인으로 나눌 수 있다[참조: Chang et al; 2002; Cruz et al, 1994; Godet, et al 1994; Jackwood et al. 2001; Sturman and Holmes; 1984; and Sun et al. 2008]. 코로나바이러스에서 S 단백질은 표면 항원이고, 여기서, 바이러스 진입을 매개하기 위한 숙주 세포 수용체 당단백질과 상호작용을 조절하고, 자연 숙주에서 중화 항체의 유도를 자극하는 역할을 한다. 따라서, S 당단백질은 PEDV에 대항하는 효과적인 백신의 개발을 위한 일차 표적이다.
PEDV M 단백질은 가장 풍부한 외피 성분이고, 바이러스 조립 프로세스에서 중요한 역할을 하고, 또한 바이러스를 중화시키는 항체를 유도한다. 유사하게, PEDV N 단백질은, 뉴클레오캡시드에 대한 구조적 기반을 제공하는 비리온 RNA에 결합하고, 또한 세포-매개된 면역의 유도에 중요할 수 있다[참조: Saif, L. 1993].
PEDV에서 유일한 액세서리(accessory) 유전자는 ORF3이다. 액세서리 유전자는 일반적으로 필드(field) 세포주에서 유지되지만, ORF3의 변경은 독성에 영향을 주는 것으로 사료되고; 세포 배양 개조(adaptation)는 ORF3 유전자를 변경시켜 독성을 감소시키기 위해 사용되었다[참조: Song et al. 2003]. 사실상, ORF3 유전자의 조사를 통해, 연구자는 2006년 이래로 중국에서 면역화된 돼지 집단에서 PEDV의 새로운 유전자그룹(genogroups)의 출현을 기록하였다. 이들 세포주 및 중국에서 PEDV의 지리학적 재출현의 계통발생 연구는 강력한(devastating) 장 질환을 야기하는 필드 세포주가 유럽 세포주 및 백신 세포주로부터의 ORF3과 유전적으로 상이하다는 것을 증명하였다[참조: Park et al. 2011].
PEDV의 상이한 세포주는 독성의 가변적인 수준으로 존재하는 것으로 널리 공지된다. 1980년대 및 1990년대 동안, PEDV는 유럽 전역에서, 예를 들면, 벨기에, 잉글랜드, 독일, 프랑스, 네덜란드, 및 스위스 국가에서, 유행하였다. 유럽에서 보고된 케이스의 빈도는 후속적으로 점점 줄어들었고, 및/또는 PEDV에 의해 야기되는 질환은 백신의 상업적 개발을 시작하기 위해서 충분한 경제학적 중요성은 없었다[참조: Song and Park 2012]. PEDV의 발생은 1980년대 이래로 중국에서 기록되지만, 2010년 이래로 나타난 설사의 대규모 발생과 관련된 PEDV 변이체 세포주는 보다 급성이고 보다 중증이었다. 따라서, 백신 개발의 시도는 주로 아시아 국가에서 수행되었다[참조: Song and Park 2012]. 2010년 이래로 출현한 변이체는 젖먹이 새끼 돼지에서 80 내지 90% 이환율(morbidity) 및 50 내지 90% 사망률을 갖는 것으로 보고되었다[참조: Bi et al. 2012; Pan et al. 2012; and Li et al. 1012]. 최근 증거는 중국에서 최근 생겨난 치명적인 형태의 PEDV는 살아있는 백신 세포주의 진화의 결과일 수 있다는 것이 제안된다[참조: Chen et al. 2010].
돼지의 장에 발병하는 장 질환으로서, PEDV는 배설물-경구 노출을 통해 전파된다. 오염된 트럭 및 장비는 비투약(naive) 동물에 대한 감염의 빈번한 근원이다. PEDV 감염의 임상적 징후는 전염성 위장염 바이러스(TGEV) 감염과 유사하다[참조: Pijpers et al. 1993]. 3주령 이하의 돼지에서, 임상적 징후(급성 물, 설사, 구토, 및 탈수를 포함함)는 PEDV 감염된지 24시간 후 즉시 나타날 수 있고, 100% 사망률을 야기한다. PEDV-감염된 비육업자(feeder) 및 사육자(grower) 돼지, 뿐만 아니라 암퇘지 및 수퇘지(boars)는, 설사 및 구토를 발병할 수 있다. 동물은 또한 식욕부진의 징후를 나타낼 수 있고, 기면성(lethargic)일 수 있다. 고령 돼지에 미치는 전면적인 충격은 아직 결정되지 않지만, 감소된 사료 효율, 시장 판매까지 추가일이 걸림(additional days to market), 및 이차적인 감염에 대한 감염된 동물의 민감성이 또한 존재한다. 암퇘지의 경우, 감소된 신체 상태는 번식 능력에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 보고는 PEDV가 북미 집단에서 풍토성이 될 수 있다는 징후를 나타내고, 이는 지속적인 설사 및 다른 접종을 야기한다.
PEDV로 감염된 동물의 내장에서 총체적인 조직학적 변화는 중국에서 관찰된 것과 미국에서 유사하고; 본질적으로 바이러스는 돼지의 장의 융모를 파괴시켜 영양분을 흡수하는데 실패하게 한다. 황 등[참조: Huang et al. 2012]은 미네소타주 및 아이오와주 발생에서 질환으로 쓰러진 동물이 소장으로 제한된 총체적인 병리학적 병소를 가졌고, 소장이 황색 유체로 팽창된 반투명한 얇은 벽을 특징으로 하였다는 것을 보고하였다. 조직학적 평가는 융모 둔감(blunting) 및 융합 및 고유판의 융모의 최소의 림프모구 침윤을 갖는 소장의 영역을 나타내었다.
황 등[참조: Huang et al. 2013]은 미국에서 출발한 발생(outgoing outbreaks)으로부터의 PEDV의 3개의 상이한 세포주를 특성규명하였다 - 미네소타주로부터 하나 아이오와주로부터 2개, MN(진뱅크 수탁 번호: KF468752) 및 IA1(진뱅크 수탁 번호: KF468753) 및 IA2(진뱅크 수탁 번호: KF48754)로 각각 지정됨. 황의 계통 발생 조사는 PEDV 세포주를 그룹화하고, 2개의 별개의 유전자그룹으로 나누고, 유전자그룹 1(G1) 및 유전자그룹 2(G2)로 지정하였다. 스파이크 유전자의 N-말단 도메인(NTD)에서 유의한 변화는 유전자그룹 1 및 2로 분화시켰다. 황 등[참조: Huang et al. 2013]은 N-말단 도메인(NTD)에서 제2 결실 영역(DR2)이 DR1보다 더 높은 정도의 항원 변화를 갖는 것으로 나타난다고 제시하는데, 이는 최근 생겨난 북미 세포주가 G1a 백신 세포주와 관련된 "항원과 관련하여(antigenically)" 덜 관련될 수 있다는 것을 제시한다.
유전자그룹 1은 적어도 3개의 클러스터 1a, 1b, 및 R을 포함한다. 하위그룹 1a는 조기 유럽, 중국, 및 대한민국 단리물, 예를 들면, 원형 CV777 세포주(Belgium, 1978, 진뱅크: AF353511.1) 및 세포주 LZC(Gansu, China, 2006; 진뱅크: EF185992) 및 SM98(Korea, 1998; 진뱅크: GU937797.1)을 포함한다. 하위그룹 1b는 5개의 세포주-대한민국으로부터 하나(DR13 약독화된 백신 세포주, 진뱅크: JQ023162.1) 및 nsp3에서 공통 "유전 시그니처(genetic signature)" 8-aa 결실 및 C 말단에서 대량 ORF3 결실에 의해 결합된 중국으로부터의 다른 하나를 포함한다. 그룹 "R"은 다른 유전자그룹의 재조합과 관련된다. 그러나, 2010년 이래로 중국에서 발생한 것 및 2013년 이래로 북미에서 발생한 것을 포함하는 새로운 신생의 PEDV 세포주는, 유전자그룹 G2a에 속한다. 중국 세포주 AH2012(진뱅크 수탁 번호: KC210145) 및 북미 세포주는 수개의 고유한 뉴클레오티드 변화를 공유하고, 유전자그룹 2a에서 함께 클러스터된다. 세포주 MN 및 IA2에 대한 AH2012와의 뉴클레오티드 동일성은 99.6%였고, 세포주 IA1은 99.5%였다. 연구자는 AH2012-유사 바이러스가 가능하게는 동중국 지역으로 전염되고, 이어서, 미국으로 운반되고, 아마도 북미 세포주와 가장 밀접한 선조인 것을 추측한다. 유전자그룹 2a의 구성원은 유전자그룹 1a의 원형 PEDV 세포주 CV777과 단지 대략적으로 96.9% 유사성을 공유한다[참조: Bridgen, et al. 1993; Huang et al. 2013; 진뱅크: AF353511.1]. 이와 같이, 역사적 CV777-유도된 G1a 세포주 또는 DR13-유도된 G1b 세포주에 기반하는 약독화된 PEDV 백신은 새로운 신생의 중국 및 북미 G2a PEDV 세포주와 항원과 관련하여서는 덜 관련될 수 있고, 따라서 열악한 백신 후보일 수 있다.
밀접하게 관련된 북미 단리물 US/콜로라도/2013(진뱅크 수탁 번호: KF272920.1)는 또한 마탈러 등에 의해 보고되었다[참조: Marthaler et al, 2013]. 상기 북미 단리물과 유사하게, CO/13의 완전한 PEDV 게놈은 진뱅크에서 이용가능한 다른 완전한 PEDV 게놈과 96.5 내지 99.5%의 뉴클레오티드 동일성을 갖고, 중국 세포주 AH2012(진뱅크 수탁 번호. KC210145)와 가장 높은 뉴클레오티드 동일성(99.5%)을 갖는다. 이는 2a 유전자그룹의 구성원이다. PEDV 참조 세포주 CV777의 완전한 게놈과 CO/13의 완전한 게놈의 비교는, CO/13이 1-nt 삽입(위치 48에서) 및 5' UTR에서 5개 뉴클레오티드의 결실(위치 73 및 83 내지 86에서)을 포함함을 나타낸다. 이러한 북미 바이러스는 수개의 삽입/결실을 갖는 단지 82% 뉴클레오티드 동일성을 공유하는 게놈 위치 20,696 및 21,125에서 S1 내의 증가된 분산(divergence)을 나타낸다.
이의 게놈 서열과 상이한 수개의 PEDV 백신, 전달 방식, 및 효능은 개발되어왔다. 유럽 CV777 세포주의 세포 배양 개조는 아시아 국가에서 사용되었고, 여기서, PEDV 발생이 극심하였다. 이들은 1990년 이래로 사용되고 있었다.
1980년대 초기에, 일본 연구자들은 감염된 돼지의 설사로부터 원인이 되는 PED 바이러스 세포주 83P-5를 단리하였다. 쿠사나기 등[참조: Kusanagi et al. 1989]은 베로(Vero) 세포에서 세포주를 단리하고 개조하였다. 세포 배양 개조된 PEDV(P-5V)(83P-5)의 약독화된 바이러스 백신을 1997년 이래로 일본에서 암퇘지에서 사용하였다. 100번째-계대 83P-5 세포주를 약독화된 PEDV 백신으로서 사용하기 위해 일본에서 니세이켄 컴퍼니 리미티드(Nisseiken Co., Ltd.)가 허가받았다[참조: Sato et al. 2011]. 83P-5세포주의 개조 및 약독화가 약독화된 DR13 세포주와 서열 유사성을 갖는 S 단백질의 세포외 부분에서 돌연변이를 나타내었음을 보고하였다[참조: Sato et al. 2011; See Strain 83P-5 Spike gene sequence at 100th passage, 진뱅크: AB548621.1). 이러한 후자의 일본 백신이 효능이 있는 것으로 고려되지만, 모든 암퇘지가 이들의 새끼 돼지에게 면역을 계대할 수 있지는 않았다[참조: Usami et al. 1998]. 일본 세포주 및 유럽 세포주는 유전자그룹 G1a 또는 G1b의 구성원이다. 상기 논의된 바와 같이, 이들 약독화된 백신 세포주는 유전자그룹 2a의 새로운 신생의 중국 세포주 보다 분산된(divergent) 북미 세포주에 덜 관련된다.
약독화된 대한민국 PEDV 세포주, DR13(계대 수준 100)(GenBank: JQ023162.1), 유전자그룹 G1b의 구성원을 사용한 경구 백신접종은 백신으로서 효능이 있는 것으로 나타났다. 바이러스 세포주는 허가되었고, 2004년 이래로 경구 백신으로서 대한민국에서 사용되었고, 필리핀에서 2011년에 등록되고 시판되었다[참조: Song and Park 2012]. 그러나, 약독화된 DR13은 접종된 새끼 돼지에서 바이러스 흘림(shedding) 동안 유의하게 변경시키지 않는다는 것이 보고되었다 - 면역 보호가 불완전함을 나타냄. 또한, 높은 약독화된 PEDV 만을 사용한 경구 면역화는 백신의 매우 높은 용량에서 보호(protection)를 부여하였다[참조: Song and Park 2012].
다른 공지된 백신은 SUISHOT® PT-100(ChoongAng Vaccine Laboratories, 대한민국) 조합 사멸 PEDV 및 TGEV 백신, 및 SUISHOT® PED 사멸 PEDV 백신을 포함한다. 준앙 백신 라보라토리즈(ChoonAng Vaccine Laboratories)를 통해 제공된 세포주 및 하위타입은 공지되어 있지 않다. 또한 또다른 대한민국 회사인 코미팜 인터내셔널 컴파니(Komipharm International Co.)는 일련의 사멸된, 살아있는, 및 조합 백신을 제공하고, 상표명 PRO-VAC®하에 시판하였고, 이는 유전자그룹 G1a의 PEDV 세포주 SM98P를 포함한다. 킬루 애니멀 헬쓰 프로덕츠 팩토리 오브 차이나(Qilu Animal Health Products Factory of China)는 또한 세포주 및 하위타입이 공지되지 않은 PEDV 및 TGEV을 포함하는 조합 사멸 백신을 중국에서 판매한다.
따라서, PEDV에 의해 야기되는 질환의 임상적 징후을 감소시키고, 면역화된 동물에서 방어 면역을 유도하고, 면역화된 동물에서 바이러스 흘림의 감소를 포함할 수 있는 현재 북미에 풍토적인 단리물 특이성 PEDV 백신이 필요하다.
발명의 요지
본 발명은 면역원성 조성물, 백신, 및 당해 기술 분야에서 결함을 극복하는 관련 방법을 제공한다. 본 발명은 면역원성 조성물에 관한 것이고, 이는 불활성화된/사멸된 및/또는 재조합 형태의 외피 보유 (+) 단일-가닥 RNA 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스, 또는 PEDV를 포함한다. 특히, 본 출원은 북미 PEDV의 단리물과 관련된 질환에 대항하여 돼지를 보호하기 위한 백신을 제공한다. 본 발명의 PEDV 단리물 BI1251-125-10(본 발명에서 "125-10"로 언급됨)(서열 번호 1 및 서열 번호 15)은 유전자그룹 2a의 보고된 다른 북미 PEDV와 유사한 유전 프로파일을 갖는 치명적인 북미 RNA 바이러스 세포주이다.
본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은 불활성화/사멸 PEDV(예를 들면, 화학적으로 불활성화된 PEDV 단리물 125-10(서열 번호 1 및 서열 번호 15))을 포함하고, 전형적으로 또한 애쥬번트를 포함한다. 백신은 또한 다른 성분, 예를 들면, 보존제(들), 항균제, 안정화제(들), 예를 들면 백신의 저장수명을 증가시킬 수 있는 안정화제, 에멀젼, 및 다른 돼지 병원균에 대항하는 항원을 포함한다.
본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은 곤충 세포에서 변형된 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스(예를 들면, 아미노산 서열(서열 번호 9)을 암호화하는 변형된 스파이크 핵산 서열(서열 번호 8))를 통해 하나의 비제한적인 예로 발현된 스파이크 항원을 포함하고, 전형적으로 또한 애쥬번트를 포함한다. 백신은 또한 다른 성분, 예를 들면, 보존제(들), 안정화제(들) 및 다른 돼지 병원균에 대항하는 항원을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 바람직한 스파이크 핵산 서열은 스파이크 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2, 6, 8, 및/또는 13과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.9%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1% , 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%. 99.99% 서열 동일성을 갖는다. "본원에 사용된 바와 같이, 특히 용어 "서열 번호 X와 서열 동일성" 또는 "동일한 서열 번호 X"는 각각, 용어 "서열 번호 X의 길이를 넘어서는 서열 번호 X의 서열을 갖는 서열 동일성(sequence identity with the sequence of SEQ ID NO:X over the length of SEQ ID NO: X)" 또는 "서열 번호 X의 길이를 넘어서는(over) 서열 번호 X의 서열과 동일한(identical to the sequence of SEQ ID NO:X over the length of SEQ ID NO: X)" 각각과 등가이고, 이러한 문맥에서 "X"는 1, 2, 6, 8, 13, 및 15로부터 선택되는 임의의 정수이다"인 것을 이해하여야 한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 바람직한 스파이크 폴리펩타이드는 서열 번호 3, 7, 9 및/또는 14의 서열 셋 아웃(set out)을 갖는, 서열 번호 3, 7, 9 및/또는 14와 적어도 80% 상동성, 예를 들면 서열 번호 3, 7, 9 및/또는 14와 적어도 85% 상동성, 예를 들면, 서열 번호 3, 7, 9 및/또는 14와 적어도 85% 상동성, 예를 들면, 서열 번호 3, 7, 9 및/또는 14와 적어도 90% 상동성, 예를 들면 서열 번호 3, 7, 9 및/또는 14와 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩타이드이다.
용어 "백신" 및 "면역원성 조성물"은 본원에서 넓은 의미에서 백신 접종된 동물에서 면역 반응을 자극할 수 있는 투여가능한 형태의 임의의 타입의 생물학적 제제를 언급하기 위해 정의된다. 백신은 일반적으로 바이러스 자체(예를 들면, 사멸된/불활성화된 또는 약독화됨) 또는 바이러스의 면역원성(항원성) 성분을 기반으로 할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 백신(면역원성 조성물)은 바람직하게는 바이러스제를 사멸된/불활성화된 형태 또는 서브-단위 백신으로서 존재하는 바이러스의 항원 부분으로 포함한다. 여기서, 용어 "보호"는 백신을 언급하여 사용되는 경우 문제가 되는 질환 또는 상태와 관련된 증상 중 어는 것의 개선(부분적 또는 완전한)를 언급한다. 따라서, 본 발명의 백신에 의한 PEDV로부터 돼지의 보호는 일반적으로 바이러스 흘림 및/또는 PEDV에 의한 감염에 관련된 임상적 증상 중 하나 이상(예를 들면, 급성 물설사, 급성 구토, 탈수, 식욕부진, 무기력, 우울증, 및 10일령 미만의 돼지에서 높은 사망률)의 감소를 야기한다.
당해 기술 분야의 숙련가는 본원에 사용되는 조성물이 공지된 주사가능한 생리학적으로 허용되는 멸균 용액을 도입할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 사용준비된 용액을 제조하기 위해, 수성 등장성 용액, 예를 들면, 염수 또는 혈장 단백질 용액이, 용이하게 이용가능하다. 추가로, 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은 수의학적으로-허용되는 담체, 희석제, 등장성제제, 안정화제, 또는 애쥬번트를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 불활성화/사멸 PEDV, 약독화 PEDV, 및/또는 스파이크 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 대상자에서 PEDV 감염에 대항하는 면역 반응을 자극하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 면역 반응은 PEDV의 하나 이상의 혈청형, 또는 세포주에 대항하여 자극된다. 본 발명의 조성물은 PEDV 감염을 예방하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 면역 반응은 하나 이상의 PEDV 혈청형을 사용하여 감염에 관련되거나 이에 의해 야기되는 하나 이상의 임상적 징후의 발생정도(incidence) 또는 중증도를 감소시킨다.
여기서, 본 발명의 조성물이 투여되는 것이 적합한 대상자 및 이를 필요로 하는 대상자는 바이러스 관련 감염, 질환, 또는 상태를 위한 예방적 치료가 필요한 동물을 포함할 수 있다. 면역 반응이 본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 자극되는 동물은 가축(livestock), 예를 들면, 돼지, 소, 가금(예를 들면, 닭, 오리, 거위, 또는 칠면조), 염소, 및 양, 및 가축(domestic animals), 예를 들면, 마우스, 래빗, 개, 고양이, 및 말을 포함한다. 바람직한 동물은 돼지, 뮤리드(murids), 에퀴드(equids), 토끼목, 및 소과(bovids)를 포함한다. 가장 바람직하게는, 면역 반응은 돼지에서 자극된다.
본 발명은 또한 불활성화/사멸 PEDV 백신을 및/또는 본원에 제공된 스파이크 항원과 조합하여 포함하고, 바람직하게는 담체 분자를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 PEDV 감염에 관련되거나 이에 의해 야기되는 하나 이상의 임상적 징후의 발생정도 또는 중증도를 감소시키는 방법을 제공하고, 이에 따라, PEDV 감염의 임상적 징후의 발생정도 또는 중증도는, 본원에 제공된 면역원성 조성물을 투여받지 않은 대상자에 비해, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 70%, 가장 바람직하게는 100% 감소된다. 이러한 임상적 징후는 물설사, 구토, 및 탈수를 포함한다. 이들 임상적 징후 중 어느 것은 2a의 유전자그룹 또는 G1a, G1b, 또는 G2b를 포함하는 임의의 다른 PEDV 유전자그룹을 갖는 PEDV로의 감염으로부터 야기될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 PEDV의 화학적으로 불활성화된 형태를 포함한다. 화학적으로 불활성화된 PEDV(서열 번호 1 또는 서열 번호 15) 바이러스를 포함하는 백신이 특히 바람직하다. 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 여러가지 화학적 불활성화 제제는 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 에틸렌이민 및 관련 유도체, 예를 들면, 이성분(binary) 에틸렌이민("BEI") 및 아세틸에틸렌이민은, PED 바이러스를 불활성화하는데 사용하기 위한 적합한 화학적 불활성화 제제의 예이다. 다른 화학적 불활성화 제제, 예를 들면, 베타-프로피오락톤 또는 알데히드(예를 들면, 포름알데히드 및 글루타르알데히드)는, 또한 바이러스를 불활성화하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 백신은 일반적으로 바람직하게는 특히 생체접착성 특성을 가질 수 있는 애쥬번트를 포함하고, 여기서, 바이러스는 비내 투여 가능하도록 설계된다. 적합한 애쥬번트의 예는 가교-결합된 올레핀계 불포화된 카복실산 중합체, 예를 들면, 가교-결합된 아크릴산 중합체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "가교-결합된 아크릴산 중합체"는 단량체 혼합물로부터 형성된 중합체 및 공중합체를 언급하고, 상기 단량체 혼합물은 혼합물 중 아크릴산을 주요 단량체로서 포함한다. 적합한 가교-결합된 아크릴산 중합체의 예는 상표명 CARBOPOL® 934P 및 CARBOPOL® 971(제조원: B.F.Goodrich Co., Cleveland, Ohio)하에 시판되는 제품을 포함한다. 본 발명의 백신에서 사용하기 위한 하나의 특히 적합한 애쥬번트는 약 20,000 cPs를 초과하지 않는 브룩필드 점도를 갖는 가교-결합된 아크릴산 중합체이다(1.0wt.% 수성 용액으로서 pH 7.5에서 20 rpm에서 측정됨). 생체접착성 애쥬번트가 바람직한 경우, 새로 절제한 래빗 위 조직의 2개의 절편 사이에 측정되어 적어도 약 50 dynes/㎠의 생체접착성 특성을 갖는 애쥬번트를 사용하는 것이 유리할 수 있다(미국 특허 제4,615,697호에 기재된 절차에 따라 측정함).
본 발명은 또한 본 발명의 기재된 면역원성 조성물 중 어느 것을 대상자에게 투여함을 포함하는 대상자를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.
용어 "면역(immunizing)"은 면역원성 조성물을 면역화될 대상자에게 투여하고 이에 따라 이러한 면역원성 조성물에 포함된 항원에 대항하는 면역학적 반응을 야기하는 능동 면역화에 관한 것이다.
바람직하게는, 면역화는 집단에서 특정한 PEDV 감염의 발생정도의 감소 또는 특정한 PEDV 감염에 의해 야기되거나 이와 관련된 임상적 징후의 중증도의 감소를 야기한다.
추가로, 본원에 제공되는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상자의 면역화는, PEDV 감염에 의한 대상자의 감염의 예방을 야기한다. 더욱 보다 바람직하게는, 면역화는 PEDV 감염에 대항하여 효과적인, 장기간 지속되는, 면역학적-반응을 야기한다. 상기 시간 기간은 2개월 초과, 바람직하게는 3개월 초과, 보다 바람직하게는 4개월 초과, 보다 바람직하게는 5개월 초과, 보다 바람직하게는 6개월 초과로 지속될 것이라는 것을 이해할 수 있다. 면역화가 면역화된 대상자 모두에서 효과적이지 않을 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
바람직하게는, 정상인 즉, 면역화 없는 대상자의 집단은 보통 PEDV 감염에 의해 야기되거나 이와 관련된 임상적 징후를 발병할 것이다라는 것이 본 발명의 문맥에서 예상된다. 집단의 대상자가 효율적으로 면역화되는지의 여부는 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 추가의 수고로움 없이 결정할 수 있다. 바람직하게는, 면역화는, 임상적 징후가 소정의 집단의 대상자의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 100%에서, 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 40%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 60%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 80%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 90%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 100%로 발생정도 또는 중증도가 감소되는 경우에, 면역화되 않거나 본 발명 이전에 시판된 면역원성 조성물로 면역화되지만 후속적으로 특정한 PEDV에 의해 감염된 대상자와 비교하여, 실효가 있다.
이를 필요로 하는 대상자에서 PEDV에 의해 야기되는 임상적 징후를 예방하는 방법, 또는 PEDV 관련 질환에 대항하여 돼지를 보호하는 방법은 불활성화/사멸 PEDV 및/또는 스파이크 항원을 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 백신을 돼지에게 투여함을 포함한다. 백신은 비내, 경구 및/또는 비경구(예를 들면, 근육내) 투여를 포함하는 여러가지 방법으로 투여될 수 있다. 방법의 하나의 양태에서, 예를 들면, 불활성화 PEDV를 포함하는 백신은 근육내로 1회 이상(예를 들면, 2 내지 4주 간격으로) 투여된다. 방법의 또다른 양태에서, 예를 들면, 불활성화 PEDV를 포함하는 백신은 경구로 1회 이상(예를 들면, 2 내지 4주 간격으로) 투여된다. 대안적인 양태에서 경구 투여는 후속되고/되거나, 적어도 1회, 근육내로 백신의 투여를 선행할 수 있다(예를 들면, 백신의 비경구 투여 이후 및/또는 이전 2 내지 4주). 이상적으로, 소정의 집단에서 모든 돼지를 처방된 간격으로 백신접종하여 질환의 증상 확산에 대항하여 보호한다.
불활성화/사멸 PEDV 백신을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 전형적으로 시미안(simian) 세포에 PED 바이러스, 예를 들면, PED 바이러스 서열 번호 1 또는 서열 번호 15를 접종함을 포함한다. 접종된 시미안 세포는, 일반적으로 적어도 CPE가 관찰되고(통상적으로 37℃에서 24 내지 120시간 후), 이어서, PED바이러스가 인큐베이팅된 세포로부터 (예를 들면, 배양 유체의 디켄팅 및 여과에 의해) 수거될 때까지 인큐베이팅된다. 상기 수거된 바이러스-함유 유체는 화학적 불활성화 제제, 예를 들면, 이성분 에틸렌이민으로 처리되어, 불활성화/사멸 PED 바이러스를 형성할 수 있다. 전형적으로, 불활성화된 바이러스는 추가로 예를 들면, 농축 및 다른 성분과의 블렌딩으로 처리하여 시판 제형을 생산한다. 예를 들면, 불활성화된 바이러스를 포함하는 유체를 농축하고 애쥬번트 및/또는 하나 이상의 다른 돼지 병원균에 대한 항원(들)과 블렌딩할 수 있다.
변형된 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 통해 곤충 세포에서 생성된 재조합 발현된 스파이크 항원 백신을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 하나의 예시적 양태에서 PEDV 스파이크 코딩 서열(서열 번호 7)을 클로닝하여 변형시켜 PEDV 스파이크 시그널 펩타이드, 막관통 도메인, 및 c-말단 도메인을 벡터(VSVG-PEDVS-VSVG DNA 서열(서열 번호 8)) 내로 제거함을 포함하고, Sf9 곤충 세포를 공형질감염시킨다. 불활성화된 재조합 PEDV 물질을 위해, PEDV 바큘로바이러스 수거물을 24시간 동안 5mM BEI를 사용하여 불활성화시키고, 정화시키고, 0.45μm 여과하였다. 전형적으로, 불활성화된 바이러스를 추가로 예를 들면, 농축 및 다른 성분과의 블렌딩으로 처리하여 시판 제형을 생산한다. 예를 들면, 불활성화된 바이러스를 포함하는 유체를 농축하고 애쥬번트 및/또는 하나 이상의 다른 돼지 병원균에 대한 항원(들)과 블렌딩할 수 있다.
본 출원은 또한 다음을 조합하여 포함하는 키트에 관한 것이다: (1) 백신을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서(dispenser); 및 (2) PEDV 관련 질환에 대항하여 보호할 수 있는 화학적으로 불활성화된 PEDV 및/또는 재조합 스파이크 항원 함유 백신. 키트는 액적으로서 이의 내용물을 예를 들면, 에어로졸, 분무 스프레이 및/또는 액체 액적으로서 투약(dispensing)할 수 있는 디스펜서, 및 예를 들면 비내로 및/또는 근육내로 투여되는 경우 PEDV 관련 질환에 대항하여 보호할 수 있는 백신 형태를 포함할 수 있다.
본 출원에 걸쳐, 당해 텍스트는 본 발명의 조성물 및/또는 관련 방법의 다양한 양태에 관한 것이다. 기재된 다양한 양태는 여러가지 예시적인 예를 제공하는 것을 의도하고, 대안적인 종(species)의 기재로서 고려되어서는 안된다. 오히려, 본원에 제공된 다양한 양태의 기재가 중복될 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 본원에 논의된 양태는 단지 예시적인 것이며, 발명의 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다.
하기 도면은 본 발명의 명세서의 부분을 형성하고, 본 발명의 특정한 측면을 추가로 증명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정한 양태의 상세한 기재와 조합하여 이들 도면의 하나 이상을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1 PEDV 1251-125-10 (125-10) 게놈 (서열 번호 1) 및 가장 밀접한 중국 PEDV 세포주 AH2012(진뱅크 수탁 번호: KC210145) (서열 번호 10)의 DNA 정렬.
도 2 PEDV 1251-125-10 (125-10) 게놈 (서열 번호 1) 및 가장 밀접한 북미 PEDV 세포주 콜로라도 2013 (진뱅크 수탁 번호: KF272920) (서열 번호 11)의 DNA 정렬.
도 3 정렬된 PEDV 1251-125-10 (125-10) 스파이크 단백질(서열 번호 14) 및 북미 콜로라도 세포주에 상응하는 가장 밀접한 진뱅크 서열 (진뱅크 수탁 번호: AGO58924) (서열 번호 12)의 아미노산 서열 정렬.
도 4 항-PEDV-IgG ELISA 데이터 (D-1, 14, 28 및 49에 대한 그룹 최소 제곱 평균±표준 오차 항-PEDV-IgG S:P 비)의 그래프 도시.
도 5 항-PEDV-IgA ELISA 데이터 (D-1, 14, 28 및 49에 대한 그룹 최소 제곱 평균±표준 오차 항-PEDV-IgA S:P 비)의 그래프 도시.
상세한 설명
본 발명은 불활성화된/사멸된, 형태의 PEDV 및/또는 재조합 발현된 PEDV-스파이크 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 백신은 PEDV 관련 질환에 대항하여 돼지를 보호하기 위해 설계된다. 백신은 전형적으로 화학적으로 불활성화된 형태의 PEDV를 포함하고, 화학적으로 불활성화된/사멸된 PEDV 바이러스를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 또다른 양태에서, 백신은 변형된 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 통해 예를 들면, 곤충 세포에서 생성된 재조합 발현된 스파이크 항원을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 PEDV 유전자형 2a의 하나 이상의 항원을 포함하는 백신일 수 있다. 바람직한 양태에서, PEDV는 북미 기원이다. 보다 바람직하게는, 북미 유전자형의 PEDV는 서열 번호 1로 암호화되거나 서열 번호 1의 서열을 포함하는 임의의 PEDV이고/이거나, 서열 번호 1의 RNA 등가물을 포함하고; 이의 서열이 서열 번호 1과 적어도 99% 동일하고, 및/또는 서열 번호 1의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일하고; 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13의 핵산 서열에 의해 암호화되고; 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되고; 이는 서열 번호 15에 의해 암호화되고; 또는 이의 서열이 서열 번호 15와 적어도 99% 동일하다.
본 발명의 또다른 양태에서, 백신은 재조합 백신 또는 사멸 백신이다. 본 발명의 예시적인 양태에서, PEDV는 화학적으로 불활성화되는데, 예를 들면, 에틸렌이민, 이성분 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 화학적 불활성화 제제로 처리된다. 바람직한 양태에서, PEDV는 이성분 에틸렌이민으로 처리하여 화학적으로 불활성화된다.
본 발명의 또한 다른 양태에서, 백신은 추가로 애쥬번트를 포함한다. 바람직한 양태에서, 애쥬번트는 EMULSIGEN® 기반 수중유(oil-in water) 에멀젼이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 백신은 재조합 백신이다. 바람직한 양태에서, 상기 재조합 백신은 PEDV 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산(여기서, 재조합 스파이크 폴리펩타이드는 서열 번호 3, 7, 9 또는 14와 적어도 90% 상동성을 갖는다); a)의 단리된 핵산을 포함하는 벡터; a)의 핵산에 의해 암호화된 재조합 PEDV 스파이크 단백질; 및/또는 이의 임의의 조합물으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 면역원성 성분을 포함한다. 임의로, 상기 재조합 백신은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함한다. 하나의 양태에서, 부형제는 하나 이상의 애쥬번트이다. 바람직하게는, 애쥬번트는 EMULSIGEN® 수중유 에멀젼-기재 애쥬번트이다.
본 발명의 또한 또다른 측면에서, 재조합 백신은 추가로 하나 이상의 추가 항원을 포함하고, 예를 들면, 추가 항원은 PEDV의 구조 단백질 M, E, 또는 N일 수 있다.
또다른 양태에서, 재조합 백신은 면역원성 성분을 포함하고, 상기 면역원성 성분은 단리된 핵산, 벡터, 재조합 PEDV 스파이크 단백질, 및/또는 후자의 적어도 2개의 조합물일 수 있다.
본 발명의 양태는 또한 본 발명의 기재된 사멸/불활성화 및/또는 재조합 백신 중 어느 것을 상기 돼지에게 투여함을 포함하는 PEDV 관련 질환에 대항하여 임상적 징후의 예방 및/또는 돼지의 보호 방법을 포함한다. 예를 들면 투여된 백신은 유전자형 2a의 PEDV의 하나 이상의 항원을 포함한다. 바람직한 양태에서, PEDV는 북미 기원이다. 보다 바람직하게는, 북미 유전자형의 PEDV는 서열 번호 1의 서열에 의해 암호화되거나 이를 포함하는 임의의 PEDV인데; 이의 서열이 서열 번호 1과 적어도 99% 동일하고; 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13의 핵산 서열에 의해 암호화되고/되거나; 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화된다.
또다른 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1에 의해 암호화되거나, 서열 번호 1의 서열을 포함하고, 및/또는 RNA 등가물(서열 번호 16)을 포함하는 PEDV로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 면역원성 성분을 포함하는 백신의 투여를 포함하고; 이의 서열이 서열 번호 1과 적어도 99% 동일하고, 및/또는 RNA 등가물 (서열 번호 15)과 적어도 99% 동일하고; 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13의 핵산 서열에 의해 암호화되고; 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되고; 이는 서열 번호 15에 의해 암호화되고; 또는 이의 서열이 서열 번호 15와 적어도 99% 동일하다.
또다른 양태에서, 상기 방법은 PEDV 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산(여기서, 재조합 스파이크 폴리펩타이드는 서열 번호 3, 7, 9 또는 14와 적어도 90% 상동성을 갖는다); a)의 단리된 핵산을 포함하는 벡터; a)의 핵산에 의해 암호화된 재조합 PEDV 스파이크 단백질; 및 이의 임의의 조합물으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 면역원성 성분을 포함하는 백신을 투여함을 포함한다.
본 발명의 또한 다른 양태는 백신을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및 본 발명의 기재된 PEDV 백신을 포함하는 PEDV 관련 질환에 대항하여 돼지를 백신접종하기 위한 키트를 포함한다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 청구항 5항에 따른 돼지 유행성 설사 백신을 생산하는 방법을 포함한다: (a) 시미안 세포에 PEDV로 접종하는 단계; (b) 접종된 시미안 세포를 인큐베이팅하는 단계; (c) 인큐베이팅된 세포로부터 PEDV를 수거하는 단계; 및 (d) 상기 수거된 세포를 화학적 불활성화 제제로, 바람직하게는 에틸렌이민, 이성분 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물로 처리하여 불활성화 PEDV 백신을 형성하는 단계. 바람직한 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1에 의해 암호화되고, 또는 서열 번호 1의 서열을 포함하고, 및/또는 서열 번호 1의 RNA 등가물을 포함하는 서열을 포함하는 PEDV를 포함하고; 이의 서열이 서열 번호 1과 적어도 99% 동일하고, 및/또는 서열 번호 1의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일하고; 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13의 핵산 서열에 의해 암호화되고; 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되고; 이는 서열 번호 15에 의해 암호화되고; 또는 이의 서열이 서열 번호 15와 적어도 99% 동일하다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1 및 또는 서열 번호 15를 포함하는 유전자그룹 2a의 PEDV를 포함한다. 상기 방법의 대안적인 양태에서, 접종된 시미안 세포는 베로 세포이다. 상기 방법의 바람직한 양태에서, 화학적 불활성화 제제는 이성분 에틸렌이민을 포함한다. 상기 방법은 추가로 애쥬번트를 PEDV 백신에 추가함을 포함할 수 있고, 바람직하게는, 애쥬번트는 EMULSIGEN® 수중유 에멀젼-기재 애쥬번트이다.
본 발명의 또다른 양태는 숙주 세포에서 PEDV의 하나 이상의 항원을 발현시키는 단계; 및 PEDV-발현 세포로부터 하나 이상의 항원을 수거하는 단계를 포함하는 재조합 백신을 생산하는 방법을 포함한다. 하나의 이러한 양태에서, 상기 방법은 PEDV 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산을 포함하는 하나 이상의 항원(여기서, 재조합 스파이크 폴리펩타이드는 서열 번호 3, 7, 9 또는 14와 적어도 90% 상동성을 갖는다); a)의 단리된 핵산을 포함하는 벡터; a)의 핵산에 의해 암호화된 재조합 PEDV 스파이크 단백질; 및 이의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 양태에서, PEDV의 하나 이상의 항원은 재조합 바큘로바이러스 벡터에 의해 발현된다. 상기 방법은 곤충 세포에서 발현된 PEDV의 하나 이상의 항원을 포함할 수 있다. 하나의 양태는 추가로 PEDV 백신에 애쥬번트를 첨가함을 포함하고, 바람직하게는, 여기서, 애쥬번트는 EMULSIGEN® 수중유 에멀젼-기재 애쥬번트이다.
보다 일반적인 용어에서, 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 여러가지 화학적 불활성화 제제가 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 에틸렌이민 및 관련된 유도체, 예를 들면, 이성분 에틸렌이민(BEI) 및 아세틸에틸렌이민은, PED 바이러스를 불활성화시키는데 사용하기에 적합한 화학적 불활성화 제제의 예이다. 다른 화학적 불활성화 제제, 예를 들면, 베타-프로피오락톤, 알데히드(예를 들면, 포름알데히드) 및/또는 세제(예를 들면, Tween® 세제, Triton® X, 또는 알킬 트리메틸암모늄 염)가 또한 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 불활성화는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 샘플은 주기적 시간 간격으로 수집되고, 잔류하는 살아있는 바이러스에 대해 검정할 수 있다. 적합한 특이 단클론성 또는 다클론성 항체를 사용한 적합한 세포주 및/또는 형광 염색에 미치는 세포변성 효과의 모니터링은 잔류하는 살아있는 바이러스의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있다.
BEI를 사용하는 불활성화를 스톡 BEI 용액(예를 들면, 0.1 내지 0.2M 2-브로모-에틸아민 하이드로브로마이드를 0.1 내지 0.2N 수성 NaOH에 첨가하여 형성된 용액)을 바이러스 유체와 최종 농도 약 1 내지 5mM BEI까지 배합하여 수행할 수 있다. 불활성화는 통상적으로 BEI-바이러스 혼합물을 35 내지 40℃(예를 들면, 37℃)에서 24 내지 72시간 동안 일정하게 혼합하면서 유지하여 수행한다. 바이러스 불활성화는 나트륨 티오설페이트 용액을 BEI 농도 초과로 최종 농도까지 첨가하고(예를 들면, 17%의 용적의 BEI에서 나트륨 티오설페이트를 첨가하여 과도한 BEI를 중화함) 혼합하여 중단시킬 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 보통 애쥬번트 및, 목적하는 경우, 하나 이상의 유화제, 예를 들면, 불활성화/사멸 PEDV와 함께 도입되는 Tween® 세제를 포함한다. 적합한 애쥬번트는, 예를 들면, 비타민 E 아세테이트 용매화물(solubilisate), 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 옥사이드, (미네랄) 오일 에멀젼, 비-이온성 세제, 스쿠알렌 및 사포닌을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 애쥬번트는 오일 기반 애쥬번트, 예를 들면, 프로인트(Freund) 완전 애쥬번트(FCA), 및 프로인트 불완전 애쥬번트(FIA)를 포함한다. 가교-결합된 올레핀계 불포화된 카복실산 중합체, 예를 들면, CARBOPOL® 971 중합체가, 본 발명의 불활성화 PEDV 면역원성 조성물에서 사용하기 위해 특히 적합한 애쥬번트인 것이 발견되었다.
적합한 수중유 에멀젼에 대한 예는 EMULSIGEN® 기반 애쥬번트, 예를 들면, EMULSIGEN®(수중유 에멀젼), EMULSIGEN-D®(수중유)(디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA)를 포함), EMULSIGEN-P®(수중유)(등록상표 면역자극제를 포함), EMULSIGEN-75®(수중유로 구성된 이중 애쥬번트)(가교-결합된 중합체를 포함), 및 EMULSIGEN®-BCL(동물 기원 성분이 없는 수중유 에멀젼)이다(MVP Technologies, Inc. Omaha, Nebr., USA). 불활성화 PEDV 또는 재조합 PEDV 단백질을 포함하는 약제학적/백신 조성물은 효율적으로 수중유 에멀젼, 바람직하게는 이러한 EMULSIGEN®-기재 애쥬번트, 보다 바람직하게는 EMULSIGEN®(동물 기원 성분이 없는 수중유 에멀젼) 및 EMULSIGEN®-BCL(동물 기원 성분이 없는 수중유 에멀젼)으로 보조제 첨가된다.
본 발명의 조성물을 용량 단위 형태로 제형화하는 것이 투여 용이성 및 용량의 균질성을 위해 일반적으로 유리하다. 본 발명에 사용된 용량 단위 형태(Dosage unit form) 는 치료될 포유동물 대상자를 위해 단일 용량으로서 적합한 물리적인 개별 단위를 언급하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 목적하는 치료적 효과를 제공하기 위해 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 포함한다. 불활성화/사멸 PEDV, 및/또는 재조합 발현된 PEDV 항원의 용량 단위 형태에 대한 명시는 다른 인자에 의해 지시되거나 좌우된다: (a) 활성 물질의 고유한 특성 및 성취될 특정한 치료적 효과; (b) 질환의 치료를 위해 이러한 활성 물질을 컴파운딩하는 당해 기술 분야에 내재된 제한사항; 및 (c) 용량 단위 형태의 의도된 투여 방식.
주요한 활성 성분을 전형적으로 용이하고 효과적인 투여를 위해 유효량으로 적합한 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 본원에 개시된 용량 단위 형태로 컴파운딩한다. 단위 용량 형태는, 예를 들면, PEDV 항원을 1 내지 약 5 비역가 단위(relative potency)("RPUs")의 범위의 양으로 포함할 수 있다. 이러한 양의 항원은 일반적으로 약 1 내지 약 25/담체의 ml로 존재한다. 보충 활성 성분을 포함하는 조성물의 경우, 용량은 보충 활성 성분의 일반적 용량 및 투여 방식을 참조하여 결정한다.
본 발명의 백신은 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 불활성화 PEDV를 포함한다. 주사 용도를 위한 적합한 약제학적 형태는 통상적으로 멸균 수성 용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균 분말을 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위해 포함한다. 제형은 바람직하게는 멸균되어야 하고, 용이한 시린지 이용성(syringability)이 존재하는 범위까지 유동하여야 한다. 용량 형태는 제조 및 보관 조건하에 안정하여야 하고, 전형적으로 미생물, 예를 들면, 박테리아 및 진균의 오염 활동에 대항하여 보존된다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 적합한 이의 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 하나의 가능한 담체는 생리학적 염 용액이다. 용액의 적합한 유동성은, 예를 들면, 코팅, 예를 들면, 레시틴을 사용하여, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하여 그리고 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 미생물 활동의 예방은 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로산(나트륨 에틸머큐리-티오살리실레이트), 데오마이신, 겐타마이신 등에 의해 야기할 수 있다. 다수의 경우, 등장성제제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는, 목적하는 경우, 조성물에서 흡수를 지연하는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 야기될 수 있다.
멸균 주사가능 용액을 불활성화된 바이러스를 목적하는 양으로 적합한 용매 중에 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 도입하고, 필요한 경우, 이어서, 멸균 여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 비히클 내로 도입하여 제조할 수 있다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 사전의 이의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가 바람직한 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
또한 안정화제를 본 발명의 조성물에 첨가하는 것이 불활성화된 바이러스의 안정화를 개선시키는데 유리할 수 있다. 적합한 안정화제는, 예를 들면, 글리세롤/EDTA, 탄수화물(예를 들면, 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 전분, 슈크로스, 덱스트란 또는 글루코스), 단백질(예를 들면, 알부민 또는 카제인) 및 단백질 분해 생성물(예를 들면, 부분 가수분해된 젤라틴)을 포함한다. 목적하는 경우, 제형은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로, 시약, 예를 들면, 알칼리 금속 포스페이트, 예를 들면, 나트륨 수소 포스페이트, 나트륨 이수소 포스페이트, 칼륨 수소 포스페이트 및/또는 칼륨 이수소 포스페이트를 사용하여 완충될 수 있다. 다른 용매, 예를 들면, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜은, 백신 제형 중 성분의 용해도 및/또는 용액의 안정화를 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 제형에서 사용될 수 있는 추가의 첨가제는 통상의 산화방지제 및 통상의 킬레이트제, 예를 들면, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법을 다음 실시예에 의해 예시할 수 있고, 이는 본 발명을 예시하기 위해 그리고 당해 기술 분야의 일반적인 숙련가들이 어떻게 이를 만들고 사용하는지 교시하기 위해 제시된다. 이들 실시예는 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 줄이거나 그렇지 않으면 제한하는 것을 의도하지 않는다.
본 발명의 실행에서, 달리 지시되지 않는 한, 당해 기술 분야 내의 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 단백질 화학 및 면역학의 통상의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전하게 설명된다. 예를 들면, 문헌을 참조한다[참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications].
본 발명은 특정한 DNA, RNA, 폴리펩타이드 서열, 또는 공정 파라미터에 제한되지 않고, 물론 변형될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 본원에 사용된 전문 용어는 본 발명의 특정한 양태를 단지 설명하기 위한 목적이고, 제한하려는 의도는 아님을 또한 이해하여야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태 하나("a", "an") 및 상기("the")는 내용에서 명백하게 지시하지 않는 한 복수 언급을 포함한다는 것을 주지하여야 한다. 따라서, 예를 들면, "하나의(an) 항원"에 대한 언급은 2개 이상의 항원의 혼합물을 포함하고; "하나의 부형제"에 대한 언급은 2개 이상의 부형제의 혼합물을 포함한다.
정의:
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 발명이 출원시에 속하는 기술 분야의 숙련가들에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어의 의미 및 범위는 명백하여야 하고; 그러나, 임의의 잠재적 다의성의 경우에, 본원에 제공된 정의는 사전적 또는 외적인 정의 보다 우선한다. 추가로, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단일 용어는 복수를 포함하여야 하고, 복수 용어는 단수형을 포함하여야 한다. 본원에서, "또는"의 사용은 달리 기재되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 추가로, 용어 "포함하는(including)", 뿐만 아니라 다른 형태, 예를 들면, "포함하다(includes)" 및 "포함된(included)"의 사용은 제한되지 않는다. 본원에 언급된 모든 특허 및 공보는 본원에 참조로서 포함된다.
"질환에 대항하는 보호", "방어 면역", "기능적 면역" 및 유사한 어구는, 질환 또는 감염에 노출된 비-면역화된 대상자에서 예상될 수 있는 것 보다 적은 유해한 효과를 야기하는, 본 발명의 하나 이상의 치료적 조성물, 또는 이의 조합의 투여에 의해 생성되는 질환 또는 상태에 대항하는 반응을 의미한다. 즉, 감염의 유해한 효과의 중증도는 백신접종된 대상자에서 완화된다. 감염은 백신접종된 대상자에서 감소되거나, 느리게 되거나, 가능하게는 완전히 예방될 수 있다. 여기서, 감염의 완전한 예방을 의미하는 경우, 이는 명확하게 기재된다. 완전한 예방이 기재되지 않는 경우, 용어는 부분적 예방을 포함한다.
여기서, "임상적 징후의 발생정도 및/또는 중증도의 감소" 또는 "임상적 증상의 감소"는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 그룹에서 감염된 대상자의 수의 감소, 감염의 임상적 징후를 나타내는 대상자의 수의 감소 또는 줄임, 또는 야생형 감염과 비교하여 하나 이상의 대상자에서 존재하는 임의의 임상적 징후의 중증도의 감소를 의미한다. 예를 들면, 병원균 적재의 감소, 병원균 흘림, 병원균 전염의 감소, 또는 PEDV의 임의의 임상적 징후 증상의 감소를 언급하여야 한다. 바람직하게는 이들 임상적 징후는 본 발명의 치료학적 조성물을 투여받는 하나 이상의 대상자에서 조성물을 투여받지 않고 감염된 대상자와 비교하여 적어도 10% 감소된다. 보다 바람직하게는 임상적 징후는 본 발명의 조성물을 투여받는 대상자에서 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 및 더욱 보다 바람직하게는 적어도 50% 감소된다.
본원에 기재된 용어 "증가된 보호"는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 대상자의 백신접종된 그룹 대 대상자의 비-백신접종된 대조군 그룹에서 각각 감염성 인자(agent), 바람직하게는 PEDV에 의한 감염과 관련된 하나 이상의 임상적 증상의 통계적으로 유의한 감소를 의미한다. 용어 "임상적 증상의 통계적으로 유의한 감소"는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 대상자의 백신접종된 그룹의 적어도 하나의 임상적 증상의 발생정도의 빈도가 감염성 인자를 사용한 접종 후 비-백신접종된 대조군 그룹에서 보다 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 보다 바람직하게는 30%, 더욱 보다 바람직하게는 50%, 및 더욱 보다 바람직하게는 70% 더 낮다는 것을 의미한다.
"장기간 지속되는 보호"는 적어도 3주, 그러나 보다 바람직하게는 적어도 3개월, 또한 보다 바람직하게는 적어도 6개월 동안 지속되는 "개선된 효능"을 언급하여야 한다. 가축의 경우, 장기간 지속되는 보호가 동물이 고기용으로 시판되는 평균 연령까지 지속되어야 하는 것이 가장 바람직하다.
"면역원성 또는 면역학적 조성물"은, 조성물에 대한 세포 또는 항체-매개된 면역 반응의 숙주에서 면역학적 반응을 도출하는, 적어도 하나의 돼지 유행성 설사 바이러스, 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 물질의 조성물을 언급한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도하고, 보다 바람직하게는, PEDV 감염의 하나 이상의 임상적 징후에 대항하여 방어 면역을 부여한다.
본 발명에 사용된 면역원성 조성물은 또한 본 발명의 기재된 PEDV 스파이크 단백질 중 어느 것을 포함하는 조성물을 언급한다. 추가의 양태에 따라서, 이러한 면역원성 조성물은 추가로 적어도 상기 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바큘로바이러스의 부분을 포함한다. 또한, 면역원성 조성물은 i) 바람직하게는 상기한 농도의 상기한 PEDV 단백질 중 어느 것, ii) 상기 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의, 바람직하게는 재조합 바큘로바이러스의 적어도 부분, 및 iii) 세포 배양 상청액의 부분을 포함할 수 있다.
이에 따라 하나의 측면에 따라서, 본 발명은 상기 돼지(들)에게 PEDV 스파이크 항원 또는 PEDV 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 돼지의 집단에서 PEDV 감염의 백분율을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 여기서, PEDV 항원은 재조합 PEDV 스파이크 항원, 바람직하게는 바큘로바이러스 발현된 PEDV 스파이크 단백질이다. 바람직하게는 이들 재조합 또는 바큘로바이러스 발현된 PEDV 스파이크은 본 발명의 기재된 서열을 갖는다.
"면역 반응" 또는 "면역학적 반응"은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 조성물 또는 관련 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 발달을 의미한다. 보통, 면역 또는 면역학적 반응은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하나 이상의 다음 효과를 포함한다: 조성물 또는 관련 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 특이적으로 지시되는, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생산 및 활성. 바람직하게는, 숙주는 치료적 또는 방어적 면역학적 (기억) 반응을 나타내어 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고 및/또는 질환의 임상적 중증도는 감소될 것이다. 이러한 보호는 증상의 수, 증상의 중증도의 감소, 또는 병원균의 감염에 관련된 증상 중 하나 이상의 결핍, 바이러스혈증의 개시의 지연, 감소된 바이러스 지속성, 전체 바이러스 적재 감소 및/또는 바이러스 배출(excretion)을 나타낼 것이다.
본원에 사용된 "약제학적- 또는 수의학적-허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 배지, 코팅, 애쥬번트, 안정화제, 희석제, 보존제, 항박테리아 및 항진균 제제, 등장성제제, 흡수 지연 제제 등을 포함한다. 몇몇 바람직한 양태 및 특히 동결건조된 면역원성 조성물을 포함하는 것에서, 본 발명에서 사용하기 위한 안정화제는 동결건조 또는 냉동 건조를 위한 안정화제를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 애쥬번트를 포함한다. 본원에 사용된 "애쥬번트"는 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트, 사포닌, 예를 들면, Quil A, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 수중유중수(water-in-oil-in-water) 에멀젼을 포함할 수 있다.
에멀젼은 특히 라이트 리퀴드(light liquid) 파라핀 오일(European Pharmacopea type); 이소프레노이드 오일, 예를 들면, 스쿠알란 또는 스쿠알렌; 알칸, 특히 이소부텐 또는 데켄의 올리고머화로부터 수득된 오일; 선형 알킬 그룹을 포함하는 산 또는 알콜의 에스테르, 보다 특히 식물 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기재로 할 수 있다. 오일은 유화제와 조합하여 사용되어 에멀젼을 형성한다. 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄, 만나이드(예를 들면, 안하이드로만니톨 올레에이트), 글리콜, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르(이들은 임의로 에톡실화됨), 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히 플루로닉(Pluronic) 생성물, 특히 L121이다. 문헌을 참조한다[참조: Hunter et al. The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al. Vaccine 15:564-570 (1997)]. 예시적인 애쥬번트는 문헌에 기재된 SPT 에멀젼 및 에멀젼 MF59이다[참조: the SPT emulsion described on page 147 of "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, and the emulsion MF59 described on page 183 of this same book].
적합한 수중유 에멀젼의 예는 EMULSIGEN® 기반 애쥬번트, 예를 들면, EMULSIGEN®(수중유 에멀젼 o/w), EMULSIGEN-D®(수중유(o/w)(디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA)를 포함), EMULSIGEN-P®(수중유(o/w)(등록상표 면역자극제를 포함), EMULSIGEN-75®(수중유(o/w)로 이루어진 이중 애쥬번트, 가교-결합된 중합체 포함), 및 EMULSIGEN®-BCL(동물 기원 성분이 없는 수중유 에멀젼)이다(MVP Laboratories, Inc. Omaha, Nebr., USA). 불활성화 PEDV 또는 재조합 PEDV 단백질을 포함하는 약제학적/백신 조성물은, 수중유 에멀젼, 바람직하게는 이러한 EMULSIGEN®-기재 애쥬번트, 보다 바람직하게는 EMULSIGEN®(수중유 에멀젼 o/w) 및/또는 EMULSIGEN®-BCL(동물 기원 성분이 없는 수중유 에멀젼)으로 효율적으로 보조제 첨가되었다.
수의학적 백신에서 사용하기 위해 적합한 흡착성 알루미늄 하이드록사이드 겔의 예는 REHYDRAGEL®, REHYDRAGEL-CG®; REHYDRAGEL-LV; REHYDRAGEL-HPA; REHYDRAPHOS(General Chemical, Berkeley Heights, New Jersey, USA)를 포함한다.
애쥬번트의 추가의 예는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이다. 유리한 애쥬번트 화합물은 특히 당의 폴리알케닐 에테르 또는 폴리알콜과 가교-결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 용어 카보머로 공지되어 있다[참조: Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996]. 당해 기술 분야의 숙련가는 또한 폴리하이드록시화 화합물과 가교-결합된 이러한 아크릴산 중합체를 기술하는 미국 특허 제2,909,462호를 언급할 수 있고, 여기서, 폴리하이드록시화 화합물은 적어도 3개 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실 그룹을 갖고, 적어도 3개의 하이드록실의 수소 원자가 적어도 2개의 탄소원자를 갖는 불포화된 지방족 라디칼로 대체된다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소원자를 포함하는 것, 예를 들면, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌성 불포화된 그룹을 포함하는 것들이다. 불포화된 라디칼 자체는 다른 치환체, 예를 들면, 메틸을 포함할 수 있다. 상표명 CARBOPOL.RTM.(또한 폴리아크릴산으로서 공지됨); (BF Goodrich, Ohio, USA)로 판매되는 제품이 특히 적합하다. 이들은 알릴 공급원 또는 알릴 펜타에리트리톨로 가교-결합된다. 그중에서도, CARBOPOL.RTM. 974P(또한 폴리아크릴산으로서 공지됨), CARBOPOL.RTM. 934P(또한 폴리아크릴산으로서 공지됨) 및 CARBOPOL.RTM. 971P(또한 폴리아크릴산으로서 공지됨)으로 언급될 수 있다. CARBOPOL.RTM. 971P(또한 폴리아크릴산으로서 공지됨)를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체 중에서, 말레산 무수물 및 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA(Monsanto)가 언급된다. 이들 중합체의 수용해는 산 용액을 야기하고, 이는 바람직하게는 생리학적 pH로 중성화되어, 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물 자체가 도입될 애쥬번트 용액을 제공할 것이다.
추가로 적합한 애쥬번트는, 이에 제한되는 것은 아니지만, RIBI 애쥬번트 시스템(Ribi Inc.), 블록 공-중합체(CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.), 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 애쥬번트, 이. 콜라이(E. coli)로부터 열-불안정성 장독소(재조합 또는 그외), 콜레라 독소, 또는 무라밀 디펩타이드를 다수 다른 것들 중에서도 포함한다.
애쥬번트가 용량당 약 100μg 내지 약 10mg의 양으로, 바람직하게는 용량당 약 100μg 내지 약 10mg의 양으로, 보다 바람직하게는 용량당 약 500μg 내지 약 5mg의 양으로, 더욱 보다 바람직하게는 용량당 약 750μg 내지 약 2.5mg의 양으로, 및 가장 바람직하게는 용량당 약 1mg의 양으로 첨가될 수 있다는 것이 예상된다. 대안적으로, 애쥬번트는, 최종 생산물의 용적을 기준으로 하여, 약 0.01 내지 50%의 농도로, 바람직하게는 약 2% 내지 30%의 농도로, 보다 바람직하게는 약 5% 내지 25%의 농도로, 또한 보다 바람직하게는 약 7% 내지 22%의 농도로, 및 가장 바람직하게는 10% 내지 20%의 농도로 존재할 수 있다.
"희석제"는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장성제제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토스를 그중에서도 포함할 수 있다. 안정화제는 알부민 및 에틸렌디아민테트라세트산의 알칼리 염을 그중에서도 포함한다.
본원에 사용되는 용어로서 "단리된"은 이의 천연 상태로부터 "사람의 손에 의해" 변경된 것을 의미하고, 즉, 자연에서 발생하는 경우, 원래 환경으로부터 변화되거나 제거되거나, 또는 그 둘 다이다. 예를 들면, 살아있는 유기체에서 자연에서 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드는 "단리"되지 않지만 이의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드는 "단리"된다.
"안전성"은 백신접종된 동물에서 백신접종 후 유해한 결과의 부재를 언급하고, 유해한 결과는 이에 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: 독성에 대한 바이러스-기재 백신의 잠재적 복귀(reversion), 임상적으로 유의한 부작용, 예를 들면, 지속적인, 전신 병 또는 백신 투여 부위의 허용되지 않는 염증.
본 발명에 사용된 용어 "백신접종" 또는 "백신접종하는" 또는 이의 변형은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여를 포함하는 과정을 의미하고, 동물에게 투여하는 경우, PEDV에 대항하는 동물에서 면역 반응을 도출하거나 -직접적으로 또는 간접적으로- 도출할 수 있다.
"사망률"은, 본 발명의 문맥내에서, PEDV 감염에 의해 야기된 사망을 언급하고, 감염이 매우 심각하여 동물은 고통을 방지하기 위해 안락사시키고, 사람은 생을 마감하는 상황을 포함한다.
여기서, "효과적인 용량"은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 항원이 투여되는 동물에서 임상적 증상의 감소를 야기하는, 면역 반응을 도출하거나 도출할 수 있는 항원의 양을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은, 조성물의 문맥에서, 동물에서 감염 또는 질환 사건의 발생정도를 감소시키거나 이의 중증도를 완화시키는 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 양을 의미한다. 특히, 유효량은 용량당 집락 형성 단위(CFU)를 언급한다. 대안적으로, 치료제의 문맥에서, 용어 "유효량"은 질환 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 기간을 감소 또는 개선시키고, 질환 또는 장애의 진행을 예방, 질환 또는 장애의 회귀를 야기하고, 질환 또는 장애에 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발병, 시작, 또는 진행을 예방하고, 또는 또다른 치료제 또는 치료적 제제의 예방 또는 치료를 향상 또는 개선시키는데 충분한 치료제의 양을 언급한다.
당해 기술 분야에 공지된 "서열 동일성"은 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 참조 서열 및 참조 서열과 비교되는 소정의 서열 간의 관계를 언급한다. 서열 동일성은, 가장 높은 정도의 서열 유사성을 생산하도록 서열이 최적으로 정렬된 후, 이러한 서열의 스트링 간의 매치에 의해 측정하여 소정의 서열을 참조 서열과 비교하여 측정한다. 이러한 정렬시, 서열 동일성은 위치-바이-위치 기준(position-by-position basis)에 따라서 확인하고, 예를 들면, 특정한 위치에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 동일한 경우, 서열은, 특정한 위치에서 "동일"하다. 이에 따라, 이러한 위치 동일성의 총 수를 참조 서열에서 뉴클레오티드 또는 잔기의 총 수로 나누어 % 서열 동일성을 수득한다. 서열 동일성은 이에 제한되는 것은 아니지만, 문헌에 기재된 것을 포함하는 공지된 방법으로 용이하게 계산할 수 있고[참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)], 문헌의 교시는 참조로서 본원에 포함된다. 서열 동일성을 측정하는 바람직한 방법은 시험된 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 서열 동일성을 측정하는 방법은 소정의 서열 간의 서열 동일성을 측정하는 공용으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 성문화(codified)된다. 이러한 프로그램의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, GCG 프로그램 패키지[참조: Devereux, J., et al. Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)], BLASTP, BLASTN 및 FASTA[참조: Altschul, S. F. et al. J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)]를 포함한다. BLAST 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원으로부터 공용 이용가능하고[참조: BLAST Manual, Altschul, S. et al. NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al. J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)], 문헌의 교시는 참조로서 본원에 포함된다. 이들 프로그램은 최적으로 디폴트 갭 웨이트를 사용하여 주어진 서열 및 참조 서열 간의 가장 높은 수준의 서열 동일성을 생산하도록 서열을 정렬한다. 예시에서와 같이, 참조 뉴클레오티드 서열에 대해, 적어도, 예를 들면, 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 보다 바람직하게는 95% "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해, 소정의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은, 소정의 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100 뉴클레오티드 당 15 이하, 바람직하게는 10 이하, 더욱 보다 바람직하게는 5 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 참조 서열과 동일하다는 것을 의도한다. 다시 말해, 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 보다 바람직하게는 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에서, 참조 서열에서 15%, 바람직하게는 10%, 더욱 보다 바람직하게는 5% 이하의 뉴클레오티드는 또다른 뉴클레오티드로 결실되거나 치환될 수 있고, 또는 참조 서열에서 총 뉴클레오티드 중 뉴클레오티드의 수 15% 이하, 바람직하게는 10%, 더욱 보다 바람직하게는 5%는 참조 서열 내로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 돌연변이는 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이의 어느곳에서 발생할 수 있거나, 참조 서열에서 뉴클레오티드 중에서 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 그룹에서 배치될 수 있다. 유사하게, 참조 아미노산 서열과 적어도, 예를 들면, 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 보다 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 소정의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 의해, 폴리펩타이드의 소정의 아미노산 서열이, 소정의 폴리펩타이드 서열이 참조 아미노산 서열의 각 100 아미노산당 15 이하, 바람직하게는 10 이하, 더욱 보다 바람직하게는 5 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 참조 서열과 동일하다는 것이 의도된다. 다시 말해, 참조 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 보다 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 소정의 폴리펩타이드 서열을 수득하기 위해, 참조 서열에서 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 보다 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 잔기는 결실되거나 또다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 또는 참조 서열에서 아미노산 잔기의 총 수 중 아미노산 수 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 보다 바람직하게는 5% 이하는 참조 서열 내로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이러한 변경은 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 간의 어느 곳에서 발생할 수 있고, 참조 서열에서 잔기 중에서 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 그룹에서 배치될 수 있다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환과 상이하다. 그러나, 보존적 치환은 서열 상동성을 측정하는 경우 매치로서 포함되지 않는다.
"보존적 치환(conservative substitution)"은, 전체 관능성을 유의하게 변경시키지 않도록 하는, 아미노산 잔기 또는 사이즈, 소수성 등을 포함하는 유사한 특징 또는 특성을 갖는 또다른 아미노산 잔기로 치환을 언급한다.
본원에 사용된 "서열 상동성"은, 보존적 치환을 디스카운트하는(discounting) 2개의 서열의 관련성을 측정하는 방법을 언급한다. 서열 상동성을 측정하기 위해, 2개 이상의 서열은 최적으로 정렬되고, 갭이 필요한 경우 도입된다. 다시 말해, 참조 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 수득하기 위해, 참조 서열에서 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 보다 바람직하게는 95%의 아미노산 잔기는 매치되거나 또다른 아미노산을 갖는 보존적 치환을 포함하여야 하고, 또는 참조 서열에서 보존적 치환을 포함하지 않는 총 아미노산 잔기의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 보다 바람직하게는 5% 이하의 아미노산의 수는 참조 서열 내로 삽입될 수 있다. 바람직하게는 상동성 서열은 적어도 50, 더욱 보다 바람직하게는 100, 더욱 보다 바람직하게는 250, 더욱 보다 바람직하게는 500 스트레치(stretch)의 아미노산을 포함한다.
용어 "서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 측정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다는 것이 본원에 정의된다(예를 들면, 갭은 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산의 서열 내에 제2 아미노 또는 핵산 서열과 함께 도입될 수 있다). 이에 따라, 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기는 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 위치에서 비교된다. 제1 서열에서 위치가 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기에 의해 제2 서열에서 상응하는 위치로 점유되는 경우, 분자는 상기 위치에서 동일하다. 2개의 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수(즉, 중복 위치) x 100). 바람직하게는, 2개의 서열은 동일한 길이이다. 서열 동일성이 단백질에 관하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다고 인식되고, 여기서, 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기 대신에 치환되고, 따라서 분자의 기능적 특성은 변화되지 않는다. 서열은 보존적 치환이 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존적 특성을 수정하기 위해 향상 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 언급된다.
서열 비교는 비교되는 2개의 서열의 전체 길이를 넘어서서(over) 또는 2개의 서열의 단편을 넘어서서 수행될 수 있다. 전형적으로, 비교는 비교되는 2개의 서열의 전체 길이를 넘어서서 수행될 것이다. 그러나, 서열 동일성은, 예를 들면, 20, 50, 100 또는 그 이상의 인접한 아미노산 잔기의 영역을 넘어서서 수행될 수 있다.
숙련가들은 수개의 상이한 컴퓨터 프로그램이 2개의 서열간의 상동성을 측정하는데 이용가능하다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 서열 비교 및 2개의 서열간의 퍼센트 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 양태에서, 2개의 아미노산 또는 핵산 서열간의 퍼센트 동일성은 Accelrys GCG 소프트웨어 패키지(http://www.accelrys.com/products/gcg/에서 이용가능함)에서 GAP 프로그램에 도입된 니들맨 및 운쉬(Needleman and Wunsch)[참조: J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)] 알고리즘을 사용하여 측정하고, Blosum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 웨이트(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 웨이트(length weight)를 사용한다. 숙련가들은 모든 이러한 상이한 파라미터가 상이한 알고리즘을 사용하는 경우 약간 다른 결과를 수득할 것이지만, 2개의 서열의 전체 퍼센트 동일성은 실질적으로 변경되지 않는다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 단백질 서열 또는 핵산 서열은 추가로 공용 데이터베이스에 대해 검색을 수행하기 위해, 예를 들면, 다른 부류 구성원 또는 관련된 서열을 확인하기 위해 "쿼리 서열(query sequence)"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌[참조: Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램(버젼 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 BLASTP 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3을 사용하여 수행하여 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 입수할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭(gapped) 정렬을 수득하기 위해, 갭(Gapped) BLAST를 문헌에 기재된 것과 같이 이용할 수 있다[참조: Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402]. BLAST 및 갭(Gapped) BLAST 프로그램을 사용하여, 각 프로그램(예를 들면, BLASTP 및 BLASTN)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 다음 홈페이지를 참조한다[참조: the National Center for Biotechnology Information at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/].
본 발명의 주장된 PEDV는 또한 PEDV 단리물 1251-125-10("125-10")의 변이체 및 이의 서브-단편의 변이체를 포함하여야 한다. 이러한 변이체는 오클라호마 세포주(서열 번호 1 및 15)의 특징과 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 갖는다. 용어 "본질적으로 동일한 면역학적 특성을 갖는"은 (이에 제한되는 것은 아니지만) 상기 변이체가 하기한 PEDV에 의해 야기되는 임상적 징후를 치료 또는 예방하거나 하기한 효능 파라미터를 개선하는데 본질적으로 효과적이라는 것을 포함한다.
서열 번호 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 및 15(예를 들면, 폴리펩타이드 또는 핵산 서열)에 대한 용어 "변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 의미하는 것을 의도한다. 개방 판독 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 대해, 변이체는 유전 암호의 축중으로 인해 비변성 단백질의 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 이들 서열을 포함한다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 또한 합성 유도된 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 위치-지시된 돌연변이유발을 사용하여 생성되고 개방 판독 프레임에 대해, 비변성 단백질을 암호화하는 것들, 뿐만 아니라 코돈 최적화를 목적으로 비변성 단백질에 관련하여 아미노산 치환을 갖는 폴리펩타이드 암호화하는 것들을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체는 표준 파라미터를 사용하는 기술된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 참조 서열과 비교하여 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.9%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1% , 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%. 99.99% 서열 동일성을 가질 것이다.
당해 기술 분야에 공지된 용어 "유전자그룹"은 속(genus) 내의 관련된 바이러스를 언급하고; 이는 추가로 유전 클러스터로 세분될 수 있다. PEDV의 확인된 유전자그룹은 하위그룹 G1a, G1b, R(약독화된/조정된)을 포함하는 그룹 G1; 및 하위그룹 G2a, 및 G2b를 포함하는 G2를 포함한다. G2a 유전자그룹의 구성원은 중국 세포주 AH2012(진뱅크 수탁 번호: KC210145) 및 북미 세포주를 포함하고, 수개의 고유한 뉴클레오티드 변화를 공유한다. 세포주 MN 및 IA2는 각각 AH2012와 99.6% 뉴클레오티드 동일성을 갖고, 세포주 IA1는 99.5% 뉴클레오티드 동일성을 갖는다. 연구자는 AH2012-유사 바이러스가 가능하게는 동중국 지역으로 전염되고, 이어서, 미국으로 운반되고, 아마도 북미 세포주와 가장 밀접한 선조인 것을 추측한다. 유전자그룹 2a의 구성원은 유전자그룹 1a의 원형 PEDV 세포주 CV777과 단지 대략적으로 96.9% 유사성을 공유한다[참조: Bridgen, et al. 1993; Huang et al. 2013; 진뱅크: AF353511.1]. 이와 같이, 역사적 CV777-유도된 G1a 세포주 또는 DR13-유도된 G1b 세포주에 기반하는 약독화된 PEDV 백신은 신생의 중국 및 북미 G2a PEDV 세포주와 항원과 관련하여서는 덜 관련될 수 있다.
밀접하게 관련된 북미 단리물 US/콜로라도/2013(진뱅크 수탁 번호: KF272920.1)은 또한 문헌[참조: Marthaler et al. 2013]에 의해 보고되었다. 상기 북미 단리물과 유사하게 CO/13의 완전한 PEDV 게놈은 진뱅크에서 이용가능한 다른 완전한 PEDV 게놈과 96.5 내지 99.5%의 뉴클레오티드 동일성을 갖고, 중국 세포주 AH2012(진뱅크 수탁 번호. KC210145)와 가장 높은 뉴클레오티드 동일성(99.5%)을 갖는다. 중국 세포주 AH2012는 2a 유전자그룹의 구성원이다. 북미 단리물 CO/13의 완전한 게놈을 PEDV 참조 세포주 CV777의 것과 비교하면, CO/13은 1-뉴클레오티드 삽입(위치 48에서) 및 5'UTR에서 5 뉴클레오티드의 결실(위치 73 및 83 내지 86에서)을 포함하는 반면, 스파이크 유전자는 16 뉴클레오티드의 삽입(위치 20804, 20810 내지 20820, 20843, 및 21053 내지 21055) 및 7 뉴클레오티드의 결실(위치 20853 및 21118 내지 21124)를 포함함을 나타낸다.
용어 "북미 기원의 PEDV"는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 15를 포함하는 PEDV 단리물, 및/또는 서열 번호 1과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 임의의 PEDV 단리물, 및/또는 서열 번호 1의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일한 것, 및/또는 스파이크 단백질이 서열 번호 13에 의해 암호화되는 PEDV 단리물, 및/또는 스파이크 단백질이 서열 번호 13과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 임의의 PEDV 단리물, 및/또는 발현된 스파이크 단백질이 서열 번호 14와 적어도 90% 상동성을 갖는 임의의 PEDV 단리물을 의미한다.
용어 "클레드(clade)"는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 계통수에서 선조 및 모든 이의 후손, 단일 "가치(branch)"로 이루어진 그룹을 언급한다. 선조는 예로서 개체, 집단 또는 종일 수 있다. 유전자그룹은 다중 클레드를 포함할 수 있고, 예를 들면 AH2012는 북미 단리물과 상이한 클레드로 존재한다.
추가의 양태에 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 기재된 이러한 핵산 분자 중 어느 것을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 달리 말하면, 본 발명은 임의의 이러한 스파이크, M, E, N PEDV 단백질, 또는 이들의 부분의 코딩 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 벡터는 발현 벡터이고, 이는 임의의 이러한 스파이크, M, E, 및/또는 N PEDV 단백질 또는 단백질의 부분의 발현을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 벡터는 시험관내 또는 생체내 박테리아, 효모 또는 동물 세포의 형질감염 또는 감염에 적합한 것이다.
벡터 및 발현을 위해 벡터(또는 재조합)을 제조 및/또는 사용하는 방법은 하기 기재된 방법에 의하거나 또는 이와 유사할 수 있다: 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호, 제5,174,993호, 제5,505,941호, 제5,338,683호, 제5,494,807호, 제4,722,848호, 제5,942,235호, 제5,364,773호, 제5,762,938호, 제5,770,212호, 제5,942,235호, 제382,425호, PCT 공보 WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996; Smith et al., 미국 특허 제4,745,051호(recombinant baculovirus); Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406; EPA0 370 573; 미국 출원 제920,197호, 1986년 10월 16일에 출원; EP 특허 공보 제265785호; 미국 특허 제4,769,331호(recombinant herpesvirus); Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996; Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996; Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996; Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; 미국 특허 제5,591,439호, 제5,552,143호; WO 98/00166; 허여된 미국 출원 시리즈 번호 제08/675,556호, 및 08/675,566호, 둘 다 1996년 7월 3일에 출원(recombinant adenovirus); Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; PCT WO 91/11525; Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; and McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996; 및 미국 특허 제5,591,639호, 제5,589,466호, 및 제5,580,859호, 뿐만 아니라 WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660; Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, inter alia. See also WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system); Sanford et al., 미국 특허 제4,945,050호; Fischbachet al. (Intracel); WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems); Szoka et al., 미국 특허 제4,394,448호(method of inserting DNA into living cells); McCormick et al., 미국 특허 제5,677,178호(use of cytopathic viruses); 및 미국 특허 제5,928,913호(vectors for gene delivery); 뿐만 아니라 본원에 인용된 다른 문헌.
바람직한 바이러스 벡터는 바큘로바이러스, 예를 들면, BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.)를 포함하고, 특히 단 생산 세포는 곤충 세포이다. 바큘로바이러스 발현 시스템이 바람직하지만, 당해 기술 분야의 숙련가에게 다른 발현 시스템이 본 발명의 목적을 위해 실행될 것이다(즉 HG의 세포 배양물 상청액으로의 발현)는 것이 이해될 것이다. 이러한 다른 발현 시스템은 배지내로의 H5 발현을 야기하기 위해 시그널 서열의 사용을 필요로 할 수 있다.
효과적인 용량:
본 발명의 기재된 화합물은 PEDV-관련 질환을 예방하기 위해 대상자에게 치료학적으로 효과적인 용량으로 투여할 수 있다. 용량은 백신을 투여받는 숙주, 뿐만 아니라 인자 예를 들면, 숙주의 사이즈, 체중, 및 연령에 좌우될 것이다.
제형에서 사용되는 본 발명의 면역원성 조성물의 정확한 양은 투여 경로 및 대상자의 특성(예를 들면, 연령, 사이즈, 질환의 단계/수준)에 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 표준 임상적 기술에 따른 각 대상자의 환경에 따라서 좌우되어야 한다. 효과적인 면역화 양(immunizing amount)은 대상자에서 PEDV 감염성 질환을 치료 또는 예방하는데 충분한 양이다.
조성물의 면역원성은 조성물로 면역화한 후 시험 대상자의 면역 반응을 당해 기술 분야에 공지된 임의의 면역검정을 사용하여 모니터링하여 측정할 수 있다. 체액성(항체) 반응 및/또는 세포-매개된 면역의 생성은 면역 반응의 징후로서 간주될 수 있다. 시험 대상자는 동물, 예를 들면, 돼지, 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 래빗, 소, 말, 양, 가금(예를 들면, 닭, 오리, 거위, 및 칠면조), 및 사람을 포함할 수 있다.
시험 대상자의 면역 반응은 다음과 같은 다양한 접근법으로 분석될 수 있다: 면역원성 접합체에 대한 수득한 면역 혈청의 반응성, 공지된 기술, 예를 들면, 효소 결합 면역흡착제 검정(ELISA), 면역블롯, 면역침강반응, 바이러스 중화, 등에 의해 검정됨; 또는, 면역화된 숙주를 병원균에 의한 감염으로부터 보호 및/또는 면역화된 숙주에서 병원균에 의한 감염으로 인한 증상의 약독화, 감염성 질환 인자의 수준, 예를 들면, 바이러스 수준(예를 들면, 대상자로부터의 샘플을 배양함에 의해)을 검정하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 방법, 또는 당해 기술 분야에 공지된 다른 기술으로 측정됨. 감염성 질환 인자의 수준은 또한 이에 대항하여 면역글로불린은 지시되는 항원의 수준을 측정하여 결정될 수 있다. 감염성 질환의 제제의 수준의 감소 또는 감염성 질환의 증상의 개선은 조성물이 효과적임을 나타낸다.
본 발명의 치료제는 동물에서 생체내 사용 전에 목적하는 치료적 또는 예방적 활성을 위해, 시험관내 시험될 수 있다. 예를 들면, 특정한 치료제의 투여가 지시되는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 시험관내 검정은 시험관내 세포 배양 검정을 포함하고, 여기서, 특정한 질환 또는 장애를 갖는 세포주로부터의 적합한 세포 또는 대상자로부터 배양된 세포는 치료제에 노출되거나 그렇지 않으면 투여되고, 세포에 미치는 치료제의 효과가 관찰된다.
대안적으로, 치료제는 치료제를 감염성 질환 인자에 의해 감염에 민감하지만 감염성 질환 인자로 감염되지 않은 세포(대상자로부터 또는 배양된 세포주로부터 배양됨)에 접촉시키고, 세포를 감염성 질환 인자에 노출시키고, 이어서, 치료제와 접촉한 세포의 감염율이 치료제와 접촉하지 않은 세포의 감염율 보다 낮은지를 측정하여 검정될 수 있다. 감염성 질환 인자로 세포의 감염은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 검정될 수 있다.
추가로, 치료제는 이에 대항하여 항체가 동물 모델 또는 사람 대상자에서 적합한 시간 간격 동안 치료 이전, 도중, 또는 이후에 지시된 분자의 수준을 측정하여 검정될 수 있다. 분자의 양의 임의의 변화 또는 변화 부재는 확인될 수 있고, 대상자에 미치는 치료의 효과와 상관관계가 있다. 분자의 수준은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 PEDV에 대한 동물의 백신접종 후, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 결합 검정은 수득한 항체 및 특정한 분자 간의 결합을 검정하기 위해 사용될 수 있다. 이들 검정은 또한 특정한 항원에 대한 더 높은 친화도 또는 특이성을 나타내는 항체를 선택하기 위해 수행될 수 있다.
대상자에게 투여:
바람직한 투여 경로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 비내, 경구, 피내, 및 근육내를 포함한다. 숙련된 기술자는 본 발명의 조성물이 또한 1개, 2개 또는 그 이상의 용량으로, 뿐만 아니라, 다른 투여 경로로 투여될 수 있다는 것을 인지할 수 있다. 예를 들면, 이러한 다른 경로는 피하, 피내, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 복강내, 경막내, 기관내, 피내, 심장내, 폐내(intralobally), 척수내, 허파속(intrapulmonarily), 및 질내를 포함한다. 목적하는 기간 및 치료 효과에 좌우되어, 본 발명에 따른 조성물은 1회 또는 수회 또한 간헐적으로, 예를 들면, 수일, 주수, 또는 수개월 동안 매일 기준으로 그리고 다양한 용량으로 투여될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 예시하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실행에서 잘 기능하도록 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 이에 따라, 이의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것이 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 인지될 것이다. 그러나, 당해 기술 분야의 숙련가는 본 발명의 개시를 고려하여, 다수의 변화가 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정한 양태로 만들어질 수 있고 여전히 유사한 결과를 수득될 수 있다는 것을 인지하여야 한다.
실시예
실시예 1: 불활성화 PEDV 세포주의 단리 및 생산
돼지 유행성 설사 바이러스 백신, 사멸 바이러스를 생산하기 위해, PEDV(단리물)의 마스터(master) 시드 배양물을 먼저 생산하였다. 이러한 마스터 시드로부터, PEDV의 배양물을 성장시키고, 이어서, 불활성화시켰다. 이어서, 불활성화된 바이러스 배양물을 애쥬번트와 혼합하여 돼지 유행성 설사 바이러스 백신을 생산하였다. 하기 방법을 사용하여 돼지 유행성 설사 바이러스 백신을 생산하였다.
극심한 설사를 나타내는 동물 또는 동물로부터의 조직을 2013년에 획득하였다. 점막 찰과로부터 쇄균액(Homogenates)을 이들 동물로부터 생성하고, 0.2마이크론 시린지 필터를 통해 여과하고, 여과물을 사용하여 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO)를 접종하였다. 바이러스를 변형된 MEM, 돼지 트립신, 트립토스 포스페이트 브로쓰, 효모 추출물 및 HEPES 완충액을 포함하는 PEDV 유지 배지의 존재하에 성장시켰다. 바이러스 성장을 평가하고, 고유한 합포체 형성 및 세포 단층의 융합 에 대해 점검하여 시각화하였다(visualized). CPE 양성 물질을 Illumina-기반 MiSeq 기술을 사용하여 서열분석을 수행하였다.
PEDV 마스터 시드 바이러스 배양물("PEDV MSV")을 생산하기 위해, 돼지 유행성 설사 바이러스 세포주(단리물)(PEDV 단리물)를 BI 베로 세포에서 단리하고, BI 베로 세포에서 총 19번 계대(pass)시키고, 이어서, 바이러스를 2013 EU 베로 세포에서 계대(passage) 30까지 성장시켰다. 바이러스의 30번 계대를 희석하고, 마스터 시드 바이러스 지정된 PEDV KV-1251-125-10-OK로서 내려놓았다(put down).
마스터 시드 바이러스로부터, PEDV(KV-1251-125-10-OK, "125-10"로서 본원에 언급됨)의 배양물은 2013 EU 베로 세포를 PEDV KV-1251-125-10-OK MSV를 사용하여 변형된 최소 필수 배지, 돼지 트립신(10μg/ml), 트립토스 포스페이트 브로쓰(0.3%), 효모 추출물(0.02%) 및 1M HEPES 완충액(2.5%)을 포함하는 PEDV 유지 배지에서 감염시켜 생산하였다. 2013 EU 베로 세포는 전형적으로 PEDV (125-10) MSV로 최저 용량 104 TCID50 /850㎠ 회전병에서 감염시켰다. 이러한 배양물은 멸균 일회용 회전병에서 또는 미세담체 비즈 상에서 성장될 수 있다. 배양물은 세포변성 효과("CPE")가 관찰될 때까지 36℃±2℃에서 24 내지 48시간 동안 인큐베이팅하였다. 전형적으로, 고유한 합포체를 감염 12시간 내에 발견할 수 있고, 합포체를 확장시키고, 세포 단층을 24 내지 48시간 융합시키고, 이어서, 세포를 슬로잉(sloughing)하였다. 인큐베이팅 동안, 배양물을 PEDV 유래된 CPE에 대해 모니터링하여 순수한 PEDV 세포주를 보장하였다. 비정형 CPE가 관찰되거나, 임의의 육안 또는 현미경적 증거의 오염이 존재하는 경우, 배양물은 폐기되었다. 순수한 바이러스 배양물을 무균성으로 멸균 폴리프로필렌 카보이 내로 수거하였다. 바이러스를 냉동 융해시켜 세포 관련 비리온을 방출시키고, 원심분리 또는 0.45 마이크론 이어서 0.2 마이크론의 필터를 통한 여과로 정화하였다. 벌크 바이러스 수거 유체를 시험하여 불활성화 전에 미코플라스마의 부재를 보장하였다. 즉시 불활성화되지 않은 수거된 유체는 -70℃ 이하에서 보관하였다.
수거된 유체의 용적을 측정하고, 유체의 온도는 36±2℃이 된다. 2-브로모에틸렌아민(BEA)의 0.4M 용액을 0.3 N NaOH의 스톡 용액과 함께 혼합하여 이성분 에틸렌이민(BEI) 스톡 용액을 생성하고, 이어서, 이를 수거 유체에 첨가하여 BEI의 최종 농도 5mM를 수득한다. 유체를 계속하여 최소 24시간 동안 교반한다. 5mM의 최종 최저 농도를 수득하기 위해 1.0M 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 임의의 잔류 BEI를 중화시킨다. 불활성화된 유체를 -70±3℃에서 장기간 동안 또는 4±3℃에서 단기간 동안 보관할 수 있다.
BEI로 처리 후, 배양물을 PEDV의 CPE 정형을 유도하는 이의 능력에 대해 시험하여 바이러스의 불활성화를 보장하였다. 이러한 과제를 BEI 처리된 바이러스 유체를 베로 세포 상에 계대시키고, 베로 세포를 임의의 바이러스 감염에 대해 확인하여 수행하였다. BEI 처리된 배양 유체를 전형적으로 -70℃ 또는 그 아래에서 불활성화 검정이 완료될 때까지 보관하였다.
불활성화된 바이러스를 불활성화 PEDV 배양물과 애쥬번트 EMULSIGEN®-BCL를 20% 포함율(inclusion rate)로 완전히 블렌딩하여 벌크 연속물을 형성하여, 보조제 첨가된 백신으로서 제형화하였다. 벌크 연속물을 1 또는 10 용량(용량당 @2.0ml)을 포함하는 바이알로 이동될 때까지 2 내지 8℃에서 유지하였다.
실시예 2: PEDV 단리물 1251-125-10 "125-10"의 게놈 서열 분석
샘플 제조 및 분석: 추출 전 바이러스 조직 배양 상청액을 DNase 및 RNase의 칵테일로 미리 처리하여 잔류 숙주 세포 게놈 핵산을 제거하였다. 이어서, 바이러스 게놈 RNA를 뉴클레아제-처리된 샘플로부터 Qiagen 바이러스 RNA 추출 키트(Cat #52906)를 사용하여 추출하였다. 추출 후, 샘플을 다시 DNase로 처리하여 추가로 바이러스 게놈 RNA를 풍부하게 하였다(enrich). 후속적으로, 바이러스 게놈 RNA를 랜덤 프라이밍된 역전사 및 Klenow 단편 처리를 통해 이중 가닥 cDNA(ds cDNA)로 전환시켰다. 이어서, ds cDNA 생성물을 사용하여 Illumina MiSeq-기반 서열분석에 대한 라이브러리를 NextEraXT 라이브러리 제조 키트(Cat #FC-131-1024)를 사용하여 생성하였다. 각 샘플을 고유한 태그로 5'- 및 3'-말단 둘 다에서 바코드하여 생물정보학 미스-비닝(mis-binning)의 가능성을 최소화하였다. 이러한 라이브러리를 500-사이클 키트(Cat # MS-102-2003)를 사용하는 MiSeq에서 수행하고, 데이터를 NextGene(버젼 2.3.4) 및 Sequencher 소프트웨어(버젼 5.1)의 조합을 사용하여 분석하였다. 고품질 서열을 25 보다 큰 중앙값 Q-스코어를 포함하는 것을 선택하고, 3'-말단에서 3개 이하의 부적절한(uncalled) 염기 또는 16 이하로 측정된 Q-스코어를 갖는 3-연속 염기를 컷-오프하여 손질하였다. 이어서, 서열을 35bp 스트레치를 넘는 85% 초과 매치의 기준을 사용하여 드 노보(de novo) 어셈블리하여 각 세포주에 대한 추정되는 PEDV 완전한 게놈을 생성하였다. 이어서, 각각에 대한 추정되는 완전한 게놈 서열을 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 또는 가변적인 소 삽입/결실을 증명하기 위해 템플릿-기재 정렬에 의해 증명하였다.
샘플 1251-125-10에 대해, 총 570,253 서열을 낮은 품질 데이터를 손질한 후 136bp의 평균 길이로 생성하였다. 이들 서열 중에서; 484,247(84.9%)을 단일 콘틱 27,995bp 길이 내로 어셈블리하고, 이는 BLASTn 분석을 통해 단일-가닥 RNA 알파코로나바이러스 PEDV와 강한 동일성을 나타내었다. 총 11 위치는 다형성을 단일 뉴클레오티드 또는 소 삽입/결실에서 나타내었고, 이들 위치를 표 1에 열거한다.
표 1: 단리물 1251-125-10 "125-10"에서 다형성 잔기
Figure pct00001
1251-125-10(서열 번호 1)의 추정되는 완전한/거의-완전한 PEDV 게놈을 PEDV의 가장 밀접한 중국 AH2012(진뱅크 수탁 번호: KC210145) 및 북미 콜로라도 2013 단리물(진뱅크 수탁 번호: AGO58924)과 정렬하였다(참조: 도 1 및 도 2). 둘 다의 단리물의 동일성은 99.2%를 초과하고, 둘 다의 세포주에 매우 근접한 관계를 유전자그룹 2a에서 둘 다 나타낸다.
이어서, 면역원성 스파이크 단백질 서열을 PEDV 스파이크 단백질의 더 큰 진뱅크 리포지토리(repository)와 단백질 동일성/유사성에 대해 검사하였다. 다시, 제출된 가장 밀접한 진뱅크 단리물은 미소네타 대학 수의학적 진단 실험실(the University of Minnesota Veterinary diagnostic laboratory)(진뱅크 수탁 번호: AGO58924)에 의해 기탁된 북미 콜로라도 2013 세포주로부터 유래되었고, 이는 99.5% 초과의 동일성(1380/1386 동일한 아미노산)을 나타내었다(도 3). 6 아미노산 변화 중에서, 1은 위치 23,101에서 다형성에 기인하고, 주로 CGA (Arg) 또는 소수로 CAA (Gln)를 위치 838에서 암호화할 것이다. 북미 콜로라도 2013 세포주는 이러한 위치에서 Gln을 포함한다.
실시예 3: 바이러스의 불활성화를 모니터링하는 방법
PEDV 바이러스 또는 풀의 각각의 로트(lot)를 불활성화에 대해 베로 세포에서 계대에 의해 시험하였다. 75㎠의 24시간 세포 배양을 2.0ml의 불활성화 PEDV 유체로 접종하고, 36±3℃에서 48시간 동안 유지하였다. 베로 세포의 하나의 플라스크는 접종되지 않고 남아있다. 양성 바이러스 대조군의 경우, 베로 세포의 하나의 배양물을 양성 대조군 PEDV로 접종하였다. 인큐베이팅 기간의 말기에, 세포 단층을 PEDV의 CPE 정형에 대해 검사하였다. 물질을 3회 냉각, 해동시키고, 이어서, 2ml의 각 물질을 1일령(one day old) 베로 세포에 접종하였다. 배양물을 37±2℃에서 48시간 동안 유지하여야 한다. 제2 계대 이후에, 제3 계대를 수행한다. 인큐베이팅 및 계대 후, 면역형광 염색의 결핍에 의해 측정된 BEI 처리된 바이러스 유체에서 바이러스-감염된 세포의 부재는 충분한 불활성화 시험을 구성한다. 양성 대조군 바이러스로 접종된 대조군 세포는 PEDV의 CPE 정형을 나타내어야 하고, 비접종된 플라스크는 PEDV CPE의 어떠한 증거도 나타내지 않아야 한다.
실시예 4:
PEDV 스파이크 항원에 대해 코딩하고 이를 발현하는 재조합 바큘로바이러스의 작제
바큘로디스플레이-스파이크 항원(BaculoDisplay-Spike antigen)은 곤충 세포에서 변형된 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 통해 생성되었다. 간단히, PEDV 스파이크 단백질(서열 번호 3)을 암호화하는 핵산 서열(서열 번호 2)은 특이적 프라이머(포워드 프라이머: 서열 번호 4 및 리버스 프라이머: 서열 번호 5)를 사용하는 진단 샘플로부터 클로닝되었다. 클로닝된 PEDV 스파이크 코딩 서열을 변형시켜 PEDV 스파이크 시그널 펩타이드, 막관통 도메인, 및 c-말단 도메인을 제거하였다(서열 번호 6). 이들 도메인은 수포성 구내염(Vesicular stomatitis) 바이러스 G 단백질(VSVG)로부터 등가물 도메인으로 오버랩 확장(overlap extension) PCR에 의해 대체되었다. VSVG-PEDVS-VSVG 코딩 서열(서열 번호 8)을 바큘로바이러스 전이 벡터(pVL1393) 내로 상보적 제한 위치를 사용하여 전달하였다. 변형된 스파이크 단백질을 발현하는 VSVG-PEDV-VSVG 스파이크 코딩 서열(서열 번호 9)을 포함하는 pVL1393 벡터를 Sf9 곤충 세포를 FlashBAC ULTRA 바큘로바이러스 DNA와 함께 공형질감염시키는데 사용하였다. 재조합 바큘로바이러스를 증폭시키고, PEDV 스파이크 단백질 발현을 PEDV-특이 혈청을 사용하여 IFA 및 웨스털 블롯에 의해 점검하였다. PEDV 스파이크 단백질은 100,000g 원심분리 단계 후 바큘로바이러스 입자를 갖는 공-펠릿(co-pellet)으로 나타났고, 이는 바큘로바이러스와 관련되었다는 것을 제시한다.
실시예 5:
PEDV 스파이크 항원을 포함하는 약제학적 조성물(백신)의 제조:
불활성화 PEDV 물질에 대해, PEDV 바이러스 수거물을 최소 24시간 동안 5mM BEI를 사용하여 불활성화시키고, 정화하고, 0.45μm 여과하였다.
중화 후 다양한 애쥬번트를 첨가하고, 하기 백신/약제학적 조성물을 생성하였다.
실시예 6:
불활성화 PEDV 및 바큘로바이러스 스파이크 백신을 사용한 돼지의 접종 및 혈청학적 반응의 평가
연구의 목적은 백신접종된 돼지의 보호를 위한 불활성화 PEDV 바이러스의 면역원성을 증명하기 위한 것이다. 연구에서 사용되는 백신은 불활성화 PED 바이러스 및 바큘로디스플레이-스파이크(바큘로-S) 단백질 작제물을 포함하였다. 불활성화 PEDV 백신 및 바큘로디스플레이-스파이크(바큘로-S) 단백질 백신 둘 다를 EMULISGEN®-BCL로 보조제 첨가하였다. 이전 접종 연구는 임상적 보호와 PEDV 접종 21일 후 혈액 중 검출된 IgA 및 IgG 반응 사이의 강한 포지티브 상관관계를 나타내었다[참조: De Arriba et al. 2002]. 따라서, 원형 백신 각각의 혈청학적 반응을 IgG 및 IgA ELISA 분석에 의해 평가하였다. 추가로, 바이러스 중화 검정을 혈청에서 수행하였다.
실험적인 설계: 실험을 2개의 원형 PEDV 백신에 대한 혈청학적 반응을 평가하기 위해 설계하였다.
18마리의 돼지(D-1에 28±7일령)를 3개의 치료 그룹으로 무작위 배정(randomized)하고(표 2 참조), 싱글룸에 연구 기간 동안 하우징하였다. 동물을 D0, 14 및 28에 위약 또는 2개의 PEDV 원형 백신 중 하나로 근육내로 백신접종하였다. 돼지를 임상적 징후에 대해 D0 내지 D49까지 매일 모니터링하였다. 직장 온도 및 주사 부위를 모니터링하여 백신의 안전성을 D0-D4, D14-18, 및 D28-D32까지 평가하였다. 배설물, 경구 및 코 면봉 및 혈청을 새끼 돼지로부터 D-1, 3, 14, 17, 28, 31 및 49에 수집하였다. D-1, 14, 28 및 49에 수집한 혈청 샘플을 ELISA에 의해서 항-PEDV-IgG에 대해 그리고 FFN 검정에 의해서 중화 항체의 존재에 대해 선별하였다. D-1, D3, 17 및 31에 수집된 배설물 샘플 및 혈청을 PCR에 의해 평가하여 어떠한 원형도 돼지에서 복제할 수 없다는 것을 확인하였다. D14, 28 및 49로부터의 배설물 샘플을 -70℃에서 미래의 잠재적 평가를 위해 보관하였다. D49에, 동물을 인도적으로 안락사시키고, 부검하였다.
표 2. 실험적인 설계의 요지
Figure pct00002
원형 백신: 표 4a 및 b는 원형 백신을 기재한다. 위약 치료를 위해, 2ml의 제품 PBS를 투여하였다. 바큘로디스플레이-스파이크 항원을 곤충 세포에서 변형된 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 통해 생성되었다. 간단히, PEDV 스파이크 단백질을 위한 코딩 서열을 진단 샘플로부터 특이적 프라이머를 사용하여 클로닝하였다. 클로닝된 PEDV 스파이크 코딩 서열을 변형시켜 PEDV 스파이크 시그널 펩타이드, 막관통 도메인, 및 c-말단 도메인을 제거하였다(서열 번호 7). 이들 도메인은 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSVG)로부터 등가물 도메인으로 오버랩 확장 PCR에 의해 대체되었다(서열 번호 8). VSVG-PEDVS-VSVG 코딩 서열을 바큘로바이러스 전이 벡터(pVL1393) 내로 상보적 제한 위치를 사용하여 전달하였다. VSVG-PEDV-VSVG 스파이크 코딩 서열을 함유하는 pVL1393 벡터를 사용하여 Sf9 곤충 세포를 FlashBAC ULTRA 바큘로바이러스 DNA와 함께 공형질감염시켰다. 재조합 바큘로바이러스를 증폭시키고, PEDV 스파이크 발현에 대해 PEDV-특이 혈청을 사용하여 IFA 및 웨스턴 블롯에 의해 점검하였다. PEDV 스파이크 단백질은 100,000g 원심분리 단계 후 바큘로바이러스 입자를 갖는 공-펠릿으로 나타났고, 이는 바큘로바이러스와 관련되었다는 것을 제시한다. 불활성화 PEDV 물질에 대해, PEDV 바이러스 수거물을 24시간 동안 5mM BEI를 사용하여 불활성화시키고, 정화하고, 0.45μm 여과하였다.
표 4a. PEDV 원형 백신 물질 - 불활성화된 바이러스 수거물의 요지
Figure pct00003
표 4b. PEDV 원형 백신 물질 - 바큘로디스플레이-스파이크의 요지
Figure pct00004
PEDV 백신접종: D0, 14 및 28에서, 연구자 또는 설계자는 백신 물질을 모든 돼지에게 투여하였다. 각 돼지는 2ml의 BEI 불활성화 PEDV 백신, 1ml의 바큘로디스플레이-스파이크 원형 또는 2ml의 위약을 근육내로 멸균 니들 및 연령에 적합한 시린지를 사용하여 투여받았다. D0 및 D28에, 백신을 오른쪽 목 근조직에 제공받고, D14에 왼쪽 목 근조직에 제공받았다.
조직 수집: 돼지를 육안으로 보이는 병소에 대해 평가하였다. 비정상을 부검 폼(necropsy form)에 기록하였다. 소장 및 결장의 신선한 샘플 및 폐, 심장, 비장, 신장, 소장, 결장 및 간의 정해진 부분을 수집하였다. 신선한 샘플을 BIVI-Ames에서 -70℃에서 연구 완료 후 최저 6개월 동안 보관하였다. 정해진 부분을 BIVI-Ames에서 실온에서 연구 완료 후 최저 6개월 동안 보관하였다.
바이러스 검정: PEDV RT-PCR: 샘플을 표 3에 기재된 RT-PCR로 스크리닝하였다. 정량적 원-스텝 RT-PCR 키트(ISCRIPT™ One-Step RT-PCR kit for probes; BioRad, cat no. 170-8895)를 검정을 위해 사용하였다. 프라이머, 프로브 및 울트라머에 대한 서열 정보는 다음과 같다: PEDV-qPCR-프로브, 5'-6-FAM/ACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACAT-3'BHQ_1 (서열 번호 16); PEDV-qPCR-F, 5'-TATAGTGGGTGTTATTTCTAGTT-3' (서열 번호 17); PEDV-qPCR-R, 5'-GCCAATACTGCCAGATTTACA-3'(서열 번호 18), PEDV-울트라머, 5'-TGATGATATAGTGGGTGTTATTTCTAGTTTGTCTAGCTCCACTTTTAACAGTACTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTCTACCATTCTAATGATGGCTCTAATTGTACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACATAGGTGTTTGTAAATCTGGCAGTATTGGCTATGTCCCAT-3'(서열 번호 19). 실시간 RT-PCR을 2㎕의 추출한 총 핵산, 0.75㎕의 프로브(4μM), 0.5㎕의 각 프라이머(10μM), 12.5㎕의 2X RT-PCR 믹스, 0.5㎕ ISCRIPT™ 역전사효소 및 8.25㎕의 DEPC-처리된 물을 포함하는 25㎕ 반응물에서 수행하였다. 반응을 CFX96 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)을 사용하여 하기 조건하에 수행하였다: 50℃에서 30분 동안 초기 역전사, 이어서, 95℃에서 5분 동안 초기 변성, 95℃에서 15s 동안 변성의 40사이클 및 57℃에서 30s 동안 어닐링(annealing) 및 확장. 광학 데이터를 CFX Manager 소프트웨어(버젼 2.1, BioRad)를 사용하여 분석하였다. 각 측정을 위해, 역치 라인을 사이클 역치(Ct) 측정 모드의 회귀 셋팅을 사용하여 자동으로 계산하였다. 기준선 공제를 자동으로 기준선 공제 모드를 사용하여 수행하였다. 10 미만의 기준선 말단 값을 갖는 곡선을 수동으로 수정하였다. 샘플을 단일 반응으로 수행하고, 정량적 양을 울트라머-기재 표준 곡선을 사용하여 측정하고, 마이크로티터(gc/㎕) 당 게놈 카피로서 기록하였다. 40사이클 후 검출이 없는 샘플을 음성으로 고려하였다.
항-PEDV-IgG ELISA: 샘플을 표 3에 기재된 ELISA로 스크리닝하였다. 검정을 위해, 평판배지를 4ng/㎕의 PEDV-1251-125-2로 1시간 동안 37℃에서 코팅하였다. 세척 후, 웰을 100㎕ ofa 1:100 희석된 혈청 샘플(IgG a 검정의 경우)로 코팅하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세척 후, 웰을 0.05% 탈지 우유로 블록킹하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세척 후, 웰을 100㎕의 호스-래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된-염소-항-돼지-IgG의 1:10,000 희석물로 코팅하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세척 후, 평판배지를 3,5,3',5'-테트라메틸벤지딘으로 5분 동안 성장시키고(developed), 반응을 450nm에서 광학 밀도(OD) 측정 전에 2 M H2SO4로 정지시켰다. 샘플을 중복 웰에서 수행하고, 결과를 양성(S:P) 비에 대한 평균 샘플로서 기록하였다. 양성 대 음성 해석에 대한 컷-오프 값이 ELISA 검정의 어느 것에 대해서도 생성되지 않았기 때문에, 2개의 표준 편차 중 높은 것과 가장 높은 대조군 그룹 평균의 합 보다 큰 S:P 비를 갖는 샘플을 양성으로 고려하였다(S:P 비>0.28 또는 >0.16 IgG 검정에 대해서).
PEDV 형광성 초점 검정: PEDV FFN 검정을 세포 배양 개조된 PEDV 스테인(stain)을 사용하는 바이러스 중화 검정에 의해 96-웰 평판배지 포맷에서 스크리닝된 중복 혈청 연속 희석물로 이루어졌다. 역가를 가장 큰 혈청 희석물로서 기록하고, 이는 음성 대조군과 비교하여 형광성 초점 90% 감소를 나타내었다. 각 샘플에 대해, 중복 웰 역가를 평균하였다.
데이터의 통계적 분석: 데이터 분석을 JMP 9.0.3(SAS Institute, Inc., Cary, North Carolina, USA)을 사용하여 모니터에 의해 수행하였다. 모든 분석에 대해, 0.05 미만의 p-값을 유의한 것으로 고려하였다. 데이터(혈청학)의 반복된 측정을 위해, 다중 분산 분석을 모델에서 반복된 변수로서 시간을 사용하여 수행하였다. 유의한 p-값을 주지하는 경우, 일원 ANOVA를 독립 인자로서 그룹을 사용하여 수행하고; 개별적인 분석을 각각의 날에 수행하였다. 유의한 p-값을 주지하는 경우; 그룹 평균 간의 쌍대 차이(pair-wise differences)를 Wilcoxon 조정된 쌍대 비교를 사용하여 평가하였다.
혈청학: PEDV 형광성 초점 중화 (FFN) 검정: 개별적인 동물 결과에 대해 표 5를 참조한다. BEI-VH 그룹에서 모든 동물은 중화 역가에서 4-배 증가를 나타내는 반면, 그룹 2에서 7마리 동물 중 단지 2마리에서 유사한 반응을 가졌다. 대조군 동물은 검출가능한 중화 역가를 갖지 않았다.
표 5. 연구 D-1, 14, 28 및 49에 대한 PEDV 형광성 초점 중화 검정 결과. 강조된 세포는 0 초과의 역가를 나타낸다.
Figure pct00005
항-PEDV-IgG ELISA: 개별적인 동물에 대한 양성 (S:P) 비에 대한 샘플을 하기 표 6에 열거하였다. 그룹 1(BEI-VH)에서 모든 동물은 D28까지 검출가능한 IgG 반응을 가졌고, 대조군 그룹의 평균 S:P 비와 비교하여 더 높은 표준 편차가 적어도 2개였다. 대조적으로, 그룹 2(바큘로-S)에서 단지 2마리의 동물이 검출가능한 IgG 반응을 단지 3개의 용량의 백신을 투여받은 후 가졌다. 그룹 최소 제곱 평균 S:P 비±표준 오차를 도 4에서 나타낸다. D28까지, 그룹 1(BEI-VH)에서 동물은 그룹 2 및 그룹 3과 비교하여 유의하게 더 높은 S:P 비를 가졌다(p<0.01, Wilcoxon 조정된 쌍대 비교).
표 6. D-1, 14, 28 및 49에 대한 개별적인 항-PEDV-IgG S:P 비. 강조된 값은 D49에 대조군 그룹의 평균 S:P 비 보다 큰 S:P 비 적어도 2개의 표준 편차를 나타낸다.
Figure pct00006
PEDV 바이러스혈증/흘림: 백신접종 후 흘림 및 바이러스혈증에 대한 잠재성을 평가하기 위해, 혈청 및 배설물 샘플을 RT-PCR로 PEDV RNA의 존재하에 각 백신접종 후 14일째(D3, D18 및 D31)에 스크리닝하였다. 어떠한 PEDV RNA도 샘플 중 어느 것에서도 검출되지 않았다.
결론: 상기 연구의 합쳐진 혈청학적 데이터(IgG 및 FFN)를 기초로 하여, BacuoloDisplay 방법으로 발현된 PEDV 스파이크 단백질(용량 당 866μg에서 제공되고 EMULSIGEN®-BCL로 보조제 첨가됨)의 3개의 용량은 일관된 혈청학적 반응을 생성할 수 없었다. 이러한 경우, 반응의 결핍은, 백신이 충분히 면역원성이 아니거나(즉, 단백질은 충분한 양으로 전달되지 않거나, 비-적합한 애쥬번트가 사용되었다), 재조합 스파이크 단백질의 확인이 야생형 바이러스와 유사하지 않다는 것을 나타낸다.
역으로, 항-PEDV IgG 및 FFN 혈청학적 데이터는 BEI 불활성화 PEDV 바이러스 수거물(5.6 log/용량로 제공되고, EMULSIGEN®-BCL로 보조제 첨가됨)의 2 또는 3개의 용량은 비투약(naive) 돼지에서 일관되게 혈청학적 반응을 도출할 수 있었다는 것을 제시한다. 그러나, 백신접종된 동물에서 평균 항-PEDV-IgG S:P 비는 피드백 물질 투여된 동물과 비교하여 낮았다. 특히, 샘플링 전 피드백 물질을 투여받은 하나의 집단으로부터의 45마리 동물에서 평균 항-PEDV-IgG S:P 비(±표준 편차)는 0.90±0.20인 것으로 발견되었고, 백신접종된 동물에서 0.69±0.12인 것과 비교된다(데이터는 나타내지 않음). 추가로, 에릭 넬슨 박사(Dr. Eric Nelson)와 개인 통신을 통해, 백신접종된 동물 7마리 중 5마리에서 FFN 역가는 이러한 연구에서 하기 피드백 투여에서 전형적으로 나타내는 역가보다 아래였다.
실시예 7:
효능 BEI 불활성화 PEDV(3개의 용량, 다양한 애쥬번트)
(연구 2013131) - 트로이 카이저
하기 연구는 사멸 PEDV 백신의 3개의 2-mL 용량을 사용하는 백신접종이 3주령 돼지에게 14일 간격으로 투여되는 경우 면역 반응을 도출할 수 있는지를 평가하였다. 일차 결과는 형광성 초점 중화(FFN)로 시험된 혈청학이었다.
연구 그룹은 다음을 포함하였다: T01 = PBS (n=10); T02 = 6.04 log TCID50/ml BEI PEDV + 20% EMULSIGEN®-BCL (n=18); T03 = 6.04 log TCID50/ml BEI PEDV + 10% EMULSIGEN-D® (n=20); T04= 6.04 log TCID50/ml BEI PEDV + 15% REHYDRAGEL®; T05 = 6.04 log TCID50/ml BEI PEDV + 5% S:P 오일 (n=20).
표 7. 백신 제형 및 대조군
Figure pct00007
D0에, 돼지는 2-mL 치료제를 근육내로 오른쪽 목에 투여받았다. 두번째 치료제는 D14에 왼쪽 목에 투여받고, 세번째 치료제는 D28에 오른쪽 목에 모든 그룹에서 투여받았다. 혈액 샘플을 D-1, D13, D27, D42, 및 D49에 수집하였다. 혈청을 PEDV 중화 항체에 대해 FFN을 사용하여 시험하였다.
혈청학: 혈청변환은 2회 백신접종 후 돼지의 11.2%에서 발생하였고, 20% Emulsigen BCL로 보조제 첨가된 PEDV 백신으로 3회 백신접종되는 경우 돼지의 55.6%에서 발생하였다(T02; 표 8). 모든 치료 그룹에 대한 혈청반응양성 돼지 ≥1:20에 대한 기하 평균 역가를 표 8에 나타낸다. 모든 돼지의 치료 그룹에 의한 역가의 빈도 분포를 표 9에 나타낸다.
표 8. 혈청반응양성 돼지의 비율 및 혈청학적으로 반응하는 돼지에 대한 그룹에 의한 기하 평균 역가
Figure pct00008
표 9. 그룹에 의한 역가의 빈도 분포
Figure pct00009
결론: 혈청변환은 2회 용량 후 T02 돼지의 11.2%에서 일어나고, 6.04 log10 TCID50/mL PEDv(이성분 에틸렌이민으로 불활성화되고 20% Emulsigen BCL로 보조제 첨가됨)으로 제형화된 실험적인 백신으로 3회 백신접종된 경우, 혈청변환은 돼지의 55.6%에서 일어났다. 이러한 연구로부터 수집된 데이터는 실험적인 백신이 효능의 합리적 예상의 주장을 뒷받침하는 면역 반응을 도출하였다는 것을 나타낸다.
실시예 8:
바큘로바이러스 백신(2개 용량, 다양한 애쥬번트)의 효능
하기 연구는 사멸된 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDv) 백신, 또는 바큘로바이러스 작제물 백신의 2개 2-mL 용량을 사용한 백신접종에 대한 혈청학적 반응을 평가하였고, 이를 3주령 돼지에게 어느 하나의 백신의 투여 후 측정하였다. 일차 결과는 치료된 돼지에서 백신접종 후 수집된 혈청 샘플에 대한 형광성 초점 중화(FFN)로 시험된 혈청학이다.
연구 그룹은 다음을 포함하였다: T01 = PBS (n=10); T02 = 6.93 log TCID50/ml BEI PEDV + 20% EMULSIGEN®-BCL (n=20); T03 = 바큘로바이러스, PEDV 스파이크 Ag를 사용함 (n=9); 6x 농축된 바큘로바이러스, PEDV 스파이크 Ag를 사용함 (n=10); 트립신 바큘로바이러스, PEDV 스파이크 Ag를 사용함 (n =10); 및 사멸된 양성 대조군 백신, 조건부 실시허락됨(conditionally licensed) (POS CON) (n=10). D0에, 돼지는 2-mL 치료제를 근육내로 오른쪽 목에 투여받았다. 두번째 치료제를 D14에 왼쪽 목에 T01-T05를, D21에 T06을 투여받았다.
표 10: 백신 제형 및 대조군
Figure pct00010
혈청학: 혈청변환 백신접종-후(D28 & D35) 20% Emulsigen BCL로 보조제 첨가된 PEDv 백신(T02; [0171]1)으로 백신접종된 돼지의 20%에서 일어났고, 트립신-성장된 PEDV 스파이크-바큘로바이러스(T05; [0171]1)로 백신접종된 돼지의 60%에서 일어났다. 모든 치료 그룹에 대한 혈청반응양성 돼지≥1:20에 대한 기하 평균 역가를 하기 [0171]1에 나타낸다. 모든 돼지의 치료 그룹에 의한 역가의 빈도 분포를 표 12에 나타낸다.
표 11: 혈청반응양성 돼지의 비율 및 혈청학적으로 반응하는 돼지에 대한 그룹에 의한 기하 평균 역가
Figure pct00011
표 12: 그룹에 의한 역가의 빈도 분포
Figure pct00012
결론: 혈청변환은 6.93 log10 TCID50/mL PEDV(BEI으로 불활성화되고 20% Emulsigen BCL로 보조제 첨가됨)로 제형화된 실험적인 백신의 2개 투여 후 T02 돼지의 20%에서 일어났다. 혈청변환은 PEDV 스파이크 당단백질로 제형화된 실험적인 재조합 트립신 성장된-바큘로바이러스 백신의 2개의 투여 후 T05 돼지의 60%에서 일어났다.
실시예 9:
효능 연구
하기 연구를 암퇘지에서 사멸 백신 및 다른 원형 백신의 효능을 평가하기 위해 설계하였다. 일차 결과 파라미터는 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 접종 후 새끼 돼지 사망률이다. 제2 결과 파라미터는 어미짐승 혈청학(dam serology)이다. 측정된 다른 파라미터를 포함하였다: 백신접종 후 암퇘지에서 임상적 징후(ISL을 포함함); 암퇘지에서 백신접종 후 PEDV 흘림(qRT-PCR을 통해); 새끼 돼지에서 임상적 징후; 및 새끼 돼지에서 PEDV 혈청학
분만 전 4주 및 2주에(D0 및 D14), 각 임산한 어미 짐승(gestating dam)은 하기 치료 중 하나의 2mL를 3가지 경로(근육내, 비내 및 경구)로 투여받았다: T01 (음성 대조군, NC) 포스페이트 완충된 염수; T02 (BEI-VH), 20% Emulsigen BCL로 보조제 첨가됨; T03 (엄격한 대조군, SC), 비-백신접종된/비-접종된 대조군으로서 역할을 함. T06을 제외하고는 8마리 동물을 그룹 당 사용하고, T06은 4마리 동물을 가졌다. D35 또는 D36에, 돼지를 경구로 1ml의 2.0 log10 TCID50/mL PEDV 바이러스 수거물로 접종하였다. 어미짐승 및 돼지에서 임상적 징후(구토 및 설사)를 접종 시기 동안 매일 관찰하였다. 혈청을 어미짐승으로부터 분만 전 4- 및 2-주(D0 및 D14), 새끼 돼지 접종 이전 일(D34 또는 D35) 및 치료-오프(off-test)의 날(D57)에 수집하였다.
D0 및 D14에, PEDV 원형 백신을 암퇘지에게 투여하였다. 각 백신접종에서, 암퇘지는 총 6ml의 백신을 투여받고, 여기서, 2mL를 근육내, 비내 및 경구 경로로 투여받았다. 근육내 투여 경로의 경우, 2mL 주사를 귀 아래 목의 근조직 내로 제공받았다. 투여를 위한 목의 면은 초기 및 부스터(booster) 백신접종을 위해 교대로 하였다. 경구 투여 경로를 위해, 2ml를 꼬리 구인두(caudal oropharynx)를 통해 시린지에 부착된 8Fr 폴리프로필렌 카테터(2.7mm 직경, 254mm 길이)를 사용하여 전달하였다. 비내 경로를 위해, 1ml를 시린지에 부착된 4.5인치 카테터를 사용하여 각 콧구멍으로 주사하였다.
표 13: 실험적인 백신 및 대조군 생산물
Figure pct00013
표 14: 접종 물질
Figure pct00014
백신 효능: 돼지 사망률: 치명적인 PEDV 단리물을 사용한 접종 후 돼지 사망률은 백신 효능을 평가하기 위해 사용되는 일차 결과 파라미터였다. 접종 기간 동안 그룹별 사망률의 요약을 하기 기재한다. 55% 사망률을 갖고 한배에서 난 새끼들(litters) 모두 T01(NC)에서 발병되었고, 접종은 충분히 치명적인 것으로 고려되었다. T01(NC)과 비교하여, T02(BEI-VH)는 돼지 사망률의 수치적 감소를 0.20(-0.550, 0.586)의 PF(95% CI)으로 나타내었다. 상기 감소는 통계적으로 유의하지 않았는데, 그 이유는 95% CI(-0.550, 0.586)이 제로(zero)를 포함하지 않았기 때문이다.
이항-이상 변동(Extra-binomial variation)은 근본적인 이항 분포를 사용하는 경우 T02(BEI-VH) PF에 대해 넓은 신뢰 구간을 야기하는 이러한 연구에서 분명하였다. 사망률은 그룹 내의 한배에서 난 새끼들 중에서도 매우 가변적이었고, T02(BEI-VH)의 경우 0% 내지 100%의 범위를 포함한다.
장내 샘플 또는 장내 내용물을 부검시에 수집하였고, PEDV 항원을 검출하기 위해 qRT-PCR로 시험하였다. 동물로부터 시험된 샘플 중 피크 사망률의 시간 동안, PEDV를 샘플의 55.5%에서 검출하였다.
표 15:
Figure pct00015
암퇘지 혈청학: 형광성 초점 중화 (FFN) 검정: FFN 검정을 백신접종 및 접종 후 어미짐승 바이러스 중화 반응을 평가하기 위해 사용하였다. 그룹에 의해 열거된 기하 평균 역가를 암퇘지로부터 혈액을 수집한 날짜에서 하기에 나타낸다.
백신의 2개의 용량 후, T02(BEI-VH)에서 암퇘지의 2/8(25%)은 중화 항체의 검출가능한 수준을 가졌다. 중화 항체의 검출가능한 수준은 다른 어떤 그룹에서도 관찰되지 않았다.
PEDV로 외측(lateral) 노출 후, 노출된 치료 그룹에서 모든 암퇘지는 중화 항체의 검출가능한 수준을 가졌다. T03(SC) 그룹에서 동물은 시도 전반에 걸쳐서 혈청반응음성으로 남아있다. D57(대략적으로 노출 후 21일)에 기하 평균 역가는 백신접종이 T01(NC)와 비교하여 수치적으로 높은 역가를 야기하였음을 나타내었다. T02 (BEI-VH) 그룹에서 암퇘지는 613의 GMT를 가졌고, 이는 T01(NC)에서 암퇘지에서 200의 GMT와 비교하여 대략적으로 3-배 높은 역가이다(p=0.005). T02(BEI-VH) 그룹에서 다중 샘플이 시험된 가장 높은 희석물(1:640)에서 검출가능한 중화 항체를 가졌기 때문에, 이러한 결과는 또한 그룹 간의 차이의 실제 보다 적게 잡은(conservative) 추정치를 나타낸다.
표 16:
Figure pct00016
S1-기재 ELISA 데이터: S1-기재 ELISA를 사용하여 백신접종 및 접종 후 PEDV-스파이크 단백질에 대한 어미 짐승의 반응을 평가하였다. 초유, 우유 및 혈청에 대한 검정 결과를 샘플을 수집한 날짜에 그룹별로 열거하였다.
돼지 접종 시점에서, T02(BEI-VH)에서 암퇘지는 T01(NC)의 암퇘지와 비교하여 혈청에서 유의하게 더 높은 기하 평균 역가를 가졌다(p=0.0005). PEDV 노출 후, 더 큰 유의차는 2 그룹 사이에 주지되었다(p<0.0001).
초유 및 우유에서 항-PEDV IgA의 기하 평균 역가에서 유의차는 T02(BEI-VH) 및 T04(NC) 간에 관찰되지 않았다.
표 17:
Figure pct00017
돼지 혈청학: 혈청을 부검 시점에서 돼지로부터 수집하여 중화 항체의 존재를 평가하였다. 하기 표는 양성 돼지의 기하 평균 FFN 역가를 그룹별로 나타낸다. 표는 또한 시험된 동물의 수에 대하여 20 보다 크거나 동일한 GMT을 갖는 돼지의 수로서 표현되는 검출 빈도를 포함한다. 시험을 모든 이용가능한 샘플에서 수행하였다. 수많은 돼지로부터의 샘플을 사망 및 부검 사이의 시간 차이 때문에 수득할 수 없었다.
사망률 상황(사망함: 예/아니오) 및 그룹(전체) 별로 FFN 역가에 대한 기술 통계학을 하기에 열거한다. 전체적으로, 백신접종된 그룹에서 돼지의 유사한 비율이 부검 시점에 상관없이 혈청전환되었다(또는 모계 항체를 가졌다). 그러나, T01(NC)에서, 연구 기간 동안 살아있는 돼지(43%)와 비교하여, 오프 시험(off test) 전에 사망한 돼지의 더 높은 백분율이 역가를 가졌다(88%).
전체 돼지 역가를 그룹별로 살펴 보면, 사망률 추정치는 T02(BEI-VH)에 대해 전체 그룹 FFN 백분율에 역비례하게 관련된다.
표 18:
Figure pct00018
접종 후 임상적 관찰: 돼지 배설물 스코어: 돼지에서 비정상 배설물 관찰 기간 동안 그룹 및 사망률 상황(사망함: Yes/No) 별로 기술 통계학을, 하기에 열거한다. 전체적으로, 동일한 사망률 상황을 갖는 돼지에서 비정상 배설물 스코어의 중앙값 기간은 그룹간에 유사하였다. 사망하거나 안락사시킨 동물에서, 비정상 배설물 스코어의 중앙값 기간이 수치적으로 더 짧았다. 이러한 경향은 T01(NC) 돼지에서 가장 명백하였고, 또한 이들 동물 대부분이 접종 후 첫째주 내에 사망하였다는 사실에 버금간다.
표 19:
Figure pct00019
돼지에서 배설물 스코어의 중증도를 빈도로 하기 표에 요약한다. 모든 치료 그룹에서, 돼지의 높은 부분(>91%)이 접종 후 적어도 하나의 관찰 동안 2의 배설물 스코어를 갖는 것을 나타내었다.
표 20:
Figure pct00020
결론: 돼지 사망률 20% 감소가 T01(NC) 그룹과 비교하여 T02(BEI-VH)에서 관찰되었다. 투여의 3가지 경로가 이러한 연구에서 시도되었다. 3가지 경로가 사용되지만, IM 이외의 경로가 애쥬번트 및 백신 제형을 기반으로 하는 T02(BEI-VH)의 효능에 기여하는 것으로는 예상되지 않는다. 전반적으로, 20% EMULSIGEN-BCL®로 보조제 첨가된 불활성화 PEDV 백신(6.04 log TCID50/ml의 최저 불활성화-전 역가를 가짐)은 새끼 돼지 및 암퇘지에서 더 우수한 면역 반응을 유도하는 것으로 나타난다. 바람직한 백신접종 스케줄은 3주령 또는 그 이상의 새끼 돼지에 대한 IM 투여 경로, 2-주 간격으로 3개 2ml 용량이다. 백신접종 후 암퇘지에서 임상적 징후는 T02(BEI-VH)에서 관찰되지 않았고, 다른 치료 그룹에서 제한되었다. 백신접종의 사용은 태어난 돼지가 살아있을 백분율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(데이터는 나타내지 않음).
어미짐승 혈청학을 이차적인 파라미터로서 2개의 개별적인 검정(초점 형광성 중화, S1-기재 ELISA)으로 평가하였다. 둘 다의 검정은, T01 (NC)과 비교하여, 백신접종 및 노출 후 T02 (BEI-VH)에서 역가의 유의한 증가를 나타내었다. FFN 검정의 공지된 제한으로 인해, 샘플을 또한 S1-기재 ELISA에 의해 시험하였다. 이러한 ELISA는, 스파이크 단백질의 S1 도메인이 중화 에피토프를 포함하는 것으로 예상되기 때문에 선택하였다.
PEDV로의 외측 노출 후, 노출된 치료 그룹에서 모든 동물은 중화 항체의 검출가능한 수준을 가졌다. T02(BEI-VH)에서 암퇘지는 T01(NC) 동물과 비교하여 대략적으로 3-배 더 높은 역가를 가졌다. 이는 백신의 사용이 초기 일차 반응을 자극하고, 접종 바이러스에 노출 후 더 높은 이차적인 반응을 야기한다는 증거이다. T02(BEI-VH) 그룹에서 다중 샘플이 시험된 가장 높은 희석물(1:640)에서 검출가능한 중화 항체를 갖기 때문에, 이들 결과는 또한 그룹 간의 차이의 실제 보다 적게 잡은 추정치를 나타낸다.
표 21: 돼지 사망률 및 암퇘지 혈청학적 데이터를 하기에 요약하였다.
Figure pct00021
본원에 개시되고 청구된 조성물 및 방법 모두는 본 발명의 개시를 고려하여 과도한 실험 없이 이루어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 양태에 관하여 기재되지만, 변형이 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않고 조성물 및 방법에 그리고 본원에 기재된 방법의 단계에 또는 단계의 순서에 적용될 수 있다는 것이 당해 기술 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 보다 특히, 화학적 및 생리학적 둘 다에 관련된 특정한 제제가 본원에 기재된 제제 대신에 대체될 수 있지만 동일하거나 유사한 결과가 성취될 것임이 명백할 것이다. 당해 기술 분야의 숙련가에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체 및 개질은 하기 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
다음 참조문헌은, 본원에 기재된 것을 보충하는 예시적인 절차 또는 다른 상세한 항목을 제공하는 범위까지, 특히 참조로서 본원에 포함된다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA, INC. <120> PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS VACCINE <130> 10-0165-WO-1 <150> 61/974,722 <151> 2014-04-03 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27995 <212> DNA <213> Porcine epidemic diarrhea virus <400> 1 gactcttgtc tactcaattc aactaaacga aattccttgt ccttccggcc gcatgtccat 60 gctgctggaa gctgacgtgg aatttcatta ggtttgctta agtagccatc gcaagtgctg 120 tgctgtcctc tagttcctgg ttggcgttcc gtcgccttct acatactaga caaacagcct 180 tcctccggtt ccgtctgggg gttgtgtgga taactagttc cgtctagttt gaaaccagta 240 actgtcggct atggctagca accatgttac attggctttt gccaatgatg cagaaatttc 300 agcttttggc ttttgcactg ctagtgaagc cgtctcatac tattctgagg ccgccgctag 360 tggatttatg caatgccgtt tcgtgtcctt cgatctcgct gacactgttg agggattgct 420 tcccgaagac tatgtcatgg tggtggtcgg cactaccaag cttagtgcgt atgtggacac 480 ttttggtagc cgccccaaaa acatttgtgg ttggctgtta ttttctaact gtaattactt 540 cctcgaagag ttagagctta cttttggtcg tcgtggtggt aacatcgtgc cagttgacca 600 atacatgtgt ggcgctgacg gtaaacctgt 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cactggtcat ggcactgacg atgatgtttc tggtttttgg accatagcat 21960 cgactaattt tgttgatgca ctcatcgaag ttcaaggaac cgccattcag cgtattcttt 22020 attgtgatga tcctgttagc caactcaagt gttctcaggt tgcttttgac cttgacgatg 22080 gtttttaccc tatttcttct agaaaccttc tgagtcatga acagccaatt tcttttgtta 22140 ctctgccatc atttaatgat cattcttttg ttaacattac tgtatctgct tcctttggtg 22200 gtcatagtgg tgccaacctt attgcatctg acactactat caatgggttt agttctttct 22260 gtgttgacac tagacaattt accatttcac tgttttataa cgttacaaac agttatggtt 22320 atgtgtctaa atcacaggac agtaattgcc ctttcacctt gcaatctgtt aatgattacc 22380 tgtcttttag caaattttgt gtttccacca gccttttggc tagtgcctgt accatagatc 22440 tttttggtta ccctgagttt ggtagtggtg ttaagtttac gtccctttac tttcaattca 22500 caaagggtga gttgattact ggcacgccta aaccacttga aggtgtcacg gacgtttctt 22560 ttatgactct ggatgtgtgt accaagtata ctatctatgg ctttaaaggt gagggtatca 22620 ttacccttac aaattctagc tttttggcag gtgtttatta cacatctgat tctggacagt 22680 tgttagcctt taagaatgtc actagtggtg ctgtttattc tgttacgcca tgttcttttt 22740 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guaaaccugu ucuucaggaa uccgaauggg aguauacaga 660 uuucuuugcu gacuccgaag acggucaacu caacauugcu gguaucacuu augugaaggc 720 cuggauugua gagcgaucgg augucucuua ugcgagucag aauuuaacau cuauuaaguc 780 uauuacuuac uguucaaccu augagcauac uuuuccugau gguacugcca ugaagguugc 840 acguacucca aagauuaaga agacuguugu cuugucugag ccacuugcua cuaucuacag 900 ggaaauuggu ucuccuuuug uggauaaugg gagcgaugcu cguucuauca uuaagagacc 960 aguguuccuc cacgcuuuug uuaaguguaa gugugguagu uaucauugga cuguugguga 1020 uuggacuucc uaugucucca cuugcugugg cuuuaagugu aagccagucc uuguggcuuc 1080 augcucugcu acgccugguu cuguuguggu uacgcgcgcu ggugcuggca cugguguuaa 1140 guauuacaac aacauguucc ugcgccaugu ggcagacauu gauggguugg cauucuggcg 1200 aauucucaag gugcagucca aagacgaccu cgcuugcucu gguaaauucc uugaacacca 1260 ugaggaaggu uucacagauc cuugcuacuu uuugaaugac ucgagcauug cuacuaagcu 1320 caaguuugac auccuuagug gcaaguuuuc ugaugaaguc aaacaagcua ucuuugcugg 1380 ucauguuguu guuggcagcg cgmucguuga cauuguugac gaugcacugg gacagccuug 1440 guuuauacgu aagcuuggug accuugcaag ugcagcuugg gagcagcuua aggcugucgu 1500 uagaggccuu aaccuccugu cugaugaggu cgugcucuuu ggcaaaagac uuagcugugc 1560 cacucuuagu aucguuaacg guguuuuuga guucaucgcc gaagugccug agaaguuggc 1620 ugcggcuguu acaguuuuug ucaacuucuu gaaugagcuu uuugagucug ccugugacug 1680 cuuaaagguc ggagguaaaa ccuuuaacaa gguuggcucu uauguucuuu uugacaacgc 1740 auugguuaag cuugucaagg caaaaguucg cggcccacga caggcaggug uuugugaagu 1800 ucguuacaca agccuuguua uugggaguac uaccaaggug guuuccaagc gcguugaaaa 1860 ugccaaugug aaucucgucg ucguugacga ggaugugacc cucaacacca cuggucguac 1920 aguuguuguu gacggacuug cauucuucga gagugacggg uuuuacagac aucuugcuga 1980 ugcugacguu gucauugaac auccuguuua uaagucugcu ugugagcuca agccaguuuu 2040 ugagugugac ccaauaccug auuuuccuau gccuguggcc gcuaguguug cagagcuuug 2100 ugugcaaacu gaucuguugc uuaaaaauua caacacuccu uauaaaacuu acagcugcgu 2160 ugugagaggu gauaaguguu guaucacuug caccuuacau uucacagcac caaguuauau 2220 ggaggcugcu gcuaauuuug uagaccucug uaccaagaac auugguacug cugguuuuca 2280 ugaguuuuac auuacggccc augaacaaca ggaucugcaa ggguucguaa ccacuuguug 2340 cacgauguca gguuuugagu guuuuaugcc uauaauccca caguguccag cagugcuuga 2400 agagauugau ggugguagca ucuggcgguc uuuuaucacu ggucuuaaua caauguggga 2460 uuuuugcaag caucuuaaag ucagcuuugg acuagauggc auuguuguca cuguagcacg 2520 caaauuuaaa cgacuuggug cucucuuggc agaaauguau aacacuuacc uuucaacugu 2580 gguggaaaac uugguacugg ccgguguuag cuucaaguau uaugccacca gugucccaaa 2640 aauuguuuug ggcuguuguu uucacagugu uaaaaguguu cuugcaagug ccuuccagau 2700 uccuguccag gcaggcguug agaaguuuaa agucuuccuu aacuguguuc acccuguugu 2760 accacguguc auugaaacuu cuuuugugga auuagaagag acgacauuua aaccaccagc 2820 acucaauggu aguauugcua uuguugaugg cuuugcuuuc uauuaugaug gaacacuaua 2880 cuaucccacc gaugguaaua gcguuguucc uaucugcuuu aagaagaaag guggugguga 2940 ugucaaauuc ucugaugaag ucucuguuaa aaccauugac ccaguuuaua aggucucccu 3000 ugaauuugag uucgagucug agacuauuau ggcugugcuu aauaaggcug uugguaauug 3060 uaucaagguu acaggugguu gggacgaugu uguugaguau aucaauguug ccauugaggu 3120 ucuuaaagau cacaucgaug ugccuaagua cuacaucuau gaugaggaag guggcaccga 3180 uccuaaucug cccguaaugg uuucucagug gccguugaau gaugacacga ucucacagga 3240 ucugcuugau guugaaguug uuacugaugc gccaguugau uucgagggug augaaguaga 3300 cuccucugac ccugwuaagg uggcagacgu ggcuaacucu gagccugagg augacggucu 3360 uaauguagcu ccugaaacaa auguagaguc ugaaguugag gaaguugccg caaccuuguc 3420 cuuuaaagau acaccuucca caguuacuaa ggauccuuuu gcuuuugacu uugcaagcua 3480 uggaggacuu aagguuuuaa gacaaucuca uaacaacugc uggguuacuu cuaccuuggu 3540 gcagcuacaa uugcuuggca ucguugauga cccugcaaug gagcuuuuua gugcugguag 3600 aguuggucca augguucgca aaugcuauga gucacaaaag gcuaucuugg gaucuuuggg 3660 ugaugugucg gcuugccuag agucucugac uaaggaccua cacacacuua agauuaccug 3720 uucuguaguc ugugguugug guacugguga acguaucuau gaugguugug cuuuucguau 3780 gacgccaacu uuggaaccgu ucccauaugg ugcuugugcu cagugugcuc aaguuuugau 3840 gcacacuuuu aaaaguauug uuggcaccgg caucuuuugu cgagauacua cugcucucuc 3900 cuuggauucu uugguuguaa aaccucuuug ugcggcugcu uuuauaggca aggauagugg 3960 ucauuauguc acuaacuuuu augaugcugc uauggcuauu gaugguuaug gucgucauca 4020 gauaaaguau gacacacuga acacuauuug uguuaaagac guuaauugga cagcaccuuu 4080 ugucccagac guugagccug uauuggagcc uguugucaaa ccuuucuauu cuuauaagaa 4140 uguugauuuu uaccaaggag auuuuaguga ccuuguuaaa cuuccaugug auuuuguugu 4200 uaaugcugca aaugagaauu ugucucacgg uggcggcaua gcaaaggcca uugauguuua 4260 uaccaagggc auguugcaga agugcucgaa ugauuacauu aaagcacacg gucccauuaa 4320 aguuggacgu ggugucaugu uggaggcauu aggucuuaag gucuuuaaug uuguuggucc 4380 acguaagggu aagcaugcac cugagcuucu uguuaaggcu uauaaguccg uuuuugcuaa 4440 uucagguguu gcucuuacac cuuugauuag uguuggaauu uuuaguguuc cuuuggaaga 4500 aucuuuaucu gcuuuucuug cauguguugg ugaucgccac uguaagugcu uuuguuauag 4560 ugacaaagag cgcgaggcga ucauuaauua cauggauggc uugguagaug cuauuuucaa 4620 agaugcacuu guugauacua cuccugucca ggaagauguu caacaaguuu cacaaaaacc 4680 aguuuugccu aauuuugaac cuuucaggau ugaaggugcu caugcuuucu augagugcaa 4740 cccugaaggu uugaugucau uaggugcuga caagcuggug uuguuuacaa auuccaauuu 4800 ggauuuuugu agcguuggua agugucuuaa caaugugacu ggcggugcau ugcuugaagc 4860 cauaaaugua uuuaaaaaga guaacaaaac agugccugcu ggcaacugug uuacuuuuga 4920 gugugcagau augauuucua uuacuauggu aguauugcca ucugacggug augcuaauua 4980 ugacaaaaau uaugcacgcg ccgucgucaa gguaucuaag cuuaaaggca aguuauugcu 5040 ugcuguuggu gaugccaugu uguauuccaa guugucccac cucagcgugu uagguuucgu 5100 auccacaccu gaugaugugg agcguuucua cgcaaauaag agugugguua uuaaaguuac 5160 ugaggauaca cguaguguua agacuguuaa aguagaaucc acuguuacuu auggacaaca 5220 aauuggaccu ugucuuguua augacaccgu ugucacagac aacaaaccug uuguugcuga 5280 uguuguagcu aagguuguac caagugcuaa uugggauuca cauuaugguu uugauaaggc 5340 uggugaguuc cacaugcuag accauacugg guuugccuuu ccuagugaag uuguuaacgg 5400 uaggcgugug cuuaaaacca cagauaauaa cuguuggguu aauguuacau guuuacaauu 5460 acaguuugcu agauuuaggu ucaagucagc aggucuacag gcuauguggg aguccuauug 5520 uacuggugau guugcuaugu uugugcauug guuguacugg cuuacuggug uugacaaagg 5580 ucagccuagu gauucagaaa augcacuuaa cauguugucu aaguacauug uuccugcugg 5640 uucugucacu auugaacgug ucacgcauga cgguuguugu uguaguaagc guguugucac 5700 ugcaccaguu gugaaugcua gcguguugaa gcuuggcguc gaggaugguc uuuguccaca 5760 uggucuuaac uacauugaca aaguuguugu aguuaaaggu acuacaauug uugucaaugu 5820 uggaaaaccu guaguggcac caucgcaccu cuuucuuaag gguguuuccu acacaacauu 5880 ccuagauaau gguaacggug uugccggcca uuauacuguu uuugaucaug acacugguau 5940 ggugcaugau ggagauguuu uuguaccagg ugaucucaau gugucuccug uuacaaaugu 6000 ugucgucuca gagcagacgg cuguugugau uaaagacccu gugaagaaag uagaguuaga 6060 cgcuacaaag cuguuagaca cuaugaauua ugcaucggaa agauucuuuu ccuuugguga 6120 uuuuauguca cguaauuuaa uuacaguguu uuuguacauc cuuaguauuu ugggucucug 6180 uuuuagggcc uuucguaaga gggauguuaa aguucuagcu gguguacccc aacguacugg 6240 uauuauauug cguaaaagug ugcgcuauaa ugcaaaggcu uugggugucu ucuucaagcu 6300 aaaacuuuau ugguucaaag uucuugguaa guuuaguuug gguauuuaug cauuguaugc 6360 auuacuauuc augacaauac gcuuuacacc uauagguggc ccuguuugug augauguugu 6420 ugcugguuau gcuaauucua guuuugacaa gaaugaguau ugcaacagug uuauuuguaa 6480 ggucugucuc uauggguacc aggaacuuuc 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gauuuccuac uuuuguggcu auuuuuggug auauuaagag 10740 uguuauguuc uguuaccuug uguuggguua uuuuaccugu ugcuucuacg guauucucua 10800 cugguucaac agguuuuuua agguuagugu aggugucuau gacuauacug uuagugcugc 10860 ugaguuuaag uauaugguug cuaacggccu acgugcacca acuggaacac uugauucacu 10920 acuucugucu gccaaauuga uugguauugg uggugagcgg aauauuaaga uuucuuccgu 10980 ucagucuaaa cugacugaua uuaaguguag uaacguugug cuuuuaggcu gucucucuag 11040 caugaauguc ucagcaaauu caacagaaug ggccuauugu guugacuugc auaacaagau 11100 caacuugugu aaugacccag aaaaagcgca ggaaaugcua cuugcuuugu uggcauuuuu 11160 ccuuaguaag aauagugcuu uugguuuaga ugacuuauug gaauccuauu uuaaugacaa 11220 uaguauguug cagaguguug caucuacuua ugucgguuug ccuucuuaug ucauuuauga 11280 aaaugcacgc caacaguaug aagaugcugu uaauaauggu ucuccaccuc aguugguuaa 11340 gcaauugcgc caugccauga auguagcaaa gagcgaauuu gaccgugagg cuucuacuca 11400 gcguaagcuu gauagaaugg cggaacaggc ugcagcacag auguacaaag aggcacgagc 11460 aguuaauagg aaguccaaag uuguaagugc uaugcauuca cugcuuuuug guauguugag 11520 acguuuggac augucuucug uagacaccau ucucaacuug gcaaaggaug ggguuguacc 11580 ucugucuguc auaccggcag ucagugcuac uaagcuuaac auuguuacuu cugauaucga 11640 uucuuauaau cguauccagc gugagggaug uguccacuac gcugguacca uuuggaauau 11700 aauugauauc aaggacaaug auggcaaggu gguacacguu aaggagguaa ccgcacagaa 11760 ugcugagucc cugucauggc cccugguccu ugggugugag cguauuguca agcuccagaa 11820 uaaugaaauu auuccuggua agcugaagca gcgcuccauu aaggcagaag gagauggcau 11880 aguuggagaa gguaaggcac uuuacaauaa ugagggugga cguacuuuua uguaugcuuu 11940 caucucggac aaaccggacc ugcguguagu caagugggag uucgauggug guuguaacac 12000 uauugagcua gaaccaccac guaaguucuu gguggauucu ccuaauggug cacagaucaa 12060 guaucucuac uuuguucgua accuuaacac guuacguagg ggugcuguuc ucggcuacau 12120 aggugccacu guacgcuugc aggcugguaa acaaacagaa caggcuauua acucuucauu 12180 guugacacuu ugcgcuuucg cuguggaucc ugcuaagacc uacaucgaug cugucaaaag 12240 uggucacaaa ccaguaggua acuguguuaa gauguuggcc aaugguucug guaauggaca 12300 agcuguuacu aauggugugg aggcuaguac uaaccaggau ucauacggug gugcguccgu 12360 gugucuauau uguagagcac auguugagca uccaucuaug gaugguuuuu gcagacugaa 12420 aggcaaguac guacagguuc cacuagguac aguggauccu auacguuuug uacuugagaa 12480 ugacguuugc aagguuugug guuguuggcu ggcuaauggc ugcacuugug acagauccau 12540 uaugcaaagc acugauaugg cuuauuuaaa cgaguacggg gcucuagugc agcucgacua 12600 gagcccugua acgguacuga uacacaacau guguaucgug cuuuugacau cuacaacaag 12660 gauguugcuu gucuagguaa auuccucaag gugaacugug uucgccugaa gaauuuggau 12720 aagcaugaug cauucuaugu ugucaaaaga uguaccaagu cugcgaugga acacgagcaa 12780 uccaucuaua gcagacuuga aaagugugga gccguagccg aacacgauuu cuucacuugg 12840 aaggaugguc gugccaucua ugguaacguu uguagaaagg aucuuaccga guauacuaug 12900 auggauuugu guuacgcuuu acguaacuuu gaugaaaaca auugcgaugu ucuuaagagc 12960 auuuuaauua agguaggcgc uugugaggag uccuacuuca auaauaaagu cugguuugac 13020 ccuguugaaa augaagacau ucaucguguc uaugcauugu uagguaccau uguuucacgu 13080 gcuaugcuua aaugcguuaa guucugugau gcaaugguug aacaagguau aguugguguu 13140 gucacauuag auaaucagga ucuuaauggu gauuuuuaug auuuugguga uuuuacuugu 13200 agcaucaagg gaauggguau acccauuugc acaucauauu acucuuauau gaugccuguu 13260 auggguauga cuaauugccu ugcuagugag uguuuuguua agagugauau auuuggugag 13320 gauuucaagu cauaugaccu gcuggaauau gauuucacgg agcauaagac agcacucuuc 13380 aacaaguauu ucaaguauug gggacugcaa uaccacccua acugugugga cugcagugau 13440 gagcagugca uaguucacug ugccaacuuc aauacguugu uuuccacuac uauaccuauu 13500 acggcauuug gaccuuugug ucgcaagugu uggauugaug guguuccacu gguaacuaca 13560 gcugguuauc auuuuaaaca guuagguaua guuuggaaca augaccucaa cuuacacucu 13620 agcaggcucu cuauuaacga auuacuccag uuuuguagug auccugcauu gcuuauagca 13680 ucaucaccag cccuuguuga ucagcguacu guuugcuuuu caguugcagc gcuagguaca 13740 gguaugacua accagacugu uaaaccuggc cauuucaaua aggaguuuua ugacuucuua 13800 cuugagcaag guuucuuuuc ugagggcucu gagcuuacuu uaaagcacuu cuucuuugca 13860 cagaagggug augcagcugu uaaggauuuu gacuacuaua gguauaauag accuacuguu 13920 cuggacauuu gccaagcucg cgucguguau caaauagugc aacgcuauuu ugauauuuac 13980 gaaggugguu guaucacugc uaaagaggug guuguuacaa accuuaacaa gagcgcaggu 14040 uauccuuuga acaaguuugg uaaagcuggu cuuuacuaug agucuuuauc cuaugaggaa 14100 caggaugaac uuuaugcuua uacuaagcgu aacauccugc ccacuaugac acagcucaac 14160 cuuaaauaug cuauaagugg caaagaacgu gcacgcacag uggguggugu uucgcuuuug 14220 ucaaccauga cuacucggca guaucaucag aaacaccuua aguccauagu uaauacuagg 14280 ggcgcuucgg uuguuauugg uacuacuaag uuuuauggug guugggacaa uaugcuuaag 14340 aaccuuauug augguguuga aaauccgugu cuuauggguu gggacuaccc aaagugcgac 14400 agagcacugc ccaaurugau acguaugauu ucagccauga uuuuaggcuc uaagcacacc 14460 acaugcugca guuccacuga ccgcuuuuuc agguugugca augaauuggc ucaaguccuu 14520 acugagguug uuuauucuaa uggagguuuu uauuugaagc caggugguac uaccucuggu 14580 gaugcaacca ccgcauaugc aaacucaguu uuuaauaucu uccaagcagu aagugccaau 14640 guuaacaaac uucuuagugu ugacagcaau gucugucaua auuuagaagu uaagcaauug 14700 cagcguaagc uuuaugagug cuguuauaga ucaacuaccg ucgaugacca guucgucguu 14760 gaguauuaug guuacuugcg uaaacauuuu ucaaugauga uucuuucuga ugauggcguu 14820 guuuguuaua acaaugacua ugcaucacuu 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ggcauguagu cuauguuggu gacccucaac agcugccugc accacguguu 16560 augauuucac gugguacuuu ggaaccaaag gacuacaacg uugucacuca acgcaugugu 16620 gcccuuaagc cugauguuuu cuugcacaag uguuaucgcu guccugcuga gauagugcgu 16680 acugugucug agauggucua ugaaaaccaa uucauuccug ugcacccaga uagcaagcag 16740 uguuuuaaaa ucuuuugcaa ggguaauguu cagguugaua augguucaag cauuaaucgc 16800 aggcaauugg auguugugcg uauguuuuug gcuaaaaauc cuaggugguc aaaggcuguu 16860 uuuauuucuc cuuauaacag ccagaauuau guugccagcc gcaugcuagg ucuacaaauu 16920 cagacaguug acucauccca ggguagugag uaugacuaug ucauuuacac acaaacuuca 16980 gauacugccc augccuguaa uguuaacagg uuuaauguug ccaucacaag ggccaagaaa 17040 ggcauauuau guauaaugug cgauaggucc cuuuuugaug ugcuuaaauu cuuugagcuu 17100 aaauugucug auuugcaggc uaaugagggu uguggucuuu uuaaagacug uagcagaggu 17160 gaugaucugu ugccaccauc ucacgcuaac accuucaugu cuuuagcgga caauuuuaag 17220 acugaucaag aucuugcugu ucaaauaggu guuaauggac ccauuaaaua ugagcauguu 17280 aucucguuua uggguuuccg uuuugauauc aacauaccca accaucauac ucucuuuugc 17340 acacgcgacu uugccaugcg caauguuaga gguugguuag gcuuugacgu ugaaggagca 17400 cauguuguug gcucuaacgu cgguacaaau gucccauugc aauuaggguu uucuaacggu 17460 guugauuuug uugucagacc ugaagguugc guuguaacag agucugguga cuacauuaaa 17520 cccgucagag cucgugcucc accaggggaa caauucgcac accuuuugcc uuuacuuaaa 17580 cgcggccaac caugggaugu uguccgcaaa cguauagugc agauguguag ugacuaccug 17640 gccaaccuau cagacauacu aauuuuugug uugugggcug gugguuugga guugacaacu 17700 augcguuauu uugucaagau uggaccaagu aagaguugug auugugguaa gguugcuacu 17760 uguuacaaua gugcgcugca uacguacugu uguuucaaac augcccuugg uugugauuau 17820 cuguauaacc cauacuguau ugauauacag caguggggau acaagggauc acuuagccuu 17880 aaccaccaug agcauuguaa uguacauaga aacgagcaug uggcuucugg ugaugccaua 17940 augacucgcu gucuggccau acaugauugc uuugucaaga acguugacug guccaucaca 18000 uacccauuua uugguaauga ggcuguuauu aauaagagcg gccgaauugu gcaaucacac 18060 acuaugcggu caguucuuaa guuauacaau ccgaaagcca uauaugauau uggcaauccu 18120 aagggcauua gaugugccgu aacggaugcu aagugguuuu gcuuugacaa gaauccuayu 18180 aauucuaaug ucaagacauu ggaguaugac uauauaacac auggccaauu ugauggguug 18240 ugcuuguuuu ggaauugcaa uguagacaug uauccagaau uuucuguggu cugucguuuu 18300 gauacucgcu guaggucacc acucaacuug gaggguugua auggugguuc acuguauguu 18360 aauaaucaug cauuccauac accggcuuuu gacaagcgug cuuuugcuaa guugaagcca 18420 augccauuuu ucuuuuauga ugauacugag ugugacaagu uacaggacuc cauaaacuau 18480 guuccucuua gggcuaguaa cugcauuacu aaauguaaug uugguggugc ugucuguagu 18540 aagcauugug cuauguauca uagcuauguu aaugcuuaca acacuuuuac gucggcgggc 18600 uuuacuauuu gggugccuac uucguuugac accuauaauc uguggcagac auuuaguaac 18660 aauuugcaag gucuugagaa cauugcuuuc aaugucguaa agaaaggauc uuuuguuggu 18720 gccgaaggug aacuuccugu agcugugguu aaugacaaag ugcucguuag agaugguacu 18780 guugauacuc uuguuuuuac aaacaagaca ucacuaccca cuaacguagc uuuugaguug 18840 uaugccaagc guaagguagg acucacccca cccauuacga uccuacguaa cuugggugua 18900 guuuguacau cuaagugugu cauuugggac uaugaagccg aacguccacu uacuacuuuu 18960 acaaaggaug uuuguaaaua uaccgacuuu gagggugacg 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Claims (49)

  1. 유전자형 2a의 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV; porcine epidemic diarrhea virus)의 하나 이상의 항원을 포함하는 백신.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)가 북미 기원인, 백신.
  3. 제2항에 있어서, 북미 유전자형의 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)가,
    a) 서열 번호 1에 의해 암호화되고/되거나, 서열 번호 1의 서열을 포함하고/하거나, 서열 번호 1의 RNA 등가물을 포함하거나;
    b) 이의 서열이 서열 번호 1과 적어도 99% 동일하고/하거나, 서열 번호 1의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일하거나;
    c) 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13의 핵산 서열에 의해 암호화되거나;
    d) 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되거나;
    e) 서열 번호 15에 의해 암호화되거나; 또는
    f) 이의 서열이 서열 번호 15와 적어도 99% 동일한
    임의의 PEDV인, 백신.
  4. 제1항에 있어서, 상기 백신이 재조합 백신 또는 사멸 백신인, 백신.
  5. 제1항에 있어서, 상기 백신이 사멸 백신인, 백신.
  6. 제5항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)가,
    a) 서열 번호 1에 의해 암호화되고/되거나, 서열 번호 1의 서열을 포함하고/하거나, 서열 번호 1의 RNA 등가물을 포함하거나;
    b) 이의 서열이 서열 번호 1과 적어도 99% 동일하고/하거나, 서열 번호 1의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일하거나,
    c) 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13의 핵산 서열에 의해 암호화되거나;
    d) 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되거나;
    e) 서열 번호 15에 의해 암호화되거나; 및/또는
    f) 이의 서열이 서열 번호 15와 적어도 99% 동일한 임의의 PEDV인, 백신.
  7. 제5항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)가 화학적으로 불활성화된, 백신.
  8. 제7항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)를, 에틸렌이민, 이성분(binary) 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 화학적 불활성화 제제로 처리하여 화학적으로 불활성화시킨, 백신.
  9. 제8항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)를 이성분 에틸렌이민으로 처리하여 화학적으로 불활성화시킨, 백신.
  10. 제5항에 있어서, 상기 백신이 애쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함하는, 백신.
  11. 제10항에 있어서, 상기 애쥬번트가 EMULSIGEN® 수중유(oil-in-water) 에멀젼-기재 애쥬번트인, 백신.
  12. 제6항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)가 서열 번호 1을 포함하고/하거나, 서열 번호 1의 RNA 등가물을 포함하는, 백신.
  13. 제4항에 있어서, 상기 백신이 재조합 백신인, 백신.
  14. 제13항에 있어서, 상기 재조합 백신이,
    a) 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산(여기서, 재조합 스파이크 폴리펩타이드는 서열 번호 3, 7, 9 또는 14와 적어도 90% 상동성을 갖는다),
    b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 벡터,
    c) a)의 핵산에 의해 암호화된 재조합 PEDV 스파이크 단백질, 및
    d) 이의 임의의 조합물
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 백신.
  15. 제13항에 있어서, 상기 백신은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 백신.
  16. 제15항에 있어서, 상기 부형제가 하나 이상의 애쥬번트인, 백신.
  17. 제16항에 있어서, 상기 애쥬번트가 EMULSIGEN® 수중유 에멀젼-기재 애쥬번트인, 백신.
  18. 제13항에 있어서, 상기 백신이 하나 이상의 추가 항원을 추가로 포함하는, 백신.
  19. 제18항에 있어서, 상기 추가 항원이 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 구조 단백질 M, E, 또는 N인, 백신.
  20. 제14항에 있어서, 면역원성 성분이 상기 단리된 핵산인, 백신.
  21. 제14항에 있어서, 면역원성 성분이 상기 벡터인, 백신.
  22. 제14항에 있어서, 면역원성 성분이 상기 재조합 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 스파이크 단백질인, 백신.
  23. 제14항에 있어서, 면역원성 성분이 조합물인, 백신.
  24. 돼지에게 제1항의 백신을 투여함을 포함하는, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)와 관련된 질환에 대항하여 돼지를 보호하는 방법.
  25. 돼지에게 제5항의 백신을 투여함을 포함하는, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)와 관련된 질환에 대항하여 돼지를 보호하는 방법.
  26. 돼지에게 제13항의 백신을 투여함을 포함하는, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)와 관련된 질환에 대항하여 돼지를 보호하는 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 백신이
    a) 서열 번호 1에 의해 암호화되고/되거나, 서열 번호 1의 서열을 포함하고/하거나, 서열 번호 1의 RNA 등가물을 포함하는 것;
    b) 이의 서열이 서열 번호 1과 적어도 99% 동일하고/하거나, 서열 번호 1의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일한 것;
    c) 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 것;
    d) 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화된 것;
    e) 서열 번호 15에 의해 암호화된 것; 및
    f) 이의 서열이 서열 번호 15와 적어도 99% 동일한 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 백신이
    a) 서열 번호 1의 서열에 의해 암호화되거나 이를 포함하는 것,
    b) 이의 서열이 서열 번호 1과 적어도 99% 동일한 것,
    c) 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 것, 및
    d) 이의 스파이크 단백질이 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화된 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 재조합 백신이,
    a) 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산(여기서, 상기 재조합 스파이크 폴리펩타이드는 서열 번호 3, 7, 9 또는 14와 적어도 90% 상동성을 갖는다),
    b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 벡터,
    c) a)의 핵산에 의해 암호화된 재조합 PEDV 스파이크 단백질, 및
    d) 이의 임의의 조합물
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 방법.
  30. a) 백신을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서(dispenser); 및
    b) 제1항에 따른 백신
    을 포함하는, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)와 관련된 질환에 대항하여 돼지를 백신접종하기 위한 키트.
  31. a) 백신을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및
    b) 제5항에 따른 백신
    을 포함하는, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)와 관련된 질환에 대항하여 돼지를 백신접종하기 위한 키트.
  32. a) 백신을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및
    b) 제13항에 따른 백신
    을 포함하는, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)와 관련된 질환에 대항하여 돼지를 백신접종하기 위한 키트.
  33. (a) 시미안(simian) 세포에 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)를 접종하는 단계;
    (b) 상기 접종된 시미안 세포를 인큐베이팅하는 단계;
    (c) 상기 인큐베이팅된 세포로부터 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)를 수거하는 단계; 및
    (d) 상기 수거된 세포를 화학적 불활성화 제제로, 바람직하게는 에틸렌이민, 이성분 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물로 처리하여 불활성화 PEDV 백신을 형성하는 단계
    를 포함하는, 제5항에 따른 돼지 유행성 설사 백신을 생산하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)가,
    a) 서열 번호 1의 서열에 의해 암호화되거나 이를 포함하는 서열,
    b) 서열 번호 1과 적어도 99% 동일한 서열,
    c) 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13의 핵산 서열에 의해 암호화되는 스파이크 단백질,
    d) 서열 번호 2, 6, 8, 또는 13과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 스파이크 단백질
    을 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 유전자그룹 2a의 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)가 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 1의 RNA 등가물을 포함하는, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 시미안 세포가 베로(Vero) 세포인, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 화학적 불활성화 제제가 이성분 에틸렌이민을 포함하는, 방법.
  38. 제33항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 백신에 애쥬번트를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 백신에 애쥬번트를 첨가하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 애쥬번트가 EMULSIGEN® 수중유 에멀젼-기재 애쥬번트인, 방법.
  40. a) 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 하나 이상의 항원을 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 및
    b) 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 세포의 하나 이상의 항원을 수거하는 단계
    를 포함하는, 제13항의 재조합 백신을 생산하는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 하나 이상의 항원이,
    a) 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산(여기서, 상기 재조합 스파이크 폴리펩타이드는 서열 번호 3, 7, 9 또는 14와 적어도 90% 상동성을 갖는다),
    b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 벡터,
    c) a)의 핵산에 의해 암호화된 재조합 PEDV 스파이크 단백질, 및
    d) 이의 임의의 조합물
    을 포함하는, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 재조합 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 상기 하나 이상의 항원이 재조합 바큘로바이러스 벡터에 의해 발현되는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 재조합 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 상기 하나 이상의 항원이 곤충 세포에서 발현되는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 백신에 애쥬번트를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 백신에 애쥬번트를 첨가하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 애쥬번트가 EMULSIGEN® 수중유 에멀젼-기재 애쥬번트인, 방법.
  46. 제1항에 있어서, 유전자형 2의 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 하나 이상의 항원이 유전자형 2a의 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)인, 백신.
  47. 의약으로서 사용하기 위한 유전자형 2a의 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 하나 이상의 항원으로서,
    여기서, 상기 PEDV의 하나 이상의 항원이 바람직하게는:
    PEDV가 임의로 제2항, 제3항, 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 PEDV인, 유전자형 2a의 PEDV; 및 PEDV의 하나 이상의 면역원성 성분이 임의로 제27항 내지 제29항 또는 제46항 중 어느 한 항의 하나 이상의 면역원성 성분인, 유전자형 2a의 PEDV의 하나 이상의 면역원성 성분
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 의약으로서 사용하기 위한 유전자형 2a의 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 하나 이상의 항원.
  48. 제1항 내지 제23항 또는 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)와 관련된 질환에 대항하여 돼지를 보호하는 방법에서 사용하기 위한, 백신.
  49. 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)와 관련된 질환에 대항하여 돼지를 보호하기 위한 의약을 제조하기 위한 유전자형 2a의 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 하나 이상의 항원의 용도로서,
    여기서, 상기 PEDV의 하나 이상의 항원이 바람직하게는:
    PEDV가 임의로 제2항, 제3항, 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 PEDV인, 유전자형 2a의 PEDV; 및 PEDV의 하나 이상의 면역원성 성분이 임의로 제27항 내지 제29항 또는 제46항 중 어느 한 항의 하나 이상의 면역원성 성분인, 유전자형 2a의 PEDV의 하나 이상의 면역원성 성분
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.


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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200121447A (ko) * 2019-04-16 2020-10-26 주식회사 바이오앱 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물 및 이의 제조 방법

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014105671A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic composition comprising mycoplasma antigens
US10280199B2 (en) * 2014-02-07 2019-05-07 Phibro Animal Health Corporation Coronavirus proteins and antigens
CN106535930A (zh) 2014-03-11 2017-03-22 明尼苏达大学董事会 猪流行性腹泻病毒疫苗及其使用方法
CA2943816A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine epidemic diarrhea virus vaccine
US9713639B2 (en) * 2014-05-19 2017-07-25 Merial, Inc. Recombinant spike protein subunit based vaccine for porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)
WO2016007576A2 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Zoetis Services Llc Novel vaccine compositions for porcine epidemic diarrhea virus and porcine deltacoronavirus
WO2016007955A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Merial, Inc. Inactivated vaccine for porcine epidemic diarrhea virus (pedv)
CN107073103A (zh) * 2014-09-12 2017-08-18 英特维特国际股份有限公司 用于保护猪免于猪流行性腹泻病毒的疫苗
KR20170103874A (ko) * 2015-01-23 2017-09-13 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 돼지 유행성 설사병 바이러스를 위한 최적화된 합성 컨센서스 dna 백신의 면역원성
US11058763B2 (en) 2015-02-27 2021-07-13 Zoetis Services Llc Porcine epidemic diarrhea virus strains and immunogenic compositions therefrom
GB2552441A (en) * 2015-10-22 2018-01-31 Royal Veterinary College Methods
TW201731525A (zh) * 2015-11-25 2017-09-16 薩斯喀徹溫大學 治療、預防及診斷豬流行性下痢病毒感染之方法
CN107304416A (zh) * 2016-04-19 2017-10-31 北京大伟嘉生物技术股份有限公司 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用
JP6253210B1 (ja) * 2016-08-17 2017-12-27 一般財団法人日本生物科学研究所 豚流行性下痢の予防又は治療方法、ワクチン、及びワクチンキット
CA3042584A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof
EA201991762A1 (ru) * 2017-01-30 2020-01-23 Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. Вакцины против коронавируса свиней
CN108822191B (zh) 2017-04-13 2023-07-07 浙江海隆生物科技有限公司 猪流行性腹泻病毒s蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用
WO2018188639A1 (zh) * 2017-04-13 2018-10-18 浙江海隆生物科技有限公司 猪流行性腹泻病毒s蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN107698665B (zh) * 2017-10-26 2020-09-15 浙江大学 一种抗病毒多肽、编码基因、载体、宿主菌及应用
CN108118032A (zh) * 2017-12-12 2018-06-05 新疆希普生物科技股份有限公司 猪流行性腹泻病毒2型毒株的培养及灭活疫苗的研制
CN108219000B (zh) * 2018-01-17 2021-05-25 北京市农林科学院 一种pedv保护性抗原蛋白及其在乳酸菌中表达的方法
CN108362871A (zh) * 2018-02-07 2018-08-03 远见生物科技（上海）有限公司 用于中性粒细胞胞外诱捕网检测的试剂盒及检测方法
CN108486067B (zh) * 2018-02-11 2022-03-15 黑龙江正康生物技术股份有限公司 猪流行性腹泻病毒变异株及其制备的灭活疫苗和应用
WO2019217967A1 (en) * 2018-05-11 2019-11-14 Kansas State University Research Foundation Multiepitope fusion antigens for vaccination and methods of making and using such antigens
CN109161534A (zh) * 2018-09-14 2019-01-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用
CN109022372B (zh) * 2018-09-19 2022-03-29 天康制药(苏州)有限公司 一种猪流行性腹泻病毒的培养方法
CN112867506A (zh) * 2018-09-20 2021-05-28 勃林格殷格翰动物保健有限公司 抗猪流行性腹泻的鼻内载体疫苗
TW202027785A (zh) * 2018-09-20 2020-08-01 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 經修飾之pedv棘蛋白
CN110967480A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 洛阳普泰生物技术有限公司 一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用
CN113557011A (zh) 2019-03-04 2021-10-26 诺华丝国际股份有限公司 降低由于病毒污染的饲料而引起的病毒感染的风险
CN110135157B (zh) * 2019-04-04 2021-04-09 国家计算机网络与信息安全管理中心 恶意软件同源性分析方法、系统、电子设备及存储介质
US11413347B2 (en) 2019-09-02 2022-08-16 Reber Genetics Co., Ltd. Vaccine composition and method of preventing porcine epidemic diarrhea virus infection in swine
WO2021231441A1 (en) * 2020-05-11 2021-11-18 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for inducing immune responses against class i fusion protein viruses
CN112063620A (zh) * 2020-06-16 2020-12-11 中国人民解放军陆军军医大学 抑制猪流行性腹泻病毒M基因表达的shRNA
CN112680421B (zh) * 2021-02-01 2022-09-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用
CN113292659B (zh) * 2021-05-19 2022-06-17 江苏省农业科学院 重组蛋白和猪流行性腹泻疫苗组合物
WO2022256695A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Mazen Animal Health Inc. Oral administration of coronavirus spike protein for altering cytokine levels and providing passive immunity to newborn pigs
CN113583141B (zh) * 2021-08-04 2023-03-03 江西农业大学 猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用
CN114395574B (zh) * 2022-01-18 2023-08-11 长沙爱科博生物科技有限公司 一种猪流行性腹泻病毒融合蛋白及其编码基因与应用
CN116024244B (zh) * 2022-08-04 2023-09-22 长沙爱科博生物科技有限公司 一种融合蛋白基因及其应用
CN115957349B (zh) * 2022-10-08 2024-04-05 华中农业大学 激活猪的pja1基因表达的制剂在制备猪抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用
CN117143207B (zh) * 2023-09-05 2024-03-12 湖南派智生物科技有限公司 一种重组表位蛋白、编码基因、重组质粒、制备方法、工程菌及应用

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0501523B1 (en) 1983-11-14 1997-04-09 Columbia Laboratories, Inc. Bioadhesive compositions
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
IL84154A0 (en) 1986-10-16 1988-03-31 Microgenesys Inc Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0386185A1 (fr) 1988-07-29 1990-09-12 IntraCel Corporation Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
DK0465529T3 (da) 1989-03-21 1998-10-05 Vical Inc Ekspression af exogene polynukleotidsekvenser i et hvirveldyr
US5552143A (en) 1989-03-24 1996-09-03 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
GB9001766D0 (en) 1990-01-25 1990-03-28 Univ Court Of The University O Vaccines
KR100242671B1 (ko) 1991-03-07 2000-03-02 고돈 에릭 유전학적으로 처리한 백신 균주
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
US5382425A (en) 1992-01-13 1995-01-17 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
US5801029A (en) 1993-02-16 1998-09-01 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
EP0620277A1 (en) 1993-03-18 1994-10-19 Merck & Co. Inc. Nucleic acid pharmaceuticals
FR2711670B1 (fr) 1993-10-22 1996-01-12 Pasteur Institut Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
ATE475668T1 (de) 1994-01-27 2010-08-15 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch impfung von dns transkriptionseinheit
AU694519B2 (en) 1994-04-29 1998-07-23 Immuno Aktiengesellschaft Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
KR0179947B1 (ko) 1994-05-06 1999-03-20 윤인중 돼지 유행성 설사병과 전염성 위장염 바이러스 혼합 사독 유성백신의 제조방법
KR0143239B1 (ko) 1994-12-22 1998-07-01 김광희 돼지 유행성 설사병 예방약 생산을 위한 약독화 바이러스주
CA2215162A1 (en) 1995-03-23 1996-09-26 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Vectors for gene delivery
JP2002512501A (ja) 1996-07-03 2002-04-23 メリアル インコーポレイテッド 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ）
JP3003989B2 (ja) 1996-09-18 2000-01-31 全国農業協同組合連合会 豚流行性下痢ウイルス（ｐｅｄｖ）感受性細胞の作出法
US6183752B1 (en) 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
KR100267745B1 (ko) 1998-01-10 2000-11-01 . 돼지 유행성설사병 바이러스의 특이 중화항체 검출방법
EP2481401A1 (en) 1999-01-18 2012-08-01 LG Life Sciences, Ltd. Lipophilic microparticles containing a protein drug or antigen and formulation comprising same
KR100432977B1 (ko) 2001-04-19 2004-05-28 녹십자수의약품(주) 돼지 아미노펩티다제 엔을 이용한 돼지 유행성 설사병바이러스의 배양방법 및 그 생독 백신
CN1561389A (zh) * 2001-07-25 2005-01-05 纽约大学 糖基神经酰胺作为用于抗传染病和癌症的疫苗的佐剂的用途
JP3812814B2 (ja) 2001-10-19 2006-08-23 株式会社微生物化学研究所 動物用多価オイルアジュバントワクチン
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
KR100492820B1 (ko) 2002-04-16 2005-05-31 양문식 돼지 유행성 설사병 바이러스 중화 에피토프 및 이의 이용
US20070286872A1 (en) 2003-04-23 2007-12-13 Vanderbilt University Live Attenuated Nidovirus Vaccines
KR100502008B1 (ko) 2003-04-29 2005-07-18 녹십자수의약품(주) 약독화된 돼지 유행성설사병 바이러스, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 상기 바이러스를 검출하는 방법
US7527967B2 (en) 2003-11-25 2009-05-05 Academia Sinica Recombinant baculovirus and virus-like particle
KR100622399B1 (ko) * 2004-01-14 2006-09-18 대한민국 불활화시킨 ｔｇｅｖ 및 ｐｅｄｖ을 함유하는 혼합불활화백신 및 그 제조방법
JP4873632B2 (ja) 2004-01-21 2012-02-08 メリアル リミテッド 改良された不活化ｆｃｖワクチン
CN1323718C (zh) 2004-03-15 2007-07-04 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法
US7452542B2 (en) 2004-05-21 2008-11-18 Vanderbilt University Live attenuated coronavirus vaccines
CN1827172A (zh) 2005-04-27 2006-09-06 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 以犬ⅱ型腺病毒为载体的猪病毒性传染病基因重组活疫苗及生产工艺
KR100737434B1 (ko) 2006-03-10 2007-07-09 대한민국 돼지전염성위장염바이러스, 유행성설사바이러스 및로타바이러스의 혼합생백신 및 이를 이용한 백신접종방법
RU2357755C2 (ru) 2006-09-27 2009-06-10 Виталий Александрович Сергеев Инактивированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней (тгс) и эпизоотической диареи свиней (эдс) из кишечного вируса искусственно зараженных безмолозивных поросят (вакцина тгэдс)
KR100773141B1 (ko) 2006-10-26 2007-11-02 재단법인서울대학교산학협력재단 돼지 유행성 설사 바이러스 ｏｒｆ3 폴리펩티드 변이체,그를 코딩하는 핵산, ｏｒｆ3 변이체 및 변이 유전자를이용하여 야생형과 약독화형 ｐｅｄｖ를 구별하는 방법 및야생형과 약독화형 ｐｅｄｖ를 구별하기 위한 키트
KR100773241B1 (ko) * 2006-12-06 2007-11-05 주식회사한국야쿠르트 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 중화항원 및 그 응용
CN101117627B (zh) 2007-02-01 2010-07-14 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其应用
CN101491673A (zh) 2008-12-26 2009-07-29 天津瑞普生物技术股份有限公司 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联疫苗
KR101671528B1 (ko) 2010-12-14 2016-11-01 단국대학교 산학협력단 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프와 점막면역보조제를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR20120066555A (ko) 2010-12-14 2012-06-22 단국대학교 산학협력단 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 ｐｅｄｖ 백신 조성물
KR101680903B1 (ko) 2010-12-14 2016-11-30 단국대학교 산학협력단 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프와 로타바이러스 유전자를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물
CN102949718B (zh) 2011-08-26 2015-06-17 普莱柯生物工程股份有限公司 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗
CN102399806A (zh) 2011-12-16 2012-04-04 武汉华扬动物药业有限责任公司 猪流行性腹泻s1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用
CN102988971B (zh) * 2012-12-04 2014-11-26 山东信得科技股份有限公司 一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法
CN103041385B (zh) 2013-01-29 2014-02-19 齐鲁动物保健品有限公司 一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗及其制备方法
CN103585625B (zh) 2013-11-29 2015-12-02 华南农业大学 一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
KR101442493B1 (ko) 2014-02-21 2014-09-26 우진 비앤지 주식회사 돼지유행성설사병바이러스 약독화주 및 이를 포함하는 돼지유행성 설사병 백신 조성물
CN106535930A (zh) * 2014-03-11 2017-03-22 明尼苏达大学董事会 猪流行性腹泻病毒疫苗及其使用方法
CN103992989B (zh) 2014-03-20 2015-02-25 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 一种猪流行性腹泻病毒及其应用
CA2943816A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine epidemic diarrhea virus vaccine

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200121447A (ko) * 2019-04-16 2020-10-26 주식회사 바이오앱 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물 및 이의 제조 방법

Also Published As

Publication number Publication date
JP6704964B2 (ja) 2020-06-03
CA2943816A1 (en) 2015-10-08
EA201691993A1 (ru) 2017-02-28
CN112316129A (zh) 2021-02-05
JP2018203757A (ja) 2018-12-27
CN107073101A (zh) 2017-08-18
US9950061B2 (en) 2018-04-24
JP2017511328A (ja) 2017-04-20
JP6395855B2 (ja) 2018-09-26
CN107073101B (zh) 2020-10-27
AU2015241107B2 (en) 2019-10-03
US20150283229A1 (en) 2015-10-08
US10702601B2 (en) 2020-07-07
MX2016012845A (es) 2017-01-11
US20180207260A1 (en) 2018-07-26
AU2015241107A1 (en) 2016-10-06
WO2015153425A1 (en) 2015-10-08
EP3125932A1 (en) 2017-02-08

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TW200825099A (en) Novel H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use

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