CN108135993B - 用于先天性震颤的瘟病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于为仔猪提供针对与新瘟病毒相关之疾病的保护的疫苗。所述疫苗通常包含瘟病毒抗原和任选的佐剂。还提供了用于为仔猪提供针对与瘟病毒相关之疾病的保护(包括但不限于先天性震颤)的方法以及生产瘟病毒疫苗的方法。

Description

用于先天性震颤的瘟病毒疫苗
相关申请
本申请要求于2015年8月31日提交的美国申请No.62/212,124的权益，其通过引用整体并入本文。
背景技术
A.技术领域
本发明涉及能够减轻先天性震颤(congenital tremor，CT)或先天性肌阵挛(myoclonia congenita)的临床症状的瘟病毒疫苗。这种病症被非正式地称为摇抖仔猪(shaking piglet)、摇动仔猪(shaker piglet)或颤抖仔猪(trembling piglet)。
瘟病毒属(Pestivirus)是黄病毒科(family Flaviviridae)中的一个病毒属。瘟病毒属中的病毒感染哺乳动物，包括猪科(family Suidae)(其包括猪的不同物种)的成员。
CT是见于新生猪中的一种散发性疾病。通常，在一窝幼崽(litter)中会影响一只以上猪。如果震颤对于仔猪来说太剧烈而不能找到乳头并吮吸，那么死亡率可能较高。受影响幼崽中或畜群爆发中的死亡率可提高至超过正常值3％至10％。这种病症随着受影响的仔猪生长而减轻。
CT分为五种类型。AI、AIII、AIV和AV型与暴露于典型猪热病毒、遗传性状或暴露于敌百虫(trichlorfon)有关。由于这些原因是已知的并且因此得以避免，因此假定AII型为最常见的原因。认为AII型与病毒感染有关。第2组中的致病病毒在大多数(如果不是全部的话)猪群中普遍存在，但在大多数畜群中几乎没有发现疾病，可能是因为在母猪群中建立了免疫力。然而，在新的小母猪群中，在第一次生产期间可存在涉及一窝所有幼崽中多至80％的大爆发。这在任何新的小母猪群中都是无法量化的风险。
猪先天颤抖的原因是相对于脑和脊髓的髓鞘形成减少(hypomyelination)或脱髓鞘(demyelination)之原发性病变的继发性病变。对于这种病症没有特异性的治疗。然而，辅助吮吸以及提供可以避免寒冷和覆盖的环境将允许更多的猪随时间而恢复，但是断奶体重可能会下降1kg或更多。
B.相关技术描述
虽然早期有报道称1型和2型猪圆环病毒(circovirus)(参见，Burnborg等，“Association of myocarditis with high viral load of porcine circovirus type2in several tissues in cases of fetal death and high mortality in piglets.Acase study.”J Vet Diagn Invest.19(4)：368-375，2007)或星状病毒(参见Blomstrom等，“Astrovirus as a possible cause of congenital tremor type AII in piglets？”Acta Vet Scand.56(1)：82，2014)感染是CT的原因，但是这此后已经被证明有误(参见Ha等，“Lack of evidence of porcine circovirus type 1and type 2infection inpiglets with congenital tremors in Korea”，Vet Rec.(2005)156：383-384；Kennedy等，“Absence of evidence of porcine circovirus infection in piglets withcongenital tremors”J Vet Diagn Invest.2003年3月；15(2)：151-156)。因此，没有仔猪中AII型CT的明确致病源，并且因此没有这种病症的有效治疗。
发明概述
针对上述技术问题的解决方案通过本说明书和在权利要求书中表征的实施方案而实现。因此，本发明在其不同方面根据权利要求书来实施。
本发明提供了克服本领域中的缺陷的免疫原性组合物、疫苗及相关方法。所述组合物和方法提供了用于仔猪中先天性震颤的治疗。
在一方面，本发明的组合物可包含灭活瘟病毒，所述瘟病毒包含与SEQ ID NO：1具有至少约95％同一性，例如至少约96％、97％、98％或至少约99％，例如100％同一性的核酸序列。在另一方面，本公开内容提供了包含灭活瘟病毒的组合物，所述瘟病毒包含与SEQ IDNO：2具有至少约95％同一性，例如至少约96％、97％、98％或至少约99％，例如100％同一性的氨基酸序列。
在本发明组合物的一些实施方案中，所述瘟病毒是经化学灭活的瘟病毒，例如通过用例如以下的灭活剂处理而灭活的瘟病毒：二元亚乙基亚胺(binary ethyleneimine)、亚乙基亚胺(ethyleneimine)、乙酰基亚乙基亚胺(acetylethyleneimine)、β-亚乙基亚胺(beta-ethyleneimine)、β-丙内酯、戊二醛、臭氧和/或甲醛。
在一些实施方案中，所述瘟病毒是经物理灭活的瘟病毒，例如通过用UV辐射、X射线辐射、γ辐射、冷冻-解冻和/或加热处理而灭活的瘟病毒。
在另一方面，本文中提供的组合物可包含减毒瘟病毒，所述瘟病毒包含与SEQ IDNO：1具有至少约95％同一性，例如至少约96％、97％、98％或至少约99％，例如100％同一性的核酸序列。在另一方面，所述组合物可包括含有减毒瘟病毒的组合物，所述瘟病毒包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％同一性，例如至少约96％、97％、98％或至少约99％，例如100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中所述的瘟病毒可以是冻干形式。在一个实施方案中，组合物具有至少约104个病毒颗粒，例如至少约104、105、106、107、108、109或至少约1010个病毒颗粒。
在一些实施方案中，本文中公开的组合物可包含可药用载体和/或赋形剂，例如佐剂，例如基于水包油型乳剂的佐剂。
在一些实施方案中，组合物可包含本文中所述的灭活瘟病毒和减毒瘟病毒的混合物。本公开内容的特征还在于包含本文中所述的灭活瘟病毒、减毒瘟病毒和载体的混合物的组合物。
在另一方面，本公开内容提供了包含载体(例如杆状病毒表达载体或犬腺病毒载体)的组合物，所述载体包含至少一个与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％或99％)同一性的核酸序列，例如至少一个与SEQID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21具有100％同一性的核酸序列。在另一方面，本公开内容的特征在于包含载体的组合物，所述载体包含至少一个编码与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20或22具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的序列，例如至少一个编码与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20或22具有100％同一性的氨基酸序列的序列。在一些实施方案中，所述组合物可包含上述载体的混合物。
还提供了用于为仔猪提供针对与瘟病毒相关之疾病的保护(例如，先天性震颤)的方法。所述方法可包括以足以保护仔猪的量向妊娠母猪或小母猪施用，或者在繁育之前向母猪或小母猪施用，或者向新生仔猪施用本文中所述的任何组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括向母猪或小母猪肌内、皮下、静脉内、经口、动脉内、鼻内(例如，具有或没有吸入)、心内、脊柱内、胸内(intrathoracically)、腹膜内、室内、舌下、经皮和/或通过吸入施用所述组合物。在一个实施方案中，所述施用是第一次施用，并且所述方法包括在第一次施用后一至三周的第二次施用。
在一些方面，本公开内容提供了本文中所述的任何组合物，例如包含灭活瘟病毒、减毒瘟病毒和/或载体的组合物，其用作药物或用于制备药物。在一些实施方案中，本文中所述的组合物用于为仔猪提供针对与瘟病毒相关之疾病的保护，例如先天性震颤。
本发明涉及本发明的灭活瘟病毒疫苗或经修饰的活瘟病毒疫苗。图1和图2鉴定了本发明的瘟病毒的系统发生树。氨基酸邻接树(neighbor-joining tree)是基于NS3的在瘟病毒之中在部分和全基因组序列之间重叠的212个氨基酸。多样性水平与瘟病毒的新物种一致。瘟病毒在核苷酸水平上在所鉴定的分离株之间83％至98％保守，如图3所示。
本发明的瘟病毒可用于制备这样的疫苗。特别地，本发明提供了下文鉴定的经改良瘟病毒分离株，或者上述分离株之一的任何后代或子代。
本发明的瘟病毒的特征可在于所述病毒可以通过在细胞培养物中传代至少四次来减毒，使得当向易患CT的猪或其他哺乳动物施用经修饰的病毒时，其不会引起CT疾病的临床症状，而是能够诱导使哺乳动物针对所述瘟病毒的致病形式免疫的免疫应答。
本发明的瘟病毒分离株可在细胞培养物中体外传代多于10次，优选至少20次，还更优选至少30次，甚至更优选至少40次，还更优选至少50次，甚至更优选至少55次，还更优选至少60次，甚至更优选至少70次，还更优选至少80次，甚至更优选至少90次，还更优选至少95次，并且最优选至少100次。
构想了所述疫苗可包含适于皮内或肌内施用的载体。在一些实施方案中，所述疫苗是冻干形式。在一些具体实施方案中，所述疫苗包含至少约104个病毒颗粒。本发明提供了克服本领域中的缺陷的免疫原性组合物、疫苗及相关方法。本发明涉及包含灭活瘟病毒或经修饰的活减毒瘟病毒的免疫原性组合物。另一些免疫原性组合物包括含有重组表达的或作为载体平台的一部分递送的亚基因组抗原的疫苗。特别地，本申请提供了用于为猪并且尤其是仔猪提供与本发明的瘟病毒分离株相关之疾病的保护的疫苗。
本发明的另一方面涉及瘟病毒，所述瘟病毒包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示的序列具有至少约95％同一性，例如至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及瘟病毒，所述瘟病毒包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示的序列具有至少约95％同一性，例如至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及用于制备用于防治先天性震颤的灭活疫苗或活减毒疫苗的方法，其包括将本文中所述的灭活瘟病毒或活减毒瘟病毒与可药用载体混合。
本发明的免疫原性组合物和疫苗包含灭活瘟病毒或经修饰的活瘟病毒，并且还可包含佐剂。所述疫苗还可包含其他成分，例如防腐剂、稳定剂和针对其他猪病原体的抗原。
本领域技术人员将理解，本文中使用的组合物可并入已知的可注射的生理上可接受的无菌溶液。为了制备用于肠胃外注射或输注的即用型溶液，可容易地利用水性等张溶液，例如盐水或血浆蛋白溶液。此外，本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物可包含药学或兽医学上可接受的载体、稀释剂、等张剂、稳定剂或佐剂。
本发明的方法还可包括将本发明的组合物与兽医学上可接受的载体、佐剂、或其组合混合。本领域技术人员将认识到，载体、佐剂或组合的选择将根据递送途径、个人喜好和动物物种等来确定。
本发明的另一方面构想了用于为猪提供针对瘟病毒感染之保护的疫苗，其包含本发明的灭活瘟病毒或活减毒瘟病毒，以及可药用载体。
这样的疫苗可有利地另外包含一种或更多种非瘟病毒或不同于本发明瘟病毒的瘟病毒、其减毒或灭活病原体或者抗原性物质。例如，非瘟病毒病原体可选自：伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、猪流感病毒(Porcine influenza virus)、猪细小病毒(Porcineparvovirus)、传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、支气管败血性鲍特杆菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、包括但不限于2型猪圆环病毒(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)的猪圆环病毒、猪生殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。
还公开了用于治疗或预防由瘟病毒引起的感染的方法。所述方法包括向动物(特别是妊娠母猪或小母猪)施用有效量的本发明的免疫原性组合物，其中所述治疗或预防由此被提供于仔猪。所述治疗或预防选自减轻CT感染的症状、降低CT感染的临床症状的严重程度或发生率、降低CT感染的动物死亡率，及其组合。
在本文中，可施用本发明组合物的合适对象和有需要对象包括需要预防或治疗病毒、微生物、寄生虫、原生动物、细菌或真菌相关感染、疾病或病症的动物。通过使用本发明的组合物或方法在其中刺激免疫应答的动物包括家畜，例如猪、牛、山羊和绵羊。优选的动物包括猪、鼠科动物、马科动物、兔类动物和牛科动物。最优选地，在猪并且尤其是母猪、小母猪和仔猪中刺激免疫应答。
本发明提供了降低与瘟病毒感染相关或由瘟病毒感染引起的一种或更多种临床症状的发生率或严重程度的方法，其包括以下步骤：施用如本文中提供的本发明的免疫原性组合物，使得相对于未接受如本文提供的免疫原性组合物的对象，瘟病毒感染的临床症状的发生率或严重程度降低至少10％，优选至少20％，甚至更优选至少30％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少70％，最优选至少100％。这样的临床症状包括全身颤抖和不同程度的摇动。仔猪通常天生摇动、颤抖和点头，并且主动刺激通常会加剧摇动。当仔猪入睡时，摇动倾向于停止。此外，可能会出现肌肉震颤(在仔猪到处走动时)、神经症状、缺乏协调、“狗式坐”和死亡率增加。在一些情况下，颤抖可能在24至48小时龄之前不会变得明显。对仔猪的影响包括影响吮吸，其中在严重情况下，需要将仔猪物理保持在乳头上。根据爆发的严重程度，死亡率水平可以为15％至20％，并且在更严重的爆发中为高达30％至40％。临床严重程度的其他量度包括日均增重的降低和神经损伤。
优选的施用途径包括鼻内、经口、皮内和肌内。肌内或阴道内施用，最优选以单剂量肌内或阴道内施用是优选的。技术从业者将认识到，本发明的组合物也可以以多个(例如，两个或更多个)剂量施用，以及通过其他或多种施用途径施用。例如，这样的其他途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心内、叶内(intralobally)、髓内或肺内。根据期望的治疗持续时间和有效性，根据本发明的组合物可以施用一次或多次，也可间歇地施用，例如每天施用持续数日、数周或数月并且以不同的剂量施用。
还构想了用于针对非哺乳动物细胞制备活减毒瘟病毒的方法。
本发明的新疫苗不限于任何特定制备类型或方法。这些疫苗通过本领域已知的标准方法制备。最优选的瘟病毒疫苗递送是针对有毒的瘟病毒对小母猪或妊娠母猪进行接种，将母体的免疫力转移给仔猪。
从下面的详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，尽管说明了本发明的一些优选实施方案，但详细描述和具体实例仅以说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围之内的多种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅结合本文中给出的对一些具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1和2示出了鉴定本发明的新瘟病毒的系统发生树。
图3是本发明的瘟病毒序列的氨基酸同一性(同一性百分比)的比较。
图4示出了在实施例1中测试的仔猪中病毒血症的循环。
图5A和5B示出了瘟病毒的系统发生关系。邻接系统发生树用对通过ClustalW多重比对进行比对的瘟病毒NS3(5A)和Npro(5B)氨基酸进行1,000次自举(bootstrap)采样(MEGA 6.0)而生成。名称中指示了每个样品的GenBank登录号。圆圈表示从该研究描述的序列，三角形表示来自该研究中描述的用于接种的病毒的序列。
图6是根据样品类型示出了阳性百分比和平均RT-qPCR Cq的条形图。通过靶向NS3基因的RT-qPCR检测瘟病毒RNA。在接种PBS的仔猪中未检测到病毒RNA。
图7是示出了经疫苗接种的仔猪中灭活瘟病毒诱导的瘟病毒特异性血清学应答的图。
发明详述
本发明提供了灭活瘟病毒、减毒瘟病毒和亚单位疫苗或免疫原性组合物，其可以向母猪或小母猪施用以降低其仔猪中先天性震颤的临床影响。此外，描述了施用方法、制备疫苗的方法、测定以及本发明的其他方面。
优选地，根据本发明的瘟病毒是具有以下核酸序列或具有以下氨基酸序列的灭活瘟病毒和/或经修饰的活瘟病毒和/或减毒瘟病毒，所述核酸序列与SEQ ID NO：1具有至少约95％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少95％同一性，例如与SEQ ID NO：2具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性。
Figure GDA0003359095520000081
Figure GDA0003359095520000091
Figure GDA0003359095520000101
Figure GDA0003359095520000111
Figure GDA0003359095520000121
Figure GDA0003359095520000131
本公开内容还提供了编码瘟病毒的Npro、衣壳、Erns、E1、E2、NS2-3、解旋酶、NS4B、NSSA或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)蛋白的载体和感染性分子克隆。
Npro：编码由180个氨基酸组成的N-末端蛋白酶(Npro)蛋白的基因见于SEQ IDNO：1的第378至917位。
Figure GDA0003359095520000132
Figure GDA0003359095520000141
衣壳：编码由111个氨基酸组成的衣壳蛋白的基因见于SEQ ID NO：1的第918至1250位。
Figure GDA0003359095520000142
Erns：编码由209个氨基酸组成的包膜蛋白Erns的基因见于SEQ ID NO：1的第1251至1877位。
Figure GDA0003359095520000143
E1：编码由200个氨基酸组成的包膜蛋白E1的基因见于SEQ ID NO：1的第1878至2477位。
Figure GDA0003359095520000151
E2：编码由372个氨基酸组成的包膜蛋白E2的基因见于SEQ ID NO：1的第2478至3593位。
Figure GDA0003359095520000152
NS2-3：编码由934个氨基酸组成的非结构蛋白NS2-3的基因见于SEQ ID NO：1的第3594至6395位。
Figure GDA0003359095520000161
Figure GDA0003359095520000171
Figure GDA0003359095520000181
解旋酶：编码由687个氨基酸组成的解旋酶蛋白的基因见于SEQ ID NO：1的第4335至6395位。
Figure GDA0003359095520000182
Figure GDA0003359095520000191
NS4B：编码由67个氨基酸组成的非结构蛋白NS4B的基因见于SEQ ID NO：1的第6396至6596位。
Figure GDA0003359095520000192
NS5A：编码由811个氨基酸组成的非结构蛋白NS5A的基因见于SEQ ID NO：1的第6597至9029位。
Figure GDA0003359095520000201
Figure GDA0003359095520000211
RdRp：编码由751个氨基酸组成的RNA依赖性RNA聚合酶的基因见于SEQ ID NO：1的第9030至11285位。
Figure GDA0003359095520000212
Figure GDA0003359095520000221
在一个实施方案中，根据本发明的瘟病毒是瘟病毒突变体，其特别地与野生型瘟病毒的基因组相比在编码所述病毒的蛋白质的基因中包含突变。
在一个优选实施方案中，根据本发明的瘟病毒在编码所述病毒的以下蛋白质的基因中包含突变：Npro、衣壳、Erns、E1、E2、NS2-3、解旋酶、NS4B、NS5A或RdRp蛋白。因此，本发明优选涉及由于编码瘟病毒多聚蛋白(polyprotein)的基因中的突变而表现出降低的病毒适合度(fitness)的瘟病毒，其中所述突变优选为下文中提到的突变。
优选地，如本文中所述的突变包含一个或更多个点突变和/或一个或更多个基因组缺失和/或一个或更多个插入，或者由其组成。
本文中使用的免疫原性组合物还指包含本文中所述的任何瘟病毒多聚蛋白的组合物。根据另一个实施方案，这样的免疫原性组合物还包含表达所述瘟病毒多聚蛋白并且特别是E2蛋白的病毒载体，优选重组杆状病毒的至少一部分。此外，所述免疫原性组合物可以包含：i)上述任何瘟病毒蛋白，优选为上述浓度；ii)表达多聚蛋白中经加工蛋白质的所述瘟病毒多聚蛋白的病毒载体，优选重组杆状病毒的至少一部分；和iii)细胞培养物上清液的一部分。
根据另一个实施方案，本发明还涉及包含如本文中所述的任何这样的核酸分子的载体。换言之，本发明涉及包含任何这样的瘟病毒多聚蛋白或其部分的编码序列的载体。优选地，所述载体是表达载体，其允许表达任何这样的瘟病毒多聚蛋白或所述蛋白质的部分。根据本发明的载体是适于在体外或体内转染或感染细菌、酵母或动物细胞的那些。
本发明的疫苗通常包含与可药用载体一起配制的灭活或减毒瘟病毒。适用于可注射用途的药物形式通常包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。制剂应期望地是无菌的，并且达到流体的程度以容易注射性。剂型应在制备和储存条件下是稳定的，并且通常防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。一种可能的载体是生理盐溶液。可以例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来实现防止微生物的作用，所述抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞(乙基汞基-硫代水杨酸钠)、新霉素(deomycin)、庆大霉素等。在许多情况下，可优选地包含等张剂，例如糖或氯化钠。如果需要的话，可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
本发明疫苗的单剂量的体积可以变化，但一般在常规疫苗中常用的范围内。在上述缀合物和佐剂的浓度下，单剂量的体积优选为约0.1ml至约3ml，优选约0.2ml至约1.5ml，更优选约0.2ml至约0.5ml。
本发明的疫苗组合物可以通过本领域已知的任何方便方式施用，例如，肌内、皮下、静脉内、经口、动脉内、鼻内(例如，具有或没有吸入)、心内、脊柱内、胸内、腹膜内、室内、舌下、经皮和/或通过吸入。
施用所述组合物的对象优选为动物，包括但不限于猪、牛、马、绵羊、家禽(例如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和大鼠。最优选地，哺乳动物是猪，更优选母猪、小母猪或仔猪。在一些实施方案中，母猪或小母猪可以是妊娠的。
本发明的制剂包含有效免疫量的一种或更多种免疫原性组合物和生理上可接受的载剂。疫苗包含有效免疫量的一种或更多种免疫原性组合物和生理上可接受的载剂。所述制剂应符合施用模式。
如果需要的话，所述免疫原性组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。所述免疫原性组合物可以是液体溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂。经口制剂可包含标准载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
优选的施用途径包括但不限于鼻内、经口、皮内和肌内。肌内或阴道内施用，最优选以单剂量肌内或阴道内施用是期望的。技术人员将认识到，本发明的组合物也可以以一个、两个或更多个剂量施用以及通过其他施用途径施用。例如，这样的其他途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心内、叶内、髓内或肺内。根据期望的治疗持续时间和有效性，根据本发明的组合物可施用一次或多次，也可间歇地施用，例如每天施用持续数日、数周或数月并且以不同的剂量施用。
本发明的一些实施方案还包括用于为仔猪提供针对与瘟病毒相关之疾病的保护的方法，其包括向妊娠母猪或小母猪施用本文中所述的任何减毒疫苗。例如，所施用的疫苗包含一种或更多种瘟病毒抗原。
因此，根据一个方面，本发明涉及用于降低仔猪群中瘟病毒感染百分比的方法，其包括以下步骤：向妊娠母猪或小母猪施用有效量的灭活或减毒瘟病毒抗原或包含瘟病毒抗原的免疫原性组合物，其中所述瘟病毒抗原是灭活瘟病毒、减毒瘟病毒或亚单位疫苗。
在一个实施方案中，本发明的瘟病毒是由SEQ ID NO：1或2的序列编码或者包含SEQ ID NO：1或2的序列的任何瘟病毒；该序列与SEQ ID NO：1或2具有至少99％同一性；和/或所述瘟病毒由与SEQ ID NO：1或2具有至少90％同一性的核酸序列编码。
在另一个实施方案中，所述方法包括施用包含选自以下瘟病毒的一种或更多种免疫原性组分的疫苗，所述瘟病毒由SEQ ID NO：1的序列编码或包含SEQ ID NO：1的序列；该序列与SEQ ID NO：2具有至少99％同一性；其中多聚蛋白由SEQ ID NO：1或2的核酸序列编码；和/或其中瘟病毒多聚蛋白由与SEQ ID NO：1或2具有至少90％同一性的核酸序列编码。
本文中所述的化合物可以以治疗有效剂量向对象施用以治疗瘟病毒相关疾病。所述剂量将取决于接受疫苗的宿主以及例如宿主的大小、体重和年龄的因素。
组合物的免疫原性可以通过使用本领域已知的任何免疫测定监测用所述组合物免疫接种后测试对象的免疫应答来确定。体液(抗体)应答和/或细胞介导的免疫力的产生可以视为免疫应答的指示。测试对象可包括动物，例如猪、小鼠、仓鼠、狗、猫、兔、牛、马、绵羊和家禽(例如鸡、鸭、鹅和火鸡)。
测试对象的免疫应答可以通过多种方法进行分析，例如：如通过已知技术(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀等)测定的所得免疫血清与免疫原性缀合物的反应性；或者，如通过本领域已知的任何方法测定的经免疫宿主针对病原体感染的保护和/或经免疫宿主中由病原体感染引起的症状的减轻，测定感染性疾病病原体(agent)的水平，例如，细菌水平(例如，通过培养来自对象的样品)，或者本领域已知的其他技术。还可以通过测量免疫球蛋白所针对的抗原的水平来确定感染性疾病病原体的水平。感染性疾病病原体的水平降低或感染性疾病的症状改善表明组合物是有效的。
在动物或人中体内使用之前，可以在体外测试本发明治疗剂的期望治疗或预防活性。例如，可用于确定是否指示施用特定治疗剂的体外测定包括体外细胞培养测定，其中使来自细胞系的合适细胞或者从患有特定疾病或病症的对象培养的细胞暴露于治疗剂或以其他方式施用治疗剂，并观察治疗剂对细胞的作用。
或者，可以如下测定治疗剂：使治疗剂与易于被感染性疾病病原体感染但未被感染性疾病病原体感染的细胞(从对象或从培养的细胞系培养的)接触，使细胞暴露于感染性疾病病原体，然后确定与治疗剂接触的细胞的感染率是否低于未与治疗剂接触的细胞的感染率。感染性疾病病原体对细胞的感染可通过本领域已知的任何方法测定。
此外，可以通过在治疗之前、期间或之后以合适的时间间隔在动物模型或人对象中测量抗体针对的分子的水平来评估治疗剂。可以鉴定分子的量的任何变化或不存在变化，并与对对象的治疗效果相关联。可以通过本领域已知的任何方法测定分子的水平。
在使用本发明的方法和组合物向动物疫苗接种瘟病毒疫苗或免疫原性组合物之后，可以使用本领域已知的任何结合测定来评估所得抗体与特定分子之间的结合。还可以进行这些测定以选择对特定抗原表现出较高亲和力或特异性的抗体。
一般而言，病毒的减毒可以由致病性病毒分离株通过在允许病毒的合适宿主细胞中重复传代直到病毒显示出所期望的特性来产生(WO 92/21375、WO 93/06211、WO93/03760、WO 93/07898、WO 96/36356、EP 0 676 467、EP 0 732 340、EP 0 835 930)。或者，其可以通过使用病毒基因组的感染性克隆(通常为全长互补DNA转录物)通过遗传再造产生(WO 98/18933、EP 1 018 557、WO 03/062407，Nielsen等，J Virol 2003，77：3702-3711)。另外，可以在非天然生理条件下使病毒传代，所述条件包括但不限于经调节的温度、来自非宿主物种的细胞或存在诱变剂。
本发明延伸至由毒株通过以相同或相异形式增殖或倍增得到的瘟病毒毒株，特别是具有所保藏毒株的基本特征的后代。在持续增殖后，毒株可能获得突变，其中大部分突变不会显著改变这些毒株的特性。
在另一方面，本发明构想了瘟病毒SEQ ID NO：1或2的子代或后代的制备和分离。因此，本发明延伸至由鉴定的毒株通过以相同或相异形式增殖或倍增得到的瘟病毒毒株，特别是具有所鉴定毒株的基本特征的后代。在持续增殖后，毒株可能获得突变，其中大部分突变不会显著改变这些毒株的特性。
本发明的分离株还可被进一步修饰以赋予其更理想的特性。这可以通过典型的增殖和选择技术来实现，例如在合适的宿主细胞中持续增殖以延伸减毒表型。或者，可以通过合适的遗传工程技术通过对这些毒株的基因组的核酸序列进行定向突变来对分离株进行遗传修饰。
用于制备经修饰序列的重组技术是本领域技术人员熟知的，并且通常采用构建病毒基因组的全长互补DNA拷贝(感染性克隆)，然后可通过DNA重组和操作方法(例如，如定点诱变等)对其进行修饰。这样，例如，可修饰病毒蛋白的抗原位点或酶特性。
优选地，本发明包括与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列共有至少95％序列同源性的瘟病毒核酸序列，这样，病毒可能会在用含有这样的同源序列的减毒病毒对动物进行疫苗接种之后有效地赋予免疫力。SEQ ID NO：1或2所示的序列是减毒瘟病毒的全长序列，并且具有约11,550个碱基的全长序列。
本发明的瘟病毒毒株适用于本发明的疫苗，其可以通过本领域已知的方法，例如通过在合适的宿主细胞中增殖来培养和收获。
特别地，如本文中提及的疫苗是活疫苗和/或经修饰活疫苗-减毒疫苗。根据本发明的瘟病毒毒株可以通过本领域已知的方法，例如通过在合适的细胞中增殖来培养和收获。经修饰的活疫苗(modified live vaccine，MLV)通常被配制成允许每剂量施用101至107个病毒颗粒，优选每剂量103至106个颗粒，更优选每剂量104至106个颗粒(4.0-6.0log10TCID50)。
本发明的一个实施方案包括生产瘟病毒疫苗的方法，其包括：(a)用瘟病毒接种细胞；(b)孵育经接种的细胞；(c)从经孵育细胞中收获瘟病毒。在一个优选实施方案中，所述方法包括包含以下的瘟病毒：由SEQ ID NO：1或2的序列编码或者包含SEQ ID NO：1或2的序列的序列；与SEQ ID NO：1或2具有至少99％同一性的序列；由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的蛋白质；和/或由与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的核酸序列编码的多聚蛋白。所述方法还可包括向瘟病毒疫苗中添加佐剂，优选地，所述佐剂是
Figure GDA0003359095520000271
基于水包油型乳剂的佐剂。
本发明的另一个实施方案包括生产重组疫苗的方法，其包括：在宿主细胞中表达一种或更多种瘟病毒抗原；以及收获瘟病毒细胞的一种或更多种抗原。在一个这样的实施方案中，所述方法可包括：一种或更多种包含编码瘟病毒蛋白抗原的分离的核酸的抗原，其中重组瘟病毒多肽与SEQ ID NO：1或2具有至少90％的同源性；包含a)的分离的核酸的载体；由a)的核酸编码的重组瘟病毒蛋白；及其任意组合。在一个示例性实施方案中，一种或更多种瘟病毒抗原由重组杆状病毒载体表达。所述方法可包括在昆虫细胞中表达的一种或更多种瘟病毒抗原。一个实施方案还包括向瘟病毒疫苗中添加佐剂，优选地，其中所述佐剂是
Figure GDA0003359095520000272
基于水包油型乳剂的佐剂。
使用本发明的瘟病毒肽产生的抗体或其结合部分可用于在样品中检测瘟病毒的存在。该检测方法包括以下步骤：提供针对本发明的瘟病毒肽产生的分离的抗体或其结合部分，向分离的抗体或其结合部分添加怀疑含有一定量瘟病毒的样品，以及检测包含与瘟病毒结合的分离的抗体或其结合部分的复合物的存在。
本发明的抗体或其结合部分还可用于在样品中检测瘟病毒肽的存在。该检测方法包括以下步骤：提供针对瘟病毒肽产生的分离的抗体或其结合部分，向分离的抗体或其结合部分添加怀疑含有一定量瘟病毒肽的样品，以及检测包含与瘟病毒肽结合的分离的抗体或其结合部分的复合物的存在。
为结合对之成员的与特定分子结合的免疫球蛋白，特别是抗体(及其功能活性片段)可用作诊断剂和预后剂，如本文中所述的。在多个实施方案中，本发明提供了结合对的成员的测量，以及这样的测量在临床应用中的用途。本发明中的免疫球蛋白可用于例如检测生物样品中的抗原，从而可测试对象的与免疫球蛋白结合的分子的异常水平，和/或这样的分子的异常形式的存在。“异常水平”意指相对于来自机体一部分或来自未患疾病的对象的类似样品中的存在或表示存在的标准水平提高或降低。本发明的抗体也可作为试剂包含在试剂盒中用于在诊断或预后技术中使用。
在一方面，与瘟病毒肽免疫特异性结合的本发明抗体可用于诊断、预后或筛选瘟病毒感染。
在另一方面，本发明提供了诊断或筛选瘟病毒感染或针对其的免疫力的存在的方法，所述方法包括在对象中测量抗体与从对象获得的样品免疫特异性结合的水平，其中抗体免疫特异性结合瘟病毒肽，其中相对于来自不具有感染性疾病病原体的对象的类似样品中所述免疫特异性结合的水平，所述免疫特异性结合的水平提高指示存在瘟病毒。
用于检测瘟病毒肽或其拮抗剂的存在的合适测定的实例包括但不限于：ELISA、放射免疫测定、凝胶扩散沉淀反应测定、免疫扩散测定、凝集测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定或免疫电泳测定。
特定分子的免疫测定通常包括在经可检测标记抗体的存在下孵育样品(例如生物流体、组织提取物、新鲜收获的细胞或培养细胞的裂解物)，并通过本领域中公知的多种技术中的任何一种来检测结合的抗体。
给定抗体的结合活性可根据公知的方法来测定。本领域技术人员将能够通过采用常规实验来确定每个测定的操作和最佳测定条件。
本发明的另一方面涉及用于检测或测量瘟病毒的诊断试剂盒。提供了用于诊断用途的试剂盒，其在一个或更多个容器中包含抗瘟病毒肽抗体，以及任选地，针对所述抗体的经标记结合配偶体。或者，抗瘟病毒肽抗体可以被标记(用可检测标志物，例如，化学发光部分、酶部分、荧光部分或放射性部分标记)。因此，本发明提供了包含抗瘟病毒肽抗体和对照免疫球蛋白的诊断试剂盒。在一个具体实施方案中，容器中的前述化合物之一可被可检测地标记。试剂盒还可任选地在容器中包含预定量被试剂盒中的抗体识别的瘟病毒肽用作标准品或对照。
本发明的另一个实施方案包括用于针对与瘟病毒相关的疾病对妊娠母猪或小母猪进行疫苗接种的试剂盒，其包含：能够向妊娠母猪或小母猪施用疫苗的分配器；以及如本文中所述的瘟病毒疫苗。
如果需要的话，所述组合物可以存在于包装或分配器装置中，其可包含一个或更多个含有活性成分的单位剂量形式。包装可例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有用于施用，优选向哺乳动物(尤其是猪)施用的说明书。与这样的容器相关的可以是由管理药品或生物产品的制造、使用或销售的政府机构指定的形式的须知(notice)，该须知反映了制造、使用或销售机构对人施用的批准。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明在提交时所属领域技术人员通常理解的相同的含义。术语的含义和范围应清楚；然而，在有任何潜在的歧义的情况下，本文中提供的定义优先于任何字典或外在的定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。在本文中，除非另有说明，否则“或/或者”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用不是限制性的。本文中引用的所有专利和出版物均通过引用并入本文。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用属于本领域技术范围内的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学和免疫学的常规技术。这样的技术在文献中得到充分解释。参见，例如Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第I、II和III卷，第2版(1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney编辑1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press，1986)；Perbal，B.，A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；从书，Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press，Inc.)；Protein purification methods-a practical approach(E.L.V.Harris和S.Angal，编辑，IRL Press at Oxford University Press)；和Handbookof Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986，Blackwell Scientific Publications)。
应理解，本发明不限于特定的DNA、多肽序列或方法参数，因为这些当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，而不是旨在进行限制。必须注意，除非有内容另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的，没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。因此，例如，提及“抗原”包括两种或更多种抗原的混合物，提及“赋形剂”包括两种或更多种赋形剂的混合物，等等。
均可在本申请中互换使用的“免疫原性或免疫组合物或疫苗”是指包含本发明的至少一种瘟病毒或其免疫原性部分的物质组合物，其在宿主中引发针对所述组合物的免疫应答，细胞或抗体介导的免疫应答。在本发明的一个优选实施方案中，免疫原性组合物诱导免疫应答，并且更优选地针对CT感染的一种或更多种临床症状赋予保护性免疫。
本文中使用的“免疫原性”或“抗原”是指引发如本文中所述的免疫应答的多肽或蛋白质。这包括细胞和/或体液免疫应答。根据组合物的预期功能，可以包括一种或更多种抗原。“免疫原性”瘟病毒蛋白或多肽包括本文中鉴定的任何瘟病毒的全长序列或者其类似物或免疫原性片段。在本申请中可互换使用的术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”是指瘟病毒的片段或者截短和/或替换形式，其包含一个或更多个表位并且因此引发本文中所述的免疫应答。一般而言，这样的截短和/或替换形式或者片段将包含来自全长瘟病毒蛋白的至少六个连续氨基酸。更优选地，截短或替换形式或者片段将具有来自全长瘟病毒蛋白的至少10个，更优选至少15个，还更优选至少19个连续氨基酸。可以使用本领域公知的任意多种表位作图技术来鉴定这样的片段。参见，例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris，编辑，1996)Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，可以如下确定线性表位：在固体支持物上同时合成大量的肽，所述肽对应于蛋白质分子的部分，并且在所述肽仍然与支持物连接时使所述肽与抗体反应。这样的技术是本领域已知并描述的，参见，例如美国专利No.4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；和Geysen等(1986)Molec.Immunol.23：709-715。类似地，通过确定氨基酸的空间构象，例如通过例如x射线晶体学和二维核磁共振来容易地鉴定构象表位。参见Epitope Mapping Protocols，同上。合成抗原也包括在定义内，例如，多表位、侧翼表位和其他重组的或合成得到的抗原。参见，例如，Bergmann等(1993)Eur：J.Immunol.23：2777-2781；Bergmann等(1996)，J.Immunol.157：3242-3249；Suhrbier，A.(1997)，Immunol.and Cell Biol.75：402-408；以及Gardner等，(1998)12th World AIDSConference，Geneva，Switzerland，1998年6月28日-7月3日。(其教导和内容均通过引用并入本文)。
本文使用的术语“疫苗”是指这样的药物组合物，其包含在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫活性成分，并且可能但不一定包含增强活性成分的免疫活性的一种或更多种另外组分。疫苗可另外包含药物组合物典型的其他成分。作为区别，疫苗的免疫活性成分可包含其原始形式的完整病毒颗粒或减毒颗粒(在所谓的经修饰活疫苗(MLV)中)或通过合适方法灭活的颗粒(在所谓的死疫苗(killed vaccine，KV)中)。在另一种形式中，疫苗的免疫活性成分可包含生物体的合适成分(亚单位疫苗)，在此可如下产生这些成分：通过破坏整个颗粒或含有这样的颗粒的生长培养物并任选地进行后续纯化步骤得到所期望的结构；或者通过合成过程加任选地后续分离和纯化操作，所述合成过程包括使用基于例如细菌、昆虫、哺乳动物或其他物种的合适系统进行适宜操作；或者通过使用合适的药物组合物直接并入遗传物质(多核苷酸疫苗接种)来在需要疫苗的动物中诱导合成过程。疫苗可以包含上述成分中的一种或同时包含多于一种。如本文中所理解的术语“疫苗”是用于兽医用途的包含抗原性物质的经修饰的活减毒疫苗，并且出于针对由瘟病毒感染引起的疾病诱导特异性主动免疫的目的而施用。灭活或减毒瘟病毒，特别是如本文中所述的灭活瘟病毒或经修饰的活减毒瘟病毒赋予可通过母体抗体被动地转移的主动免疫抵抗其包含的免疫原并且有时还抵抗抗原性相关生物体。
如本文中使用的术语“灭活的”或“死的”同义使用。多种物理和化学灭活方法是本领域已知的。术语“灭活的”是指已被辐射(紫外线(UV)、X射线、电子束或γ辐射)、加热或化学处理而失活、杀死同时保留其免疫原性的先前有毒或无毒的病毒或细菌。在一个实施方案中，本文中公开的灭活病毒通过用灭活剂处理而灭活。合适的灭活剂包括β-丙内酯、二元或β-或乙酰基-亚乙基亚胺、戊二醛、臭氧和福尔马林(甲醛)。
为了通过福尔马林或甲醛灭活，通常将甲醛与水和甲醇混合以产生福尔马林。添加甲醇防止活化过程期间的降解或交叉反应。一个实施方案使用约0.1％至1％的37％甲醛溶液来灭活病毒或细菌。关键是要调整福尔马林的量以确保物质被灭活，但不至于发生高剂量的副作用。
一种更优选的灭活方法是使用亚乙基亚胺及相关衍生物，例如二元亚乙基亚胺(BEI)和乙酰基亚乙基亚胺是用于灭活瘟病毒属病毒的合适化学灭活剂的实例。还可使用其他化学灭活剂例如β-丙内酯、醛(例如甲醛)和/或洗涤剂(例如
Figure GDA0003359095520000321
洗涤剂、
Figure GDA0003359095520000322
X或烷基三甲基铵盐)来灭活病毒。灭活可使用本领域技术人员已知的标准方法来进行。可以以周期性时间间隔采集样品，并测定残留的活病毒。可利用监测对合适细胞系的致细胞病变作用和/或用合适的特异性单克隆抗体或多克隆抗体进行荧光染色来检测残留活病毒的存在。或者，可利用在连续传代中通过定量实时PCR监测生长来确定残留感染性病毒的存在。
BEI灭活可如下实现：将储备BEI溶液(例如，通过向0.1至0.2N NaOH水溶液添加0.1至0.2M 2-溴-乙胺氢溴酸盐形成的溶液)与病毒流体合并达到终浓度为约1至5mM BEI。通常通过将BEI-病毒混合物在不断混合下在35℃至40℃(例如37℃)下保持约24至72小时来进行灭活。可通过添加硫代硫酸钠溶液至终浓度超过BEI浓度(例如，以BEI体积的17％添加硫代硫酸钠以中和过量的BEI)，然后混合来停止病毒灭活。
更特别地，在病毒的背景下，术语“灭活的”意指病毒不能够在体内或体外复制，并且分别地，在病毒的背景下，术语“灭活的”意指病毒不能够在体内或体外增殖。例如，术语“灭活的”可指已在体外，例如在体外增殖并随后使用化学或物理手段失活，使得其不再能够复制的病毒。在另一个实例中，术语“灭活的”可指这样的病毒，其已经增殖，然后使用化学或物理手段失活，得到病毒、病毒的片段或组分的混悬液，例如得到可用作疫苗之组分的溶液。
术语“活疫苗”是指包含活的，特别是活的病毒活性成分的疫苗。
“亚单位疫苗”可包含最佳刺激免疫系统的抗原。在一些情况下，这些疫苗使用瘟病毒的Npro、衣壳、Erns、E1、E2、NS2-3、解旋酶、NS4B、NS5A和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)蛋白或者来自这些蛋白质的表位。由于亚单位疫苗仅包含必需抗原，并且不包含构成瘟病毒的所有其他分子，因此针对疫苗的不良反应的可能性较低。
亚单位疫苗可包含任意1至10种或更多种抗原，例如2、3、4、5、6、7、8或9种抗原。技术从业者将了解如何制备亚单位疫苗。例如，可使用重组DNA技术来表达抗原分子。以这种方式产生的疫苗称为“重组亚单位疫苗”。
“药物组合物”基本上由一种或更多种以下成分组成，所述成分能够调节施用所述组合物的生物体或者生活在生物体之中或之上的生物体的生理功能(例如，免疫功能)。该术语包括但不限于抗生素或抗寄生虫剂，以及通常用于实现某些其他目的的其他成分，所述目的例如但不限于：加工性状、不育性、稳定性，通过肠内或肠胃外途径(例如经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、皮内或其他合适的途径)施用组合物的可行性，施用后的耐受性，或控释特性。仅用于说明目的给出的这样的药物组合物的一个非限制性实例可以如下制备：将感染细胞培养物的细胞培养物上清液与稳定剂(例如，亚精胺和/或牛血清白蛋白(BSA))混合)，随后通过其他方法将混合物冻干或脱水。在疫苗接种之前，然后将混合物在水溶液(例如，盐水、磷酸缓冲盐水(PBS))或非水溶液(例如油乳剂、基于铝的佐剂)中再水合。
如本文中使用的，“药学或兽医学上可接受的载体”包括任何以及所有的溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂等。在一些优选实施方案，并且特别是包括冻干免疫原性组合物的那些实施方案中，用于本发明的稳定剂包括用于冻干或冷冻-干燥的稳定剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含佐剂。本文使用的“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷(例如Quil A)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，CambridgeMA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)、油包水型乳剂、水包油型乳剂、水包油包水型乳剂。乳剂可特别地基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型(EuropeanPharmacopea type))；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(特别是异丁烯或癸烯)的低聚产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂优选为非离子表面活性剂，特别是脱水山梨醇、二缩甘露醇(例如，油酸脱水甘露醇酯)、二醇、聚甘油、丙二醇以及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，其任选地是乙氧基化的；以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是普朗尼克(Pluronic)产品，特别是L121。参见Hunter等，The Theory andPractical Application ofAdjuvants(Stewart-Tull，D.E.S.编辑)，JohnWiley和Sons，NY，第51-94页(1995)，以及Todd等，Vaccine 15：564-570(1997)。示例性佐剂是由M.Powell和M.Newman，Plenum Press，1995编辑的“Vaccine Design，The Subunit and AdjuvantApproach”在第147页描述的SPT乳剂，以及该同一本书在第183页描述的MF59乳剂。
佐剂的另一个实例是选自以下的化合物：丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的交联的，特别是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。这些化合物通过术语卡波姆(carbomer)(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)知晓。本领域技术人员还可参考美国专利No.2,909,462，其描述了与多羟基化化合物交联的这样的丙烯酸类聚合物，所述多羟基化化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个羟基，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂族基团取代。优选的基团是含有2至4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基以及其他烯键式不饱和基团。不饱和基团本身可含有其他取代基，例如甲基。以卡波普(Carbopol)(BFGoodrich，Ohio，USA)名称销售的产品是特别适合的。其与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中，可提及卡波普974P、934P和971P。最优选的是使用卡波普971P。共聚物EMA(Monsanto)属于马来酸酐和烯基衍生物的共聚物，其是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解产生酸性溶液，所述酸性溶液将被中和，优选中和至生理pH以提供将免疫原性组合物、免疫组合物或疫苗组合物本身并入其中的佐剂溶液。
其他合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质(Avridinelipid)-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)的热不稳定性肠毒素(重组或其他形式)、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽，或者天然存在或重组细胞因子或其类似物或者内源性细胞因子释放的兴奋剂等。
预期可以以每剂量约100μg至约10mg的量，优选以每剂量约100μg至约10mg的量，更优选以每剂量约500μg至约5mg的量，甚至更优选以每剂量约750μg至约2.5mg的量，并且最优选以每剂量约1mg的量添加佐剂。或者，按最终产品的体积计，佐剂的浓度可以为约0.01％至50％，优选浓度为约2％至30％，更优选浓度为约5％至25％，还更优选浓度为约7％至22％，并且最优选浓度为10％至20％。
“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等张剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸(EDTA)的碱盐等。
“分离的”意指从其天然状态“人工”变化而来，即如果其在自然界中发生，则其已被改变或从其原始环境中移出，或者二者兼有。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如该术语在本文中使用的。
“减毒”意指降低病原体的毒力。在本发明中，减毒病毒是其中毒力已经降低使得其不会引起瘟病毒感染的临床症状但能够在目标哺乳动物中诱导免疫应答的病毒，而且也可意指与用未减毒的野生型瘟病毒感染和未接受灭活病毒或减毒病毒的“对照组”动物相比，在经灭活或减毒瘟病毒感染的动物中临床症状的发生率或严重程度降低。在该背景下，术语“降低/降低的”意指与上述对照组相比，降低至少10％，优选25％，甚至更优选50％，还更优选60％，甚至更优选70％，还更优选80％，甚至更优选90％，并且最优选100％。因此，灭活的、减毒的和/或无毒的瘟病毒分离株是适于并入包含灭活瘟病毒或经修饰活瘟病毒的免疫原性组合物中的瘟病毒分离株。
“减毒病毒”是活着的(“活”)病毒，其中感染原的毒力已例如通过在特定细胞系中使病毒传代或者通过对病毒基因组进行遗传操作而降低。病毒的减毒与其毒力(致病性)有关，但不一定影响病毒的复制能力。减毒病毒仍然能够复制。因此，其可以是致病性已经降低使得其将引发免疫应答而不引起特定疾病的病毒毒株。在本发明的上下文中，减毒病毒可以是已通过使涉及毒力的至少一个基因或蛋白质失活而消除或降低致病性的瘟病毒。在本发明中，“减毒”与“无毒”是同义的。在该背景下，术语“降低/降低的”意指与对照组相比，致病性降低至少10％，优选25％，甚至更优选50％，还更优选60％，甚至更优选70％，还更优选80％，甚至更优选90％，并且最优选100％。
“经修饰的活的”意指已经通过本领域已知的数种方法中的任何一种降低病毒的毒力，所述方法包括但不限于在细胞培养物中重复传代；迫使适应在正常限制性温度下生长；用化学诱变剂处理以迫使产生大量突变并选择所期望的特征；以及使用rDNA技术缺失或插入基因。术语“非毒性的”或“无毒的”意指经修饰的活病毒在施用时表现出降低的或没有感染的临床症状。
“有毒的”是指瘟病毒分离株引起与瘟病毒相关的疾病的能力。可通过观察动物中的疾病进展来评估毒力。瘟病毒的“有毒”毒株的一个实例是本发明中描述并使用的通过攻击性毒株例示的。
“无毒的”是指缺乏毒力的瘟病毒分离株。也就是说，无毒的毒株、分离株或构建体是非致病性的并且不能引起疾病。本文使用的术语“无毒的”与术语“非毒性的”同义使用。
本文中使用的术语“毒株”或“分离株”可互换使用。
本文中使用的术语“野生型瘟病毒”特别是指感染性的致病性瘟病毒，其特别地能够在猪并且尤其是仔猪中引起CT。在一个具体的优选实施方案中，术语“野生型病毒”是指其基因组包含RNA序列或由RNA多核苷酸组成的瘟病毒，其中所述RNA序列或RNA多核苷酸是包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21的多核苷酸的RNA拷贝。在一些实施方案中，野生型瘟病毒包含含有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的氨基酸序列。
在本文中，“有效剂量”意指但不限于在施用抗原的动物中引发或能够引发使得减轻临床症状的免疫应答的抗原量。
本文中使用的术语“有效量”在组合物的背景下意指能够在动物中诱导以下免疫应答的免疫原性组合物的量，所述免疫应答降低感染或疾病事件的发生率或者减轻其严重程度。特别地，有效量是指以组织培养感染剂量50或每剂量的噬斑形成单位测量的滴度。或者，在治疗的背景下，术语“有效量”是指这样的治疗量：其足以降低或改善疾病或病症或者其一种或更多种症状的严重程度或持续时间，防止疾病或病症的进展，引起疾病或病症的消退，防止与疾病或病症相关的一种或更多种症状的复发、发展、发生或进展，或者增强或改善另一治疗或治疗剂的预防或治疗。
本文中使用的术语“对瘟病毒具有免疫反应性”意指肽或片段引发针对瘟病毒的免疫应答。
术语“序列同一性”或“同一性百分比”在本文中可互换使用。出于本发明的目的，在此如下定义：为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的将序列对齐(例如，可在第一氨基酸或核酸序列中引入空位用于与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后，比较在对应氨基酸或核苷酸位置处的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/位置总数(即，重叠位置)×100)。优选地，两个序列具有相同的长度。
本文使用的“序列同源性”是指确定两个序列的相关性的方法。为了确定序列同源性，将两个或更多个序列进行最佳对齐，并且如果需要的话，引入空位。然而，与“序列同一性”形成对比，在确定序列同源性时，保守氨基酸替换被计为匹配。换言之，为了获得与参考序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中的85％，优选90％，甚至更优选95％氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包含用另一氨基酸或核苷酸的保守替换，或者参考序列中总氨基酸残基或核苷酸中一定数目的氨基酸或核苷酸(多至15％，优选多至10％，甚至更优选多至5％)(不包括保守替换)可插入到参考序列中。优选地，同源序列至少包含50个，甚至更优选100个，甚至更优选250个，甚至更优选500个核苷酸的延展段。
“保守替换”是指用具有类似特征或特性(包括尺寸、疏水性等)的另一氨基酸残基替换氨基酸残基，使得整体功能不显著变化。
技术人员知晓数种不同计算机程序可用于确定两个序列之间的同源性的事实。例如，可使用数学算法来实现两个序列之间的序列比较和同一性百分比确定。在一个优选实施方案中，采用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重使用已经并入到Accelrys GCG软件包(可在www.accelrys.com/products/gcg获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法来确定两个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。
序列比较可在正进行比较的两个序列的整个长度上或者两个序列的片段上进行。通常，比较将在正进行比较的两个序列的全长上进行。然而，序列同一性可在例如20、50、100个或更多个连续氨基酸残基的区域上进行。
如本领域已知的，“序列同一性”是指两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列(即，参考序列和与参考序列进行比较的给定序列)之间的关系。在序列已被最佳地对齐以产生最高度序列相似性之后，通过比较给定序列与参考序列来确定序列同一性，如通过这样的序列的串之间的匹配所确定的。在这样的对齐之后，序列同一性基于一个位置接一个位置来确定，例如，如果在特定位置，核苷酸或氨基酸残基相同，则在该位置，序列是“相同”的。然后，将这样的位置身份的总数除以参考序列中核苷酸或残基的总数以给出序列同一性％。序列同一性可通过已知方法容易地计算，包括但不限于以下中描述的那些：Computational Molecular Biology，Lesk，A.N.，编辑，Oxford University Press，NewYork(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编辑，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第I章，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinge，G.，Academic Press(1987)；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M.Stockton Press，New York(1991)；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAMJ.Applied Math.，48：1073(1988)，其教导通过引用并入本文。设计了确定序列同一性的优选方法以给出测试序列之间的最大匹配。确定序列同一性的方法被编入公众可得的确定给定序列之间序列同一性的计算机程序中。这样的程序的实例包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等，Nucleic Acids Research，12(1)：387(1984)))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)。BLASTX程序是可从NCBI和其他来源(BLAST Manual；Altschul，S.等，NCVI NLMNIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)，其教导通过引用并入本文)公众可得的。为了产生给定序列和参考序列之间最高水平的序列同一性，这些程序使用默认空位权重来将序列最佳对齐。作为例示，具有与参考核苷酸序列具有至少例如95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)“序列同一性”的核苷酸序列的多核苷酸意指除给定多核苷酸序列可包含多至5、4、3、2、1或0个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸之外，给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中的多至5％、4％、3％、2％、1％或0％核苷酸可缺失或用其他核苷酸置换，或者参考序列中总核苷酸中一定数目的核苷酸(多至5％、4％、3％、2％、1％或0％)可插入参考序列。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5′或3′末端位置或者这些末端位置之间的任何位置，单独地散布在参考序列中的核苷酸中或者以一个或更多个连续组群散布在参考序列中。类似地，具有与参考氨基酸序列具有至少例如95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的给定氨基酸序列的多肽意指除给定多肽序列可包含多至5、4、3、2、1或0个氨基酸变化/参考氨基酸序列的100个氨基酸之外，多肽的给定氨基酸序列与参考序列相同。换言之，为了获得与参考氨基酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的给定多肽序列，参考序列中的多至5％、4％、3％、2％、1％或0％氨基酸残基可缺失或用其他氨基酸替换，或者参考序列中总氨基酸残基数中一定数目的氨基酸(多至5％、4％、3％、2％、1％或0％)可插入参考序列中。参考序列的这些变化可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或者这些末端位置之间的任何位置，单独地散布在参考序列中的残基中或者以一个或更多个连续组群散布在参考序列中。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸替换而不同。然而，在确定序列同一性时，不包括保守替换作为匹配。
在本发明的上下文中，术语“突变”被理解为基因组序列，特别是瘟病毒的RNA序列的变化。由于使用RNA作为其遗传物质的病毒具有快速突变速率，因此如本文所述的术语“突变”特别涉及基因组序列的基因工程变化，例如通过克隆、强迫重组、在诱变剂存在下的生长、或用于实验改变基因组的其他技术，其特别地产生当在相同条件下增殖时在受感染的宿主中生长至显著低于野生型瘟病毒的滴度的病毒。此外，在另一个优选实施方案中，本文所述的突变还可由自然突变和根据本发明的后续瘟病毒分离引起，其中所述分离的病毒包含本文所述的突变。
本发明的蛋白质序列或核酸序列还可作为“查询序列”用于对公共数据库进行检索例如以鉴定其他家族成员或相关序列。这样的检索可使用Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的BLASTN和BLASTP程序(2.0版)来进行。BLAST蛋白质检索可用BLASTP程序(评分＝50，字长＝3)来进行以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位对齐，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述，可利用GaDped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(例如，BLASTP和BLASTN)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)的主页：www.ncbi.nlm.nih.gov。
如本领域已知的，术语“载体”是指用于向宿主细胞传递遗传物质的多核苷酸构建体，通常为质粒或病毒。载体可以是例如病毒、质粒、黏粒或噬菌体。如本文使用的载体可由DNA或RNA构成。在一些实施方案中，载体由DNA构成。“表达载体”是这样的载体：当其存在于合适的环境中时，其能够指导由该载体携带的一个或更多个基因编码的蛋白质的表达。载体优选地能够进行自主复制。通常，表达载体包含转录启动子、基因和转录终止子。基因表达通常在启动子的控制之下，并且认为基因与启动子“可操作地连接”。
如本文使用的术语“可操作地连接”用于描述调控元件与基因或其编码区之间的连接。通常，基因表达在一种或更多种调控元件(例如但不限于组成型或诱导型启动子、组织特异性调控元件和增强子)的控制之下。基因或编码区被认为与调控元件“可操作地连接”或“有效连接”或“可操作地相连”，意指基因或编码区受调控元件控制或影响。例如，如果启动子引起编码序列的转录或表达，则该启动子与编码序列可操作地连接。
如本文使用的术语“构建体”是指出于表达特定核苷酸序列的目的而产生的重组核酸，或者用于其他重组核苷酸序列的构建的重组核酸。
载体以及用于制备载体(或重组子)和/或使用其进行表达的方法可通过以下中公开的方法进行或与其类似：美国专利No.4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、382,425，PCT公开WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti，″Applicationsof pox virus vectors to vaccination：An update，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11349-11353，1996年10月；Moss，″Genetically engineered poxviruses forrecombinant gene expression，vaccination，and safety，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：11341-11348，1996年10月；Smith等，美国专利No.4,745,051(重组杆状病毒)；Richardson，C.D.(编辑)，Methods in Molecular Biology 39，″Baculovirus ExpressionProtocols″(1995Humana Press Inc.)；Smith等，″Production of Human BetaInterferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector″，Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等，″Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase inInfect Cells with a Baculovirus vector，″Molecular and Cellular Biology 1984年3月，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；美国申请No.920,197，于1986年10月16日提交；欧洲专利公开No.265785；美国专利No.4,769,331(重组疱疹病毒)；Roizman，″Thefunction of herpes simplex virus genes：A primcr for genetic engineering ofhovel vectors，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11307-11312，1996年10月；Andreansky等，″The application of genetically engineered herpes simplex viruses to thetreatment of experimental brain tumors，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11313-11318，1996年10月；Robertson等，″EDstein-Barr virus vectors for gene delivery toB lymphocytes″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11334-11340，1996年10月；Frolov等，″Alphavirus-based expression vectors：Strategies and applications，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11371-11377，1996；Kitson等，J.Virol.65，3068-3075，1991；美国专利No.5,591,439、5,552,143；WO 98/00166；许可的美国申请No.08/675,556和08/675,566，二者均提交于1996年7月3日(重组腺病毒)；Grunhaus等，1992，″Adenovirusas cloning vectors，″Seminars in Virology 3：237-52，1993；Ballay等EMBO Journal4：3861-65，Graham，Tibtech 8：85-87，1990；Prevec等，J.Gen Virol.70：429-34；PCT WO91/11525；Felgner等(1994)，J.Biol.Chem.269，2550-2561，Science 259：1745-49，1993；以及McClements等，″Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D orglycoprotein B，alone or in combination，induces protective immunity in animalmodels of herpes simplex virus-2 disease″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11414-11420，1996；以及美国专利No.5,591,639、5,589,466和5,580,859，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等，Nature，以及Furth等，Analytical Biochemistry；其涉及DNA表达载体，等等。另参见，WO 98/33510；Ju等，Diabetologia，41：736-739，1998(慢病毒表达系统)；Sanford等，美国专利No.4,945,050；Fischbach等(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等，Seminars in Immunology第9卷，第271-283页(1997)(DNA载体系统)；Szoka等，美国专利No.4,394,448(向活细胞中插入DNA的方法)；McCormick等，美国专利No.5,677,178(致细胞病变病毒的使用)；以及美国专利No.5,928,913(用于基因递送的载体)；以及本文引用的其他文献。
如本文使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的并且是指任何核酸。术语“核酸”和“多核苷酸”还特别地包括由除5种生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基构成的核酸。
术语“调控元件”和“表达控制元件”可互换使用并且是指可影响可操作连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达的核酸分子。这些术语广泛地用于并且涵盖促进或调控转录的所有元件，包括启动子，RNA聚合酶与转录因子的基本相互作用所需的核心元件、上游元件、增强子和响应元件。原核生物中的示例性调控元件包括启动子、操纵子序列和核糖体结合位点。用于真核细胞中的调控元件可包括但不限于转录和翻译控制序列，例如启动子、增强子、剪接信号、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、内部核糖体进入元件(internal ribosome-entry element，IRES)、2A序列等，其在宿主细胞中提供和/或调控编码序列的表达和/或所编码多肽的产生。
如本文使用的术语“启动子”是允许RNA聚合酶结合并指导基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5′非编码区，接近基因的转录起始位点。启动子中在转录起始中发挥功能的序列元件的特征通常在于共有核苷酸序列。启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括人)的启动子。启动子可以是诱导型的、阻遏型的和/或组成型的。诱导型启动子响应于培养条件的一些变化(例如温度变化)而使从在其控制之下的DNA转录的水平提高。
如本文使用的术语“增强子”是指不管增强子相对于转录起始位点的距离或取向均可提高转录效率的调控元件类型。
病毒载体的产生可使用本领域熟知的任何合适的基因工程技术来实现，所述技术包括但不限于限制性内切核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术，例如如Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press，N.Y.(1989))中所述。
病毒载体可并入有来自任何已知生物体的基因组的序列。所述序列可以以其原始形式并入或者可以以任何方式进行修饰以获得所需的活性。例如，序列可包含插入、缺失或替换。
病毒载体可包含两个或更多个目的蛋白的编码区。例如，病毒载体可包含第一目的蛋白的编码区和第二目的蛋白的编码区。第一目的蛋白和第二目的蛋白可相同或不同。在一些实施方案中，病毒载体可包含第三或第四目的蛋白的编码区。第三和第四目的蛋白可相同或不同。由一个病毒载体编码的两个或更多个目的蛋白的总长度可变化。例如，两个或更多个蛋白质的总长度可以为至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸、或更长。
优选的病毒载体包括杆状病毒如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen，SanDiego，Calif.)，特别是如果产生细胞是昆虫细胞的话。尽管杆状病毒表达系统是优选的，但本领域技术人员理解对于本发明的目的而言其他表达系统也起作用，即E或Erns表达到细胞培养物的上清液中。这样的其他表达系统可能需要使用信号序列以促使E或Erns表达到培养基中。
如本领域已知的术语“遗传组(genogroup)”是指属内的相关病毒，其可进一步细分成遗传簇。鉴定的瘟病毒属的遗传组包括边界病病毒、牛腹泻病毒1(bovine diarrheavirus-1，BVD-1)、BVD-2、典型猪热病毒以及其他未分类的瘟病毒。
如本领域已知的术语“进化枝”是指由祖先和其所有后代组成的组，系统发生树中的单个“分支”。作为一个实例，祖先可以是个体、群体或物种。遗传组可包含多个进化枝。
“免疫应答”或“免疫学应答”意指但不限于针对目的组合物或疫苗发生的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，免疫应答或免疫学应答包括但不限于以下一种或更多种效应：特异性地针对包含在目的组合物或疫苗中的一种或更多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生或激活。优选地，宿主将表现出治疗性或保护性免疫学(记忆)应答，使得对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重程度降低。这样的保护将通过以下来证明：症状数量、症状的严重程度降低，或者缺乏与病原体感染有关的一种或更多种症状、延迟病毒血症的发生、病毒持续性降低、总病毒载量降低和/或病毒排泄物减少。
在本文中，“特异性免疫反应性”是指识别瘟病毒或CT感染特征性抗原但不与严格攻击性对照特征性抗原反应的免疫反应性蛋白质或多肽。
“针对疾病的保护”、“保护性免疫”、“功能性免疫”和类似的短语意指通过施用本发明的一种或更多种治疗性组合物或其组合产生的针对疾病或病症的应答，与已暴露于疾病或感染的未免疫对象中将预期到的相比，其使得有害影响更少。即，在疫苗接种对象中，感染的有害影响的严重程度降低。在疫苗接种对象中，可降低、减慢或可能完全预防感染。在本文中，在意指完全预防感染的情况下，会特别说明。如果没有说明完全预防，则该术语包括部分预防。
在本文中，“临床症状的发生率和/或严重程度降低”或“临床症状减轻”意指但不限于与野生型感染相比，降低组内感染对象的数目、降低或消除表现出感染临床症状的对象的数目、或者降低存在于一个或更多个对象中的任何临床症状严重程度。例如，其应指病原体载量、病原体排出的任何降低、病原体播散的降低，或CT症状性的任何临床症状的减轻。优选地，与未接受组合物和被感染的对象相比，在接受本发明的治疗性组合物的一个或更多个对象中这些临床症状减轻至少10％。更优选地，在接受本发明组合物的对象中，临床症状减轻至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，并且甚至更优选至少50％。
本文中的术语“提高的保护”意指但不限于相对于未疫苗接种的对照组对象，在疫苗接种组对象中分别与感染原感染(优选瘟病毒产生的CT)有关的一种或更多种临床症状在统计学上显著减轻。术语“临床症状在统计学上显著减轻”意指但不限于在感染原攻击后，疫苗接种组对象中至少一种临床症状的发生频率比未疫苗接种对照组中低至少10％，优选20％，更优选30％，甚至更优选50％，并且甚至更优选70％。
“持久保护”应是指持续至少3周，但更优选至少3个月，还更优选至少6个月的“提高的效力”。在家畜的情况下，最优选的是，持久保护应持续直至销售动物的肉时的平均年龄。
如本文使用的术语“病毒血症”特别地被理解为其中瘟病毒颗粒在动物(特别是仔猪)的血流中复制和循环的病症。
术语“减轻由瘟病毒诱导的病毒血症”意指但不限于降低瘟病毒进入动物血流，其中与未接受本发明组合物并且可能被感染的对象相比，在接受所述组合物的对象的血清中病毒血症水平(即，瘟病毒拷贝数/mL血清、或噬斑形成集落数/分升血清)降低至少50％。更优选地，在接受本发明组合物的对象中，病毒血症水平降低至少90％，优选至少99.9％，更优选至少99.99％，并且甚至更优选至少99.999％。
“安全性”是指在疫苗接种后疫苗接种动物中不存在不良后果，所述不良后果包括但不限于：基于细菌的疫苗向毒力的潜在逆转；临床上显著的副作用，例如持续性、全身性疾病，或疫苗施用部位的不可接受炎症。
如本文使用的术语“疫苗接种”或其变化形式意指但不限于包括施用本发明的免疫原性组合物的过程，所述组合物当施用于动物时在动物中直接或间接地引发或能够引发针对瘟病毒或CT的免疫应答。
在本发明的上下文中，“死亡率”是指由瘟病毒感染或CT引起的死亡，并且包括其中感染是如此严重以致对动物实施安乐死以防止痛苦并人道地结束其生命的情况。
包括以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解的是，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好的技术，并且因此可被认为构成用于本发明实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在所公开的具体实施方案中可进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍获得相同或类似的结果。
实施例
实施例1
本研究的目的是确定使用包含本发明新瘟病毒的组织匀浆是否可以在剖腹产初乳缺乏(cesarean-derived-colostrum deprived，CDCD)猪中重现临床疾病。具体地，目的是在用包含新瘟病毒的血清攻击之后在CDCD仔猪中重现病毒血症和组织定殖(如通过qRT-PCR检测的)。
动物护理
在研究期间，将猪圈养在VRI(Cambridge，IA)的动物设施。根据该地区可接受的畜牧实践，向猪饲喂适合于其尺寸、年龄和状况的市售定粮(UltraCare Medicated，批次#16年7月4日)(包括抗生素)。水是随意可得的。占地和进料器空间满足或超过联盟“Guide forthe Care and Use of Agricultural Animals in Agricultural Research andTeaching”，第三版，2010年1月中所述的要求。
根据研究者的判断，在尸检日之前对任何濒死动物和不愿吃或喝的动物实施安乐死。在整个研究期间死亡或实施安乐死的任何动物都要经兽医进行尸检。在研究结束时对所有动物实施安乐死，说明，并通过焚化处理。
实验设计
总共10只CDCD猪用于该生物测定。将猪随机分为两组。第1组动物(n＝6)用包含瘟病毒的血清通过3种途径(颅内、鼻内和静脉内)进行攻击。第2组动物(n＝4)用安慰剂材料以类似的方式进行接种，并充当阴性对照。将每组中的动物保持在单独的室中。在攻击之后，从攻击后当天(D0)至D28，每日监测猪的临床症状。在整个研究期间，每周量取直肠温度两次。在整个研究期间，每周收集血清、排泄物和鼻样品两次。对样品进行瘟病毒RNA筛选。在D0和尸检时量取动物体重以评价攻击对日均增重的影响。将来自攻击组的一只动物在D10、14、17、21、24和28进行尸检。关于哪只动物进行尸检的决定基于血清中瘟病毒RNA的检测。将来自安慰剂组的一只动物在D17、21、24和28实施安乐死。通过qRT-PCR来对在尸检时收集的组织和终期血清筛选瘟病毒RNA的存在(图4)。
将来自NAC#20140530、动物ID no.21-24、批次#2815-105-2至2815-105-5的血清在37℃下解冻并合并。对合并的血清进行0.2μm过滤，并通过将6mL血清添加至29mL的1X磷酸缓冲盐水(Gibco目录#10010-023，L#1535358)来进行稀释。将制备的材料指定为L#2815-171-A，并储存在-70℃±10℃下直至使用(FreezerWorks id#466528)。在攻击的当天，将材料解冻并且在攻击期期间保持在冰上。将3份2mL的等分试样作为保留样品储存在-70℃±10℃下(FreezerWorks id#466044)。将合并的材料保留但不进行进一步测试。
表1.关键事件的时间表，其中DPC是指攻击后的天数
Figure GDA0003359095520000471
攻击
鼻内攻击：在DPC0，研究者使用无菌注射器来施用2ml攻击材料，1ml/鼻孔。这在使动物麻醉之前进行施用。
颅内攻击：在DPC0，研究者用氯胺酮、甲苯噻嗪和Telazol的混合物麻醉动物。清洗颅盖并消毒。使用活检穿孔器(Miltex Instrument Company，Inc.)来从颅盖移出4mm的皮肤部分。使用手持式电钻经颅盖环钻孔。使用20号的1.88英寸长导管(BD AngioCath部件号H3272)将攻击材料注入大脑。在接种物注射之后，将0.5ml的1X PBS插入导管中以确保接种物的递送。用单缝合线闭合皮肤切口。
静脉内攻击：在仔猪麻醉时，使用无菌的蝶形导管和注射器向耳静脉中缓慢施用2ml攻击材料。
临床观察
在攻击之后，每天一次地监测仔猪的临床症状的存在。由于不知道临床症状与其他猪瘟病毒(例如，典型猪热病毒、Bungowannah病毒)是否类似，因此监测仔猪的全身性感染症状以及神经症状。
排泄物样品收集
由研究者从仔猪收集排泄物材料。样品是置于falcon管中的拭子(Fisher目录号23-400-111)。样品是从动物而不是地面收集的。在收集的当天将材料转移，并且如果在递送后＜24小时进行测试，则将样品保持在2℃至8℃，或者如果在更迟的日期进行测试，则保持在-70℃±10℃。
鼻样品收集
由研究者从仔猪收集鼻拭子。样品是置于falcon管中的拭子(Fisher目录号23-400-H1)。通过擦拭两个鼻孔从动物收集样品。用研究编号、研究日和动物ID中的最少一个来标记样品。在收集的当天将材料转移，并且如果在递送后＜24小时进行测试，则将样品保持在2℃至8℃，或者如果在更迟的日期进行测试，则保持在-70℃±10℃。
血液收集
在血液收集日，由研究者使用无菌的18g至20g x 1英寸(2.54cm)至1.5英寸(3.81cm)
Figure GDA0003359095520000481
针、
Figure GDA0003359095520000482
持针器和9mL或13mL血清分离管(serum separator tube，SST)从各个猪中经前腔静脉收集4mL至15mL静脉全血。通过离心使血清与凝块分离并倒入螺旋帽低温瓶中。在收集的当天将材料转移，并且如果在递送后＜24小时进行测试，则将样品保持在2℃至8℃，或者如果在更迟的日期进行测试，则保持在-70℃±10℃。
尸检
总体概述：对任何濒死的动物取血，人道地实施安乐死，然后由兽医进行尸检。基于在预定尸检前这天产生的病毒血症数据(Ct值＜30)来选择用于尸检的猪。在尸检时将仔猪称重并记录肉眼可见的病变。
终期血液收集和处理：在血液收集之前将仔猪深度麻醉。将血液(约体重的5％)收集入无菌罐、瓶或多个SST管中，并允许在室温下凝结。通过离心使血清与凝块分离并倒入无菌瓶中。如果在递送后＜24小时进行测试，则将血清样品保持在2℃至8℃，或者如果在更迟的日期进行测试，则保持在-70℃。
样品收集：研究者收集以下的经福尔马林固定的组织样品：大脑(器官的1/2)、小脑(器官的1/2)、脑干(器官的1/2)、脊髓(6节)、骨髓(收集长骨的部分)、扁桃体(1个部分)、肺(附加叶或具有病变的区域的1个部分)、心脏(2个部分)、脾(1个部分)、肾(1个部分)、肝(1个部分)、淋巴结(气管支气管和肠系膜)、小肠(3部分回肠)、大肠(3个部分)。建议1英寸的肺部分和1英寸至2英寸的肠部分，使得维持固定组织与福尔马林的1∶10比例。将所有固定组织置于一个包含10％缓冲福尔马林溶液的容器中。对于各个仔猪，将以上列出的部分的重复样品收集入单独的旋转包装袋中。
组织处理：在收集的当天将样品运输，并且如果在递送后＜24小时进行测试，则将样品保持在2℃至8℃，或者如果在更迟的日期进行测试，则保持在-70℃。将固定组织保持在室温下。
体重测量
在DPC0、尸检的当天对仔猪进行体重测量。以校准标度量取体重，并记录在由动物设施提供的合适形式上。体重用于计算日均增重。
样品测试
对所有的样品进行瘟病毒PCR。对选择的样品筛选肠病毒、猪杯状病毒、传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella)和/或梭菌(Clostridium sp.)或其他感染原。
实施例2
此方案的目的是：1)检测来自患有先天性震颤的仔猪的样品中的潜在病原体，以及2)开发重现疾病的感染模型。使用下一代测序，在患有先天性震颤的仔猪中检测到相异谱系瘟病毒。所述病毒起初与蝙蝠瘟病毒最密切相关，但是现在与最近公开的暂时命名为非典型猪瘟病毒的新猪瘟病毒更密切相关。定量实时PCR在来自两个单独农场的患有先天性震颤的新生仔猪的样品中检测到病毒，而在来自同一农场的未受影响仔猪的样品中未检测到。为了实现第二个目的，通过静脉内和鼻内途径向妊娠母猪接种包含瘟病毒或PBS(对照)的血清，同时通过超声引导的外科手术技术直接接种胎儿羊膜囊泡。接种在妊娠45天或62天进行。所有接种有新瘟病毒的母猪均产下患有先天性震颤的仔猪，而接种PBS的对照仔猪未受影响。每只仔猪的震颤严重程度由在产后0、1和2天拍摄的录像评分。对于大多数仔猪，从产后0至2天震颤严重程度保持相对恒定。接种瘟病毒的幼崽中先天性震颤的流行率为57％(7只受影响仔猪中的4只)至100％(10只受影响仔猪中的10只)。通过PCR在来自患有先天性震颤的仔猪的组织中一致地检测到病毒，而在对照仔猪中未检测到。在大于90％采样仔猪中PCR阳性的样品包括脑干(37/41)、肠系膜淋巴结(37/41)、气管支气管淋巴结(37/41)、和全血(19/20)。尽管先天性震颤的首次描述是在1922年，但是这是首次报道在用相异谱系的猪瘟病毒实验接种之后重现先天性震颤。需要探索疾病机理、流行病学和诊断测定开发的研究，以更好地了解由这种瘟病毒引起的先天性震颤的病理生理学。
下一代测序
获得来自三项CT诊断研究的多种猪组织(血清、大脑、小脑、脊髓、脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和/或肺)：来自单只仔猪的肺组织(ID 20130103)；来自6只仔猪的合并脑组织或合并肺组织(ID 20120705)；以及来自来源于两个不同农场的6只不同仔猪的CSF(n＝2，农场B)、血清(n＝2，农场A和B)和肺(n＝2，农场A和B)(ID 2014016573)。除来自样品ID 20120705的肺组织之外，所有的测试样品均表现出至少部分的瘟病毒基因组序列。将血清或组织匀浆重悬于Hanks平衡盐溶液(Corning-Cellgro)中，并通过用以下核酸酶组合消化来富集病毒颗粒保护的核酸：RNA酶A(Invitrogen)、Baseline Zero DNA酶(Epicentre)、和Turbo DNA酶(Invitrogen)。使用Qiagen病毒RNA血液试剂盒按照制造商的方案提取病毒核酸。在提取后，用Turbo DNA酶进一步处理核酸以移除宿主或潜在的病毒DNA，从而进一步富集病毒RNA。使用用无规六聚物引发通过逆转录和Klenow(NEB)处理产生双链cDNA。
按照制造商建议的方案使用NextEra XT文库制备试剂盒(Illumina)通过文库产生对样品进行处理用于基于MiSeq的测序，其中更换柱洗脱(Qiagen，MinElute)代替珠归一化。使用500-循环试剂盒(Illumina)在MiSeq上运行文库，并使用NextGene(2.3.4.2版)和Sequencher软件(5.1版)的组合分析数据。选择高质量序列作为包含大于25的中值Q评分的那些，并用以下截止值修剪：在3’末端有不超过3个未调用碱基或不超过3个连续碱基的Q评分测量小于16。通过经由BLASTn和BLASTx与GenBank序列进行比较来分析从头组装的序列。ClustalW比对用于对NS3基因中215个氨基酸的序列和Npro基因中170个氨基酸的序列进行系统发生分析。使用MEGA 6.0软件由1,000次重复产生邻接系统发生树。
定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)
设计了靶向相异谱系瘟病毒的基因组的N3S区的RT-qPCR。使用提交给爱荷华州立大学兽医诊断实验室(Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory，ISUVDL)用于常规诊断测试的来自生长猪的组织样品(n＝362)来确定该样品组中瘟病毒的频率。还从具有先天性震颤的农场收集了两个样品组。这些样品包括血清、大脑、小脑、脑干和脊髓。第一组(农场A)由以下组成：6只受影响和2只未受影响的哺乳前仔猪，来自从其选择哺乳前仔猪的5只母猪的血清，以及5只受影响和2只未受影响的6天至14天大哺乳后仔猪。第二组(农场B：ISUVDL2014016573)由以下组成：哺乳状态未知的5只受影响仔猪，以及来自具有受影响仔猪的5只母猪的血清。
在含有2μl提取的总核酸、1.0μl探针(2μM)、1μl每种引物(5μM)、12.5μl 2X RT-PCR混合物、0.5μl iScript逆转录酶和7.0μl经DEPC处理的水的25μl反应中进行定量一步RT-PCR试剂盒(iTaq通用探针一步试剂盒；BioRad，目录号172-5141)(表2)。在以下条件下使用CFX96实时PCR检测系统(BioRad)进行反应：在50℃下进行初始逆转录10分钟，随后在95℃下进行初始变性3分钟，40个循环的95℃下变性15秒和退火，在57℃下延伸30秒。为了产生定量数据，在涵盖引物靶向的NS3区的每个实验中包括瘟病毒ultramer(IntegratedDNA Technologies)。在循环定量(cycle quantification，Cq)值低于36时建立阳性样品的截止值。
表2.实时PCR引物、探针和Ultramer序列
Figure GDA0003359095520000521
母猪接种模型
动物
所有操作均由爱荷华州立大学的机构动物护理和使用委员会批准(登录号：1-14-7907-S 2)。从先前CT史未知的商业来源获得8只分别鉴定的在妊娠38天的杂交母猪。通过RT-qPCR，来自所有母猪的血清均对PCV2a、PCV2b、PRRSV、PPV1、PPV5和新瘟病毒呈阴性，之后运输和接种。将各个母猪随机分配至单独圈养的三个组[在妊娠45天(n＝1)和妊娠62天(n＝1)时假接种，在妊娠45天(n＝3)时接种瘟病毒，和在妊娠62天(n＝3)时接种瘟病毒]之一，并且在整个研究期期间饲喂营养完全的饮食。
动物接种
在外科手术前，对母猪保持停止饲料和水12小时以降低麻醉剂反流的风险。将来自病毒血症猪的终期血清(ISUVDL2014016573)在37℃下解冻。提取总核酸并通过PCR筛选PCV2a、PCV2b、PRRSV、PPV1、PPV5和瘟病毒的存在，仅检测到瘟病毒(Cq＝27.47)。对血清进行0.2μm过滤，并通过将6mL血清添加至35mL的1X PBS(Gibco)来进行稀释。在接种的当天，将接种物解冻并且在接种操作期间保持在冰上。用肌内注射替来他明和唑拉西泮的组合
Figure GDA0003359095520000522
氯胺酮和甲苯噻嗪来诱导全身麻醉。在麻醉诱导之后，将各个母猪放置为左侧躺卧，并准备右腹用于无菌剖腹术。在切开前，将腹部盖住用于外科手术，并实施2％利多卡因的局部线阻滞。在乳房组织的侧部约5cm产生约30cm的正中旁切口以进入腹腔。将子宫取出，并使用无菌的手持线性阵列超声转换器来对各个胎儿单元成像并引导接种针进入胎儿羊膜囊泡。使用小号针(22g)向每个囊泡接种0.25mL接种物(PBS或瘟病毒血清)(S2MP4)。使用规格2聚乳酸羟基乙酸(polyglactin)910缝合线以三层闭合腹壁。在外科手术操作之后，还立即通过鼻内(2mL)和静脉内(2mL)途径向母猪直接施用接种物。在切口闭合之后且麻醉恢复之前，立即肌内给予单剂量的氟尼辛葡甲胺
Figure GDA0003359095520000531
和头孢噻呋结晶型游离酸
Figure GDA0003359095520000532
在各自的外科手术当天，对第一只母猪在8:30AM进行麻醉诱导。每个操作花费约1小时。最后母猪的麻醉诱导在11:30AM进行。
临床观察、样品收集和尸检
在接种之后，对母猪进行每日监测并从接种后(DPI)0至7天量取直肠温度。在DPI2、7、10和14从母猪收集排泄物材料、血液和鼻拭子，然后每周进行直至生产。在生产时，对仔猪进行单独鉴定并收集血清、鼻拭子和排泄物拭子。在仔猪的子集(n＝7)中，收集来自脐带的血液。从产后(DPF)0至2天每天拍摄各个仔猪的录像。对各组盲态的四名研究者对录像进行审查，并且每只仔猪接受震颤严重程度评分：0-不存在、1-细微肌肉成束、2-轻度震颤、3-中度震颤、4-具有明显跳跃的严重震颤。然后，对评分求平均值以向各个仔猪分配根据DPF的整体震颤严重程度评分。认为接受≥0.75(DPF 2)的评分的仔猪受到影响。对各个仔猪在每个DPF还记录了八字腿的存在或不存在。在DPF 2分别通过俘获式螺栓枪和过剂量可注射巴比妥类药物对母猪和仔猪实施安乐死。在尸检仔猪时，收集血清、大脑、小脑、脑干、脊髓、肾、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结、胸腺、心脏和脾。在仔猪的子集中，收集全血(EDTA管，n＝20)和CSF(n＝29)。在尸检时，还收集母猪血清。
瘟病毒鉴定
下一代测序
通过使用下一代测序技术，从三项独立的先天性震颤疾病研究中发现了现在已知与最近报道的临时命名的非典型猪瘟病毒更密切相关的病毒。从这三项研究之一获得了接近完整的基因组。在该研究中，将来自病毒血症动物的血清中的这种病毒随后用于动物接种。所述病毒的NS3和Npro支持分类的系统发生分析在本文中鉴定为推定“非典型猪瘟病毒”物种的成员(图5)，分别具有88.0％和94.6％的核苷酸和氨基酸同一性。通过RT-qPCR从提交给ISU VDL的病例对瘟病毒RNA进行回顾性分析显示，362个样品中有21个(6％)是阳性的。这些病例是来自经历不同临床症状的群体的常规提交。
RT-qPCR
从两个农场(农场A和农场B)收集来自表现出先天性震颤的动物和未受影响组群的仔猪样品。被诊断患有先天性震颤的动物通过RT-qPCR对瘟病毒是阳性的，而在未受影响仔猪的中枢神经组织或血清中没有检测到病毒(表3)。在来自农场A的一只母猪的血清中检测到病毒。
表3.来自农场A和农场B的仔猪样品的定量实时PCR结果
Figure GDA0003359095520000541
a先天性震颤的存在(+)或不存在(-)。
bCq＝定量循环值。
cSQ＝起始量。
dU＝40个循环之后“未检测到”。
eND＝未进行。
母猪接种模型
母猪观察和样品
一只妊娠45天假接种母猪在外科手术后发生中度发热，并且在DPI 3和4流产所有胎儿。来自在妊娠45天接种的组的一只母猪发现在接种时未怀孕，将其从该研究中移除。假接种和接种瘟病毒的母猪未表现出临床症状，其也未发生可检测的病毒血症或者排出通过RT-qPCR可检测的水平的病毒。所有的母猪均自然生产。有一只死产仔猪(母猪ID 3661)和一个浸软胎(母猪ID 3500)。
仔猪观察和样品
在DPF 0、1或2，假接种的仔猪不具有与CT一致的临床症状(S4 MP4)。在妊娠45天或62天时作为胎儿接种瘟病毒的大多数仔猪具有与CT一致的临床症状(S4 MP4)。在DPF 2，接种瘟病毒的幼崽中先天性震颤(S5 MP4)和八字腿(S6 MP4)的流行率分别为57％至100％和0％至40％(表4)。震颤严重程度在幼崽中因仔猪而异，但是在大多数仔猪中在两天的观察期期间保持相对恒定(表5)。
表4.产后第2天在接种瘟病毒的幼崽中先天性震颤和八字腿的流行率
Figure GDA0003359095520000551
a在接种时的妊娠天数。
b如果震颤严重程度评分≥0.75，则认为仔猪受先天性震颤影响。
表5.根据仔猪和产后天数的先天性震颤评分
Figure GDA0003359095520000561
a在接种时的妊娠天数。
bDPF＝产后天数。
从收集的组织、血清和全血提取病毒核酸并通过定量实时PCR进行分析。虽然在接种安慰剂的幼崽中在任何组织中都没有观察到瘟病毒阳性，但是来自实验接种组的几乎所有动物都在至少一个组织中是阳性的。组织向性较宽，因为在接种瘟病毒的活产仔猪中通过RT-qPCR在以下中检测到瘟病毒RNA：血清(26/41)、鼻拭子(12/41)、粪便(14/41)、终期血清(34/41)、大脑(30/41)、小脑(36/41)、脑干(37/41)、脊髓(33/41)、肾(35/41)、肠系膜淋巴结(37/41)、气管支气管淋巴结(36/41)、胸腺(37/41)、心脏(35/41)、和脾(37/41)(图6)；在来自接种PBS的仔猪的相同样品中没有检测到病毒RNA。此外，在来自仔猪子集的脐带血(5/7)、全血(19/20)和CSF(26/29)中检测到瘟病毒RNA(图6)。血清、鼻拭子、CSF、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结、脾和脐带血的平均Cq小于26。排泄物、终期血清、小脑、脊髓、肾、胸腺和心脏的平均Cq为26至28。大脑、脑干和全血具有最高的平均Cq值(＞28)。瘟病毒RNA在脑干、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结和全血中最常检测到(采集的样品中的＞90％)；在终期血清、小脑、脊髓、CSF、肾、胸腺、心脏和脾中较不常检测到(采集的样品中的80％至90％)；在血清、鼻分泌物、排泄物、大脑和脐带血中最不常检测到(采集的样品中的29％至74％)。随机地选择来自两只动物(35和90)的血清以通过完全基因组测序来评价基因组稳定性。与亲本毒株相比，两只动物均表现出相同的7种核苷酸固定变化，产生四种保守的氨基酸变化。在回顾攻击材料的深度测序数据之后，在这些位置各自观察到多态性的证据。
讨论
在近100年以前就首次记载了CT综合征；然而，当代的大多数爆发已归因于未鉴定的病毒。使用下一代测序，在患有CT的仔猪的样品中检测到最初被鉴定为与蝙蝠瘟病毒密切相关的新病原体。
为了在多种不同样品类型中检测病毒RNA，设计了靶向相异谱系瘟病毒的基因组的N3S部分的RT-qPCR。回顾性分析在来自经历不同临床症状之群体的6％(21/362)样品中通过RT-qPCR检测到瘟病毒RNA，表明该病毒以低流行率存在于来自该样品组的组织中。基于CT的临床症状以及CSFV的组织分布和复制部位来选择来自接种研究的样品。来自两个不相关农场的CT仔猪的组织样品包含在血清和中枢神经系统组织中一致地检测到的病毒RNA，表明所述病毒具有全身性分布同时在临床上影响中枢神经系统功能。这通过病毒RNA在接种瘟病毒的仔猪中的的组织分布得到进一步支持。由于所有的测试组织均具有类似的可检测瘟病毒RNA水平，因此没有确定复制的具体部位。这可表明病毒复制全身性地发生，并且可包括外周血单个核细胞或内皮细胞(类似于CSFV)。
由于关于体外病毒培养的尝试没有成功，因此用于该接种模型的瘟病毒为病毒血症血清。由于缺乏对这种新发现病毒的血清学测定，因此母猪在该研究中的免疫状态是未知的。为了避免来自母猪中抗瘟病毒抗体的可能干扰，直接接种胎儿羊膜囊泡，因为猪胎盘不允许抗体从母畜向胎儿转移。
虽然一只接种PBS的母猪由于外科手术操作而流产，但是在假接种和接种瘟病毒的母猪之间没有观察到临床差异。先前没有报道具有CT爆发的死胎、干化胎儿或浸软胎。来自接种瘟病毒之母猪的一窝幼崽中的一个死胎和另一窝幼崽中的一个浸软胎被认为是偶然的并且可能不是胎儿感染的结果。尽管进行IN和IV接种，但是母猪没有发生可检测的病毒血症或者排出通过RT-qPCR可检测的水平的病毒。因此，在攻击之后母猪没有感染，或者可得的诊断测试不足以检测感染。
对于待证明的CT而言，可能的是胎儿感染必须在仔猪中出现胎儿免疫能力之前进行，所述胎儿免疫能力在妊娠约70天至80天出现。在该研究中，在妊娠45天和62天的胎儿都易受到相异谱系瘟病毒的感染，这在大多数受感染仔猪中导致CT。这两个妊娠时间点的选择基于：基于CSFV的这种瘟病毒的类似病毒血症发生在胎儿免疫出现(妊娠45天)和胎儿中枢神经系统发育(妊娠62天)之前。在其他物种中在不同妊娠时间点的子宫内瘟病毒感染具有不同的临床结果，包括繁殖失败、先天畸形或免疫耐受性，由此持续感染的动物可在其整个生命期间排出病毒。在该研究中，许多接种瘟病毒的仔猪天生具有八字腿。这一情况在猪中常常观察到；然而，发病机理和病因学目前是猜测的。这种病毒对八字腿、母猪繁殖失败或子宫内感染导致持续感染动物的能力的作用(如果有的话)需要进行另外的研究。
总之，本文重现的临床疾病模拟天然存在的爆发，其中变化之处在于幼崽之间CT的流行率和幼崽中临床症状的严重程度。在所有患有CT的仔猪中检测到病毒RNA。此外，在41/42接种瘟病毒的活产仔猪中检测到病毒RNA。在接种瘟病毒的活产仔猪中，在DPF 2或DPF 0，11只未患CT(95)，除一只以外，在所有接种瘟病毒的未受影响仔猪中检测到病毒RNA(95)。然而，大多数仔猪而不是所有受感染仔猪中的中枢神经系统功能障碍的机理目前是未知的。宿主-病毒相互作用的病因学(ecology)和发病机理在此点是未阐明的，但是是有趣的。有必要研究持续感染或功能障碍性免疫应答在CT的临床表达和中枢神经系统功能障碍的机理方面的作用。尽管该症状学在人和兽医医学中的高流行率和重要性，关于人和动物中震颤病症的机理的文献仍然是有限的。
该研究在患有CT的仔猪中鉴定到最近描述的相异猪瘟病毒，而在未受影响的组群中未鉴定到，并且通过开发创新的接种技术将这种病毒用于重现CT。病毒分离技术、特异性抗体测定、原位检测技术和精细分子工具的成功开发无疑将使得更好地了解这种病毒的发病机理和流行病学。
实施例3
本研究的目的是评价瘟病毒疫苗在施用于未感染瘟病毒(pestivirus naive)或瘟病毒血清反应阴性母畜时的效力。
研究设计
总共10只母畜用于该实验。将母畜随机分成三组。在即将繁育之前或在繁育之后不久在D0和D14向第1组动物(n＝4)疫苗接种原型瘟病毒疫苗。向第2组动物(n＝4)疫苗接种安慰剂原型疫苗制剂。使第3组动物(n＝2)保持未疫苗接种(严格对照)。将每组中的动物保持在单独的室中。在约妊娠42天时，通过例如静脉内、肌内、鼻内、阴道内或子宫内接种的途径用瘟病毒对第1组和第2组中的母畜进行攻击。在攻击之后，在整个研究期间，对母畜的临床症状进行每日监测。在整个妊娠期间，每周收集血清、排泄物和鼻样品以及直肠温度两次。在约妊娠80天时，对所有的母猪进行超声评价。在生产时，通过视觉评估仔猪的临床症状的存在。收集血清、脐带血和胎盘用于检测瘟病毒。对仔猪进行处理并采集录像记录。使仔猪维持在母猪上。当仔猪为24小时大时，通过视觉评估仔猪的临床症状的存在，并捕获录像记录。在48小时龄时，对仔猪实施安乐死。在安乐死之前，通过视觉评估仔猪的临床症状的存在，并捕获录像记录。在尸检时，收集选择的组织和血液。对样品筛选瘟病毒RNA和抗瘟病毒抗体。
表6.实验设计
Figure GDA0003359095520000601
表7.关键事件的时间表，其中DPC是指攻击后天数
Figure GDA0003359095520000602
为了确保不知情，施用本发明疫苗和对照的人(施用者)不是负责研究动物的临床观察和采样的同一人。实验室测试与实施例2中所述相同。
实施例4
该研究的首要目的是确定在施用灭活的全病毒疫苗之后诱导瘟病毒特异性血清学应答的可行性。具体地，使未感染
Figure GDA0003359095520000611
的动物暴露于浓缩的灭活病毒的肌内注射并在疫苗接种前后通过血清学ELISA来评价。
从多个爆发研究病历中使用深度测序技术发现了新病毒。这些病历的临床史包括先天性震颤(2例)、贫血仔猪(1例)、或认为与PCVAD有关的生长滞后(fallback)仔猪(1例)。基于这些发现，设计了qPCR并在从爱荷华州立大学兽医诊断实验室(ISU VDL)收集的两个样品组中确定所鉴定病毒的流行率。发现表观流行率在肺匀浆组中为7.3％(8/110)和在来自具有多浆膜炎史的病历的临床样品组中为5.2％(13/252)。通过与ISU VDL教学人员(Paulo Arruda博士)合作收集了另外的来自具有先天性震颤临床史的两个农场的样品。这些样品用于猪的接种，并产生包含高水平病毒的血清(实施例1)。在后续研究中，证明了向妊娠母畜中子宫内接种血清导致高百分比的猪天生患有先天性震颤(实施例2)。由于瘟病毒引起临床疾病的能力，开发疫苗是吸引人的。在该研究中包括常规的灭活疫苗。
在该研究中包括常规的灭活疫苗。此外，在该研究中包括病毒载体。由于使用活病毒载体来表达相关抗原是Lead2Grow策略的一个关键要素，因此该研究提供在猪中评价载体。该研究利用表达瘟病毒的E2蛋白的犬腺病毒载体(CAV-2；在Solo-Jec CAV-2中许可使用)。载体是能够复制的并且假设诱导长持续时间的广泛免疫应答。包括另外的表达甲型流感病毒(Influenza A)HA基因的CAV构建体作为构建体对照。
动物入选标准
由于本研究是在BSL2条件下在出生的动物中进行并且血清学测定目前不能用于瘟病毒，因此不进行血清样品的预筛选。只有在疫苗接种时健康的猪才被纳入实验。如果在疫苗接种时研究者注意到不健康的动物，则这些动物不进行疫苗接种并人道地实施安乐死。
动物护理
在研究期间，将所有动物圈养在Sioux Center，IA的动物设施。根据该地区可接受的牧畜实践向动物饲喂适合于其尺寸、年龄和状况的市售定粮(可包括抗生素)。水是随意可得的。占地和进料器空间满足或超过联盟“Guide for the Care and Use ofAgricultural Animals in Agricultural Research and Teaching”，第三版，2010年1月中所述的要求。
未经研究监测者事先批准，不对测试动物施用其他生物或药物产品。
入选后移出标准
根据主治兽医/研究者的判断，对任何濒死动物实施安乐死。濒死动物定义为不愿吃或喝或者因严重临床症状而严重脱水的动物。在整个研究期间死亡或实施安乐死的任何动物都要经兽医尸检。如下所述进行尸检。监测者和研究者商议确定是否将来自移出的测试动物的数据包括在数据分析和最终报告中。
研究动物处理
在研究结束时，对所有动物人道地实施安乐死，说明，并通过炼制处理。所有操作均按照设施SOP中所述进行。
实验设计
一般描述
设计该实验以评价原型瘟病毒疫苗在常规动物中的血清学应答。对于实验组的说明，参见下表8。
在断奶时，将共6只约6周龄的动物随机分成第1组和第2组，并根据表8施用2mL剂量的疫苗或安慰剂。将动物随机化并共混在同一室内的单独箱子中。将第3组中的动物共混在单独的室中。在整个研究期间，记录一般健康观察，并且观察到没有不良反应。在疫苗接种后约14天，收集血清并保持在4℃下直至完成处理用于血清学评价。在首次疫苗接种后21天，施用相同材料的加强疫苗接种。在加强后13天(第34天)收集来自动物的血清。
当测定变得可行时，测定血清样品的血清转化的证据。从D0至D7在第3组中从猪中每天收集口、鼻和排泄物拭子。评价样品的活CAV的存在。在疫苗施用后，观察注射部位的反应最少3天。在试验结束时，对动物人道地实施安乐死。对于研究事项和具体操作细节的概述，参见下表9。
表8.实验设计
Figure GDA0003359095520000631
表9.按室的关键事件的时间表
Figure GDA0003359095520000632
疫苗材料
通过超速离心将来自受感染SK6细胞的上清液浓缩10倍，并在37℃下用5mM BEI溶液灭活6小时。用12.5％emulsigen D配制疫苗，储存在4℃下直到施用时。使第2组中的猪接受安慰剂材料(磷酸缓冲盐水+12.5％emulsigen D)。使用合适尺寸的无菌针和注射器向颈部的肌肉组织中施用2mL剂量的合适疫苗。
疫苗接种
在施用任何疫苗材料之前，研究者或指定人员检查所有动物的整体健康并纳入研究中。在D0和D21，使用合适尺寸的无菌针和注射器向颈部的肌肉组织中施用，或者使用无菌注射器和插管向鼻中(每个鼻孔1mL)施用2mL剂量的合适疫苗。对于IM注射，右颈的肌肉组织用于在D0进行注射，左颈的肌肉组织用于在D21进行注射。在疫苗确认记录中记录了疫苗材料的批号、剂量、动物识别号和施用时机。
临床观察
在疫苗接种期期间，使用一般的健康观察形式对动物进行每日评价。在疫苗接种后，监测注射部位区域最少三天。如果注射部位区域存在病变，则对该区域进行监测直到病变消退或直到研究结束。
血液收集
在血液收集日，由研究者或指定人员经前腔静脉收集3至9mL静脉全血。使用无菌的18g至20g x 1英寸(2.54cm)至1.5英寸(3.81cm)
Figure GDA0003359095520000641
针、
Figure GDA0003359095520000642
持针器和合适尺寸的血清分离管(SST)。如果在星期一到星期四收集，则在收集的当天将血液在冰上连夜运送到在爱荷华州埃姆斯的BIVI Biological R&D。如果在星期五或星期六收集血清，则通过离心使血清与凝块分离，并倒入用至少研究编号、研究日和动物ID标记的螺旋帽低温瓶中。将经处理的血清样品储存在-70℃下，并在下一个运送日在干冰上运送至埃姆斯。在BIVI-埃姆斯，通过FreezerWorks电子管理系统追踪血清样品。在BIVI-埃姆斯，如果在递送后＜48小时进行测试，则将血清样品保持在2℃至8℃，或者如果在更迟的日期进行测试，则保持在-70℃。在该研究完成之后，将样品储存最少6个月。
拭子样品
将材料在冰上连夜运送到在爱荷华州埃姆斯的BIVI Biological R&D。如果收集发生在周末，则将样品冷冻在-70℃下并在下一个采样日在干冰上运送。在BIVI-埃姆斯，如果在递送后＜24小时进行测试，则将样品保持在2℃至8℃，或者如果在更迟的日期进行测试，则保持在-70℃。通过FreezerWorks电子管理系统追踪样品。在该研究完成之后，将样品储存最少6个月。
尸检
如果在研究期间存在濒死的动物，则根据主治兽医的判断对动物实施安乐死并尸检。收集合适的样品以确定死亡原因。可将样品提交至诊断实验室用于确认测试。
在测试结束(off-test)时，按照设施SOP对动物进行深度麻醉，并从每只动物收集1x250mL离心瓶的血液(自由捕获)。按照设施SOP对动物实施安乐死，并对注射部位进行触诊。如果在尸检时大体上触诊到注射部位反应，则收集样品(新鲜的和固定的)。如果在研究期间动物中存在临床症状或者存在临床疾病的证据，则对动物进行尸检。收集合适的样品以确定死亡原因。可将样品提交至诊断实验室用于确认测试。
室消毒、进入和工作程序
不认为原型疫苗对人具有感染性。当与动物一起工作时，戴上手套、口罩和一次性
Figure GDA0003359095520000651
。靴子和个人防护设备(personal protective equipment，PPE)是室特定的。在进行第3组动物与第1和2组中动物的工作之间需要淋浴。不允许物料或PPE在室之间转移。详细说明设施和设备消毒并放入研究者的报告中。
血清学应答
针对猪初级肺细胞吸附旋转血清以降低酶联吸附测定(ELISA)背景。用300ng浓缩的灭活瘟病毒包被ELISA板。一式两份地评价来自疫苗接种动物、安慰剂动物的吸附测试血清、恢复阳性对照血清和来自未经处理动物的血清，其中数据总结在图7中。在第0天，从所有组收集的所有血清通过ELISA都是阴性的(OD＜0.15)。截止灭活瘟病毒的加强接种后13天，所有4只动物都表现出强的血清学应答，而匹配安慰剂对照均没有超过测定的阀值0.7OD。使用精确Wilcoxon秩和检验，与安慰剂相比，在疫苗接种组内OD在统计学上显著增加(p值＝0.004)，表明针对瘟病毒的特异性血清学应答。
实施例5
该研究的首要目的是离体分离并有成效地复制新瘟病毒。具体地，在从天然宿主物种(猪)获得的细胞中实现病毒增殖，并通过分子生物技术进行监测。
接种物制备
收集来自实施例2的受感染仔猪的组织，并单独称重，向每个中添加SAFC改性最低基础培养基(minimum essential medium，MEM)至10％的最终重量：体积。将组织通过用金属珠高速震荡分散，通过微量离心澄清，并经0.2μm过滤器过滤。此外，单独地收集来自实施例2中瘟病毒感染仔猪的终期血液。使用qPCR对各个组织匀浆和血清样品测定瘟病毒的存在和相对浓度。基于来自终期血清、脾和肾匀浆的样品类型，将具有最高滴度的样品合并。这些合并物随后用作接种物。
猪初级组织的接种
使用上述接种物对初级胚胎猪肺和初级猪胚胎肾细胞培养物进行病毒生长尝试。由从剖腹产初乳缺乏(CDCD)猪收集的组织制备初级细胞培养物。
将接种物用等体积的MEM稀释，并经由通过0.8μm/0.2μm过滤器来灭菌。在接种之前，将样品进一步以1∶2或1∶10稀释，以试图移除任何血清或宿主细胞相关毒性。
在生长培养基(具有10％经辐射的胎牛血清和2.5％1M HEPES的MEM)中进行培养。在培养7天之后，对材料进行3个冷冻/解冻循环，然后在37℃、5％CO2下在摇动的同时通过允许病毒感染接种到新鲜细胞上1小时。1小时之后，将接种物移除并用生长培养基更换。传代在初级肺细胞中持续11轮，在初级肾细胞中持续4轮。初级肾细胞的循环阀值为21.3至22.5，表明有成效的复制。初级肺的循环阀值也表明有成效的病毒复制，并且总结在表8中。
表8.实验设计
Figure GDA0003359095520000671
永生化猪细胞的接种
类似于初级细胞的最初接种条件，通过添加来自第11代初级肺培养物的上清液(冷冻/解冻3个循环)接种永生化猪肾细胞(SK6)并在37℃、5％CO2下在摇动的同时孵育1小时。在37℃、5％CO2下孵育6天之后，材料以相同的方式传递至新鲜SK6细胞。在14次传代之后，提取来自每一代的核酸，并通过qPCR监测。在连续传代之后，循环阀值降低至约17(参见表8)，表明病毒滴度增加约10倍。
病毒收获物的灭活
将来自第11代SK6细胞的上清液合并，并通过高速离心使病毒沉淀来浓缩约10倍。将病毒沉淀物重悬于原始体积的约1/10的惰性缓冲液(1X磷酸缓冲盐水)中。使用环化的二元亚乙基亚胺(BEI)以5mM的终浓度并且在37℃下不断搅拌来将浓缩的病毒灭活6小时。在灭活完成之后，用硫代硫酸钠溶液(按体积计17％)在37℃下孵育15分钟来使BEI失活。用12.5％终浓度的emulsigen D配制灭活瘟病毒，并用作实施例4中的推定疫苗候选物。
根据本公开内容，本文公开并要求保护的所有组合物和方法均可以在没有过度实验的情况下进行和执行。虽然已经根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以向本文描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤顺序施加变化，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理均相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这样的类似替代和修改被认为在由所附权利要求书限定的本发明精神、范围和概念内。
序列表
<110> 贝林格尔. 英格海姆维特梅迪卡有限公司
爱荷华州立大学研究基金会
<120> 用于先天性震颤的瘟病毒疫苗
<130> 24152-0041WO1
<140> PCT/US2016/049709
<141> 2016-08-31
<150> US 62/212,124
<151> 2015-08-31
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11550
<212> DNA
<213> 2型瘟病毒
<400> 1
cataatgctt taattggccg cattatgtgt gggacatcct aaatatttat gagccctgcg 60
gtgagtgggg gaaagaggtt aaccaggcct ctagtaccac aggcaccaat ggacagggca 120
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tatacttgct gggggctagt atgaattggg tcgagagaga aaaaaagaaa ttgctagtga 3720
agaggagact aatatacaag aaagccgtta cttgcagtca ggatgagaat gtattggaga 3780
ataaattcaa caagataact gtaaacgcgg atttcacccc atgcaagctt gaacttctac 3840
aattacttag ggctttttta gtctctttgt gtttttccta ctacaaacct ctcctgtatg 3900
cagagactac cttaactgta atagtaattg gcgtacaaga gtacaacgta gccatggccc 3960
gcgggcgaag tgtggtccac aggctactag ccatggccta ttacatatac ggccgcatac 4020
agggtgacat gttccagctc gccactatcc agtgcctgct gtcgagtccg aggaaaatta 4080
tgaaacacat ggtagagaat ccaactctca agaagctctg gcaaggcgaa acagaactct 4140
tcaaccaggg tgttagtcaa tccaagatag tgaatccaaa gaaaattggg ctggaagaat 4200
tacacaaggg catgtgtggc ctcccaacag tagtgcaaaa tttggtcata tatgcaaaga 4260
agaatgactc tcttatttta ggagagctgg gttacccccc tggggatctc accagtgatg 4320
ggtgggaaat tttaggtcct ggcagaatcc caaagatcac taacgtcgag tctgctaaga 4380
tggacttact ctccaaactt atgacctttc tggggattga aagctcgagg gtccccagga 4440
ccccagtcca ctcaacaagg aaattattga agatagtaag gggcttggaa acaggatggg 4500
ggtacactca cgcagggggg ataagtagcg caaaacacgt tacaggtgaa aagaacttaa 4560
tgacccacat ggagggtagg aagggaaaat atatcctaca atctcaagaa catggtgctg 4620
acgaggtaga gtacggagta aaaactgatc aaaaagctcc cgacaatgcc ttatgctact 4680
gttttaaccc tgaagctaca aacataaaag gagagacggg agccatggtg ttcatgaaga 4740
agataggaaa aaagtggact ctcgtaacat cagacggcaa taaagcctat tataatgtaa 4800
acaatttgaa agggtggtct ggactaccaa taatgctgca ctccaccggg gccatagtgg 4860
ggaggattaa atcagcgtat tcagatgaaa acgacctggt ggaggaactt attgactcta 4920
gaactattag taagagcaat gagacaaacc tggaccacct tatcaaggaa ttggcagaca 4980
tgcggagggg ggagttccgc tcaattaccc ttggaacggg agccgggaaa accacagaac 5040
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caatggtttt ttttgatgaa tatcacacag caactccaga acaaatagcc ataataagca 5340
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ccgtgacgac tgaaggcagg aagtttgaca ttgaagaggt aggggttgct accatagaga 5460
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aagtagtgaa tttctcggca aagatgccct tgattgtcac ttcattagta aagaaaaaaa 5820
tcaccaggga agaacagggc cagaggaaag gtcgagtggg caggcaaaag aaaggaaaat 5880
actactaccc ctcgggggtg gtaccgaatg ggtcaaaaga cctaagctat ttaatcctac 5940
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atgaggactg gggtctctat gacgtagatg aagtagaagt gagaatactt gagagaatga 6060
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tcagcaaaga gtattgttat gagctgaccg attcaccgga tacttacgaa aactcattcg 6540
cacctttgga cgtcgacgtc caaaactccg gtgaaggaaa acacccagag caactggcag 6600
accatcaatt gaggcaacta ctggagactg ggagagacaa ggcaattgat ttcctaaaag 6660
gaatccgcga gttcactagt ggggccataa acagtccaaa ggcactaagt atatgggaga 6720
aaatatatca gtatttgaag aagcatcagg gcgagatcat ctcatcagca gcgtggggca 6780
gtgcgacggc ccttcacgac agtattaaat ctagactagg agatgaggtc gctactgcag 6840
taataatcct caagtattta gcatttggtg aaagagaact gtctgggcta actaggcaag 6900
ttctaattga catcatagta tattatatag ttaacaagcc ccggttcgaa ggagacgact 6960
acgcaaagag aaaaggaaga aggctagtca tcgaagtcct gatgggggca ctggcgactt 7020
atgcggtgtc caatttttgg ggtgtgtcca ttaataagat actgcaacca atttctgatt 7080
atctacccta tgccaccgcc actttggctt ttcttcgccc aaccttcatg gaatcagcag 7140
tggtggtcgc ttcctctatc tatagagctt ttctctccat taagcatgcg gaaaacagga 7200
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atgaggagaa aaggacactt atactgaaaa tgtttgtcaa aaactttata gaccaggcgg 7380
cactagacga gttggataaa ctggagccag aaaaaataat cctctcattg ttggagggta 7440
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gagaaacttt cacagaagct ttgtctaaga tggccggcaa gtctctcatt gtgatggtca 7560
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atttgctgac ctttctcctc gagaaactaa aaaaaatgac taacctcgcc atcggggaag 7680
ctagaaaggt cttgctcccc atcccatact tgtactgtga aacctggcag tctgacgcca 7740
gaatcaaggc ccctgaatcc tacgaccaag tggtagtgga atgcaaatgt ggcgcttcag 7800
cgaggtattc cttccgcgat ggagttcatg agatattgga agaaaaaagg actaattggt 7860
gcaagaactt cttcttatgg ggacccaact tccacaatcc ggatccaaaa aggatgacat 7920
tctatgaata cggccaagca aaaaagtgtc ctgttatcat aattggtgaa gacataacct 7980
tcggcaaata tggcatatat atcaaatttg gccataggcc tgatggaggg aggttaataa 8040
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gccaagtggc cataggcaag gtcaagctaa ccgattactg taatcaaaaa ggaataatag 8160
acaggaaatt ggccgtactt gaaggtgaca aaatacattt ttggaaagca caccgtggat 8220
ccaaaatcac agaccaactc actattgaga atctgacaga tgatttgggg tcagaaatca 8280
gggacatcac atgggagctg tacacaggtg gaacgtgcac cgtaaaaggg gtgtccctta 8340
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ttagcccctg ttacctaata aacggcagga gaccatcccc atttgacgtc gcggaaggtt 8460
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tacaccatag ttcggtatta ctactgctga cacctggagt aaactcagag ttgcccttac 8760
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tgacgacctg tataggtccg atctgatatc 11550
<210> 2
<211> 3635
<212> PRT
<213> 2型瘟病毒
<400> 2
Met Glu Lys Gln Ile Ala Tyr Tyr Leu Lys Lys Glu Lys Gln Arg Asn
1 5 10 15
Gly Trp Thr Glu Leu Val Val Gly Glu Ser His Thr Lys Ile Thr Thr
20 25 30
Leu Ser Gly Lys Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Glu Met Glu Lys Arg Pro
35 40 45
Asn Pro Tyr Gly Thr Tyr Leu Pro Arg Pro Ser Pro Gln Gln Leu Thr
50 55 60
Ala Leu His Pro His Pro Val Val Asn Cys Lys Val Val Glu Tyr Lys
65 70 75 80
Glu Met Asp Pro Asn Tyr Gly Asp Cys Pro Asn Thr Asn Gly Val Phe
85 90 95
Val Asp Glu Lys Gly Arg Arg Leu Ser Ser Pro Pro Leu Gly Ile Trp
100 105 110
Lys Ile Arg Leu Asp Tyr Ser Asp Leu Val Asn Ile Ser Arg Pro Thr
115 120 125
Pro Ala Ser Gly Lys Asn Ser Tyr Gln Val Glu Thr Cys Ser Gly Glu
130 135 140
Leu Ala Thr Val Thr Leu Val His Asn Arg Val Leu Val Glu Asp Cys
145 150 155 160
Arg Gly Leu Tyr Gln Trp Lys Pro Asn Cys Glu Gly Ile Val Leu Tyr
165 170 175
Val Lys Thr Cys Ser Asp Trp Ala Asp Gln Val Glu Lys Gln Glu Lys
180 185 190
Glu Ser Pro Pro Lys Pro Gln Arg Pro Pro Arg Arg Asp Pro Arg Lys
195 200 205
Gly Leu Gln Pro Gln Val Pro Lys Glu Thr Glu Val Thr Glu Lys Lys
210 215 220
Arg Gln Pro Ser Val Thr Leu Val Ser Gly Gly Gln Lys Ala Gln Val
225 230 235 240
Ile Tyr Lys Gly Arg Thr Lys Asn Lys Lys Thr Pro Asp Gly Val Tyr
245 250 255
Arg Tyr Pro Gly Ala Lys Glu Gly Asp Val Val Lys Val Arg Lys Met
260 265 270
Leu Lys Asn Trp His Ile Ala Leu Val Met Tyr Leu Ile His Ile Ile
275 280 285
Thr Pro Gly Leu Ala Lys Val Gln Trp Phe Leu Lys Asp Glu Asn Ser
290 295 300
Thr Gly Ile Asn Gln Ile Leu Trp Gln Arg Gln Ile Asn Arg Ser Leu
305 310 315 320
His Gly Glu Trp Pro Asn Gln Ile Cys His Gly Met Pro Asn Glu Thr
325 330 335
Ile Thr Asp Glu Glu Leu Arg Ser Leu Gly Met Val Asp Thr Ser Pro
340 345 350
Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Gln Leu Gln Tyr His Glu Trp Lys Lys
355 360 365
His Gly Trp Cys Asn Tyr Pro Gln Lys Gln Ala Trp Ile Thr Arg Ile
370 375 380
Thr Ala Leu Gln Ala Asn Leu Thr Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Glu Cys
385 390 395 400
Ala Val Ile Cys Arg Phe Asn Gly Ser Tyr Asn Ile Val Lys Gln Ala
405 410 415
Arg Asp Glu Val Ser Pro Leu Thr Gly Cys Lys Glu Gly His Pro Phe
420 425 430
Leu Phe Ser Gly Glu Arg Ser Asp Thr Ser Cys Leu Arg Pro Pro Ser
435 440 445
Thr Ser Trp Val Arg Pro Val Lys Met Asp Glu Ala Ser Met Ala Asp
450 455 460
Gly Phe Ala His Gly Val Asp Lys Ala Ile Ile Leu Ile Arg Lys Gly
465 470 475 480
Ala Ser Gly Ile Ile Asn Phe Leu Asp Thr Ile Gly Arg Trp Leu Pro
485 490 495
Val Ala Glu Ala Thr Ile Val Pro Tyr Cys Asp Thr Tyr Thr Val Thr
500 505 510
Gly Met Tyr Val His Val Lys Asn Cys Leu Pro Arg Gly Leu Pro Lys
515 520 525
His Ser Lys Ile Ile Ser Pro Thr Met Ile Tyr Leu Gly Glu Gly Asp
530 535 540
Pro Ala His Asn Ile Gln His Leu Phe Gly Ser Gly Ile Ala Lys Trp
545 550 555 560
Val Leu Val Leu Leu Gly Ile Leu Gly Glu Trp Tyr Gly Glu Leu Ala
565 570 575
Ser Thr Ile Tyr Leu Leu Leu Glu Tyr Gly Ser Glu Trp Leu Glu His
580 585 590
Glu Ser Leu Val Thr Glu Gly Leu Ile Pro Gly Ile Asn Ile Thr Ile
595 600 605
Glu Leu Pro Ala Ser His Thr Val Pro Gly Trp Val Trp Val Ala Gly
610 615 620
Gln Trp Val Cys Val Lys Pro Asp Trp Trp Pro Thr Gln Ile Trp Ile
625 630 635 640
Glu Thr Val Val Ala Glu Thr Trp His Ile Leu Lys Ile Leu Ala Ser
645 650 655
Ala Leu Val Asn Ile Val Ala Ala Phe Val Asn Leu Glu Leu Val Tyr
660 665 670
Leu Val Ile Ile Leu Val Lys Ile Ser Lys Gly Asn Leu Ile Gly Ala
675 680 685
Ile Leu Trp Cys Leu Leu Leu Ser Gly Ala Glu Gly Ser Cys Tyr Lys
690 695 700
Arg Gln Asp Tyr Tyr Asn Thr Gln Leu Val Val Glu Glu Lys Thr Gly
705 710 715 720
Val Glu Lys Arg Ser Ile Met Gly Lys Trp Thr Val Ile Thr Arg Glu
725 730 735
Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gln Ile Asn Met Val Leu Asn Asp
740 745 750
Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn Thr Ser Thr Trp
755 760 765
Gly Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln Thr Val Pro Tyr
770 775 780
Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr Ser Thr Gly Tyr
785 790 795 800
Trp Val Asn Val Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu Gly Val Trp Leu
805 810 815
Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly Ser Ser Leu Met
820 825 830
Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met Glu Ile Pro Cys
835 840 845
Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Ala Gln Gly Thr Cys
850 855 860
Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr Tyr Asn Arg Lys
865 870 875 880
Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Ile Lys Lys Asn Asp Tyr Gln Tyr Trp
885 890 895
Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Met Tyr Arg His Leu
900 905 910
Leu Pro Leu Leu Val Ala Cys Leu Met Gly Gly Arg Ile Ser Val Trp
915 920 925
Phe Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Gln Val Glu Ala Ser Glu Val Gly
930 935 940
Thr Lys Gln Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Trp Lys Met Asp Trp Thr
945 950 955 960
Glu Leu Leu Phe Tyr Ile Val Leu Met Leu Ala Val Lys Glu Glu Leu
965 970 975
Ile Lys Lys Ile Val Thr Ala Ser Leu Val Ala Leu Lys Asn Ser Pro
980 985 990
Val Ala Leu Ser Phe Leu Ile Val Leu Arg Leu Val Gly Gly Ser Glu
995 1000 1005
Ala Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Glu Lys Met Cys Ile Asp Gln
1010 1015 1020
Pro Glu Phe Gly Thr Pro Phe Leu Ile Tyr Leu Trp Asp Asn Trp
1025 1030 1035
Lys Trp Thr Val Leu Val Ser Phe Ser Ala Leu Asn His Glu Lys
1040 1045 1050
Thr Ile Lys Leu Ala Arg Lys Leu Leu Leu Ala Thr His Ile Thr
1055 1060 1065
Ala Leu Thr Leu Thr Gly Leu Ser Asp Ser Ile Phe Tyr Met Met
1070 1075 1080
Leu Ile Thr Thr Asn Leu Leu Ile Lys Thr Phe Ile Tyr Leu Leu
1085 1090 1095
Gly Ala Ser Met Asn Trp Val Glu Arg Glu Lys Lys Lys Leu Leu
1100 1105 1110
Val Lys Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Lys Ala Val Thr Cys Ser Gln
1115 1120 1125
Asp Glu Asn Val Leu Glu Asn Lys Phe Asn Lys Ile Thr Val Asn
1130 1135 1140
Ala Asp Phe Thr Pro Cys Lys Leu Glu Leu Leu Gln Leu Leu Arg
1145 1150 1155
Ala Phe Leu Val Ser Leu Cys Phe Ser Tyr Tyr Lys Pro Leu Leu
1160 1165 1170
Tyr Ala Glu Thr Thr Leu Thr Val Ile Val Ile Gly Val Gln Glu
1175 1180 1185
Tyr Asn Val Ala Met Ala Arg Gly Arg Ser Val Val His Arg Leu
1190 1195 1200
Leu Ala Met Ala Tyr Tyr Ile Tyr Gly Arg Ile Gln Gly Asp Met
1205 1210 1215
Phe Gln Leu Ala Thr Ile Gln Cys Leu Leu Ser Ser Pro Arg Lys
1220 1225 1230
Ile Met Lys His Met Val Glu Asn Pro Thr Leu Lys Lys Leu Trp
1235 1240 1245
Gln Gly Glu Thr Glu Leu Phe Asn Gln Gly Val Ser Gln Ser Lys
1250 1255 1260
Ile Val Asn Pro Lys Lys Ile Gly Leu Glu Glu Leu His Lys Gly
1265 1270 1275
Met Cys Gly Leu Pro Thr Val Val Gln Asn Leu Val Ile Tyr Ala
1280 1285 1290
Lys Lys Asn Asp Ser Leu Ile Leu Gly Glu Leu Gly Tyr Pro Pro
1295 1300 1305
Gly Asp Leu Thr Ser Asp Gly Trp Glu Ile Leu Gly Pro Gly Arg
1310 1315 1320
Ile Pro Lys Ile Thr Asn Val Glu Ser Ala Lys Met Asp Leu Leu
1325 1330 1335
Ser Lys Leu Met Thr Phe Leu Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val Pro
1340 1345 1350
Arg Thr Pro Val His Ser Thr Arg Lys Leu Leu Lys Ile Val Arg
1355 1360 1365
Gly Leu Glu Thr Gly Trp Gly Tyr Thr His Ala Gly Gly Ile Ser
1370 1375 1380
Ser Ala Lys His Val Thr Gly Glu Lys Asn Leu Met Thr His Met
1385 1390 1395
Glu Gly Arg Lys Gly Lys Tyr Ile Leu Gln Ser Gln Glu His Gly
1400 1405 1410
Ala Asp Glu Val Glu Tyr Gly Val Lys Thr Asp Gln Lys Ala Pro
1415 1420 1425
Asp Asn Ala Leu Cys Tyr Cys Phe Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ile
1430 1435 1440
Lys Gly Glu Thr Gly Ala Met Val Phe Met Lys Lys Ile Gly Lys
1445 1450 1455
Lys Trp Thr Leu Val Thr Ser Asp Gly Asn Lys Ala Tyr Tyr Asn
1460 1465 1470
Val Asn Asn Leu Lys Gly Trp Ser Gly Leu Pro Ile Met Leu His
1475 1480 1485
Ser Thr Gly Ala Ile Val Gly Arg Ile Lys Ser Ala Tyr Ser Asp
1490 1495 1500
Glu Asn Asp Leu Val Glu Glu Leu Ile Asp Ser Arg Thr Ile Ser
1505 1510 1515
Lys Ser Asn Glu Thr Asn Leu Asp His Leu Ile Lys Glu Leu Ala
1520 1525 1530
Asp Met Arg Arg Gly Glu Phe Arg Ser Ile Thr Leu Gly Thr Gly
1535 1540 1545
Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu Pro Arg Gln Tyr Leu Thr Thr Val
1550 1555 1560
Gly Ala His Lys Ser Val Leu Val Leu Val Pro Leu Lys Ala Pro
1565 1570 1575
Ala Glu Ser Val Cys Arg Phe Met Arg Ser Lys Tyr Pro Thr Ile
1580 1585 1590
Asn Phe Ser Leu Arg Val Gly Glu Arg Lys Glu Gly Asp Val Ser
1595 1600 1605
Ser Gly Ile Thr Tyr Ala Thr Tyr Gly Phe Cys Cys Gln Leu Asn
1610 1615 1620
Leu Val Gln Leu Lys Glu Trp Ile Ser Arg Tyr Ser Met Val Phe
1625 1630 1635
Phe Asp Glu Tyr His Thr Ala Thr Pro Glu Gln Ile Ala Ile Ile
1640 1645 1650
Ser Lys Ile His Ala Leu Lys Val Lys Thr Arg Ile Val Ala Met
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Asp Ile Glu Glu Val Gly Val Ala Thr Ile Glu Lys Gly Glu Glu
1685 1690 1695
Pro Lys Arg Gly Arg Ile Ala Val Ala Gly Met Gln Val Pro Leu
1700 1705 1710
Glu Asp Leu Thr Gly Lys Asn Cys Leu Val Phe Val Ala Thr Lys
1715 1720 1725
Glu Ala Ala Glu Thr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Thr Arg Gly Ile
1730 1735 1740
Asn Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ile Asp Pro Lys Thr Leu Glu
1745 1750 1755
His Gly Met Thr Asn Gln Pro Tyr Cys Ile Val Ala Thr Asn Ala
1760 1765 1770
Ile Glu Ser Gly Ile Thr Cys Pro Asp Leu Asp Val Val Ile Asp
1775 1780 1785
Thr Met Gln Lys Tyr Glu Lys Val Val Asn Phe Ser Ala Lys Met
1790 1795 1800
Pro Leu Ile Val Thr Ser Leu Val Lys Lys Lys Ile Thr Arg Glu
1805 1810 1815
Glu Gln Gly Gln Arg Lys Gly Arg Val Gly Arg Gln Lys Lys Gly
1820 1825 1830
Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ser Gly Val Val Pro Asn Gly Ser Lys Asp
1835 1840 1845
Leu Ser Tyr Leu Ile Leu Gln Ala Gln Glu Tyr Gly Val Leu Glu
1850 1855 1860
Gln Val Asn Ile Thr Glu Tyr Phe Ile Ile Met Asn Glu Asp Trp
1865 1870 1875
Gly Leu Tyr Asp Val Asp Glu Val Glu Val Arg Ile Leu Glu Arg
1880 1885 1890
Met Asn Lys Glu Ile Leu Leu Pro Leu Gly Ile Val Glu Lys Gln
1895 1900 1905
Ile Leu Glu Arg Ser Thr His Pro Glu Lys Val Ala Leu Leu Tyr
1910 1915 1920
Asn Lys Leu Val Gln Lys Asn Pro Ile Val Tyr Pro Arg Val Gln
1925 1930 1935
Glu Gly Glu Val Ser Lys Glu Tyr Asn Thr Tyr Asn Leu Ala Val
1940 1945 1950
Tyr Asp Lys Leu Lys Asp Val Asn Pro Gln Ala Ile Tyr Val Leu
1955 1960 1965
Ala Glu Glu Glu Arg Ala Thr Glu Met Met Gly Leu Glu Phe Glu
1970 1975 1980
Gln Asp Pro Ser Asp Leu Gln Asp Ser Val Val Gln Leu Cys Glu
1985 1990 1995
Asp Ile Lys Arg Tyr Thr Lys Leu Ser Gly Ile Thr Glu Lys Leu
2000 2005 2010
Leu Val Gly Thr Met Val Gly Tyr Ile Gly Tyr Lys Ala Leu Thr
2015 2020 2025
Arg Asn His Val Pro Trp Val Ser Lys Glu Tyr Cys Tyr Glu Leu
2030 2035 2040
Thr Asp Ser Pro Asp Thr Tyr Glu Asn Ser Phe Ala Pro Leu Asp
2045 2050 2055
Val Asp Val Gln Asn Ser Gly Glu Gly Lys His Pro Glu Gln Leu
2060 2065 2070
Ala Asp His Gln Leu Arg Gln Leu Leu Glu Thr Gly Arg Asp Lys
2075 2080 2085
Ala Ile Asp Phe Leu Lys Gly Ile Arg Glu Phe Thr Ser Gly Ala
2090 2095 2100
Ile Asn Ser Pro Lys Ala Leu Ser Ile Trp Glu Lys Ile Tyr Gln
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Tyr Leu Lys Lys His Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ser Ala Ala Trp
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Gly Ser Ala Thr Ala Leu His Asp Ser Ile Lys Ser Arg Leu Gly
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Asp Glu Val Ala Thr Ala Val Ile Ile Leu Lys Tyr Leu Ala Phe
2150 2155 2160
Gly Glu Arg Glu Leu Ser Gly Leu Thr Arg Gln Val Leu Ile Asp
2165 2170 2175
Ile Ile Val Tyr Tyr Ile Val Asn Lys Pro Arg Phe Glu Gly Asp
2180 2185 2190
Asp Tyr Ala Lys Arg Lys Gly Arg Arg Leu Val Ile Glu Val Leu
2195 2200 2205
Met Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Ala Val Ser Asn Phe Trp Gly Val
2210 2215 2220
Ser Ile Asn Lys Ile Leu Gln Pro Ile Ser Asp Tyr Leu Pro Tyr
2225 2230 2235
Ala Thr Ala Thr Leu Ala Phe Leu Arg Pro Thr Phe Met Glu Ser
2240 2245 2250
Ala Val Val Val Ala Ser Ser Ile Tyr Arg Ala Phe Leu Ser Ile
2255 2260 2265
Lys His Ala Glu Asn Arg Ser Leu Val Thr Gln Val Ala Ser Ala
2270 2275 2280
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2285 2290 2295
Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Cys Val Leu His Met Asn Ile Asp
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2315 2320 2325
Asn Phe Ile Asp Gln Ala Ala Leu Asp Glu Leu Asp Lys Leu Glu
2330 2335 2340
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Thr Asn Pro Ile Arg Ala Ile Met Ile Leu Tyr Arg Val Tyr Tyr
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Ser Leu Ile Val Met Val Ile Val Glu Phe Leu Glu Leu Thr Gly
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Phe Leu Leu Glu Lys Leu Lys Lys Met Thr Asn Leu Ala Ile Gly
2420 2425 2430
Glu Ala Arg Lys Val Leu Leu Pro Ile Pro Tyr Leu Tyr Cys Glu
2435 2440 2445
Thr Trp Gln Ser Asp Ala Arg Ile Lys Ala Pro Glu Ser Tyr Asp
2450 2455 2460
Gln Val Val Val Glu Cys Lys Cys Gly Ala Ser Ala Arg Tyr Ser
2465 2470 2475
Phe Arg Asp Gly Val His Glu Ile Leu Glu Glu Lys Arg Thr Asn
2480 2485 2490
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2525 2530 2535
Gly Ile Tyr Ile Lys Phe Gly His Arg Pro Asp Gly Gly Arg Leu
2540 2545 2550
Ile Arg Gly Thr Thr His Ala Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu
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Ala Val Leu Glu Gly Asp Lys Ile His Phe Trp Lys Ala His Arg
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Gly Gly Thr Cys Thr Val Lys Gly Val Ser Leu Arg Ser Cys Ala
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Val Leu Ser Pro Cys Tyr Leu Ile Asn Gly Arg Arg Pro Ser Pro
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Phe Asp Val Ala Glu Gly Tyr Glu Cys His His Arg Lys Pro Arg
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Ala Thr Tyr Glu Asp Leu Glu Met Glu Glu Ile Leu Lys Arg Arg
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Val Pro Val Tyr Asp Pro Leu Cys Leu Phe Asp Thr Asp Ser Lys
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Leu Leu Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Glu Glu Asp Gln Glu Asp
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Phe Glu Tyr Ala Leu Arg Cys Trp Gly Leu Gly Val Tyr Val Ala
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Ile Met Tyr Lys Trp Val Lys Gln Lys Pro Ile Val Ile Pro Gly
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Ala Asp Trp Ala Gln Phe Lys Asn Pro Val Ala Val Ser Phe Asp
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3350 3355 3360
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Gly Val Pro Leu Leu Ala Ala Phe Gly Lys Pro Gln Lys Ile Thr
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Glu Gly Ala Ser Leu Lys Val Thr Ser Asn Phe Asp Gly Ile Glu
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Met Gly Lys Glu Glu Thr Pro Cys Ser Asp Glu Gly Val Lys Tyr
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Lys Tyr Ile Phe Gln Lys Met Lys Phe Met Gln Arg Met Phe Ala
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<212> DNA
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atggaaaaac agattgcata ttacttaaaa aaagaaaaac aaagaaatgg gtggacggaa 60
ctggtggtag gagaaagtca tacaaaaata accacgcttt ctggaaagac ctatcgaggc 120
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<211> 180
<212> PRT
<213> 2型瘟病毒
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Gly Trp Thr Glu Leu Val Val Gly Glu Ser His Thr Lys Ile Thr Thr
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Ala Leu His Pro His Pro Val Val Asn Cys Lys Val Val Glu Tyr Lys
65 70 75 80
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Val Asp Glu Lys Gly Arg Arg Leu Ser Ser Pro Pro Leu Gly Ile Trp
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180
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<212> DNA
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gctaaagaag gggacgtagt aaaggtcagg aagatgctga agaattggca tatagcctta 300
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Arg Thr Lys Asn Lys Lys Thr Pro Asp Gly Val Tyr Arg Tyr Pro Gly
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Ala Lys Glu Gly Asp Val Val Lys Val Arg Lys Met Leu Lys Asn Trp
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cttgccaagg tccagtggtt cttaaaagat gaaaactcga cggggatcaa ccagatactg 60
tggcaaagac agatcaacag atccttacat ggagaatggc ctaaccagat ctgccacggt 120
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cctagaacaa actacacctg ttgccagttg caatatcatg agtggaagaa acatggttgg 240
tgcaactatc cacaaaaaca ggcgtggatc acgaggataa cggccctaca agctaacctt 300
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atcgtaaaac aggccagaga tgaggtgagt ccactgacag ggtgcaagga agggcatcct 420
tttctattct ctggtgaaag atccgacacc tcatgcctaa ggcccccttc cactagttgg 480
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Cys Asn Tyr Pro Gln Lys Gln Ala Trp Ile Thr Arg Ile Thr Ala Leu
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Cys Arg Phe Asn Gly Ser Tyr Asn Ile Val Lys Gln Ala Arg Asp Glu
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Val Ser Pro Leu Thr Gly Cys Lys Glu Gly His Pro Phe Leu Phe Ser
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Gly Glu Arg Ser Asp Thr Ser Cys Leu Arg Pro Pro Ser Thr Ser Trp
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Val Arg Pro Val Lys Met Asp Glu Ala Ser Met Ala Asp Gly Phe Ala
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130 135 140
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Leu Leu Leu Ser Gly Ala Glu Gly
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<212> DNA
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tcgtgctaca aaagacaaga ctattacaac acccaactag tcgtcgaaga aaaaacaggc 60
gtagaaaaac gatctataat gggcaagtgg accgtgataa ccagggaagg tcgggagcca 120
agattaatgg agcaaataaa tatggtattg aatgatagcc tgtcagaaac ctactgctat 180
aataggctaa acaccagcac ttgggggcgg caaccggcaa gacaaagagg gtgtggtcaa 240
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actgtgttag tcagcttctc cgcactgaac catgaaaaaa ctataaaact ggcaagaaaa 1080
ctgttgttgg caacacatat aacagcgctc acattg 1116
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<211> 372
<212> PRT
<213> 2型瘟病毒
<400> 12
Ser Cys Tyr Lys Arg Gln Asp Tyr Tyr Asn Thr Gln Leu Val Val Glu
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20 25 30
Ile Thr Arg Glu Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gln Ile Asn Met
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Val Leu Asn Asp Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn
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Ser Thr Gly Tyr Trp Val Asn Val Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu
100 105 110
Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly
115 120 125
Ser Ser Leu Met Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met
130 135 140
Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Ala
145 150 155 160
Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr
165 170 175
Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Ile Lys Lys Asn Asp
180 185 190
Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Met
195 200 205
Tyr Arg His Leu Leu Pro Leu Leu Val Ala Cys Leu Met Gly Gly Arg
210 215 220
Ile Ser Val Trp Phe Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Gln Val Glu Ala
225 230 235 240
Ser Glu Val Gly Thr Lys Gln Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Trp Lys
245 250 255
Met Asp Trp Thr Glu Leu Leu Phe Tyr Ile Val Leu Met Leu Ala Val
260 265 270
Lys Glu Glu Leu Ile Lys Lys Ile Val Thr Ala Ser Leu Val Ala Leu
275 280 285
Lys Asn Ser Pro Val Ala Leu Ser Phe Leu Ile Val Leu Arg Leu Val
290 295 300
Gly Gly Ser Glu Ala Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Glu Lys Met Cys
305 310 315 320
Ile Asp Gln Pro Glu Phe Gly Thr Pro Phe Leu Ile Tyr Leu Trp Asp
325 330 335
Asn Trp Lys Trp Thr Val Leu Val Ser Phe Ser Ala Leu Asn His Glu
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Lys Thr Ile Lys Leu Ala Arg Lys Leu Leu Leu Ala Thr His Ile Thr
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Ala Leu Thr Leu
370
<210> 13
<211> 2802
<212> DNA
<213> 2型瘟病毒
<400> 13
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acattcatat acttgctggg ggctagtatg aattgggtcg agagagaaaa aaagaaattg 120
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ttggagaata aattcaacaa gataactgta aacgcggatt tcaccccatg caagcttgaa 240
cttctacaat tacttagggc ttttttagtc tctttgtgtt tttcctacta caaacctctc 300
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tgctactgtt ttaaccctga agctacaaac ataaaaggag agacgggagc catggtgttc 1140
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<212> DNA
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cttagatcat gcgcaccagg tcatagaact aaggctatgg tcttgtgtga ttgcactgat 1800
gtgcttagcc cctgttacct aataaacggc aggagaccat ccccatttga cgtcgcggaa 1860
ggttatgaat gtcaccaccg gaagccccga gcgacgtatg aagacctaga aatggaggaa 1920
atactaaaga gacgagtccc tgtctacgat cctctgtgtt tgtttgacac tgatagtaaa 1980
ctgctacctc ccgacaccta ctacttggaa gaagatcaag aggactttga gtacgcattg 2040
agatgctggg gcctcggggt ttatgtagca gacgggcctg tcacttcccc cccggacata 2100
agaatacacc atagttcggt attactactg ctgacacctg gagtaaactc agagttgccc 2160
ttacagtaca tacgttgtta ccctcatcag gcagaggtgg acatctacat taggagtcag 2220
cttttggagg aggaagacac tgctacggag gtggaaggct cccaggaaga tggtgatgaa 2280
gggatgggcg atgcggtaat agaggatgag gatacatcgt ccacaacaga atcaataccc 2340
ccactagaag aggaggaagg gggcgaagag ccaatcacct atgtggtcat aaggggatta 2400
caagaagaaa gatacgccag ccatcttaaa cta 2433
<210> 20
<211> 811
<212> PRT
<213> 2型瘟病毒
<400> 20
Ala Asp His Gln Leu Arg Gln Leu Leu Glu Thr Gly Arg Asp Lys Ala
1 5 10 15
Ile Asp Phe Leu Lys Gly Ile Arg Glu Phe Thr Ser Gly Ala Ile Asn
20 25 30
Ser Pro Lys Ala Leu Ser Ile Trp Glu Lys Ile Tyr Gln Tyr Leu Lys
35 40 45
Lys His Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ser Ala Ala Trp Gly Ser Ala Thr
50 55 60
Ala Leu His Asp Ser Ile Lys Ser Arg Leu Gly Asp Glu Val Ala Thr
65 70 75 80
Ala Val Ile Ile Leu Lys Tyr Leu Ala Phe Gly Glu Arg Glu Leu Ser
85 90 95
Gly Leu Thr Arg Gln Val Leu Ile Asp Ile Ile Val Tyr Tyr Ile Val
100 105 110
Asn Lys Pro Arg Phe Glu Gly Asp Asp Tyr Ala Lys Arg Lys Gly Arg
115 120 125
Arg Leu Val Ile Glu Val Leu Met Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Ala Val
130 135 140
Ser Asn Phe Trp Gly Val Ser Ile Asn Lys Ile Leu Gln Pro Ile Ser
145 150 155 160
Asp Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ala Thr Leu Ala Phe Leu Arg Pro Thr
165 170 175
Phe Met Glu Ser Ala Val Val Val Ala Ser Ser Ile Tyr Arg Ala Phe
180 185 190
Leu Ser Ile Lys His Ala Glu Asn Arg Ser Leu Val Thr Gln Val Ala
195 200 205
Ser Ala Ala Leu Glu Val Met Gly Leu Thr Pro Val Ser Ala Gly Leu
210 215 220
Gly Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Cys Val Leu His Met Asn Ile Asp
225 230 235 240
Lys Asn Glu Glu Lys Arg Thr Leu Ile Leu Lys Met Phe Val Lys Asn
245 250 255
Phe Ile Asp Gln Ala Ala Leu Asp Glu Leu Asp Lys Leu Glu Pro Glu
260 265 270
Lys Ile Ile Leu Ser Leu Leu Glu Gly Ile Gln Thr Cys Thr Asn Pro
275 280 285
Ile Arg Ala Ile Met Ile Leu Tyr Arg Val Tyr Tyr Lys Gly Glu Thr
290 295 300
Phe Thr Glu Ala Leu Ser Lys Met Ala Gly Lys Ser Leu Ile Val Met
305 310 315 320
Val Ile Val Glu Phe Leu Glu Leu Thr Gly Gln Thr Gln Gly Gly Tyr
325 330 335
Ile Asp Leu Ser Ala Asn Leu Leu Thr Phe Leu Leu Glu Lys Leu Lys
340 345 350
Lys Met Thr Asn Leu Ala Ile Gly Glu Ala Arg Lys Val Leu Leu Pro
355 360 365
Ile Pro Tyr Leu Tyr Cys Glu Thr Trp Gln Ser Asp Ala Arg Ile Lys
370 375 380
Ala Pro Glu Ser Tyr Asp Gln Val Val Val Glu Cys Lys Cys Gly Ala
385 390 395 400
Ser Ala Arg Tyr Ser Phe Arg Asp Gly Val His Glu Ile Leu Glu Glu
405 410 415
Lys Arg Thr Asn Trp Cys Lys Asn Phe Phe Leu Trp Gly Pro Asn Phe
420 425 430
His Asn Pro Asp Pro Lys Arg Met Thr Phe Tyr Glu Tyr Gly Gln Ala
435 440 445
Lys Lys Cys Pro Val Ile Ile Ile Gly Glu Asp Ile Thr Phe Gly Lys
450 455 460
Tyr Gly Ile Tyr Ile Lys Phe Gly His Arg Pro Asp Gly Gly Arg Leu
465 470 475 480
Ile Arg Gly Thr Thr His Ala Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu
485 490 495
Ile Leu Thr Ala Pro Ser Gln Val Ala Ile Gly Lys Val Lys Leu Thr
500 505 510
Asp Tyr Cys Asn Gln Lys Gly Ile Ile Asp Arg Lys Leu Ala Val Leu
515 520 525
Glu Gly Asp Lys Ile His Phe Trp Lys Ala His Arg Gly Ser Lys Ile
530 535 540
Thr Asp Gln Leu Thr Ile Glu Asn Leu Thr Asp Asp Leu Gly Ser Glu
545 550 555 560
Ile Arg Asp Ile Thr Trp Glu Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Val
565 570 575
Lys Gly Val Ser Leu Arg Ser Cys Ala Pro Gly His Arg Thr Lys Ala
580 585 590
Met Val Leu Cys Asp Cys Thr Asp Val Leu Ser Pro Cys Tyr Leu Ile
595 600 605
Asn Gly Arg Arg Pro Ser Pro Phe Asp Val Ala Glu Gly Tyr Glu Cys
610 615 620
His His Arg Lys Pro Arg Ala Thr Tyr Glu Asp Leu Glu Met Glu Glu
625 630 635 640
Ile Leu Lys Arg Arg Val Pro Val Tyr Asp Pro Leu Cys Leu Phe Asp
645 650 655
Thr Asp Ser Lys Leu Leu Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Glu Glu Asp
660 665 670
Gln Glu Asp Phe Glu Tyr Ala Leu Arg Cys Trp Gly Leu Gly Val Tyr
675 680 685
Val Ala Asp Gly Pro Val Thr Ser Pro Pro Asp Ile Arg Ile His His
690 695 700
Ser Ser Val Leu Leu Leu Leu Thr Pro Gly Val Asn Ser Glu Leu Pro
705 710 715 720
Leu Gln Tyr Ile Arg Cys Tyr Pro His Gln Ala Glu Val Asp Ile Tyr
725 730 735
Ile Arg Ser Gln Leu Leu Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Glu Val Glu
740 745 750
Gly Ser Gln Glu Asp Gly Asp Glu Gly Met Gly Asp Ala Val Ile Glu
755 760 765
Asp Glu Asp Thr Ser Ser Thr Thr Glu Ser Ile Pro Pro Leu Glu Glu
770 775 780
Glu Glu Gly Gly Glu Glu Pro Ile Thr Tyr Val Val Ile Arg Gly Leu
785 790 795 800
Gln Glu Glu Arg Tyr Ala Ser His Leu Lys Leu
805 810
<210> 21
<211> 2256
<212> DNA
<213> 2型瘟病毒
<400> 21
aatgactgga tcagtgaaaa catttcagag ccacacagag tccaaattat gctagatggg 60
acagtgagag tcacaataaa agagggcaaa gtgaaacatt tgtttggggt ctatagaata 120
gaaaactccc tggaagcaat gtttaaagag accatagctg acctccccgt agctacccaa 180
ccgccccagg ggccagtcta tacggctaaa gagctggccc aagggaacat cgccccggtc 240
caacctgcag cgaattatta cggaatgata gaggggagag gcgacccaat gacggcattc 300
gaagccttat cagtcttgcg gtcacaaaaa gtcttagcca aggacgtgaa ggtgaacacc 360
cgcagggcgc aggttttttt aaataaagtc aggagaattg ctgaggtcag agcgtcggaa 420
ctgacattaa aatgcttacc gatacttggc aaagtaaatg ggaggaaatt gattagagag 480
gaaaccaaca tccccaacca aaggttggca tcaataatga cctcaatagg aattagacta 540
gaaaaactgc cagtggttag agcaaacact tccggctcta agttcagaca gtcaatctta 600
gaaaaaatgg ataagtatga aaatgaacaa gtcccagggt tacatgaaaa gatgtgggca 660
gcgttcctgg caactgccag gcaagattta agaaatacct atgaggaagt aacttatctt 720
gaattagagg ccggaatcaa tcggaaagga gccccaggtt tctttgaaaa agaaagctca 780
ataggagaag tgctggaaaa aaaagaaaaa attgacgtca caatccaaga gattgaaaaa 840
ggcaaccact tatactatga aacagccatg ccaaaaaatg agaaaagaga tgtgcttgat 900
gattggttgt cagaggattt cgtcacttat aagaaaccac gtgtgataca gtaccctgag 960
gcagtcaccc ggttggccat caccaaaata atgtataagt gggtgaagca aaagcctata 1020
gtgattcccg gttatgaggg aaaaaccccg atctttgaaa tatttgaaaa agtcagtgca 1080
gattgggctc agttcaaaaa tccggtagcc gtcagcttcg acaccagagc ctgggacact 1140
caagtaacaa gagaagacct caggctggta gggcggatac agaaatacta ttacaaaaaa 1200
aaatattgga agttcattga caatttgaca gccatgatgg aggaagtgcc tgtaatcact 1260
gtagaaggag atatgttcct cagagttgga cagcgcggat ccggacagcc tgatacctca 1320
gcaggcaatt ccatgctaaa tgtgctgact atgttggtag ctttctctga atccacaaat 1380
ctgcccatag cggctgcctg gaaggcctgt cggatccacg tctgtggtga cgacggtttc 1440
ttaatcacag aatcggaatt agggaggaag tttgctgaaa aaggtgttcc tctgttagct 1500
gcatttggca aaccccaaaa aattacagag ggagcgagcc taaaggtaac cagcaacttt 1560
gacggaatag agttttgtag tcatacccct atcagagtcc aaacaccaaa catcaggtgg 1620
atgccagcga gaccaacagc aacaatccta ggcaaaatga gtaccaggct gggtgagggt 1680
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ccctggaacc cgctggtcag gagaatcagc ctcctattgt tatcgactac tgacccaatg 1800
gggaaagagg aaaccccatg ctccgatgag ggggtgaagt atgttgggga ccctatcgct 1860
gcatacaggg atgtatgggg gcacaaatta gaggatgtag gccatgttga tcaaccgcag 1920
ttatcccgga tgaactatag catgacttac ttagggattt ggaaaccaaa gacaagtcag 1980
cggctagtcg aacagtgttg tcgtctggcc gagaaaagca attgtgtggt acgtgctgac 2040
tccctgataa agaaaaaggt caagatcact tatgacccgg ggataggagt ggctcaggtc 2100
attcgtaggt gggaagagct tgagtggacc agaaggaaac ctgaactcac caatgtaatt 2160
gtagaagatg atatcttcct agtcctgtgg aagagatttt caaagtacat ttttcagaaa 2220
atgaagttca tgcagagaat gttcgcccct tattaa 2256
<210> 22
<211> 751
<212> PRT
<213> 2型瘟病毒
<400> 22
Asn Asp Trp Ile Ser Glu Asn Ile Ser Glu Pro His Arg Val Gln Ile
1 5 10 15
Met Leu Asp Gly Thr Val Arg Val Thr Ile Lys Glu Gly Lys Val Lys
20 25 30
His Leu Phe Gly Val Tyr Arg Ile Glu Asn Ser Leu Glu Ala Met Phe
35 40 45
Lys Glu Thr Ile Ala Asp Leu Pro Val Ala Thr Gln Pro Pro Gln Gly
50 55 60
Pro Val Tyr Thr Ala Lys Glu Leu Ala Gln Gly Asn Ile Ala Pro Val
65 70 75 80
Gln Pro Ala Ala Asn Tyr Tyr Gly Met Ile Glu Gly Arg Gly Asp Pro
85 90 95
Met Thr Ala Phe Glu Ala Leu Ser Val Leu Arg Ser Gln Lys Val Leu
100 105 110
Ala Lys Asp Val Lys Val Asn Thr Arg Arg Ala Gln Val Phe Leu Asn
115 120 125
Lys Val Arg Arg Ile Ala Glu Val Arg Ala Ser Glu Leu Thr Leu Lys
130 135 140
Cys Leu Pro Ile Leu Gly Lys Val Asn Gly Arg Lys Leu Ile Arg Glu
145 150 155 160
Glu Thr Asn Ile Pro Asn Gln Arg Leu Ala Ser Ile Met Thr Ser Ile
165 170 175
Gly Ile Arg Leu Glu Lys Leu Pro Val Val Arg Ala Asn Thr Ser Gly
180 185 190
Ser Lys Phe Arg Gln Ser Ile Leu Glu Lys Met Asp Lys Tyr Glu Asn
195 200 205
Glu Gln Val Pro Gly Leu His Glu Lys Met Trp Ala Ala Phe Leu Ala
210 215 220
Thr Ala Arg Gln Asp Leu Arg Asn Thr Tyr Glu Glu Val Thr Tyr Leu
225 230 235 240
Glu Leu Glu Ala Gly Ile Asn Arg Lys Gly Ala Pro Gly Phe Phe Glu
245 250 255
Lys Glu Ser Ser Ile Gly Glu Val Leu Glu Lys Lys Glu Lys Ile Asp
260 265 270
Val Thr Ile Gln Glu Ile Glu Lys Gly Asn His Leu Tyr Tyr Glu Thr
275 280 285
Ala Met Pro Lys Asn Glu Lys Arg Asp Val Leu Asp Asp Trp Leu Ser
290 295 300
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Lys Lys Pro Arg Val Ile Gln Tyr Pro Glu
305 310 315 320
Ala Val Thr Arg Leu Ala Ile Thr Lys Ile Met Tyr Lys Trp Val Lys
325 330 335
Gln Lys Pro Ile Val Ile Pro Gly Tyr Glu Gly Lys Thr Pro Ile Phe
340 345 350
Glu Ile Phe Glu Lys Val Ser Ala Asp Trp Ala Gln Phe Lys Asn Pro
355 360 365
Val Ala Val Ser Phe Asp Thr Arg Ala Trp Asp Thr Gln Val Thr Arg
370 375 380
Glu Asp Leu Arg Leu Val Gly Arg Ile Gln Lys Tyr Tyr Tyr Lys Lys
385 390 395 400
Lys Tyr Trp Lys Phe Ile Asp Asn Leu Thr Ala Met Met Glu Glu Val
405 410 415
Pro Val Ile Thr Val Glu Gly Asp Met Phe Leu Arg Val Gly Gln Arg
420 425 430
Gly Ser Gly Gln Pro Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met Leu Asn Val
435 440 445
Leu Thr Met Leu Val Ala Phe Ser Glu Ser Thr Asn Leu Pro Ile Ala
450 455 460
Ala Ala Trp Lys Ala Cys Arg Ile His Val Cys Gly Asp Asp Gly Phe
465 470 475 480
Leu Ile Thr Glu Ser Glu Leu Gly Arg Lys Phe Ala Glu Lys Gly Val
485 490 495
Pro Leu Leu Ala Ala Phe Gly Lys Pro Gln Lys Ile Thr Glu Gly Ala
500 505 510
Ser Leu Lys Val Thr Ser Asn Phe Asp Gly Ile Glu Phe Cys Ser His
515 520 525
Thr Pro Ile Arg Val Gln Thr Pro Asn Ile Arg Trp Met Pro Ala Arg
530 535 540
Pro Thr Ala Thr Ile Leu Gly Lys Met Ser Thr Arg Leu Gly Glu Gly
545 550 555 560
Ala Thr Arg Ser Gly Glu Glu Tyr Glu Lys Gln Val Ala Phe Ala Tyr
565 570 575
Leu Leu Met Tyr Pro Trp Asn Pro Leu Val Arg Arg Ile Ser Leu Leu
580 585 590
Leu Leu Ser Thr Thr Asp Pro Met Gly Lys Glu Glu Thr Pro Cys Ser
595 600 605
Asp Glu Gly Val Lys Tyr Val Gly Asp Pro Ile Ala Ala Tyr Arg Asp
610 615 620
Val Trp Gly His Lys Leu Glu Asp Val Gly His Val Asp Gln Pro Gln
625 630 635 640
Leu Ser Arg Met Asn Tyr Ser Met Thr Tyr Leu Gly Ile Trp Lys Pro
645 650 655
Lys Thr Ser Gln Arg Leu Val Glu Gln Cys Cys Arg Leu Ala Glu Lys
660 665 670
Ser Asn Cys Val Val Arg Ala Asp Ser Leu Ile Lys Lys Lys Val Lys
675 680 685
Ile Thr Tyr Asp Pro Gly Ile Gly Val Ala Gln Val Ile Arg Arg Trp
690 695 700
Glu Glu Leu Glu Trp Thr Arg Arg Lys Pro Glu Leu Thr Asn Val Ile
705 710 715 720
Val Glu Asp Asp Ile Phe Leu Val Leu Trp Lys Arg Phe Ser Lys Tyr
725 730 735
Ile Phe Gln Lys Met Lys Phe Met Gln Arg Met Phe Ala Pro Tyr
740 745 750
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室合成的DNA序列
<400> 23
tgcctggtat tcgtggc 17
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室合成的DNA序列
<400> 24
tcatcccatg ttccagagt 19
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室合成的DNA序列
<400> 25
cctccgtctc cgcggctttg g 21
<210> 26
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室合成的DNA序列
<400> 26
aacaggaaag aactgcctgg tattcgtggc aaccaaagaa gccgcggaga cggaggctaa 60
agaactgcgc accagaggaa ttaacgccac ctattcaggt atagacccta agactctgga 120
acatgggatg accaatcagc cat 143

Claims (19)

1.组合物，其包含含有核酸序列的灭活瘟病毒，所述核酸序列为SEQ ID NO：1。
2.组合物，其包含含有氨基酸序列的灭活瘟病毒，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述瘟病毒是经化学灭活的瘟病毒，并且其中所述瘟病毒通过用选自以下的灭活剂处理而灭活：二元亚乙基亚胺、亚乙基亚胺、乙酰基亚乙基亚胺、β-亚乙基亚胺、β-丙内酯、戊二醛、臭氧和甲醛。
4.权利要求1或2所述的组合物，其中所述瘟病毒是经物理灭活的瘟病毒，并且其中所述瘟病毒通过用UV辐射、X射线辐射、γ辐射、冷冻-解冻和/或加热处理而灭活。
5.权利要求1或2所述的组合物，其还包含可药用载体和/或赋形剂。
6.权利要求5所述的组合物，其中所述可药用载体和/或赋形剂是佐剂。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述佐剂是基于水包油型乳剂的佐剂。
8.组合物，其包含含有核酸序列的减毒瘟病毒，所述核酸序列为SEQ ID NO：1。
9.组合物，其包含含有氨基酸序列的减毒瘟病毒，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
10.权利要求8或9所述的组合物，其还包含可药用载体和/或赋形剂。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述可药用载体和/或赋形剂是佐剂。
12.权利要求11所述的组合物，其中所述佐剂是基于水包油型乳剂的佐剂。
13.权利要求8或9所述的组合物，其中所述瘟病毒是冻干形式的。
14.权利要求8或9所述的组合物，其中所述组合物包含至少约104个病毒颗粒。
15.权利要求1至14中任一项所述的组合物在制备用于为仔猪提供针对先天性震颤的保护的药物中的用途，其中所述保护包括将权利要求1至14中任一项所述的组合物以足以保护所述仔猪的量向妊娠母猪或小母猪施用，或者在繁育之前向母猪或小母猪施用。
16.权利要求15所述的用途，其中所述保护包括将所述组合物向妊娠母猪或小母猪施用。
17.权利要求15所述的用途，其中所述保护包括将所述组合物在繁育之前向母猪或小母猪施用。
18.权利要求15所述的用途，其中所述保护包括将所述组合物向所述母猪或小母猪肌内施用。
19.权利要求15所述的用途，其中所述施用是第一次施用，并且其中所述保护还包括在所述第一次施用后一至三周的第二次施用。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140170180A1 (en) 2012-12-17 2014-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine parvovirus 5a, methods of use and vaccine
US9920302B2 (en) * 2015-08-31 2018-03-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Pestivirus vaccines for congenital tremors
CN106801109B (zh) * 2017-03-24 2021-03-05 温氏食品集团股份有限公司 一种猪非典型瘟病毒rt-pcr检测特异性引物、试剂盒及检测方法
CN109295014B (zh) * 2018-10-30 2021-08-17 华中农业大学 一种非典型猪瘟病毒e2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US382425A (en) 1888-05-08 Brandt
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US3456053A (en) * 1966-05-06 1969-07-15 Pfizer & Co C Inactivated hog cholera virus vaccine
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
IL84154A0 (en) 1986-10-16 1988-03-31 Microgenesys Inc Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
WO1990001543A1 (fr) 1988-07-29 1990-02-22 Intracel Corporation Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
ES2200016T3 (es) 1989-03-21 2004-03-01 Vical Incorporated Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado.
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5552143A (en) 1989-03-24 1996-09-03 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
GB9001766D0 (en) 1990-01-25 1990-03-28 Univ Court Of The University O Vaccines
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
EP0575491B1 (en) 1991-03-07 2003-08-13 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
UA27788C2 (uk) 1991-06-06 2000-10-16 Стіхтінг Сентрал Діргенескюндіг Інстітют Композиція, що містить виділений фактор лелістада, вакцинна композиція для вакцинації тварин (варіанти), діагностичний набір для виявлення антитіла
US6042830A (en) 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
ES2065303T5 (es) 1991-08-26 2001-05-01 Univ Minnesota Procedimiento de diagnosis y vacuna especifica.
WO1993006211A1 (en) 1991-09-16 1993-04-01 Collins James E Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof
AU2684792A (en) 1991-10-14 1993-05-21 Akzo Nobel N.V. Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
US5801029A (en) 1993-02-16 1998-09-01 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
IL108915A0 (en) 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
FR2711670B1 (fr) 1993-10-22 1996-01-12 Pasteur Institut Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
EP0740704A1 (en) 1994-01-27 1996-11-06 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of dna transcription unit
DE69522984T2 (de) 1994-04-11 2002-04-25 Akzo Nobel Nv Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins
WO1995030018A2 (en) 1994-04-29 1995-11-09 Immuno Aktiengesellschaft Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
DE69632658T2 (de) 1995-03-14 2005-06-09 Akzo Nobel N.V. Expression in der selben Zelle von Polypeptide vom schweinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom
AU711702B2 (en) 1995-03-23 1999-10-21 Cambridge University Technical Services Limited Vectors for gene delivery
EP0979101B1 (en) 1996-07-03 2010-10-27 Merial, Inc. Recombinant canine adenovirus 2 (cav2) containing exogenous dna
DE69704011T2 (de) 1996-10-09 2001-06-07 Akzo Nobel Nv Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Sweins (PRRSV)
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US6183752B1 (en) 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
NZ501264A (en) 1998-12-22 2001-09-28 Pfizer Prod Inc Polynucleotide DNA sequence encoding an infectious RNA molecule encoding a North American PRRS
ATE322541T1 (de) * 2000-04-21 2006-04-15 Akzo Nobel Nv Pestivirus mutanten und dessen enthaltende impfstoffe
EP1290016A2 (en) * 2000-06-15 2003-03-12 Purdue Research Foundation Vaccine for congenital tremors in pigs
US6841364B2 (en) 2002-01-22 2005-01-11 Protatek International, Inc. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof
CN104178505B (zh) * 2014-09-01 2017-03-08 华中农业大学 一种表达猪瘟病毒e2基因重组病毒及制备方法与应用
KR102472939B1 (ko) * 2014-12-19 2022-11-30 인터벳 인터내셔널 비.브이. 페스티바이러스
WO2016176624A2 (en) 2015-04-30 2016-11-03 Kansas State University Research Foundation Porcine pestvirus, vaccines, and assays
US9920302B2 (en) * 2015-08-31 2018-03-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Pestivirus vaccines for congenital tremors

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