EA036116B1

EA036116B1 - Пестивирусные вакцины против врожденного тремора

Info

Publication number: EA036116B1
Application number: EA201792593A
Authority: EA
Inventors: Джозеф Гилберт Виктория; Эбби Рэй Паттерсон; Кэлли Энн Вайзек; Арун В. Айер; Леа Энн Хоббс; Бэйли Лорен Арруда; Пауло Энрике Элиас Арруда; Дрю Роберт Магстадт; Кент Джей Швартц
Original assignee: Берингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх; Айова Стейт Юниверсити Рисерч Фаундейшн, Инк.
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2020-09-30
Also published as: BR112017028224A2; JP2018525324A; EA201792593A1; CL2018000513A1; EP3344289B1; PH12017501795B1; MX2017016252A; US10633637B2; PL3344289T3; WO2017040672A1; CN108135993A; TW201718007A; CA2996629A1; AU2016315796A1; UA124140C2; PT3344289T; US9920302B2; ES2778649T3; KR20180042167A; AU2016315796B2

Abstract

Изобретение относится к вакцине для защиты поросят от болезней, связанных с новым пестивирусом. Вакцина обычно включает пестивирусное средство и, необязательно, адъювант. Изобретение также относится к способам защиты свиней от болезней, связанных с пестивирусом, включая, но не ограничиваясь им, врожденный тремор, и к способам получения пестивирусной вакцины.

Description

Связанные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент США № 62/212124, поданной 31 августа 2015 г., которая включена в настоящее описание в полном объеме в виде ссылки.

Предпосылки изобретения

А. Уровень техники.

Настоящее изобретение относится к пестивирусной вакцине, которая способна снижать клинические симптомы врожденного тремора (СТ) или врожденной миоклонии. Состояние, известное также как трясущиеся поросята.

Pestivirus является родом вирусов семейства Flaviviridae. Вирусы рода Pestivirus инфицируют млекопитающих, включая представителей семейства Suidae (который включает различные виды свиней).

СТ является спорадическим заболеванием, наблюдаемым у новорожденных поросят. Обычно в приплоде поражается более одного поросенка. Если тремор у поросят настолько сильный, что не дает доступа к соскам и сосанию, тогда смертность может быть высокой. Смертность в пораженном приплоде или при вспышке в стаде может возрастать на 3-10% выше нормы. По мере роста пораженных поросят это состояние ослабевает.

СТ подразделяется на пять типов. Типы AI, AIII, AIV и AV связаны с действием вируса классической чумы свиней, генетической особенностью или воздействием трихлорфона. Поскольку указанные причины известны и, следовательно, их стараются избегать, тип AII считается наиболее частой причиной. Полагают, что тип AII связан с вирусной инфекцией. Каузальный вирус группы 2 широко распространен в большинстве, если не во всех популяциях свиней, однако в большинстве стад наблюдается легкое течение заболевания, по-видимому, из-за того, что у свиноматки был приобретен иммунитет. Тем не менее, в новых стадах молодых свиней могут возникать крупные вспышки, при которых во время первых родов поражается до 80% всего помета.

Это не поддающийся количественному определению риск для любого нового стада молодых свиней.

Причина, по которой поросята рождаются с тремором, является вторичной по отношению к первичному поражению, заключающемуся в гипомиелинизации или демиелинизации мозга и спинного мозга. Специального лечения этого состояния не существует. Тем не менее, помощь при сосании и обеспечение условий содержания, при которых можно избежать охлаждения и задавливания, может позволить со временем восстановить большую часть свиней, хотя вес при отъеме может быть пониженным на 1 кг или более.

В. Описание предшествующего уровня техники.

Несмотря на имеющиеся ранее сообщения о том, что цирковирусные инфекции свиней типа 1 и типа 2 (см. Burnborg et al., Association of myocarditis with high viral load of porcine circovirus type 2 in several tissues in cases of fetal death and high mortality in piglets. A case study. J. Vet. Diagn. Invest. 19(4):368-375, 2007) или астровируса (см. Blomstrom et al., Astrovirus as a possible cause of congenital tremor type AII in piglets? Acta Vet Scand. 56(1):82, 2014) являются причиной СТ, позднее они были опровергнуты (см., На et al., Lack of evidence of porcine circovirus type 1 and type 2 infection in piglets with congenital tremors in Korea, Vet. Rec. (2005) 156:383-384; Kennedy et al., Absence of evidence of porcine circovirus infection in piglets with congenital tremors J. Vet. Diagn Invest. 2003 Mar; 15(2):151-156). Таким образом, не имеется явного патогенного источника СТ типа AII у поросят и, следовательно, нет эффективного лечения этого состояния.

Сущность изобретения

Решение вышеуказанной технической проблемы достигается описанием и вариантами осуществления, определенными в формуле изобретения. Таким образом, изобретение в его различных аспектах реализовано в соответствии с формулой изобретения.

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, вакцинам и связанным с ними способам, которые устраняют пробелы в данной области. Композиции и способы обеспечивают лечение врожденного тремора у поросят.

В одном из аспектов композиции по настоящему изобретению могут включать инактивированный пестивирус, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична SEQ ID NO: 1, например по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98 или по меньшей мере приблизительно на 99%, например на 100%. В другом аспекте настоящее описание относится к композициям, которые включают инактивированный пестивирус, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична SEQ ID NO: 2, например по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98 или по меньшей мере приблизительно на 99%, например на 100%.

В некоторых вариантах осуществления композиций по настоящему изобретению пестивирус представляет собой химически инактивированный пестивирус, например пестивирус, инактивированный обработкой инактивирующим средством, таким как бинарный этиленимин, этиленимин, ацетилметиленимин, β-этиленимин, β-пропиолактон, глутаровый альдегид, озон и/или формальдегид.

В некоторых вариантах осуществления пестивирус представляет собой физически инактивирован- 1 036116 ный пестивирус, например пестивирус, инактивированный обработкой УФ-излучением, рентгеновским излучением, γ-излучением, замораживанием-оттаиванием и/или нагреванием.

В другом аспекте композиции по настоящему изобретению могут включать аттенуированный пестивирус, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична SEQ ID NO: 1, например по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98 или по меньшей мере приблизительно на 99%, например на 100%. В еще одном аспекте композиции могут включать композиции, которые включают аттенуированный пестивирус, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична SEQ ID NO: 2, например по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98 или по меньшей мере приблизительно на 99%, например на 100%.

В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящему документе пестивирус может находиться в лиофилизованной форме. В одном из вариантов осуществления композиция имеет по меньшей мере приблизительно 10⁴ вирусных частиц, например по меньшей мере приблизительно 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 108, 10⁹ или по меньшей мере приблизительно 10¹⁰ вирусных частиц.

В некоторых вариантах осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент, например адъювант, например, адъювант на основе эмульсии типа масло-в-воде.

В некоторых вариантах осуществления композиция может включать смесь инактивированных и аттенуированных пестивирусов, описанных в настоящем изобретении. В настоящем описании также раскрыты композиции, которые включают смесь инактивированных пестивирусов, аттенуированных пестивирусов и векторов, описанных в настоящем документе.

В еще одном аспекте в настоящем описании представлены композиции, которые включают вектор, например вектор экспрессии бакуловируса или вектор аденовируса собаки, который содержит по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 95% (например, по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98 или 99%) идентична SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21, например, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 100% идентична SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21. В другом аспекте в настоящем описании раскрыты композиции, которые включают вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность, кодирующую аминокислотную последовательно, которая по меньшей мере приблизительно на 95% (например, по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98 или 99%) идентична SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22, например, по меньшей мере одну последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22. В некоторых вариантах осуществления композиции могут включать смесь векторов, описанных выше.

Также описаны способы защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, например, от врожденного тремора. Способы могут включать введение беременной свиноматке или молодой свинье, либо свиноматке или молодой свинье перед случкой, либо новорожденному поросенку любой из описанных в настоящем документе композиций в количестве, достаточном для защиты поросят.

В некоторых вариантах осуществления способы включают введение композиции свиноматке или молодой свинье внутримышечно, подкожно, внутривенно, перорально, внутриартериально, интраназально (например, ингаляцией или без нее), внутрисердечно, интраспинально, интраторакально, внутрибрюшинно, внутрижелудочно, сублингвально, чрезкожно и/или путем ингаляции. В одном их вариантов осуществления введение представляет собой первое введение, а способы предусматривают второе введение через одну-три недели после первого введения.

В некоторых аспектах настоящее изобретение касается описанных в настоящем документе композиций, например композиций, которые включают инактивированный пестивирус, аттенуированный пестивирус и/или векторы, для применения в качестве лекарственного средства или для применения при получении лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления композиции, описанные в настоящем документе, предназначены для защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, например от врожденного тремора.

Настоящее изобретение относится к инактивированным или модифицированным живым пестивирусным вакцинам по настоящему изобретению, которые филогенетически ближе всего к пестивирусу китайских летучих мышей. На фиг. 1 и 2 представлено филогенетическое дерево пестивируса по настоящему изобретению. Филогенетическое дерево по алгоритму ближайших соседей основано на 212 аминокислотах NS3, которые перекрываются между частичными и полными геномными последовательностями у пестивирусов. Уровень генетической изменчивости соответствует новому виду пестивируса. Пестивирусы на уровне нуклеотидов консервативны в пределах 83-98% у идентифицированных изолятов, как показано на фиг. 3.

Пестивирусы по настоящему изобретению могут использоваться для получения таких вакцин. В частности, изобретение относится к улучшенным изолятам пествируса, которые определены ниже, или к любому потомку или потомству одного из вышеуказанных изолятов.

Пестивирусы по настоящему изобретению могут быть описаны следующим образом: вирус может

- 2 036116 быть аттенуирован путем пассирования по меньшей мере четыре раза в клеточной культуре так, что когда модифицированный вирус вводят свинье или другому млекопитающему, подверженному СТ, он не вызывает клинических симптомов СТ, а способен индуцировать иммунный ответ, который иммунизиру ет млекопитающее против патогенных форм пестивируса.

Изоляты пестивируса по настоящему изобретению можно пассировать более 10, предпочтительно по меньшей мере 20, еще более предпочтительно по меньшей мере 30, еще более предпочтительно по меньшей мере 40, еще более предпочтительно по меньшей мере 50, еще более предпочтительно по меньшей мере 55, еще более предпочтительно по меньшей мере, 60, еще более предпочтительно по меньшей мере 70, еще более предпочтительно по меньшей мере 80, еще более предпочтительно по меньшей мере 90, еще более предпочтительно по меньшей мере 95 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100 раз в культуре клеток in vitro.

Предполагается, что вакцина может содержать носитель, который подходит для внутрикожного или внутримышечного применения. В некоторых вариантах осуществления вакцина находится в лиофилизованной форме. В конкретных вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере приблизительно 10⁴ вирусных частиц. Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, вакцинам и связанным с ними способам, которые устраняют пробелы в данной области. Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, которые включают инактивированный или модифицированный живой аттенуированный пестивирус. Дополнительные иммуногенные композиции включают вакцину, состоящую из субгеномного антигена, либо экспрессированного рекомбинантно, либо доставленного как часть векторной платформы. В частности, в заявке предложена вакцина для защиты свиней и особенно поросят от болезней, связанных с изолятами пестивируса по настоящему изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к пестивирусу, содержащему нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95%, например по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21.

В другом аспекте изобретение относится к пестивирусу, содержащему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95%, например по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22.

Другой аспект изобретения относится к способу получения инактивированной или живой аттенуированной вакцины для борьбы с врожденным тремором, включающему смешивание инактивированного или живого аттенуированного пестивируса, описанного в настоящем документе, с фармацевтически при емлемым носителем.

Иммуногенные композиции и вакцины по изобретению содержат инактивированные или модифицированные живые пестивирусы и могут также включать адъювант. Вакцина может также включать другие компоненты, такие как консервант(ы), стабилизатор(ы) и антигены против других патогенов свиней.

Специалистам в данной области будет понятно, что используемые в настоящем документе композиции могут включать известные инъекционные физиологически приемлемые стерильные растворы. Для получения готового к употреблению раствора для парентеральной инъекции или инфузии доступны водные изотонические растворы, например солевые или плазменные белковые растворы. Кроме того, иммуногенные и вакцинные композиции по настоящему изобретению могут включать фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители, разбавители, изотонические средства, стабилизаторы или адъюванты.

Способы по изобретению могут также включать смешивание композиции по изобретению с ветеринарно приемлемым носителем, адъювантом или их комбинацией. Специалистам в данной области будет понятно, что выбор носителя, адъюванта или комбинации будет определяться, кроме прочего, путем введения, личными предпочтениями и видом животных.

В другом аспекте изобретения относится к вакцине для защиты свиней против инфекции пестивирусом, включающей инактивированный или живой аттенуированный пестивирус по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Такая вакцина может предпочтительно дополнительно содержать один или несколько непестивирусов или пестивирусов, которые отличаются от пестивируса по настоящему изобретению, аттенуированных или инактивированных патогенов или их антигенного материала. Например, непестивирусные патогены могут быть выбраны из вируса псевдобешенства, вируса свиного гриппа, парвовируса свиней, вируса трансмиссивного гастроэнтерита, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, цирковируса свиней, включая, но этим не ограничиваясь, цирковирус свиньей типа 2 (PCV2), вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS) и Actinobacillus pleuropneumoniae.

Также описаны способы лечения или профилактики инфекций, вызванных пестивирусом. Способ включает введение эффективного количества иммуногенной композиции по настоящему изобретению животному, в частности беременной свиноматке или молодой свинье, при этом указанное лечение или профилактика, таким образом, обеспечивается поросятам. Лечение или профилактика выбраны из группы, состоящей из уменьшения симптомов инфекции СТ, уменьшения тяжести или частоты клинических симптомов инфекции СТ, уменьшения смертности животных от инфекции СТ и их комбинаций.

При этом подходящими особями и особями, нуждающимися во введении композиции по изобрете- 3 036116 нию, могут быть животные, нуждающиеся в профилактике или лечении вирусной, микробной, паразитарной, бактериальной или грибковой инфекции, заболевания или состояния или инфекции, заболевания или состояния, вызванных простейшими. Животные, у которых иммунный ответ индуцирован за счет применения композиций или способов по изобретению, включают домашний скот, такой как свиньи, быки, козы и овцы. Предпочтительные животные включают свиней, быков, представителей семейства мышиных, лошадиных и зайцеобразных. Наиболее предпочтительно иммунный ответ индуцирован у свиней и особенно у свиноматок, молодых свиней и поросят.

Изобретение относится к способу снижения частоты или тяжести одного или нескольких клинических симптомов, связанных или вызванных пестивирусной инфекцией, включающему стадию введения иммуногенной композиции по изобретению, как указано в настоящем документе, так что частота или тяжесть клинического симптома пестивирусной инфекции снижается по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100% по сравнению с особями, которые не получали иммуногенную композицию, как указано в настоящем изобретении. Такие клинические симптомы включают трясение и дрожание всего тела в различной степени. Поросята, как правило, рождаются дрожащими, трясущимися и качающимися, и активная стимуляция часто усиливает дрожание. Дрожание имеет тенденцию прекращаться, когда поросята засыпают. Кроме того, могут наблюдаться мышечный тремор при хождении поросят, нервные симптомы, отсутствие координации, поза сидячей собаки и повышенная смертность. В некоторых случаях трясение может отсутствовать 24-48 ч. Такое воздействие на поросенка включает влияние на сосание, когда в тяжелых случаях требуется физическое удерживание поросенка на соске. В зависимости от тяжести вспышки заболевания уровень смертности может составлять 15-20% и вплоть до 30-40% при более тяжелых вспышках. Другие критерии клинической тяжести включают снижение среднего дневного прироста веса и неврологическое повреждение.

Предпочтительные пути введения включают интраназальный, пероральный, внутрикожный и внутримышечный. Предпочтительным является внутримышечное или интравагинальное введение наиболее предпочтительно единичной дозой. Специалисту в данной области будет понятно, что композиции по изобретению также можно вводить многократными (например, двукратными или более) дозами, а также другими или несколькими путями введения. Например, такие другие пути включают подкожное, внутрикожное, внутривенное, внутрисосудистое, внутриартериальное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутритрахеальное, внутрикожное, внутрисердечное, внутрь легочной доли, внутримедуллярное или внутрилегочное введение. В зависимости от желаемой продолжительности и эффективности лечения композиции по изобретению можно вводить один или несколько раз, а также периодически, например ежедневно в течение нескольких дней, недель или месяцев, и в разных дозах.

Также изобретение относится к способу получения живых аттенуированных пестивирусов в клетках, исключая клетки млекопитающих.

Новые вакцины по настоящему изобретению не ограничены каким-либо конкретным типом или способом получения. Эти вакцины получают стандартными способами, известными в данной области. Наиболее предпочтительной доставкой пестивирусной вакцины является прививка молодых свиней или беременных свиноматок против вирулентного пестивируса с передачей материнского иммунитета поросятам.

Другие объекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания. Следует, однако, понимать, что подробное описание и конкретные примеры с указанием предпочтительных вариантов осуществления изобретения приведены только для иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в рамках сущности и объема изобретения будут очевидны для специалистов в данной области из подробного описания.

Описание чертежей

Приведенные ниже фигуры являются частью настоящего описания и включены для дополнительной иллюстрации некоторых аспектов данного изобретения. Изобретение может быть лучше понято посредством ссылки на одну или несколько этих фигур в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем документе.

На фиг. 1 и 2 проиллюстрированы филогенетические деревья, идентифицирующие новые пестивирусы по изобретению;

на фиг. 3 представлено сравнение аминокислотной идентичности (процент идентичности) последовательностей пестивирусов по изобретению;

на фиг. 4 показан цикл виремии у поросят, исследованный в примере 1;

на фиг. 5А и 5В показана филогенетическая связь пестивирусов. Филогенетическое дерево по алгоритму ближайших соседей получено по 1000 выборке, сформированной по методу бутстрепа (MEGA 6.0) для аминокислот пестивируса NS3 (5А) и Npro (5В), выровненных с помощью множественного выравнивания ClustalW. Номера доступа в GenBank для каждого образца указаны в названии. Круги указывают последовательности, описанные в этом исследовании, а треугольник указывает последовательность вируса, описанного в этом исследовании, используемого для инокуляции;

- 4 036116 на фиг. 6 показана гистограмма, демонстрирующая процент положительных и средних значений

ОТ-кПЦР Cq по типу образца. РНК пестивируса, обнаруженная с помощью ОТ-кПЦР, нацеленной на ген

NS3. Вирусная РНК не была обнаружена у PBS-инокулированных поросят;

на фиг. 7 представлен график, который показывает, что инактивированный пестивирус индуцирует специфический серологический ответ на пестивирус у привитых поросят.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к инактивированному пестивирусу, аттенуированному пестивирусу и субъединичным вакцинам или иммуногенным композициям, которые можно вводить свиноматкам или молодым свиньям для уменьшения клинических проявлений врожденного тремора у их поросят. Кроме того, описаны способы введения, способы получения вакцины, анализы и другие аспекты настоящего изобретения.

Предпочтительно пестивирус по изобретению представляет собой инактивированный пестивирус, и/или модифицированный живой пестивирус, и/или аттенуированный пестивирус с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична SEQ ID NO: 1, например по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 1 или имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2, например по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 2.

CATAATGCTTTAATTGGCCGCATTATGTGTGGGACATCCTAAATATTTATGAGCCCTGC GGTGAGTGGGGGAAAGAGGTTAACCAGGCCTCTAGTACCACAGGCACCAATGGACAGGGCAACT CAAACCTGAGAGAGAGGTACCGAACTCTTAAGCCCCGAGTACGGGGCAGACGTCACCGAGTAGT ACACCCAAAGACCACCACTTCTAGGTGTAGGGTCTACTGAGGCTCGGGTGGACGTGGGCGCGCC CAAAGAGAAATCGGTGGTGGACCTGGGGGTCGGGGCCACCATGCCCCTTTACGGGGTAGACCTT ACTGCTTGATAGAGTGCCGGCGGATGCCTCAGGTAAGAGTATAAAATCCGTTGTTCATTAACAT GGAAAAACAGAT T GCATAT ТАС T TAAAAAAAGAAAAACAAAGAAAT GGGT GGACGGAAC T GGT G GTAGGAGAAAGTCATACAAAAATAACCACGCTTTCTGGAAAGACCTATCGAGGCACCTGGGAAA TGGAGAAACGGCCAAATCCTTATGGAACCTATCTCCCCAGACCTAGTCCCCAACAGCTTACAGC CCTACACCCCCACCCAGTGGTGAATTGTAAGGTGGTTGAGTACAAGGAGATGGACCCTAATTAT GGTGATTGCCCAAATACGAACGGGGTGTTTGTTGACGAAAAGGGTAGAAGGCTGAGCAGCCCTC CATTAGGCATTTGGAAGATAAGATTGGACTATAGTGACTTGGTAAACATAAGCAGACCAACCCC CGCTAGTGGGAAAAACTCTTACCAAGTTGAGACCTGCAGTGGGGAGCTGGCTACAGTGACACTG GTACACAATAGGGTGCTCGTGGAAGATTGCAGGGGGCTATACCAATGGAAACCCAACTGTGAAG GAAT T GT GC T C TAT GT GAAAAC T T GT T С T GAG T GGGCAGAT CAGGTAGAAAAACAGGAGAAAGA AAGCCCCCCAAAACCACAGCGGCCACCAAGGCGAGACCCACGAAAAGGGTTACAACCACAAGTC CCCAAAGAGACTGAGGTCACAGAAAAGAAGAGACAACCTAGTGTCACCTTAGTATCGGGGGGGC AGAAGGCCCAAGTCATCTACAAAGGCAGGACCAAAAACAAAAAGACCCCGGATGGAGTCTATAG ATACCCAGGAGCTAAAGAAGGGGACGTAGTAAAGGTCAGGAAGATGCTGAAGAATTGGCATATA GCCTTAGTGATGTACCTGATACATATCATAACTCCAGGCCTTGCCAAGGTCCAGTGGTTCTTAA AAGATGAAAACTCGACGGGGATCAACCAGATACTGTGGCAAAGACAGATCAACAGATCCTTACA TGGAGAATGGCCTAACCAGATCTGCCACGGTATGCCCAATGAAACTATCACGGATGAGGAATTA CGCAGTCTGGGAATGGTAGATACAAGCCCTAGAACAAACTACACCTGTTGCCAGTTGCAATATC ATGAGTGGAAGAAACATGGTTGGTGCAACTATCCACAAAAACAGGCGTGGATCACGAGGATAAC GGCCCTACAAGCTAACCTTACCGGGCCTTATGAGGGACCTGAGTGCGCCGTCATCTGCCGATTT AACGGCAGCTACAACATCGTAAAACAGGCCAGAGATGAGGTGAGTCCACTGACAGGGTGCAAGG AAGGGCATCCTTTTCTATTCTCTGGTGAAAGATCCGACACCTCATGCCTAAGGCCCCCTTCCAC

- 5 036116

TAGTTGGGTAAGACCAGTGAAAATGGACGAGGCATCAATGGCCGATGGCTTTGCCCATGGGGTT GATAAGGCGATAATACTAATCAGGAAGGGGGCATCAGGAATAATCAATTTGCTAGACACTATTG GGAGGTGGCTACCGGTAGCTGAAGCAACTATAGTACCATATTGTGATACTTACACTGTGACAGG GATGTATGTСCATGTAAAGAATTGССTСССTAGAGGGTTACCTAAGCATTCAAAAATAATСTСC CCGACAATGATATATCTGGGAGAAGGAGACCCGGCCCATAATATCCAGCACTTATTTGGCTCAG GTATAGCAAAGTGGGTCCTAGTTCTACTCGGGATTCTGGGTGAGTGGTATGGAGAATTGGCTTC CACAATATACTTACTACTAGAATACGGGTCTGAGTGGTTGGAACATGAAAGCCTGGTCACGGAA GGGTTGATTCCTGGCATTAATATTACAATAGAACTCCCAGCTAGTCATACAGTGCCTGGTTGGG TGTGGGTCGCAGGCCAGTGGGTATGCGTGAAGCCAGACTGGTGGCCTACACAGATTTGGATTGA AACCGTGGTGGCAGAGACCTGGCATATACTAAAAATATTGGCGTCAGCCCTGGTGAACATAGTT GCAGCGTTCGTAAACCTGGAATTGGTTTATCTGGTCATAATACTAGTCAAAATATCAAAAGGGA ACCTGATAGGTGCCATATTATGGTGCTTGTTACTGTCAGGCGCTGAAGGCTCGTGCTACAAAAG ACAAGAC TAT TACAACACССAAC TAGT CGT CGAAGAAAAAACAGGCGTAGAAAAACGAT C TATA ATGGGCAAGTGGACCGTGATAACCAGGGAAGGTCGGGAGCCAAGATTAATGGAGCAAATAAATA TGGTATTGAATGATAGCCTGTCAGAAACCTACTGCTATAATAGGCTAAACACCAGCACTTGGGG GCGGCAACCGGCAAGACAAAGAGGGTGTGGTCAAACCGTGCCCTATTGGCCTGGTGACAATGTT CTAGAAGAACAATACTACAGCACAGGTTACTGGGTGAATGTAACAGGCGGTTGCCAGCTGAGAG AAGGCGTATGGCTATCAAGAAAGGGTAACGTACAGTGTCAGCGTAACGGCTCATCCTTGATGCT GCAATTGGCGATAAAAGAAGAGAATGACACTATGGAAATACCATGTGACCCAGTGGAAACTGAA AGTATGGGTCCAGTTGCACAGGGCACTTGTGTGTACAGCTGGGCATTCGCCCCAAGAGGGTGGT ACTATAACAGGAAGGATGGTTATTGGCTCCAGTACATAAAGAAAAACGACTACCAGTATTGGAC AAAAATGCCTACTGCCTCGTCCGCCGCAACCATGTACCGCCACTTGCTCCCCTTACTGGTGGCC TGCCTCATGGGCGGTAGGATATCGGTGTGGTTTGTGGCAATGCTCCTGTCTCTACAGGTGGAAG CTAGTGAAGTAGGCACTAAACAACTGGCTGTCACGCTAACCCTGTGGAAAATGGACTGGACAGA ACTACTTTTСTATATTGTСTTGATGСTAGСCGTTAAGGAAGAACTTATAAAAAAAATTGTGACC GCTAGCCTTGTGGCCTTAAAAAATAGTCCAGTAGCCTTGAGTTTTCTTATTGTACTCAGACTTG TGGGGGGCAGTGAAGCACTCCCAGTAGGTTTATTATTAGAAAAAATGTGCATAGACCAACCGGA GTTTGGAACTCCTTTCCTGATCTACCTATGGGACAACTGGAAGTGGACTGTGTTAGTCAGCTTC TCCGCACTGAACCATGAAAAAACTATAAAACTGGCAAGAAAACTGTTGTTGGCAACACATATAA CAGCGC T CACAT T GAC T GGC T T GAGT GAT T CAAT С T T C TATAT GAT GC T TATAACAACAAAT T T GTTAATAAAGACATTCATATACTTGCTGGGGGCTAGTATGAATTGGGTCGAGAGAGAAAAAAAG AAATTGCTAGTGAAGAGGAGACTAATATACAAGAAAGCCGTTACTTGCAGTCAGGATGAGAATG TATTGGAGAATAAATTCAACAAGATAACTGTAAACGCGGATTTCACCCCATGCAAGCTTGAACT TCTACAATTACTTAGGGCTTTTTTAGTCTCTTTGTGTTTTTCCTACTACAAACCTCTCCTGTAT GCAGAGACTACCTTAACTGTAATAGTAATTGGCGTACAAGAGTACAACGTAGCCATGGCCCGCG GGCGAAGTGTGGTCCACAGGCTACTAGCCATGGCCTATTACATATACGGCCGCATACAGGGTGA

- 6 036116

CATGTTCCAGCTCGCCACTATCCAGTGCCTGCTGTCGAGTCCGAGGAAAATTATGAAACACATG GTAGAGAATCCAACTCTCAAGAAGCTCTGGCAAGGCGAAACAGAACTCTTCAACCAGGGTGTTA GTCAATCCAAGATAGTGAATCCAAAGAAAATTGGGCTGGAAGAATTACACAAGGGCATGTGTGG С С T С С СAACAGTAGT GСAAAAT TTGGTCATATATGCAAAGAAGAAT GAG TCTCTTATTTTAGGA GAGCTGGGTTACCCCCCTGGGGATCTCACCAGTGATGGGTGGGAAATTTTAGGTCCTGGCAGAA TСCCAAAGATСACTAACGTCGAGTСTGCTAAGATGGAGTTACTСTСCAAACTTATGAGСTTTСT GGGGATTGAAAGCTCGAGGGTCCCCAGGACCCCAGTCCACTCAACAAGGAAATTATTGAAGATA GTAAGGGGCTTGGAAACAGGATGGGGGTACACTCACGCAGGGGGGATAAGTAGCGCAAAACACG TTACAGGTGAAAAGAACTTAATGACCCACATGGAGGGTAGGAAGGGAAAATATATCCTACAATC TCAAGAACATGGTGCTGACGAGGTAGAGTACGGAGTAAAAACTGATCAAAAAGCTCCCGACAAT GCCTTATGCTACTGTTTTAACCCTGAAGCTACAAACATAAAAGGAGAGACGGGAGCCATGGTGT TCATGAAGAAGATAGGAAAAAAGTGGACTCTCGTAACATCAGACGGCAATAAAGCCTATTATAA TGTAAACAATTTGAAAGGGTGGTCTGGACTACCAATAATGCTGCACTCCACCGGGGCCATAGTG GGGAGGATTAAATCAGCGTATTCAGATGAAAACGACCTGGTGGAGGAACTTATTGACTCTAGAA CTATTAGTAAGAGCAATGAGACAAACCTGGACCACCTTATCAAGGAATTGGCAGACATGCGGAG GGGGGAGTTCCGCTCAATTACCCTTGGAACGGGAGCCGGGAAAACCACAGAACTGCCTAGGCAA TACCTCACAACAGTAGGTGCCCATAAATCCGTGCTGGTCTTAGTCCCCTTAAAAGCACCTGCTG AAAGTGTTTGCCGCTTTATGAGGTCTAAATACCCTACCATCAACTTTTCCTTAAGAGTGGGGGA ACGGAAAGAGGGAGATGTGAGCAGCGGCATCACCTACGCTACTTACGGATTTTGCTGCCAGCTA AAC С TAG T С CAAC T TAAAGAAT G GATAT С CAG G TAC T СAAT GGTTTTTTTTGAT GAATATCACA CAGCAAC T CCAGAACAAATAGCCATAATAAGCAAGATT CAT GCAC T GAAAGT TAAGACCAGGAT AGTGGCTATGTCAGCAACCCCCCCGGGTACCGTGACGACTGAAGGCAGGAAGTTTGACATTGAA GAGGTAGGGGTTGCTACCATAGAGAAAGGAGAGGAACCAAAAAGGGGGCGCATAGCGGTCGCTG GTATGCAGGTCCCATTAGAAGACTTAACAGGAAAGAACTGCCTGGTGTTCGTGGCAACCAAAGA AGCCGCGGAGACGGAGGCTAAAGAACTGCGCACCAGAGGAATTAACGCCACCTAGTAGTATTCA GGTATAGACCCTAAGACTCTGGAACATGGGATGACCAATCAGCCATACTGTATTGTAGCTACCA ATGCCATTGAATCAGGTATAACCTGTCCTGACTTGGATGTGGTCATAGACACCATGCAGAAGTA CGAAAAAGTAGTGAATTTСTCGGCAAAGATGСССTTGATTGTСACTTCATTAGTAAAGAAAAAA ATCACCAGGGAAGAACAGGGCCAGAGGAAAGGTCGAGTGGGCAGGCAAAAGAAAGGAAAATACT ACTACCCCTCGGGGGTGGTACCGAATGGGTCAAAAGACCTAAGCTATTTAATCCTACAGGCCCA AGAATATGGT GT С T T GGAACAAGT CAATATAACAGAGТАС T T CAT CATAAT GAAT GAGGAC T GG GGTCTCTAT GAC G TAGAT GAAG TAGAAGT GAGAATACT T GAGAGAAT GAACAAGGAAAT С T T GC TACCACTAGGTATTGTGGAGAAGCAAATCTTGGAAAGAAGTACTCACCCGGAAAAAGTGGCACT G T T G TATAACAAATTAGT GCAGAAAAATCCTATAGTATACCC TAGAGTAGAGGAAGGT GAGGT C AGCAAGGAATACAATACCTATAATCTGGCCGTATATGACAAGCTAAAAGATGTCAACCCACAAG CCATTTATGTTCTAGCAGAAGAGGAGAGAGCCACAGAAATGATGGGTCTCGAGTTTGAACAAGA

- 7 036116

С C CAT C T GAC Т ТАСAG GATTCGGTAGTT СAG С Т Т Т G Т GAAGATАТСAAGAGGТАТАСААААСТ С TCTGGGATCACTGAGAAACTGCTAGTAGGTACGATGGTGGGGTATATTGGATACAAAGCCTTAA CCAGAAACCACGTGCCCTGGGTCAGCAAAGAGTATTGTTATGAGCTGACCGATTCACCGGATAC ТТACGAAAACТСАТТСGСАССТТТGGACGТСGACGТССААААСТССGGТGAAGGAAAACАСССА GAGCAACТGGCAGACCATСААТТGAGGCAACТАСТGGAGACТGGGAGAGACAAGGCAATТGATТ TCCTAAAAGGAATCCGCGAGTTCACTAGTGGGGCCATAAACAGTCCAAAGGCACTAAGTATATG GGAGAAAATATATCAGTATTTGAAGAAGCATCAGGGCGAGATCATCTCATCAGCAGCGTGGGGC AGTGCGACGGCCCTTCACGACAGTATTAAATCTAGACTAGGAGATGAGGTCGCTACTGCAGTAA TAATCCTCAAGTATTTAGCATTTGGTGAAAGAGAACTGTCTGGGCTAACTAGGCAAGTTCTAAT Т GACAT CATAGTATATTATATAGT ТAACAAGCCCCGGTTC GAAGGAGAC GAC ТAC GСAAAGAGA AAAGGAAGAAGGCTAGTCATCGAAGTCCTGATGGGGGCACTGGCGACTTATGCGGTGTCCAATT TTTGGGGTGTGTCCATTAATAAGATACTGCAACCAATTTCTGATTATCTACCCTATGCCACCGC CACTTTGGCTTTTCTTCGCCCAACCTTCATGGAATCAGCAGTGGTGGTCGCTTCCTCTATCTAT AGAGCTTTTCTCTCCATTAAGCATGCGGAAAACAGGAGTCTTGTCACGCAGGTCGCTTCTGCCG CCCTCGAAGTCATGGGCCTGACCCCAGTATCGGCTGGCCTAGGCGTCTTGCTGGGGCTTGGGTT GTGTGTGCTCCATAT GAACАТТ GACAAGAATGAGGAGAAAAGGACАС Т ТАТАС Т GAAAAT GТ Т Т GTCAAAAACTTTATAGACCAGGCGGCACTAGACGAGTTGGATAAACTGGAGCCAGAAAAAATAA TCCTCTCATTGTTGGAGGGTATCCAAACCTGCACAAACCCGATTAGAGCAATCATGATTTTGTA CAGGGTGTACTACAAGGGAGAAACTTTCACAGAAGCTTTGTCTAAGATGGCCGGCAAGTCTCTC ATTGTGATGGTCATAGTCGAGTTCCTGGAATTGACAGGCCAAACCCAAGGAGGGTATATAGATC TTAGTGCTAATTTGCTGACCTTTCTCCTCGAGAAACTAAAAAAAATGACTAACCTCGCCATCGG GGAAGCTAGAAAGGTCTTGCTCCCCATCCCATACTTGTACTGTGAAACCTGGCAGTCTGACGCC AGAATCAAGGCCCCTGAATCCTACGACCAAGTGGTAGTGGAATGCAAATGTGGCGCTTCAGCGA GGTATTCCTTCCGCGATGGAGTTCATGAGATATTGGAAGAAAAAAGGACTAATTGGTGCAAGAA CTTCTTCTTATGGGGACCCAACTTCCACAATCCGGATCCAAAAAGGATGACATTCTATGAATAC GGCCAAGCAAAAAAGTGTCCTGTTATCATAATTGGTGAAGACATAACCTTCGGCAAATATGGCA TATATATCAAATTTGGCCATAGGCCTGATGGAGGGAGGTTAATAAGGGGTACCACCCACGCTAC TATCAGTAGGGAGGAATTGCTGGAAATCCTAACAGCCCCAAGCCAAGTGGCCATAGGCAAGGTC AAGCTAACCGATTACTGTAATCAAAAAGGAATAATAGACAGGAAATTGGCCGTACTTGAAGGTG АСААААТАСАТТ Т Т Т GGAAAGСАСАССGТ GGAT ССААААТ СACAGACСAAC Т САС ТАТТ GAGAA TCTGACAGATGATTTGGGGTCAGAAATCAGGGACATCACATGGGAGCTGTACACAGGTGGAACG TGCACCGTAAAAGGGGTGTCCCTTAGATCATGCGCACCAGGTCATAGAACTAAGGCTATGGTCT TGTGTGATTGCACTGATGTGCTTAGCCCCTGTTACCTAATAAACGGCAGGAGACCATCCCCATT TGACGTCGCGGAAGGTTATGAATGTCACCACCGGAAGCCCCGAGCGACGTATGAAGACCTAGAA ATGGAGGAAATACTAAAGAGACGAGTCCCTGTCTACGATCCTCTGTGTTTGTTTGACACTGATA G ТАААС TGCTACCTCCC GACАС С ТАС ТАС Т Т G GAAGAAGAT СAAGAG GAC ТТТ GAG ТAC G САТ Т

- 8 036116

GAGATGCTGGGGCCTCGGGGTTTATGTAGCAGACGGGCCTGTCACTTCCCCCCCGGACATAAGA ATACACCATAGTTCGGTATTACTACTGCTGACACCTGGAGTAAACTCAGAGTTGCCCTTACAGT ACATACGTTGTTACCCTCATCAGGCAGAGGTGGACATCTACATTAGGAGTCAGCTTTTGGAGGA GGAAGACACTGCTACGGAGGTGGAAGGCTCCCAGGAAGATGGTGATGAAGGGATGGGCGATGCG G TAATAGAG GAT GAG GATACAT C G T С СACAACAGAAT СAATAC С С С СAC TAGAAGAG GAG GAAG GGGGCGAAGAGCCAATCACCTATGTGGTCATAAGGGGATTACAAGAAGAAAGATACGCCAGCCA T С T T AAAC T AAAT GAC T G GAT C AG T GAAAAC AT T T C AGAG С C AC AC AGAG T С С AAAT T AT G С T A GATGGGACAGTGAGAGTCACAATAAAAGAGGGCAAAGTGAAACATTTGTTTGGGGTCTATAGAA TAGAAAACTCCCTGGAAGCAATGTTTAAAGAGACCATAGCTGACCTCCCCGTAGCTACCCAACC GCCCCAGGGGCCAGTCTATACGGCTAAAGAGCTGGCCCAAGGGAACATCGCCCCGGTCCAACCT GCAGCGAATTATTACGGAATGATAGAGGGGAGAGGCGACCCAATGACGGCATTCGAAGCCTTAT CAGTCTTGCGGTCACAAAAAGTCTTAGCCAAGGACGTGAAGGTGAACACCCGCAGGGCGCAGGT TTTTTTAAATAAAGTCAGGAGAATTGCTGAGGTCAGAGCGTCGGAACTGACATTAAAATGCTTA CCGATACTTGGCAAAGTAAATGGGAGGAAATTGATTAGAGAGGAAACCAACATCCCCAACCAAA GGTTGGCATCAATAATGACCTCAATAGGAATTAGACTAGAAAAACTGCCAGTGGTTAGAGCAAA CAC TTCCGGCTC TAAG T T CAGACAG T CAAT С T TAGAAAAAAT G GATAAG TAT GAAAAT GAACAA GTCCCAGGGTTACATGAAAAGATGTGGGCAGCGTTCCTGGCAACTGCCAGGCAAGATTTAAGAA ATACCTATGAGGAAGTAACTTATCTTGAATTAGAGGCCGGAATCAATCGGAAAGGAGCCCCAGG T T T С T T T GAAAAAGAAAGC T CAATAGGAGAAGT GC T GGAAAAAAAAGAAAAAAT T GACGT CACA AT C CAAGAGAT T GAAAAAGGCAAC САС T TATAC TAT GAAACAGC CAT GC CAAAAAATGAGAAAA GAGAT G T G С T T GAT GATTGGTTGT CAGAG GAT T T C G T СAC T TATAAGAAAC CAC G T G T GATACA GTACCCTGAGGCAGTCACCCGGTTGGCCATCACCAAAATAATGTATAAGTGGGTGAAGCAAAAG ССTATAGTGATTССCGGTTATGAGGGAAAAACССCGATСTTTGAAATATTTGAAAAAGTCAGTG CAGATTGGGCTCAGTTCAAAAATCCGGTAGCCGTCAGCTTCGACACCAGAGCCTGGGACACTCA AGTAACAAGAGAAGACCTCAGGCTGGTAGGGCGGATACAGAAATACTATTACAAAAAAAAATAT TGGAAGTTCATTGACAATTTGACAGCCATGATGGAGGAAGTGCCTGTAATCACTGTAGAAGGAG ATATGTTCCTCAGAGTTGGACAGCGCGGATCCGGACAGCCTGATACCTCAGCAGGCAATTCCAT GCTAAATGTGCTGACTATGTTGGTAGCTTTCTCTGAATCCACAAATCTGCCCATAGCGGCTGCC TGGAAGGCCTGTCGGATCCACGTCTGTGGTGACGACGGTTTCTTAATCACAGAATCGGAATTAG GGAGGAAGTTTGCTGAAAAAGGTGTTCCTCTGTTAGCTGCATTTGGCAAACCCCAAAAAATTAC AGAGGGAGCGAGCCTAAAGGTAACCAGCAACTTTGACGGAATAGAGTTTTGTAGTCATACCCCT ATCAGAGTCCAAACACCAAACATCAGGTGGATGCCAGCGAGACCAACAGCAACAATCCTAGGCA AAATGAGTACCAGGCTGGGTGAGGGTGCCACCAGGTCGGGAGAAGAATACGAAAAACAGGTGGC ATTCGCATATCTACTGATGTACCCCTGGAACCCGCTGGTCAGGAGAATCAGCCTCCTATTGTTA TCGACTACTGACCCAATGGGGAAAGAGGAAACCCCATGCTCCGATGAGGGGGTGAAGTATGTTG GGGACCCTATCGCTGCATACAGGGATGTATGGGGGCACAAATTAGAGGATGTAGGCCATGTTGA

- 9 036116

TCAACCGCAGTTATCCCGGATGAACTATAGCATGACTTACTTAGGGATTTGGAAACCAAAGACA AGTCAGCGGCTAGTCGAACAGTGTTGTCGTCTGGCCGAGAAAAGCAATTGTGTGGTACGTGCTG ACTCCCTGATAAAGAAAAAGGTCAAGATCACTTATGACCCGGGGATAGGAGTGGCTCAGGTCAT TCGTAGGTGGGAAGAGCTTGAGTGGACCAGAAGGAAACCTGAACTCACCAATGTAATTGTAGAA GATGATATCTTCCTAGTCCTGTG GAAGAGAT T T T CAAAG TAGAT T T T T CAGAAAATGAAGT T CA TGCAGAGAATGTTCGCCCCTTATTAAGTGGGGGGCACTCATTTAAATTATAACCAGTATCTGGT AAGTATAAGATTTGTGTAAATAAAGTATATAACTGAAAGGGGCAAGTGGCCGTATAGGCTGGGG TGATCGCCGCACCCCCCCCTTCACTAGGCGCCTCAACCCCATGTACCATGGGGTTGTTGTAAAT ACTTGAATGAATGGAGTAATACGGGTAACAAACTTATAGGCCAGTATTGCCCCATTTGCTTTAT AGTGGTGACGACCTGTATAGGTCCGATCTGATATC (SEQ ID NO :1)

MEKQIAYYLKKEKQRNGWTELWGESHTKITTLSGKTYRGTWEMEKRPNPYGTYLPRPS PQQLTALHPHPWNCKWEYKEMDPNYGDCPNTNGVFVDEKGRRLSSPPLGIWKIRLDYSDLVN ISRPTPASGKNSYQVETCSGELATVTLVHNRVLVEDCRGLYQWKPNCEGIVLYVKTCSDWADQV EKQEKESPPKPQRPPRRDPRKGLQPQVPKETEVTEKKRQPSVTLVSGGQKAQVIYKGRTKNKKT PDGVYRYPGAKE GDVVKVRKMLKNWHIALVMYLIΗ11T PGLAKVQW FLKDENS T GINQILWQRQ INRSLHGEWPNQICHGMPNETITDEELRSLGMVDTSPRTNYTCCQLQYHEWKKHGWCNYPQKQA WITRITALQANLTGPYEGPECAVICRFNGSYNIVKQARDEVSPLTGCKEGHPFLFSGERSDTSC LRPPSTSWVRPVKMDEASMADGFAHGVDKAIILIRKGASGIINFLDTIGRWLPVAEATIVPYCD TYTVTGMYVHVKNCLPRGLPKHSKIISPTMIYLGEGDPAHNIQHLFGSGIAKWVLVLLGILGEW YGELASTIYLLLEYGSEWLEHESLVTEGLIPGINITIELPASHTVPGWVWVAGQWVCVKPDWWP TQIWIETWAETWHILKILASALVNIVAAFVNLELVYLVIILVKISKGNLIGAILWCLLLSGAE GSCYKRQDYYNTQLVVEEKTGVEKRSIMGKWTVITREGREPRLMEQINMVLNDSLSETYCYNRL NTSTWGRQPARQRGCGQTVPYWPGDNVLEEQYYSTGYWVNVTGGCQLREGVWLSRKGNVQCQRN GSSLMLQLAIKEENDTMEIPCDPVETESMGPVAQGTCVYSWAFAPRGWYYNRKDGYWLQYIKKN DYQYWTKMPTASSAATMYRHLLPLLVACLMGGRISVWFVAMLLSLQVEASEVGTKQLAVTLTLW KMDWTELLFYIVLMLAVKEELIKKIVTASLVALKNSPVALSFLIVLRLVGGSEALPVGLLLEKM CIDQPEFGTPFLIYLWDNWKWTVLVSFSALNHEKTIKLARKLLLATHITALTLTGLSDSIFYMM LITTNLLIKTFIYLLGASMNWVEREKKKLLVKRRLIYKKAVTCSQDENVLENKFNKITVNADFT PCKLELLQLLRAFLVSLCFSYYKPLLYAETTLTVIVIGVQEYNVAMARGRSVVHRLLAMAYYIY GRIQGDMFQLATIQCLLSSPRKIMKHMVENPTLKKLWQGETELFNQGVSQSKIVNPKKIGLEEL HKGMCGLPTWQNLVIYAKKNDSLILGELGYPPGDLTSDGWEILGPGRIPKITNVESAKMDLLS KLMTFLGIESSRVPRTPVHSTRKLLKIVRGLETGWGYTHAGGISSAKHVTGEKNLMTHMEGRKG KYILQSQEHGADEVEYGVKTDQKAPDNALCYCFNPEATNIKGETGAMVFMKKIGKKWTLVTSDG NKAYYNVNNLKGWSGLPIMLHSTGAIVGRIKSAYSDENDLVEELIDSRTISKSNETNLDHLIKE LADMRRGEFRSITLGTGAGKTTELPRQYLTTVGAHKSVLVLVPLKAPAESVCRFMRSKYPTINF SLRVGERKEGDVSSGITYATYGFCCQLNLVQLKEWISRYSMVFFDEYHTATPEQIAIISKIHAL

- 10 036116

KVKTRIVAMSATPPGTVTTEGRKFDIEEVGVATIEKGEEPKRGRIAVAGMQVPLEDLTGKNCLV FVATKEAAETEAKELRTRGINATYYYSGIDPKTLEHGMTNQPYCIVATNAIESGITCPDLDWI DTMQKYEKWNFSAKMPLIVTSLVKKKITREEQGQRKGRVGRQKKGKYYYPSGWPNGSKDLSY LILQAQEYGVLEQVNITEYFIIMNEDWGLYDVDEVEVRILERMNKEILLPLGIVEKQILERSTH PEKVALLYNKLVQKNPIVYPRVQEGEVSKEYNTYNLAVYDKLKDVNPQAIYVLAEEERATEMMG LEFEQDPSDLQDSVVQLCEDIKRYTKLSGITEKLLVGTMVGYIGYKALTRNHVPWVSKEYCYEL TDSPDTYENSFAPLDVDVQNSGEGKHPEQLADHQLRQLLETGRDKAIDFLKGIREFTSGAINSP KALSIWEKIYQYLKKHQGEIISSAAWGSATALHDSIKSRLGDEVATAVIILKYLAFGERELSGL TRQVLIDIIVYYIVNKPRFEGDDYAKRKGRRLVIEVLMGALATYAVSNFWGVSINKILQPISDY LPYATATLAFLRPTFMESAVWASSIYRAFLSIKHAENRSLVTQVASAALEVMGLTPVSAGLGV LLGLGLCVLHMNIDKNEEKRTLILKMFVKNFIDQAALDELDKLEPEKIILSLLEGIQTCTNPIR AIMILYRVYYKGETFTEALSKMAGKSLIVMVIVEFLELTGQTQGGYIDLSANLLTFLLEKLKKM TNLAIGEARKVLLPIPYLYCETWQSDARIKAPESYDQVWECKCGASARYSFRDGVHEILEEKR TNWCKNFFLWGPNFHNPDPKRMTFYEYGQAKKCPVIIIGEDITFGKYGIYIKFGHRPDGGRLIR GTTHATISREELLEILTAPSQVAIGKVKLTDYCNQKGIIDRKLAVLEGDKIHFWKAHRGSKITD QLTIENLTDDLGSEIRDITWELYTGGTCTVKGVSLRSCAPGHRTKAMVLCDCTDVLSPCYLING RRPSPFDVAEGYECHHRKPRATYEDLEMEEILKRRVPVYDPLCLFDTDSKLLPPDTYYLEEDQE DFEYALRCWGLGVYVADGPVTSPPDIRIHHSSVLLLLTPGVNSELPLQYIRCYPHQAEVDIYIR SQLLEEEDTATEVEGSQEDGDEGMGDAVIEDEDTSSTTESIPPLEEEEGGEEPITYWIRGLQE ERYASHLKLNDWISENISEPHRVQIMLDGTVRVTIKEGKVKHLFGVYRIENSLEAMFKETIADL PVATQPPQGPVYTAKELAQGNIAPVQPAANYYGMIEGRGDPMTAFEALSVLRSQKVLAKDVKVN TRRAQVFLNKVRRIAEVRASELTLKCLPILGKVNGRKLIREETNIPNQRLASIMTSIGIRLEKL PVVRANTSGSKFRQSILEKMDKYENEQVPGLHEKMWAAFLATARQDLRNTYEEVTYLELEAGIN RKGAPGFFEKESSIGEVLEKKEKIDVTIQEIEKGNHLYYETAMPKNEKRDVLDDWLSEDFVTYK KPRVIQYPEAVTRLAITKIMYKWVKQKPIVIPGYEGKT ΡIFEIFEKVSADWAQFKNPVAVS FDT RAWDTQVTREDLRLVGRIQKYYYKKKYWKFIDNLTAMMEEVPVITVEGDMFLRVGQRGSGQPDT SAGNSMLNVLTMLVAFSESTNLPIAAAWKACRIHVCGDDGFLITESELGRKFAEKGVPLLAAFG KPQKITEGASLKVTSNFDGIEFCSHTPIRVQTPNIRWMPARPTATILGKMSTRLGEGATRSGEE YEKQVAFAYLLMYPWNPLVRRISLLLLSTTDPMGKEETPCSDEGVKYVGDPIAAYRDVWGHKLE DVGHVDQPQLSRMNYSMTYLGIWKPKTSQRLVEQCCRLAEKSNCVVRADSLIKKKVKITYDPGI GVAQVIRRWEELEWTRRKPELTNVIVEDDIFLVLWKRFSKYIFQKMKFMQRMFAPY (SEQ ID NO: 2)

В настоящем описании также раскрыты векторы и инфекционные молекулярные клоны, кодирующие белки пестивирусов Npro, капсида, Erns, E1, E2, NS2-3, геликазы, NS4B, NS5A или РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp).

Npro: ген, кодирующий белок N-концевой протеазы (Npro), состоящий из 180 аминокислот, находится в положениях с 378 по 917 последовательности SEQ ID NO: 1.

AT GGAAAAACAGAT T GCATAT ТАС T TAAAAAAAGAAAAACAAAGAAAT GGGT GGACGGA ACTGGTGGTAGGAGAAAGTCATACAAAAATAACCACGCTTTCTGGAAAGACCTATCGAGGCACC TGGGAAATGGAGAAACGGCCAAATCCTTATGGAACCTATCTCCCCAGACCTAGTCCCCAACAGC TTACAGCCCTACACCCCCACCCAGTGGTGAATTGTAAGGTGGTTGAGTACAAGGAGATGGACCC TAATTATGGTGATTGCCCAAATACGAACGGGGTGTTTGTTGACGAAAAGGGTAGAAGGCTGAGC AGCCCTCCATTAGGCATTTGGAAGATAAGATTGGACTATAGTGACTTGGTAAACATAAGCAGAC CAACCCCCGCTAGTGGGAAAAACTCTTACCAAGTTGAGACCTGCAGTGGGGAGCTGGCTACAGT GACACTGGTACACAATAGGGTGCTCGTGGAAGATTGCAGGGGGCTATACCAATGGAAACCCAAC TGTGAAGGAATTGTGCTCTATGTGAAAACTTGT (SEQ ID NO :3)

MEKQIAYYLKKEKQRNGWTELWGESHTKITTLSGKTYRGTWEMEKRPNPYGTYLPRPS PQQLTALHPHPWNCKWEYKEMDPNYGDCPNTNGVFVDEKGRRLSSPPLGIWKIRLDYSDLVN ISRPTPASGKNSYQVETCSGELATVTLVHNRVLVEDCRGLYQWKPNCEGIVLYVKTC (SEQ ID NO:4)

- 11 036116

Капсид: ген, кодирующий капсидный белок, состоящий из 111 аминокислот, находится в положениях с 918 по 1250 последовательности SEQ ID NO: 1.

TCTGACTGGGCAGATCAGGTAGAAAAACAGGAGAAAGAAAGCCCCCCAAAACCACAGCG GCCACCAAGGCGAGACCCACGAAAAGGGTTACAACCACAAGTCCCCAAAGAGACTGAGGTCACA GAAAAGAAGAGACAACCTAGTGTCACCTTAGTATCGGGGGGGCAGAAGGCCCAAGTCATCTACA AAGGCAGGACCAAAAACAAAAAGACCCCGGATGGAGTCTATAGATACCCAGGAGCTAAAGAAGG GGACGTAGTAAAGGTCAGGAAGATGCTGAAGAATTGGCATATAGCCTTAGTGATGTACCTGATA CATATCATAACTCCAGGC (SEQ ID NO:5)

SDWADQVEKQEKESPPKPQRPPRRDPRKGLQPQVPKETEVTEKKRQPSVTLVSGGQKAQ

VIYKGRTKNKKTPDGVYRYPGAKEGDVVKVRKMLKNWHIALVMYLIHIITPG (SEQ ID

NO: 6)

Erns: ген, кодирующий белок оболочки Erns, состоящий из 209 аминокислот, находится в положениях от 1251 до 1877 последовательности SEQ ID NO: 1.

CTTGCCAAGGTCCAGTGGTTCTTAAAAGATGAAAACTCGACGGGGATCAACCAGATACT GTGGCAAAGACAGATCAACAGATCCTTACATGGAGAATGGCCTAACCAGATCTGCCACGGTATG CCCAATGAAACTATCACGGATGAGGAATTACGCAGTCTGGGAATGGTAGATACAAGCCCTAGAA CAAACTACACCTGTTGCCAGTTGCAATATCATGAGTGGAAGAAACATGGTTGGTGCAACTATCC ACAAAAACAGGCGTGGATCACGAGGATAACGGCCCTACAAGCTAACCTTACCGGGCCTTATGAG GGACCTGAGTGCGCCGTCATCTGCCGATTTAACGGCAGCTACAACATCGTAAAACAGGCCAGAG ATGAGGTGAGTCCACTGACAGGGTGCAAGGAAGGGCATCCTTTTCTATTCTCTGGTGAAAGATC CGACACCTCATGCCTAAGGCCCCCTTCCACTAGTTGGGTAAGACCAGTGAAAATGGACGAGGCA TCAATGGCCGATGGCTTTGCCCATGGGGTTGATAAGGCGATAATACTAATCAGGAAGGGGGCAT CAGGAATAATCAATTTCCTAGACACTATTGGGAGGTGGCTACCGGTAGCTGAAGCA (SEQ ID NO: 7)

LAKVQWFLKDENSTGINQILWQRQINRSLHGEWPNQICHGMPNETITDEELRSLGMVDT SPRTNYTCCQLQYHEWKKHGWCNYPQKQAWITRITALQANLTGPYEGPECAVICRFNGSYNIVK QARDEVSPLTGCKEGHPFLFSGERSDTSCLRPPSTSWVRPVKMDEASMADGFAHGVDKAIILIR KGASGIINFLDTIGRWLPVAEA (SEQ ID NO :8)

E1: ген, кодирующий белок оболочки Е1, состоящий из 200 аминокислот, находится в положениях с 1878 по 2477 последовательности SEQ ID NO: 1.

AC ТАТ AG ТАС С AT AT Т G Т GAT АС Т ТАС AC Т G Т GAC AG GGATGTATGTCCATG T AAAGAA TTGCCTCCCTAGAGGGTTACCTAAGCATTCAAAAATAATCTCCCCGACAATGATATATCTGGGA GAAGGAGACCCGGCCCATAATATCCAGCACTTATTTGGCTCAGGTATAGCAAAGTGGGTCCTAG TTCTACTCGGGATTCTGGGTGAGTGGTATGGAGAATTGGCTTCCACAATATACTTACTACTAGA ATACGGGTCTGAGTGGTTGGAACATGAAAGCCTGGTCACGGAAGGGTTGATTCCTGGCATTAAT ATTACAATAGAACTCCCAGCTAGTCATACAGTGCCTGGTTGGGTGTGGGTCGCAGGCCAGTGGG TATGCGTGAAGCCAGACTGGTGGCCTACACAGATTTGGATTGAAACCGTGGTGGCAGAGACCTG GCATATACTAAAAATATTGGCGTCAGCCCTGGTGAACATAGTTGCAGCGTTCGTAAACCTGGAA TTGGTTTATCTGGTCATAATACTAGTCAAAATATCAAAAGGGAACCTGATAGGTGCCATATTAT GGTGCTTGTTACTGTCAGGCGCTGAAGGC (SEQ ID NO:9)

TIVPYCDTYTVTGMYVHVKNCLPRGLPKHSKIISPTMIYLGEGDPAHNIQHLFGSGIAK WVLVLLGILGEWYGELASTIYLLLEYGSEWLEHESLVTEGLIPGINITIELPASHTVPGWVWVA GQWVCVKPDWWP T QIWIE TWAETWHILKILASALVNIVAAFVNLELVYLVIILVKIS KGNLIG AILWCLLLSGAEG (SEQ ID NO:10)

Е2: ген, кодирующий белок оболочки Е2, состоящий из 372 аминокислот, находится в положениях с 2478 по 3593 последовательности SEQ ID NO: 1.

- 12 036116

T C G T G С TACAAAAGACAAGAC TAT T AC AAC AC С С AAC T AG T C G T C GAAGAAAAAAC AG G CGTAGAAAAACGATCTATAATGGGCAAGTGGACCGTGATAACCAGGGAAGGTCGGGAGCCAAGA T TAAT GGAGCAAATAAATAT GGTAT T GAAT GATAGCC T GT CAGAAACC T AC TGC TATAATAGGC TAAACACCAGCACTTGGGGGCGGCAACCGGCAAGACAAAGAGGGTGTGGTCAAACCGTGCCCTA TTGGCCTGGTGACAATGTTCTAGAAGAACAATACTACAGCACAGGTTACTGGGTGAATGTAACA GGCGGTTGCCAGCTGAGAGAAGGCGTATGGCTATCAAGAAAGGGTAACGTACAGTGTCAGCGTA ACGGCTCATCCTTGATGCTGCAATTGGCGATAAAAGAAGAGAATGACACTATGGAAATACCATG TGACCCAGTGGAAACTGAAAGTATGGGTCCAGTTGCACAGGGCACTTGTGTGTACAGCTGGGCA TTCGCCCCAAGAGGGTGGTACTATAACAGGAAGGATGGTTATTGGCTCCAGTACATAAAGAAAA ACGACTACCAGTATTGGACAAAAATGCCTACTGCCTCGTCCGCCGCAACCATGTACCGCCACTT GCTCCCCTTACTGGTGGCCTGCCTCATGGGCGGTAGGATATCGGTGTGGTTTGTGGCAATGCTC CTGTCTCTACAGGTGGAAGCTAGTGAAGTAGGCACTAAACAACTGGCTGTCACGCTAACCCTGT GGAAAATGGACTGGACAGAACТАСTTTTСTATATTGTСTTGATGCTAGCCGTTAAGGAAGAACT TATAAAAAAAATTGTGACCGCTAGCCTTGTGGCCTTAAAAAATAGTCCAGTAGCCTTGAGTTTT CTTATTGTACTCAGACTTGTGGGGGGCAGTGAAGCACTCCCAGTAGGTTTATTATTAGAAAAAA TGTGCATAGACCAACCGGAGTTTGGAACTCCTTTCCTGATCTACCTATGGGACAACTGGAAGTG GACTGTGTTAGTCAGСTTСTСCGСACTGAACCATGAAAAAACTATAAAACTGGCAAGAAAACTG TTGTTGGCAACACATATAACAGCGCTCACATTG (SEQ ID NO:11)

SCYKRQDYYNTQLVVEEKTGVEKRSIMGKWTVITREGREPRLMEQINMVLNDSLSETYC YNRLNTSTWGRQPARQRGCGQTVPYWPGDNVLEEQYYSTGYWVNVTGGCQLREGVWLSRKGNVQ CQRNGSSLMLQLAIKEENDTMEIPCDPVETESMGPVAQGTCVYSWAFAPRGWYYNRKDGYWLQY IKKNDYQYWTKMPTASSAATMYRHLLPLLVACLMGGRISVWFVAMLLSLQVEASEVGTKQLAVT LTLWKMDWTELLFYIVLMLAVKEELIKKIVTASLVALKNSPVALSFLIVLRLVGGSEALPVGLL LEKMCIDQPEFGTPFLIYLWDNWKWTVLVSFSALNHEKTIKLARKLLLATHITALTL (SEQ ID NO:12)

NS2-3: ген, кодирующий неструктурный белок NS2-3, состоящий из 934 аминокислот, находится в положениях 3594-6959 последовательности SEQ ID NO: 1.

AC Т GGC Т Т GAG Т GAT Т СААТ С Т Т С ТАТAT GAT GC Т ТАТААСААСАААТ Т Т G Т ТААТААА GACATTCATATACTTGCTGGGGGCTAGTATGAATTGGGTCGAGAGAGAAAAAAAGAAATTGCTA GTGAAGAGGAGACTAATATACAAGAAAGCCGTTACTTGCAGTCAGGATGAGAATGTATTGGAGA АТАААТ Т СAACAAGATAAC Т G ТАААС GCGGATTTCACCCCATG СAAG С Т Т GAAC Т Т С ТАСААТ Т ACTTAGGGCTTTTTTAGTCTCTTTGTGTTTTTCCTACTACAAACCTCTCCTGTATGCAGAGACT ACCTTAACTGTAATAGTAATTGGCGTACAAGAGTACAACGTAGCCATGGCCCGCGGGCGAAGTG TGGTCCACAGGCTACTAGCCATGGCCTATTACATATACGGCCGCATACAGGGTGACATGTTCCA GСТСGССАСТАТССAGТGССТGСТGТСGAGТССGAGGAAAATТATGAAACACATGGТAGAGAAT CCAACTCTCAAGAAGCTCTGGCAAGGCGAAACAGAACTCTTCAACCAGGGTGTTAGTCAATCCA AGATAGTGAATCCAAAGAAAATTGGGCTGGAAGAATTACACAAGGGCATGTGTGGCCTCCCAAC AGTAGTGCAAAATТТGGTСАТАТАТGCAAAGAAGAATGACТСТСТТАТТТTAGGAGAGCТGGGТ TACCCCCCTGGGGATCTCACCAGTGATGGGTGGGAAATTTTAGGTCCTGGCAGAATCCCAAAGA TCACTAACGTCGAGTCTGCTAAGATGGACTTACTCTCCAAACTTATGACCTTTCTGGGGATTGA AAGCTCGAGGGTCCCCAGGACCCCAGTCCACTCAACAAGGAAATTATTGAAGATAGTAAGGGGC

- 13 036116

TTGGAAACAGGATGGGGGTACACTCACGCAGGGGGGATAAGTAGCGCAAAACACGTTACAGGTG AAAAGAAC T TAAT GACCCACAT GGAGGGTAGGAAGGGAAAATATAT CC TACAATС T CAAGAACA TGGTGCTGACGAGGTAGAGTACGGAGTAAAAACTGATCAAAAAGCTCCCGACAATGCCTTATGC TACTGTTTTAACCCTGAAGCTACAAACATAAAAGGAGAGACGGGAGCCATGGTGTTCATGAAGA AGATAGGAAAAAAGTGGACTCTCGTAACATCAGACGGCAATAAAGCCTATTATAATGTAAACAA TTTGAAAGGGTGGTCTGGACTACCAATAATGCTGCACTCCACCGGGGCCATAGTGGGGAGGATT AAAT GAG C G TAT T CAGAT GAAAAC GAG С T G G T G GAG GAAC T TAT T GAG T С TAGAACTAT TAGTA AGAGCAATGAGACAAACCTGGACCACCTTATCAAGGAATTGGCAGACATGCGGAGGGGGGAGTT CCGCTCAATTACCCTTGGAACGGGAGCCGGGAAAACCACAGAACTGCCTAGGCAATACCTCACA ACAGTAGGTGCCCATAAATCCGTGCTGGTCTTAGTCCCCTTAAAAGCACCTGCTGAAAGTGTTT GCCGCTTTATGAGGTCTAAATACCCTACCATCAACTTTTCCTTAAGAGTGGGGGAACGGAAAGA GGGAGATGTGAGCAGCGGCATCACCTACGCTACTTACGGATTTTGCTGCCAGCTAAACCTAGTC CAAC T T AAAGAAT G GAT AT C CAGG T AC T CAAT GG T T T T T T T T GAT GAAT AT CACACAGCAAC T C CAGAACAAATAGCCATAATAAGCAAGAT T CAT GCAC T GAAAGTTAAGACCAGGATAGT GGC TAT GTCAGCAACCCCCCCGGGTACCGTGACGACTGAAGGCAGGAAGTTTGACATTGAAGAGGTAGGG GTTGCTACCATAGAGAAAGGAGAGGAACCAAAAAGGGGGCGCATAGCGGTCGCTGGTATGCAGG TCCCATTAGAAGACTTAACAGGAAAGAACTGCCTGGTGTTCGTGGCAACCAAAGAAGCCGCGGA GACGGAGGCTAAAGAACTGCGCACCAGAGGAATTAACGCCACCTACTACTATTCAGGTATAGAC CCTAAGACTCTGGAACATGGGATGACCAATCAGCCATACTGTATTGTAGCTACCAATGCCATTG AAT CAG G TATААСС T GT СС T GAC TTGGATGTGGT CATAGACACCAT GCAGAAGTAGGAAAAAGT AGTGAATTTСTCGGCAAAGATGСССTTGATTGTСACTTCATTAGTAAAGAAAAAAATСACCAGG GAAGAACAGGGCCAGAGGAAAGGTCGAGTGGGCAGGCAAAAGAAAGGAAAATACTACTACCCCT CGGGGGTGGTACCGAATGGGTCAAAAGACCTAAGCTATTTAATCCTACAGGCCCAAGAATATGG T GT С T T GGAACAAG T CAATATAACAGAGTAC T T CAT CATAAT GAAT GAGGAC TGGGGTCTC TAT GAC G TAGAT GAAG TAGAAGT GAGAATACT T GAGAGAAT GAACAAGGAAATС T T GС TACCAC TAG GTATTGTGGAGAAGCAAATCTTGGAAAGAAGTACTCACCCGGAAAAAGTGGCACTGTTGTATAA CAAATTAGTGCAGAAAAATCCTATAGTATACCCTAGAGTACAGGAAGGTGAGGTCAGCAAGGAA TACAATACС TATAAT С T GGС CGTATATGACAAGС TAAAAGAT GT CAACСCACAAGCCATTTATG T T С TAG CAGAAGAGGAGAGAGСCACAGAAATGATGGGTCTCGAGT T T GAACAAGACСCAT С T GA CTTACAGGATTCGGTAGTTCAGCTTTGTGAAGATATCAAGAGGTATACAAAACTC (SEQ ID NO:13)

TGLSDSIFYMMLITTNLLIKTFIYLLGASMNWVEREKKKLLVKRRLIYKKAVTCSQDEN VLENKFNKITVNADFTPCKLELLQLLRAFLVSLCFSYYKPLLYAETTLTVIVIGVQEYNVAMAR GRSWHRLLAPAYYIYGRIQGDMFQLATIQCLLSSPRKIMKHMVENPTLKKLWQGETELFNQGV SQSKIVNPKKIGLEELHKGMCGLPTWQNLVIYAKKNDSLILGELGYPPGDLTSDGWEILGPGR IPKITNVESAKMDLLSKLMTFLGIESSRVPRTPVHSTRKLLKIVRGLETGWGYTHAGGISSAKH VTGEKNLMTHMEGRKGKYILQSQEHGADEVEYGVKTDQKAPDNALCYCFNPEATNIKGETGAMV FMKKIGKKWTLVTSDGNKAYYNVNNLKGWSGLPIMLHSTGAIVGRIKSAYSDENDLVEELIDSR TISKSNETNLDHLIKELADMRRGEFRSITLGTGAGKTTELPRQYLTTVGAHKSVLVLVPLKAPA ESVCRFMRSKYPTINFSLRVGERKEGDVSSGITYATYGFCCQLNLVQLKEWISRYSMVFFDEYH TATPEQIAIISKIHALKVKTRIVAMSATPPGTVTTEGRKFDIEEVGVATIEKGEEPKRGRIAVA GMQVPLEDLTGKNCLVFVATKEAAETEAKELRTRGINATYYYSGIDPKTLEHGMTNQPYCIVAT NAIESGITCPDLDVVIDTMQKYEKWNFSAKMPLIVTSLVKKKITREEQGQRKGRVGRQKKGKY YYPSGWPNGSKDLSYLILQAQEYGVLEQVNITEYFIIMNEDWGLYDVDEVEVRILERMNKEIL LPLGIVEKQILERSTHPEKVALLYNKLVQKNPIVYPRVQEGEVSKEYNTYNLAVYDKLKDVNPQ AIYVLAEEERATEMMGLEFEQDPSDLQDSWQLCEDIKRYTKL (SEQ ID NO:14)

Геликаза: ген, кодирующий белок геликазы, состоящий из 687 аминокислот, находится в положениях с 4335 по 6395 последовательности SEQ ID NO: 1.

- 14 036116

GGTCCTGGCAGAATCCCAAAGATCACTAACGTCGAGTCTGCTAAGATGGACTTACTCTC CAAACTTATGACCTTTCTGGGGATTGAAAGCTCGAGGGTCCCCAGGACCCCAGTCCACTCAACA AGGAAATTATTGAAGATAGTAAGGGGCTTGGAAACAGGATGGGGGTACACTCACGCAGGGGGGA TAAGTAGCGCAAAACACGTTACAGGTGAAAAGAACTTAATGACCCACATGGAGGGTAGGAAGGG ΑΆΑΆΤATATСС TACAATС T CAAGAACATGGT GС T GAC GAGGTAGAG TACGGAGTAAAAAC T GAT CAAAAAG С T С С C GACAAT GCCTTATGCTACTGTTT TAAC С С T GAAG С TACAAACATAAAAGGAG AGACGGGAGCCATGGTGTTCATGAAGAAGATAGGAAAAAAGTGGACTCTCGTAACATCAGACGG CAATAAAGCC TATTATAAT GTAAACAAT T T GAAAGGG T GGT СT GGAC TACCAATAAT GC T GCAC TCCACCGGGGCCATAGTGGGGAGGATTAAATCAGCGTATTCAGATGAAAACGACCTGGTGGAGG AACT TAT T GAC T C TAGAACTAT TAGTAAGAGCAAT GAGACAAACС T GGACСACС T TAT CAAGGA ATTGGCAGACATGCGGAGGGGGGAGTTCCGCTCAATTACCCTTGGAACGGGAGCCGGGAAAACC ACAGAACTGCCTAGGCAATACCTCACAACAGTAGGTGCCCATAAATCCGTGCTGGTCTTAGTCC CCTTAAAAGCACCTGCTGAAAGTGTTTGCCGCTTTATGAGGTCTAAATACCCTACCATCAACTT TTCCTTAAGAGTGGGGGAACGGAAAGAGGGAGATGTGAGCAGCGGCATCACCTACGCTACTTAC GGATTTTGCTGCCAGCTAAACCTAGTCCAACTTAAAGAATGGATATCCAGGTACTCAATGGTTT T T T T T GAT GAATAT CACACAGCAAC T CCAGAACAAATAGCOATAATAAGCAAGATT CAT GCAC T GAAAGTTAAGACCAGGATAGTGGCTATGTCAGCAACCCCCCCGGGTACCGTGACGACTGAAGGC AGGAAGTTTGACATTGAAGAGGTAGGGGTTGCTACCATAGAGAAAGGAGAGGAACCAAAAAGGG GGCGCATAGCGGTCGCTGGTATGCAGGTCCCATTAGAAGACTTAACAGGAAAGAACTGCCTGGT GTTCGTGGCAACCAAAGAAGCCGCGGAGACGGAGGCTAAAGAACTGCGCACCAGAGGAATTAAC GCCACCTACTACTATTCAGGTATAGACCCTAAGACTCTGGAACATGGGATGACCAATCAGCCAT ACTGTATTGTAGCTACCAATGCCATTGAATCAGGTATAACCTGTCCTGACTTGGATGTGGTCAT AGACAC CAT G CAGAAGTACGAAAAAGTAGT GAAT T T С T CGGCAAAGAT GCCCTTGATTGT САС T TCATTAGTAAAGAAAAAAATCACCAGGGAAGAACAGGGCCAGAGGAAAGGTCGAGTGGGCAGGC AAAAGAAAGGAAAATACTACTACCCCTCGGGGGTGGTACCGAATGGGTCAAAAGACCTAAGCTA T T TAAT С СTACAGGССCAAGAATATGGTGTCTTGGAACAAGT CAATATAACAGAGTAC T T CAT C ATAAT GAAT GAG GAC TGGGGTCTCTAT GAC G TAGAT GAAG TAGAAGT GAGAATACT T GAGAGAA TGAACAAGGAAATСTTGCTACCACTAGGTATTGTGGAGAAGCAAATСTTGGAAAGAAGTACTCA С С C G GAAAAAG T G G СAC T G T T G TATAACAAATTAGT GCAGAAAAATCCTATAGTATACCC TAGA GTACAGGAAGGTGAGGTCAGCAAGGAATACAATACCTATAATCTGGCCGTATATGACAAGCTAA AAGATGTCAACCCACAAGCCATTTATGTTCTAGCAGAAGAGGAGAGAGCCACAGAAATGATGGG TСTCGAGTTTGAACAAGACСCATСTGACTTACAGGATTCGGTAGTTCAGСTTTGTGAAGATATC AAGAGGTATACAAAACTC (SEQ ID NO:15)

GPGRIPKITNVESAKMDLLSKLMTFLGIESSRVPRTPVHSTRKLLKIVRGLETGWGYTH AGGISSAKHVTGEKNLMTHMEGRKGKYILQSQEHGADEVEYGVKTDQKAPDNALCYCFNPEATN IKGETGAMVFMKKIGKKWTLVTSDGNKAYYNVNNLKGWSGLPIMLHSTGAIVGRIKSAYSDEND LVEELIDSRTISKSNETNLDHLIKELADMRRGEFRSITLGTGAGKTTELPRQYLTTVGAHKSVL VLVPLKAPAESVCRFMRSKYPTINFSLRVGERKEGDVSSGITYATYGFCCQLNLVQLKEWISRY SMVFFDEYHTATPEQIAIISKIHALKVKTRIVAMSATPPGTVTTEGRKFDIEEVGVATIEKGEE PKRGRIAVAGMQVPLEDLTGKNCLVFVATKEAAETEAKELRTRGINATYYYSGIDPKTLEHGMT NQPYCIVATNAIESGITCPDLDWIDTMQKYEKWNFSAKMPLIVTSLVKKKITREEQGQRKGR VGRQKKGKYYYPSGWPNGSKDLSYLILQAQEYGVLEQVNITEYFIIMNEDWGLYDVDEVEVRI LERMNKEILLPLGIVEKQILERSTHPEKVALLYNKLVQKNPIVYPRVQEGEVSKEYNTYNLAVY DKLKDVNPQAIYVLAEEERATEMMGLEFEQDPSDLQDSWQLCEDIKRYTKL (SEQ ID

NO :16)

NS4B: ген, кодирующий неструктурный белок NS4B, состоящий из 67 аминокислот, находится в положениях с 6396 по 6596 последовательности SEQ ID NO: 1.

- 15 036116

TCTGGGATCACTGAGAAACTGCTAGTAGGTACGATGGTGGGGTATATTGGATACAAAGC CTTAACCAGAAACCACGTGCCCTGGGTCAGCAAAGAGTATTGTTATGAGCTGACCGATTCACCG GATACTTACGAAAACTCATTCGСACСTTTGGAGGTCGAGGTСCAAAACTСCGGTGAAGGAAAAC ACCCAGAGCAACTG (SEQ ID NO:17)

SGITEKLLVGTMVGYIGYKALTRNHVPWVSKEYCYELTDSPDTYENSFAPLDVDVQNSG

EGKHPEQL (SEQ ID NO:18)

NS5A: ген, кодирующий неструктурный белок NS5A, состоящий из 811 аминокислот, находится в положениях с 6597 по 9029 последовательности SEQ ID NO: 1.

GCAGACCATCAATTGAGGCAACTACTGGAGACTGGGAGAGACAAGGCAATTGATTTCCT

AAAAGGAATCCGCGAGTTCACTAGTGGGGCCATAAACAGTCCAAAGGCACTAAGTATATGGGAG AAAATATATCAGTATTTGAAGAAGCATCAGGGCGAGATCATCTCATCAGCAGCGTGGGGCAGTG CGACGGCCCTTCACGACAGTATTAAATCTAGACTAGGAGATGAGGTCGCTACTGCAGTAATAAT CCTCAAGTATTTAGCATTTGGTGAAAGAGAACTGTCTGGGCTAACTAGGCAAGTTCTAATTGAC ATCATAGTATATTATATAGT T AAC AAG CCCCGGTTC GAAG GAGAC GAC T AC G C AAAGAGAAAAG GAAGAAGGCTAGTCATCGAAGTCCTGATGGGGGCACTGGCGACTTATGCGGTGTCCAATTTTTG GGGTGTGTCCATTAATAAGATACTGCAACCAATTTCTGATTATCTACCCTATGCCACCGCCACT TTGGCTTTTCTTCGCCCAACCTTCATGGAATCAGCAGTGGTGGTCGCTTCCTCTATCTATAGAG CTTTTCTCTCCATTAAGCATGCGGAAAACAGGAGTCTTGTCACGCAGGTCGCTTCTGCCGCCCT CGAAGTCATGGGCCTGACCCCAGTATCGGCTGGCCTAGGCGTCTTGCTGGGGCTTGGGTTGTGT GTGCTCCATAT GAACAT T GACAAGAAT GAG GAGAAAAG GACAC T TATAC T GAAAAT G T T T G T CA AAAACTTTATAGACCAGGCGGCACTAGACGAGTTGGATAAACTGGAGCCAGAAAAAATAATCCT CTCATTGTTGGAGGGTATCCAAACCTGCACAAACCCGATTAGAGCAATCATGATTTTGTACAGG GTGTACTACAAGGGAGAAACTTTCACAGAAGCTTTGTCTAAGATGGCCGGCAAGTCTCTCATTG TGATGGTCATAGTCGAGTTCCTGGAATTGACAGGCCAAACCCAAGGAGGGTATATAGATCTTAG TGCTAATTTGCTGACCTTTCTCCTCGAGAAACTAAAAAAAATGACTAACCTCGCCATCGGGGAA GCTAGAAAGGTCTTGCTCCCCATCCCATACTTGTACTGTGAAACCTGGCAGTCTGACGCCAGAA TCAAGGCCCCTGAATCCTACGACCAAGTGGTAGTGGAATGCAAATGTGGCGCTTCAGCGAGGTA TTCCTTCCGCGATGGAGTTCATGAGATATTGGAAGAAAAAAGGACTAATTGGTGCAAGAACTTC TTCTTATGGGGACCCAACTTCCACAATCCGGATCCAAAAAGGATGACATTCTATGAATACGGCC AAGCAAAAAAGTGTCCTGTTATCATAATTGGTGAAGACATAACCTTCGGCAAATATGGCATATA TATCAAATTTGGCCATAGGCCTGATGGAGGGAGGTTAATAAGGGGTACCACCCACGCTACTATC AGTAGGGAGGAATTGCTGGAAATCCTAACAGCCCCAAGCCAAGTGGCCATAGGCAAGGTCAAGC TAACCGATTACTGTAATCAAAAAGGAATAATAGACAGGAAATTGGCCGTACTTGAAGGTGACAA AATACAT T T T T G GAAAG СACAC C G T G GAT С СAAAAT CACAGAC CAAC T СAC TAT T GAGAAT С T G ACAGATGATTTGGGGTCAGAAATCAGGGACATCACATGGGAGCTGTACACAGGTGGAACGTGCA CCGTAAAAGGGGTGTCCCTTAGATCATGCGCACCAGGTCATAGAACTAAGGCTATGGTCTTGTG TGATTGCACTGATGTGCTTAGCCCCTGTTACCTAATAAACGGCAGGAGACCATCCCCATTTGAC GTCGCGGAAGGTTATGAATGTCACCACCGGAAGCCCCGAGCGACGTATGAAGACCTAGAAATGG AGGAAATACTAAAGAGACGAGTCCCTGTCTACGATCCTCTGTGTTTGTTTGACACTGATAGTAA ACTGCTACCTCCC GACAC С TAC TAC T T G GAAGAAGAT CAAGAG GAC T T T GAG TAC G CAT T GAGA TGCTGGGGCCTCGGGGTTTATGTAGCAGACGGGCCTGTCACTTCCCCCCCGGACATAAGAATAC ACCATAGTTCGGTATTACTACTGCT GACAC С T G GAG TAAAC T CAGAG T T G С С С T TAGAG TAGAT ACGTTGTTACCCTCATCAGGCAGAGGTGGACATCTACATTAGGAGTCAGCTTTTGGAGGAGGAA GACACTGCTACGGAGGTGGAAGGCTCCCAGGAAGATGGTGATGAAGGGATGGGCGATGCGGTAA TAGAGGATGAGGATACATCGTCCACAACAGAATCAATACCCCCACTAGAAGAGGAGGAAGGGGG CGAAGAGCCAATCACCTATGTGGTCATAAGGGGATTACAAGAAGAAAGATACGCCAGCCATCTT

- 16 036116

AAACTA (SEQ ID NO:19)

ADHQLRQLLETGRDKAIDFLKGIREFTSGAINSPKALSIWEKIYQYLKKHQGEIISSAA WGSATALHDSIKSRLGDEVATAVIILKYLAFGERELSGLTRQVLIDIIVYYIVNKPRFEGDDYA KRKGRRLVIEVLMGALATYAVSNFWGVSINKILQPISDYLPYATATLAFLRPTFMESAVWASS IYRAFLSIKHAENRSLVTQVASAALEVMGLTPVSAGLGVLLGLGLCVLHMNIDKNEEKRTLILK MFVKNFIDQAALDELDKLEPEKIILSLLEGIQTCTNPIRAIMILYRVYYKGETFTEALSKMAGK SLIVMVIVEFLELTGQTQGGYIDLSANLLTFLLEKLKKMTNLAIGEARKVLLPIPYLYCETWQS DARIKAPESYDQVWECKCGASARYSFRDGVHEILEEKRTNWCKNFFLWGPNFHNPDPKRMTFY EYGQAKKCPVIIIGEDITFGKYGIYIKFGHRPDGGRLIRGTTHATISREELLEILTAPSQVAIG KVKLTDYCNQKGIIDRKLAVLEGDKIHFWKAHRGSKITDQLTIENLTDDLGSEIRDITWELYTG GTCTVKGVSLRSCAPGHRTKAMVLCDCTDVLSPCYLINGRRPSPFDVAEGYECHHRKPRATYED LEMEEILKRRVPVYDPLCLFDTDSKLLPPDTYYLEEDQEDFEYALRCWGLGVYVADGPVTSPPD IRIHHSSVLLLLTPGVNSELPLQYIRCYPHQAEVDIYIRSQLLEEEDTATEVEGSQEDGDEGMG DAVIEDEDTSSTTESIPPLEEEEGGEEPITYWIRGLQEERYASHLKL (SEQ ID NO:20)

RdRp: ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу, состоящую из 751 аминокислоты, находится в положениях с 9030 по 11285 последовательности SEQ ID NO: 1.

ААТ GAG Т GGAT GAG Т GAAAACAT Т Т CAGAGC CACACAGAG Т С САААТ ТAT GO ТAGAT GG GACAGTGAGAGTCACAATAAAAGAGGGCAAAGTGAAACATTTGTTTGGGGTCTATAGAATAGAA AACTCCCTGGAAGCAATGTTTAAAGAGACCATAGCTGACCTCCCCGTAGCTACCCAACCGCCCC AGGGGCCAGTCTATACGGCTAAAGAGCTGGCCCAAGGGAACATCGCCCCGGTCCAACCTGCAGC GAATTATTACGGAATGATAGAGGGGAGAGGCGACCCAATGACGGCATTCGAAGCCTTATCAGTC TTGCGGTCACAAAAAGTCTTAGCCAAGGACGTGAAGGTGAACACCCGCAGGGCGCAGGTTTTTT TAAATAAAGTCAGGAGAATTGCTGAGGTCAGAGCGTCGGAACTGACATTAAAATGCTTACCGAT ACTTGGCAAAGTAAATGGGAGGAAATTGATTAGAGAGGAAACCAACATCCCCAACCAAAGGTTG GOAT СААТААТ GACC Т CAATAGGAAT TAGAC TAGAAAAAC Т GCCAGT GGT TAGAGCAAACAC Т Т С С G G С Т С ТAAG Т Т СAGACAG Т СААТ С Т ТAGAAAAAAT G GATAAG ТАТ GAAAAT GAACAAG Т С С С AGGGTTACATGAAAAGATGTGGGCAGCGTTCCTGGCAACTGCCAGGCAAGATTTAAGAAATACC TATGAGGAAGTAACTTATCTTGAATTAGAGGCCGGAATCAATCGGAAAGGAGCCCCAGGTTTCT Т Т GAAAAAGAAAG С Т СААТAG GAGAAG Т G С Т G GAAAAAAAAGAAAAAAT Т GAG G Т САСААТ С СА AGAGAT Т GAAAAAGGCAACCAC Т ТАТ AC ТАТ GAAACAGCCAT GCCAAAAAAT GAGAAAAGAGAT GTGCTTGATGATTGGTTGTCAGAGGATTTCGTCACTTATAAGAAACCACGTGTGATACAGTACC CTGAGGCAGTCACCCGGTTGGCCATCACCAAAATAATGTATAAGTGGGTGAAGCAAAAGCCTAT AGТGATТСССGGТТATGAGGGAAAAACСССGATСТТТGAAATАТТТGAAAAAGТСAGТGСAGAT TGGGCTCAGTTCAAAAATCCGGTAGCCGTCAGCTTCGACACCAGAGCCTGGGACACTCAAGTAA CAAGAGAAGACCТCAGGCТGGTAGGGCGGATACAGAAATACТАТТАСАААААААААТАТТGGAA

- 17 036116

GTTCATTGACAATTTGACAGCCATGATGGAGGAAGTGCCTGTAATCACTGTAGAAGGAGATATG TTCCTCAGAGTTGGACAGCGCGGATCCGGACAGCCTGATACCTCAGCAGGCAATTCCATGCTAA ATGTGCTGACTATGTTGGTAGCTTTCTCTGAATCCACAAATCTGCCCATAGCGGCTGCCTGGAA GGCCTGTCGGATCCACGTCTGTGGTGACGACGGTTTCTTAATCACAGAATCGGAATTAGGGAGG AAGTTTGCTGAAAAAGGTGTTCCTCTGTTAGCTGCATTTGGCAAACCCCAAAAAATTACAGAGG GAGCGAGCCTAAAGGTAACCAGCAACTTTGACGGAATAGAGTTTTGTAGTCATACCCCTATCAG AGTCCAAACACCAAACATCAGGTGGATGCCAGCGAGACCAACAGCAACAATCCTAGGCAAAATG AGTACCAGGCTGGGTGAGGGTGCCACCAGGTCGGGAGAAGAATACGAAAAACAGGTGGCATTCG CATATCTACTGATGTACCCCTGGAACCCGCTGGTCAGGAGAATCAGCCTCCTATTGTTATCGAC TACTGACCCAATGGGGAAAGAGGAAACCCCATGCTCCGATGAGGGGGTGAAGTATGTTGGGGAC CCTATCGCTGCATACAGGGATGTATGGGGGCACAAATTAGAGGATGTAGGCCATGTTGATCAAC CGCAGTTATCCCGGATGAACTATAGCATGACTTACTTAGGGATTTGGAAACCAAAGACAAGTCA GCGGCTAGTCGAACAGTGTTGTCGTCTGGCCGAGAAAAGCAATTGTGTGGTACGTGCTGACTCC CTGATAAAGAAAAAGGTCAAGATCACTTATGACCCGGGGATAGGAGTGGCTCAGGTCATTCGTA GGTGGGAAGAGCTTGAGTGGACCAGAAGGAAACCTGAACTCACCAATGTAATTGTAGAAGATGA TATСTTССTAGTССTGTGGAAGAGATTTTCAAAGTACATTTTTCAGAAAATGAAGTTCATGCAG AGAATGTTCGCCCCTTATTAA (SEQ ID NO:21)

NDWISENISEPHRVQIMLDGTVRVTIKEGKVKHLFGVYRIENSLEAMFKETIADLPVAT QPPQGPVYTAKELAQGNIAPVQPAANYYGMIEGRGDPMTAFEALSVLRSQKVLAKDVKVNTRRA QVFLNKVRRIAEVRASELTLKCLPILGKVNGRKLIREETNIPNQRLASIMTSIGIRLEKLPWR ANTSGSKERQSILEKMDKYENEQVPGLHEKMWAAFLATARQDLRNTYEEVTYLELEAGINRKGA PGFFEKESSIGEVLEKKEKIDVTIQEIEKGNHLYYETAMPKNEKRDVLDDWLSEDFVTYKKPRV IQYPEAVTRLAITKIMYKWVKQKPIVIPGYEGKTPIEEIFEKVSADWAQFKNPVAVS FDTRAWD TQVTREDLRLVGRIQKYYYKKKYWKFIDNLTAMMEEVPVITVEGDMFLRVGQRGSGQPDTSAGN SMLNVLTMLVAFSESTNLPIAAAWKACRIHVCGDDGFLITESELGRKFAEKGVPLLAAFGKPQK ITEGASLKVTSNFDGIEFCSHTPIRVQTPNIRWMPARPTATILGKMSTRLGEGATRSGEEYEKQ VAFAYLLMYPWNPLVRRISLLLLSTTDPMGKEETPCSDEGVKYVGDPIAAYRDVWGHKLEDVGH VDQPQLSRMNYSMTYLGIWKPKTSQRLVEQCCRLAEKSNCWRADSLIKKKVKITYDPGIGVAQ VIRRWEELEWTRRKPELTNVIVEDDIFLVLWKRFSKYIFQKMKFMQRMFAPY (SEQ ID

NO:22)

В одном из вариантов осуществления пестирус по изобретению представляет собой мутант пестивируса, в частности, содержащий по сравнению с геномом пествируса дикого типа мутацию в гене, кодирующем белок указанного вируса.

В предпочтительном варианте осуществления пестирус по изобретению содержит мутацию в гене, кодирующем белки Npro, капсида, Erns, E1, E2, NS2-3, геликазы, NS4B, NS5A или RdRp указанного вируса. Таким образом, изобретение предпочтительно относится к пестивирусу, который проявляет пониженную репликативную способность вируса в результате мутации в гене, кодирующем полипротеин пестивируса, где указанная мутация предпочтительно представляет собой мутацию, как указано ниже.

Предпочтительно мутация, как описано в настоящем документе, включает или состоит из одной или более точечных мутаций и/или одной или нескольких геномных делеций и/или одной или нескольких вставок.

Используемая в настоящем документе иммуногенная композиция также относится к композиции, которая содержит любой описанный в настоящем документе полипротеин пестивируса. В соответствии с еще одним вариантом осуществления такая иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный полипротеин пестивируса и, в частности, белок Е2, предпочтительно, рекомбинантный бакуловирус. Кроме того, иммуногенная композиция может включать: i) любой из описанных выше белков пестивирусов предпочтительно в концентрациях, описанных выше, ii) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный полипротеин пестивируса обработанных белков в полипротеине предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и iii) часть супернатанта клеточной культуры.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящее изобретение также относится к вектору, который содержит любую из таких молекул нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем документе. Другими словами, настоящее изобретение относится к вектору, который включает кодирующую последовательность любого такого полипептида пестивируса или его части. Предпочтительно ука- 18 036116 занный вектор представляет собой вектор экспрессии, который позволяет экспрессировать любой такой полипротеин пестивируса или часть белка. Векторами по изобретению являются такие векторы, которые подходят для трансфекции или инфицирования бактериальных, дрожжевых или животных клеток, in vitro или in vivo.

Вакцины по настоящему изобретению обычно включают инактивированные или аттенуированные пестивирусы, включенные в состав вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, обычно включают стерильные водные растворы (водорастворимые) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для немедленного используемых инъекций. Состав желательно должен был стерильным и жидким в той степени, при которой он легко проходит через иглу. Лекарственная форма должна быть стабильной в условиях производства и хранения, и она обычно защищена от загрязняющего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиспирты (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Одним из возможных носителей является физиологический солевой раствор. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, за счет использования агентов покрытия, таких как лецитин, поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсий и использования поверхностно-активных веществ. Предохранение от воздействия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, таких как парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота, тимеросал (натрий этилмеркурий-тиосалицилат), деомицин, гентамицин и т.п. Во многих случаях предпочтительным будет включение в композицию изотонических агентов, например сахара или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций, если желательно, может быть достигнута за счет использования в композициях агентов, замедляющих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.

Объем однократной дозы вакцины по настоящему изобретению может варьировать, но обычно находится в пределах диапазонов, используемых в обычных вакцинах. Объем одноразовой дозы предпочтительно составляет от примерно 0,1 до примерно 3 мл, предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 1,5 мл, более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 0,5 мл при концентрациях конъюгата и адъюванта, указанных выше.

Вакцинные композиции по изобретению могут вводиться любыми удобными способами, известными в данной области, например внутримышечно, подкожно, внутривенно, перорально, внутриартериально, интраназально (например, ингаляцией или без нее), внутрисердечно, интраспирально, интраторакально, внутрибрюшинно, внутрижелудочно, сублингвально, чрескожно и/или путем ингаляции.

Особью, которой вводят композицию, предпочтительно, является животное, включая, но не ограничиваясь ими, свиней, коров, лошадей, овец, птиц (например, цыплят), коз, кошек, собак, хомяков, мышей и крыс. Наиболее предпочтительно млекопитающим является свинья, более предпочтительно свиноматка, молодая свинья или поросенок. В некоторых вариантах осуществления свиноматка или молодая свинья могут быть беременными.

Составы по настоящему изобретению включают эффективное иммунизирующее количество одной или нескольких иммуногенных композиций и физиологически приемлемый носитель. Вакцины включают эффективное иммунизирующее количество одной или нескольких иммуногенных композиций и физиологически приемлемый носитель. Состав должен подходить для способа введения.

Иммуногенная композиция может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов либо рН-буферных агентов. Иммуногенная композиция может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетку, пилюлю, капсулу, композицию с замедленным высвобождением или порошок. Пероральный состав может включать стандартные носители фармацевтической степени чистоты, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.п.

Предпочтительные пути введения включают, но ими не ограничиваются, интраназальный, пероральный, внутрикожный и внутримышечный. Предпочтительным является внутримышечное или интравагинальное введение наиболее предпочтительно единичной дозой, если желательно. Специалисту в данной области будет понятно, что композицию по изобретению также можно вводить одной, двумя или несколькими дозами, а также другими путями введения. Например, такие другие пути включают подкожное, внутрикожное, внутривенное, внутрисосудистое, внутриартериальное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутритрахеальное, внутрикожное, внутрисердечное, внутрь легочной доли, внутримедуллярное или внутрилегочное введение. В зависимости от желаемой продолжительности и эффективности лечения композиции по изобретению можно вводить один или несколько раз, а также периодически, например ежедневно в течение нескольких дней, недель или месяцев, и в разных дозах.

Варианты осуществления изобретения также включают способ защиты поросят от болезней, связанных с пестивирусом, включающий введение беременной свиноматке или молодой свинье любой из аттенуированных вакцин, описанных в настоящем документе. Например, введенная вакцина содержит один или несколько антигенов пестивируса.

- 19 036116

Таким образом, в соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение относится к способу снижения процента пестивирусных инфекций в стаде поросят, включающему стадию введения беременным свиноматкам или молодым свиньям эффективного количества инактивированного или аттенуированного пестивирусного агента или иммуногенной композиции, содержащей пестивирусный агент, где пестивирусный антиген представляет собой инактивированный пестивирус, аттенуированный пестивирус или субъединичную вакцину.

В одном из вариантов осуществления пестивирус по изобретению представляет собой любой пестивирус, кодируемый или содержащий последовательность SEQ ID NO: 1 или 2; где последовательность по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 или 2; и/или где пестивирус кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1 или 2.

В еще одном варианте осуществления способ включает введение вакцины, содержащей один или несколько иммуногенных компонентов, выбранных из группы, состоящей из пестивируса, который кодируется или содержит последовательность SEQ ID NO: 1; где последовательность по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 2; где полипротеин кодируется последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1 или 2; и/или где полипротеин пестивируса кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1 или 2.

Соединения, описанные в настоящем описании, могут вводиться пациенту в терапевтически эффективных дозах для лечения заболеваний, связанных с пестивирусом. Доза зависит от хозяина, получающего вакцину, а также от таких факторов, как размер, масса тела и возраст хозяина.

Иммуногенность композиции может быть определена путем мониторинга иммунного ответа испытуемых особей после иммунизации композицией, используя любой иммуноанализ, известный в данной области. Индукция гуморального (антительного) ответа и/или клеточного иммунитета может быть воспринята как признак иммунного ответа. Среди испытуемых особей могут быть такие животные, как свиньи, мыши, хомяки, собаки, кошки, кролики, коровы, лошади, овцы и домашняя птица (например, цыплята, утки, гуси и индюки).

Иммунный ответ испытуемых особей может быть проанализирован с помощью различных подходов, таких как реактивность полученной иммунной сыворотки в отношении иммуногенного конъюгата, которую осуществляют известными методами, например иммуноферментным анализом с ферментным связыванием (ELISA), иммуноблоттингом, иммунопреципитацией и т.п.; или путем защиты иммунизированных хозяев от инфекции патогеном и/или ослабления симптомов инфекции патогеном у иммунизированных хозяев, что осуществляют любым способом, известным в данной области, для анализа уровней возбудителя инфекционных заболеваний, например бактериальных уровней (например, путем культивирования образца особи) или другими методиками, известными в данной области. Уровни возбудителя инфекционных заболеваний также могут быть определены путем измерения уровней антигена, на который направлен иммуноглобулин. Снижение уровней возбудителя инфекционных заболеваний или улучшение симптомов инфекционного заболевания указывает на то, что композиция эффективна.

Терапевтические агенты по изобретению могут быть проанализированы in vitro на желаемую терапевтическую или профилактическую активность перед испытанием in vivo на животных или людях. Например, анализы in vitro, которые могут быть использованы для определения того, показано ли введение конкретного терапевтического средства, включают анализы на клеточных культурах in vitro, в которых соответствующие клетки из клеточной линии или клетки, культивируемые у особи с конкретным заболеванием или расстройством, подвергаются воздействию или иным образом получают эффект терапевтического средства, и наблюдается эффект терапевтического средства на клетки.

Альтернативно, терапевтическое средство может быть проанализировано путем приведения в контакт терапевтического средства с клетками (либо культивируемыми от особи, либо культивируемой клеточной линии), которые восприимчивы к инфекции, вызываемой возбудителем инфекционного заболевания, но которые не инфицированы возбудителем инфекционного заболевания, подвергая клетки действию возбудителя инфекционного заболевания, а затем определяя, был ли уровень инфицирования клеток, приведенных в контакт с терапевтическим средство, ниже, чем уровень инфицирования клеток, не находившихся в контакте с терапевтическим средством. Инфекция клеток возбудителем инфекционного заболевания может быть проанализирована любым способом, известным в данной области.

Кроме того, терапевтическое средство может быть оценено путем измерения уровня молекулы, на которую направлено антитело в модели животного или человека, в подходящих временных интервалах до, в процессе или после терапии. Любое изменение или отсутствие изменения количества молекулы можно идентифицировать и коррелировать с эффектом лечения этой особи. Уровень молекулы может быть определен любым способом, известным в данной области.

После вакцинации животного пестивирусной вакциной или иммуногенной композицией с использованием способов и композиций по настоящему изобретению для оценки связывания полученного антитела и конкретной молекулы может быть использован любой анализ связывания, известный в данной области. Эти анализы также могут быть осуществлены для отбора антител, которые проявляют более высокую аффинность или специфичность в отношении конкретного антигена.

- 20 036116

Обычно аттенуация вируса может быть получена из изолятов патогенных вирусов путем повторного пассажа в подходящих клетках-хозяевах, которые пермиссивны к вирусу до тех пор, пока вирус не проявит желаемые свойства (WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, ЕР 0676467, ЕР 0732340, ЕР 0835930). Альтернативно, это может быть осуществлено путем генетического реинжиниринга посредством использования инфекционного клона, обычно полноразмерной комплементарной ДНК-транскрипцией вирусного генома (WO 98/18933, ЕР 1018557, WO 03/062407, Nielsen et al., J. Virol. 2003, 77:3702-3711). Дополнительно вирус может быть пассирован при неприродных физиологических условиях, которые включают, но ими не ограничиваются, модифицированную температуру, клетки из видов, не являющихся хозяевами, или в присутствии мутагенов.

Изобретение распространяется на штаммы пестивируса, которые получены из штаммов путем культивирования или размножения в идентичной или дивергентной форме, в частности, на потомков, которые обладают основными характеристиками депонированных штаммов. При продолжении размножения штаммы могут приобретать мутации, большинство из которых не будут существенно изменять свойства этих штаммов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к получению и выделению потомства или потомка пестивируса SEQ ID NO: 1 или 2. Изобретение также распространяется на штаммы пестивируса, которые получены из идентифицированных штаммов путем культивирования или размножения в идентичной или дивергентной форме, в частности на потомков, которые обладают основными характеристиками идентифицированных штаммов. При продолжении размножения штаммы могут приобретать мутации, большинство из которых не будут существенно изменять свойства этих штаммов.

Изоляты по изобретению также могут быть дополнительно модифицированы для придания им дополнительных желательных свойств. Это может быть достигнуто путем классических методов размножения и селекции, таких как непрерывная репродукция в подходящих клетках-хозяевах для расширения аттенуированного фенотипа. Альтернативно, изоляты могут быть генетически модифицированы путем направленной мутации последовательности нуклеиновой кислоты генома этих штаммов подходящими методами генной инженерии.

Рекомбинантные методы получения модифицированных последовательностей хорошо известны специалистам в данной области, и они обычно используют конструкцию полноразмерных комплементарных копий ДНК (инфекционных клонов) вирусного генома, которые затем могут быть модифицированы методами рекомбинантной ДНК и обработки (например, сайт-направленный мутагенез и т.п.). Так, например, можно модифицировать антигенные сайты или ферментативные свойства вирусных белков.

Предпочтительно изобретение охватывает последовательности нуклеиновой кислоты пестивируса, которые имеют по меньшей мере 95% гомологию с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, поскольку такие вирусы могут быть эффективными для индукции иммунитета у животных, вакцинированных аттенуированными вирусами, содержащими такие гомологичные последовательности. Последовательность, показанная в SEQ ID NO: 1 или 2, представляет собой полноразмерную последовательность аттенуированного пестивируса и имеет полную длину последовательности, равную приблизительно 11550 оснований.

Пестивирусные штаммы по настоящему изобретению, подходящие для вакцин по изобретению, можно выращивать и собирать способами, известными в данной области, например путем репродукции в подходящих клетках-хозяевах.

В частности, вакцина, как указано в настоящем описании, представляет собой живую вакцину и/или модифицированную живую аттенуированную вакцину. Штаммы пестивируса по изобретению можно выращивать и собирать способами, известными в данной области, например путем репродукции в подходящих клетках.

Модифицированные живые вакцины (MLV) обычно вводят в состав в количестве, обеспечивающем введение 101-107 вирусных частиц на дозу, предпочтительно 103-10⁶ частиц на дозу и более предпочтительно 104-10⁶ частиц на дозу (4,0-6,0 log₁₀ TCID₅₀).

Вариант осуществления изобретения включает способ получения пестивирусной вакцины, включающий: (a) инокулирование клеток пестивирусом; (b) инкубацию инокулированных клеток; (c) сбор пестивируса из инкубированных клеток. В предпочтительном варианте осуществления способ включает пестивирус, содержащий последовательность, которая кодируется или содержит последовательность SEQ ID NO: 1 или 2; последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 или 2; белок, который кодируется последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1; и/или полипротеин, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 2. Способ может дополнительно включать добавление адъюванта к пестивирусной вакцине, предпочтительно адъювант представляет собой адъювант на основе эмульсии типа масло-в-воде EMULSIGEN®.

Другой вариант осуществления изобретения включает способ получения рекомбинантной вакцины, включающий экспрессию одного или более антигенов пестивируса в клетке-хозяине и сбор одного или нескольких антигенов пестивирусных клеток. В одном из таких вариантов осуществления способ может включать один или несколько антигенов, содержащих выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую

- 21 036116 антиген пестивирусного белка, где рекомбинантный пестивирусный полипептид по меньшей мере на 90% гомологичен SEQ ID NO: 1 или 2; вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту а); рекомбинантный пестивирусный белок, кодируемый нуклеиновой кислотой а); и любую их комбинацию. В одном из примеров варианта осуществления один или несколько антигенов пестивируса экспрессированы рекомбинантным бакуловирусным вектором. Способ может включать один или несколько антигенов пестивируса, экспрессируемых в клетках насекомых. Один из вариантов осуществления дополнительно включает добавление адъюванта к пестивирусной вакцине, предпочтительно, адъювант представляет собой адъювант на основе эмульсии типа масло-в-воде EMULSIGEN®.

Антитела или их связывающие части, получающиеся в результате применения пестивирусных пептидов по настоящему изобретению, могут использоваться для обнаружения в образце наличия пестивируса. Этот метод обнаружения включает стадии предоставления выделенного антитела или его связывающей части, полученного против пестивирусного пептида по изобретению, добавления к выделенному антителу или его связывающей части образца, предположительно содержащего некоторое количество пестивируса, и обнаружение наличия комплекса, содержащего выделенное антитело или его связывающую часть, связанную с пестивирусом.

Антитела или их связывающие части по настоящему изобретению также можно использоваться для обнаружения наличия в образце пестивирусного пептида. Этот метод обнаружения включает стадии предоставления выделенного антитела или его связывающей части, полученного против пестивирусного пептида, добавления к выделенному антителу или его связывающей части образца, предположительно содержащего некоторое количество пестивирусного пептида, и обнаружение комплекса, содержащего выделенное антитело или его связывающую часть, связанную с пестивирусным пептидом.

Иммуноглобулины, в частности антитела (и их функционально активные фрагменты), которые связывают специфическую молекулу, которая является членом пары связывания, могут быть использованы в качестве диагностических и прогностических агентов, как описано в настоящем описании. В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к исследованию члена пары связывания и применению таких исследований для клинического использования. Иммуноглобулины в настоящем изобретении могут быть использованы, например, при обнаружении антигена в биологическом образце, посредством чего испытуемые могут быть исследованы на аберрантные уровни молекулы, с которой связывается иммуноглобулин, и/или на наличие патологических форм таких молекул. Под патологическими уровнями подразумевается увеличение или уменьшение относительно присутствующего уровня или стандартного уровня, представляющего присутствующий уровень, в аналогичном образце части организма или особи, не страдающей этим заболеванием. Антитела по настоящему изобретению также могут быть включены в качестве реагента в набор для использования в диагностическом или прогностическом методе.

В одном из аспектов антитело по изобретению, которое иммуноспецифически связывается с пестивирусным пептидом, может быть использовано для диагностики, прогнозирования или скрининга пестивирусной инфекции.

В другом аспекте изобретение относится к способу диагностики или скрининга на наличие пестивирусной инфекции или иммунитета к ней, включающему измерение у особи уровня иммуноспецифического связывания антитела с образцом, полученным от особи, у которой иммуноспецифическое антитело связывается с пестивирусным пептидом, где повышение уровня указанного иммуноспецифического связывания по сравнению с уровнем указанного иммуноспецифического связывания в аналогичном образце у особи без этого инфекционного агента заболевания, указывает на наличие пестивируса.

Примеры подходящих анализов для обнаружения пестивирусных пептидов или их антагонистов включают, но не ограничиваются ими, ELISA, радиоиммунологический анализ, гель-диффузионную реакцию преципитации, иммунодиффузионный анализ, анализ агглютинации, флуоресцентный иммуноанализ, иммуноанализ белка A или иммуноэлектрофоретический анализ.

Иммуноанализы для конкретной молекулы обычно включают инкубацию образца, такого как биологическая жидкость, тканевой экстракт, свежесобранные клетки или лизаты культивируемых клеток, в присутствии детектируемого меченого антитела и обнаружения связанного антитела любым из большого числа методик, хорошо известных в данной области.

Активность связывания заданного антитела может быть определена в соответствии с известными способами. Специалисты в данной области смогут определить функциональные и оптимальные условия анализа для каждого определения, используя обычные эксперименты.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к диагностическим наборам для обнаружения или количественного определения пестивируса. Представлены наборы для диагностического применения, которые содержат один или несколько контейнеров антител против пестивирусных пептидов и, необязательно, меченый связывающий партнер антитела.

Альтернативно, антитело против пестивирусного пептида может быть меченым (детектируемым маркером, например хемилюминесцентным, ферментативным, флуоресцентным или радиоактивным агентом). Соответственно, настоящее изобретение относится к диагностическому набору, содержащему антитело против пестивирусного пептида и контрольный иммуноглобулин. В конкретном варианте осу- 22 036116 ществления одно из вышеуказанных соединений контейнера может быть мечено с возможностью обнаружения. Набор может необязательно дополнительно содержать в контейнере заранее определенное количество пестивирусного пептида, распознаваемого антителом набора, для использования в качестве стандарта или контроля.

Еще один вариант осуществления изобретения включает набор для вакцинации беременной свиноматки или молодой свиньи против болезней, связанных с пестивирусом, включающий: дозатор, способный вводить вакцину беременной свиноматке или молодой свинье; и пестивирусную вакцину, как описано в настоящем описании.

Композиции могут, при желании, быть представлены в упаковке или дозаторном устройстве, которое может содержать одну или несколько лекарственных форм с однократной дозировкой, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такая как блистерная упаковка. Упаковка или дозаторное устройство могут сопровождаться инструкциями для введения, предпочтительно для введения млекопитающему, особенно для введения свинье. В таком контейнере(ах) может находится указание в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, с информацией об одобрении этим агентом по производству, применению или продаже для введения людям.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой принадлежит это изобретение на момент подачи. Смысл и область применения терминов должен быть ясным; однако в случае любой скрытой двусмысленности, определения, приведенные в настоящем описании, важнее определений, приведенных в любом словаре или внешнем источнике. Кроме того, если иное не требуется в соответствии с контекстом, термины в единственном числе включают множественное число, а термины во множественном числе включают единственное число. В данном случае использование или означает и/или, если не указано иное. Кроме того, использование термина включая, а также других форм, таких как включает и включено, не является ограничивающим. Все патенты и публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылки.

При практическом осуществлении настоящего изобретения будут использованы, если не указано иное, общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии, методы рекомбинантной ДНК, химии белка и иммунологии, которые находятся в компетенции специалистов в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II и III, второе издание (1989); DNA Cloning, Vols. I и II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, В., А Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); и Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and С.С. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).

Следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретной ДНК, полипептидные последовательности или параметры способа, как таковые, могут, разумеется, изменяться. Кроме того, следует учитывать, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения. Следует отметить, что использованное в настоящем описании и приложенной формуле изобретения, единственное число включает ссылку и на множественное число, если из контекста с очевидностью не следует обратное. Так, например, ссылка на антиген включает смесь двух или более антигенов, ссылка на эксципиент включает смеси двух или более эксципиентов и т.п.

Иммуногенная или иммунологическая композиция или вакцина, используемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, относятся к композиции вещества, которая содержит по меньшей мере один пестивирус по настоящему изобретению или его иммуногенную часть, которые вызывают иммунологический ответ в организме хозяина, клеточный или антитело-опосредованный иммунный ответ на композицию. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуногенная композиция индуцирует иммунный ответ и более предпочтительно обеспечивает защитный иммунитет против одного или нескольких клинических симптомов инфекции СТ.

Используемый в настоящем описании иммуногенный или антиген относится к полипептиду или белку, которые вызывают иммунологический ответ, как описано в настоящем описании. К ним относятся клеточный и/или гуморальный иммунные ответы. В зависимости от предполагаемой функции композиции в нее могут быть введены один или несколько антигенов. Иммуногенный пестивирусный белок или полипептид включают полноразмерную последовательность любого из описанных в настоящем описании пестивирусов или аналогов или их иммуногенных фрагментов. Термин иммуногенный фрагмент или иммуногенная часть, используемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, относится к фрагменту или усеченной и/или замещенной форме пестивируса, которые включают один или несколько эпитопов и, таким образом, вызывают описанный в настоящем описании иммунологический ответ. В целом, такие

- 23 036116 усеченные и/или замещенные формы или фрагменты будут содержать по меньшей мере шесть смежных аминокислот полноразмерного пестивирусного белка. Более предпочтительно усеченные или замещенные формы или фрагменты будут иметь по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15 и еще более предпочтительно по меньшей мере 19 смежных аминокислот полноразмерного пестивирусного белка. Такие фрагменты могут быть идентифицированы с использованием любого количества методик картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут быть определены путем параллельного синтеза большого числа пептидов на твердых носителях, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и взаимодействия пептидов с антителами, в то время как пептиды по-прежнему присоединены к носителям. Такие методики известны и описаны в данной области, см., например, патент США № 4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; и Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Аналогично, конформационные эпитопы можно легко идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например рентгеновской кристаллографией и двумерным ядерным магнитным резонансом. См. Epitope Mapping Protocols, выше. Синтетические антигены также включены в это определение, например полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие антигены, полученные рекомбинантными или синтетическими методами. См., например, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; и Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998 (описание и содержание которых включены в настоящее описание в качестве ссылки).

Используемый в настоящем описании термин вакцина относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один иммунологически активный компонент, который индуцирует иммунологический ответ у животного и возможно, но не обязательно, один или несколько дополнительных компонентов, которые усиливают иммунологическую активность активного компонента. Вакцина может дополнительно содержать дополнительные компоненты, характерные для фармацевтических композиций. Как отличие, иммунологически активный компонент вакцины может содержать полноразмерные вирусные частицы либо в их первоначальной форме, либо в виде аттенуированных частиц в так называемой модифицированной живой вакцине (MLV) или в виде частиц, инактивированных подходящими способами, в так называемой инактивированной вакцине (KV). В другой форме иммунологически активный компонент вакцины может содержать соответствующие элементы организмов (субъединичные вакцины), где эти элементы образуются либо путем разрушения полноразмерной частицы или растущих культур, содержащих такие частицы, и, необязательно, путем последующих этапов очистки, дающих желаемую структуру(ы), либо путем синтетических процессов, включая соответствующие манипуляции с использованием подходящей системы, основанной, например, на бактериях, насекомых, млекопитающих или других видах, плюс, необязательно, путем последующих процедур выделения и очистки или путем индукции синтетических процессов у животного, нуждающегося в вакцине, путем непосредственного введения генетического материала с использованием подходящих фармацевтических композиций (полинуклеотидная вакцинация). Вакцина может содержать один или одновременно более одного элементов, описанных выше. Используемый в настоящем описании термин вакцина представляет собой модифицированную живую аттенуированную вакцину для ветеринарного применения, включающую антигенные вещества, и она вводится с целью индукции специфического и активного иммунитета против заболевания, вызванного пестивирусной инфекцией. Инактивированный или аттенуированный пестивирус, в частности инактивированный или модифицированный аттенуированный пестивирус, как описано в настоящем описании, придает активный иммунитет, который может передаваться пассивно через материнские антитела против иммуногенов, которые содержит организм, а иногда и против антигенносвязанных организмов.

Используемые в настоящем описании термины инактивированные или убитые используются как синонимы. В данной области известны различные физические и химические способы инактивации. Термин инактивированный относится к ранее вирулентному или невирулентному вирусу, или бактерии, которые были подвергнуты облучению (ультрафиолетовое (УФ), рентгеновское, электроннолучевое или γ-излучение), нагреты или химически обработаны для инактивации, уничтожения, сохраняя при этом их иммуногенность. В одном из вариантов осуществления инактивированный вирус, описанный в настоящем описании, инактивирован путем обработки инактивирующим агентом. Подходящие инактивирующие агенты включают β-пропиолактон, бинарный или β- или ацетил-этиленимин, глутаровый альдегид, озон и формалин (формальдегид).

При инактивации формалином или формальдегидом формальдегид обычно смешивают с водой и метиловым спиртом для образования формалина. Добавление метилового спирта предотвращает деградацию или перекрестную реакцию во время процесса активации. В одном из вариантов осуществления используют 0,1-1% 37%-го раствора формальдегида для инактивации вируса или бактерии. Крайне важно подобрать количество формалина, которое гарантировало бы инактивацию вещества, но чтобы при этом не возникали побочные эффекты от высокой дозы.

- 24 036116

Более предпочтительным способом инактивации является использование этиленимина и соответствующих производных, таких как бинарный этиленимин (BEI) и ацетилэтиленимин, которые являются примерами подходящих химических инактивирующих агентов для использования при инактивации пестивируса. Другие химические инактивирующие агенты, например, β-пропиолактон, альдегиды (такие как формальдегид) и/или детергенты (например, детергент TWEEN®, TRITON® X или алкилтриметиламмониевые соли), также можно использовать для инактивации вируса. Инактивация может быть выполнена с помощью стандартных способов, известных специалистам в данной области. Образцы могут быть взяты с периодическим временным интервалом и проанализированы на наличие остаточного живого вируса. Мониторинг цитопатического эффекта на соответствующей клеточной линии и/или флуоресцентное окрашивание подходящим специфическим моноклональным или поликлональным антителом можно использовать для обнаружения остаточного живого вируса. Альтернативно, рост, контролируемый количественной ПЦР в реальном времени в сериях пассажей, может быть использован для определения наличия остаточного инфекционного вируса.

Инактивация с помощью BEI может быть осуществлена путем объединения маточного раствора BEI (например, раствора, образованного добавлением 0,1-0,2М раствора гидробромида 2-бромэтиламина к 0,1-0,2 н водному раствору NaOH) с растворами вируса до конечной концентрации, равной приблизительно 1-5 мМ BEI. Инактивацию обычно проводят путем выдерживания смеси BEI-вирус при 35-40°C (например, при 37°C) при постоянном перемешивании в течение приблизительно 24-72 ч. Инактивацию вируса можно остановить путем добавления раствора тиосульфата натрия до конечной концентрации, превышающей концентрацию BEI (например, добавление тиосульфата натрия в объеме 17% от объема BEI для нейтрализации избытка BEI) с последующим перемешиванием.

Более конкретно, термин инактивированный в контексте вируса означает, что вирус неспособен к репликации in vivo или in vitro и, соответственно, термин инактивированный в контексте вируса означает, что вирус неспособен к размножению in vivo или in vitro. Например, термин инактивированный может относиться к вирусу, который был реплицирован in vitro, например in vitro, а затем дезактивирован с помощью химических или физических средств так, что он больше не может реплицироваться. В другом примере термин инактивированный может относиться к вирусу, который был реплицирован, а затем дезактивирован с помощью химических или физических средств с получением суспензии вируса, фрагментов или компонентов вируса, например с получением раствора, который может использоваться в качестве компонента вакцины.

Термин живая вакцина относится к вакцине, содержащей живой, в частности живой вирусный активный компонент.

Субъединичная вакцина может включать антигены, которые лучше всего стимулируют иммунную систему. В некоторых случаях в таких вакцинах используются белки Npro, капсида, Erns, E1, E2, NS2-3, геликазу, NS4B, NS5A и /или белок РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) пестивируса или эпитопы этих белков. Поскольку субъединичные вакцины содержат только существенные антигены, и не содержат все другие молекулы, которые составляют пестивирус, шансы неблагоприятных реакций на вакцину снижаются.

Субъединичные вакцины могут содержать от одного до 10 или более антигенов, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 антигенов. Специалистам в данной области будет понятно, как получить субъединичные вакцины. Например, молекулы антигена могут быть экспрессированы с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Вакцины, полученные таким образом, называются рекомбинантными субъединичными вакцинами.

Фармацевтическая композиция, по существу, состоит из одного или нескольких ингредиентов, способных модифицировать физиологические, например иммунологические, функции организма, в который ее вводят, или организмов, обитающих в организме или на организме. Термин включает, но этим не ограничивается, антибиотики или противопаразитарные средства, а также другие компоненты, обычно используемые для достижения некоторых других показателей, таких как, но не ограничиваясь ими, характеристики обработки, стерильность, стабильность, возможность введения композиции энтеральным или парентеральным путями, такими как пероральный, интраназальный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный или другой подходящий путь, толерантность после введения или свойства контролируемого высвобождения. Один из неограничивающих примеров такой фармацевтической композиции исключительно для демонстрационных целей может быть получен следующим образом: супернатант клеточной культуры инфицированной клеточной культуры смешивают со стабилизатором (например, спермидином и/или бычьим сывороточным альбумином (BSA)) и смесь затем лиофилизируют или обезвоживают другими способами. Перед вакцинацией смесь затем регидратируют в водном (например, физиологическом растворе, забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS)) или неводном растворах (например, масляная эмульсия, адъювант на основе алюминия).

Используемый в настоящем описании термин фармацевтический или ветеринарно приемлемый носитель включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотониче- 25 036116 ские агенты, агенты, замедляющие адсорбцию, и т.п. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления и особенно в тех, которые включают лиофилизованные иммуногенные композиции, стабилизирующие агенты для использования в настоящем изобретении включают стабилизаторы для лиофилизации или сушки вымораживанием.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция по настоящему изобретению содержит адъювант. Адъюванты, используемые в настоящем описании, могут включать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), эмульсию масло-в-воде, эмульсию вода-вмасле, эмульсию вода-в-масле-в-воде.

Эмульсия может быть основана, в частности, на легком жидком парафиновом масле (типа приведенном в Европейской Фармакопее); на изопреноидном масле, таком как сквалан или сквален; на масле, полученном в результате олигомеризации алкенов, в частности изобутена или децена; на сложных эфирах кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, более конкретно на растительных маслах, этилолеате, ди-(каприлат/капрат) пропиленгликоля, три-(каприлат/капрат)глицериле или диолеате пропиленгликоля; на сложных эфирах разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности сложных эфирах изостеариновой кислоты.

Масло используют в сочетании с эмульгаторами с образованием эмульсии. Предпочтительными эмульгаторами являются неионные поверхностно-активные вещества, в частности сложные эфиры сорбитана, маннида (например, олеат ангидроманнитола), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой кислоты, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и полиоксипропилен-полиоксиэтиленовых сополимерных блоков, в частности продуктов плюроника, особенно L121. См., Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp. 51-94 (1995), и Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Типичными адъювантами являются эмульсия SPT, описанная на стр. 147 Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach под редакцией M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, и эмульсия MF59, описанная на стр. 183 этой же книги.

Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного.

Преимущественными адъювантными соединениями являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, которые являются перекрестно-связанными, особенно с полиалкенильными эфирами сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под термином карбомер (Phameuropa, т. 8, № 2, июнь 1996). Специалисты в данной области также могут ссылаться на патент США № 2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, перекрестно-связанные с полигидроксилированным соединением, имеющим по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, причем атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов заменены на ненасыщенные алифатические радикалы, имеющие по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например винильные, аллильные и другие группы с этиленовыми двойными связями. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Особенно подходят продукты, продаваемые под названием карбопол (BF Goodrich, Огайо, США). Они являются перекрестно-связанными с аллилсахарозой или с аллилпентаэритритом. Среди них можно упомянуть карбопол 974Р, 934Р и 971Р. Наиболее предпочтительным является использование карбопола 971P. Среди сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного представлены сополимеры ЕМА (Monsanto), которые являются сополимерами малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде дает раствор кислоты, который будет нейтрализован предпочтительно до физиологического рН, с получением адъювантного раствора, в который будет включена сама иммуногенная, иммунологическая или вакцинная композиция.

Другие подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются ими, адъювантную систему RIBI (Ribi Inc.), блок-сополимер (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), монофосфорильный липид А, адъювант авридин липид-амин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или полученный другим образом), холерный токсин, IMS 1314 или мурамилдипептид, или природные или рекомбинантные цитокины, или их аналоги или стимуляторы высвобождения эндогенных цитокинов, среди многих других.

Предполагается, что адъювант может быть добавлен в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу, предпочтительно в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу, более предпочтительно в количестве от приблизительно 500 мкг до приблизительно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве от приблизительно 750 мкг до приблизительно 2,5 мг на дозу и наиболее предпочтительно в количестве приблизительно 1 мг на дозу. Альтернативно, адъювант может быть в концентрации от около 0,01 до 50%, предпочтительно в концентрации от около 2 до 30%, более предпочтительно в концентрации от около 5 до 25%, еще более предпочтительно в концентрации от около 7 до 22% и наиболее предпочтительно в концентрации от 10 до 20 об.% конечного продукта.

Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п.

- 26 036116

Изотонические агенты могут включать, среди прочих, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают альбумин и щелочные соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и другие.

Выделенный означает преобразованный рукой человека из его природного состояния, т.е. если вещество является природным, то оно изменено или удалено из своей первоначальной среды или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, естественно присутствующий в живом организме, не выделен, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от сосуществующих веществ своего природного состояния является выделенным, как этот термин используется в настоящем описании.

Аттенуация означает снижение вирулентности патогена. В настоящем изобретении аттенуированным вирусом является вирус, у которого вирулентность снижена так, что не вызывает клинических симптомов пестивирусной инфекции, но он способен индуцировать иммунный ответ у мишеневого млекопитающего, а также может означать, что клинические симптомы снижены при первичной заболеваемости или снижена тяжесть заболевания у животных, инфицированных инактивированным или аттенуированным пестивирусом, по сравнению с контрольной группой животных, инфицированных неаттенуированным пестивирусом дикого типа и не получающих инактивированный или аттенуированный вирус. В этом контексте термин уменьшение/уменьшенный означает уменьшение по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 25%, еще более предпочтительно на 50%, еще более предпочтительно на 60%, еще более предпочтительно на 70%, еще более предпочтительно на 80%, еще больше предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно на 100% по сравнению с контрольной группой, как определено выше. Таким образом, инактивированный, аттенуированный и /или авирулентный пестивирусный изолят является изолятом, подходящим для включения в иммуногенную композицию, содержащую инактивированный или модифицированный живой пестивирус.

Аттенуированный вирус является жизнеспособным (живым) вирусом, в котором вирулентность инфекционного агента снижена, например, при пассировании вируса в определенной клеточной линии или при генетической манипуляции вирусным геномом. Аттенуация вируса имеет отношение к его вирулентности (патогенности), но не обязательно влияет на репликативную способность вируса. Аттенуированный вирус по-прежнему может быть способен к репликации. Таким образом, это может быть штамм вируса, патогенность которого снижена, так что он будет индуцировать иммунный ответ, не вызывая конкретного заболевания. В контексте настоящего изобретения аттенуированным вирусом может быть пестивирус, патогенность которого была уничтожена или уменьшена путем инактивации по меньшей мере одного гена или белка, вовлеченного в вирулентность. В настоящем изобретении аттенуация является синонимом авирулентности. В этом контексте термин уменьшение/уменьшенный означает уменьшение патогенности по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 25%, еще более предпочтительно на 50%, еще более предпочтительно на 60%, еще более предпочтительно на 70%, еще более предпочтительно на 80%, еще более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно на 100% по сравнению с контрольной группой.

Модифицированный живой означает, что вирулентность вируса была уменьшена любым из нескольких известных в данной области способов, таких как, но ими не ограничиваясь, повторный пассаж в клеточной культуре; принудительная адаптация к росту при нормальных ограниченных температурах; лечение химическими мутагенами для обеспечения большого количества мутаций и отбора по желаемым характеристикам; и делеция или вставка генов, используя технологию рДНК. Под термином невирулентный или авирулентный подразумевается, что модифицированный живой вирус демонстрирует снижение или отсутствие клинических симптомов инфекции при введении.

Вирулентный относится к способности пестивирусного изолята вызывать заболевание, связанное с пестивирусом. Вирулентность можно оценить, наблюдая прогрессирование болезни у животного. Примером вирулентного штамма пестивируса является пример штамма для экспериментального заражения, как описано и используется в настоящем изобретении.

Авирулентый относится к изолятам пестивируса, которые лишены вирулентности. То есть авирулентные штаммы, изоляты или конструкции являются непатогенными и не способны вызвать заболевание. Используемый здесь термин авирулентный используется как синоним термина невирулентный.

Используемые в данном описании термины штамм или изолят используются взаимозаменяемо.

Термин пестивирус дикого типа, как используется в настоящем описании, в частности, относится к инфекционному патогенному пестивирусу, который, в частности, способен вызывать СТ у свиней и особенно у поросят. В одном из конкретных предпочтительных вариантов осуществления термин вирус дикого типа относится к пестивирусу, геном которого содержит последовательность РНК или состоит из полинуклеотида РНК, где указанная последовательность РНК или полинуклеотида РНК представляет собой РНК-копию полинуклеотида, содержащего SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21. В некоторых вариантах осуществления пестивирус дикого типа содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22.

В настоящем описании эффективная доза означает, но не ограничивается этим, количество антигена, которое вызывает или способно вызывать иммунный ответ, приводящий к уменьшению клинических симптомов у животного, которому вводится антиген.

- 27 036116

Используемый в настоящем описании термин эффективное количество означает, в контексте композиции, количество иммуногенной композиции, способной индуцировать иммунный ответ, который уменьшает заболеваемость или уменьшает тяжесть инфекции или частоту заболевания у животного. В частности, эффективное количество относится к титру, измеренному в культуре ткани при инфекционной дозе 50, или к единицам образования бляшек на дозу. Альтернативно, в контексте терапии термин эффективное количество относится к количеству терапевтического средства, которое является достаточным для снижения тяжести или облегчения течения или продолжительности заболевания или расстройства или одного или нескольких симптомов, препятствуя распространению заболевания или расстройства, вызывая регрессию заболевания или расстройства, предотвращая повторение, развитие, начало или прогрессирование одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или расстройством, или улучшает или усиливает профилактику или лечение с помощью другой терапии или терапевтического агента.

Используемый в настоящем описании термин иммунореактивный к пестивирусу означает, что пептид или фрагмент вызывает иммунологический ответ против пестивируса.

Термины идентичность последовательности или процент идентичности используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Для целей настоящего изобретения в настоящем описании определено, что для установления процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты с целью оптимального сравнения последовательности выравнивают (например, пропуски могут быть введены в последовательности первой аминокислоты или нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания с последовательностью второй аминокислоты или нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные или нуклеотидные остатки в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Если положение в первой последовательности занято теми же аминокислотой или нуклеотидным остатком, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы в этом положении являются идентичными. Процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % идентичности=количество одинаковых положений/общее количество положений (т.е. перекрывающиеся положения)/100). Предпочтительно две последовательности имеют одинаковую длину.

Гомология последовательности, как используется в настоящем описании, относится к способу определения родства двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей две или более последовательности оптимально выравнивают и при необходимости в них вводят пробелы. Однако в отличие от идентичности последовательности консервативные аминокислотные замены считаются совпадением при определении гомологии последовательностей. Другими словами, для получения полипептида или полинуклеотида, имеющего 95%-ную гомологию последовательности с эталонной последовательностью, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в эталонной последовательности должны соответствовать или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или некоторое количество аминокислот или нуклеотидов до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены, в эталонной последовательности может быть встроено в эталонную последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность содержит участок по меньшей мере с 50, еще более предпочтительно со 100, еще более предпочтительно с 250, еще более предпочтительно с 500 нуклеотидами.

Консервативная замена относится к замене аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим сходные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.п., так что общая функциональность существенно не изменяется.

Специалисту в данной области известно, что для определения гомологии между двумя последовательностями доступно несколько различных компьютерных программ. Например, сравнение последовательностей и определение процентной идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями определяют с использованием алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), который был включен в программу GAP в программном пакете Accelrys GCG (см. www.accelrys.com/products/gcg), используя либо матрицу Blosum 62, либо матрицу РАМ250, и штраф за пропуск 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штраф за продолжение пропуска 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту в данной области будет понятно, что все эти различные параметры дадут несколько отличные результаты, но общая процентная идентичность двух последовательностей существенно не изменится при использовании разных алгоритмов.

Сравнение последовательностей может проводиться по всей длине двух последовательностей, которые сравниваются, или по длине фрагмента двух последовательностей. Как правило, сравнение будет проводиться по всей длине двух сравниваемых последовательностей. Однако идентичность последовательности может быть проведена в области, например, двадцать, пятьдесят, сто или более смежных аминокислотных остатков.

Идентичность последовательности, как известно в данной области, относится к взаимосвязи между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными

- 28 036116 последовательностями, а именно ссылочной последовательности и заданной последовательности, которая должна сравниваться со ссылочной последовательностью. Идентичность последовательности определяется путем сравнения данной последовательности со ссылочной последовательностью после того, как последовательности были оптимально выровнены, чтобы обеспечить наивысшую степень сходства последовательностей, как определено совпадением строк таких последовательностей. При таком выравнивании идентичность последовательности определяется на основании положения по отношению к положению, например последовательности идентичны в конкретном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее число таких идентичных положений затем делится на общее число нуклеотидов или остатков в ссылочной последовательности для получения % идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей может быть легко рассчитана известными способами, включая, но не ограничиваясь, такими, которые описаны в Computational Molecular Biology, Lesk, A.N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); и Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылки. Предпочтительные способы определения идентичности последовательностей предназначены для обеспечения наибольшего соответствия между исследованными последовательностями. Способы определения идентичности последовательностей зашифрованы в общедоступных компьютерных программах, которые определяют идентичность последовательностей между заданными последовательностями. Примеры таких программ включают, но этим не ограничиваются, пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). Программа BLASTX общедоступна от NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки). Эти программы оптимально выравнивают последовательности, используя штрафы за делецию по умолчанию для того, чтобы получить высокий уровень идентичности последовательностей между заданной и эталонной последовательностями. В качестве иллюстрации полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, например по меньшей мере 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность последовательности со ссылочной нуклеотидной последовательностью, предполагается, что нуклеотидная последовательность заданного полинуклеотида идентична ссылочной последовательности, за исключением того, что заданная полинуклеотидная последовательность может включать до 5, 4, 3, 2, 1 или 0 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов ссылочной нуклеотидной последовательности. Другими словами, в полинуклеотиде, имеющем нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 95%-й, например по меньшей мере с 96, 97, 98, 99 или 100%-й идентичностью последовательности относительно эталонной нуклеотидной последовательности, до 5, 4, 3, 2, 1 или 0% нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть удалены или заменены другим нуклеотидом, или некоторое количество нуклеотидов до 5, 4, 3, 2 1 или 0% от общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть встроены в эталонную последовательность. Эти мутации ссылочной последовательности могут встречаться в 5'- или 3'концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими конечными положениями, расположенные либо индивидуально среди нуклеотидов в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких соседних группах в эталонной последовательности. Аналогично, касательно полипептида, имеющего заданную аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере, например, на 95%, например по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100% идентична эталонной аминокислотной последовательности, предполагается, что заданная аминокислотная последовательность полипептида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что заданная полипептидная последовательность может включать до 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот эталонной аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения заданной полипептидной последовательности, которая по меньшей мере на 95%, например по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100 идентична по последовательности ссылочной аминокислотной последовательности, 5, 4, 3, 2, 1 или 0% включительно аминокислотных остатков в ссылочной последовательности могут быть удалены или замещены другой аминокислотой или количество аминокислот, равное 5, 4, 3 2, 1 или 0% включительно от общего числа аминокислотных остатков в ссылочной последовательности может быть встроены в ссылочную последовательность. Эти изменения эталонной последовательности могут происходить в аминокислотных или карбоксиконцевых положениях эталонной аминокислотной последовательности или где-нибудь между этими конечными положениями, расположенными либо по отдельности среди остатков в эталонной последовательности, либо в одной или более соседних группах в эталонной последовательности. Предпочтительно положения остатков, которые не идентичны, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не включаются как соответствие при определении идентичности последовательности.

Термин мутация в контексте изобретения понимается как изменение геномной последовательно

- 29 036116 сти, в частности в последовательности РНК пестивируса. Поскольку вирусы, которые используют РНК в качестве своего генетического материала, обладают быстрой скоростью мутаций, термин мутация, как указано в настоящем описании, в частности, относится к генетически модифицированному изменению геномной последовательности, такому как клонирование, принудительная рекомбинация, рост в присутствии мутагенов или другие способы, используемые для экспериментального изменения генома, которые, в частности, приводят к тому, что вирус, растущий до титров, значительно ниже, чем пестивирус дикого типа в инфицированном хозяине, при распространении в тех же условиях. Кроме того, в другом предпочтительном варианте осуществления мутация, описанная в настоящем описании, также может быть природной мутацией и вызвана последующим выделением пестивируса по изобретению, где указанный выделенный вирус включает описанную в настоящем описании мутацию.

Последовательности белка или последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть дополнительно использованы как искомая последовательность для выполнения поиска в публичных базах данных, например для идентификации других членов семейства или связанных последовательностей. Такой поиск может быть выполнен с использованием программ BLASTN и BLASTP (версия 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиск белка BLAST может быть выполнен программой BLASTP, штраф=50, длина слова=3 с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка по изобретению. Для получения выравнивания с пробелами для целей сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать параметры по умолчанию для соответствующих программ (например, BLASTP и BLASTN). См. домашнюю страницу National Center for Biotechnology Information at www.ncbi.nlm.nih.gov.

Термин вектор, как известно в данной области, относится к полинуклеотидной конструкции, обычно к плазмиде или вирусу, которая используется для передачи генетического материала в клеткухозяина. Векторами могут быть, например, вирусы, плазмиды, космиды или фаг. Используемый в настоящем описании вектор может состоять либо из ДНК, либо из РНК. В некоторых вариантах осуществления вектор состоит из ДНК. Вектор экспрессии представляет собой вектор, который способен направлять экспрессию белка, кодируемого одним или несколькими генами, переносимыми этим вектором, если он находится в соответствующем окружении. Предпочтительно векторы способны к автономной репликации. Обычно вектор экспрессии содержит промотор транскрипции, ген и терминатор транскрипции. Экспрессия гена обычно находится под контролем промотора, а ген, как говорят, функционально связан с этим промотором.

Как используется в настоящем описании термин функционально связанный используется для описания связи между регуляторными элементами и геном или его кодирующей областью. Как правило, экспрессия гена находится под контролем одного или нескольких регуляторных элементов, например, но ими не ограничиваясь, конститутивных или индуцируемых промоторов, ткане-специфических регуляторных элементов и энхансеров. Говорят, что ген или кодирующая область функционально связаны с регуляторными элементами, что означает, что ген или кодирующая область контролируется или зависит от регуляторного элемента. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор осуществляет транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности.

Как используется в настоящем описании, термин конструкция относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, которая была создана для экспрессии специфической нуклеотидной последовательности(ей), или которая должна использоваться при конструировании других рекомбинантных нуклеотидных последовательностей.

Векторы и способы получения и/или использования векторов (или рекомбинантных вариантов) для экспрессии могут быть или аналогичны способам, раскрытым в следующих патентах: патенты США №№ 4603112, 4769330, 5174993, 5505941, 5338683, 5494807, 4722848, 5942235, 5364773, 5762938, 5770212, 5942235, 382425, публикациях WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoletti, Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11341-11348, October 1996; Smith et al., U.S. Patent No. 4,745,051 (recombinant baculovirus); Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, Baculovirus Expression Protocols (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector, Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406; EPA0370573; заявка США № 920197, поданная 16 октября 1986; европейская патентная заявка № 265785; патент США № 4769331 (рекомбинантный вирус герпеса); Roizman, The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11307-11312, октябрь 1996; Andreansky et al., The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11313-11318, октябрь 1996; Robertson et al., Epstein-Barnm virus vectors for gene delivery to В lymphocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11334-11340, октябрь 1996; Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11371- 30 036116

11377, 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; патенты США 5593939, 5552143; WO 98/00166; принятые заявки США №№ 08/675556 и 08/675566, обе поданы 3 июля 1996 (рекомбинантный аденовирус); Grunhaus et al., 1992, Adenovirus as cloning vectors, Seminars in Virology 3:237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal 4:3861-65, Graham, Tibtech 8:85-87, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70:429-34; PCT WO 91/11525; Feigner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science 259:1745-49, 1993; и McClements et al., Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11414-11420, 1996; и патенты №№ 5591639, 5589466 и 5580859, а также WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797, WO 95/11307, WO 95/20660; Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, помимо прочих. См. также WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736739, 1998 (лентивирусная экспрессионная система); Sanford et al., патент США № 4945050; Fischbachet al. (Intracel); WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (векторные системы на основе ДНК); Szoka et al., патент США № 4394448 (способ введения ДНК в живые клетки); McCormick et al., патент США № 5677178 (применение цитопатических вирусов); и патент США № 5928913 (векторы для доставки генов); а также другие документы, цитированные в настоящем описании.

Используемые в настоящем описании термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид взаимозаменяемы и относятся к любой нуклеиновой кислоте. Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид также конкретно включают нуклеиновые кислоты, состоящие из оснований, отличных от пяти биологически встречающихся оснований (аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил).

Термины регуляторный элемент и элемент контроля экспрессии используются взаимозаменяемо и относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут влиять на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Эти термины широко используются и охватывают все элементы, которые способствуют или регулируют транскрипцию, включая промоторы, основные элементы, необходимые для основного взаимодействия РНК-полимеразы и факторов транскрипции, расположенных в направлении 3'-5' элементов, энхансеров и элементов ответа. Характерные регуляторные элементы в прокариотах включают промоторы, последовательности операторов и сайты связывания рибосом. Регуляторные элементы, которые используются в эукариотических клетках, могут включать, но ими не ограничиваются, транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности, такие как промоторы, энхансеры, сигналы сплайсинга, сигналы полиаденилирования, терминаторы, сигналы деградации белка, участок внутренней посадки рибосомы (IRES), последовательности 2А и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют экспрессию кодирующей последовательности и/или продукцию кодированного полипептида в клетке-хозяине.

Используемый в настоящем описании термин промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая обеспечивает связывание РНК-полимеразу и направляет транскрипцию гена. Как правило, промотор расположен в 5'-некодирующей области гена, проксимальной к месту начала транскрипции гена. Элементы последовательности внутри промоторов, которые функционируют при инициировании транскрипции, часто характеризуются консенсус-нуклеотидными последовательностями. Примеры промоторов включают, но не ограничиваются ими, промоторы из бактерий, дрожжей, растений, вирусов и млекопитающих (включая людей). Промотор может быть индуцибельным, репрессируемым и/или конститутивным. Индуцируемые промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции из ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение культуральных условий, такое как изменение температуры.

Как используется в настоящем описании, термин энхансер относится к типу регуляторного элемента, который может повысить эффективность транскрипции, независимо от расстояния или ориентации энхансера относительно исходного сайта транскрипции.

Получение вирусного вектора может быть осуществлено с использованием любых подходящих способов генной инженерии, хорошо известных в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, стандартные методы рестрикционного расщепления эндонуклеазой, лигирование, трансформацию, плазмидную очистку и секвенирование ДНК, например, как описано в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)).

Вирусный вектор может включать последовательности генома любого известного организма. Последовательности могут быть включены в их нативной форме или могут быть любым образом модифицированы для получения желаемой активности. Например, последовательности могут содержать вставки, делеции или замены.

Вирусный вектор может включать кодирующие области для двух или более представляющих интерес белков. Например, вирусный вектор может включать кодирующую область для первого представляющего интерес белка и кодирующую область для второго представляющего интерес белка. Первый представляющий интерес белок и второй представляющий интерес белок могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор может включать кодирующую(ие) область(и) для третьего или четвертого представляющего интерес белка. Третий и четвертый представляющие интерес белки могут быть одинаковыми или разными. Общая длина двух или более представ

- 31 036116 ляющих интерес белков, кодируемых одним вирусным вектором, может изменяться. Например, общая длина двух или более белков может составлять по меньшей мере около 400 аминокислот, по меньшей мере около 450 аминокислот, по меньшей мере около 500 аминокислот, по меньшей мере около 550 аминокислот, по меньшей мере около 600 аминокислот, по меньшей мере около 650 аминокислот, по меньшей мере около 700 аминокислот, по меньшей мере около 750 аминокислот, по меньшей мере около 800 аминокислот или более.

Предпочтительные вирусные векторы включают бакуловирус, такой как BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), в частности, при условии, что продуцирующими клетками являются клетки насекомых. Хотя бакуловирусная система экспрессии является предпочтительной, специалистам в данной области будет понятно, что другие системы экспрессии будут эффективны для целей настоящего изобретения, а именно экспрессия Е или Erns в супернатанте клеточной культуры. Для таких других систем экспрессии могут потребоваться сигнальная последовательность для индукции экспрессии Е или Erns в среду.

Термин геногруппа, как известно в данной области, относится к связанным вирусам в пределах рода; которые могут быть дополнительно подразделены на генетические кластеры. Идентифицированные геногруппы рода пестивируса включают вирус пограничной болезни овец, вирус бычьей диареи 1 (BVD-1), BVD-2, вирус классической свиной лихорадки и другие неклассифицированные пестивирусы.

Термин филогенетическая ветвь или клада, как известно в данной области, относится к группе, состоящей из предка и всех его потомков, единственной ветви в филогенетическом дереве. Предком может быть, например, особь, популяция или вид. Г еногруппа может включать несколько клад.

Иммунный ответ или иммунологический ответ означает, но не ограничивается этим, развитие клеточного и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Обычно иммунный или иммунологический ответ включает (но не ограничивается этим) один или несколько следующих эффектов: продукцию или активацию антител, В-клеток, хелперных Т-клеток, супрессорных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенные в композицию или интересующую вакцину.

Предпочтительно хозяин будет проявлять либо терапевтический, либо защитный иммунологический (память) ответ, благодаря чему повышается устойчивость к новой инфекции и/или уменьшается клиническая тяжесть заболевания. Такая защита будет продемонстрирована либо снижением числа симптомов, тяжести симптомов, либо отсутствием одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией, вызываемой патогеном, задержкой начала виремии, снижением вирусной персистенции, снижением общей вирусной нагрузки и/или снижением экскреции вируса.

В настоящем описании специфически иммунореактивный относится к иммунореактивному белку или полипептиду, которые распознают антиген, характерный для пестивируса или инфекции СТ, но не взаимодействуют с антигеном, характерным для строго контроля заражения.

Защита от болезней, защитный иммунитет, функциональный иммунитет и аналогичные фразы означает ответ на заболевание или состояние, вызванное введением одной или нескольких терапевтических композиций по изобретению, или их сочетания, что приводит к меньшему количеству побочных эффектов, чем могло бы ожидаться у неиммунизированной особи, которая подвержена болезни или инфекции. То есть тяжесть побочных эффектов инфекции уменьшается у вакцинированной особи. У вакцинированной особи инфекция может быть уменьшена, замедлена или, возможно, полностью предотвращена. В настоящем описании, если подразумевается полная профилактика инфекции, то это конкретно указано. Если полная профилактика не указана, то термин включает частичную профилактику.

При этом снижение частоты и/или тяжести клинических признаков или снижение клинических симптомов означает, но этим не ограничивается, уменьшение числа инфицированных особей в группе, уменьшение количества особей, проявляющих клинические симптомы инфекции, или их исчезновение, или уменьшение тяжести любых клинических симптомов, которые присутствуют у одной или нескольких особей, по сравнению с инфекцией дикого типа. Например, это должно касаться любого уменьшения патогенной нагрузки, уменьшения количества патогенов, снижения передачи патогенов или уменьшения любого клинического симптома, характерного для СТ. Предпочтительно эти клинические симптомы уменьшаются у одной или более особей, получающих терапевтическую композицию по настоящему изобретению, по меньшей мере на 10% по сравнению с особями, не получающими композицию, и которые становятся инфицированными. Более предпочтительно клинические симптомы снижаются у особей, получающих композицию по настоящему изобретению, по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%.

Термин повышенная защита в настоящем описании означает, но не ограничивается этим, статистически значимое уменьшение одного или нескольких клинических симптомов, которые связаны с инфекцией инфекционным агентом, предпочтительно пестивирусом, вызываемым СТ, соответственно, в вакцинированной группе особей по сравнению с невакцинированной контрольной группой особей. Термин статистически значимое снижение клинических симптомов означает, но не ограничивается этим, что частота распространенности по меньшей мере одного клинического симптома в вакцинированной

- 32 036116 группе особей по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 20%, более предпочтительно на 30%, еще более предпочтительно на 50% и даже более предпочтительно на 70% ниже, чем в невакцинированной контрольной группе после заражения инфекционным агентом.

Долгосрочная защита должна относиться к улучшенной эффективности, которая сохраняется в течение по меньшей мере 3 недель, но более предпочтительно по меньшей мере 3 месяца, еще более предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев. В случае домашнего скота наиболее предпочтительно, чтобы длительная защита сохранялась до среднего возраста, при котором животных реализуют на рынке в пищу.

Как используется в настоящем описании, термин виремия, в частности, понимают как состояние, при котором частицы пестивируса воспроизводятся и циркулируют в кровотоке животного, в частности поросят.

Термин снижение виремии, индуцированной пестивирусом, означает, но не ограничивается этим, сокращение пестивируса, проникающего в кровоток животного, где уровень виремии, т.е. количество копий пестивирусов на 1 мл сыворотки крови или количество колоний, образующих бляшки, на децилитр сыворотки снижается в сыворотке особей, получающих композицию по настоящему изобретению, по меньшей мере на 50% по сравнению с особями, не получающими такую композицию, и которые становятся инфицированными. Более предпочтительно уровень виремии снижается у особей, получающих композицию по настоящему изобретению, по меньшей мере, на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 99,9%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,99% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,999%.

Безопасность относится к отсутствию неблагоприятных последствий у вакцинированного животного после вакцинации, включая, но этим не ограничиваясь, возможную реверсию вакцины на основе бактерий к вирулентности, клинически значимые побочные эффекты, такие как постоянная, системная болезнь или нежелательное воспаление на месте введения вакцины.

Термины вакцинация или вакцинирование или их варианты, используемые в настоящем описании, означают, но не ограничиваются ими, способ, который включает введение иммуногенной композиции по изобретению, которая при введении животному вызывает или способна вызывать, напрямую или косвенно, иммунный ответ у животного против пестивируса или СТ.

Смертность в контексте настоящего изобретения относится к смерти, вызванной пестивирусной инфекцией или СТ, и включает ситуацию, когда инфекция настолько сильная, что животное подвергают эвтаназии, чтобы предотвратить страдания и дать ему умереть.

Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения.

Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что способы, описанные в следующих ниже примерах, представляют собой методы, обнаруженные изобретателями, которые хорошо функционируют при практическом осуществлении изобретения и, таким образом, могут считаться предпочтительными при его практическом осуществлении. Однако специалистам в данной области будет в свете настоящего описания понятно, что может быть сделано большое число изменений в конкретных раскрытых вариантах осуществления и могут быть получены аналогичные или сходные результаты без отхода от сущности и объема изобретения.

Примеры

Пример 1.

Цель исследования состояла в том, чтобы определить, можно ли воспроизвести клиническое заболевание у свиней, рожденных с помощью кесарева сечения (CDCD), используя гомогенат ткани, содержащий новый пестивирус по настоящему изобретению. В частности, цель заключалась в воспроизведении виремии и колонизации тканей (как обнаружено с помощью кПЦР в реальном времени) у поросят CDCD после заражения сывороткой, содержащей новый пестивирус.

Уход за животными.

Свиньей размещали в вивариях при VRI в Кембридже, IA, на протяжении всего исследования. Свиней вскармливали на коммерческом рационе (UltraCare Medicated, лот № 4Jun16), который соответствовал их размеру, возрасту и состоянию в соответствии с приемлемыми методами животноводства в данном регионе (были включены антибиотики). Вода была доступна ad libitum. Пол и место для корма удовлетворяли требованиям, изложенным в соглашении Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Agricultural Research and Teaching, третье издание, январь 2010.

Любое умирающее животное и животные, отказывающиеся от еды или питья, подвергались эвтаназии до даты вскрытия по усмотрению исследователя. Любое животное, которое погибло или было подвергнуто эвтаназии в течение всего периода исследования, вскрывалось ветеринаром. Все животные подвергались эвтаназии по завершению исследования, учитывались и утилизировались путем сжигания.

Организация эксперимента.

Для данного биоанализа использовалось в общей сложности десять свиней CDCD. Свиньи были рандомизированы на две группы. Животным группы 1 (n=6) вводили посредством трех путей введения (интракраниально, интраназально и внутривенно) сыворотку, содержащую пестивирусы. Животных

- 33 036116 группы 2 (n=4) инокулировали аналогичным образом веществом плацебо, и они служили отрицательным контролем. Животные в каждой группе находились в отдельных комнатах. После заражения проводили ежедневный мониторинг клинических симптомов у свиней со дня заражения (D0) до D28. На протяжении всего исследования дважды в неделю определяли ректальную температуру. На протяжении всего исследования дважды в неделю собирали образцы сыворотки, фекалий и образцы из носа. Образцы подвергали скринингу на пестивирусную РНК. Вес животных измеряли в D0 и во время вскрытия для оценки воздействия заражения на среднесуточный прирост. На D10, 14, 17, 21, 24 и 28 вскрывали одно животное из группы заражения. Решение о том, какое животное будет вскрыто, основывалось на обнаружении РНК пестивируса в сыворотке. На D17, 21, 24 и 28 эвтаназии подвергали одно животное из группы плацебо. Ткани и терминальную сыворотку, собранные во время вскрытия, подвергали скринингу на наличие РНК пестивируса посредством кПЦР в реальном времени (фиг. 4).

Сыворотку NAC#20140530, животное номер 21-24, лот с 2815-105-2 по 2815-105-5, оттаивали при 37°C и объединяли. Объединенные сыворотки фильтровали через фильтр 0,2 мкм и разбавляли добавлением 6 мл сыворотки к 29 мл 1 хзабуференного фосфатом физиологического раствора (Gibco номер в каталоге 10010-023, лот номер 1535358). Полученное вещество обозначали лот 2815-171-А и хранили при -70±10°C перед использованием (FreezerWorks id#466528). В день испытания вещество размораживали и сохраняли на льду в течение периода заражения. Три аликвоты по 2 мл хранили в качестве контрольных образцов при -70±10°C (FreezerWorks id#466044). Объединенное вещество сохраняли, но дополнительно не тестировали.

Таблица 1

Схема основных событий, DPC означает день после заражения

День исследования	День события
D0 (05 авг 14)	Заражение свиней - сбор образцов сыворотки, фекалий и мазка из носа перед заражением - измерение массы перед заражением
D2, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27	- сбор образцов сыворотки, фекалий и мазка из носа - ректальная температура
D10	- сбор сыворотки у всех имеющихся животных
D10, 14, 17, 21, 24, 28	Вскрытие 1 животного в день для зараженной группы

- 34 036116

	- сбор крови у умирающего животного - измерение веса
D17, 21, 24, 28	Вскрытие 1 животного в день для группы плацебо - сбор крови у умирающего животного - измерение веса
D0-28	Ежедневные клинические наблюдения
TBD	Поросят доставляют в VRI Оценка поросят
DPC0	Заражение поросят - сбор образцов сыворотки, фекалий и мазка из носа перед заражением - измерение массы перед заражением
DPC1, 3, 5, 7	- сбор образцов сыворотки, фекалий и мазка из носа - ректальная температура - фотография или видеозапись в случае появления клинических симптомов
DPC 8-28	- сбор образцов сыворотки, фекалий и мазка из носа дважды в неделю - ректальная температура дважды в неделю
DPC0-28	Ежедневные клинические наблюдения
DPC3, 7, 10, 14, 21, 28	Вскрытие - сбор крови у умирающего животного - измерение веса

Заражение.

Интраназальное заражение: на DPC0 исследователь вводил 2 мл вещества для заражения, 1 мл в каждую ноздрю, используя стерильный шприц. Это введение проводили перед анестезией животного.

Интракраниальное введение: на DPC0 исследователь анестезировал животных смесью кетамина, ксилазина и телазола.

Свод черепа очищали и дезинфицировали. Для удаления участка кожи размером 4 мм из свода черепа использовали иглу для биопсии кожи (Miltex Instrument Company, Inc.). Через отверстие проводили трепанацию свода черепа, используя ручную механическую дрель. Зараженное вещество вводили в головной мозг с помощью катетера калибром 20, длиной 1,88 дюймов (BD AngioCath, партия номер Н3272). После инъекции инокулята в катетер вводили 0,5 мл 1х PBS для доставки инокулята. Разрез кожи закрывали одним швом.

Внутривенное заражение: после того как поросят анестезировали, 2 мл вещества для заражения медленно вводили в ушную вену, используя стерильный катетер-бабочку и шприц.

Клинические наблюдения.

После заражения проводили мониторинг поросят один раз в день на наличие клинических симптомов. Поскольку неизвестно, будут ли клинические признаки сходны с другими пестивирусами свиней (например, классическая чума свиней, вирус Bungowannah), то проводили монитор поросят на симптомы системной инфекции, а также на неврологические симптомы.

Сбор проб фекалий.

Фекальный материал у поросят собирал исследователь. Образцы собирали на тампон (номер в каталоге Fisher 23-400-111), помещенный в пробирку фирмы Falcon. Образцы брали у животных, а не с пола. Материал переносили в день сбора, и образцы поддерживали при 2-8°C, если тестирование проводили в течение <24 ч после доставки или поддерживали при -70±10°C, если их проводили позднее.

Взятие мазков из носа.

Мазки из носа у поросят собирал исследователь. Образцы собирали на тампон (номер в каталоге Fisher 23-400-111), помещенный в пробирку фирмы Falcon. Образцы собирали у животного, беря мазки из обоих ноздрей. Образцы помечали, указывая минимальный номер исследования, день исследования и идентификационный номер животного. Материал переносили в день сбора и образцы поддерживали при

- 35 036116

2-8°C, если тестирование проводили в течение <24 ч после доставки, или поддерживали при -70±10°C, если их проводили позднее.

Забор крови.

В день сбора крови исследователь собирал от 4 до 15 мл венозной цельной крови через переднюю полую вену у каждой свиньи, используя стерильную иглу VACCUTAINER® размером от 18-20gx от 1 дюйма (2,54 см) до 1,5 дюйма (3,81 см)®, держатель иглы VACCUTAINER® и 9 или 13 мл-вые пробирки для отделения сыворотки (SST). Сыворотку отделяли от тромба центрифугированием и декантировали в низкотемпературный флакон с завинчивающейся крышкой. Материал переносили в день сбора и образцы поддерживали при 2-8°C, если тестирование проводили в течение <24 ч после доставки, или поддерживали при -70±10°C, если их проводили позднее.

Вскрытие.

Общий осмотр: у каждого умирающего животного забирали кровь, подвергали эвтаназии, а затем ветеринар проводил вскрытие. Свиней отбирали для вскрытия на основе данных о виремии (значение Ct <30), полученных за день до запланированного вскрытия. Поросят взвешивали во время вскрытия и регистрировали макроскопические повреждения.

Сбор крови у умирающего животного и обработка: поросят глубоко анестезировали перед сбором крови. Кровь (приблизительно 5% массы тела) собирали в стерильные банки, бутылки или несколько пробирок SST и оставляли коагулироваться при комнатной температуре. Сыворотку отделяли от сгустка центрифугированием и декантировали в стерильные бутылки. Образцы сыворотки поддерживали при 28°C, если тестирование проводили в течение <24 ч после доставки, или поддерживали при -70°C, если их проводили позднее.

Сбор образцов: исследователь собирал фиксированные в формалине образцы тканей головного мозга (1/2 органа), мозжечка (1/2 органа), ствола мозга (1/2 органа), спинного мозга (6 секций), костного мозга (гистологический срез длинной кости), миндалины (1 срез), легких (1 срез добавочной доли легких или область с поражением), сердца (2 среза), селезенки (1 срез), почки (1 срез), печени (1 срез), лимфатического узла (трахеобронхиальный и брыжеечный), тонкой кишки (3 среза подвздошной кишки), толстой кишки (3 среза). Рекомендуется 1-дюймовый гистологический срез легкого и 1-2-дюймовый срез кишечника так, чтобы сохранялось постоянное соотношение фиксированной ткани и формалина 1:10. Все фиксированные ткани помещали в один контейнер, содержащий 10% буферный раствор формалина. У каждого поросенка собирали образец секций в повторе, как перечислено выше, в отдельные упаковочные пакеты для центрифугирования.

Обработка ткани: образцы перевозили в день сбора и образцы поддерживали при 2-8°C, если тестирование проводили в течение <24 ч после доставки, или поддерживали при -70°C, если их проводили позднее. Фиксированные ткани содержали при комнатной температуре.

Измерение веса.

Измерение веса поросят проводили на DPC0 в день вскрытия. Вес наносили на калибровочную шкалу и записывали по соответствующей форме, предоставляемой виварием. Показатели веса использовали для расчета среднего дневного прироста.

Тестирование образцов.

ПЦР пестивируса проводили во всех образцах. Отобранные образцы подвергали скринингу на энтеровирус, свиной калицивирус, трансмиссивный вирус гастроэнтерита, Escherichia coli, Salmonella и/или Clostridium sp. или другие инфекционные агенты.

Пример 2.

Цели этого проекта состояли в том, чтобы 1) обнаружить потенциальный(ые) патоген(ы) в образцах от поросят с врожденным тремором и 2) разработать модель инфекции для воспроизведения болезни. Используя следующее поколение секвенирования у поросят с врожденным тремором был обнаружен дивергентный родственный пестивирус. Первоначально вирус был близкородственным с пестивирусом летучих мышей, но теперь он является близкородственным с новым свиным пестивирусом, информация о котором недавно была опубликована, условно названным атипичным свиным вирусом. Количественная ПЦР в реальном времени обнаружила вирус в образцах новорожденных поросят с врожденным тремором на двух разных фермах, но не обнаружила в образцах не пораженных поросят той же фермы. Для выполнения второй задачи беременным свиноматкам инокулировали либо сывороткой, содержащей пестивирус, либо PBS (контроль) внутривенным и интраназальным путем одновременно с прямой инокуляцией эмбриональных амниотических пузырей с помощью ультразвуковой хирургической методики. Прививки проводили на 45 или 62 день беременности. Все свиноматки, которым инокулировали новый пестивирус, поросились поросятами, пораженными врожденным тремором, тогда как те, которым в качестве контроля инокулировали PBS, не были поражены. Степень тяжести тремора у каждого поросенка оценивали по видеороликам, сделанным в 0, 1 и 2 дни после рождения. Степень тремора оставалась относительно постоянной в течение от 0 до 2 дня после рождения для большинства поросят. Распространенность врожденного тремора в помете, инокулированном пестивирусом, изменялась от 57% (4 из 7 пораженных поросят) до 100% (10 из 10 пораженных поросят). Вирус последовательно обнаруживали с помощью ПЦР в

- 36 036116 тканях поросят с врожденным тремором, но он не был обнаружен у контрольных поросят. Образцы, положительные по данным ПЦР у более 90% поросят, включали ствол головного мозга (37 из 41), брыжеечный лимфатический узел (37 из 41), трахеобронхиальный лимфатический узел (37 из 41) и цельную кровь (19 из 20). Хотя первое описание врожденного тремора было сделано в 1922 г., это первый зарегистрированный помет с врожденным тремором после экспериментальной инокуляции дивергентным родственным свиным пестивирусом. Для лучшего понимания патофизиологии врожденного тремора, вызванного этим пестивирусом, необходимы исследования, изучающие механизм заболевания, эпидемиологию и диагностический анализ.

Секвенирование следующего поколения.

Были получены разнообразные ткани свиней (сыворотка, головной мозг, мозжечок, спинной мозг, цереброспинальная жидкость (CSF) и/или легкое) из трех диагностических исследований СТ: легочная ткань от одного поросенка (ID 20130103); либо объединили мозговую ткань, либо объединили легочную ткань от шести поросят (ID 20120705); и CSF (n=2, ферма В), сыворотка (n=2, ферма А и В) и легкие (n=2; ферма А и В) из шести разных поросят, происходящих из двух разных ферм (ID 2014016573). За исключением ткани легких из образца ID 20120705, во всех испытуемых образцах была обнаружена по меньшей мере частичная геномная последовательность пестивируса. Сыворотка и тканевые гомогенаты ресуспендировали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (Corning-Cellgro) и обогащали защищенными нуклеиновыми кислотами вирусных частиц путем ферментации комбинацией нуклеаз: РНКазой А (Invitrogen), ДНКазой Baseline Zero (Epicentre) и ДНКазой Turbo (Invitrogen). Вирусные нуклеиновые кислоты экстрагировали в соответствии с протоколом производителя, используя набор для крови Qiagen Viral RNA. После экстракции нуклеиновые кислоты затем обрабатывали ДНКазой Turbo для удаления ДНК хозяина или вероятной вирусной ДНК, таким образом дополнительно обогащая вирусной РНК. Двухцепочечную кДНК получали посредством обратной транскрипции и обработкой Кленова (NEB), используя прайминг со случайными гексамерами.

Образцы обрабатывали для секвенирования на основе MiSeq посредством создания библиотеки с использованием набора для подготовки библиотеки NextEra XT (Illumina) в соответствии с предлагаемым протоколом изготовителя, заменяя колоночное элюирование (Qiagen, MinElute) на нормализацию бусами. Библиотеку пускали на MiSeq, используя набор с 500 циклами (Illumina), и данные анализировали, используя комбинацию NextGene (версия 2.3.4.2) и программное обеспечение Sequencher (версия 5.1). Выбирали последовательности высокого качества как последовательности, которые содержат медианный критерий Q более 25, и обрезали с отсечением не более 3 непривлеченных оснований на 3'-конце или 3последовательных оснований с критерием Q, с оценкой менее 16. Последовательности, собранные de novo, анализировали путем сравнения с последовательностью из GenBank с помощью BLASTn и BLASTx. Выравнивание ClustalW использовали для филогенетического анализа 215 аминокислотной последовательности гена NS3 и 170 аминокислотной последовательности гена Npro. Соседние филогенетические деревья были созданы из 1000 реплик с использованием программного обеспечения MEGA 6.0.

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (ОТ-кПЦР).

Была разработана ОТ-кПЦР, нацеленная на область N3S генома дивергентного пестивируса. Образцы тканей (n=362) растущих свиней, которые были представлены в State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU VDL) для рутинного диагностического тестирования, использовали для определения количества пестивируса в этом наборе образцов. Два набора образцов также собирали с ферм с врожденным тремором. Эти образцы включали сыворотку, головной мозг, мозжечок, ствол мозга и спинной мозг. Первый набор (ферма А) состоял из 6 пораженных и 2 непораженных вскормленных на грудном молоке поросят, сыворотки из пяти свиноматок, из которых были отобраны вскормленные на грудном молоке поросята, а также 5 пораженных и 2 непораженных поросят в возрасте от 6 до 14 дней. Второй набор (ферма В: ISUVDL2014016573) состоял из 5 пораженных свиней с неизвестным статусом вскармливания и сыворотки от пяти свиноматок с пораженными поросятами.

Набор для количественного одностадийного RT-PCR (набор One-Step Kit iTaq Universal, BioRad, № 172-5141) использовали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл экстрагированной общей нуклеиновой кислоты, 1,0 мкл зонда (2 мкМ), 1 мкл каждого праймера (5 мкМ), 12,5 мкл смеси 2xRTPCR, 0,5 мкл обратной транскриптазы iScript и 7,0 мкл воды, обработанной DEPC (табл. 2). Реакцию проводили с использованием системы детекции PCR в режиме реального времени CFX96 (BioRad) при следующих условиях: начальная обратная транскрипция при 50°C в течение 10 мин с последующей начальной денатурацией при 95°C в течение 3 мин, 40 циклов денатурации при 95°C в течение 15 с и отжигом и удлинением при 57°C в течение 30 с. Для получения количественных показателей пестивирусный ультрамер включали в каждый прогон (Integrated DNA Technologies), включая область NS3, нацеленный на праймеры. Отсечение для положительных образцов было установлено при значениях количественного определения цикла (Cq) ниже 36.

- 37 036116

Таблица 2

Праймер, зонд и ультрамерные последовательности для ПЦР в реальном времени

Последовательность
Pesti_6332_F	TGC CTG GTA TTC GTG GC (SEQ ID NO:23)
Pesti_6455_R	TCA TGC CAT GTT CCA GAG T (SEQ ID NO:24)
Pesti_6351_P	/5Cy5/CCT CCG TCT CCG CGG GTT TGG /3BHQ_2/ (SEQ ID NO:25)
Pesti_ultra	AAC AGG AAA GAA CTG CCT GGT ATT CGT GGC AAC CAA AGA AGG CGG GGA GAG GGA GGC TAA AGA ACT GCG GAG GAG AGG AAT TAA CGG САС СТА TTC AGG TAT AGA CCG TAA GAG TCT GGA AGA TGG GAT GAG CAA TCA GGC AT (SEQ ID NO:26)

Модель инокуляции свиноматок.

Животные.

Все процедуры были одобрены the Institutional Animal Care and Use Committee of Iowa State University (Log Number: 1-14-7907-S 2). Восемь индивидуально идентифицированных кросс-бредных свиноматок на 38-й день беременности получали из коммерческого источника без СТ в анамнезе. Сыворотка от всех свиноматок была отрицательной на PCV2a, PCV2b, PRRSV, PPV1, PPV5 и новый пестивирус ОТ-кПЦР перед отгрузкой и инокуляцией. Индивидуальные свиноматки были случайным образом распределены по одной из трех групп, размещенных отдельно [ложные прививки делали на 45 день беременности (n=1) и на 62 день беременности (n=1), инокулировали пестивирусом на 45 день беременности (n=3) и инокулировали пестивирус на 62 день беременности (n=3)], и в течение всего периода исследования кормили полноценной диетой.

Инокуляция животных.

У свиноматок забирали корм и воду за 12 ч до операции, чтобы снизить риск анестезирующей регургитации. Терминальную сыворотку свиньи с виремией (ISUVDL2014016573) оттаивали при 37°C. Общую нуклеиновую кислоту экстрагировали и подвергали скринингу ПЦР на присутствие PCV2a, PCV2b, PRRSV, PPV1, PPV5 и пестивируса; был обнаружен только пестивирус (Cq=27,47). Сыворотку в объеме 0,2 мкм фильтровали и разбавляли, добавляя 6 мл сыворотки до 35 мл 1xPBS (Gibco). В день инокуляции инокулят оттаивали и держали на льду во время процедуры инокуляции. Общую анестезию начинали с внутримышечной инъекции комбинации тилетамина и золазепама (TELAZOL®), кетамина и ксилазина. После начала анестезии каждую свиноматку помещали в левый бок, а правую часть живота подготавливали для асептической лапаротомии. Живот закрывали для операции, и место разреза блокировали 2% лидокаином перед рассечением. Делали парамедиальнный разрез размером приблизительно 30 см на 5 см сбоку от ткани молочной железы, чтобы получить доступ к брюшной полости. Матку временно выводили на поверхность тела, и использовали стерильный ручной векторный линейный ультразвуковой преобразователь для визуализации каждого зародыша и направляли иглу для инокуляции в эмбриональную амниотическую везикулу. В каждую везикулу инокулировали 0,25 мл инокулята (PBS или пестивирусную сыворотку), используя иглу малого калибра (22 g) (S2 МР4). Брюшную стенку закрывали в трех слоях, используя шов полиглактина 910 размером 2. Инокулят также вводили непосредственно в свиноматку интраназальным (2 мл) и внутривенным (2 мл) путем сразу же после хирургической процедуры. Единичные дозы мелумина флуниксина (BANAMINE-S®) и кристаллической свободной цефтиофуровой кислоты (EXCEDE®) вводили внутримышечно сразу после закрытия и перед обезболиванием. Анастезия первой свиноматки начиналась в 8:30 утра в соответствующий день операции. Каждая процедура занимала приблизительно 1 ч. Анастезию последней свиноматки начинали 11:30.

Клинические наблюдения, сбор образцов и вскрытие.

После инокуляции проводили ежедневный мониторинг свиноматок, а ректальную температуру измеряли через 0-7 дней после инокуляции (DPI). Фекальный материал, кровь и мазки из носа собирали у свиноматок на 2, 7, 10 и 14 DPI, а затем еженедельно перед тем как они поросились. Во время их опороса поросят индивидуально идентифицировали и брали сыворотку, мазки из носа и фекальные мазки. У субпопуляции поросят (n=7) собирали кровь из пуповины. Каждого поросенка снимали на видео ежедневно с 0 по 2 день после опороса (DPF). Четыре исследователя из слепых групп просматривали видеоролики, и каждый поросенок получал оценку тяжести тремора: 0 - отсутствует, 1 - мелкая мускулатурная фасцикуляция, 2 - легкий тремор, 3 - умеренный тремор, 4 - сильный тремор с выраженным подпрыгиванием. Затем оценки усредняли, назначая каждому поросенку общий показатель тяжести тремора по DPF. Поросят, получивших оценку >0,75 на DPF 2, считали пораженными. Наличие или отсутствие дисплазии тазобедренного сустава также записывали на каждом DPF для каждого поросенка. Свиноматок и поросят подвергали эвтаназии на DPF 2 с помощью пистолета с выдвигающимся ударным стержнем и инъекцией сверхдозы барбитурата соответственно. При вскрытии берут образцы сыворотки поросят, головного моз- 38 036116 га, мозжечка, ствола головного мозга, спинного мозга, почек, брыжеечного лимфатического узла, трахеобронхиального лимфатического узла, тимуса, сердца и селезенки. У субпопуляции поросят брали цельную кровь (пробирки ЭДТА, n=20) и CSF (n=29). Сыворотку свиноматок также собирали при вскрытии.

Идентификация пестивируса.

Секвенирование следующего поколения.

Благодаря использованию технологии секвинирования следующего поколения вирус, близкородственный пестивирусу Китайских летучих мышей, а теперь, как известно, более близкородственный недавно описанному пестивирусу, предварительно обозначенным как атипичный вирус свиней, был обнаружен в трех независимых исследованиях врожденного тремора. Почти полный геном был получен из одного из трех исследований. Этот вирус в сыворотке от виремического животного впоследствии использовали для инокуляции животных в этом исследовании. Филогенетический анализ NS3 и Npro подтверждает классификацию вируса, идентифицированного в настоящем описании как представитель предположительного вида атипичного свиного вируса (фиг. 5), с 88,0 и 94,6% нуклеотидами и аминокислотами соответственно. Ретроспективный анализ ренивирусной РНК с помощью ОТ-кПЦР из случаев, представленных в ISU VDL, показал, что 21 из 362 образцов (6%) были положительными. Эти случаи были обычными данными стад, испытывающих различные клинические признаки.

ОТ-кПЦР.

Образцы от поросят с врожденным тремором и от непораженных когорт собирали из двух ферм, ферма А и ферма В. Животные, у которых был диагностирован врожденный тремор, были положительными на пестивирус с помощью ОТ-кПЦР, но вирус не был обнаружен в центральной нервной ткани или сыворотке непораженных поросят (табл. 3). Вирус был обнаружен в сыворотке из одной свиноматки из фермы А.

Таблица 3 Количественные результаты ПЦР в реальном времени для образцов от поросят из фермы А и фермы В ________________Вид образца_____________________________________

Ствол головного

Головной мовг Мозжечок мозга Спинной мозг Сыворотка

Ферма	ID ЖИВОTH	Состояни
е	SQ	Cq	SQ	Cq	SQ	Cq	SQ
болезни*	Cq^b	SQ^C	Cq
	Pl	-	U^d	0	и	0	и	0	и	0	и	0
	Р2а	+	и	0	34,18	3,95Е+02	35,93	1,36Е+О2	33,39	6,38Е+02	30,64	1,14Е+05
	Р2В	+	и	0	35,92	1,37Е+02	и	0	35,53	1,74Е+02	30,14	1,47Е+05
	Р4а	+	и	0	32,44	1,13Е+03	и	0	36, 51	9,56Е+01	36, 44	6,62Е+03
	Р4Ь	+	и	0	29,37	2,14Е+05	35,41	1,87Е+02	и	0	30,97	9,71Е+04
	Р5а	-	и	0	и	0	и	0	и	0	и	0
	Рба	+	и	0	33,65	4,76Е+02	и	0	33,89	4,71Е+02	и	0
А	Р6Ь	+	и	0	28,75	2,89Е+05	и	0	и	0	31,37	8,00Е+04
	1	+	32,65	1,00Е+03	и	0	и	0	35,65	1,61Е+02	30,92	1,05Е+05
	2	+	и	0	32,31	1,23Е+05	и	0	35,72	1,54Е+02	30,77	1,13Е+05
	3	-	и	0	и	0	и	0	и	0	и	0
	4	-	и	0	и	0	и	0	и	0	и	0
	5	+	и	0	30,50	3,69Е+03	и	0	35,90	1,38Е+02	33,97	2,31Е+04
	б	+	НО^е	НО	НО	НО	НО	НО	НО	НО	29,40	2,23Е+05
	7	+	и	0	32,39	0	и	0	и	0	31,29	8,74Е+04

	20	+	26, 59	8,36Е+05	24,04	2,92Е+06	24,56	2,27Е+06	25,50	1,42Е+06	26, 04	1,09Е+06
В	21	+	30,92	9,96Е+04	26,25	9,89Е+05	27,41	5,5 8Е+05	26, 14	1,04Е+06	22,26	6,98Е+06
	22	+	25,79	1,24Е+05	29,32	2,19Е+05	27,31	5,85Е+05	26, 14	1,04Е+06	22,25	7,04Е+06
	23	+	27,51	5,31Е+05	23,45	3,91Е+06	26,43	9,05Е+05	24,46	2,38Е+06	22,47	6,31Е+06
	24	+	27,93	4,34Е+05	24,13	2,79Е+06	27,25	6,05Е+05	24,10	2,38Е+06	22,25	7,04Е+06

^a Присутствие (+) или отсутствие (-) врожденного тремора.

^b Cq=значение цикла количественных показаний.

^c SQ=начальное количество.

^-'необнаруженный после 40 циклов.

^e HO-Не определено.

Модель инокуляции свиноматок.

Наблюдения и образцы свиноматок.

У одной ложно инокулированной свиньи на 45 день беременности развивалась умеренная лихорадка после операции и у нее был выкидыш на 3 и 4 DPI. Было обнаружено, что свиноматка из группы, которую нужно прививать через 45 дней беременности, не была беременна во время инокуляции; она была удалена из исследования. Ложно инокулированные и инокулированные пестивирусом свиноматки не проявляли клинических симптомов, и, кроме того, у них не развивалась обнаруживаемая виремия или

- 39 036116 вирус не распространялся до уровней, определяемых ОТ-кПЦР. Все свиноматки поросились естественным образом. Один поросенок был мертворожденным (свиноматка с идентификационным номером

3661), а один плод был мацерированным (свиноматка с идентификационным номером 3500).

Наблюдения за поросятами и образцы.

У ложно инокулированных поросят не было клинических признаков, согласующихся с СТ на DPF 0, 1 или 2 (S4 МР4). Большинство поросят, которым на эмбриональной стадии инокулировали пестивирус на 45 или 62 день беременности, имели клинические признаки, соответствующие СТ (S4 МР4).

Распространенность врожденного тремора (S5 МР4) и дисплазии тазобедренного сустава (S6 МР4) в помете, инокулированном пестивирусом, варьировала от 57 до 100% и от 0 до 40% на DPF 2 соответственно (табл. 4). Тяжесть тремора изменялась в пометах поросенка, но оставалась относительно постоянной в течение двухдневного периода наблюдения у большинства поросят (табл. 5).

Таблица 4

Распространенность врожденного тремора и дисплазия тазобедренного сустава у помета, _____________инокулированного пестивирусом, на второй день рождения_____________

	Врожденный тремор	Дисплазия тазобедренного сустава
Идентификационный	Номер		Номер
номер	пораженного^		пораженного/номер
свиноматки/день	/номер в	Распространенность	в помете	Распространенность
беременности³·	помете	(%)		(%)

4036/45	5/8	62,5	1/8	12,5
3992/45	7/9	77, 7	2/9	22,2
3661/62	4/6	66, 6	0/6	0, 0
3500/62	10/10	100	4/10	40, 0
4023/62	4/7	57,1	0/7	0, 0

^a День беременности во время инокуляции.

^b Поросят считали пораженными врожденным тремором, если показатель тяжести тремора составлял >0,75.

Таблица 5

Оценка врожденного тремора по поросятам и дням после рождения

	Средний	показатель
тяжести	тремора
Идентификационный	номер
свиноматки/инокуляция/день	ID
беременности³		живоTH.	DPI* 0	DPF 1	DPF 2
		71	0	0	0
		72	0,25	0	NA
		73	0	0	0
2427/PBS/62		74	0,50	0	0
		75	0	0	0
		124	0,25	0,5	0
		125	0	0	0
		31	2,00	0	0,75
		32	0,25	0,25	0
		33	3,50	4,00	4,00
		34	0,50	0	0
4036/пестивирус/45		35	3,75	4,0	4,0
		36	3,75	4,0	4,0
		37	1,00	0	0,25
		38	3,50	3,5	3,5
		40	4,00	3,25	3,25
		41	0,25	0	0
		42	3, 00	1,75	1,5
		43	2,00	0,25	0,25
3992/пестивирус/45		44	2,50	1,50	1,75
		45	3, 00	3,75	4,00
		46	3,25	2,50	2,75
		47	2,25	1,25	1,25
		48	3, 00	2,00	2,50
		94	1,00	2,5	3, 0
3661/пестивирус/62		95	0	NA	NA
		96	2,00	3, 00	3,25

- 40 036116

	97	0,75	0	0
	98	2,50	2,0	2,5
	99	2,25	2,50	2,25
	100	0	0	0,25
	89	2,75	2,75	3,25
	90	3,75	3,25	3,50
	111	3,50	3, 00	2,50
	112	1,75	NA	NA
	113	2,50	2,50	3, 00
3500/пестивирус/62	116	3,25	3,75	4,00
	117	3,50	3,25	3,25
	118	3,25	4,00	3,75
	121	2,75	1,75	3, 00
	122	2,00	2,75	2,75
	123	3, 00	2,75	2,75
	114	0,50	0	0,50
	115	1,50	3,50	4,00
	119	1,00	1,50	2,25
4023/пестивирус/62	120	0	0	0,25
	130	1, 00	0,50	2,25
	131	0	1, 00	0
	132	1,75	0,25	0,75

^a День беременности во время инокуляции. ^b DPF=дней после опороса.

Вирусные нуклеиновые кислоты экстрагировали из тканей, сывороток и цельной крови, собирали и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Хотя ни в какой из тканей помета, инокулированных плацебо, не было обнаружено пестивируса, почти все животные из экспериментально инокулированной группы были положительными по меньшей мере в одной ткани. Тропизм ткани был широким, так как РНК пестивируса была обнаружена в сыворотке (26 из 41), мазке из носа (12 из 41), фекалиях (14 из 41), терминальной сыворотке (34 из 41), головном мозге (30 из 41 ), мозжечке (36 из 41), стволе головного мозга (37 из 41), спинном мозге (33 из 41), почке (35 из 41), брыжеечном лимфатическом узле (37 из 41), трахеобронхиальном лимфатическом узле (36 из 41), тимусе (37 из 41), сердце (35 из 41) и селезенке (37 из 41) с помощью ОТ-кПЦР у поросят, рожденных живыми, инокулированных пестивирусом (фиг. 6); вирусную РНК не обнаруживали в таких же образцах PBS-инокулированных поросят. Кроме того, РНК пестивируса была обнаружена в пуповинной крови (5 из 7), цельной крови (19 из 20) и цереброспинальной жидкости (26 из 29) субпопуляции поросят (фиг. 6). Среднее значение Cq сыворотки, мазков из носа, цереброспинальной жидкости, брыжеечного лимфатического узла, трахеобронхиального лимфатического узла, селезенки и пуповинной крови было меньше 26. Среднее значение Cq фекалий, терминальной сыворотки, мозжечка, спинного мозга, почки, тимуса и сердца измерялось от 26 до 28. Мозжечок, ствол мозга и цельная кровь имели самые высокие средние значения Cq (>28). Наиболее часто РНК пестивируса обнаружилась (>90% взятых образцов) в стволе головного мозга, брыжеечном лимфатическом узле, трахеобронхиальном лимфатическом узле и цельной крови; реже (от 80 до 90% взятых проб) в терминальной сыворотке, мозжечке, спинном мозге, цереброспинальной жидкости, почке, тимусе, сердце и селезенке; и реже всего (от 29 до 74% взятых проб) в сыворотке, назальных секретах, фекалиях, головном мозге и пуповинной крови. Сыворотка двух животных (35 и 90) была случайно выбрана для оценки геномной стабильности путем полного секвенирования генома. Оба животных имели идентичные 7 фиксированные изменения в 7 нуклеотидах родительского штамма, приводящие к четырем консервативным изменениям аминокислот. При анализе данных глубокого секвенирования исследуемого материала в каждом из этих положений наблюдалось доказательство полиморфизма.

Обсуждение.

Синдром СТ был впервые зарегистрирован почти 100 лет назад; тем не менее, большинство современных вспышек заболевания были связаны с неидентифицированным вирусом. Используя секвенирование следующего поколения, новый возбудитель, первоначально идентифицированный как близкородственный с пестивирусом летучих мышей, был обнаружен в образцах поросят с СТ.

Был разработан ОТ-кПЦР, нацеленный на N3S-часть генома дивергентного пестивируса, чтобы обнаружить вирусную РНК во множестве образцах различного типа. Ретроспективный анализ выявил РНК пестивируса с помощью OT-rGWH в 6% (21 из 362) образцов стада с различными клиническими симптомами, что свидетельствует о том, что вирус в тканях этого набора образцов слабо распространен. Образцы исследования с инокуляцией отбирали на основании клинических симптомов СТ и распределения тканей и сайтов репликации CSFV. Образцы тканей поросят с СТ двух неродственных ферм содержали

- 41 036116 вирусную РНК, которая была последовательно обнаружена в сыворотке и в ткани центральной нервной системы, что указывает на то, что вирус имеет системное распределение при клиническом влиянии на функцию центральной нервной системы. Это также подтверждается распределением в ткани вирусной РНК у поросят, инокулированных пестивирусом. Специфический сайт репликации определен не был, так как все тестируемые ткани имели одинаковые уровни обнаруживаемой РНК пестивируса. На этом основании можно предположить, что репликация вируса происходит системно и может включать мононуклеарные клетки периферической крови или эндотелиальные клетки, сходные с CSFV.

Пестивирус, используемый для этой модели инокуляции, был виремической сывороткой, поскольку попытки in vitro культивирование вируса не были успешными. Иммунный статус свиноматок в этом исследовании неизвестен из-за отсутствия серологического анализа нового вируса. Чтобы избежать возможного влияния антипестивирусных антител у свиноматкок, непосредственно инокулировали эмбриональные амниотические пузырьки, так как плацента свиньи не дает проникать антителам от матери к плоду.

Несмотря на то, что в результате хирургической процедуры у одной из PBS-инокулированных свиноматок был аборт, клинических различий между свиноматками и свиноматками, инокулированных пестивирусом, не наблюдалось. По имеющимся данным, мертворожденные, мумифицированные или мацерированные плоды отсутствуют при вспышках СТ. Один мертворожденный плод в одном из помета и один мацерированный плод в другом помете свиноматок, инокулированных пестивирусом, считались случайными и, вероятно, не связанными с инфекцией плода. Несмотря на IN и IV инокуляции у свиноматок не развивалась обнаруживаемая виремия или вирус не распространялся до уровней, определяемых ОТ-кПЦР. Поэтому либо свиноматки не были заражены после заражения, либо доступные диагностические тесты были недостаточными для обнаружения инфекции.

Для того чтобы СТ проявился, вполне вероятно, что инфекция плода должна произойти до развития иммунокомпетентности плода, которая происходит у поросят в период приблизительно от 70 до 80 дней беременности. В этом исследовании плоды как на 45, так и на 62 день беременности были восприимчивы к инфекции дивергентным пестивирусом, что приводило к СТ у большинства инфицированных поросят. Выбор этих двух временных точек гестации был основан на приблизительной виремии этого пестивируса на основе CSFV, имевшего место до развития иммунитета плода (45 день беременности) и развития центральной нервной системы плода (62 день беременности). Утробные инфекции пестивируса у других видов в разные временные точки гестации имеют разные клинические результаты, включая репродуктивную недостаточность, врожденные пороки развития или иммунотолерантность, при которых хронически инфицированное животное может распространять вирус на протяжении всей жизни. В этом исследовании родилось несколько поросят, зараженных пестивирусом, с дисплазией тазобедренного сустава. Это состояние обычно наблюдается у свиней; однако патогенез и этиология в настоящее время активно обсуждаются. Роль, если таковая имеет место, пестивируса в развитии дисплазии тазобедренного сустава, репродуктивной недостаточности у свиноматок или способность утробной инфекции давать хроническую инфекцию у животных, требует дополнительного исследования.

В целом, клиническое заболевание, воспроизведенное в настоящем описании, имитирует естественные вспышки заболевания с изменением распространенности СТ среди пометов и тяжестью клинических симптомов в пометах. Вирусная РНК была обнаружена у всех поросят с СТ. Более того, вирусная РНК была обнаружена у 41 из 42 живых поросят, инокулированных пестивирусом. Из рожденных живыми поросят, инокулированных пестивирусом, у одиннадцати не было СТ на DPF 2 или DPF 0 (95), и вирусная РНК была обнаружена у всех зараженных пестивирусом непораженных поросят, кроме одной (95). Тем не менее, механизм дисфункции центральной нервной системы у большинства поросят, но не у всех инфицированных поросят, в настоящее время неизвестен. Экология и патогенез взаимодействия с хозяином-вирусом на данный момент не определены, но озадачивают. Исследование роли хронической инфекции или дисфункционального иммунного ответа в клиническом выражении СТ и механизма дисфункции центральной нервной системы является оправданным. Литература, касающаяся механизмов треморных расстройств у людей и животных, ограничена, несмотря на высокую распространенность и важность такой симптоматики в медицине и ветеринарии.

В этом исследовании был идентифицирован недавно описанный дивергентный пестивирус свиньи у поросят с СТ и в непораженных когортах и использован этот вирус для воспроизведения СТ путем разработки инновационной методики инокуляции. Успешная разработка методик выделения вирусов, специфических анализов с антителами, методик детекции in situ и усовершенствованные молекулярные инструменты, несомненно, приведут к лучшему пониманию патогенеза и эпидемиологии этого вируса.

Пример 3.

Целью этого исследования является оценка эффективности пестивирусной вакцины при введении пестивируса наивным или серонегативным самкам.

План исследования.

В этом эксперименте было использовано 10 самок. Самок рандомизировали на три группы. Животных 1-й группы (n=4) вакцинировали на DO и D14 с помощью прототипные пестивирусной вакцины непосредственно перед или вскоре после скрещивания. Животные 2-й группы (n=4), вакцинировали плаце

- 42 036116 бо прототипной вакциной. Животные 3-й группы (n=2) оставались невакцинированными (строгий контроль). Животные в каждой группе находились в отдельных комнатах. Примерно через 42 дня беременности самок групп 1 и 2 заражали пестивирусом таким путем, как внутривенная, внутримышечная, интраназальная, внутривагинальная или внутриматочная инокуляция. Следуя задаче, у самок ежедневно контролировали клинические симптомы на протяжении всего исследования. Дважды в неделю на протяжении беременности собирали образцы сыворотки, фекалий и брали мазки из носа. Примерно через 80 дней беременности всем свиноматкам проводили ультразвуковую оценку. Во время опороса поросят визуально оценивали на наличие клинических симптомов. Для обнаружения пестивируса собирали сыворотку, пуповинную кровь и плаценту. Поросят обрабатывали и делали видеозаписи. Поросят оставляли со свиноматкой. Поросят, достигших возраста 24 ч, визуально оценивали на наличие клинических симптомов и фиксировали на видеозаписи. Поросят подвергали эвтаназии в возрасте 48 ч. Перед эвтаназией поросят визуально оценивали на наличие клинических симптомов и делали видеозапись. Отобранные ткани и кровь собирали во время вскрытия. Образцы подвергали скринингу на наличие РНК пестивируса и антитела против пестивируса.

Таблица 6

Организация эксперимента

Группа	η	Вакцинация (DO, D14)	Заражение (~42 дня беременности)
1	4	Прототипная пестивирусная вакцина	Да
2	4	Отсутствует	Да
3	2	Строгий	Нет

Таблица 7

День исследования	День события
TBD	- Самок доставляют в ISU - Оценка самок
DO- D14	- Кормовая основа для всех самок - Ежедневные клинические наблюдения

- 43 036116

D18-D24	- Проверка эструса с прогибом спины и скрещивание всех самок
DO, D14	- Вакцинация самок - Сбор образцов сыворотки, фекалий и взятие мазков из носа перед вакцинацией
D54	- Проверка на беременность у всех самок
D66 (-день 42 беременности )	- Заражение самок - Сбор образцов сыворотки, фекалий и мазка из носа перед заражением
-D137 (день опороса)	- Ожидаемая дата опороса - Обработка поросят - Видео всех поросят во время опороса - Сбор пуповинной крови и плаценты - Коллекция образцов крови, назальных и фекальных образцов от поросят
-D138 (24 часа после опороса)	- Видео всех поросят во время опороса - Коллекция образцов крови, назальных и фекальных образцов от поросят
~ D139 (48 часов после родов)	- Видео всех поросят во время опороса - Коллекция образцов крови, назальных и фекальных образцов от поросят - Вскрытие всех поросят и свиноматок (сбор тканей)

Для проведения слепого анализа лицо (администратор), вводящее вакцину по настоящему изобретению и осуществляющее контроль, не было одним и тем же лицом, ответственным за клиническое наблюдение и взятие образцов у исследуемых животных. Лабораторные испытания были такими же, как описано в примере 2.

Пример 4.

Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы определить возможность индукции серологического ответа, специфичного для пестивируса, после введения инактивированной цельной вирусной вакцины. В частности, наивные животные подвергались внутримышечной инъекции концентрированного инактивированного вируса и оценивались с помощью серологического ELISA до и после вакцинации.

Был обнаружен новый вирус наиболее близкородственный с пестивирусом летучих мышей с помощью технологии глубокого секвенирования в нескольких случаях исследования вспышек заболевания. Клинический анамнез этих случаев включал врожденный тремор (2 случая), анемичных поросят (1 случай) или поросята с прогибом в спине, что, как считается, связано с PCVAD (1 случай). На основании полученных данных был разработан кПЦР, а распространенность идентифицированного вируса была определена в двух наборах образцов, собранных в Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU VDL). Было обнаружено, что предполагаемая распространенность составляет 7,3% (8/110) в наборе гомогенатов легких и 5,2% (13/252) в наборе клинических образцов случаев с полисерозитом в анамнезе. Дополнительные образцы двух ферм с клиническим анамнезом врожденного тремора были собраны в сотрудничестве с преподавателем ISU VDL (д-р Паулу Арруда). Эти образцы были использованы для инокуляции свиней и была получена сыворотка, содержащая высокие уровни вируса (пример 1). В последующем исследовании было показано, что внутриматочная инокуляция сыворотки беременным самках привела к высокому проценту свиней, рожденных с врожденным тремором (пример 2). Благодаря способности пестивируса вызывать клиническое заболевание, существует интерес в разработке вакцины. В это исследование была включена обычная инактивированная вакцина.

Обычная инактивированная вакцина включена в исследование. Кроме того, в исследование включен вирусный вектор. Поскольку использование живых вирусных векторов для экспрессии соответствующих антигенов является ключевым компонентом стратегии Lead2Grow, это исследование обеспечит оценку вектора у свиней. В этом исследовании использован аденовирусный вектор собак (CAV-2, лицензированный для использования в Solo-Jec CAV-2), экспрессирующий белок Е2 пестивируса. Вектор яв- 44 036116 ляется репликационным компетентным вектором, и по-видимому, вызывает обширный длительный иммунный ответ. В качестве контроля конструкции включена дополнительная конструкция CAV, экспрессирующая ген НА гриппа А.

Критерии включения животных.

Поскольку исследование проводилось на животных, родившихся в условиях BSL2, и серологические анализы в настоящее время недоступны для пестивируса, то предварительный скрининг образцов сыворотки не проводился. Только свиньи, здоровые во время вакцинации, были включены в исследование. Если во время вакцинации исследователь замечал нездоровое животное, то этих животных не вакцинировали и подвергали гуманной эвтаназии.

Уход за животными.

Всех животных размещали в вивариях при Sioux Center, IA, на протяжении всего исследования. Животных вскармливали на коммерческом рационе, который соответствовал их размеру, возрасту и состоянию в соответствии с приемлемыми методами животноводства в данном регионе (могут быть включены антибиотики). Вода была доступна ad libitum. Пол и место для корма удовлетворяли требованиям, изложенным в соглашении Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Agricultural Research and Teaching, третье издание, январь 2010.

Никакие другие биологические или фармацевтические продукты не вводились испытуемым животным без предварительного одобрения с помощью монитора исследования.

Критерий удаления после включения.

Любое умирающее животное подвергалось эвтаназии по усмотрению наблюдающего ветеринара/исследователя. Умирающее животное определяли как животное, которое отказывается от еды или питья или сильно обезвожено из-за тяжелых клинических симптомов. Любое животное, которое погибло или подвергалось эвтаназии в течение всего периода исследования, вскрывалось ветеринаром. Вскрытие проводили, как описано ниже. Наблюдатель и исследователь консультировались для определения того, были ли данные от удаленных исследуемых животных включены в анализ данных и окончательный отчет.

Уход за животными.

Все животные подвергались гуманной эвтаназии, учитывались и утилизировались путем сжигания в конце исследования. Все процедуры были выполнены, как описано для SOP.

Организация эксперимента.

Общее описание.

Этот эксперимент был разработан для оценки серологического ответа прототипных пестивирусных вакцин у обычных животных. См. табл. 8 ниже для объяснения экспериментальных групп.

Во время отъемки шесть животных в возрасте 6 недель рандомизировали в 1 и 2 группу, и им вводили дозу 2 мл либо вакцины, либо плацебо в соответствии с табл. 8. Животных рандомизировали и объединяли в отдельные клетки в одной комнате. Животные в 3 группе были соединены в отдельной комнате. Общие наблюдения за состоянием здоровья регистрировали на протяжении всего исследования и никаких побочных реакций не наблюдали. Примерно через 14 дней после вакцинации сыворотку собирали и выдерживали при 4°C до завершения обработки для серологической оценки. Бустерную вакцинацию идентичных материалов вводили через 21 день после первичной вакцинации. Сыворотку животных собирали через 13 дней после бустерной инъекции (день 34).

Образцы сыворотки анализировали на наличие сероконверсии, когда анализы стали доступны. Пероральные образцы, мазки носа и фекальные мазки собирали у свиней ежедневно в группе 3 с D0 по D7. Образцы анализировали на наличие живых CAV. Места инъекций наблюдали на реакции в течение минимум трех дней после введения вакцины. Животным проводили эвтаназцию в конце испытания. См. табл. 9 ниже, чтобы ознакомиться с подробностями исследовательских мероприятий и конкретными деталями процедуры.

Таблица 8

Организация эксперимента

Групп а	Комната	N (поросята)	Вакцинотерапия (6 и 9 недель после опороса)	Доза/спосо б введения
1	1	4	Вакцина с прототипом инактивированного пестивируса	2 мл/1М

- 45 036116

2	1	8	Плацебо (забуференный фосфатом физиологический раствор+12,5% эмульсиген D)	2 мл/IM
3	2	~7	Прототипная вакцина Pesti-CAV-2	2 мл/IM

Таблица 9

Расписание ключевых событий по комнатам

День исследования	День события	Испытание
TBD	- Осуществление GHO ежедневно до D0	Отсутствуют
D0	- Вакцинация #1 - Наблюдения за участками инъекций в течение трех дней после вакцинации - Сбор сыворотки у всех имеющихся животных	Образец сыворотки: серологический анализ
DO, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7	- Сбор пероральных, назальных и фекальных мазков от животных в группе 3	Образцы образцов: образцы, сохраненные для будущих испытаний/оценки снижения веса
D21	- Вакцинация #2 - Сбор сыворотки у животных - Наблюдения за участками инъекций в течение трех дней после вакцинации	Образец сыворотки: серологический анализ
D0-D35	Общие наблюдения за состоянием здоровья (1 раз в день)	Отсутствуют
D35	- Вскрытие - Сбор терминальной сыворотки (1x250 мл флакон) у всех животных	Образцы сыворотки: серологический анализ

Вакцинный материал.

Супернатант из инфицированных клеток SK6 концентрировали в 10 раз путем ультрацентрифугирования и инактивировали 5 мМ раствором BEI в течение 6 ч при 37°C. Вакцина была приготовлена с 12,5% эмульсигеном D, хранящимся при 4°C до времени введения. Свиньи в группе 2 получали плацебоматериал (забуференный фосфатом физиологический раствор+12,5% эмульсиген D). Дозу 2 мл соответствующей вакцины вводили в мускулатуру шеи с использованием соответствующего размера стерильных иглы и шприца.

Вакцинация.

Перед введением любого вакцинного материала исследователь или сотрудник изучали общее состояние всех животных и включение в исследование. На D0 и D21 дозу подходящей вакцины в объеме 2 мл вводили либо в мускулатуру шеи, используя иглу и шприц подходящего размера, стерильную иглу и шприц, либо вводили в нос (1 мл в ноздрю), используя стерильный шприц и канюлю. Для инъекций IM использовали мышцы правой стороны шеи для инъекций на D0, а мышцы левой стороны шеи для инъекций на D21. Номер лота, количество дозы, идентификационные номера животных и сроки введения вакцинного материала были задокументированы в записи подтверждения вакцинации.

Клинические наблюдения.

Во время вакцинации животных ежедневно оценивали, используя обычную форму наблюдения за

- 46 036116 состоянием здоровья. Участки мест инъекции контролировались в течение как минимум трех дней после вакцинации. Если на участках в местах инъекции были обнаружены повреждения, то эти участки наблюдали до тех пор, пока повреждение не прекращалось или до окончания исследования.

Сбор крови.

На даты взятия проб крови исследователь или назначенное лицо собирали от трех до девяти мл венозной цельной крови через переднюю полую вену. Использовали стерильную иглу размером 18-20gx от 1 дюйма (2,54 см) до 1,5 дюймов (3,81 см) VACCUTAINER®, держатель иглы VACCUTAINER® и пробирки сывороточного сепаратора соответствующего размера (SST). Кровь на льду отправляли в течение ночи в IVI Biological R&D в Ames, Iowa, в день сбора, если она была собрана с понедельника по четверг. Если сыворотку собирали в пятницу или субботу, то сыворотку отделяли от кровяного сгустка центрифугированием и выливали в криогенный флакон с закручивающейся крышкой, указывая по меньшей мере номер исследования, день исследования и идентификационный номер животного. Обработанные образцы сыворотки хранили при -70°C и отправляли на сухом льду в Ames на следующий день отправки. В BIVI-Ames образцы сыворотки отслеживали с помощью электронной системы управления FreezerWorks. Образцы сыворотки в BIVI-Ames поддерживали при 2-8°C, если тестирование проводили в течение <48 ч после доставки, или поддерживали при -70°C, если их проводили позднее. Образцы хранили в течение как минимум шесть месяцев после завершения этого исследования.

Образцы мазков.

Материалы на льду отправляли в течение ночи в BIVI Biological R&D in Ames, Iowa. Если сбор происходил в выходные дни, то образцы замораживали при -70°C и отправляли на сухом льду на следующий день после взятия проб. Образцы в BIVI-Ames поддерживали при 2-8°C, если тестирование проводили в течение <2 ч после доставки, или поддерживали при -70°C, если их проводили позднее. Образцы отслеживали с помощью электронной системы управления FreezerWorks. Образцы хранили в течение как минимум шесть месяцев после завершения этого исследования.

Вскрытие.

Если во время исследования имелось агонизирующее животное, то животное подвергали эвтаназии и вскрывали по усмотрению наблюдающего ветеринара. Для определения причины смерти собирали соответствующие образцы. Образцы могли быть отправлены в диагностическую лабораторию для подтверждения.

Во время некондиционного испытания животных подвергали глубокой анестезии по одному SOP, и у каждого животного собирали кровь в 1x250 мл бутылочку для центрифугирования (свободный сбор). Животное подвергали эвтаназии после SOP, и место инъекции пальпировали. Если во время вскрытия четко пальпировались реакции в месте инъекции, то брали образец (свежий и фиксированный). Если во время исследования у животного присутствовали клинические симптомы или имелись доказательства клинического заболевания, то животное вскрывали. Для определения причины смерти собирали соответствующие образцы. Образцы могли быть отправлены в диагностическую лабораторию для подтверждения.

Дезинфекция помещений, процедуры входа и обслуживания.

Прототипные вакцины не считаются инфекционными для людей. При работе с животными носили перчатки, маски и одноразовые комбинезоны TYVEK®. Сапоги и средства индивидуальной защиты (РРЕ) были отдельными для каждого помещения. При смене работы с животными 3 группы на работу с животными в 1 и 2 группах требовалась обработка душем. Не допускался перенос предметов или РРЕ между комнатами. Дезинфекция оборудования подробно описывалась, и описание помещалось в отчет исследователя.

Серологический ответ.

Центрифугированную сыворотку абсорбировали из первичных клеток легких свиньи, чтобы уменьшить фон твердофазного ферментного анализа (ELISA). Пластины ELISA покрывали 300 нг концентрированного инактивированного пестивируса.

Абсорбированную тестируемую сыворотку вакцинированных животных, животных плацебо, сыворотки реконвалесцентого положительного контроля и сыворотки наивных животных оценивали в двух повторах, данные представлены на фиг. 7. Все сыворотки, собранные во всех группах, по данным ELISA на 0-й день (OD <0,15) были отрицательными. Через 13 дней после бустерной инокуляции инактивированного пестивируса у всех четырех животных наблюдался сильный серологический ответ, в то время как ни у одного из плацебо контроля значение не превышало 0,7 OD пороговой величины для анализа. Используя критерий суммы рангов Уилкоксона, статистически значимое увеличение OD в вакцинированной группе по сравнению с плацебо ф-значение=0,004) указывало на специфический серологический ответ на пестивирус.

Пример 5.

Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы выделить и продуктивно реплицировать новый пестивирус ex vivo. В частности, вирусная репродукция была достигнута в клетках, полученных из природных хозяев (свиньи), и их мониторинг проводили с помощью молекулярно-биологических ме- 47 036116 тодов.

Получение инокулята.

Ткани инфицированных поросят из примера 2 собирали и взвешивали индивидуально и добавляли минимальную необходимую среду, модифицированную SAFC, (MEM) до конечного значения масса:объем, равного 10%. Ткани диспергировали путем высокоскоростного встряхивания с металлическими бусами, осветляли микроцентрифугированием и фильтровали через фильтр 0,2 мкм. Дополнительно собирали кровь от каждого умирающего поросенка, зараженного пестивирусом. Каждый тканевой гомогенизат и образец сыворотки анализировали на наличие и относительную концентрацию пестивируса, используя кПЦР. Образцы с наивысшим титром объединяли по типу образца терминальной сыворотки, гомогенатов селезенки и почек. Затем эти объединенные образцы использовали в качестве инокулята.

Инокуляция первичных тканей свиней.

Попытки вырастить вирус осуществляли, используя инокулят, как описано выше, как на первичных эмбриональных легких, так и на первичных эмбриональных культурах клеток почек свиньи. Культуры первичных клеток получали из тканей, собранных у свиней, перенесших кесарево сечение и не получавших молозиво (CDCD).

Инокулят разбавляли равным объемом MEM и стерилизовали, пропуская через фильтры 0,8 мкм/0,2 мкм. Образцы дополнительно разбавляли либо 1:2, либо 1:10 перед инокуляцией в попытке удалить сыворотку или клетки-хозяева, вызывающие токсичность.

Культуральный рост осуществляли на ростовых средах (MEM с 10% облученной фетальной бычьей сывороткой и 2,5% 1М HEPES). Через семь дней после культивирования материалы подвергали 3 циклам замораживания/оттаивания, а затем инокулировали на свежие клетки, обеспечивая инфекцию вирусом, в течение 1 ч при 37°C, 5% CO₂ при покачивании. Через 1 ч инокулят удаляли и заменяли растительной средой. Пассажи проводили в течение 11 раундов на первичных клетках легкого и в течение 4 раундов на первичных клетках почек. Пороговые значения цикла для первичных клеток почек изменялись от 21,3 до 22,5, что свидетельствовало о продуктивной репликации. Пороговые значения цикла для первичного легкого также указывали на продуктивную репликацию вируса, и они суммированы в табл. 8.

Таблица 8 ____________________Организация эксперимента____________________

Клеточный тип для пассажа вируса	Пассаж вируса	Значение кПЦР Ct пестивируса
Первичное легкое	Р1	28, 6
Первичное легкое	Р4	21, 6
Первичное легкое	Р7	20, 9
Первичное легкое	Р11	21,8
SK6	Х+1	22, 6
SK6	Х+4	22,0
SK6	Х+10	17,2
SK6	Х+14	16, 45

Инокуляция иммортализованных клеток свиней.

Подобно первоначальным условиям инокуляции первичных клеток, иммортализованные клетки почек свиней (SK6) инокулировали путем добавления супернатанта первичной культуры легких с 11 пассажами (замораживание/оттаивание в течение трех циклов) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C, 5% CO2 при покачивании. Через 6 дней инкубации при 37°C 5% CO2 материал пассировали в свежие клетки SK6 таким же образом. Нуклеиновые кислоты каждого пассажа экстрагировали после 14 пассажей и контролировали с помощью кПЦР. При последовательных пассажах пороговая величина цикла уменьшалась (см. табл. 8) до ~17, что свидетельствовало о приблизительно 10-кратном увеличении вирусного титра.

Инактивация вирусного урожая.

Супернатанты из 11 пассажа клеток SK6 объединяли и концентрировали ~10-кратно высокоскоростным центрифугированием до вирусного осадка. Вирусный осадок ресуспендировали в ~1/10^ых исходного объема инертном буфере (1 х забуференный фосфатом физиологический раствор). Концентрированный вирус инактивировали с использованием циклического бинарного этиленимина (BEI) с конечной концентрацией 5 мМ в течение 6 ч и при постоянном перемешивании при 37°C. По завершении инактивации BEI инактивировали раствором тиосульфата натрия (17 об.%) при инкубации при 37°C в течение 15 мин. Инактивированный пестивирус готовили с 12,5% конечной концентрацией эмульгигена D и использовали в качестве предполагаемой кандидатной вакцины в примере 4.

Все композиции и способы, раскрытые и заявленные в настоящем описании, в свете настоящего описания могут быть получены и выполнены без излишнего экспериментирования. Хотя композиции и способы по настоящему изобретению были описаны с точки зрения предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области будет очевидно, что могут быть сделаны изменения в компо

- 48 036116 зициях и способах, а также в стадиях или последовательностях стадий, описанных в настоящем описании, без отхода от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые агенты, которые являются как химически, так и физиологически близкими, могут быть заменены агентами, описанными в настоящем описании, и при этом будут достигнуты одинаковые или сходные результаты. Все такие сходные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как определено в следующей формуле изобретения.

Список последовательностей <110> (как в заявлении!!!)

Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH

Iowa State University Research Foundation, Inc.

<120> ПЕСТИВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВРОЖДЕННОГО ТРЕМОРА <130> 24152-0041WO1 <140> PCT/US2016/049709 <141> 2016-08-31 <150> US 62/212,124 <151> 2015-08-31 <160> 26 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 11550 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2

<400> 1 cataatgctt	taattggccg	cattatgtgt gggacatcct	aaatatttat	gagccctgcg	60
gtgagtgggg	gaaagaggtt	aaccaggcct	ctagtaccac	aggcaccaat	ggacagggca	120
actcaaacct	gagagagagg	taccgaactc	ttaagccccg	agtacggggc	agacgtcacc	180
gagtagtaca	cccaaagacc	accacttcta	ggtgtagggt	ctactgaggc	tcgggtggac	240
gtgggcgcgc	ccaaagagaa	atcggtggtg	gacctggggg	tcggggccac	catgcccctt	300
tacggggtag	accttactgc	ttgatagagt	gccggcggat	gcctcaggta	agagtataaa	360
atccgttgtt	cattaacatg	gaaaaacaga	ttgcatatta	cttaaaaaaa	gaaaaacaaa	420
gaaatgggtg	gacggaactg	gtggtaggag	aaagtcatac	aaaaataacc	acgctttctg	480
gaaagaccta	tcgaggcacc	tgggaaatgg	agaaacggcc	aaatccttat	ggaacctatc	540
tccccagacc	tagtccccaa	cagcttacag	ccctacaccc	ccacccagtg	gtgaattgta	600
aggtggttga	gtacaaggag	atggacccta	attatggtga	ttgcccaaat	acgaacgggg	660
tgtttgttga	cgaaaagggt	agaaggctga	gcagccctcc	attaggcatt	tggaagataa	720
gattggacta	tagtgacttg	gtaaacataa	gcagaccaac	ccccgctagt	gggaaaaact	780
cttaccaagt	tgagacctgc	agtggggagc	tggctacagt	gacactggta	cacaataggg	840

- 49 036116 tgctcgtgga agattgcagg gggctatacc aatggaaacc caactgtgaa ggaattgtgc 900 tctatgtgaa aacttgttct gactgggcag atcaggtaga aaaacaggag aaagaaagcc 960 ccccaaaacc acagcggcca ccaaggcgag acccacgaaa agggttacaa ccacaagtcc 1020 ccaaagagac tgaggtcaca gaaaagaaga gacaacctag tgtcacctta gtatcggggg 1080 ggcagaaggc ccaagtcatc tacaaaggca ggaccaaaaa caaaaagacc ccggatggag 1140 tctatagata cccaggagct aaagaagggg acgtagtaaa ggtcaggaag atgctgaaga 1200 attggcatat agccttagtg atgtacctga tacatatcat aactccaggc cttgccaagg 1260 tccagtggtt cttaaaagat gaaaactcga cggggatcaa ccagatactg tggcaaagac 1320 agatcaacag atccttacat ggagaatggc ctaaccagat ctgccacggt atgcccaatg 1380 aaactatcac ggatgaggaa ttacgcagtc tgggaatggt agatacaagc cctagaacaa 1440 actacacctg ttgccagttg caatatcatg agtggaagaa acatggttgg tgcaactatc 1500 cacaaaaaca ggcgtggatc acgaggataa cggccctaca agctaacctt accgggcctt 1560 atgagggacc tgagtgcgcc gtcatctgcc gatttaacgg cagctacaac atcgtaaaac 1620 aggccagaga tgaggtgagt ccactgacag ggtgcaagga agggcatcct tttctattct 1680 ctggtgaaag atccgacacc tcatgcctaa ggcccccttc cactagttgg gtaagaccag 1740 tgaaaatgga cgaggcatca atggccgatg gctttgccca tggggttgat aaggcgataa 1800 tactaatcag gaagggggca tcaggaataa tcaatttcct agacactatt gggaggtggc 1860 taccggtagc tgaagcaact atagtaccat attgtgatac ttacactgtg acagggatgt 1920 atgtccatgt aaagaattgc ctccctagag ggttacctaa gcattcaaaa ataatctccc 1980 cgacaatgat atatctggga gaaggagacc cggcccataa tatccagcac ttatttggct 2040 caggtatagc aaagtgggtc ctagttctac tcgggattct gggtgagtgg tatggagaat 2100 tggcttccac aatatactta ctactagaat acgggtctga gtggttggaa catgaaagcc 2160 tggtcacgga agggttgatt cctggcatta atattacaat agaactccca gctagtcata 2220 cagtgcctgg ttgggtgtgg gtcgcaggcc agtgggtatg cgtgaagcca gactggtggc 2280 ctacacagat ttggattgaa accgtggtgg cagagacctg gcatatacta aaaatattgg 2340 cgtcagccct ggtgaacata gttgcagcgt tcgtaaacct ggaattggtt tatctggtca 2400 taatactagt caaaatatca aaagggaacc tgataggtgc catattatgg tgcttgttac 2460 tgtcaggcgc tgaaggctcg tgctacaaaa gacaagacta ttacaacacc caactagtcg 2520 tcgaagaaaa aacaggcgta gaaaaacgat ctataatggg caagtggacc gtgataacca 2580 gggaaggtcg ggagccaaga ttaatggagc aaataaatat ggtattgaat gatagcctgt 2640 cagaaaccta ctgctataat aggctaaaca ccagcacttg ggggcggcaa ccggcaagac 2700 aaagagggtg tggtcaaacc gtgccctatt ggcctggtga caatgttcta gaagaacaat 2760 actacagcac aggttactgg gtgaatgtaa caggcggttg ccagctgaga gaaggcgtat 2820 ggctatcaag aaagggtaac gtacagtgtc agcgtaacgg ctcatccttg atgctgcaat 2880 tggcgataaa agaagagaat gacactatgg aaataccatg tgacccagtg gaaactgaaa 2940 gtatgggtcc agttgcacag ggcacttgtg tgtacagctg ggcattcgcc ccaagagggt 3000 ggtactataa caggaaggat ggttattggc tccagtacat aaagaaaaac gactaccagt 3060 attggacaaa aatgcctact gcctcgtccg ccgcaaccat gtaccgccac ttgctcccct 3120 tactggtggc ctgcctcatg ggcggtagga tatcggtgtg gtttgtggca atgctcctgt 3180 ctctacaggt ggaagctagt gaagtaggca ctaaacaact ggctgtcacg ctaaccctgt 3240 ggaaaatgga ctggacagaa ctacttttct atattgtctt gatgctagcc gttaaggaag 3300 aacttataaa aaaaattgtg accgctagcc ttgtggcctt aaaaaatagt ccagtagcct 3360 tgagttttct tattgtactc agacttgtgg ggggcagtga agcactccca gtaggtttat 3420 tattagaaaa aatgtgcata gaccaaccgg agtttggaac tcctttcctg atctacctat 3480 gggacaactg gaagtggact gtgttagtca gcttctccgc actgaaccat gaaaaaacta 3540 taaaactggc aagaaaactg ttgttggcaa cacatataac agcgctcaca ttgactggct 3600 tgagtgattc aatcttctat atgatgctta taacaacaaa tttgttaata aagacattca 3660 tatacttgct gggggctagt atgaattggg tcgagagaga aaaaaagaaa ttgctagtga 3720 agaggagact aatatacaag aaagccgtta cttgcagtca ggatgagaat gtattggaga 3780 ataaattcaa caagataact gtaaacgcgg atttcacccc atgcaagctt gaacttctac 3840 aattacttag ggctttttta gtctctttgt gtttttccta ctacaaacct ctcctgtatg 3900 cagagactac cttaactgta atagtaattg gcgtacaaga gtacaacgta gccatggccc 3960

- 50 036116 gcgggcgaag tgtggtccac aggctactag ccatggccta ttacatatac ggccgcatac 4020 agggtgacat gttccagctc gccactatcc agtgcctgct gtcgagtccg aggaaaatta 4080 tgaaacacat ggtagagaat ccaactctca agaagctctg gcaaggcgaa acagaactct 4140 tcaaccaggg tgttagtcaa tccaagatag tgaatccaaa gaaaattggg ctggaagaat 4200 tacacaaggg catgtgtggc ctcccaacag tagtgcaaaa tttggtcata tatgcaaaga 4260 agaatgactc tcttatttta ggagagctgg gttacccccc tggggatctc accagtgatg 4320 ggtgggaaat tttaggtcct ggcagaatcc caaagatcac taacgtcgag tctgctaaga 4380 tggacttact ctccaaactt atgacctttc tggggattga aagctcgagg gtccccagga 4440 ccccagtcca ctcaacaagg aaattattga agatagtaag gggcttggaa acaggatggg 4500 ggtacactca cgcagggggg ataagtagcg caaaacacgt tacaggtgaa aagaacttaa 4560 tgacccacat ggagggtagg aagggaaaat atatcctaca atctcaagaa catggtgctg 4620 acgaggtaga gtacggagta aaaactgatc aaaaagctcc cgacaatgcc ttatgctact 4680 gttttaaccc tgaagctaca aacataaaag gagagacggg agccatggtg ttcatgaaga 4740 agataggaaa aaagtggact ctcgtaacat cagacggcaa taaagcctat tataatgtaa 4800 acaatttgaa agggtggtct ggactaccaa taatgctgca ctccaccggg gccatagtgg 4860 ggaggattaa atcagcgtat tcagatgaaa acgacctggt ggaggaactt attgactcta 4920 gaactattag taagagcaat gagacaaacc tggaccacct tatcaaggaa ttggcagaca 4980 tgcggagggg ggagttccgc tcaattaccc ttggaacggg agccgggaaa accacagaac 5040 tgcctaggca atacctcaca acagtaggtg cccataaatc cgtgctggtc ttagtcccct 5100 taaaagcacc tgctgaaagt gtttgccgct ttatgaggtc taaataccct accatcaact 5160 tttccttaag agtgggggaa cggaaagagg gagatgtgag cagcggcatc acctacgcta 5220 cttacggatt ttgctgccag ctaaacctag tccaacttaa agaatggata tccaggtact 5280 caatggtttt ttttgatgaa tatcacacag caactccaga acaaatagcc ataataagca 5340 agattcatgc actgaaagtt aagaccagga tagtggctat gtcagcaacc cccccgggta 5400 ccgtgacgac tgaaggcagg aagtttgaca ttgaagaggt aggggttgct accatagaga 5460 aaggagagga accaaaaagg gggcgcatag cggtcgctgg tatgcaggtc ccattagaag 5520 acttaacagg aaagaactgc ctggtgttcg tggcaaccaa agaagccgcg gagacggagg 5580 ctaaagaact gcgcaccaga ggaattaacg ccacctacta ctattcaggt atagacccta 5640 agactctgga acatgggatg accaatcagc catactgtat tgtagctacc aatgccattg 5700 aatcaggtat aacctgtcct gacttggatg tggtcataga caccatgcag aagtacgaaa 5760 aagtagtgaa tttctcggca aagatgccct tgattgtcac ttcattagta aagaaaaaaa 5820 tcaccaggga agaacagggc cagaggaaag gtcgagtggg caggcaaaag aaaggaaaat 5880 actactaccc ctcgggggtg gtaccgaatg ggtcaaaaga cctaagctat ttaatcctac 5940 aggcccaaga atatggtgtc ttggaacaag tcaatataac agagtacttc atcataatga 6000 atgaggactg gggtctctat gacgtagatg aagtagaagt gagaatactt gagagaatga 6060 acaaggaaat cttgctacca ctaggtattg tggagaagca aatcttggaa agaagtactc 6120 acccggaaaa agtggcactg ttgtataaca aattagtgca gaaaaatcct atagtatacc 6180 ctagagtaca ggaaggtgag gtcagcaagg aatacaatac ctataatctg gccgtatatg 6240 acaagctaaa agatgtcaac ccacaagcca tttatgttct agcagaagag gagagagcca 6300 cagaaatgat gggtctcgag tttgaacaag acccatctga cttacaggat tcggtagttc 6360 agctttgtga agatatcaag aggtatacaa aactctctgg gatcactgag aaactgctag 6420 taggtacgat ggtggggtat attggataca aagccttaac cagaaaccac gtgccctggg 6480 tcagcaaaga gtattgttat gagctgaccg attcaccgga tacttacgaa aactcattcg 6540 cacctttgga cgtcgacgtc caaaactccg gtgaaggaaa acacccagag caactggcag 6600 accatcaatt gaggcaacta ctggagactg ggagagacaa ggcaattgat ttcctaaaag 6660 gaatccgcga gttcactagt ggggccataa acagtccaaa ggcactaagt atatgggaga 6720 aaatatatca gtatttgaag aagcatcagg gcgagatcat ctcatcagca gcgtggggca 6780 gtgcgacggc ccttcacgac agtattaaat ctagactagg agatgaggtc gctactgcag 6840 taataatcct caagtattta gcatttggtg aaagagaact gtctgggcta actaggcaag 6900 ttctaattga catcatagta tattatatag ttaacaagcc ccggttcgaa ggagacgact 6960 acgcaaagag aaaaggaaga aggctagtca tcgaagtcct gatgggggca ctggcgactt 7020 atgcggtgtc caatttttgg ggtgtgtcca ttaataagat actgcaacca atttctgatt 7080

- 51 036116 atctacccta tgccaccgcc actttggctt ttcttcgccc aaccttcatg gaatcagcag 7140 tggtggtcgc ttcctctatc tatagagctt ttctctccat taagcatgcg gaaaacagga 7200 gtcttgtcac gcaggtcgct tctgccgccc tcgaagtcat gggcctgacc ccagtatcgg 7260 ctggcctagg cgtcttgctg gggcttgggt tgtgtgtgct ccatatgaac attgacaaga 7320 atgaggagaa aaggacactt atactgaaaa tgtttgtcaa aaactttata gaccaggcgg 7380 cactagacga gttggataaa ctggagccag aaaaaataat cctctcattg ttggagggta 7440 tccaaacctg cacaaacccg attagagcaa tcatgatttt gtacagggtg tactacaagg 7500 gagaaacttt cacagaagct ttgtctaaga tggccggcaa gtctctcatt gtgatggtca 7560 tagtcgagtt cctggaattg acaggccaaa cccaaggagg gtatatagat cttagtgcta 7620 atttgctgac ctttctcctc gagaaactaa aaaaaatgac taacctcgcc atcggggaag 7680 ctagaaaggt cttgctcccc atcccatact tgtactgtga aacctggcag tctgacgcca 7740 gaatcaaggc ccctgaatcc tacgaccaag tggtagtgga atgcaaatgt ggcgcttcag 7800 cgaggtattc cttccgcgat ggagttcatg agatattgga agaaaaaagg actaattggt 7860 gcaagaactt cttcttatgg ggacccaact tccacaatcc ggatccaaaa aggatgacat 7920 tctatgaata cggccaagca aaaaagtgtc ctgttatcat aattggtgaa gacataacct 7980 tcggcaaata tggcatatat atcaaatttg gccataggcc tgatggaggg aggttaataa 8040 ggggtaccac ccacgctact atcagtaggg aggaattgct ggaaatccta acagccccaa 8100 gccaagtggc cataggcaag gtcaagctaa ccgattactg taatcaaaaa ggaataatag 8160 acaggaaatt ggccgtactt gaaggtgaca aaatacattt ttggaaagca caccgtggat 8220 ccaaaatcac agaccaactc actattgaga atctgacaga tgatttgggg tcagaaatca 8280 gggacatcac atgggagctg tacacaggtg gaacgtgcac cgtaaaaggg gtgtccctta 8340 gatcatgcgc accaggtcat agaactaagg ctatggtctt gtgtgattgc actgatgtgc 8400 ttagcccctg ttacctaata aacggcagga gaccatcccc atttgacgtc gcggaaggtt 8460 atgaatgtca ccaccggaag ccccgagcga cgtatgaaga cctagaaatg gaggaaatac 8520 taaagagacg agtccctgtc tacgatcctc tgtgtttgtt tgacactgat agtaaactgc 8580 tacctcccga cacctactac ttggaagaag atcaagagga ctttgagtac gcattgagat 8640 gctggggcct cggggtttat gtagcagacg ggcctgtcac ttcccccccg gacataagaa 8700 tacaccatag ttcggtatta ctactgctga cacctggagt aaactcagag ttgcccttac 8760 agtacatacg ttgttaccct catcaggcag aggtggacat ctacattagg agtcagcttt 8820 tggaggagga agacactgct acggaggtgg aaggctccca ggaagatggt gatgaaggga 8880 tgggcgatgc ggtaatagag gatgaggata catcgtccac aacagaatca atacccccac 8940 tagaagagga ggaagggggc gaagagccaa tcacctatgt ggtcataagg ggattacaag 9000 aagaaagata cgccagccat cttaaactaa atgactggat cagtgaaaac atttcagagc 9060 cacacagagt ccaaattatg ctagatggga cagtgagagt cacaataaaa gagggcaaag 9120 tgaaacattt gtttggggtc tatagaatag aaaactccct ggaagcaatg tttaaagaga 9180 ccatagctga cctccccgta gctacccaac cgccccaggg gccagtctat acggctaaag 9240 agctggccca agggaacatc gccccggtcc aacctgcagc gaattattac ggaatgatag 9300 aggggagagg cgacccaatg acggcattcg aagccttatc agtcttgcgg tcacaaaaag 9360 tcttagccaa ggacgtgaag gtgaacaccc gcagggcgca ggttttttta aataaagtca 9420 ggagaattgc tgaggtcaga gcgtcggaac tgacattaaa atgcttaccg atacttggca 9480 aagtaaatgg gaggaaattg attagagagg aaaccaacat ccccaaccaa aggttggcat 9540 caataatgac ctcaatagga attagactag aaaaactgcc agtggttaga gcaaacactt 9600 ccggctctaa gttcagacag tcaatcttag aaaaaatgga taagtatgaa aatgaacaag 9660 tcccagggtt acatgaaaag atgtgggcag cgttcctggc aactgccagg caagatttaa 9720 gaaataccta tgaggaagta acttatcttg aattagaggc cggaatcaat cggaaaggag 9780 ccccaggttt ctttgaaaaa gaaagctcaa taggagaagt gctggaaaaa aaagaaaaaa 9840 ttgacgtcac aatccaagag attgaaaaag gcaaccactt atactatgaa acagccatgc 9900 caaaaaatga gaaaagagat gtgcttgatg attggttgtc agaggatttc gtcacttata 9960 agaaaccacg tgtgatacag taccctgagg cagtcacccg gttggccatc accaaaataa 10020 tgtataagtg ggtgaagcaa aagcctatag tgattcccgg ttatgaggga aaaaccccga 10080 tctttgaaat atttgaaaaa gtcagtgcag attgggctca gttcaaaaat ccggtagccg 10140 tcagcttcga caccagagcc tgggacactc aagtaacaag agaagacctc aggctggtag 10200

- 52 036116 ggcggataca gaaatactat tacaaaaaaa aatattggaa gttcattgac aatttgacag 10260 ccatgatgga ggaagtgcct gtaatcactg tagaaggaga tatgttcctc agagttggac 10320 agcgcggatc cggacagcct gatacctcag caggcaattc catgctaaat gtgctgacta 10380 tgttggtagc tttctctgaa tccacaaatc tgcccatagc ggctgcctgg aaggcctgtc 10440 ggatccacgt ctgtggtgac gacggtttct taatcacaga atcggaatta gggaggaagt 10500 ttgctgaaaa aggtgttcct ctgttagctg catttggcaa accccaaaaa attacagagg 10560 gagcgagcct aaaggtaacc agcaactttg acggaataga gttttgtagt cataccccta 10620 tcagagtcca aacaccaaac atcaggtgga tgccagcgag accaacagca acaatcctag 10680 gcaaaatgag taccaggctg ggtgagggtg ccaccaggtc gggagaagaa tacgaaaaac 10740 aggtggcatt cgcatatcta ctgatgtacc cctggaaccc gctggtcagg agaatcagcc 10800 tcctattgtt atcgactact gacccaatgg ggaaagagga aaccccatgc tccgatgagg 10860 gggtgaagta tgttggggac cctatcgctg catacaggga tgtatggggg cacaaattag 10920 aggatgtagg ccatgttgat caaccgcagt tatcccggat gaactatagc atgacttact 10980 tagggatttg gaaaccaaag acaagtcagc ggctagtcga acagtgttgt cgtctggccg 11040 agaaaagcaa ttgtgtggta cgtgctgact ccctgataaa gaaaaaggtc aagatcactt 11100 atgacccggg gataggagtg gctcaggtca ttcgtaggtg ggaagagctt gagtggacca 11160 gaaggaaacc tgaactcacc aatgtaattg tagaagatga tatcttccta gtcctgtgga 11220 agagattttc aaagtacatt tttcagaaaa tgaagttcat gcagagaatg ttcgcccctt 11280 attaagtggg gggcactcat ttaaattata accagtatct ggtaagtata agatttgtgt 11340 aaataaagta tataactgaa aggggcaagt ggccgtatag gctggggtga tcgccgcacc 11400 ccccccttca ctaggcgcct caaccccatg taccatgggg ttgttgtaaa tacttgaatg 11460 aatggagtaa tacgggtaac aaacttatag gccagtattg ccccatttgc tttatagtgg 11520 tgacgacctg tataggtccg atctgatatc 11550 <210> 2 <211> 3635 <212> БЕЛОК <213> пестивирус типа 2 <400> 2

Met Glu Lys Gin He Ala Tyr Tyr 1 5

Leu Lys Lys Glu Lys Gin Arg Asn

15

Gly Trp Thr Glu Leu Vai Vai Gly 20

Glu Ser His Thr Lys lie Thr Thr 25 30

Leu Ser Gly Lys Thr Tyr Arg Gly

40

Thr Trp Glu Met Glu Lys Arg Pro 45

Asn Pro Tyr Gly Thr Tyr Leu Pro

55

Arg Pro Ser Pro Gin Gin Leu Thr 60

Ala Leu His Pro His Pro Vai Vai 65 70

Asn Cys Lys Vai Vai Glu Tyr Lys

80

Glu Met Asp Pro Asn Tyr Gly Asp 85

Cys Pro Asn Thr Asn Gly Vai Phe

95

Vai Asp Glu Lys Gly Arg Arg Leu

100

Ser Ser Pro Pro Leu Gly lie Trp

105 110

Lys He Arg Leu Asp Tyr Ser Asp

115 120

Leu Vai Asn lie Ser Arg Pro Thr

125

Pro Ala Ser Gly Lys Asn Ser Tyr

130 135

Gin Vai Glu Thr Cys Ser Gly Glu

140

Leu Ala Thr Vai Thr Leu Vai His

145 150

Asn Arg Vai Leu Vai Glu Asp Cys

155 160

Arg Gly Leu Tyr Gin Trp Lys Pro

165

Asn Cys Glu Gly lie Vai Leu Tyr

170 175

Vai Lys Thr Cys Ser Asp Trp Ala

180

Asp Gin Vai Glu Lys Gin Glu Lys 185 190

Glu Ser Pro Pro Lys Pro Gin Arg

Pro Pro Arg Arg Asp Pro Arg Lys

195 200205

Gly Leu Gin Pro Gin Vai Pro Lys Glu Thr Glu Vai Thr Glu Lys Lys

210 215220

Arg Gin Pro Ser Vai Thr Leu Vai Ser Gly Gly Gin Lys Ala Gin Vai

225 230 235240 lie Tyr Lys Gly Arg Thr Lys Asn Lys Lys Thr Pro Asp Gly Vai Tyr

245 250255

Arg Tyr Pro Gly Ala Lys Glu Gly Asp Vai Vai Lys Vai Arg Lys Met

260 265270

Leu Lys Asn Trp His lie Ala Leu Vai Met Tyr Leu lie His lie lie

275 280285

Thr Pro Gly Leu Ala Lys Vai Gin Trp Phe Leu Lys Asp Glu Asn Ser

290 295300

Thr Gly lie Asn Gin lie Leu Trp Gin Arg Gin lie Asn Arg Ser Leu

305 310 315320

His Gly Glu Trp Pro Asn Gin lie Cys His Gly Met Pro Asn Glu Thr

325 330335 lie Thr Asp Glu Glu Leu Arg Ser Leu Gly Met Vai Asp Thr Ser Pro

340 345350

Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Gin Leu Gin Tyr His Glu Trp Lys Lys

355 360365

His Gly Trp Cys Asn Tyr Pro Gin Lys Gin Ala Trp lie Thr Arg lie

370 375380

Thr Ala Leu Gin Ala Asn Leu Thr Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Glu Cys

385 390 395400

Ala Vai lie Cys Arg Phe Asn Gly Ser Tyr Asn lie Vai Lys Gin Ala

405 410415

Arg Asp Glu Vai Ser Pro Leu Thr Gly Cys Lys Glu Gly His Pro Phe

420 425430

Leu Phe Ser Gly Glu Arg Ser Asp Thr Ser Cys Leu Arg Pro Pro Ser

435 440445

Thr Ser Trp Vai Arg Pro Vai Lys Met Asp Glu Ala Ser Met Ala Asp

450 455460

Gly Phe Ala His Gly Vai Asp Lys Ala lie lie Leu lie Arg Lys Gly

465 470 475480

Ala Ser Gly lie lie Asn Phe Leu Asp Thr lie Gly Arg Trp Leu Pro

485 490495

Vai Ala Glu Ala Thr lie Vai Pro Tyr Cys Asp Thr Tyr Thr Vai Thr

500 505510

Gly Met Tyr Vai His Vai Lys Asn Cys Leu Pro Arg Gly Leu Pro Lys

515 520525

His Ser Lys lie lie Ser Pro Thr Met lie Tyr Leu Gly Glu Gly Asp

530 535540

Pro Ala His Asn lie Gin His Leu Phe Gly Ser Gly lie Ala Lys Trp

545 550 555560

Vai Leu Vai Leu Leu Gly lie Leu Gly Glu Trp Tyr Gly Glu Leu Ala

565 570575

Ser Thr lie Tyr Leu Leu Leu Glu Tyr Gly Ser Glu Trp Leu Glu His

580 585590

Glu Ser Leu Vai Thr Glu Gly Leu lie Pro Gly lie Asn lie Thr lie

595 600605

Glu Leu Pro Ala Ser His Thr Vai Pro Gly Trp Vai Trp Vai Ala Gly

610 615620

Gin Trp Val Cys Val Lys Pro Asp Trp Trp Pro Thr Gin lie Trp lie

625 630 635640

Glu Thr Val Val Ala Glu Thr Trp His lie Leu Lys lie Leu Ala Ser

645 650655

Ala Leu Val Asn lie Val Ala Ala Phe Val Asn Leu Glu Leu Val Tyr

660 665670

Leu Val lie lie Leu Val Lys lie Ser Lys Gly Asn Leu lie Gly Ala

675 680685 lie Leu Trp Cys Leu Leu Leu Ser Gly Ala Glu Gly Ser Cys Tyr Lys

690 695700

Arg Gin Asp Tyr Tyr Asn Thr Gin Leu Val Val Glu Glu Lys Thr Gly

705 710 715720

Val Glu Lys Arg Ser lie Met Gly Lys Trp Thr Val lie Thr Arg Glu

725 730735

Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gin lie Asn Met Val Leu Asn Asp

740 745750

Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn Thr Ser Thr Trp

755 760765

Gly Arg Gin Pro Ala Arg Gin Arg Gly Cys Gly Gin Thr Val Pro Tyr

770 775780

Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gin Tyr Tyr Ser Thr Gly Tyr

785 790 795800

Trp Val Asn Val Thr Gly Gly Cys Gin Leu Arg Glu Gly Val Trp Leu

805 810815

Ser Arg Lys Gly Asn Val Gin Cys Gin Arg Asn Gly Ser Ser Leu Met

820 825830

Leu Gin Leu Ala lie Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met Glu lie Pro Cys

835 840845

Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Ala Gin Gly Thr Cys

850 855860

Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr Tyr Asn Arg Lys

865 870 875880

Asp Gly Tyr Trp Leu Gin Tyr lie Lys Lys Asn Asp Tyr Gin Tyr Trp

885 890895

Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Met Tyr Arg His Leu

900 905910

Leu Pro Leu Leu Val Ala Cys Leu Met Gly Gly Arg lie Ser Val Trp

915 920925

Phe Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Gin Val Glu Ala Ser Glu Val Gly

930 935940

Thr Lys Gin Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Trp Lys Met Asp Trp Thr

945 950 955960

Glu Leu Leu Phe Tyr lie Val Leu Met Leu Ala Val Lys Glu Glu Leu

965 970975 lie Lys Lys lie Val Thr Ala Ser Leu Val Ala Leu Lys Asn Ser Pro

980 985990

Val Ala Leu Ser Phe Leu lie Val Leu Arg Leu Val Gly Gly Ser Glu

995 10001005

Ala Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Glu Lys Met Cys lie Asp Gin

1010 10151020

Pro Glu Phe Gly Thr Pro Phe Leu lie Tyr Leu Trp Asp Asn Trp

- 55 036116

1025 10301035

Lys Trp Thr Vai Leu Vai Ser Phe Ser Ala Leu Asn His Glu Lys

1040 10451050

Thr lie Lys Leu Ala Arg Lys Leu Leu Leu Ala Thr His lie Thr

1055 10601065

Ala Leu Thr Leu Thr Gly Leu Ser Asp Ser lie Phe Tyr Met Met

1070 10751080

Leu lie Thr Thr Asn Leu Leu lie Lys Thr Phe lie Tyr Leu Leu

1085 10901095

Gly Ala Ser Met Asn Trp Vai Glu Arg Glu Lys Lys Lys Leu Leu

1100 11051110

Vai Lys Arg Arg Leu lie Tyr Lys Lys Ala Vai Thr Cys Ser Gin

1115 11201125

Asp Glu Asn Vai Leu Glu Asn Lys Phe Asn Lys lie Thr Vai Asn

1130 11351140

Ala Asp Phe Thr Pro Cys Lys Leu Glu Leu Leu Gin Leu Leu Arg

1145 11501155

Ala Phe Leu Vai Ser Leu Cys Phe Ser Tyr Tyr Lys Pro Leu Leu

1160 11651170

Tyr Ala Glu Thr Thr Leu Thr Vai He Vai He Gly Vai Gin Glu

1175 11801185

Tyr Asn Vai Ala Met Ala Arg Gly Arg Ser Vai Vai His Arg Leu

1190 11951200

Leu Ala Met Ala Tyr Tyr lie Tyr Gly Arg lie Gin Gly Asp Met

1205 12101215

Phe Gin Leu Ala Thr lie Gin Cys Leu Leu Ser Ser Pro Arg Lys

1220 12251230 lie Met Lys His Met Vai Glu Asn Pro Thr Leu Lys Lys Leu Trp

1235 12401245

Gin Gly Glu Thr Glu Leu Phe Asn Gin Gly Vai Ser Gin Ser Lys

1250 12551260 lie Vai Asn Pro Lys Lys lie Gly Leu Glu Glu Leu His Lys Gly

1265 12701275

Met Cys Gly Leu Pro Thr Vai Vai Gin Asn Leu Vai lie Tyr Ala

1280 12851290

Lys Lys Asn Asp Ser Leu lie Leu Gly Glu Leu Gly Tyr Pro Pro

1295 13001305

Gly Asp Leu Thr Ser Asp Gly Trp Glu lie Leu Gly Pro Gly Arg

1310 13151320 lie Pro Lys lie Thr Asn Vai Glu Ser Ala Lys Met Asp Leu Leu

1325 13301335

Ser Lys Leu Met Thr Phe Leu Gly lie Glu Ser Ser Arg Vai Pro

1340 13451350

Arg Thr Pro Vai His Ser Thr Arg Lys Leu Leu Lys lie Vai Arg

1355 13601365

Gly Leu Glu Thr Gly Trp Gly Tyr Thr His Ala Gly Gly lie Ser

1370 13751380

Ser Ala Lys His Vai Thr Gly Glu Lys Asn Leu Met Thr His Met

1385 13901395

Glu Gly Arg Lys Gly Lys Tyr lie Leu Gin Ser Gin Glu His Gly

1400 14051410

Ala Asp Glu Vai Glu Tyr Gly Vai Lys Thr Asp Gin Lys Ala Pro

- 56 036116

1415 14201425

Asp Asn Ala Leu Cys Tyr Cys Phe Asn Pro Glu Ala Thr Asn lie

1430 14351440

Lys Gly Glu Thr Gly Ala Met Vai Phe Met Lys Lys He Gly Lys

1445 14501455

Lys Trp Thr Leu Vai Thr Ser Asp Gly Asn Lys Ala Tyr Tyr Asn

1460 14651470

Vai Asn Asn Leu Lys Gly Trp Ser Gly Leu Pro He Met Leu His

1475 14801485

Ser Thr Gly Ala lie Vai Gly Arg lie Lys Ser Ala Tyr Ser Asp

1490 14951500

Glu Asn Asp Leu Vai Glu Glu Leu lie Asp Ser Arg Thr lie Ser

1505 15101515

Lys Ser Asn Glu Thr Asn Leu Asp His Leu lie Lys Glu Leu Ala

1520 15251530

Asp Met Arg Arg Gly Glu Phe Arg Ser lie Thr Leu Gly Thr Gly

1535 15401545

Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu Pro Arg Gin Tyr Leu Thr Thr Vai

1550 15551560

Gly Ala His Lys Ser Vai Leu Vai Leu Vai Pro Leu Lys Ala Pro

1565 15701575

Ala Glu Ser Vai Cys Arg Phe Met Arg Ser Lys Tyr Pro Thr lie

1580 15851590

Asn Phe Ser Leu Arg Vai Gly Glu Arg Lys Glu Gly Asp Vai Ser

1595 16001605

Ser Gly lie Thr Tyr Ala Thr Tyr Gly Phe Cys Cys Gin Leu Asn

1610 16151620

Leu Vai Gin Leu Lys Glu Trp lie Ser Arg Tyr Ser Met Vai Phe

1625 16301635

Phe Asp Glu Tyr His Thr Ala Thr Pro Glu Gin lie Ala lie lie

1640 16451650

Ser Lys lie His Ala Leu Lys Vai Lys Thr Arg lie Vai Ala Met

1655 16601665

Ser Ala Thr Pro Pro Gly Thr Vai Thr Thr Glu Gly Arg Lys Phe

1670 16751680

Asp lie Glu Glu Vai Gly Vai Ala Thr lie Glu Lys Gly Glu Glu

1685 16901695

Pro Lys Arg Gly Arg lie Ala Vai Ala Gly Met Gin Vai Pro Leu

1700 17051710

Glu Asp Leu Thr Gly Lys Asn Cys Leu Vai Phe Vai Ala Thr Lys

1715 17201725

Glu Ala Ala Glu Thr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Thr Arg Gly lie

1730 17351740

Asn Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ser Gly lie Asp Pro Lys Thr Leu Glu

1745 17501755

His Gly Met Thr Asn Gin Pro Tyr Cys lie Vai Ala Thr Asn Ala

1760 17651770 lie Glu Ser Gly lie Thr Cys Pro Asp Leu Asp Vai Vai lie Asp

1775 17801785

Thr Met Gin Lys Tyr Glu Lys Vai Vai Asn Phe Ser Ala Lys Met

1790 17951800

Pro Leu lie Vai Thr Ser Leu Vai Lys Lys Lys lie Thr Arg Glu

- 57 036116

1805 18101815

Glu Gin Gly Gin Arg Lys Gly Arg Vai Gly Arg Gin Lys Lys Gly

1820 18251830

Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ser Gly Vai Vai Pro Asn Gly Ser Lys Asp

1835 18401845

Leu Ser Tyr Leu lie Leu Gin Ala Gin Glu Tyr Gly Vai Leu Glu

1850 18551860

Gin Vai Asn lie Thr Glu Tyr Phe lie lie Met Asn Glu Asp Trp

1865 18701875

Gly Leu Tyr Asp Vai Asp Glu Vai Glu Vai Arg lie Leu Glu Arg

1880 18851890

Met Asn Lys Glu lie Leu Leu Pro Leu Gly lie Vai Glu Lys Gin

1895 19001905 lie Leu Glu Arg Ser Thr His Pro Glu Lys Vai Ala Leu Leu Tyr

1910 19151920

Asn Lys Leu Vai Gin Lys Asn Pro lie Vai Tyr Pro Arg Vai Gin

1925 19301935

Glu Gly Glu Vai Ser Lys Glu Tyr Asn Thr Tyr Asn Leu Ala Vai

1940 19451950

Tyr Asp Lys Leu Lys Asp Vai Asn Pro Gin Ala lie Tyr Vai Leu

1955 19601965

Ala Glu Glu Glu Arg Ala Thr Glu Met Met Gly Leu Glu Phe Glu

1970 19751980

Gin Asp Pro Ser Asp Leu Gin Asp Ser Vai Vai Gin Leu Cys Glu

1985 19901995

Asp lie Lys Arg Tyr Thr Lys Leu Ser Gly lie Thr Glu Lys Leu

2000 20052010

Leu Vai Gly Thr Met Vai Gly Tyr lie Gly Tyr Lys Ala Leu Thr

2015 20202025

Arg Asn His Vai Pro Trp Vai Ser Lys Glu Tyr Cys Tyr Glu Leu

2030 20352040

Thr Asp Ser Pro Asp Thr Tyr Glu Asn Ser Phe Ala Pro Leu Asp

2045 20502055

Vai Asp Vai Gin Asn Ser Gly Glu Gly Lys His Pro Glu Gin Leu

2060 20652070

Ala Asp His Gin Leu Arg Gin Leu Leu Glu Thr Gly Arg Asp Lys

2075 20802085

Ala lie Asp Phe Leu Lys Gly lie Arg Glu Phe Thr Ser Gly Ala

2090 20952100 lie Asn Ser Pro Lys Ala Leu Ser lie Trp Glu Lys He Tyr Gin

2105 21102115

Tyr Leu Lys Lys His Gin Gly Glu He lie Ser Ser Ala Ala Trp

2120 21252130

Gly Ser Ala Thr Ala Leu His Asp Ser lie Lys Ser Arg Leu Gly

2135 21402145

Asp Glu Vai Ala Thr Ala Vai lie lie Leu Lys Tyr Leu Ala Phe

2150 21552160

Gly Glu Arg Glu Leu Ser Gly Leu Thr Arg Gin Vai Leu lie Asp

2165 21702175 lie lie Vai Tyr Tyr lie Vai Asn Lys Pro Arg Phe Glu Gly Asp

2180 21852190

Asp Tyr Ala Lys Arg Lys Gly Arg Arg Leu Vai lie Glu Vai Leu

- 58 036116

2195 22002205

Met Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Ala Vai Ser Asn Phe Trp Gly Vai

2210 22152220

Ser lie Asn Lys lie Leu Gin Pro lie Ser Asp Tyr Leu Pro Tyr

2225 22302235

Ala Thr Ala Thr Leu Ala Phe Leu Arg Pro Thr Phe Met Glu Ser

2240 22452250

Ala Vai Vai Vai Ala Ser Ser lie Tyr Arg Ala Phe Leu Ser lie

2255 22602265

Lys His Ala Glu Asn Arg Ser Leu Vai Thr Gin Vai Ala Ser Ala

2270 22752280

Ala Leu Glu Vai Met Gly Leu Thr Pro Vai Ser Ala Gly Leu Gly

2285 22902295

Vai Leu Leu Gly Leu Gly Leu Cys Vai Leu His Met Asn lie Asp

2300 23052310

Lys Asn Glu Glu Lys Arg Thr Leu lie Leu Lys Met Phe Vai Lys

2315 23202325

Asn Phe lie Asp Gin Ala Ala Leu Asp Glu Leu Asp Lys Leu Glu

2330 23352340

Pro Glu Lys He He Leu Ser Leu Leu Glu Gly lie Gin Thr Cys

2345 23502355

Thr Asn Pro lie Arg Ala lie Met lie Leu Tyr Arg Vai Tyr Tyr

2360 23652370

Lys Gly Glu Thr Phe Thr Glu Ala Leu Ser Lys Met Ala Gly Lys 2375 23802385

Ser Leu lie Vai Met Vai lie Vai Glu Phe Leu Glu Leu Thr Gly

2390 23952400

Gin Thr Gin Gly Gly Tyr lie Asp Leu Ser Ala Asn Leu Leu Thr 2405 24102415

Phe Leu Leu Glu Lys Leu Lys Lys Met Thr Asn Leu Ala lie Gly

2420 24252430

Glu Ala Arg Lys Vai Leu Leu Pro lie Pro Tyr Leu Tyr Cys Glu

2435 24402445

Thr Trp Gin Ser Asp Ala Arg lie Lys Ala Pro Glu Ser Tyr Asp

2450 24552460

Gin Vai Vai Vai Glu Cys Lys Cys Gly Ala Ser Ala Arg Tyr Ser

2465 24702475

Phe Arg Asp Gly Vai His Glu lie Leu Glu Glu Lys Arg Thr Asn

2480 24852490

Trp Cys Lys Asn Phe Phe Leu Trp Gly Pro Asn Phe His Asn Pro

2495 25002505

Asp Pro Lys Arg Met Thr Phe Tyr Glu Tyr Gly Gin Ala Lys Lys

2510 25152520

Cys Pro Vai lie lie lie Gly Glu Asp lie Thr Phe Gly Lys Tyr

2525 25302535

Gly lie Tyr lie Lys Phe Gly His Arg Pro Asp Gly Gly Arg Leu

2540 25452550 lie Arg Gly Thr Thr His Ala Thr lie Ser Arg Glu Glu Leu Leu

2555 25602565

Glu lie Leu Thr Ala Pro Ser Gin Vai Ala lie Gly Lys Vai Lys

2570 25752580

Leu Thr Asp Tyr Cys Asn Gin Lys Gly lie lie Asp Arg Lys Leu

- 59 036116

2585 25902595

Ala Vai Leu Glu Gly Asp Lys He His Phe Trp Lys Ala His Arg

2600 26052610

Gly Ser Lys He Thr Asp Gin Leu Thr lie Glu Asn Leu Thr Asp

2615 26202625

Asp Leu Gly Ser Glu lie Arg Asp lie Thr Trp Glu Leu Tyr Thr

2630 26352640

Gly Gly Thr Cys Thr Vai Lys Gly Vai Ser Leu Arg Ser Cys Ala

2645 26502655

Pro Gly His Arg Thr Lys Ala Met Vai Leu Cys Asp Cys Thr Asp

2660 26652670

Vai Leu Ser Pro Cys Tyr Leu lie Asn Gly Arg Arg Pro Ser Pro

2675 26802685

Phe Asp Vai Ala Glu Gly Tyr Glu Cys His His Arg Lys Pro Arg

2690 26952700

Ala Thr Tyr Glu Asp Leu Glu Met Glu Glu lie Leu Lys Arg Arg

2705 27102715

Vai Pro Vai Tyr Asp Pro Leu Cys Leu Phe Asp Thr Asp Ser Lys

2720 27252730

Leu Leu Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Glu Glu Asp Gin Glu Asp

2735 27402745

Phe Glu Tyr Ala Leu Arg Cys Trp Gly Leu Gly Vai Tyr Vai Ala

2750 27552760

Asp Gly Pro Vai Thr Ser Pro Pro Asp lie Arg lie His His Ser

2765 27702775

Ser Vai Leu Leu Leu Leu Thr Pro Gly Vai Asn Ser Glu Leu Pro

2780 27852790

Leu Gin Tyr lie Arg Cys Tyr Pro His Gin Ala Glu Vai Asp lie

2795 28002805

Tyr lie Arg Ser Gin Leu Leu Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Glu

2810 28152820

Vai Glu Gly Ser Gin Glu Asp Gly Asp Glu Gly Met Gly Asp Ala

2825 28302835

Vai lie Glu Asp Glu Asp Thr Ser Ser Thr Thr Glu Ser lie Pro

2840 28452850

Pro Leu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Pro lie Thr Tyr Vai

2855 28602865

Vai lie Arg Gly Leu Gin Glu Glu Arg Tyr Ala Ser His Leu Lys

2870 28752880

Leu Asn Asp Trp lie Ser Glu Asn lie Ser Glu Pro His Arg Vai

2885 28902895

Gin lie Met Leu Asp Gly Thr Vai Arg Vai Thr lie Lys Glu Gly

2900 29052910

Lys Vai Lys His Leu Phe Gly Vai Tyr Arg lie Glu Asn Ser Leu

2915 29202925

Glu Ala Met Phe Lys Glu Thr lie Ala Asp Leu Pro Vai Ala Thr

2930 29352940

Gin Pro Pro Gin Gly Pro Vai Tyr Thr Ala Lys Glu Leu Ala Gin

2945 29502955

Gly Asn lie Ala Pro Vai Gin Pro Ala Ala Asn Tyr Tyr Gly Met

2960 29652970 lie Glu Gly Arg Gly Asp Pro Met Thr Ala Phe Glu Ala Leu Ser

- 60 036116

2975 29802985

Vai Leu Arg Ser Gin Lys Vai Leu Ala Lys Asp Vai Lys Vai Asn

2990 29953000

Thr Arg Arg Ala Gin Vai Phe Leu Asn Lys Vai Arg Arg lie Ala

3005 30103015

Glu Vai Arg Ala Ser Glu Leu Thr Leu Lys Cys Leu Pro lie Leu

3020 30253030

Gly Lys Vai Asn Gly Arg Lys Leu lie Arg Glu Glu Thr Asn lie

3035 30403045

Pro Asn Gin Arg Leu Ala Ser lie Met Thr Ser lie Gly lie Arg

3050 30553060

Leu Glu Lys Leu Pro Vai Vai Arg Ala Asn Thr Ser Gly Ser Lys

3065 30703075

Phe Arg Gin Ser lie Leu Glu Lys Met Asp Lys Tyr Glu Asn Glu

3080 30853090

Gin Vai Pro Gly Leu His Glu Lys Met Trp Ala Ala Phe Leu Ala

3095 31003105

Thr Ala Arg Gin Asp Leu Arg Asn Thr Tyr Glu Glu Vai Thr Tyr

3110 31153120

Leu Glu Leu Glu Ala Gly lie Asn Arg Lys Gly Ala Pro Gly Phe

3125 31303135

Phe Glu Lys Glu Ser Ser lie Gly Glu Vai Leu Glu Lys Lys Glu

3140 31453150

Lys He Asp Vai Thr He Gin Glu lie Glu Lys Gly Asn His Leu

3155 31603165

Tyr Tyr Glu Thr Ala Met Pro Lys Asn Glu Lys Arg Asp Vai Leu

3170 31753180

Asp Asp Trp Leu Ser Glu Asp Phe Vai Thr Tyr Lys Lys Pro Arg

3185 31903195

Vai lie Gin Tyr Pro Glu Ala Vai Thr Arg Leu Ala lie Thr Lys

3200 32053210 lie Met Tyr Lys Trp Vai Lys Gin Lys Pro lie Vai lie Pro Gly

3215 32203225

Tyr Glu Gly Lys Thr Pro lie Phe Glu lie Phe Glu Lys Vai Ser

3230 32353240

Ala Asp Trp Ala Gin Phe Lys Asn Pro Vai Ala Vai Ser Phe Asp

3245 32503255

Thr Arg Ala Trp Asp Thr Gin Vai Thr Arg Glu Asp Leu Arg Leu

3260 32653270

Vai Gly Arg lie Gin Lys Tyr Tyr Tyr Lys Lys Lys Tyr Trp Lys

3275 32803285

Phe lie Asp Asn Leu Thr Ala Met Met Glu Glu Vai Pro Vai lie

3290 32953300

Thr Vai Glu Gly Asp Met Phe Leu Arg Vai Gly Gin Arg Gly Ser

3305 33103315

Gly Gin Pro Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met Leu Asn Vai Leu

3320 33253330

Thr Met Leu Vai Ala Phe Ser Glu Ser Thr Asn Leu Pro lie Ala

3335 33403345

Ala Ala Trp Lys Ala Cys Arg lie His Vai Cys Gly Asp Asp Gly

3350 33553360

Phe Leu lie Thr Glu Ser Glu Leu Gly Arg Lys Phe Ala Glu Lys

3365 33703375

Gly Vai Pro Leu Leu Ala Ala Phe Gly Lys Pro Gin Lys lie Thr

3380 33853390

Glu Gly Ala Ser Leu Lys Vai Thr Ser Asn Phe Asp Gly lie Glu

3395 34003405

Phe Cys Ser His Thr Pro lie Arg Vai Gin Thr Pro Asn lie Arg

3410 34153420

Trp Met Pro Ala Arg Pro Thr Ala Thr lie Leu Gly Lys Met Ser

3425 34303435

Thr Arg Leu Gly Glu Gly Ala Thr Arg Ser Gly Glu Glu Tyr Glu

3440 34453450

Lys Gin Vai Ala Phe Ala Tyr Leu Leu Met Tyr Pro Trp Asn Pro

3455 34603465

Leu Vai Arg Arg lie Ser Leu Leu Leu Leu Ser Thr Thr Asp Pro

3470 34753480

Met Gly Lys Glu Glu Thr Pro Cys Ser Asp Glu Gly Vai Lys Tyr

3485 34903495

Vai Gly Asp Pro lie Ala Ala Tyr Arg Asp Vai Trp Gly His Lys

3500 35053510

Leu Glu Asp Vai Gly His Vai Asp Gin Pro Gin Leu Ser Arg Met

3515 35203525

Asn Tyr Ser Met Thr Tyr Leu Gly lie Trp Lys Pro Lys Thr Ser

3530 35353540

Gin Arg Leu Vai Glu Gin Cys Cys Arg Leu Ala Glu Lys Ser Asn

3545 35503555

Cys Vai Vai Arg Ala Asp Ser Leu lie Lys Lys Lys Vai Lys lie

3560 35653570

Thr Tyr Asp Pro Gly lie Gly Vai Ala Gin Vai lie Arg Arg Trp

3575 35803585

Glu Glu Leu Glu Trp Thr Arg Arg Lys Pro Glu Leu Thr Asn Vai

3590 35953600 lie Vai Glu Asp Asp lie Phe Leu Vai Leu Trp Lys Arg Phe Ser

3605 36103615

Lys Tyr lie Phe Gin Lys Met Lys Phe Met Gin Arg Met Phe Ala

3620 36253630

Pro Tyr

3635 <210> 3 <211> 540 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 3

atggaaaaac	agattgcata	ttacttaaaa	aaagaaaaac	aaagaaatgg	gtggacggaa	60
ctggtggtag	gagaaagtca	tacaaaaata	accacgcttt	ctggaaagac	ctatcgaggc	120
acctgggaaa	tggagaaacg	gccaaatcct	tatggaacct	atctccccag	acctagtccc	180
caacagctta	cagccctaca	cccccaccca	gtggtgaatt	gtaaggtggt	tgagtacaag	240
gagatggacc	ctaattatgg	tgattgccca	aatacgaacg	gggtgtttgt	tgacgaaaag	300
ggtagaaggc	tgagcagccc	tccattaggc	atttggaaga	taagattgga	ctatagtgac	360
ttggtaaaca	taagcagacc	aacccccgct	agtgggaaaa	actcttacca	agttgagacc	420
tgcagtgggg	agctggctac	agtgacactg	gtacacaata	gggtgctcgt	ggaagattgc	480
agggggctat	accaatggaa	acccaactgt	gaaggaattg	tgctctatgt	gaaaacttgt	540

<210> 4 <211> 180 <212> БЕЛОК <213> пестивирус типа 2

- 62 036116 <400> 4

Met Glu Lys Gin lie Ala Tyr Tyr Leu Lys Lys Glu Lys Gin Arg Asn

1015

Gly Trp Thr Glu Leu Vai Vai Gly Glu Ser His Thr Lys lie Thr Thr 20 2530

Leu Ser Gly Lys Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Glu Met Glu Lys Arg Pro 35 4045

Asn Pro Tyr Gly Thr Tyr Leu Pro Arg Pro Ser Pro Gin Gin Leu Thr

5560

Ala Leu His Pro His Pro Vai Vai Asn Cys Lys Vai Vai Glu Tyr Lys 65 70 7580

Glu Met Asp Pro Asn Tyr Gly Asp Cys Pro Asn Thr Asn Gly Vai Phe 85 9095

Vai Asp Glu Lys Gly Arg Arg Leu Ser Ser Pro Pro Leu Gly lie Trp

100 105110

Lys lie Arg Leu Asp Tyr Ser Asp Leu Vai Asn lie Ser Arg Pro Thr

115 120125

Pro Ala Ser Gly Lys Asn Ser Tyr Gin Vai Glu Thr Cys Ser Gly Glu

130 135140

Leu Ala Thr Vai Thr Leu Vai His Asn Arg Vai Leu Vai Glu Asp Cys

145 150 155160

Arg Gly Leu Tyr Gin Trp Lys Pro Asn Cys Glu Gly lie Vai Leu Tyr

165 170175

Vai Lys Thr Cys

180 <210> 5 <211> 333 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 5

tctgactggg	cagatcaggt	agaaaaacag	gagaaagaaa	gccccccaaa	accacagcgg	60
ccaccaaggc	gagacccacg	aaaagggtta	caaccacaag	tccccaaaga	gactgaggtc	120
acagaaaaga	agagacaacc	tagtgtcacc	ttagtatcgg	gggggcagaa	ggcccaagtc	180
atctacaaag	gcaggaccaa	aaacaaaaag	accccggatg	gagtctatag	atacccagga	240
gctaaagaag	gggacgtagt	aaaggtcagg	aagatgctga	agaattggca	tatagcctta	300
gtgatgtacc	tgatacatat	cataactcca	ggc			333

<210> 6 <211> 111 <212> БЕЛОК <213> пестивирус типа 2 <400> 6

Ser Asp Trp Ala Asp Gin Vai Glu Lys Gin Glu Lys Glu Ser Pro Pro

1015

Lys Pro Gin Arg Pro Pro Arg Arg Asp Pro Arg Lys Gly Leu Gin Pro 20 2530

Gin Vai Pro Lys Glu Thr Glu Vai Thr Glu Lys Lys Arg Gin Pro Ser 35 4045

Vai Thr Leu Vai Ser Gly Gly Gin Lys Ala Gin Vai lie Tyr Lys Gly

5560

Arg Thr Lys Asn Lys Lys Thr Pro Asp Gly Vai Tyr Arg Tyr Pro Gly 65 70 7580

Ala Lys Glu Gly Asp Vai Vai Lys Vai Arg Lys Met Leu Lys Asn Trp 85 9095

His lie Ala Leu Vai Met Tyr Leu lie His lie lie Thr Pro Gly

100 105110 <210> 7 <211> 627 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 7

cttgccaagg	tccagtggtt	cttaaaagat	gaaaactcga	cggggatcaa	ccagatactg	60
tggcaaagac	agatcaacag	atccttacat	ggagaatggc	ctaaccagat	ctgccacggt	120
atgcccaatg	aaactatcac	ggatgaggaa	ttacgcagtc	tgggaatggt	agatacaagc	180
cctagaacaa	actacacctg	ttgccagttg	caatatcatg	agtggaagaa	acatggttgg	240
tgcaactatc	cacaaaaaca	ggcgtggatc	acgaggataa	cggccctaca	agctaacctt	300
accgggcctt	atgagggacc	tgagtgcgcc	gtcatctgcc	gatttaacgg	cagctacaac	360
atcgtaaaac	aggccagaga	tgaggtgagt	ccactgacag	ggtgcaagga	agggcatcct	420
tttctattct	ctggtgaaag	atccgacacc	tcatgcctaa	ggcccccttc	cactagttgg	480
gtaagaccag	tgaaaatgga	cgaggcatca	atggccgatg	gctttgccca	tggggttgat	540
aaggcgataa	tactaatcag	gaagggggca	tcaggaataa	tcaatttcct	agacactatt	600
gggaggtggc	taccggtagc	tgaagca				627

<210> 8 <211> 209 <212> БЕЛОК <213> пестивирус типа 2 <400> 8

Leu 1

Ala

Lys

Vai

Gin 5

Trp Phe

Leu

Lys Asp Glu 10

Asn

Ser

Thr

Gly 15

He

Asn

Gin

He

Leu 20

Trp

Gin Arg

Gin

lie Asn Arg 25

Ser

Leu

His 30

Gly

Glu

Trp

Pro

Asn 35

Gin

He

Cys His

Gly 40

Met Pro Asn

Glu

Thr 45

He

Thr

Asp

Glu

Leu

Arg

Ser

Leu Gly

Met

Vai Asp Thr

Ser

Pro

Arg

Thr

Asn

55 60

Туг Thr Cys Cys Gin Leu Gin Tyr His Glu Trp Lys Lys His Gly Trp 65 70 7580

Cys Asn Tyr Pro Gin Lys Gin Ala Trp lie Thr Arg lie Thr Ala Leu 85 9095

Gin Ala Asn Leu Thr Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Glu Cys Ala Vai lie

100 105110

Cys Arg Phe Asn Gly Ser Tyr Asn lie Vai Lys Gin Ala Arg Asp Glu

115 120125

Vai Ser Pro Leu Thr Gly Cys Lys Glu Gly His Pro Phe Leu Phe Ser

130 135140

Gly Glu Arg Ser Asp Thr Ser Cys Leu Arg Pro Pro Ser Thr Ser Trp

145 150 155160

Vai Arg Pro Vai Lys Met Asp Glu Ala Ser Met Ala Asp Gly Phe Ala

165 170175

His Gly Vai Asp Lys Ala lie lie Leu lie Arg Lys Gly Ala Ser Gly

180 185190 lie lie Asn Phe Leu Asp Thr lie Gly Arg Trp Leu Pro Vai Ala Glu

195 200205

Ala <210> 9 <211> 600 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 9

actatagtac catattgtga	tacttacact	gtgacaggga	tgtatgtcca	tgtaaagaat	60
tgcctcccta gagggttacc	taagcattca	aaaataatct	ccccgacaat	gatatatctg	120
ggagaaggag acccggccca	taatatccag	cacttatttg	gctcaggtat	agcaaagtgg	180

- 64 036116 gtcctagttc tactcgggat tctgggtgag tggtatggag aattggcttc cacaatatac240 ttactactag aatacgggtc tgagtggttg gaacatgaaa gcctggtcac ggaagggttg300 attcctggca ttaatattac aatagaactc ccagctagtc atacagtgcc tggttgggtg360 tgggtcgcag gccagtgggt atgcgtgaag ccagactggt ggcctacaca gatttggatt420 gaaaccgtgg tggcagagac ctggcatata ctaaaaatat tggcgtcagc cctggtgaac480 atagttgcag cgttcgtaaa cctggaattg gtttatctgg tcataatact agtcaaaata540 tcaaaaggga acctgatagg tgccatatta tggtgcttgt tactgtcagg cgctgaaggc600 <210> 10 <211> 200 <212> БЕЛОК <213> пестивирус типа 2 <400> 10

Thr lie Vai Pro Tyr Cys Asp Thr Tyr Thr Vai Thr Gly Met Tyr Vai

1015

His Vai Lys Asn Cys Leu Pro Arg Gly Leu Pro Lys His Ser Lys lie 20 2530 lie Ser Pro Thr Met lie Tyr Leu Gly Glu Gly Asp Pro Ala His Asn

4045 lie Gin His Leu Phe Gly Ser Gly lie Ala Lys Trp Vai Leu Vai Leu

5560

Leu Gly lie Leu Gly Glu Trp Tyr Gly Glu Leu Ala Ser Thr lie Tyr 65 70 7580

Leu Leu Leu Glu Tyr Gly Ser Glu Trp Leu Glu His Glu Ser Leu Vai 85 9095

Thr Glu Gly Leu lie Pro Gly lie Asn lie Thr lie Glu Leu Pro Ala

100 105110

Ser His Thr Vai Pro Gly Trp Vai Trp Vai Ala Gly Gin Trp Vai Cys

115 120125

Vai Lys Pro Asp Trp Trp Pro Thr Gin He Trp He Glu Thr Vai Vai

130 135140

Ala Glu Thr Trp His lie Leu Lys lie Leu Ala Ser Ala Leu Vai Asn

145 150 155160 lie Vai Ala Ala Phe Vai Asn Leu Glu Leu Vai Tyr Leu Vai lie lie

165 170175

Leu Vai Lys lie Ser Lys Gly Asn Leu lie Gly Ala lie Leu Trp Cys

180 185190

Leu Leu Leu Ser Gly Ala Glu Gly

195200 <210> 11 <211> 1116 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 11

tcgtgctaca	aaagacaaga	ctattacaac acccaactag	tcgtcgaaga	aaaaacaggc	60
gtagaaaaac	gatctataat	gggcaagtgg accgtgataa	ccagggaagg	tcgggagcca	120
agattaatgg	agcaaataaa	tatggtattg aatgatagcc	tgtcagaaac	ctactgctat	180
aataggctaa	acaccagcac	ttgggggcgg caaccggcaa	gacaaagagg	gtgtggtcaa	240
accgtgccct	attggcctgg	tgacaatgtt ctagaagaac	aatactacag	cacaggttac	300
tgggtgaatg	taacaggcgg	ttgccagctg agagaaggcg	tatggctatc	aagaaagggt	360
aacgtacagt	gtcagcgtaa	cggctcatcc ttgatgctgc	aattggcgat	aaaagaagag	420
aatgacacta	tggaaatacc	atgtgaccca gtggaaactg	aaagtatggg	tccagttgca	480
cagggcactt	gtgtgtacag	ctgggcattc gccccaagag	ggtggtacta	taacaggaag	540
gatggttatt	ggctccagta	cataaagaaa aacgactacc	agtattggac	aaaaatgcct	600
actgcctcgt	ccgccgcaac	catgtaccgc cacttgctcc	ccttactggt	ggcctgcctc	660
atgggcggta	ggatatcggt	gtggtttgtg gcaatgctcc	tgtctctaca	ggtggaagct	720

- 65 036116 agtgaagtag gcactaaaca actggctgtc acgctaaccc tgtggaaaat ggactggaca780 gaactacttt tctatattgt cttgatgcta gccgttaagg aagaacttat aaaaaaaatt840 gtgaccgcta gccttgtggc cttaaaaaat agtccagtag ccttgagttt tcttattgta900 ctcagacttg tggggggcag tgaagcactc ccagtaggtt tattattaga aaaaatgtgc960 atagaccaac cggagtttgg aactcctttc ctgatctacc tatgggacaa ctggaagtgg1020 actgtgttag tcagcttctc cgcactgaac catgaaaaaa ctataaaact ggcaagaaaa1080 ctgttgttgg caacacatat aacagcgctc acattg1116 <210> 12 <211> 372 <212> БЕЛОК <213> пестивирус типа 2 <400> 12

Ser Cys Tyr Lys Arg Gin Asp Tyr Tyr Asn Thr Gin Leu Vai Vai Glu

1015

Glu Lys Thr Gly Vai Glu Lys Arg Ser lie Met Gly Lys Trp Thr Vai

2530 lie Thr Arg Glu Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gin lie Asn Met 35 4045

Vai Leu Asn Asp Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn

5560

Thr Ser Thr Trp Gly Arg Gin Pro Ala Arg Gin Arg Gly Cys Gly Gin 65 70 7580

Thr Vai Pro Tyr Trp Pro Gly Asp Asn Vai Leu Glu Glu Gin Tyr Tyr 85 9095

Ser Thr Gly Tyr Trp Vai Asn Vai Thr Gly Gly Cys Gin Leu Arg Glu

100 105110

Gly Vai Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Vai Gin Cys Gin Arg Asn Gly

115 120125

Ser Ser Leu Met Leu Gin Leu Ala lie Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met

130 135140

Glu lie Pro Cys Asp Pro Vai Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Vai Ala

145 150 155160

Gin Gly Thr Cys Vai Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr

165 170175

Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gin Tyr lie Lys Lys Asn Asp

180 185190

Tyr Gin Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Met

195 200205

Tyr Arg His Leu Leu Pro Leu Leu Vai Ala Cys Leu Met Gly Gly Arg

210 215220 lie Ser Vai Trp Phe Vai Ala Met Leu Leu Ser Leu Gin Vai Glu Ala

225 230 235240

Ser Glu Vai Gly Thr Lys Gin Leu Ala Vai Thr Leu Thr Leu Trp Lys

245 250255

Met Asp Trp Thr Glu Leu Leu Phe Tyr lie Vai Leu Met Leu Ala Vai

260 265270

Lys Glu Glu Leu lie Lys Lys lie Vai Thr Ala Ser Leu Vai Ala Leu

275 280285

Lys Asn Ser Pro Vai Ala Leu Ser Phe Leu lie Vai Leu Arg Leu Vai

290 295300

Gly Gly Ser Glu Ala Leu Pro Vai Gly Leu Leu Leu Glu Lys Met Cys

305 310 315320 lie Asp Gin Pro Glu Phe Gly Thr Pro Phe Leu lie Tyr Leu Trp Asp

325 330335

Asn Trp Lys Trp Thr Vai Leu Vai Ser Phe Ser Ala Leu Asn His Glu 340 345350

Lys Thr lie Lys Leu Ala Arg Lys Leu Leu Leu Ala Thr His lie Thr 355 360365

Ala Leu Thr Leu 370 <210> 13 <211> 2802 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 13

actggcttga	gtgattcaat	cttctatatg	atgcttataa	caacaaattt	gttaataaag	60
acattcatat	acttgctggg	ggctagtatg	aattgggtcg	agagagaaaa	aaagaaattg	120
ctagtgaaga	ggagactaat	atacaagaaa	gccgttactt	gcagtcagga	tgagaatgta	180
ttggagaata	aattcaacaa	gataactgta	aacgcggatt	tcaccccatg	caagcttgaa	240
cttctacaat	tacttagggc	ttttttagtc	tctttgtgtt	tttcctacta	caaacctctc	300
ctgtatgcag	agactacctt	aactgtaata	gtaattggcg	tacaagagta	caacgtagcc	360
atggcccgcg	ggcgaagtgt	ggtccacagg	ctactagcca	tggcctatta	catatacggc	420
cgcatacagg	gtgacatgtt	ccagctcgcc	actatccagt	gcctgctgtc	gagtccgagg	480
aaaattatga	aacacatggt	agagaatcca	actctcaaga	agctctggca	aggcgaaaca	540
gaactcttca	accagggtgt	tagtcaatcc	aagatagtga	atccaaagaa	aattgggctg	600
gaagaattac	acaagggcat	gtgtggcctc	ccaacagtag	tgcaaaattt	ggtcatatat	660
gcaaagaaga	atgactctct	tattttagga	gagctgggtt	acccccctgg	ggatctcacc	720
agtgatgggt	gggaaatttt	aggtcctggc	agaatcccaa	agatcactaa	cgtcgagtct	780
gctaagatgg	acttactctc	caaacttatg	acctttctgg	ggattgaaag	ctcgagggtc	840
cccaggaccc	cagtccactc	aacaaggaaa	ttattgaaga	tagtaagggg	cttggaaaca	900
ggatgggggt	acactcacgc	aggggggata	agtagcgcaa	aacacgttac	aggtgaaaag	960
aacttaatga	cccacatgga	gggtaggaag	ggaaaatata	tcctacaatc	tcaagaacat	1020
ggtgctgacg	aggtagagta	cggagtaaaa	actgatcaaa	aagctcccga	caatgcctta	1080
tgctactgtt	ttaaccctga	agctacaaac	ataaaaggag	agacgggagc	catggtgttc	1140
atgaagaaga	taggaaaaaa	gtggactctc	gtaacatcag	acggcaataa	agcctattat	1200
aatgtaaaca	atttgaaagg	gtggtctgga	ctaccaataa	tgctgcactc	caccggggcc	1260
atagtgggga	ggattaaatc	agcgtattca	gatgaaaacg	acctggtgga	ggaacttatt	1320
gactctagaa	ctattagtaa	gagcaatgag	acaaacctgg	accaccttat	caaggaattg	1380
gcagacatgc	ggagggggga	gttccgctca	attacccttg	gaacgggagc	cgggaaaacc	1440
acagaactgc	ctaggcaata	cctcacaaca	gtaggtgccc	ataaatccgt	gctggtctta	1500
gtccccttaa	aagcacctgc	tgaaagtgtt	tgccgcttta	tgaggtctaa	ataccctacc	1560
atcaactttt	ccttaagagt	gggggaacgg	aaagagggag	atgtgagcag	cggcatcacc	1620
tacgctactt	acggattttg	ctgccagcta	aacctagtcc	aacttaaaga	atggatatcc	1680
aggtactcaa	tggttttttt	tgatgaatat	cacacagcaa	ctccagaaca	aatagccata	1740
ataagcaaga	ttcatgcact	gaaagttaag	accaggatag	tggctatgtc	agcaaccccc	1800
ccgggtaccg	tgacgactga	aggcaggaag	tttgacattg	aagaggtagg	ggttgctacc	1860
atagagaaag	gagaggaacc	aaaaaggggg	cgcatagcgg	tcgctggtat	gcaggtccca	1920
ttagaagact	taacaggaaa	gaactgcctg	gtgttcgtgg	caaccaaaga	agccgcggag	1980
acggaggcta	aagaactgcg	caccagagga	attaacgcca	cctactacta	ttcaggtata	2040
gaccctaaga	ctctggaaca	tgggatgacc	aatcagccat	actgtattgt	agctaccaat	2100
gccattgaat	caggtataac	ctgtcctgac	ttggatgtgg tcatagacac	catgcagaag	2160
tacgaaaaag tagtgaattt	ctcggcaaag	atgcccttga	ttgtcacttc	attagtaaag	2220
aaaaaaatca	ccagggaaga	acagggccag	aggaaaggtc	gagtgggcag	gcaaaagaaa	2280
ggaaaatact	actacccctc	gggggtggta	ccgaatgggt	caaaagacct	aagctattta	2340
atcctacagg	cccaagaata	tggtgtcttg	gaacaagtca	atataacaga	gtacttcatc	2400
ataatgaatg	aggactgggg	tctctatgac	gtagatgaag	tagaagtgag	aatacttgag	2460
agaatgaaca	aggaaatctt	gctaccacta	ggtattgtgg	agaagcaaat	cttggaaaga	2520

- 67 036116 agtactcacc cggaaaaagt ggcactgttg tataacaaat tagtgcagaa aaatcctata2580 gtatacccta gagtacagga aggtgaggtc agcaaggaat acaataccta taatctggcc2640 gtatatgaca agctaaaaga tgtcaaccca caagccattt atgttctagc agaagaggag2700 agagccacag aaatgatggg tctcgagttt gaacaagacc catctgactt acaggattcg2760 gtagttcagc tttgtgaaga tatcaagagg tatacaaaac tc2802 <210> 14 <211> 934 < 212> БЕЛОК < 213> пестивирус типа 2 < 400> 14

Thr Gly Leu Ser Asp Ser lie Phe Tyr Met Met Leu lie Thr Thr Asn

1015

Leu Leu lie Lys Thr Phe lie Tyr Leu Leu Gly Ala Ser Met Asn Trp

2530

Val Glu Arg Glu Lys Lys Lys Leu Leu Val Lys Arg Arg Leu lie Tyr 35 4045

Lys Lys Ala Val Thr Cys Ser Gin Asp Glu Asn Val Leu Glu Asn Lys

5560

Phe Asn Lys lie Thr Val Asn Ala Asp Phe Thr Pro Cys Lys Leu Glu 65 70 7580

Leu Leu Gin Leu Leu Arg Ala Phe Leu Val Ser Leu Cys Phe Ser Tyr 85 9095

Tyr Lys Pro Leu Leu Tyr Ala Glu Thr Thr Leu Thr Val lie Val lie

100 105110

Gly Val Gin Glu Tyr Asn Val Ala Met Ala Arg Gly Arg Ser Val Val

115 120125

His Arg Leu Leu Ala Met Ala Tyr Tyr lie Tyr Gly Arg lie Gin Gly

130 135140

Asp Met Phe Gin Leu Ala Thr lie Gin Cys Leu Leu Ser Ser Pro Arg

145 150 155160

Lys lie Met Lys His Met Val Glu Asn Pro Thr Leu Lys Lys Leu Trp

165 170175

Gin Gly Glu Thr Glu Leu Phe Asn Gin Gly Val Ser Gin Ser Lys lie

180 185190

Val Asn Pro Lys Lys lie Gly Leu Glu Glu Leu His Lys Gly Met Cys

195 200205

Gly Leu Pro Thr Val Val Gin Asn Leu Val lie Tyr Ala Lys Lys Asn

210 215220

Asp Ser Leu lie Leu Gly Glu Leu Gly Tyr Pro Pro Gly Asp Leu Thr

225 230 235240

Ser Asp Gly Trp Glu lie Leu Gly Pro Gly Arg lie Pro Lys lie Thr

245 250255

Asn Val Glu Ser Ala Lys Met Asp Leu Leu Ser Lys Leu Met Thr Phe

260 265270

Leu Gly lie Glu Ser Ser Arg Val Pro Arg Thr Pro Val His Ser Thr

275 280285

Arg Lys Leu Leu Lys lie Val Arg Gly Leu Glu Thr Gly Trp Gly Tyr

290 295300

Thr His Ala Gly Gly lie Ser Ser Ala Lys His Val Thr Gly Glu Lys

305 310 315320

Asn Leu Met Thr His Met Glu Gly Arg Lys Gly Lys Tyr lie Leu Gin

325 330335

Ser Gin Glu His Gly Ala Asp Glu Val Glu Tyr Gly Val Lys Thr Asp

340 345350

Gin Lys Ala Pro Asp Asn Ala Leu Cys Tyr Cys Phe Asn Pro Glu Ala

355 360365

Thr Asn He Lys Gly Glu Thr Gly Ala Met Vai Phe Met Lys Lys lie

370 375380

Gly Lys Lys Trp Thr Leu Vai Thr Ser Asp Gly Asn Lys Ala Tyr Tyr

385 390 395400

Asn Vai Asn Asn Leu Lys Gly Trp Ser Gly Leu Pro lie Met Leu His

405 410415

Ser Thr Gly Ala lie Vai Gly Arg lie Lys Ser Ala Tyr Ser Asp Glu

420 425430

Asn Asp Leu Vai Glu Glu Leu lie Asp Ser Arg Thr lie Ser Lys Ser

435 440445

Asn Glu Thr Asn Leu Asp His Leu lie Lys Glu Leu Ala Asp Met Arg

450 455460

Arg Gly Glu Phe Arg Ser lie Thr Leu Gly Thr Gly Ala Gly Lys Thr

465 470 475480

Thr Glu Leu Pro Arg Gin Tyr Leu Thr Thr Vai Gly Ala His Lys Ser

485 490495

Vai Leu Vai Leu Vai Pro Leu Lys Ala Pro Ala Glu Ser Vai Cys Arg

500 505510

Phe Met Arg Ser Lys Tyr Pro Thr lie Asn Phe Ser Leu Arg Vai Gly

515 520525

Glu Arg Lys Glu Gly Asp Vai Ser Ser Gly lie Thr Tyr Ala Thr Tyr 530 535540

Gly Phe Cys Cys Gin Leu Asn Leu Vai Gin Leu Lys Glu Trp lieSer

545 550 555560

Arg Tyr Ser Met Vai Phe Phe Asp Glu Tyr His Thr Ala Thr ProGlu

565 570575

Gin lie Ala lie lie Ser Lys lie His Ala Leu Lys Vai Lys Thr Arg

580 585590 lie Vai Ala Met Ser Ala Thr Pro Pro Gly Thr Vai Thr Thr Glu Gly

595 600605

Arg Lys Phe Asp lie Glu Glu Vai Gly Vai Ala Thr lie Glu Lys Gly

610 615620

Glu Glu Pro Lys Arg Gly Arg lie Ala Vai Ala Gly Met Gin Vai Pro

625 630 635640

Leu Glu Asp Leu Thr Gly Lys Asn Cys Leu Vai Phe Vai Ala Thr Lys

645 650655

Glu Ala Ala Glu Thr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Thr Arg Gly lie Asn

660 665670

Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ser Gly lie Asp Pro Lys Thr Leu Glu His Gly

675 680685

Met Thr Asn Gin Pro Tyr Cys lie Vai Ala Thr Asn Ala lie Glu Ser

690 695700

Gly lie Thr Cys Pro Asp Leu Asp Vai Vai lie Asp Thr Met Gin Lys

705 710 715720

Tyr Glu Lys Vai Vai Asn Phe Ser Ala Lys Met Pro Leu lie Vai Thr

725 730735

Ser Leu Vai Lys Lys Lys lie Thr Arg Glu Glu Gin Gly Gin Arg Lys

740 745750

Gly Arg Vai Gly Arg Gin Lys Lys Gly Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ser Gly

755 760765

Vai Vai Pro Asn Gly Ser Lys Asp Leu Ser Tyr Leu lie Leu Gin Ala

770 775780

Gin Glu Tyr Gly Vai Leu Glu Gin Vai Asn lie Thr Glu Tyr Phe lie

785 790 795800 lie Met Asn Glu Asp Trp Gly Leu Tyr Asp Vai Asp Glu Vai Glu Vai

805 810815

Arg lie Leu Glu Arg Met Asn Lys Glu He Leu Leu Pro Leu Gly He 820 825830

Vai Glu Lys Gin lie Leu Glu Arg Ser Thr His Pro Glu Lys Vai Ala

835 840845

Leu Leu Tyr Asn Lys Leu Vai Gin Lys Asn Pro lie Vai Tyr Pro Arg

850 855860

Vai Gin Glu Gly Glu Vai Ser Lys Glu Tyr Asn Thr Tyr Asn Leu Ala

865 870 875880

Vai Tyr Asp Lys Leu Lys Asp Vai Asn Pro Gin Ala lie Tyr Vai Leu

885 890895

Ala Glu Glu Glu Arg Ala Thr Glu Met Met Gly Leu Glu Phe Glu Gin

900 905910

Asp Pro Ser Asp Leu Gin Asp Ser Vai Vai Gin Leu Cys Glu Asp lie

915 920925

Lys Arg Tyr Thr Lys Leu 930 <210> 15 <211> 2061 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 15

ggtcctggca	gaatcccaaa	gatcactaac	gtcgagtctg	ctaagatgga	cttactctcc	60
aaacttatga	cctttctggg	gattgaaagc	tcgagggtcc	ccaggacccc	agtccactca	120
acaaggaaat	tattgaagat	agtaaggggc	ttggaaacag	gatgggggta	cactcacgca	180
ggggggataa	gtagcgcaaa	acacgttaca	ggtgaaaaga	acttaatgac	ccacatggag	240
ggtaggaagg	gaaaatatat	cctacaatct	caagaacatg	gtgctgacga	ggtagagtac	300
ggagtaaaaa	ctgatcaaaa	agctcccgac	aatgccttat	gctactgttt	taaccctgaa	360
gctacaaaca	taaaaggaga	gacgggagcc	atggtgttca	tgaagaagat	aggaaaaaag	420
tggactctcg	taacatcaga	cggcaataaa	gcctattata	atgtaaacaa	tttgaaaggg	480
tggtctggac	taccaataat	gctgcactcc	accggggcca	tagtggggag	gattaaatca	540
gcgtattcag	atgaaaacga	cctggtggag	gaacttattg	actctagaac	tattagtaag	600
agcaatgaga	caaacctgga	ccaccttatc	aaggaattgg	cagacatgcg	gaggggggag	660
ttccgctcaa	ttacccttgg	aacgggagcc	gggaaaacca	cagaactgcc	taggcaatac	720
ctcacaacag	taggtgccca	taaatccgtg	ctggtcttag	tccccttaaa	agcacctgct	780
gaaagtgttt	gccgctttat	gaggtctaaa	taccctacca	tcaacttttc	cttaagagtg	840
ggggaacgga	aagagggaga	tgtgagcagc	ggcatcacct	acgctactta	cggattttgc	900
tgccagctaa	acctagtcca	acttaaagaa	tggatatcca	ggtactcaat	ggtttttttt	960
gatgaatatc	acacagcaac	tccagaacaa	atagccataa	taagcaagat	tcatgcactg	1020
aaagttaaga	ccaggatagt	ggctatgtca	gcaacccccc	cgggtaccgt	gacgactgaa	1080
ggcaggaagt	ttgacattga	agaggtaggg	gttgctacca	tagagaaagg	agaggaacca	1140
aaaagggggc	gcatagcggt	cgctggtatg	caggtcccat	tagaagactt	aacaggaaag	1200
aactgcctgg	tgttcgtggc	aaccaaagaa	gccgcggaga	cggaggctaa	agaactgcgc	1260
accagaggaa	ttaacgccac	ctactactat	tcaggtatag	accctaagac	tctggaacat	1320
gggatgacca	atcagccata	ctgtattgta	gctaccaatg	ccattgaatc	aggtataacc	1380
tgtcctgact	tggatgtggt	catagacacc	atgcagaagt	acgaaaaagt	agtgaatttc	1440
tcggcaaaga	tgcccttgat	tgtcacttca	ttagtaaaga	aaaaaatcac	cagggaagaa	1500
cagggccaga	ggaaaggtcg	agtgggcagg	caaaagaaag	gaaaatacta	ctacccctcg	1560

- 70 036116

ggggtggtac	cgaatgggtc	aaaagaccta	agctatttaa	tcctacaggc	ccaagaatat	1620
ggtgtcttgg	aacaagtcaa	tataacagag	tacttcatca	taatgaatga	ggactggggt	1680
ctctatgacg	tagatgaagt	agaagtgaga	atacttgaga	gaatgaacaa	ggaaatcttg	1740
ctaccactag	gtattgtgga	gaagcaaatc	ttggaaagaa	gtactcaccc	ggaaaaagtg	1800
gcactgttgt	ataacaaatt	agtgcagaaa	aatcctatag	tataccctag	agtacaggaa	1860
ggtgaggtca	gcaaggaata	caatacctat	aatctggccg	tatatgacaa	gctaaaagat	1920
gtcaacccac	aagccattta	tgttctagca	gaagaggaga	gagccacaga	aatgatgggt	1980
ctcgagtttg	aacaagaccc	atctgactta	caggattcgg	tagttcagct	ttgtgaagat	2040
atcaagaggt	atacaaaact	c				2061

<210> 16 <211> 687 <212> БЕЛОК <213> пестивирус типа 2 <400> 16

Gly Pro Gly Arg He Pro Lys lie Thr Asn Vai Glu Ser Ala Lys Met 15 1015

Asp Leu Leu Ser Lys Leu Met Thr Phe Leu Gly lie Glu Ser Ser Arg 20 2530

Vai Pro Arg Thr Pro Vai His Ser Thr Arg Lys Leu Leu Lys lie Vai 35 4045

Arg Gly Leu Glu Thr Gly Trp Gly Tyr Thr His Ala Gly Gly lie Ser 50 5560

Ser Ala Lys His Vai Thr Gly Glu Lys Asn Leu Met Thr His Met Glu 65 70 7580

Gly Arg Lys Gly Lys Tyr lie Leu Gin Ser Gin Glu His Gly Ala Asp 85 9095

Glu Vai Glu Tyr Gly Vai Lys Thr Asp Gin Lys Ala Pro Asp Asn Ala

100 105110

Leu Cys Tyr Cys Phe Asn Pro Glu Ala Thr Asn lie Lys Gly Glu Thr

115 120125

Gly Ala Met Vai Phe Met Lys Lys lie Gly Lys Lys Trp Thr Leu Vai

130 135140

Thr Ser Asp Gly Asn Lys Ala Tyr Tyr Asn Vai Asn Asn Leu Lys Gly

145 150 155160

Trp Ser Gly Leu Pro lie Met Leu His Ser Thr Gly Ala lie Vai Gly

165 170175

Arg lie Lys Ser Ala Tyr Ser Asp Glu Asn Asp Leu Vai Glu Glu Leu

180 185190 lie Asp Ser Arg Thr lie Ser Lys Ser Asn Glu Thr Asn Leu Asp His

195 200205

Leu lie Lys Glu Leu Ala Asp Met Arg Arg Gly Glu Phe Arg Ser lie

210 215220

Thr Leu Gly Thr Gly Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu Pro Arg Gin Tyr

225 230 235240

Leu Thr Thr Vai Gly Ala His Lys Ser Vai Leu Vai Leu Vai Pro Leu

245 250255

Lys Ala Pro Ala Glu Ser Vai Cys Arg Phe Met Arg Ser Lys Tyr Pro

260 265270

Thr lie Asn Phe Ser Leu Arg Vai Gly Glu Arg Lys Glu Gly Asp Vai

275 280285

Ser Ser Gly lie Thr Tyr Ala Thr Tyr Gly Phe Cys Cys Gin Leu Asn

290 295300

Leu Vai Gin Leu Lys Glu Trp lie Ser Arg Tyr Ser Met Vai Phe Phe

- 71 036116

305 310 315320

Asp Glu Tyr His Thr Ala Thr Pro Glu Gin He Ala lie lie Ser Lys

325 330335 lie His Ala Leu Lys Vai Lys Thr Arg lie Vai Ala Met Ser Ala Thr

340 345350

Pro Pro Gly Thr Vai Thr Thr Glu Gly Arg Lys Phe Asp lie Glu Glu

355 360365

Vai Gly Vai Ala Thr He Glu Lys Gly Glu Glu Pro Lys Arg Gly Arg

370 375380 lie Ala Vai Ala Gly Met Gin Vai Pro Leu Glu Asp Leu Thr Gly Lys

385 390 395400

Asn Cys Leu Vai Phe Vai Ala Thr Lys Glu Ala Ala Glu Thr Glu Ala

405 410415

Lys Glu Leu Arg Thr Arg Gly He Asn Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ser Gly

420 425430 lie Asp Pro Lys Thr Leu Glu His Gly Met Thr Asn Gin Pro Tyr Cys

435 440445 lie Vai Ala Thr Asn Ala lie Glu Ser Gly lie Thr Cys Pro Asp Leu

450 455460

Asp Vai Vai lie Asp Thr Met Gin Lys Tyr Glu Lys Vai Vai Asn Phe

465 470 475480

Ser Ala Lys Met Pro Leu lie Vai Thr Ser Leu Vai Lys Lys Lys lie

485 490495

Thr Arg Glu Glu Gin Gly Gin Arg Lys Gly Arg Vai Gly Arg Gin Lys

500 505510

Lys Gly Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ser Gly Vai Vai Pro Asn Gly Ser Lys

515 520525

Asp Leu Ser Tyr Leu lie Leu Gin Ala Gin Glu Tyr Gly Vai Leu Glu

530 535540

Gin Vai Asn lie Thr Glu Tyr Phe lie lie Met Asn Glu Asp Trp Gly

545 550 555560

Leu Tyr Asp Vai Asp Glu Vai Glu Vai Arg lie Leu Glu Arg Met Asn

565 570575

Lys Glu lie Leu Leu Pro Leu Gly lie Vai Glu Lys Gin lie Leu Glu

580 585590

Arg Ser Thr His Pro Glu Lys Vai Ala Leu Leu Tyr Asn Lys Leu Vai

595 600605

Gin Lys Asn Pro lie Vai Tyr Pro Arg Vai Gin Glu Gly Glu Vai Ser

610 615620

Lys Glu Tyr Asn Thr Tyr Asn Leu Ala Vai Tyr Asp Lys Leu Lys Asp

625 630 635640

Vai Asn Pro Gin Ala lie Tyr Vai Leu Ala Glu Glu Glu Arg Ala Thr

645 650655

Glu Met Met Gly Leu Glu Phe Glu Gin Asp Pro Ser Asp Leu Gin Asp

660 665670

Ser Vai Vai Gin Leu Cys Glu Asp lie Lys Arg Tyr Thr Lys Leu

675 680685 <210> 17 <211> 201 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 17 tctgggatca ctgagaaact gctagtaggt acgatggtgg ggtatattgg atacaaagcc ttaaccagaa accacgtgcc ctgggtcagc aaagagtatt gttatgagct gaccgattca

120

- 72 036116

Tyr lie 15

Lys Glu

Ser Phe

His Pro ccggatactt acgaaaactc attcgcacct ttggacgtcg acgtccaaaa ctccggtgaa 180 ggaaaacacc cagagcaact g 201 <210> 18 <211> 67 <212> БЕЛОК <213> пестивирус типа 2 <400> 18

Ser Gly He Thr Glu Lys Leu Leu Vai Gly Thr Met Vai Gly 1510

Gly Tyr Lys Ala Leu Thr Arg Asn His Vai Pro Trp Vai Ser 20 2530

Tyr Cys Tyr Glu Leu Thr Asp Ser Pro Asp Thr Tyr Glu Asn 35 4045

Ala Pro Leu Asp Vai Asp Vai Gin Asn Ser Gly Glu Gly Lys 50 5560

Glu Gin Leu 65 <210> 19 <211> 2433 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 19

gcagaccatc	aattgaggca	actactggag	actgggagag	acaaggcaat	tgatttccta	60
aaaggaatcc	gcgagttcac	tagtggggcc	ataaacagtc	caaaggcact	aagtatatgg	120
gagaaaatat	atcagtattt	gaagaagcat	cagggcgaga	tcatctcatc	agcagcgtgg	180
ggcagtgcga	cggcccttca	cgacagtatt	aaatctagac	taggagatga	ggtcgctact	240
gcagtaataa	tcctcaagta	tttagcattt	ggtgaaagag	aactgtctgg	gctaactagg	300
caagttctaa	ttgacatcat	agtatattat	atagttaaca	agccccggtt	cgaaggagac	360
gactacgcaa acttatgcgg	agagaaaagg tgtccaattt	aagaaggcta ttggggtgtg	gtcatcgaag tccattaata	tcctgatggg agatactgca	ggcactggcg accaatttct	420 480
gattatctac	cctatgccac	cgccactttg	gcttttcttc	gcccaacctt	catggaatca	540
gcagtggtgg	tcgcttcctc	tatctataga	gcttttctct	ccattaagca	tgcggaaaac	600
aggagtcttg	tcacgcaggt	cgcttctgcc	gccctcgaag	tcatgggcct	gaccccagta	660
tcggctggcc	taggcgtctt	gctggggctt	gggttgtgtg	tgctccatat	gaacattgac	720
aagaatgagg	agaaaaggac	acttatactg	aaaatgtttg	tcaaaaactt	tatagaccag	780
gcggcactag	acgagttgga	taaactggag	ccagaaaaaa	taatcctctc	attgttggag	840
ggtatccaaa	cctgcacaaa	cccgattaga	gcaatcatga	ttttgtacag	ggtgtactac	900
aagggagaaa	ctttcacaga	agctttgtct	aagatggccg	gcaagtctct	cattgtgatg	960
gtcatagtcg	agttcctgga	attgacaggc	caaacccaag	gagggtatat	agatcttagt	1020
gctaatttgc	tgacctttct	cctcgagaaa	ctaaaaaaaa	tgactaacct	cgccatcggg	1080
gaagctagaa	aggtcttgct	ccccatccca	tacttgtact	gtgaaacctg	gcagtctgac	1140
gccagaatca	aggcccctga	atcctacgac	caagtggtag	tggaatgcaa	atgtggcgct	1200
tcagcgaggt	attccttccg	cgatggagtt	catgagatat	tggaagaaaa	aaggactaat	1260
tggtgcaaga	acttcttctt	atggggaccc	aacttccaca	atccggatcc	aaaaaggatg	1320
acattctatg	aatacggcca	agcaaaaaag	tgtcctgtta	tcataattgg	tgaagacata	1380
accttcggca	aatatggcat	atatatcaaa	tttggccata	ggcctgatgg	agggaggtta	1440
ataaggggta	ccacccacgc	tactatcagt	agggaggaat	tgctggaaat	cctaacagcc	1500
ccaagccaag	tggccatagg	caaggtcaag	ctaaccgatt	actgtaatca	aaaaggaata	1560
atagacagga	aattggccgt	acttgaaggt	gacaaaatac	atttttggaa	agcacaccgt	1620
ggatccaaaa	tcacagacca	actcactatt	gagaatctga	cagatgattt	ggggtcagaa	1680
atcagggaca	tcacatggga	gctgtacaca	ggtggaacgt	gcaccgtaaa	aggggtgtcc	1740
cttagatcat	gcgcaccagg	tcatagaact	aaggctatgg	tcttgtgtga	ttgcactgat	1800
gtgcttagcc	cctgttacct	aataaacggc	aggagaccat	ccccatttga	cgtcgcggaa	1860
ggttatgaat	gtcaccaccg	gaagccccga	gcgacgtatg	aagacctaga	aatggaggaa	1920
atactaaaga	gacgagtccc	tgtctacgat	cctctgtgtt	tgtttgacac	tgatagtaaa	1980

- 73 036116

ctgctacctc	ccgacaccta	ctacttggaa	gaagatcaag	aggactttga	gtacgcattg	2040
agatgctggg	gcctcggggt	ttatgtagca	gacgggcctg	tcacttcccc	cccggacata	2100
agaatacacc	atagttcggt	attactactg	ctgacacctg	gagtaaactc	agagttgccc	2160
ttacagtaca	tacgttgtta	ccctcatcag	gcagaggtgg	acatctacat	taggagteag	2220
cttttggagg	aggaagacac	tgctacggag	gtggaaggct	cccaggaaga	tggtgatgaa	2280
gggatgggcg	atgcggtaat	agaggatgag	gatacatcgt	ccacaacaga	atcaataccc	2340
ccactagaag	aggaggaagg	gggcgaagag	ccaatcacct	atgtggtcat	aaggggatta	2400
caagaagaaa	gatacgccag	ccatcttaaa	eta			2433

<210> 20 <211> 811 <212> БЕЛОК <213> пестивирус типа 2 <400> 20

Ala Asp His Gin Leu Arg Gin Leu Leu Glu Thr Gly Arg Asp Lys Ala 15 1015

He Asp Phe Leu Lys Gly lie Arg Glu Phe Thr Ser Gly Ala lie Asn

2530

Ser Pro Lys Ala Leu Ser lie Trp Glu Lys lie Tyr Gin Tyr Leu Lys 35 4045

Lys His Gin Gly Glu lie lie Ser Ser Ala Ala Trp Gly Ser Ala Thr

5560

Ala Leu His Asp Ser lie Lys Ser Arg Leu Gly Asp Glu Vai Ala Thr 65 70 7580

Ala Vai lie lie Leu Lys Tyr Leu Ala Phe Gly Glu Arg Glu Leu Ser 85 9095

Gly Leu Thr Arg Gin Vai Leu lie Asp lie lie Vai Tyr Tyr lie Vai 100 105110

Asn Lys Pro Arg Phe Glu Gly Asp Asp Tyr Ala Lys Arg Lys Gly Arg 115 120125

Arg Leu Vai lie Glu Vai Leu Met Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Ala Vai

130 135140

Ser Asn Phe Trp Gly Vai Ser lie Asn Lys lie Leu Gin Pro lie Ser

145 150 155160

Asp Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ala Thr Leu Ala Phe Leu Arg Pro Thr

165 170175

Phe Met Glu Ser Ala Vai Vai Vai Ala Ser Ser lie Tyr Arg Ala Phe

180 185190

Leu Ser lie Lys His Ala Glu Asn Arg Ser Leu Vai Thr Gin Vai Ala

195 200205

Ser Ala Ala Leu Glu Vai Met Gly Leu Thr Pro Vai Ser Ala Gly Leu

210 215220

Gly Vai Leu Leu Gly Leu Gly Leu Cys Vai Leu His Met Asn lie Asp

225 230 235240

Lys Asn Glu Glu Lys Arg Thr Leu lie Leu Lys Met Phe Vai Lys Asn

245 250255

Phe lie Asp Gin Ala Ala Leu Asp Glu Leu Asp Lys Leu Glu Pro Glu

260 265270

Lys lie lie Leu Ser Leu Leu Glu Gly lie Gin Thr Cys Thr Asn Pro

275 280285 lie Arg Ala lie Met lie Leu Tyr Arg Vai Tyr Tyr Lys Gly Glu Thr

290 295300

Phe Thr Glu Ala Leu Ser Lys Met Ala Gly Lys Ser Leu lie Vai Met

305 310 315320

Vai lie Vai Glu Phe Leu Glu Leu Thr Gly Gin Thr Gin Gly Gly Tyr

325 330335 lie Asp Leu Ser Ala Asn Leu Leu Thr Phe Leu Leu Glu Lys Leu Lys

340 345350

Lys Met Thr Asn Leu Ala lie Gly Glu Ala Arg Lys Vai Leu Leu Pro

355 360365 lie Pro Tyr Leu Tyr Cys Glu Thr Trp Gin Ser Asp Ala Arg lie Lys

370 375380

Ala Pro Glu Ser Tyr Asp Gin Vai Vai Vai Glu Cys Lys Cys Gly Ala

385 390 395400

Ser Ala Arg Tyr Ser Phe Arg Asp Gly Vai His Glu lie Leu Glu Glu

405 410415

Lys Arg Thr Asn Trp Cys Lys Asn Phe Phe Leu Trp Gly Pro Asn Phe

420 425430

His Asn Pro Asp Pro Lys Arg Met Thr Phe Tyr Glu Tyr Gly Gin Ala

435 440445

Lys Lys Cys Pro Vai lie lie lie Gly Glu Asp lie Thr Phe Gly Lys

450 455460

Tyr Gly lie Tyr lie Lys Phe Gly His Arg Pro Asp Gly Gly Arg Leu

465 470 475480 lie Arg Gly Thr Thr His Ala Thr lie Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu

485 490495 lie Leu Thr Ala Pro Ser Gin Vai Ala lie Gly Lys Vai Lys Leu Thr

500 505510

Asp Tyr Cys Asn Gin Lys Gly lie lie Asp Arg Lys Leu Ala Vai Leu 515 520525

Glu Gly Asp Lys lie His Phe Trp Lys Ala His Arg Gly Ser Lys lie 530 535540

Thr Asp Gin Leu Thr lie Glu Asn Leu Thr Asp Asp Leu Gly Ser Glu

545 550 555560 lie Arg Asp lie Thr Trp Glu Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Vai

565 570575

Lys Gly Vai Ser Leu 580	Arg Ser	Cys Ala 585	Pro	Gly His	Arg	Thr 590	Lys	Ala
Met Vai Leu Cys Asp	Cys Thr	Asp Vai	Leu	Ser Pro	Cys	Tyr	Leu	He

595 600 605

Asn Gly Arg Arg Pro Ser Pro Phe Asp Vai Ala Glu Gly Tyr Glu Cys

610 615620

His His Arg Lys Pro Arg Ala Thr Tyr Glu Asp Leu Glu Met Glu Glu

625 630 635640 lie Leu Lys Arg Arg Vai Pro Vai Tyr Asp Pro Leu Cys Leu Phe Asp

645 650655

Thr Asp Ser Lys Leu Leu Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Glu Glu Asp

660 665670

Gin Glu Asp Phe Glu Tyr Ala Leu Arg Cys Trp Gly Leu Gly Vai Tyr

675 680685

Vai Ala Asp Gly Pro Vai Thr Ser Pro Pro Asp lie Arg lie His His

690 695700

Ser Ser Vai Leu Leu Leu Leu Thr Pro Gly Vai Asn Ser Glu Leu Pro

705 710 715720

Leu Gin Tyr lie Arg Cys Tyr Pro His Gin Ala Glu Vai Asp lie Tyr

725 730735 lie Arg Ser Gin Leu Leu Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Glu Vai Glu

740 745750

Gly Ser Gin Glu Asp Gly Asp Glu Gly Met Gly Asp Ala Vai lie Glu

755 760765

Asp Glu Asp Thr Ser Ser Thr Thr Glu Ser lie Pro Pro Leu Glu Glu

770 775780

Glu Glu Gly Gly Glu Glu Pro lie Thr Tyr Vai Vai lie Arg Gly Leu

785 790 795800

Gin Glu Glu Arg Tyr Ala Ser His Leu Lys Leu

805810 <210> 21 <211> 2256 <212> ДНК <213> пестивирус типа 2 <400> 21

aatgactgga tcagtgaaaa	catttcagag	ccacacagag	tccaaattat	gctagatggg	60
acagtgagag tcacaataaa	agagggcaaa	gtgaaacatt	tgtttggggt	ctatagaata	120
gaaaactccc tggaagcaat	gtttaaagag	accatagctg	acctccccgt	agctacccaa	180
ccgccccagg ggccagtcta	tacggctaaa	gagctggccc	aagggaacat	cgccccggtc	240
caacctgcag cgaattatta	cggaatgata	gaggggagag	gcgacccaat	gacggcattc	300
gaagccttat cagtcttgcg	gtcacaaaaa	gtcttagcca	aggacgtgaa	ggtgaacacc	360
cgcagggcgc aggttttttt	aaataaagtc	aggagaattg	ctgaggtcag	agcgtcggaa	420
ctgacattaa aatgcttacc	gatacttggc	aaagtaaatg	ggaggaaatt	gattagagag	480
gaaaccaaca tccccaacca	aaggttggca	tcaataatga	cctcaatagg	aattagacta	540
gaaaaactgc cagtggttag	agcaaacact	tccggctcta	agttcagaca	gtcaatctta	600
gaaaaaatgg ataagtatga	aaatgaacaa	gtcccagggt	tacatgaaaa	gatgtgggca	660
gcgttcctgg caactgccag	gcaagattta	agaaatacct	atgaggaagt	aacttatctt	720
gaattagagg ccggaatcaa	tcggaaagga	gccccaggtt	tctttgaaaa	agaaagctca	780
ataggagaag tgctggaaaa	aaaagaaaaa	attgacgtca	caatccaaga	gattgaaaaa	840
ggcaaccact tatactatga	aacagccatg	ccaaaaaatg	agaaaagaga	tgtgcttgat	900
gattggttgt cagaggattt	cgtcacttat	aagaaaccac	gtgtgataca	gtaccctgag	960
gcagtcaccc ggttggccat	caccaaaata	atgtataagt	gggtgaagca	aaagcctata	1020
gtgattcccg gttatgaggg	aaaaaccccg	atctttgaaa	tatttgaaaa	agtcagtgca	1080
gattgggctc agttcaaaaa	tccggtagcc	gtcagcttcg	acaccagagc	ctgggacact	1140
caagtaacaa gagaagacct	caggctggta	gggcggatac	agaaatacta	ttacaaaaaa	1200
aaatattgga agttcattga	caatttgaca	gccatgatgg	aggaagtgcc	tgtaatcact	1260
gtagaaggag atatgttcct	cagagttgga	cagcgcggat	ccggacagcc	tgatacctca	1320
gcaggcaatt ccatgctaaa	tgtgctgact	atgttggtag	ctttctctga	atccacaaat	1380
ctgcccatag cggctgcctg	gaaggcctgt	cggatccacg	tctgtggtga	cgacggtttc	1440
ttaatcacag aatcggaatt	agggaggaag	tttgctgaaa	aaggtgttcc	tctgttagct	1500
gcatttggca aaccccaaaa	aattacagag	ggagcgagcc	taaaggtaac	cagcaacttt	1560
gacggaatag agttttgtag	tcatacccct	atcagagtcc	aaacaccaaa	catcaggtgg	1620
atgccagcga gaccaacagc	aacaatccta	ggcaaaatga	gtaccaggct	gggtgagggt	1680
gccaccaggt cgggagaaga	atacgaaaaa	caggtggcat	tcgcatatct	actgatgtac	1740
ccctggaacc cgctggtcag	gagaatcagc	ctcctattgt	tatcgactac	tgacccaatg	1800
gggaaagagg aaaccccatg	ctccgatgag	ggggtgaagt	atgttgggga	ccctatcgct	1860
gcatacaggg atgtatgggg	gcacaaatta	gaggatgtag	gccatgttga	tcaaccgcag	1920
ttatcccgga tgaactatag	catgacttac	ttagggattt	ggaaaccaaa	gacaagtcag	1980
cggctagtcg aacagtgttg	tcgtctggcc	gagaaaagca	attgtgtggt	acgtgctgac	2040
tccctgataa agaaaaaggt	caagatcact	tatgacccgg	ggataggagt	ggctcaggtc	2100
attcgtaggt gggaagagct	tgagtggacc	agaaggaaac	ctgaactcac	caatgtaatt	2160
gtagaagatg atatcttcct	agtcctgtgg	aagagatttt	caaagtacat	ttttcagaaa	2220
atgaagttca tgcagagaat	gttcgcccct	tattaa			2256

- 76 036116 <210> 22 <211> 751 < 212> БЕЛОК < 213> пестивирус типа 2 < 400> 22

Asn Asp Trp lie Ser Glu Asn lie Ser Glu Pro His Arg Vai Gin lie 15 1015

Met Leu Asp Gly Thr Vai Arg Vai Thr lie Lys Glu Gly Lys Vai Lys 20 2530

His Leu Phe Gly Vai Tyr Arg lie Glu Asn Ser Leu Glu Ala Met Phe 35 4045

Lys Glu Thr lie Ala Asp Leu Pro Vai Ala Thr Gin Pro Pro Gin Gly

5560

Pro Vai Tyr Thr Ala Lys Glu Leu Ala Gin Gly Asn lie Ala Pro Vai 65 70 7580

Gin Pro Ala Ala Asn Tyr Tyr Gly Met lie Glu Gly Arg Gly Asp Pro 85 9095

Met Thr Ala Phe Glu Ala Leu Ser Vai Leu Arg Ser Gin Lys Vai Leu

100 105110

Ala Lys Asp Vai Lys Vai Asn Thr Arg Arg Ala Gin Vai Phe Leu Asn

115 120125

Lys Vai Arg Arg lie Ala Glu Vai Arg Ala Ser Glu Leu Thr Leu Lys

130 135140

Cys Leu Pro lie Leu Gly Lys Vai Asn Gly Arg Lys Leu lie Arg Glu

145 150 155160

Glu Thr Asn lie Pro Asn Gin Arg Leu Ala Ser lie Met Thr Ser lie

165 170175

Gly lie Arg Leu Glu Lys Leu Pro Vai Vai Arg Ala Asn Thr Ser Gly

180 185190

Ser Lys Phe Arg Gin Ser lie Leu Glu Lys Met Asp Lys Tyr Glu Asn

195 200205

Glu Gin Vai Pro Gly Leu His Glu Lys Met Trp Ala Ala Phe Leu Ala

210 215220

Thr Ala Arg Gin Asp Leu Arg Asn Thr Tyr Glu Glu Vai Thr Tyr Leu

225 230 235240

Glu Leu Glu Ala Gly lie Asn Arg Lys Gly Ala Pro Gly Phe Phe Glu

245 250255

Lys Glu Ser Ser lie Gly Glu Vai Leu Glu Lys Lys Glu Lys lie Asp

260 265270

Vai Thr lie Gin Glu lie Glu Lys Gly Asn His Leu Tyr Tyr Glu Thr

275 280285

Ala Met Pro Lys Asn Glu Lys Arg Asp Vai Leu Asp Asp Trp Leu Ser

290 295300

Glu Asp Phe Vai Thr Tyr Lys Lys Pro Arg Vai lie Gin Tyr Pro Glu

305 310 315320

Ala Vai Thr Arg Leu Ala lie Thr Lys lie Met Tyr Lys Trp Vai Lys

325 330335

Gin Lys Pro lie Vai lie Pro Gly Tyr Glu Gly Lys Thr Pro lie Phe

340 345350

Glu lie Phe Glu Lys Vai Ser Ala Asp Trp Ala Gin Phe Lys Asn Pro

355 360365

Vai Ala Vai Ser Phe Asp Thr Arg Ala Trp Asp Thr Gin Vai Thr Arg

370 375380

Glu Asp Leu Arg Leu Vai Gly Arg lie Gin Lys Tyr Tyr Tyr Lys Lys

385 390 395400

Lys Tyr Trp Lys Phe He Asp Asn Leu Thr Ala Met Met Glu Glu Vai

405 410415

Pro Vai lie Thr Vai Glu Gly Asp Met Phe Leu Arg Vai Gly Gin Arg

420 425430

Gly Ser Gly Gin Pro Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met Leu Asn Vai

435 440445

Leu Thr Met Leu Vai Ala Phe Ser Glu Ser Thr Asn Leu Pro lie Ala

450 455460

Ala Ala Trp Lys Ala Cys Arg lie His Vai Cys Gly Asp Asp Gly Phe

465 470 475480

Leu lie Thr Glu Ser Glu Leu Gly Arg Lys Phe Ala Glu Lys Gly Vai

485 490495

Pro Leu Leu Ala Ala Phe Gly Lys Pro Gin Lys lie Thr Glu Gly Ala

500 505510

Ser Leu Lys Vai Thr Ser Asn Phe Asp Gly lie Glu Phe Cys Ser His

515 520525

Thr Pro lie Arg Vai Gin Thr Pro Asn lie Arg Trp Met Pro Ala Arg

530 535540

Pro Thr Ala Thr lie Leu Gly Lys Met Ser Thr Arg Leu Gly Glu Gly

545 550 555560

Ala Thr Arg Ser Gly Glu Glu Tyr Glu Lys Gin Vai Ala Phe Ala Tyr

565 570575

Leu Leu Met Tyr Pro Trp Asn Pro Leu Vai Arg Arg lie Ser Leu Leu

580 585590

Leu Leu Ser Thr Thr Asp Pro Met Gly Lys Glu Glu Thr Pro Cys Ser

595 600605

Asp Glu Gly Vai Lys Tyr Vai Gly Asp Pro lie Ala Ala Tyr Arg Asp

610 615620

Vai Trp Gly His Lys Leu Glu Asp Vai Gly His Vai Asp Gin Pro Gin

625 630 635640

Leu Ser Arg Met Asn Tyr Ser Met Thr Tyr Leu Gly lie Trp Lys Pro

645 650655

Lys Thr Ser Gin Arg Leu Vai Glu Gin Cys Cys Arg Leu Ala Glu Lys

660 665670

Ser Asn Cys Vai Vai Arg Ala Asp Ser Leu lie Lys Lys Lys Vai Lys

675 680685 lie Thr Tyr Asp Pro Gly lie Gly Vai Ala Gin Vai lie Arg Arg Trp

690 695700

Glu Glu Leu Glu Trp Thr Arg Arg Lys Pro Glu Leu Thr Asn Vai lie

705 710 715720

Vai Glu Asp Asp lie Phe Leu Vai Leu Trp Lys Arg Phe Ser Lys Tyr

725 730735 lie Phe Gin Lys Met Lys Phe Met Gin Arg Met Phe Ala Pro Tyr

740 745750 <210> 23 <211> 17 <212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> лабораторно-синтезированная последовательность ДНК < 400> 23 tgcctggtat tcgtggc 17 <210> 24

- 78 036116 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> лабораторно-синтезированная последовательность ДНК <400> 24 tcatcccatg ttccagagt 19 <210> 25 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> лабораторно-синтезированная последовательность ДНК <400> 25 cctccgtctc cgcggctttg g 21 <210> 26 <211> 143 <212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> лабораторно-синтезированная последовательность ДНК < 400> 26 aacaggaaag aactgcctgg tattcgtggc aaccaaagaa gccgcggaga cggaggctaa 60 agaactgcgc accagaggaa ttaacgccac ctattcaggt atagacccta agactctgga 120 acatgggatg accaatcagc cat 143

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Композиция для защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, содержащая инактивированный пестивирус, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 1.
2. Композиция для защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, содержащая инактивированный пестивирус, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2.
3. Композиция по п.1 или 2, где пестивирус представляет собой химически инактивированный пестивирус и где пестивирус инактивирован обработкой инактивирующим средством, выбранным из группы, состоящей из бинарного этиленимина, этиленимина, ацетилметиленимина, β-этиленимина, βпропиолактона, глутарового альдегида, озона и формальдегида.
4. Композиция по п.1 или 2, где пестивирус является физически инактивированным пестивирусом и где пестивирус инактивирован обработкой УФ-излучением, рентгеновским излучением, γ-излучением, замораживанием-оттаиванием и/или нагреванием.
5. Композиция по п.1 или 2, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.
6. Композиция по п.5, где фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом является адъювант.
7. Композиция по п.6, где адъювант представляет собой адъювант на основе эмульсии типа масло-вводе.
8. Композиция для защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, содержащая аттенуированный пестивирус, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 1.
9. Композиция для защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, содержащая аттенуированный пестивирус, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2.
10. Композиция по п.8 или 9, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.
11. Композиция по п.10, где фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом является адъювант.
12. Композиция по п.11, где адъювант представляет собой адъювант на основе эмульсии типа масло-в-воде.
13. Композиция по п.8 или 9, где пестивирус находится в лиофилизированной форме.
14. Композиция по п.8 или 9, в которой композиция содержит по меньшей мере около 10⁴ вирусных частиц.
15. Композиция для защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, содержащая вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21.

- 79 036116
16. Композиция для защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, содержащая вектор, кодирующий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична

SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22.
17. Композиция по п.15 или 16, где вектор представляет собой вектор экспрессии бакуловируса или вектор аденовируса собак.
18. Композиция по любому из пп.1-17, где заболевание характеризуется врожденным тремором.
19. Способ защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, включающий введение беременной свиноматке или молодой свинье, свиноматке или молодой свинье перед размножением композиции по пп.1, 2, 8, 9, 14 или 15 в количестве, достаточном для защиты поросят.
20. Способ по п.19, где заболевание характеризуется врожденным тремором.
21. Способ по п.19, в котором способ включает введение композиции беременной свиноматке или молодой свинье.
22. Способ по п.19, где способ включает введение композиции свиноматке или молодой свинье до размножения.
23. Способ по п.19, где способ включает введение композиции свиноматке или молодой свинье внутримышечно.
24. Способ по п.19, где введение представляет собой первое введение, и где способ дополнительно включает второе введение через одну-три недели после первого введения.