KR0143239B1 - 돼지 유행성 설사병 예방약 생산을 위한 약독화 바이러스주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사병(PED) 바이러스 약독화주(KCTC 8641P), 그를 이용한 돼지 유행성 설사병 예방약(백신), 약독화주를 이용한 돼지 유행성 설사병의 진단방법 등을 제공한다.

본 발명의 돼지 유행성 설사병 바이러스 약독화주(KCTC 8641P)는 돼지 유행성 설사병 바이러스를 동물세포인 베로(Vero) 세포주에서 90대이상 연속 계대 배양하여 약독화시키므로써 얻은 것으로서 병원성을 전혀 갖지 않으면서 우수한 면역성을 나타내므로 백신 진단시약으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돼지 유행성 설사병 예방약 생산을 위한 약독화 바이러스주

제 1도는 본 발명에 따라 약독화된 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine Epidermic Diarrhea Virus : PEDV)를 전자현미경으로 검사한 결과로서 전형적인 코로나바이러스(Coronavirus)의 특징을 나타내고 있다.

제 2도는 본 발명에 따라 약독화된 돼지 유행성 설사 바이러스의 유전자를 감염세포 내에서 확인한 결과로서 20kb이상의 바이러스 RNA(PEDV RNA)를 관찰할 수 있다.

제 3도는 분리된 돼지 유행성 설사 바이러스를 세포 계대함에 있어 계대횟수에 따른 중식성을 나타낸 것이다.

제 4도는 계대별 돼지 유행성 설사 바이러스의 자돈내 병원성을 검사한 것으로서 세포내 연속 계대시 자돈내 바이러스의 병원성이 소실된 것을 관찰한 결과이다.

제 5도는 본 발명에 따라 약독화된 PEDV를 자돈에 접종한 후, 돼지 유행성 설사 바이러스의 면역형성 유무를 ELISA방법에 의해 관찰한 결과를 나타낸다.

본 발명은 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이러스주 및 이를 이용한 돼지 유생성 설사병의 진단방법 및 이를 함유하는 돼지 유행성 설사병의 예방약에 관한 것이다.

돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine Epidermic Diarrhea Virus : PEDV)는 포유자돈 및 육성돈을 비롯한 모든 연령의 돼지에 설사를 일으키며 포유자돈의 경우 50∼100%에 달하는 폐사율을 나타낸다.

돼지 유행성 설사(PED)는 전염성 위장염과 같은 종류의 바이러스 전염병으로서 1970년대 부터 유럽지역에서 발생이 보고되었으며, 우리나라의 경우 자돈의 설사병에 이환되어 폐사율 50%이상의 피해를 나타낸 바 있다. 그럼에도 불구하고 이 질병에 대한 예방약은 전세계적으로 개발되어 있지 않은 실정이며 항생제를 통한 치료 역시 불가능하여 질병의 유행시 속수무책으로 피해를 보는 현실이다.

이 질병의 유행에 따른 돼지전염성 위장염과 같은 수준임에도 불구하고 예방약 개발이나 진단이 곤란하였던 점은 병원체인 바이러스의 증식이 대단히 불량하며, 병의 진단 역시 용이하지 않았기 때문이다.

이러한 상황하에서 본 발명자들은 돼지 유행성 설사병을 진단 및 예방할 수 있는 수단을 제공하고자 하는 목적으로 광범위하게 연구를 행하였고, 그 결과로서 돼지 유행성 설사병 바이러스를 분리하여 약독화하는데 성공하므로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 돼지 유행성 설사병 바이러스 국내분리주의 세포내에서 연속계대하여 약독화시킨 바이러스주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이러스주를 이용하여 돼지 유행성 설사병을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이러스주를 이용한 돼지 유행성 설사병에 대한 예방약을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스 국내분리주를 이용하여세포내에서 연속계대하여 약독화시킨 바이러스를 제공하며, 이 바이러스는 돼지 유행성 설사병에 대한 예방약으로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 약독화 바이러스는 예방약으로 사용할 경우 면역형성을 유도하므로써 돼지 유행성 설사 감염중에 의한 폐사를 예방하므로써 생산성 저하를 방지할 수 있는 효과를 갖는다.

본 발명에 따라 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이러스는 자돈, 성돈 및 포유자돈에 접종하였을 때 병원성이 없는 반면 면역이 형성되어 야외 돼지 유행성 설사 바이러스 감염에 의한 폐사를 예방할 수 있다.

야외에서 분리된 유행성 설사 바이러스의 약독화과정을 위해서 세포내 연속계대를 이용하였으며 그 계대 과정은 다음과 같다.

(1) 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)의 분리

돼지 유행성 설사 바이러스의 분리는 유행성 설사로 폐사한 6일령 자돈의 소장 및 장 내용물을 이용하여 실시하였다. 즉, 장 조직 및 장 내용물을 인산염 완충액 식염수(PBS)로서 10배 희석한 다음 25rpm으로 10분간 원심침전시킨 상등액을 채취하여 10^-1∼10^-5까지 단계별로 희석한 다음 회전시험관에 중식된 Vero세포(ATCC C1008)에 접종하였다.

접종 후 4∼5일간 세포를 관찰하면서 세포 변성 효과(CPE)를 나타낸 10^-4∼10_-5희석 단계의 세포를 선정하여 3회 동결용해시킨 다음, 그 상층액을 이용하여 Vero세포에 동일한 방법으로 재접종하였다. 그리고 10^-4∼10^-5접종 군에 대해 동일한 세포 변성 효과를 나타낸 세포군을 클로닝하였다.

이와 같은 한계 희석방법을 3회 실시하여 클로닝한 유행성 설사 바이러스를 다시 Vero 세포에 접종한 다음 0.8%의 아가로스를 세포에 도포하고 세포 변성 효과를 나타낸 플라크를 취하여 약독화 바이러스 주의 작성에 사용하였다.

(2) PEDV의 약독화

베로(Vero) 세포 (ATCC C1008)를 5% 우태아 혈청이 첨가된 α-MEM(Gibco)배지에 2×10⁵/㎖의 양으로 접종하여 세포배양병에서 회전 배양시킨 뒤 세포가 80∼90%의 모노레이어(monolayer)를 형성하였을 때 인산염 완충액 식염수(phosphate buffer saline : PBS pH7.4)로 3회 세척한 다음 상기 (1)에서 얻어진 돼지 유행성 설사 바이러스를 접종하였다.

접종된 세포는 37℃에서 1시간 흡착시켜 세포에 바이러스를 감염시킨 후 다시 접종액을 PBS액으로 1회 세척하였다.

세척된 세포에서 α-MEM 배지에 효모추출액(Difco)를 0.02%, 트립토스 포스페이트 브로쓰(Tryptose phosphate broth: Difco)를 0.3%, 트립신(Sigma type III)을 2㎍/㎖의 농도로 첨가하여 37℃에서 4∼5일간 회전배양하였다. 이후 바이러스를 접종한 세포와 배양액을 -70℃에서 3회 동결 용해한 뒤 2500rpm에 10분 원심분리한 다음 상층액을 수확하여 1대 계대 바이러스로 하였으며 이 바이러스를 이용하여 베로 세포에 상기한 방법으로 연속 계대하였다.

즉 야외에서 분리된 유행성 설사 바이러스의 병원성을 감소시키기 위하여 vero 세포주에서 90대 이상 연속계대 하였으며 연속 계대된 바이러스의 일반적 특성은 제1,2,3도와 같다.

제 1도는 본 발명에서 유래된 90代이상 계대된 바이러스를 전자현미경으로서 관찰한 것이며 바이러스 코로나바이러스(Coronavirus)의 형태학적 특징을 나타내고 있다. 제 2도는 90代이상 계대한 바이러스의 유전자를 감염된 Vero세포를 이용하여 PEDV RNA를 추출한 다음 전기영동으로 분석한 결과로서 20kb 이상의 규모를 갖는 RNA 유전자를 돼지 유행성 설사 바이러스가 감염된 세포에서만 관찰할 수 있다. 제 3도는 바이러스의 계대시 바이러스 증식성을 분석한 결과이며 90代 이후의 바이러스, 즉 본 발명에 따라 약독화된 바이러스는 50% 조직배양감염가(=TCID₅₀: mediam tissue culture infectious dose) 가 10^5.0∼10^6.0TCID₅₀/㎖의 수준을 나타내었다.

본 발명에 따라 90대이상 계대배양하여 약독화시킨 유생성 설사 바이러스는 Coronavirus (PED virus)의 균주명칭으로서 1994년 12월 21일자로 한국과학기술연구원 유전공학센터내 유전자은행(KCTC)에 기탁되어 TCTC 8641P의 수탁번호를 부여받았다.

(3) 약독화된 바이러스의 비병원성

Vero 세포내에서 연속계대된 바이러스의 병원성을 파악하고자 유행성 설사 바이러스주를 계대별(10대, 22대, 33대, 53대 및 90대 수준)로 각 2두씩 5주령의 자돈의 1㎖씩 근육내로 접종한 다음 설사 발병 및 지속기간의 관찰을 통하여 병원성의 유무를 관찰하였다. 그 결과 10대, 22대, 33대 및 순으로 5일내지 1일동안 설사가 관찰된 반면 90대 계대된 바이러스주의 경우 설사나 체온등 아무런 이상을 발견할 수 없었다.

이러한 결과는 제 4도에 나타내었다. 제 4도에서 알 수 있는 바와 같이, 33대까지 계대배양한 경우에는 병원성이 남아서 시험용 돼지가 설사를 약 3일간 하지만, 53대 계대배양한 경우에는 설사 일수가 1일로 줄어들고, 90대 배양한 경우에는 전혀 병원성을 나타내지 않고 돼지는 전혀 설사를 하지 않았다.

(4) 약독화된 바이러스의 면역원성

본 발명에 따라 제공되는 비병원성 돼지 유행성 설사 바이러스의 면역원성은 효소 면역법(ELISA) 방법으로 검정하였으며 면역원성 검사를 위한 제반절차는 다음과 같다.

(4-1) 항원의 정제

효소면역법을 위한 항원정제는 유행성 설사 바이러스 배양액을 3회 동결 융해시킨 다음 2500rpm에 10분동안 원심한 후 상층액을 채취하였다. 이후 채취된 상층액 100㎖당 폴리에틸렌 글리콜(PEG M.W. 6000) 과 NaCl을 각각 7%와 2.3g의 농도로 첨가한 후 5℃에서 16시간 동안 교반한 다음 10000g에 30분간 원심한 후 침전물을 수확하였다. 침전물은 TEN(Tris 10mM, EDTA 1mM, NaCl 100mM, pH 7.4) 완충액에 원 용량의 1/10농도로 산정하여 재융해 시킨 후 다시 70,000×g 에 90분간 원심하여 침전된 펠릿을 수확하여 원심전 용량의 1/20의 농도로 TEN 완충액에 재용해하여 효소 면역법을 위한 항원으로 사용하였다.

(4-2) 효소 면역 분석방법(ELISA)

정제된 바이러스 항원을 1∼2㎕의 농도로 50mM 카보네이트 완충액(pH 9.6)에 희석시킨 후 96웰 ELISA 플레이트(Costar)에 분주하여 5℃ 16시간 항원을 부착시켰다. 이후 항원이 부착된 마이크로 플레이트를 다시 1% 스킴 밀크(Sigma)가 함유된 PBS를 이용하여 37℃에서 1시간 처리하여 실험에 사용하였다.

돼지 유행성 설사 바이러스 항체 측정은 가검 동물에서 채취된 혈액에서 혈청을 분리한 다음 PBST[0.5% Tween 20(Sigma)]을 이용하여 1/200의 농도로 희석하여 행하였으며 그 검사 과정은 다음과 같이 약술할 수 있다.

① 항원이 부착된 마이크로플레이트에 희석된 가검 혈청을 100㎕씩 2웰당 분주한다.

② 37℃에서 30분간 배양한 다음 0.5% Tween 20가 함유된 PBS로 200㎕씩 첨가하여 5분동안 3회 세척한다.

③ 세척된 마이크크로플레이트에 항-돼지 1gG 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish Peroxidase : KPL)을 PBST로 2000배 희석시킨 후 각 well 당 50㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간동안 배양한다.

④ 반응된 마이크로플레이트는 PBST로 3회 세척한 다음 OPD(o-페닐렌디아민 : Sigma) 첨가하여 실온에서 30분간 발색시킨 후 H₂SO₄를 첨가하여 정지시킨다.

발색이 정지된 마이크로플레이트내 반응을 490nm의 파장에서 광학밀도(O.D)를 측정하여 결과를 판정한다.

⑤결과의 판정을 위하여 표준 음성 돼지혈청(specific pathogen free pig) 및 기지의 양성 혈정을동일한 조건으로 검사한 다음 표준 음성자돈 혈청 및 검염자돈 혈청과의 O.D 차를 비교하여 결정한다. 인공 접종돼지의 경우 접종전후 자돈 혈청을 동일한 조건으로 검사하여 접종한 후 O.D치의 결과를 비교한다. 이상의 실험에서 양성판정은 표준음성혈청이나 기지의 인공 감염자돈 혈청의 O.D에 2배 이상인 경우로 정한다.

상기한 방법을 이용하여 약독화 바이러스를 1㎖씩(10_5.0TCID/₅₀/㎖) 2두의 자돈에 접종한 다음 경시별로 혈청을 채취하여 효소면역법(ELISA)으로 검사하였던바 접종 1주일 이후부터 항체가 형성되는 것을 관찰할 수 있었으며 2주후 2차접종을 실시한 결과 2차접종 후 7주까지 항체가 지속되는 것을 알 수 있었다.

한편 상기 효소면역분석법을 이용하여 돼지 유행 설사병을 진단할 수 있다.

(4) 약독화 바이러스의 안전성

본 발명에서 유래된 비병원성 유행성 설사 바이러스의 안전성을 검사하기 위하여 돼지 유행성 설사병 항체 음성의 포유 자돈을 인공포유 시키면서 1㎖(10^5.0TCID₅₀/㎖)의 바이러스를 경구로 투여한 다음 포유자돈내 안전성을 검사하였던 바 별다른 증상없이 생존하였다. 그리고, 인공 감염 7일 후 부검하여 장 가검을 이용 형광항체반응으로 바이러스의 존재를 검사하였던바 음성으로 판정되었다.

반면 야외 강독 바이러스를 동일한 조건하에 포유자돈에 경구 투여하였을때는 유행성 설사의 특징적인 소견인 심한 설사 및 탈수 증상을 나타낸 다음 모두 폐사하였다.

또한 본 발명에 따른 조직 계대 순화 유행성 설사 바이러스 주를 2두의 임신 모돈에 분만 5주 및 분만 3주전에 근육내 접종하였던 바 아무런 이상없이 정상 분만하였다.

이상의 결과로서 본 발명에서 개발된 조직배양 계대 순화 유행성 설사 바이러스는 자돈, 포유돈 및 임신모돈에서 비병원성으로 판정되었다.

(5) 돼지 유행성 설사병의 진단

전국에 걸쳐 돼지로부터 혈청을 채취하고 본 발명에 따른 약독화 바이러스(KCTC 864IP)를 이용하여 상기에서 설명한 바 있는 ELISA법에 따라 돼지 유행성 설사병을 진단하고 결과를 표 1에 나타내었다.

본 실험에 있어서, 약독화 바이러스의 접종전과 접종 후 3주째의 A₄₉₀이 2배 이상 차이나는 경우를 PEDV 항체 양성반응으로 간주하였다. 그 결과, 총 피검 혈청중 총 45%가 양성반응을 나타내었고, 이 양성율은 지역에 다라 17.6 내지 79%의 범위내에서 큰 편차를 보였다.

(6) 약독화 바이러스의 생체내 안정성 및 효능

본 발명에 따라 조직 계대순화 유행성 설사병 바이러스 주의 예방약으로서의 안정성 및 효능을 검사하기 위하여, 다음과 같이 예방약을 제조하여 야외에서 적용하였다.

(6-1) 예방약의 생산

예방약의 생산은 상기에서 제조한 약독화 돼지 설사 바이러스(KCTC 8641P)를 배양한 상층액을 동량의 보호제(락토스 0.217M, 인산일칼륨염 0.0038M, 인산이칼륨염 0.0072M, 글루탐산 일나트륨염 0.0094M, 겔라틴 1%)와 혼합 교반한 다음 동결건조시켜 예방약을 제조하고, 이를 야외적용에 사용하였다. 접종예방약의 역가는 1두당 10 TCID에 상당하였으며 근육에 접종하였다.

(6-2) 결과

본 발명에 따른 약독화 바이러스의 예방약으로서의 안전성 및 효능을 검증하기 위하여, 과거 돼지 유행성 설사의 발생이 없었던 농장, 과거 유행성 설사 발생했던 농장 및 현재 유행성 설사 발생에 의한 피해를 입고 있는 3개의 농장을 선정하여 본 발명의 약독화 바이러스를 예방약으로 적용하였다.

그 겨로가, 돼지 유행성 설사의 발생이 없었던 농장에서 예방약을 접종받은 23두의 임신 모돈은 모두 정상분만하였다. 또한 1993년에 유행성 설사가 발생하였던 농장에서는 본 발명의 예방약을 접종받은 40두는 접종받지 않았떤 군과 동일하게 정상 순자수를 나타내었다.

한편, 유행성 설사가 발생하고 있는 경우에 있어서는, 예방약 접종 이후 자돈의 생존율 97.1%로 판정되었다가, 이는 본 발명의 예방약을 접종하기 전 44.1%에 불과하던 생존율과 비료하면 현저히 증가된 것이다.

이상에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 약독화 바이러스는 돼지 유행성 설사병의 예방약으로 사용할 경우 돼지 유행성 설사병에 대한 면역능의 형성을 유도하므로서 돼지유행성 설사 감염증에 의한 폐사를 예방함으로서 생산성저하를 방지할 수 있다.

본 발명에 따른 약독화 PEDV는 자돈, 성돈 및 포유자돈에 접종하였을 때 병원성이 없는 반면 면역이 형성되어 야외 돼지 유행성 설사바이러스 감염에 의한 폐사를 예방할 수 있다.

Claims (1)

1. 동물 세포내에서 90대이상 계대배양하여 약독화시킨 것임을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사 바이러스(PED) 약독화주(KCTC 8641P)

2. 제 1항에 있어서, 동물세포는 베로(Vero) 세포임을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사 바이러스주.

3. 제 1항에 돼지 유행성 설사(PED) 바이러스주(KCTC 8641P)를 유효량으로 함유함을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사병 예방약.

4. 제 1항의 돼지 유행성 설사(PED) 바이러스 약독화주(KCTC 8641P)를 돼지 유행성 설사병에 걸릴 가능성이 있는 돼지에게 예방에 유효한 양으로 투여함을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사병의 예방방법.

5. 제 1항에 바이러스주를 돼지 유행성 설사병에 걸려 있을 수 있는 돼지의 혈액과 접촉시킴을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사병의 진단방법.