KR101938556B1 - 복수의 소바이러스성설사병바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물, 및 이를 이용한 소바이러스성설사병바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법 - Google Patents

복수의 소바이러스성설사병바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물, 및 이를 이용한 소바이러스성설사병바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 복수의 소바이러스성설사병바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물, 및 이를 이용한 소바이러스성설사병바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 소 신장세포에서 연속계대배양하여 수확한 서로 다른 유전형(Genotype)의 소바이러스성설사병바이러스(Bovine Viral Diarrhoea Virus, BVDV) 백신주를 2종 이상 유효성분으로 포함하는 소바이러스성설사병바이러스의 감염 예방 또는 소바이러스성설사병바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 이용하는 소바이러스성설사병바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

복수의 소바이러스성설사병바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물, 및 이를 이용한 소바이러스성설사병바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법{Vaccine Composition Containing Multiple Bovine Viral Diarrhoea Virus Vaccine Strains, and Method of Preventing or Treating Bovine Viral Diarrhoea Virus Infection Diseases Using the Same}
본 발명은 복수의 소바이러스성설사병바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물, 및 이를 이용한 소바이러스성설사병바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 소 신장세포에서 연속계대배양하여 수확한 서로 다른 유전형(Genotype)의 소바이러스성설사병바이러스(Bovine Viral Diarrhoea Virus, BVDV) 백신주를 2종 이상 유효성분으로 포함하는 소바이러스성설사병바이러스의 감염 예방 또는 소바이러스성설사병바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물, 및 상기 백신 조성물을 이용하는 소바이러스성설사병바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
소에서 설사와 소화기내 미란 등 소화기 증상과 기침, 콧물 등 호흡기 증상 및 암소에서 유사산 등 번식장애까지 다양한 증상을 나타낼 수 있는 소바이러스성설사병(Bovine Viral Diarrhea, BVD)은 1946년 미국에서 우역과 유사한 질병이라고 최초로 보고되었다.
소바이러스성설사병은 일명 소바이러스성설사점막병으로도 불리우며, 소바이러스성설사병바이러스(Bovine Viral Diarrh(o)ea Virus, BVDV)의 감염에 의하여 발병하는 소의 전염병으로서 소의 소화관 점막의 궤양, 설사, 호흡기 병변 등을 유발하고 심하면 폐사하는 질병이다.
본 병의 원인체는 플라비비리대(Flaviviridae)의 페스티바이러스(pestivirus)속으로 분류되는 RNA 바이러스이며 세포주에서 세포변성효과를 일으키는지의 유무에 따라 세포변성주(Cytopathic BVDV: NADL, Singer, T20주 등)와 비세포변성주(Non-Cytopathic BVDV: New York주 등)로 생물형(Biotype)이 분류된다.
BVDV는 형태학적으로는 지름이 40~60nm의 구형으로 막(Envelope)을 가지고 있다. BVD의 감염경로를 살펴보면, 분변으로 오염된 사료에 의한 경구감염, 또는 태반감염이 주가되고, 호흡기 감염 또는 생식기 감염에 의해서도 가능하다. 생식기 감염은 정액과 수정란을 통하여 전염될 수 있다.
BVDV 감염에 의한 임상증상은 크게 여섯 가지로 나타날 수 있다.
(1) 첫 번째 임상증상으로는 급성형 임상증상으로, 4~24개월령의 소에 감염시 다발하며, 임상적으로는 심한 설사, 백혈구 감소증, 식욕절폐, 유량감소, 기침, 호흡촉박, 콧물, 탈수에 의한 폐사 등의 증상을 나타낸다. 병리학적으로는 구강점막의 난반 및 궤양, 심한 경우 잇몸과 경구개를 포함한 입전체 상피세포의 탈락 및 심한 유연, 분만 등의 스트레스나 다른 2차 감염이 병발할 경우 전신 장기의 충출혈을 들 수 있다.
(2) 두 번째 임상증상으로는 준임상형 임상증상으로, 전연령층의 소에 발병 가능하며, 약한 발열, 백혈구감소증, 기침 및 구강점막의 산발적 난반이 관찰된다. 준임상형 임상증상으로부터 회복한 암소는 대개 유산이나 선천성 기형우 분만률이 높다.
(3) 세 번째 임상증상으로는 호흡기형 임상증상으로, 주로 3~6개월령의 소에 다발하며, 발열, 콧물, 호흡촉박을 보이다가 스트레스나 2차 감염이 없으면 쉽게 회복되나, 유사산과 선천성 기형우 분만을 유발할 수 있다.
(4) 네 번째 임상증상으로는 번식장애형 임상증상으로, 임신초기의 암소에 감염시 다발하며, 태반감염으로 인한 유산 흑자 및 사산이 일어나거나 신생우의 운동실조 및 나약증세를 일으킨다. 태자의 흉선 및 중추 신경계조직의 기형 즉 소 뇌형성 부전 및 눈의 기형 등의 병리소견을 나타낸다.
(5) 다섯 번째 임상증상으로는 만성형 임상증상으로, 준임상형 또는 급성형 임상증상이 완화되어 BVDV 감염으로부터 회복한 소에서 다발하며, 간헐적 설사, 콧물, 콧등의 각피형성, 눈물, 피부의 균혈증, 일시적인 구강내 난반 및 궤양 등의 증상을 나타낸다. 감염우에서 항체가 형성되지 않는 경우가 대부분이며 심한 면역기능 저하를 야기하여 번식 등의 생산성이 극도로 떨어지는 것이 특징이다.
(6) 여섯 번째는 임상증상으로는 급성형, 준임상형, 호흡기형, 번식 장애형 및 만성형 임상증상과는 사뭇 다른 그밖에 기타증상으로 유방염, 태반정체의 다발 및 일시적 당뇨병 증상이 있을 수 있다. 이렇듯 BVDV 감염에 의해 다양한 임상증상이 나타나므로 치료법으로는 대증요법으로 전해질 및 수액제재를 공급하여 탈수를 방지하고, 광범위항생제를 사용하여 세균의 2차 감염을 방지하며, 면역혈청요법으로 면역제재 또는 어미의 초유를 냉장 보관해 두었다가 심한 감염 소에 먹임으로써 증상을 완화시키는 방법 등이 있다. 그러나 상기와 같은 치료방법으로는 BVDV 감염에 대한 양호한 치료효과를 보기 어려우므로 많은 연구자들은 BVDV 감염에 대한 치료 효과가 매우 우수한 예방백신으로 능동면역에 의한 수동면역(모우의 초유를 통한 송아지 면역)을 추천하고 있다.
한편, 산업적인 측면에서 살펴보면, BVDV에 감염된 젖소는 우유 생산량의 감소를 유발하므로 낙농산업에 막대한 지장을 초래한다. 특히, 농장내에서 BVDV 감염에 대한 적절한 치료가 이루어지지 않아 지속성 감염(Persistent Infection, PI)으로 젖소 및 한우에 의해 생산된 지속감염우는 감염되지 않은 다른 소들을 감염시키므로 BVDV 감염으로 인한 소의 설사와 임신우의 유산 등의 번식장애 유발 등을 근절하기는 매우 어려운 실정이다.
BVDV에 의한 지속성 감염은 감염되기 쉬운 동물이 약 125일의 임신기간에 면역적격성이 나타나기 전에 BVDV의 비세포변성(Non-CPE) 바이러스주에 의해 감염될 때 발생한다. 지속성으로 감염된 동물은 감염된 균주에 대해 면역내성을 나타내며, 병원체 보유숙주로 작용하며, 통상적으로 수명 전체에 걸쳐 뇨, 분변, 정액, 침, 눈물 및 코 점막에서 다량의 바이러스를 발산한다.
유럽에서는 BVDV에 의해 유발되는 질병을 매우 중요 질병으로 인식하여 다수의 국가에서 BVDV를 예방하고, 치료하기 위한 청정화 작업을 추진하고 있음에도 불구하고 어려움이 많다. 예컨대, 스위스는 최근에 BVDV 발생율이 감소한 상황에서도 BVDV로 인한 피해액만 연간 약 100억원 내외의 경제손실을 초래하고 있다.
BVDV는 소 신장세포인 MDBK(Madin-Darby Bovine Kidney)에서 증식하며 세포변성효과(Cytopathic Effect, CPE)를 일으키는 주(CPE)와 일으키지 않는 주(non-CPE)로 나뉘어지는 생물형(Biotype)으로 구별한다. BVDV는 혈청형은 한가지이지만 유전형에 따라 크게 유전형 1(Genotype 1)과 유전형 2(Genotype 2)로 나뉘어지고, 다시 세부적으로 유전형 1은 유전형 1a부터 유전형 1t로, 유전형 2는 유전형 2a 및 유전형 2b 등으로 나뉘어지고 있다(Ridpath et al., Mol Cell Probes, 12(2):101-106, 1998; Wolfmeyer et al, Arch Virol, 142(10):2049-2057, 1997).
현재 국내에서 상용화되어 사용되고 있는 BVDV 백신은 유전형 1a에 속하는 NADL 주로서 수십년 동안 사용하고 있으나 국내의 소농장에서 주로 발생하는 BVDV의 유전형은 유정형 1a, 유전형 1b, 유전형 2a로, 약 30%씩 비슷한 분포를 차지하고 있다. 따라서, BVDV 유전형 1a를 표적으로 하는 기존 백신으로는 국내에서 발생되는 BVDV의 유전형 1, 유전형 2 및 이들의 아유전형(Subgenotype)에 의한 감염을 완전히 방어하기에는 어려움이 있다.
국내에서 사용되고 있는 BVDV에 대한 예방 및/또는 치료용 백신은 다른 호흡기바이러스들과 함께 제조된 3종 혼합백신(IBR, PI-3, BVDV) 또는 4종 혼합백신(IBR, PI-3, BRSV, BVDV)이 관납으로 납품되어 국가에서 농가에 보급하고 있는데 이들 백신에는 유전형 1a의 BVDV 백신주만이 포함되어 있어 국내에서 유행하는 다양한 BVDV 유전형들(즉, 유전형 1 및 유전형 2 등)을 효율적으로 방어하기 어렵다.
특히, 현재 관납으로 사용되는 3종 및 4종 혼합백신에 함유되는 BVDV의 함량이 적은 관계로 BVDV에 대한 면역형성이 낮고, BVDV 유전형 1 백신주만을 포함하고 있어 완전한 능동면역으로 모우의 수동면역을 송아지에게 이끌어 내기는 어렵다. 또한, 상기 3종 및 4종 혼합백신을 이용하더라도, 모우의 완전한 면역이 이루어지지 않아 BVDV 야외주에 의해 감염된 모우의 자우는 지속감염우(PI)로 생산되어 지속적으로 농장내 정상인 소들한테 야외주를 감염시키는 문제를 일으키게 된다.
한편, 종래 기술에 따르면, 3가지 유전형(1a, 1b 및 2a)의 BVDV를 혼합한 백신을 기니픽 또는 소(송아지)에 접종하여 항체 면역형성능을 확인한 내용은 개시되어 있으나, 연속계대배양법(연속계대감염)을 통해 특정된 계대수(passage number)로 최적화된 바이러스 역가(Virus Titer)로 제조한 국내 BVDV 유행주들을 기니픽 또는 소에 접종하여 향상된 중화항체 형성능과 항체 형성 지속능, 및 모우 접종 시 모체항체의 자우로의 이행에 따른 혈청/혈액 내 높은 항체 역가를 확인한 내용은 개시된 바 없다(한국 공개특허 10-2014-0034342, 한국 공개특허 10-2015-0030223 참조).
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 한우농가 및 젖소농가에서 BVDV 감염의 의해 계속하여 발생되는 지속감염우의 발생을 줄이는 해결방안을 모색하기 위하여 최근 국내 BVDV 유행주들의 유전형들의 분포와 교차 방어능에 대해 조사한 다음, BVDV 감염에 취약한 소, 특히 임신모우의 BVDV에 대한 효과적인 방어 항체의 생성을 위해 BVDV의 다양한 유전형들에 대한 방어력이 고루 높은 예방백신을 개발하고자 예의 노력한 결과, 최종 선별된 3가지 BVDV 유전형 백신주를 특정된 계대수로 연속계대배양하여 최적화된 바이러스 역가로 BVDV를 수확하고, 서로 다른 유전형의 BVDV를 2종 이상 혼합한 백신주 혼합물을 불활화한 다음, 어쥬번트(예컨대, IMS1313)와 혼합하여 제조한 BVDV 백신을 접종한 기니픽, 모우 및 송아지와, 상기 BVDV 백신으로 접종한 모우의 초유를 섭취한 자우의 혈청/혈액 내 중화항체 역가가 현저하게 상승하고 장기간 동안 유지(기니픽: 백신 접종 후 12주 이상; 송아지: 백신 접종 후 16주 이상)되어 BVDV에 대한 방어능이 매우 우수한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 국내에서 지속적으로 발생하는 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스의 감염 예방 또는 소바이러스성설사병바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스에 의한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소 신장세포에서 연속계대배양하여 수확한 서로 다른 유전형(Genotype)의 소바이러스성설사병바이러스(Bovine Viral Diarrhoea Virus, BVDV) 백신주를 2종 이상 유효성분으로 포함하는 소바이러스성설사병바이러스의 감염 예방 또는 소바이러스성설사병바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 백신 조성물을 동물(단, 인간은 제외)에 투여하여 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스에 의한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 소 신장세포에서 연속계대배양하여 수확한 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스 백신주를 2종 이상 유효성분으로 포함하는 소바이러스성설사병바이러스의 감염 예방 또는 소바이러스성설사병바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물을 목적 동물에 접종할 경우 기존 백신 조성물로 해결하지 못했던 국내에서 유행하는 유전형 1의 BVDV 및 유전형 2의 BVDV에 대한 교차 방어력의 증진으로 BVD 임상형 질병 및 지속감염우의 생산을 저지하여 농가의 젖소와 한우의 생상성 증대에 기여할 수 있다.
도 1은 소바이러스성설사병바이러스(BVDV)의 분리 바이러스주(Isolated Virus Strain)를 소 신장세포인 MDBK 세포에 접종하여 연속계대배양하면서 5대 간격으로 바이러스 역가(바이러스 함량)를 확인하여 소바이러스성설사병바이러스의 분리 바이러스주들 간의 바이러스 성장곡선을 비교하여 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 부피, 시간(기간), 농도, 함량 등을 표현하는데 사용된 용어 "약"은 해당 수치 또는 수치 범위에서 최대 10%의 허용오차가 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 젖소의 분변으로부터 분리되고, 비-세포변성(non-CPE) 타입으로, 바이러스 증식율이 높은 3가지 유전형의 소바이러스성설사병바이러스(BVD1a-JB(유전형 1a), BVD1b-JH(유전형 1b) 및 BVD2a-CA(유전형 2a))를 선별하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 최종 선별된 3가지 유전형의 BVDV 백신주(BVD1a-JB, BVD1b-JH 및 BVD2a-CA)의 혼합물을 농도별로 1x102~1x104TCID50/ml까지 연속계대배양한 것을 기니픽에 접종하고 2주 간격으로 2회 접종하고 최종 접종 2주 후에 채혈하여 중화항체 역가를 확인하였다. 그 결과, 3가지 서로 다른 유전형의 BVDV를 혼합한 백신은 개선된 교차면역반응으로 1x104TCID50/ml의 바이러스 역가에서 BVD1a-JB, BVD1b-JH 및 BVD2a-CA에 대해 가장 높은 항체가를 나타냈었다. 반면, 상업적으로 구매 가능한 기존 BVDV 백신(NADL, 유전형 1a)을 접종한 그룹에서는 BVDV 유전형 1a에 대해서는 항체 형성 반응이 양호하였으나, BVDV 유전형 1b 및 BVDV 유전형 2b와는 교차면역반응이 낮게 나타났다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 면역항체의 형성능과 지속능을 배가시키기 위해 BVDV 백신에 포함되는 어쥬번트의 종류를 비교하였다. 그 결과, 기니픽에 BVDV 백신 접종 시 어쥬번트인 IMS1313이 카보폴(Cabopol) 또는 ISA206보다 우수한 항체 형성능을 나타내었고, 접종 후 12주까지의 항체 지속능은 BVDV 1a, BVDV 1a 또는 BVDV 2a를 각각 접종한 그룹보다는 3가지 서로 다른 유전형의 BVDV를 혼합한 백신을 접종하였을 때 높은 항체 역가를 형성하여 항체 지속능이 기니픽에서 우수한 것으로 확인되었다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 기니픽에서 얻은 면역항체의 형성능과 지속능이 소에서도 구현 가능한지 확인하였다. 그 결과, 송아지에 BVDV 백신 2차 접종 후 4~16주까지의 항체 지속능은 BVDV 1a, BVDV 1a 또는 BVDV 2a를 각각 접종한 그룹보다는 3가지 서로 다른 유전형의 BVDV를 혼합한 백신을 접종하였을 때 높은 항체 역가를 형성하여 항체 지속능이 송아지에서도 우수한 것으로 확인되었다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 임신우에 2회씩 3가지 서로 다른 유전형의 BVDV를 혼합한 백신을 접종한 후, 상기 임신우로부터 생산되고 모우의 초유를 섭취한 자우의 BVDV에 대한 면역성을 확인하였다. 그 결과, 모우의 모체이행항체로 인해 BVDV에 대한 면역항체의 지속능이 유지되는 것으로 확인되었으며, 특히 3가지 서로 다른 유전형의 BVDV를 혼합한 백신을 접종한 임신우로부터 생산된 자우가 BVDV 백신을 접종하지 않은 임신우로부터 생산된 자우에 BVDV 백신을 접종하여 비교한 결과, BVDV를 혼합한 백신을 접종한 임신우로부터 생산된 자우가 훨씬 높은 BVDV에 대한 항체 역가를 나타내는 것으로 확인되었다(실시예 5 참조).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 소 신장세포에서 연속계대배양하여 수확한 서로 다른 유전형(Genotype)의 소바이러스성설사병바이러스(Bovine Viral Diarrhoea Virus, BVDV) 백신주를 2종 이상 유효성분으로 포함하는 소바이러스성설사병바이러스의 감염 예방 또는 소바이러스성설사병바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
전통적으로, 백신 조성물은 2가지 유형으로 분리될 수 있다. 즉, 바이러스를 덜 병원성이 되도록 만드는(약독화) 방식으로 처리하거나 성장시킨 생-바이러스를 함유하는 생 백신, 또는 사독화(불활성화) 바이러스 입자를 함유하는 백신 조성물로 나눌 수 있다.
BVDV와 관련하여, 바이러스는 자체로 세포병원성 또는 비-세포병원성일 수 있다. 소바이러스성설사병바이러스 바이러스주는 또한 바이러스 RNA 내의 실질적인 차이를 기준으로 유전형 1 및 유전형 2의 두 개로 분류될 수 있다. 따라서, 원칙적으로, BVDV의 8가지 주 부류가 존재할 수 있지만, 상업적인 백신의 대부분은 세포병원성 바이러스를 기본으로 한다.
본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 BVDV는 당해 분야에 공지되어 있는 방법, 또는 당업자에 의해 변형된 방법을 이용하여 연속계대배양(연속계대감염)을 통해 약독화되는 것이 바람직하다.
연속계대배양하여 확립된 BVDV 분리주(BVDV Isolated Strain)는 공지된 다양한 방법, 예를 들어 미국공개특허 5,565,205호에 기술된 바와 같이 BVDV 분리주를 BEI(Binary Ethylene Imine)으로 처리하거나, 포르말린, 글루타알데하이드, 가열, 조사, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활성화제를 사용하여 불활성화(불활화)될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 불활성화된 BVDV 분리주 이외에도, 1종 이상의 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 1종 이상의 수의학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "담체"라는 용어는 목적 동물(숙주 동물)에게 투여하는 것에 대해 제약상 허용되는 임의의 용매(용액), 분산 매질, 코팅제, 희석제, 완충제, 등장성 작용제, 현탁액, 콜로이드, 안정화제, 방부제, 항생제(항균제, 항진균제 등), 흡착 지연제, 보조제(어쥬번트, Adjuvant), 삽입물 등을 의미한다. 일반적으로는 화학 화합물, 특히 면역원에 대한 1종 이상의 전달 비히클의 사용은 제약 업계의 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한, 진단, 예방 및 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 1종 이상의 보충 활성 성분(들)이 또한 개시된 면역원성 조성물 및 백신 제제 중 1종 이상 이내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있다.
상기 희석제로는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글라이세롤 등이 포함될 수 있고, 상기 등장성 작용제로는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 락토스 등이 포함될 수 있으며, 상기 안정화제로는 알부민이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 보조제로는 광물성 겔, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 겔; 표면 활성 물질, 예를 들어 라이소레시틴; 글리코사이드, 예를 들어 사포닌 유도체, 예를 들어 퀼 A(Quil A) 또는 GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., 알라바마주 버밍햄); 플루론 폴리올; 다가음이온(다중음이온); 비-이온성 블록 중합체, 예를 들어 플루론 F-127(B.A.S.F., 미국); 펩타이드; 광유, 예를 들어 몬타나이드(Montanide) ISA-50(셉픽(Seppic), 프랑스), 카보폴(Cabopol), 암피겐, 암피겐 마크 II(하이드로닉스(Hydronic), 미국), 알하이드로겔, 오일 에멀젼(예컨대, 베이올F(BayolF)/아르라셀 A(Arlacel A)와 같은 광유와 물의 유화액), 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 유화액; 명반(alum); 콜레스테롤; 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보조제; 블록 공중합체(CytRx, 죠지아주 아틀란타); SAF-M(카이론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌); 암피겐(AMPHIGEN, 등록상표) 보조제; 모노포스포릴 지질 A, 애브리딘(Avridine) 지질-아민 보조제; 대장균(E. coli) 유래 열-불안정성 장독소(재조합 등); 콜레라 독소; 뮤라밀 다이펩타이드; IMS1313(셉픽(Seppic사), 프랑스); ISA206; 및 이들 보조제의 혼합물이 포함되나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 IMS1313, 카보폴(Cabopol) 및 ISA206로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트이다. 상기 어쥬번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다.
상기 항생제로는 젠타마이신(Gentamicin) 및 메티올레이트(Merthiolate)가 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 사이토카인(예컨대, 인터류킨, 인터페론 등)과 같은 1종 이상의 면역조절제를 더 포함할 수 있다.
상기 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스 백신주는 야외주(Wild-type) 소바이러스성설사병바이러스를 소 신장세포인 MDBK(Madin-Darby Bovine Kidney)에 접종한 후 10대 이상, 바람직하게는 15~30대 연속계대배양하였을 때 1x106.0~1x108.1TCID50/ml의 바이러스 역가를 가지는 소바이러스성설사병바이러스로부터 유래된 것임을 특징으로 할 수 있다.
상기 백신 조성물은 본 발명에 따른 연속계대배양방법으로 제조한 1x102.0TCID50/ml 이상, 바람직하게는 1x103. 0TCID50/ml 이상, 가장 바람직하게는 1x104. 0TCID50/ml 이상의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 소바이러스성설사병바이러스 백신주를 이용하여 2종 이상의 소바이러스성설사병바이러스 백신주(유전형: 1a+1b, 1a+2a, 1b+2a, 1a+1b+2a)와 어쥬번트(바람직하게는 IMS13133)를 포함하는 것으로, 상기 백신 조성물에 포함된 2종 이상의 소바이러스성설사병바이러스 백신주(바람직하게는, 소바이러스성설사병바이러스 백신주의 배양물) 및 어쥬번트는 부피 기준으로, 6~8:2~4, 바람직하게는 7:3이다.
상기 2종 이상의 소바이러스성설사병바이러스 백신주는 각각의 유전형별로 BVDV를 바이러스 역가가 1x102. 0TCID50/ml 이상, 바람직하게는 1x103. 0TCID50/ml 이상, 가장 바람직하게는 1x104. 0TCID50/ml 이상이 되도록 소 신장세포인 MDBK 세포에서 10대 이상, 바람직하게는 15~30대 연속계대배양하여 각각의 유전형별 BVDV의 필요한 바이러스 함량(즉, 백신주 함량)을 수확한 다음, 각각의 유전형별 BVDV의 바이러스 역가를 동등하게 하여 혼합하거나 서로 다르게 하여 혼합하여 해당 유전형의 BVDV 혼합물(예컨대, 유전형 1a+1b, 유전형 1a+2a, 유전형 1b+2a, 바람직하게는 유전형 1a+1b+2a)을 수확하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 주사 용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 냉동-건조, 동결-건조 또는 탈수 형태(단, 투여 전에 제약상 허용되는 비히클(예컨대, 멸균 식염수, 완충액 등)로 재수화 또는 현탁됨)로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 목적 동물에서 BVDV 감염에 따른 증상을 예방, 방어, 관리 또는 치료하기 위한 백신 조성물로서 본원 명세서에 개시된 백신 접종 방법으로 사용할 수 있는 단일-용량 분취량 또는 다중-용량 분취량으로 제조될 수 있고, 백신 접종은 단일 접종 또는 다회 접종을 통해 달성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 반추류의 소바이러스성설사병바이러스에 대한 면역반응 유도용임을 특징으로 할 수 있다.
상기 반추류는 소, 산양, 면양, 사슴, 낙타 및 기린으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 "소"란 용어는 수소, 암소, 수송아지, 암송아지, 임신우, 수유중인 암소, 임신우의 태아 등 모두를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 임신중인 암소(임신우), 수유중인 암소, 임신우의 태아 등의 소과 동물이 모두 포함된다.
목적 동물인 반추류의 면역반응 유도를 위한 효과적인 BVDV 백신 조성물의 용량은 백신 조성물의 성분 및 목적 동물 투여 스케쥴에 따라 달라진다. 특히 백신 조성물에 포함되는 BVDV 백신주의 정확한 용량은 목적 동물의 면역반응을 효과적으로 유도해낼 수 있는 양(유효량)을 의미하며, "효과량(유효량)"이란 용어는 백신 조성물이 투여되는 동물에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 백신 조성물의 양을 말한다.
상기 면역반응은, 세포성 면역 및/또는 체액성 면역의 유도를 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료적으로 효과적인 백신의 양은 사용되는 특정 바이러스, 목적 동물(예컨대, 소)의 상태 및/또는 감염 정도에 따라 달라질 수 있으며, 숙련된 수의사에 의해 결정될 수 있다.
본원 명세서에서, '치료'란 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로에 의해 소에게 투여하지만, 다른 투여 경로, 예를 들면, 경구 투여, 비강 투여(예컨대, 에어로졸 또는 다른 무침 투여), 경피 투여 및 비경구 투여(예컨대, 정맥주사, 복강 투여, 림프절내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장 투여, 질 투여 또는 근육내 투여), 또는 이들 투여 경로를 조합한 경로를 포함하는 공지된 경로를 통해 수행될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이고, 더욱 바람직한 투여 경로는 피하 투여 또는 근육내 투여이며, 가장 바람직한 투여 경로는 동물의 목 부분의 근육내 투여이다.
상기 "TCID50(Tissue Culture Infective Dose 50%)"는 바이러스의 "감염유발 단위"로, 세포 또는 조직 배양물의 50％를 감염 또는 사망시키는데 필요한 양으로 정의된다. 상기 TCID50의 계산방법을 간략하게 설명하면, 먼저 바이러스 시료를 연속계단희석(Serial Dilution)하고 각 희석된 바이러스 시료를 세포배양용 플레이트(예컨대, 96 well-plate)의 각 웰에서 동일한 수로 배양된 숙주세포들에 첨가하여 감염시킨 다음, 세포병변을 나타내는 웰 수를 확인하여 50%의 웰 수에서 세포병변을 나타내는 희석율의 역수로 최종 바이러스의 TCID50 값을 계산한다.
본 발명에 있어서, 상기 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스 백신주는 유전형 1a의 BVDV, 유전형 1b의 BVDV 및 유전형 2a의 BVDV로 구성된 군에서 선택되는 2종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전형 1a의 BVDV는 수탁번호 KCTC18531P로 한국생명공학연구원에 수탁된 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)이고, 상기 유전형 1b의 BVDV는 수탁번호 KCTC18532P로 한국생명공학연구원에 수탁된 BVD1b-JH(Bovine viral diarrhea virus)이며, 상기 유전형 2a의 BVDV는 수탁번호 KCTC18533P로 한국생명공학연구원에 수탁된 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약독화된 소 소화기 바이러스 백신주, 약독화된 소 호흡기 바이러스 백신주, 또는 상기 약독화된 소 소화기 바이러스 백신주와 약독화된 소 호흡기 바이러스 백신주의 혼합물을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 백신 조성물은 다가 백신(Polyvalent Vaccine) 조성물로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 다가 백신으로 제조하기 위하여, 약독화된 소 호흡기 세포융합 바이러스(Bovine Respiratory Syncytial Virus, BRSV), 파라인플루엔자 3(Bovine Parainfluenza 3, PI3), 약독화된 감염성 소 비기관염(Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR)을 유발하는 소 헤르페스 바이러스-1(Bovine Herpesvirus-1, BHV-1)의 약독화된 바이러스 등의 약독화된 소 호흡기 바이러스 백신주를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 소 소화기 바이러스 백신주 및/또는 소 호흡기 바이러스 백신주는 당해 분야에 공지되어 있는 방법, 또는 당업자에 의해 변형된 방법을 이용하여 연속계대배양(연속계대감염)을 통해 약독화되는 것이 바람직하다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 접종한 동물(단, 인간은 제외)의 혈청으로부터 수확한 항체를 포함하는 소바이러스성설사병바이러스 함유 추정 시료의 소바이러스성설사병바이러스의 검출 또는 소바이러스성설사병바이러스 유전형의 판별용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소바이러스성설사병바이러스의 판별 또는 검출은 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 접종한 동물(단, 인간은 제외)의 혈청으로부터 수확한 항체를 포함하는 소바이러스성설사병바이러스 함유 추정 시료의 소바이러스성설사병바이러스의 검출 또는 소바이러스성설사병바이러스 유전형의 판별용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 추가로 상기 항체와 소바이러스성설사병바이러스 함유 추정 시료 내 소바이러스성설사병바이러스, 또는 소바이러스성설사병바이러스의 파편들(Fragments)간 혼성화되는 반응을 탐지하기 위한 검출시약을 더 포함할 수 있으며, 검출시약은 검사하고자 하는 표적물질(Analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지시약(Labelled Reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성성분이 구비될 수 있다.
상기 표지시약 즉, 표지된 검출시약은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 것을 사용할 수 있으며, 상기 표지는 예컨대 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타아제, 퍼옥시다아제 등, 보다 구체적인 예로는 염기성 포스퍼타아제와 호스래디시 퍼옥시다제(Horseradish Peroxidase, HRP) 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도페와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플루우레세인(Fluorescein), 피코빌리프로틴(Phycobiliprotein), 로다민(Rhodamine) 등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate Latex), 발색 지시약(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color Matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보조적 특이결합부재의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 예를 들면, 아비딘(Avidin), 바이오틴(Biotin), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 항-FITC 항체, 마우스 면역 글로불린, 항-마우스 면역 글로불린 항체에서 선택되는 1종이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 소바이러스성설사병바이러스의 판별 또는 검출은 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 접종한 동물(단, 인간은 제외)의 혈청으로부터 수확한 항체를 이용하여 소바이러스성설사병바이러스 함유 추정 시료의 소바이러스성설사병바이러스를 검출하고 소바이러스성설사병바이러스의 유전형을 판별하는 단계를 포함하는 소바이러스성설사병바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소바이러스성설사병바이러스의 판별 또는 검출은 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 접종한 동물(단, 인간은 제외)의 혈청으로부터 수확한 항체를 이용하여 소바이러스성설사병바이러스 함유 추정 시료의 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스를 판별하고 검출하는 단계를 포함하는 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스에 대한 교차면역반응 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소바이러스성설사병바이러스의 판별 또는 검출은 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "시료(검체)"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(Biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 소바이러스성설사병바이러스와 혼합된 시료이거나 소바이러스성설사병바이러스에 감염된 개체(예컨대, 소 등)의 시료일 수 있으며, 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다.
조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다.
분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(Fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(Medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "백신"이라는 용어는 척추동물, 바람직하게는 포유동물과 같은 동물에 투여될 수 있는 형태의 면역원성 조성물을 함유하는 조성물 또는 제제를 지칭한다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 목적 동물(숙주 동물)에 투여하기 위해 제제화된, 본원 명세서에 개시된 면역원성 조성물인 2가지 이상의 BVDV 바이러스주를 포함하는 조성물 및 기타 면역원성 조성물들을 포함할 수 있다.
상기 2가지 이상의 BVDV 바이러스주를 포함하는 면역원성 조성물의 "면역원성"은 유전형 1의 BVDV, 유전형 2의 BVDV, 또는 유전형 1의 BVDV와 유전형 2의 BVDV 둘 다에 대해 목적 동물에서 면역 반응을 유발하는 BVDV의 능력(항원으로서의 작용력)을 의미한다. 면역반응은 주로 세포독성 T-세포에 의해 매개되는 세포성 면역반응, 또는 B-세포를 활성화시켜 항체 생성을 유도하는 보조 T-세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역반응일 수 있다.
특히, "면역원성"이라는 용어는 목적 동물(숙주 동물)에서 면역반응을 유발하는 BVDV 바이러스를 구성하는 핵산, 폴리펩티드 등의 물질을 지칭하는 것으로 체액성 유형(B 세포) 및/또는 세포성 유형(T 세포)의 면역반응을 유도할 수 있는 물질들이 이러한 특성을 갖는다.
상기 면역원성 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물은 목적 동물에 도입 시 면역반응, 바람직하게는 도입된 항원(들)에 대해 특이적인 면역반응을 일으킬 수 있는데, 이와 같은 면역반응은 백신 접종된 목적 동물의 세포 및 조직 내에서의 특이적 항체의 생산, 사이토카인, 및/또는 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포 및/또는 기타 세포성 반응의 활성화 여부로 검출하되, 면역학 업계의 당업자에게 공지된 통상적인 검정법을 사용하여 쉽게 검출 가능하다.
BVDV는 분변-경구 방식으로 BVDV 감염 개체로부터 다수의 BVDV 비감염 개체들에게 전파된다. 특히 BVDV 감염 징후를 유발하는데 필요한 바이러스 수는 BVDV의 유전형 및 BVDV 발생 지역(origin)의 특성에 따라 바이러스의 병원성 및 동물 무리 전체에 전파되는 속도와 연관이 있는 것으로 보고된 바 있다.
동물의 BVDV의 감염 여부는 증상학(Symptomology)에 의해 확인될 수 있다. BVDV에 감염된 동물의 통상적인 증상으로는 백혈구감소증, 불규칙한 열 주기, 혈소판감소증, 뇌형성부전, 면역 저하, 이질, 불임, 조기 배아사, 태아 미라 변성, 유산이 포함될 수 있으며, 현재까지의 BVDV 감염증의 진단은 상기 증상들을 기준으로 이루어져 왔다.
그러나 혈청학적 연구에 따르면, BVDV로 감염된 소들은 임상적 증후가 나타나지 않더라도, 지속감염(Persistent Infection, PI)이 되어 있는 것으로 보고된 바 있다.
따라서, BVDV 감염 동물의 바람직한 확인방법은 증상학에 의존하기보다는 혈청학적 분석방법을 통해 BVDV 자체의 존재를 검출하는 것이다. 예컨대, BVDV 및/또는 BVDV-감염 동물의 정확한 검출방법으로는 바이러스 분리법(Virus Isolation), 바이러스 역가 측정(Virus Titration), 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법이 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 바이러스 분리법, 역전사-중합효소 연쇄 반응, 조직면역염색법, 효소결합 면역흡착 검사법이 포함된다(Haines et al., Vet. Pathol ., 29(1):27-32, 1992; Homer et al., Vet. Microbiol ., 43(1):75-84, 1995).
본원에서 사용된 바와 같이, "항원" 또는 "면역원"이라는 용어는 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 약독화되었거나 생물·생화학적 활성을 갖는 유기체(바이러스)의 전체 또는 일부분(서브유닛(Subunit) 등); 면역원성 성질이 있고, 숙주 동물에게 제시되는 경우에 면역 반응을 유도할 수 있는 핵산 단편; 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 에피토프, 합텐, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일반적으로 항원은 임의의 면역원성 물질, 즉 감수성 동물의 조직내로 도입되었을 때 면역 반응(예를 들어, 특이적 항체 분자의 생산)을 유발하고 항원 도입에 반응하여 생산된 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 항원은 면역계에 의해 인식되고/되거나, 체액성 면역 반응을 유도하고/하거나, B-림프구 및/또는 T-림프구 활성화에 이르는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 항원은 단일 에피토프, 또는 2개 이상의 에피토프를 포함할 수 있다.
"항체"라는 용어는 각각 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 VH 및 VL을 통해 다른 분자(항원)에 결합하는 단백질을 지칭한다. "항체"라는 용어는 IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, 및 이의 임의의 서브클래스 또는 이의 조합이 예를 들어 포함되지만 이에 한정되지는 않는 임의의 면역글로불린 분자를 지칭한다. "항체"라는 용어는 달리 명백하게 언급되지 않는 한 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, Fd, scFv 및 sdFv 단편이 예를 들어 포함되지만 이에 한정되지는 않는 면역글로불린 분자의 기능성 단편을 또한 의미한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 백신 조성물을 동물(단, 인간은 제외)에 투여하여 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스에 의한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 임신우 및 임신우의 젖을 먹는 송아지를 포함하는 소에 투여되는 효과량의 백신 조성물은 BVDV(유전형 1 및 유전형 2)와 관련된 질병 및 태아 감염에 대한 효과적인 면역성을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 백신 조성물을 송아지에게 약 1 내지 4주의 간격으로 2회 투여한다. 예를 들어, 제1 투여는 동물이 약 1 내지 약 3개월이 되었을 때 수행된다. 제2 투여는 백신 조성물의 제1 투여 이후 약 1 내지 약 4주 후 수행된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 투여는 교미 5주 전에 수행된다. 제2 투여는 교미 2주 전에 수행된다. 후속 백신 조성물의 투여량의 투여는 바람직하게는 해마다 실시해온 바에 근거하여 수행된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 약 6개월이 되기 전에 백신 접종된 동물은 6개월이 된 후 다시 백신 접종되어야 한다. 후속 백신 투여는 바람직하게는 해마다 실시해온 바에 근거하여 수행된다. 효과적인 백신의 투여량은 백신의 성분 및 투여 일정에 따라 좌우된다. 전형적으로, 불활성화된 BVDV(유전형 1 및 유전형 2) 제제가 백신 조성물에 사용되는 경우, 약 3 내지 4주의 기간 동안 목적 동물에 2회 투여될 때 BVDV(유전형 1 및 유전형 2) 투여량 당 약 1x104TCID50/ml를 갖는 백신의 양이 효과적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[ 실시예 1] BVDV의 분리, 계대배양 및 특성 조사
국내에서 유행하는 소바이러스성설사병바이러스(Bovine Viral Diarrhoea Virus, BVDV)를 분리하기 위하여, 먼저 야외가검물(분변) 시료에 BVDV가 존재하는지 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)로 확인한 다음, 역학조사를 통하여 농가의 피해 정도를 파악한 후 RT-PCR에서 강한 양성반응을 보인 야외가검물 시료를 희석하여 바이러스주별로 분리하였다.
상기 야외가검물 시료로부터 분리한 BVDV 분리주(BVDV Isolated Strain)로 소 신장세포인 MDBK(Madin-Darby Bovine Kidney, ATCC) 세포를 감염시킨 후 연속계대배양(Successive Subculture)하였고, 각각의 연속계대배양 단계에서 수확한 배양물에 함유된 BVDV의 핵산을 유전자 염기서열분석을 통해 바이러스 유전형(Virus Genotype)을 확인하고, 상기 배양물의 세포변성효과(Cytopathic Effect, CPE)의 유무를 확인하였다.
또한, BVDV 특이적 항체를 이용하여 항원-항체 반응으로 간접형광항체법(Indirect Fluorescent Antibody Technique)을 통하여 BVDV의 바이러스 역가(Virus Titer; 바이러스의 증식 농도, 바이러스의 함량)를 확인하되, 바이러스 역가를 높이기 위해 상술한 바와 같이 각각의 야외가검물 시료 유래 BVDV로 감염된 MDBK 세포를 25대까지 연속계대배양한 다음, 가장 높은 바이러스 역가를 나타낸 유전형들(BVD1a-JB, BVDV1b-JH, BVDV2a-CA 등)을 선별하였다.
즉, 증식이 우세한 바이러스주를 선별하기 위하여 9가지의 서로 다른 BVDV 분리 바이러스주를 MDBK 세포에 접종하여 연속계대배양하면서 5대 간격으로 바이러스 역가를 확인하였다.
바이러스 증식의 확인은 세포변성효과(Cytopathic Effect, CPE)가 없기 때문에, 하기와 같이 형광항체진단법(Fluoresent Assay, FA), PLA(Peroxidase-Linked Assay), 및 RT-PCR을 실시하여 확인하였다.
< 형광항체진단법 ( Immunofluorescence Assay, IFA ) >
IFA에 필요한 시약으로는, BVDV E2 특이적 단클론항체(Monoclonal Antibody, mAb), FITC로 표지된 항-생쥐 IgG(FITC-labeled Anti-Mouse IgG)와 BVDV E2 특이적 다클론항체(Polyclonal Antibody, pAb)(토끼-유래 항체 또는 염소-유래 항체), FITC로 표지된 항-토끼 IgG(FITC-labeled Anti-Rabbit IgG), FITC-표지 항-염소 IgG(FITC-labeled Anti-Goat IgG)를 준비하였다.
먼저, BVDV로 감염된 PK-15(Porcine kidney cell line, ATCC) 세포를 고정제(Fixative)로 처리하여 고정시킨 다음, 사용농도(Working Concentration)로 희석한 1차 항체인 BVDV E2 특이적 단클론항체 또는 BVDV E2 특이적 다클론항체를 상기 고정된 PK-15 세포와 37℃에서 40분간 반응시켰다(여기서, 1차 항체는 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 희석한 것을 사용함).
그 다음, 상기 1차 항체와 반응시킨 PK-15 세포는 PBS로 3~5회 세척하고, 상기 1차 항체인 BVDV E2 특이적 단클론항체와 반응한 PK-15 세포는 2차 항체인 FITC로 표지된 항-생쥐 IgG(단클론항체)와 37℃에서 40분간 반응시키고, 1차 항체인 BVDV E2 특이적 다클론항체와 반응한 PK-15 세포는 FITC로 표지된 항-토끼 IgG(다클론항체) 또는 FITC로 표지된 항-염소 IgG(다클론항체)와 37℃에서 40분간 반응시킨 후, PBS로 3~5회 세척하였다(여기서, 2차 항체는 약 200배로 희석한 것을 사용함)
상기 1차 항체 및 2차 항체와 반응한 PK-15 세포를 형광현미경 하에서 관찰한 결과, BVDV로 감염된 PK-15 세포는 항-BVDV E2 단클론항체와 특이적으로 반응하여 BVDV로 감염된 PK-15 세포의 세포질이 밝은 녹색 형광을 나타내었다.
< Peroxidase -Linked Assay( PLA ) >
PLA에 필요한 시약으로는 ABC Kit(Vector PK-4000), BVDV E2 특이적 단클론항체, 바이오틴화 항-생쥐 IgG(Biotinylated Anti-Mouse IgG), DAB(3,3'-diaminobenzidine) 등을 준비하였다.
먼저, BVDV로 감염된 PK-15 세포를 고정제로 처리하여 고정시키고, 1차 항체인 BVDV E2 특이적 단클론항체와 37℃에서 40분간 반응시킨 후 PBS로 3~5회 세척하였다(여기서, 1차 항체는 PBS로 희석한 것을 사용함).
그 다음, 2차 항체인 바이오틴화 항-생쥐 IgG를 희석하여 상기 1차 항체와 반응한 PK-15 세포와 37℃에서 40분간 반응시켰다(여기서, 바이오틴화 항-생쥐 IgG(ABC Kit)는 PBS 10mL + 바이오틴화 항-생쥐 IgG 용액 1drop)로 희석하고, 바이오틴화 항-생쥐 IgG IgG(타제품)는 약 200배로 희석함).
상기 2차 항체와 반응한 PK-15 세포를 PBS로 3~5회 세척하고 AB 용액으로 37℃에서 40분간 처리한 다음(AB 용액은 PBS 10mL + A 용액 2drops + B 용액 2drops; 실온에 두고 20~40분간 반응시켜야 하므로 미리 제조), DAB 기질 용액(Substrate Solution)과 실온에서 10분간 반응시킨 후(10X DAB는 0.6g DAB + 100mL 증류수; DAB 기질 용액은 10X DAB 1mL + PBS 9mL + H2O2(1000X) 10μL), 증류수로 3회 세척하였다.
상기 1차 항체 및 2차 항체와 반응한 PK-15 세포를 형광현미경 하에서 관찰한 결과, BVDV로 감염된 PK-15 세포는 항-BVDV E2 단클론항체와 특이적으로 반응하여 BVDV로 감염된 PK-15 세포 주위가 갈색으로 염색되어 있었다.
< RT- PCR 분석방법 >
RT-PCR 실험에 필요한 시약으로는, BVDV 항원 진단 키트(RT-PCR Premix, Median diagnostic) 및 RNA 분리 키트를 준비하였다.
먼저, RNA 분리 키트를 이용하여 BVDV의 RNA를 분리하고, 상기 분리한 RNA를 RT-PCR Premix에 첨가하고 RT-PCR을 수행(Premix에 BVDV 유전형별 프라이머가 포함되어 있으며, 5'NCR 부위를 300bp로 증폭시킴)한 후 젤에 로딩(Gel Loading)하고, 전기영동한 후, 증폭산물(핵산)의 분자량을 밴드 크기로 확인하였다.
상술한 실시예 1의 IFA, PLA, 및 RT-PCR의 실험 결과들을 종합하여, 소 배설물로부터 분리한 BVDV 야외주(Wild-Type Strain)의 특성을 하기 표 1에 나타내었다.
No. 바이러스주
(Virus Strain)		 바이러스 소스
(해당 소 분변)		 RT-PCR 반응 바이러스 분리 바이러스 특성
생물형
(Biotype)		 바이러스 역가
(Virus Titer, TCID50/ml)		 IFA 반응 유전형
(Genotype)
1 BVD1a-KB Holstein Strong o Non-CPE 1x105.6 +++ 1a
2 BVD1a-HS Cow Strong o Non-CPE 1x107.2 ++ 1a
3 BVD1a - JB Holstein Strong o Non- CPE 1x10 8.1 +++ 1a
4 BVD1a-NJ Cow Moderate x NT NT(Not Tested) NT 1a
5 BVD1a-OK Cow Strong x NT NT NT 1a
6 BVD1b-GH Holstein Moderate o Non-CPE 1x106.8 ++ 1b
7 BVD1b - JH Holstein Strong o Non- CPE 1x10 7.5 +++ 1b
8 BVD1b-KH Holstein Strong x NT NT NT 1b
9 BVD1b-MY Cow Strong x NT NT NT 1b
10 BVD1c-YI Cow Moderate o Non-CPE 1x102.4 + 1c
11 BVD1n-YS Cow Strong o Non-CPE 1x102.8 + 1n
12 BVD2a -CA Holstein Strong o Non- CPE 1x10 7.6 +++ 2a
13 BVD2a-PK Cow Strong o Non-CPE 1x104.7 ++ 2a
14 BVD2a-CJ Holstein Moderate x NT NT NT 2a
15 BVD2a-IS Holstein Strong x NT NT NT 2a
16 BVD2a-CW Cow Strong x NT NT NT 2a
상기 표 1에 기초하여 BVDV 야외주 중에서 RT-PCR 반응이 강하게 나타나면서, BVDV 분리실험에서 BVDV의 증식이 이루어진 9 바이러스주(Virus Strain)를 분리할 수 있었으며, 이들 모두는 비-세포변성(Non-Cytopathic Effect, Non-CPE)의 특성을 갖는 타입들이었다.
또한, 도 1에 나타낸 바와 같이, 바이러스 성장곡선으로 25대까지 연속계대배양한 BVDV 분리 바이러스주들 중에서 가장 우세한 바이러스 증식량(높은 바이러스 역가)을 나타낸 바이러스주를 최종 선별하였다. 즉, 유전형 1a(Genotype 1a), 유전형 1b(Genotype 1b) 및 유전형 2a(Genotype 2a)의 BVDV 중에서 각각 가장 높은 바이러스 증식량을 나타낸 BVD1a-JB(1x108. 1TCID50/ml), BVD1b-JH(1x107. 5TCID50/ml) 및 BVD2a-CA(1x107.6TCID50/ml)를 선별하였다.
상기 선별한 유전형 1a, 유전형 1b 또는 유전형 2a의 BVDV는 백신 조성물용 유전형 1a의 BVDV 백신주, 유전형 1b의 BVDV 백신주 또는 유전형 2a의 BVDV 백신주(Vaccine Strain)로 사용하였다.
본 발명에 따른 상기 유전형 1a의 BVDV 백신주는 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)로 명명하여 한국생명공학연구원에 기탁하였고, 2017년 2월 10일자로 수리되어 수탁번호 KCTC18531P를 부여받았다.
본 발명에 따른 상기 유전형 1b의 BVDV 백신주는 BVD1b-JH(Bovine viral diarrhea virus)로 명명하여 한국생명공학연구원에 기탁하였고, 2017년 2월 10일자로 수리되어 수탁번호 KCTC18532P를 부여받았다.
본 발명에 따른 상기 유전형 2a의 BVDV 백신주는 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)로 명명하여 한국생명공학연구원에 기탁하였고, 2017년 2월 10일자로 수리되어 수탁번호 KCTC18533P를 부여받았다.
최종 선별된 3가지 유전형의 백신주(BVD1a-JB(유전형 1a), BVD1b-JH(유전형 1b) 또는 BVD2a-CA(유전형 2a))는 후술하는 실시예 2~5에서 목적 동물(기니픽 또는 소)을 접종하는데 이용되었다.
여기서, 1가지 유전형(즉, 1a, 1b 또는 2a)의 BVDV 백신주를 접종에 이용할 경우, 바이러스 역가가 1x104TCID50/ml 이상이 되도록 BVDV를 MDBK 세포에서 10~25대까지 연속계대배양하면서 필요한 바이러스 역가(즉, 백신주 함량)를 수득하여, 기니픽 또는 소에 접종하였다.
서로 다른 유전형의 BVDV 백신주를 2종 이상 접종에 이용할 경우, 각각의 유전형별로 BVDV를 바이러스 역가가 1x104. 0TCID50/ml 이상이 되도록 MDBK 세포에서 10~25대 연속계대배양하여 각각의 유전형별 BVDV의 필요한 바이러스 함량(즉, 백신주 함량)을 수득한 다음, 각각의 유전형별 BVDV의 바이러스 역가를 동등하게 혼합하여 해당 유전형의 BVDV 혼합물(즉, 유전형 1a+1b, 또는 유전형 1a+1b+2a)을 수득하여, 기니픽 또는 소에 접종하였다.
[ 실시예 2] BVDV 백신 혼합물의 바이러스 역가에 따른 기닉픽의 항체 역가 조사
실시예 1에서 최종 선별된 3가지 유전형의 BVDV 백신주(BVD1a-JB(유전형 1a), BVD1b-JH(유전형 1b) 및 BVD2a-CA(유전형 2a))를 포함하는 백신주 혼합물의 바이러스 함량(바이러스 역가, Virus Titer)을 달리하여 면역 보조제로서 어쥬번트(Adjuvant)인 IMS1313(셉픽(Seppic사), 프랑스)과 혼합하여 기니픽에 1ml씩 그룹당 5두씩 2주 간격으로 2회 근육접종한 다음, 최종 접종 2주 후에 채혈하여 하기 중화시험법(Neutralization Perixidase-Linked Assay; NPLA)으로 중화항체 형성율을 확인하였다. 여기서, 항체형성 유도용 항원으로 이용되는 BVDV 바이러스주는 TCID50값이 높을수록 바이러스 함량이 증가하는 것을 의미한다(하기 표 2 참조).
상기 백신주 혼합물은 BVDV를 BEI(Binary Ethylene Imine) 처리로 불활성화(불활화)시켜 제조되었으며, 목적 동물 접종 전 상기 불활성화된 백신주 혼합물에 첨가되는 상기 어쥬번트의 역할은 BVDV 백신주의 면역원성을 강화함으로써 상기 백신주 혼합물에 접종된 목적 동물(숙주 동물)의 면역계를 자극하여 세포성 면역, 면역반응 속도 등의 면역의 형성능 및 지속능을 개선하기 위한 것이다.
상기 BEI 처리 방법은, 먼저 0.1M BEI를 실시예 1에서 제조한 BVDV 배양물에 BEI의 최종 농도가 0.001M이 되도록 첨가한 후, NaOH 용액으로 pH8.0으로 조정하여 37℃에서 15시간 교반하면서 BVDV 배양물을 불활화시켰다. 상기 불활화시킨 배양물에 멸균된 20％ 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 최종 농도가 2％가 되도록 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 교반하여 BEI를 중화시켰다. 필요에 따라 pH를 7.0~7.5로 조정하여 불활화시킨 BVDV 배양물을 MDBK 세포주에 접종하여 바이러스 증식 여부로 불활화 유무를 측정하였다. 상기 BEI는 2-BEA(2-Bromoethylamine Hydrobromide, 시그마)를 0.2N NaOH 용액에 0.1M이 되도록 용해하여 37℃ 항온 수조에서 1시간 처리하여 0.1M BEI를 제조한 것이다(4℃ 보관).
통상적으로 사용하는 소 접종용 백신 조성물(BVDV 백신주 배양물 및 어쥬번트의 혼합물)의 접종량은 소 한마리 당 2ml이고, 상기 소 접종용 백신 조성물은 70%(v/v)의 백신 혼합물과 30%(v/v)의 어쥬번트(예컨대, IMS13133)로 구성된다. 따라서, 3종의 서로 다른 유전형의 BVDV 백신주를 이용하여 소 접종용 백신 조성물을 제조하기 위해서는, 유전형 1a의 BVDV 백신주 배양물, 유전형 1b의 BVDV 백신주 배양물 및 유전형 2a의 BVDV 백신주 배양물을 동등한 부피로 혼합하여 제조한 백신 배양물 70%(v/v)에 어쥬번트 30%(v/v)를 첨가하여 제조하였다.
여기서, 상기 소 접종용 백신 조성물에 포함되는 유전형 1a의 BVDV 백신주, 유전형 1b의 BVDV 백신주 및 유전형 2a의 BVDV 백신주 각각의 바이러스 역가가 1x104.0TCID50/ml 이상이 되도록 하기 위해, 상기 소 접종용 백신 조성물 제조에 이용되는 BVDV 백신주 소스는 최소한 1x105. 0TCID50/m 이상의 바이러스 역가를 가진 것을 선택하여 이용하였다.
구체적으로, 소 5두의 접종에 필요한 소 접종용 백신 조성물은 유전형 1a의 BVDV 백신주 배양물, 유전형 1b의 BVDV 백신주 배양물 및 유전형 2a의 BVDV 백신주 배양물을 각각 약 2.33ml씩 혼합한 약 6.99ml의 백신 배양물에 약 3ml의 어쥬번트인 IMS13133을 혼합(즉, 부피기준으로, 백신주 배양물:어쥬버트=7:3)하여 제조하였다.
한편, 바이러스주가 접종되지 않은 기니픽의 혈청(음성대조군: PBS)과 유전형 1a의 BVDV 백신주만 접종된 기니픽의 혈청(양성대조군: 상업적으로 구매 가능한 기존 백신 조성물, NADL)을 중화항체 형성율을 확인하기 위한 대조군으로 이용하였다.
< 중화시험법( NPLA ) >
NPLA 실험에 필요한 BVDV에 대한 항체 역가 측정을 위한 중화시험법 시약으로는, ABC Kit(Vector PK-4000), BVDV E2 특이적 단클론항체, 바이오틴화 항-생쥐 IgG, DAB 등을 준비하였다.
시료 준비 단계: 먼저, 96웰 마이크로플레이트(96-well Microplate)에 항생제만 첨가된 α-MEM을 웰 당 50μL씩 첨가한 다음, 백신주가 접종되지 않은 기니픽의 혈청(음성대조군: PBS), 유전형 1a의 BVDV 백신주만 접종된 기니픽의 혈청(양성대조군: 상업적으로 구매 가능한 기존 백신 조성물, NADL), 또는 3가지 유전형의 BVDV 백신주(BVD1a-JB(유전형 1a), BVD1b-JH(유전형 1b) 및 BVD2a-CA(유전형 2a))를 포함하는 백신주 혼합물로 접종된 기니픽의 혈청을 첨가한 다음, 37℃에서 60분간 감작시간을 주고 MDBK(Madin-Darby Bovine Kidney) 세포를 웰에 첨가(분주)한 다음, 5% CO2 및 37℃ 조건 하에서 3일간 배양하였다.
염색 단계: 상기 배양된 MDBK 세포를 고정(fixation)한 다음, 1차 항체인 BVDV E2 특이적 단클론항체를 PBS에 사용농도로 희석하여 상기 고정한 MDBK 세포에 처리하여 37℃에서 40분간 반응시켰고, PBS로 3~5회 세척한 후 2차 항체인 바이오틴화 항-생쥐 IgG를 사용농도로 희석하여 1차 항체로 처리한 MDBK 세포에 처리하여 37℃에서 40분간 반응시켰다(여기서, 바이오틴화 항-생쥐 IgG(ABC kit)는 PBS 10mL + 바이오틴화 항-생쥐 IgG 용액 1drop로 희석하고, 바이오틴화 항-생쥐 IgG(타제품)는 200배로 희석함). 그 다음, 상기 2차 항체로 처리한 MDBK 세포를 PBS로 3~5회 세척하고 AB 용액을 첨가하여 37℃에서 40분간 반응시키고(AB 용액은 PBS 10mL + A 용액 2drops + B 용액 2drops; 실온에 두고 20~40분간 반응시켜야 하므로 미리 제조), PBS로 3~5회 세척한 후 DAB 기질 용액을 처리하고 실온에서 10분간 반응시켰다(10X DAB는 0.6g DAB + 100mL 증류수; DAB 기질 용액은 10X DAB 1mL + PBS 9mL + H2O2(1000X) 10μL). 상기 DAB 기질 용액으로 처리한 MDBK 세포를 증류수로 3회 세척하고 현미경 하에서 관찰하였다.
그 결과, 백신주가 접종되지 않은 기니픽의 혈청(음성대조군)은 BVDV에 대한 항체가 음성반응(항체 생성 없음)으로 나타난 반면, BVDV 백신주가 접종된 기니픽의 혈청은 모두 양성반응(항체 생성 있음)으로 나타났다. 즉, 유전형 1a의 BVDV 백신주만 접종된 기니픽의 혈청(양성대조군, NADL)과 3가지 유전형의 BVDV 백신주(BVD1a-JB(유전형 1a), BVD1b-JH(유전형 1b) 및 BVD2a-CA(유전형 2a))를 포함하는 백신주 혼합물로 접종된 기니픽의 혈청을 처리한 MDBK 세포는 특이적으로 세포 주위에 갈색으로 염색이 되었다.
상기 결과를 토대로 염색이 되지 않은 웰까지 판독하여 BVDV에 대한 기니픽의 항체 역가(Antibody Titer)를 계산한 결과, 3가지 유전형의 BVDV 백신주(BVD1a-JB(유전형 1a), BVD1b-JH(유전형 1b) 및 BVD2a-CA(유전형 2a))를 포함하는 백신주 혼합물을 1x104. 0TCID50/ml 농도로 접종할 경우 기니픽의 혈청에 포함된 항체는 유전형 1a에 대해 7.7log2, 유전형 1b에 대해 8.6log2, 유전형 2a에 대해 6.6log2의 높은 항체 역가 값을 나타내었다.
반면, 상업적으로 구매 가능한 기존 백신주(양성대조군: 유전형 1a, NADL)로 접종한 기니픽의 혈청은 유전형 1a에 대해서는 높게 나타났으나(6.3log2), 유전형 1b에 대한 교차 역가 반응이 4.5log2, 유전형 2a에 대한 교차 역가 반응이 3.7log2로 매우 낮게 형성되었다(백신접종에 따른 접종부위에 대한 이상 증상은 발견되지 않음).
하기 표 2는 실시예 1에서 최종 선별된 3가지 유전형의 BVDV 백신주와 IMS1313를 포함하는 BVDV 백신 조성물을 BVDV 함량(바이러스 역가, Virus Titer)을 달리하여 접종한 기니픽의 혈청을 채혈하여 측정한 중화항체 역가를 나타낸 것이다(백신은 기니픽에 2주 간격으로 2회 접종한 다음, 2주 후 채혈한 혈청의 항체 역가를 조사함).
백신의 항원 농도
(바이러스 함량)		 백신 구성
(BVDV 유전형)		 BVDV 유전형에 대한 항체 역가
(Antibody Titer, SN Titer, log2)
1a 1b 2a
1x104. 0TCID50/ml 1a+1b+2a 7.7 8.6 6.6
1x103. 0TCID50/ml 1a+1b+2a 6.5 7.8 5.4
1x102. 0TCID50/ml 1a+1b+2a 4.9 5.3 3.5
양성대조군
(기존 백신)		 1a 6.3 4.5 3.7
음성대조군
(PBS)		 - <2 <2 <2
[ 실시예 3] BVDV 백신 조성물에 포함되는 어쥬번트 종류에 따른 기닉픽의 항체 역가 및 항체 형성 지속능 조사
실시예 1에서 최종 선별된 3가지 유전형의 BVDV 백신주(BVD1a-JB(유전형 1a), BVD1b-JH(유전형 1b) 및 BVD2a-CA(유전형 2a))를 포함하는 백신주 혼합물의 바이러스 함량(바이러스 역가, Virus Titer)을 1x104. 0TCID50/ml 농도로 일정하게 고정한 다음, 어쥬번트인 IMS1313, 카보폴(Cabopol) 또는 ISA206과 실시예 2의 혼합비율로 혼합하여 기니픽에 1ml씩 그룹당 4두씩 2주 간격으로 2회 근육접종한 다음, 최종 접종 2주 후에 채혈하여 실시예 2에서와 같이 중화시험법(NPLA)으로 중화항체 형성율을 확인하였다.
한편, 1가지 유전형의 BVDV 백신주, 또는 2가지 유전형의 BVDV 백신주를 혼합한 백신주 혼합물, 바이러스주가 접종되지 않은 기니픽의 혈청(음성대조군: PBS) 및 유전형 1a의 BVDV 백신주만 접종된 기니픽의 혈청(양성대조군: 상업적으로 구매 가능한 기존 백신 조성물, NADL)을 이용하여 중화항체 형성율을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 어쥬번트의 종류와 무관하게, 1가지 유전형의 BVDV 백신주(1a, 1b, 또는 2a) 또는 2가지 유전형의 BVDV 백신주(1a, 1b)를 접종하여 형성된 기니픽의 항체는 유전형 1a의 BVDV, 유전형 1b의 BVDV 또는 유전형 2a의 BVDV 백신주에 대한 교차반응이 낮게 나타났다.
반면, 3가지 유전형의 BVDV 백신주와 IMS1313을 혼합한 조성물을 기니픽에 접종한 경우, 2차 접종 2주 후(4주)에 항체 역가는 유전형 1a에 대해 8.5log2, 유전형 1b에 대해 8.9log2, 및 유전형 2a에 대해 7.7log2로 높게 나타났다.
특히, 3가지 유전형의 BVDV 백신주 및 IMS1313을 혼합한 조성물은 낮은 교차방어를 나타낸 기존 백신(비교예 1)보다 중화항체 형성율이 높게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 항체 형성 지속능 측면에서도, BVDV 백신주를 포함하는 조성물의 기니픽 접종 후, 12주까지 조사한 결과, 유전형 1a에 대해 6.3log2, 유전형 1b에 대해 6.5log2, 유전형 2a에 대해 6.6log2로 항체 역가가 높게 유지되어 1가지 유전형의 BVDV 백신주를 포함하는 조성물을 접종한 그룹보다도 월등히 높은 항체 역가를 나타내는 것으로 확인되었다.
한편, 각각의 어쥬번트는 생체 적합성에 차이가 있어, IMS1313 접종그룹에서는 접종부위에 이상 증상이 없었으나, ISA206 접종 그룹에서는 경결현상이 관찰되었다.
따라서, 3가지 유전형의 BVDV 백신주를 포함하는 백신주 혼합물에 첨가되는 어쥬번트가 IMS1313인 경우, 카보폴(Cabopol) 또는 ISA206보다 기니픽에서 훨씬 높은 항체 역가를 유지하고, 부작용이 없는 것으로 확인되었다.
하기 표 3은 실시예 1에서 최종 선별된 3가지 유전형의 BVDV 백신주를 포함하는 백신주 혼합물과 각기 다른 어쥬번트(IMS1313, Cabopol 또는 ISA206)를 혼합한 백신 조성물을 기니픽에 접종한 다음, 중화항체 형성능과 항체 형성 지속능을 백신 접종 후 12주까지 중화항체 역가로 확인한 것을 나타낸 것이다(0주: 1차 백신 접종; 2주: 2차 백신접종).
Figure 112017060129325-pat00001
[ 실시예 4] 목적 동물에 따른 BVDV 백신 조성물의 항체 역가 및 항체 형성 지속능 조사
실시예 3의 기니픽을 대상으로 한 실험의 결과가 목적 동물인 소, 특히 송아지에서도 같은 결과를 도출할 수 있는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 3가지 유전형의 BVDV 백신주를 포함하는 백신주 혼합물의 바이러스 함량이 1x104. 0TCID50/ml 농도가 되도록 하여 IMS1313과 혼합하여 제조한 백신 조성물을 2ml씩 2주 간격으로 2회 송아지 그룹당 2두씩 근육접종하였다. 그 다음, 혈청의 채혈은 접종 전(0주), 1차 접종 후 2주(2주), 2차 접종 후 2주(4주), 2차 접종 후 4주(6주), 8주(10주), 14주(16주)까지 수행하였으며 중화시험은 3가지 유전형의 BVDV를 모두 이용하여 수행하였다. 특히, 2차 접종의 특성인 부스팅 효과를 항체 역가의 급격한 상승 여부로 조사하였다.
한편, 1가지 유전형의 BVDV 백신주, 바이러스주가 접종되지 않은 송아지의 혈청(음성대조군: PBS) 및 유전형 1a의 BVDV 백신주만 접종된 송아지의 혈청(양성대조군: 상업적으로 구매 가능한 기존 백신 조성물, NADL)을 이용하여 중화항체 형성율을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상업적으로 구매 가능한 기존 백신주(비교예 2: 유전형 1a)로 접종한 송아지의 혈청은 2차 접종 4주 후(6주)의 경우, 유전형 1a에 대해서는 높게 나타났으나(4.1log2), 유전형 1b에 대한 교차 역가 반응이 2.4log2, 유전형 2a에 대한 교차 역가 반응이 2.1log2로 매우 낮게 형성되었다
반면, 3가지 유전형의 BVDV 백신주를 포함하는 백신주 혼합물과 IMS1313를 혼합하여 소아지에 2차 접종 4주 후(6주)의 경우, 유전형 1a에 대한 교차 역가가 6.2log2, 유전형 1b에 대한 교차 역가가 6.4log2, 유전형 2a에 대한 교차 역가가 5.6log2 역가의 높은 항체 역가 값을 나타내었다.
또한, 항체 형성 지속능 측면에서도, BVDV 백신의 송아지 접종 후, 16주까지 조사한 결과, 유전형 1a에 대해 5.5log2, 유전형 1b에 대해 5.8log2, 유전형 2a에 대해 5.3log2로 항체 역가가 높게 유지되어 1가지 유전형의 BVDV 백신주를 포함하는 조성물을 접종한 그룹보다도 월등히 높은 항체 역가를 나타내는 것으로 확인되었다.
한편, IMS1313을 사용한 접종부위에 대한 경결이나 부작용은 송아지에서는 나타나지 않았다.
따라서, 3가지 유전형의 BVDV 백신주 및 IMS1313을 포함하는 백신 조성물의 경우, 소아지에서 높은 항체 역가를 유지하면서, 부작용이 없는 것으로 확인되었다.
하기 표 4는 실시예 1에서 최종 선별된 3가지 유전형의 BVDV 백신주를 포함하는 백신주 혼합물 또는 1가지 유전형의 BVDV 백신주와 IMS1313를 혼합한 백신 조성물을 송아지에 접종한 다음, 중화항체의 형성능 및 지속능을 백신 접종 후 16주까지 중화항체 역가로 확인한 것을 나타낸 것이다(0주: 1차 백신 접종; 2주: 2차 백신접종).
Figure 112017060129325-pat00002
[ 실시예 5] BVDV 백신 조성물로 접종한 모우의 면역항체 , 및 모체이행항체를 통해 얻어진 송아지의 항체 역가 조사
모우(어미소, 임신우) 4두에 IMS1313을 각각 포함하며, 유전형 1a의 BVDV 백신주, 유전형 1b의 BVDV 백신주, 유전형 2a의 BVDV 백신주, 또는 3가지 유전형의 BVDV 백신주를 포함하는 백신 조성물 2ml를 2주 간격으로 2회 접종하였고, 2차 접종 4주 후 출산시 모우를 채혈하였다. 또한, 각각의 모우에서 태어난 자우가 초유를 섭취하도록 한 다음, 5일 후 채혈하여 자우의 항체 역가도 조사하였다.
그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 3가지 유전형의 BVDV 백신주 및 IMS1313을 혼합한 백신으로 접종한 모우는, 2차 접종 4주 후(6주)에 유전형 1a에 대해 6.2log2, 유전형 1b에 대해 6.5log2, 유전형 2a에 대해 5.8log2로 높은 항체 역가 값을 나타내었으며, 상기 3가지 유전형의 BVDV 백신주 및 IMS1313을 혼합한 백신으로 접종한 모우의 초유를 섭취한 자우에서도 유전형 1a에 대해 6.0log2, 유전형 1b에 대해 6.0log2, 유전형 2a에 대해 5.6log2의 높은 항체 역가 값을 갖는 모체 항체가 자우에게로 이행된 것을 확인할 수 있었다.
반면, 1가지 유전형의 BVDV 백신주로 접종한 모우의 항체 역가는 낮게 형성되었고, 상기 1가지 유전형의 BVDV 백신주로 접종한 모우의 초유를 섭취한 자우에서도 항체 역가가 낮게 나타나는 것으로 조사되었다.
따라서, 3가지 유전형의 BVDV 백신주 및 IMS1313이 혼합된 백신 조성물을 이용할 경우, 모우뿐만 아니라, 상기 모우의 초유를 섭취한 자우에서도 모우 초유에 포함된 모체항체의 자우로의 이행에 따른 높은 항체 역가를 유지하는 것으로 확인되었다.
하기 표 5는 실시예 1에서 최종 선별된 3가지 유전형의 BVDV 백신주, 및 이를 혼합한 백신주 혼합물과 IMS1313를 혼합한 BVDV 백신 조성물을 접종한 모우, 및 상기 모우의 초유를 섭취한 자우의 혈청을 채혈하여 측정한 중화항체 역가를 나타낸 것이다.
시료 백신 구성 BVDV 유전형에 대한 항체 역가(SN Titer, log2)
어쥬번트 BVDV 유전형 1a 1b 2a
모우1 자우1 모우2 자우2 모우3 자우3
제조예 20 IMS1313 1a 5.0 4.7 3.4 3.2 2.7 2.6
제조예 21 IMS1313 1b 3.4 3.0 4.3 4.0 2.3 2.0
제조예 22 IMS1313 2a 2.8 2.8 2.3 2.1 3.6 3.4
제조예 23 IMS1313 1a+1b+2a 6.2 6.0 6.5 6.0 5.8 5.6
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18531P 20170210 한국생명공학연구원 KCTC18532P 20170210 한국생명공학연구원 KCTC18533P 20170210

Claims (11)

  1. 수탁번호 KCTC18531P로 수탁된 소바이러스성설사병바이러스 백신주 BVD1a-JB, 수탁번호 KCTC18532P로 수탁된 소바이러스성설사병바이러스 백신주 BVD1b-JH 및 수탁번호 KCTC18533P로 수탁된 소바이러스성설사병바이러스 백신주 BVD2a-CA로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 소바이러스성설사병바이러스 백신주 혼합물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 BVD1a-JB는 유전형 1a의 소바이러스성설사병바이러스이고,
    상기 BVD1b-JH는 유전형 1b의 소바이러스성설사병바이러스이고,
    상기 BVD2a-CA는 유전형 2a의 소바이러스성설사병바이러스인, 소바이러스성설사병바이러스의 감염 예방 또는 소바이러스성설사병바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 각 유전형별 소바이러스성설사병바이러스 백신주는 각 유전형의 야외주(Wild-type) 소바이러스성설사병바이러스를 소 신장세포인 MDBK(Madin-Darby Bovine Kidney)에 접종한 후 10대 이상 연속계대배양하였을 때 1x106.0~1x108.1TCID50/ml의 바이러스 역가를 가지는 소바이러스성설사병바이러스인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 연속계대배양의 횟수는 15~30대임을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 백신주 혼합물은 1x103.0~1x104.0TCID50/ml 이상의 바이러스 역가를 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 반추동물의 소바이러스성설사병바이러스에 대한 면역반응 유도용임을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 IMS1313, 카보폴(Cabopol) 및 ISA206로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 소바이러스성설사병바이러스 백신주 혼합물과 어쥬번트를 부피 기준으로, 6~8:2~4로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항, 및 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 반추동물에 투여하여 서로 다른 유전형의 소바이러스성설사병바이러스에 의한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법.
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