BG64693B1 - Ваксина против репродуктивния и респираторвия синдром при свинете - Google Patents

Ваксина против репродуктивния и респираторвия синдром при свинете Download PDF

Info

Publication number
BG64693B1
BG64693B1 BG102809A BG10280998A BG64693B1 BG 64693 B1 BG64693 B1 BG 64693B1 BG 102809 A BG102809 A BG 102809A BG 10280998 A BG10280998 A BG 10280998A BG 64693 B1 BG64693 B1 BG 64693B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
virus
vaccine
pigs
prrs
neb
Prior art date
Application number
BG102809A
Other languages
English (en)
Other versions
BG102809A (bg
Inventor
Richard Hesse
Original Assignee
Schering Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24442410&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG64693(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Schering Corporation filed Critical Schering Corporation
Publication of BG102809A publication Critical patent/BG102809A/bg
Publication of BG64693B1 publication Critical patent/BG64693B1/bg

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до ваксина и методи за лечение на репродуктивния и респираторен синдром при свинете. Ваксината се получава от вирусния агент NEB-1-P94, депозиран в Американската колекция на типовете култури под Х VR-2525. Изобретението се отнася също до ваксинален вирус с фенотипни характеристики, по които той може да бъде различен от вируса на PRRS див тип.

Description

(54) ВАКСИНА ПРОТИВ РЕПРОДУКТИВНИЯ И РЕСПИРАТОРНИЯ СИНДРОМ ПРИ СВИНЕТЕ
Предшестващо състояние на техниката
Настоящото изобретение се отнася до ваксина, предназначена за лечение на репродуктивния и респираторния синдром при свинете (PRRS).
През 1987 г. свинепроизводителната индустрия в Съединените щати се сблъсква с неизвестно инфекциозно заболяване, имащо сериозни икономически последствия за свинепроизводството. За този синдром се съобщава в Европа, в това число в Германия, Белгия, Нидерландия, Испания и Англия.
Заболяването се характеризира с невъзможност за възпроизводство, респираторна болест и различни клинични признаци, включително загуба на апетит, температура, диспнея, както и леки неврологични признаци. Основен компонент на синдрома представлява невъзможността за възпроизводство, която се проявява като преждевременни раждания, аборти с късен термин, слаби прасета при раждането, мъртвородени, мумифицирани фетуси, понижени честоти на опрасванията, както и забавено следващо разгонване. Клиничните признаци на респираторната болест са най-силно изразени в прасета на 3-седмична възраст, но се съобщава за нейната поява и в прасета на всички стадии от свинепроизводството. Засегнатите прасенца растат бавно, имат загрубяла четина, респираторен дистрес (“thumping) и повишена смъртност.
Синдромът на заболяването се назовава с различни термини, в това число като мистериозна свинска болест (MSD), респираторен синдром на епидемичните свински аборти (PEARS), свинско безплодие и респираторен синдром (SIRS). Общоприетото сега название е свински репродуктивен и респираторен синдром (PRRS); този термин ще бъде използван навсякъде в тази патентна заявка.
Задача на изобретението представлява обезпечаването на ваксина, която предпазва прасетата от клиничното заболяване, причинявано от PRRS. Друга задача представлява обезпечаването на ваксина, чието приложение в размно жаващите се свински стада, води до намаляване в тяхната популация на съществуването на PRRS.
Техническа същност на изобретението
Задача на настоящото изобретение представлява осигуряването на нова ваксина, която предпазва прасетата от клинично заболяване, което се причинява от вируса на репродуктивния и респираторен синдром (PRRS) при свинете.
Друга задача на настоящото изобретение представлява осигуряването на ваксина, която предпазва прасетата от щам NEB-1 на вируса на PRRS.
Следваща задача на настоящото изобретение представлява осигуряването на метод за предпазване на прасетата от клинично заболяване, което се причинява от вируса на репродуктивното и респираторно заболяване при свинете.
Друга задача на това изобретение представлява осигуряването на ваксинален вирус с фенотипни характеристики, които могат да го отличат от вируса на PRRS див тип.
Изобретението се отнася до ваксина за прилагане за предпазване на свине от репродуктивния и респираторен синдром при свинете, включваща PRRS вирус, отговарящ точно на изолата NEB-1-Р94, депозиран в Американската колекция на типовите култури под кодовия номер VR-2525; при което NEB-1-P94 се характеризира с това, че се отличава от дивия тип форми на вируса, основаващи се на липса на реакция с моноклонално антитяло SDOW17 и увреден растеж върху свински алвеоларни макрофагни клетки.
Освен това изобретението се отнася до препарат, включващ атенюиран вирус на репродуктивния и респираторен синдром при свинете (PRRS), който чрез лабораторни манипулации е модифициран за използването му като ваксина. Препаратът има също фенотипни свойства, които позволяват използването му за диагностични цели в случаите, когато трябва да се направи разлика между свине, които са били инфектирани с вируса на PRRS по естествен път и животни, които са инфектирани само с ваксинален щам. Изолатът NEB-1-P94 на вируса на PRRS е депозиран в Американската колекция на типовете култури (кодов № VR-2525).
Вирулентен изолат на вируса на PRRS беше получен от тъканни проби на мъртво прасе, предоставени на диагностичната лаборатория на Университета в Небраска. Тъканен хомогенат от мъртво прасе беше инокулиран в първични свински алвеоларни макрофаги, като наличието на вируса беше установено по цитопатичните му ефекти върху инокулираните, но не и върху контролните култури. Впоследствие изолираният вирус (означен NEB-1) беше охарактеризиран като вирус на PRRS на основата на физични признаци (чувствителност спрямо етер и хлороформ, плътност и отсъствие на хемаглутинираща активност), реакция със специфични антитела и генетичен анализ. Инокулирането на вируса в неотбити прасенца водеше до респираторно заболяване, характеризиращо се с висока температура, променено дишане и белодробна патология от типа на вирусната интерстициална пневмония. Освен това, инокулирането на вируса в бременни свине водеше до репродуктивно заболяване, характеризиращо се с мумифициране на фетусите, мъртвородени прасенца и слаби прасета при раждането, които впоследствие умираха.
Респираторното и репродуктивното заболяване, причинени от този вирус, беше типично за синдрома, описан за вируса на PRRS.
Вирусът NEB-1 беше атенюиран (отслабен) чрез серийно препосяване в тьканна култура. Първоначално вирусът беше препосяван чрез инокулиране на култури от първични свински алвеоларни макрофаги (SAM) (за първите две препосявки), а след това чрез серийно препосяване върху клетки МА104 (получени от Microbiological Associates, Inc., Rockville, MD) за общо 94 препосявки. По време на този процес чрез пречистване от плаки бяха изолирани вирусни клонове и характеризирани за фенотипни признаци. Ваксиналният клон, означен NEB-1-P94, беше отбран за увреден растеж върху свински алвеоларни макрофаги, липса на реакция с моноклоналното антитяло SDOW17 (ATCC НВ10997), специфично за PRRS и непатогенност в прасенца и бременни свине. NEB-1-P94 беше размножен в клетки МА 104 и замразен като изходен образец на вируса, означен също PRRS -MSV94-1, предназначен за използване в изследванията при разработването на ваксината.
Ваксината се получава чрез използването на клетките МА104 като субстрат (макар че мо гат да се използват и други клетъчни линни, върху които расте вирусът на PRRS, такива като MARC, 145 [която може да се получи от Dr. Wang, Agriculture Research Station, Clay Center NE]). Клетките MA 104 c е култивират до образуването на плътен монослой (конфлуентност) в подходящи за тъканни култури съдове, напр. овални матраци с площ 850 cm2, при използването на средата Eagle’s minimum essental media (ЕМЕМ), съдържаща 5 до 10% говежди серум, 30 мМ НЕРЕ8 (№2-хидроксиетилпиперазин-№-2-етансулфонова киселина, 2 мМ L-глутамин и антибиотици (такива като 30 pkg/ml гентамицин). Могат да се използват и други среди за тъканни култури, в които могат да растат клетките МА104, такива като Dulbecco’s modified essential media [DMEM], Среда 199 или други. Конфлуенгните монослоеве от клетките МА 104 се инокулират с вируса NEB-1-Р94 при множественост на инфекцията (МО1) в границите от 1:5 до 1:1000, а за предпочитане в областта 1:10. След инкубиране в продължение на три до пет дни при 37°С културалните течности над клетките се събират с пипета.
Вирусните течности се титруват, като се правят серийни разреждания в ЕМЕМ, допълнена както по-горе. В 96-ямкови плаки за тъканни култури се инокуклират по 0,2 ml от разрежданията в една ямка при най-малко четири повторения на ямките с конфлуентни клетки МА104 или MARC 145. Културите се инкубират пет дни на 37°С, 3-5% СО2 в камера с поддържане на влага камера и се наблюдават за цитопатични ефекти. Тигрите (50% крайни точки) се изчисляват съгласно методите на Spearman and Karber (Methods in Virology, Volume IV, K. Maramorosch and H. Koprowski (Eds). Academic Press, New York, 1977). За да се потвърди фенотипната идентичност на вируса, клетките могат да се фиксират с 80% ацетон и да се тестират за отсъствие на реакция с моноклоналното антитяло SDOW/ 17 и за положителна реакция с моноклоналните антитела V017 или ЕР147 (които могат да се получат от Dr. Е. Nelson Dakota State University, Brookings, SD,) (очакван положителен резултат).
За получаването на “убита” ваксина вирусните течности се инкубират с химично инактивиращо вещество. Примерите за инактивиращи вещества включват формалдехид, глутаралдехид, вторичен етиленимин или β-пропиолак3 тон. След това вирусните течности се съхраняват на 4°С до включването им във ваксина. Ваксината се приготвя чрез смесване на вирусните течности (съдържащи 106 до 10’ TCID^ от вируса; на основата на тигрите преди инактивирането) с физиологично приемлив разредител (такъв като ЕМЕМ, балансиран солеви разтвор на Ханк, физиологичен разтвор, буфериран с фосфат) и имуностимулиращ адювант (такъв като минерално масло, растително масло, алуминиев хидроксид, сапонин, нейонни детергенти, сквален, блокови кополимери или други известни съединения, които се използват поединично или в комбинация). Дозата на ваксината е обикновено между 1 и 5 ml.
За съставянето на “жива” ваксина вирусните течности се съхраняват замразени на -50°С или на по-студено до използването им. Вирусните течности в границите на 104 0 и 107 0 TCID/ доза и за предпочитане съд ържащи 106 0 ТСШдоза се разреждат с физиологично подходящ разредител (такъв като ЕМЕМ, балансиран солеви разтвор на Ханк, физиологичен разтвор, буфериран с фосфат) и физиологично подходяща смес от съединения, предназначени да стабилизират вируса. Известните в областта на техниката съединения, които могат да се използват самостоятелно или в комбинация, за да стабилизират вирусите, включват захароза, лактоза, NZ-амин, глутатион, неопептон, желатин, декстран и триптон. Ваксината се съхранява замразена (-50°С или на по-студено) или лиофилизирана на 4°С до използването и. Ваксината обикновено има големина на дозата в границите от 1 до 5 ml, като се предпочитат 2 ml.
За профилактика на заболяване, което се индуцира от PRRS, ваксината се прилага в прасето орално, интраназално или парентерално. Примерите за парентерален начин на приложение включват интрадермални, мускулни, интравенозни, интраперитонеални и подкожни начини на приложение.
Когато се прилага като разтвор, настоящата ваксина може да се приготви под формата на воден разтвор, сироп, елексир или тинктура. Такива лекарствени форми са известни в областта на техниката и се приготвят чрез разтваряне на антигена и на други подходящи добавки в съответните системи от разтворители. Такива разтворители включват вода, физиологичен раз твор, етанол, етиленгликол, глицрол, А1-течност и т. н. Подходящите добавки, известни в областта на техниката, включват одобрени багрила, оцветители, подсладители и противомикробни консерванти, такива като тимерозал (натриев етилмеркуритиосалицилат). Такива разтвори могат да се стабилизират, например, чрез добавянето на частично хидролизиран желатин, сорбитол или среда за клетъчни култури, и могат да се буферират чрез методи, известни в областта на техниката, като се използват известни реактиви, такива като натриев хидрогенфосфат, натриев дихидрогенфосфат, калиев хидрогенфосфат и/или калиев дихидрогенфосфат.
Към течните лекарствени форми могат да се причислят също суспензиите и емулсиите. Приготвянето на суспензии, например чрез използването на колоидна мелница, както и на емулсии чрез използването на хомогенизатор, са познати в областта на техниката.
Формите на дозите за парентерално приложение, предназначени за инжектиране в системите от телесни течности, изискват точна изотоничност и буфериране на pH до съответните равнища на свинските телесни течности. Парентералните лекарствени форми трябва също да бъдат стерилизирани преди използване.
Изотоничността може да се постигне с натриев хлорид или, ако е необходимо, с други соли. Могат да се използват и други разтворители, например такива като етанол или пропиленгликол, за да се повиши разтворимостта на съставките на препарата и стабилността на разтвора. Други добавки, които могат да се използват в настоящите лекарствени форми, включват декстроза, традиционни антиоксиданти и традиционни хелатиращи вещества, такива като етиленидиаминтетраоцетна киселина (EDTA).
Две до четири седмици след първоначалната имунизация може да се направи ваксиниране за подсилване на имунния отговор (booster). За предпазване от репродуктивно заболяване режимът на ваксинирането се провежда обикновено до 6 седмици преди и 1 седмица след оплождането. За предпазване на прасенцата от респираторно заболяване ваксината може да се направи на ранна възраст от 3 седмици. Отговорът спрямо ваксината може да се проследи чрез измерване тигъра на антителата, насочени срещу вируса на PRRS, чрез използването на ензимно свързан имуносорбентен тест (ELISA), тест по серумна неутрализация, индиректна имунофлуоресценция или белтъчен пренос (Western blot).
Ваксиналният щам има фенотипни признаци, които могат да се използват за диагноза на инфекция с вируса на PRRS див тип при свинете, която може да се различи от заразяването само с ваксиналния щам. Животните, заразени с природни щамове на вируса на PRRS, могат да се различат от животни, заразени само с ваксиналния щам NEB-1-Р94, чрез измерване на отговора чрез образуването на антитела срещу епитопа, който се разпознава от моноклоналното антитяло (MAb) SDOW17. Наличието на антитела, които реагират с епитопа SDOW17, е показателно за заразяването с вируса див тип.
Измерването на антителата срещу епитопа на SDOW17 може да се извърши чрез конкурентна ELISA. Плаки (96-ямкови) се покриват с вируса на PRRS NEB-1 (или с други вируси на PRRS, които експресират епитопа на SDOW/17). След това плаките се инкубират със свински серум от тестираните животни и белязано с ензим (например конюгирано с пероксидаза от хрян) моноклонално антитяло SDOW17. Способността на свинските серуми да разпознават епитопа на SDOW 17 се измерва по инхибирането на свързването на белязаното с ензим MAb SDOW 17 с плаката, което се установява по липсата на промяна в цвета на ензимния субстрат. Като алтернатива може да се използва директна ELISA. Аминокиселинната последователност, включваща епитопа на SDOW 17, може да се получи като синтетичен пептид или чрез методи за експресия на рекомбинантна ДНК в подходяща векторна система, такава като Е. coli. Плаки, покрити с антигена на SDOW 17, се инкубират със свинския серум. Свързването на свинските антитела с антигена на SDOW 17 се установява чрез инкубиране със серуми, съдържащи конюгирани с ензим антитела срещу свински имуноглобулини, инкубиране с ензимния субстрат и отчитане на промяната в цвета.
Следващите примери описват изобретението в детайли. За специалистите от областта на техниката ще стане ясно, че материалите и методите могат да се модифицират, без това до доведе до отдалечаване от целите и намеренията на тази спецификация.
Примери за изпълнение на изобретението
Пример 1
Фенотипна характеристика на NEB-1Р-94 за растеж върху алвеоларни макрофаги
След пет препосявки от изходния образец ваксиналният щам на вируса NEB-1-P94 се характеризира за растеж върху МА 104, MARC 145 и върху свински алвеоларни макрофаги. Свински алвеоларни макрофаги (SAM) се получават чрез бронхо-алвеоларен лаваж във физиологичен разтвор, следван от центрофугирне за утаяване на клетките. Макрофагите се ресуспендират в ЕМЕМ с 10% фетален говежди серум и 50 pkg /ml гентамицин и се посяват приблизително по 7 х 104клетки на ямка в 96-ямкови плаки за тьканни култури. Клетките МА 104 и MARC 145 се посяват в 96-ямкови плаки за тьканни култури в среда (ЕМЕМ, съдържаща 10% фетален говежди серум, 30 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамин и 50 pkg/ml гентамицин). NEB-1-P96 или родителският NEB-1 вирус се разреждат серийно в среда и по 0,2 ml от всяко разреждане се инокулират в по две ямки на 96-ямкови плаки, съдържащи клетките SAM, МА 104 или МАЕС 145. Културите се инкубират 5 дни на 37°С, 3% до 5% СО2 в камера с поддържане на влага и се проследяват за цитопатични ефекти, типични за вируса на PRRS. Тигрите (50% крайни точки) се изчисляват съгласно метода на Spearman & Karber. NEB-1-P94 показва понижени или неизмерими тигри върху три отделни култури or SAM в сравнение с тигрите, получени върху клетките МА104 и MARC 145 (Таблица 1). Това е фенотипно изменение в сравнение с изходния щам, който показва сходни тигри върху всички тестирани култури. Така увреденият растеж върху свински алвеоларни макрофаги представлява селективен фенотипен маркер за ваксиналния щам NEB-1-P94.
Таблица 1. Сравняване на растежа на вируса NEB-1-P94 върху различни типове клетки
Вирус Титър' върху МА 104 Титър' върху MARC 145 Титър' върху SAM 7 Титър върху SAM 8 Титър' върху SAM 22
NEB-1-P94 5,3 6,1 1.2 2,5 <1.2
NEN-1 5,2 6,5 5,2 6,5 6,5
Титър = 1од10ТСЮ5о/мл (чувствителността на този тест е 1,2)
Пример 2.
Фенотипна характеристика на NEB-1-Р94 за липсата на вирулентност при свинете
Четири гнотобиотични прасенца (на възраст от седем до 10 дни) от серонегативни по отношение на PRRS свине се инокулират интраназално (3 ml/ноздра) с изходния образец на вируса NEB-1-P94 (105.’TClD5(l/ml). Прасенцата се наблюдават за клинични признаци на респираторно заболяване и ваксиналният щам на вируса се изолира повторно от серум пет дни след инокулирането. Серум от първата група прасета се използва за интраназално инокулиране на втора група от гнотобиотични прасета, които се проследяват по същия начин. Този процес на повторно инокулиране в прасенцата се повтаря общо пет пъти, за да се установи дали ваксиналният щам би могъл да премине отново към вирулентно състояние. Ваксинален вирус се изолира след всяко следващо препосяване в животните, но в гнотобиотичните прасета не се наблюдава респираторно заболяване. Освен това в нормални прасенца на възраст една и три седмици интраназално се инокулира вирус, изолиран след петата препосявка в прасетата (приблизително 105·3 TCID w/ml на прасенце). Животните се проследяват 42 дни след инокулирането на вируса, при което не се откриват клинични признаци на заболяването (т. е. продължителна висока температура, респираторни признаци, белодробни лезии), типични за инфекция с вирулентния вирус на PRRS. Ето защо се прави заключението, че вирусът NEB-1-Р94 не е вирулентен и не индуцира респираторно заболяване в прасенцата.
След това вирусът NEB-1-94 се изследва за неговата способност да причинява репродуктивно заболяване. Серонегативни по отношение на PRRS свине се инокулират интраназално (3 ml/ ноздра) на 85-тия ден от бременността с изходния образец на вируса NEB-1-P94 (104 5 TCID^/ ml). Всички свине се опрасват в очакваното за тях време и 96% от прасенцата се раждат живи и здрави. И така, ваксиналният щам NEB-1-P94 не индуцира репродуктивно заболяване, типично за вирулентния вирус на PRRS (виж Пример 4). Тези данни потвърждават невирулентния фенотип на ваксиналния щам, NEB-1-P94.
Пример 3.
Фенотипна характеристика на NEB-1-Р94 за реакция с моноклонални антитела, специфични за вируса на PRRS
Клетки МА 104, инфектирани с родителския щам NEB-1 или с ваксиналния щам вирус NEB-1-P94 се изследват за реакция с моноклонални антитела, специфични за вируса на PRRS чрез индиректна имунофлуоресценция. Накратко, 96-ямкови плаки с плътен монослой клетки МА104 се фиксират с 80% ацетон за 10 min 2 дни след инфекцията с всеки от вирусите. Монослоевете след това се инкубират с моноклоналните антитела SDOW17, V017 или ЕР147. След промиване реакцията на моноклоналните антитела с всеки от вирусите се установява чрез инкубиране с флуоресцинизотиоцианат, конюгиран с антимиши IgG, следвано от промиване и изследване за флуоресценция с микроскоп. За родителския щам NEB-1 се отбелязва положителна флуоресценция с всичките три моноклонални антитела (Таблица 2). Ваксиналният щам, NEB-1 Р94, обаче е загубил способността си да реагира с моноклоналното антитяло SDOW17, но тестът с останалите две моноклонални антитела е положителен. Тези данни посочват, че щамът NEB-1-Р94 не експресира епитопа, който се разпознава от антитялото SDOW17. Загубата на реактивоспособност с това моноклонално антитяло най-вероятно представлява генетична му6 тация в РНК последователността на NEB-1-Р94, която води до променена аминокиселинна последователност в областта от нуклеокапсидния белтък, разпознавана от SDOW17.
Таблица 2. Реактивоспособност на родителския и ваксиналния щам на PRRS със специфични моноклонални антитела.
реакция с SDOW17 реакция cV017 реакция с ЕР147
NEB-1-P94 - + +
NEB-1 + + +
Пример 4
Предотвратяване на репродуктивно заболяване чрез ваксиниране на свинете с NEB-1-P94
Ваксината се приготвя чрез инокулиране на овални матраци с плътни монослоеве от клетки МА104 с NEB-1-P94 (4 препосявки от изходния образец) при множественост на инфекцията приблизително 1:10 в ЕМЕМ, съдържаща 10% фетален говежди серум, 2 мМ L-глутамин и 30 pkg/ml гентамицин. Културите се инкубират три дни на 37°С и след това надстоящите течности се отделят. Вирусните течности се разреждат 50% (обем/обем) със стабилизатор (75 g/l триптон, 30 g/l декстран, 2 g/l желатин, 100 g/l лактоза, 2 g/l натриев глутамат, 1,05 g/l КН2РО4, 2,5 g/g К2НРО4, 10 g/l албуминова фракция V), замразяват се и се лиофилизират. Ваксината се рехидратира със стерилна деионизирана вода и свинете се инжектират мускулно с 2 ml (10s·1 TCIDM/ml) четири до шест седмици преди оплождането.
На 85-ия ден от бременността ваксинираните и неваксинираните контролни свине се заразяват чрез интраназално въвеждане на вируса NEB-1 (приблизително 106 3 TCID^). В продължение на седем седмици след опрасването животните се преглеждат за признаци на фетална
2f или неонатална смърт, причинена от вируса на PRRS. PRRS виремия се развива в 11/12 (92%) от контролните свине и в 100% от техните живородени прасенца. Инфекцията с PRRS по време на бременността води до 16% смъртност при раждането (големи мумии и мъртвородени прасета) в контролната група (Таблица 3) в сравнение със само 6% смъртност при ваксинираните свине. Осен това ваксинирането води до 50% намаляване на случаите на слаби и кекави прасенца и 94% намаляване на прасенцата с ниски тегла при раждането (тежащи по-малко от 2 фунта при раждането) при сравнение с контролите. Ваксинирането предотвратява конгениталния PRRS, което се вижда от липсата на вируса на PRRS в кръвта или тъканите на което и да е от прасенцата на имунизираните свине и от 55%ното предотвратяване на смъртността в рамките на 7-седмична възраст (Таблица 3) при сравняване с контролите. Статистически достоверното предотвратяване на смъртността и вирусната инфекция във ваксинираните свине и в тяхното потомство ясно показва ефикасността на тази ваксина за предотвратяване на репродуктивната форма на заболяването, което се индуцира от вируса на PRRS.
Таблица 3. Обобщени данни за репродуктивно заболяване, наблюдавано след заразяване на ваксинирани срещу контролни свине с вируса на PRRS.
група бройна саината (ср.бр. прасата/праси % големи мумии и мъртвородени %роден живи, ноумряли % слаби и кекави Чпраоанца, тежащи <2 либри смъртност в рамките ни 7 седмици
ваксинирани 21(10,8) 6« 2% 3% 1% 17%
контроли 12(11,1) 16% 3% 6% 17% 38%
Пример 5.
Предотвратяване на респираторно заболяване чрез ваксиниране на свине с NEB-1-P94
Ваксината се приготвя чрез инокулиране на овални матраци с плътни монослоеве от клетки МА 104 с NEB-1-Р94 (4 препосявки от изходния образец) при множественост на инфекцията приблизително 1:10 в ЕМЕМ, съдържаща 10% фетален говежди серум, 2 мМ L-глутамин и 30 цк^ш1 гентамицин. Културите се инкубират три дни на 37°С и след това надстоящите течности се отделят. Вирусните течности се разреждат 50% (обем/обем) със стабилизатор (75 g/l триптон, 30 g/l декстран, 2 g/l желатин, 100 g/l лактоза, 2 g/l натриев глутамат, 1,05 g/l KHjP04 2,5 g/l К2НРО4, 10 g/l албуминова фракция V), замразяват се и се лиофилизират. Ваксината се рехидратира със стерилна дейонизирана вода и серонегативни прасенца на триседмична възраст се инжектират мускулно с 1 ml(1049TCID5O/ml).
Четири седмици след ваксинираното прасенцата се заразяват интраназално с вирулентния вирус на PRRS NEB-1, както е описано за свинете-майки (Пример 4). Прасенцата се преглеждат за признаци на респираторно заболяване в продължение на 14 дни след заразяването. Всички неваксинирани контролни прасенца развиват клинични признаци на респираторно заболяване в сравнение с 3/40 (8%) от ваксинираните животни. Ваксинираното води до статистически достоверно намаляване на признаците на дихателно възпаление и клинично заболяване във ваксинираните животни в сравнение с контролите (Таблица 4). Това изследване ясно демонстрира ефикасността на ваксината за предотвратяване на респираторно заболяване, причинявано от вируса на PRRS в млади прасета.
Таблица 4. Обобщени данни за клинично заболяване във ваксинирани и контролни животни след заразяване с вируса нва PRRS.
м· 1-4 <П «п о ш X ш X m <η ο
«*) о сч г· хг r* ο
гЧ С*) гЧ сч
см <п Ю о <n ο
гЧ сч сч σι
гЧ о Ш г* о ο СЧ
гЧ ч1 <п г*4 ч>
о г*· ю с- о ο (Ν
гЧ •ч» гЧ Ю
о сч г- ο CM
а ш гЧ Ш
г- о г* сч σ> ο
co сп <п σ>
о 00 о о Γ- CM
г» ю сч «4·
о сч vo о ο ο
ч> vo ю гЧ to
Г о «п о ο ο
т σι г- гЧ Ю
tn 00 (П ο ο
кг tf) 00 гЧ \0
с* е <п о <η CM
т in г- сч СЧ
<п о
сч о о сч ο ο
г*
гЧ о о гЧ гЧ ο ο
о о о <п о ο ο
X
X X <0 X X
а. X а X ф ζ
2 х X S £ц. X Φ Q _ X о co ζ δ
3.S х £ < о а ИНИ ЯЛ ф “1 < a X X co ss < g X
с S Q Е S ь о X ο ь δ
о X X X S ° X X X VO X X
Ф Q Q. Е ва ф 7 J- л о X <0 ф ί 3 s co α
HE = липсват данни контроли п=30 ваксинирани η=40

Claims (4)

  1. Патентни претенции
    1. Ваксина за прилагане за предпазване на свине от репродуктивния и респираторния синдром при свинете, включваща PRRS вирус, отговарящ точно на изолата NEB-1-Р94, депозиран в Американската колекция на типовите култури под кодовия номер VR-2525; при което NEB1-Р94 се характеризира с това, че се отличава от дивия тип форми на вируса, основаващи се на липса на реакция с моноклонално антитяло SDOW17 и увреден растеж върху свински алвеоларни макрофагни клетки.
  2. 2. Ваксина съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че PRRS вирусът е в убита или модифицирана (атенюирана) форма на живот.
  3. 3. Ваксина съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че PRRS е в течна, замразе-
    5 на или лиофилизирана форма.
  4. 4. Ваксина съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че количеството на PRRS вируса е в границите от 104·0 до 1090TCID50 на 1 ml.
    10 5. Използване на ваксина съгласно пре- тенции 1 - 4 за получаване на фармацевтичен продукт, предназначен за предпазване на прасе от клинично заболяване, което се причинява от вируса на репродуктивния и респираторен синдром 15 при свинете.
BG102809A 1996-03-01 1998-09-29 Ваксина против репродуктивния и респираторвия синдром при свинете BG64693B1 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60980696A 1996-03-01 1996-03-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG102809A BG102809A (bg) 1999-05-31
BG64693B1 true BG64693B1 (bg) 2005-12-30

Family

ID=24442410

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG102809A BG64693B1 (bg) 1996-03-01 1998-09-29 Ваксина против репродуктивния и респираторвия синдром при свинете

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0894007A1 (bg)
JP (1) JP3135069B2 (bg)
KR (1) KR100297537B1 (bg)
CN (1) CN1165342C (bg)
AR (1) AR006023A1 (bg)
AU (1) AU2277497A (bg)
BG (1) BG64693B1 (bg)
BR (1) BR9708443B1 (bg)
CA (1) CA2248182C (bg)
CO (1) CO4600644A1 (bg)
CZ (1) CZ273798A3 (bg)
EE (1) EE04741B1 (bg)
HU (1) HUP9901958A3 (bg)
MY (1) MY115070A (bg)
PL (1) PL328627A1 (bg)
RU (1) RU2187333C2 (bg)
SK (1) SK119498A3 (bg)
WO (1) WO1997031651A1 (bg)
ZA (1) ZA971663B (bg)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
NZ501264A (en) 1998-12-22 2001-09-28 Pfizer Prod Inc Polynucleotide DNA sequence encoding an infectious RNA molecule encoding a North American PRRS
EP1157121B1 (en) 1999-03-08 2013-04-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Prrsv replicon
MXPA01010681A (es) 1999-04-22 2003-08-20 Us Agriculture Vacuna de sindrome respiratorio y reproductiva porcina a base de ja-142 aislado.
AR049924A1 (es) 2004-06-18 2006-09-13 Univ Minnesota Identificacion de organismos viralmente infectados y vacunados
US7632636B2 (en) 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
CA2894069C (en) 2005-06-24 2019-02-26 Regents Of The University Of Minnesota Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use
CN101612395B (zh) * 2008-06-24 2012-02-08 扬州优邦生物制药有限公司 一种培养敏感细胞生产蓝耳病疫苗的方法
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
US9944902B2 (en) 2011-02-17 2018-04-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Commercial scale process for production of PRRSV
PL2675475T3 (pl) 2011-02-17 2015-12-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Nowy europejski szczep prrs
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
US9315781B2 (en) 2011-07-29 2016-04-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious CDNA clone of european PRRS virus and uses thereof
KR101300528B1 (ko) * 2011-10-05 2013-09-02 캔 테크놀로지스 인코포레이티드 액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물
EP2968513A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use
CZ309704B6 (cs) * 2020-12-10 2023-08-09 Univerzita Palackého v Olomouci Transportní médium pro transport a skladování virů
EP4012025A1 (en) * 2020-12-10 2022-06-15 Univerzita Palackého v Olomouci Transport medium for samples containing nucleic acids and/or proteins

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6042830A (en) * 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
EP0610250B2 (en) * 1991-10-14 2008-10-29 Intervet International BV Porcine reproductive respiratory syndrome (prrs) vaccine and diagnostic
FR2686097B1 (fr) * 1992-01-14 1994-12-30 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
US5695766A (en) * 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
CZ289743B6 (cs) * 1993-02-08 2002-03-13 Bayer Corporation Izolát viru vepřového reprodukčního a respiračního syndromu PRRSV, způsob kultivace PRRSV, tkáňová kultura, způsob přípravy vakcíny a vakcína obsahující PRRSV izolát
ES2074950B1 (es) * 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
ES2165405T3 (es) * 1994-04-11 2002-03-16 Akzo Nobel Nv Cepas de vacuna europeas del virus del sindrome reproductor y respiratorio porcino (prrsv).
US5690940A (en) * 1995-06-21 1997-11-25 Regents Of The University Of Minnesota Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP3135069B2 (ja) 2001-02-13
MY115070A (en) 2003-03-31
KR100297537B1 (ko) 2001-10-26
EE04741B1 (et) 2006-12-15
CA2248182A1 (en) 1997-09-04
HUP9901958A2 (hu) 1999-10-28
AU2277497A (en) 1997-09-16
CN1216922A (zh) 1999-05-19
AR006023A1 (es) 1999-07-21
JPH11506122A (ja) 1999-06-02
PL328627A1 (en) 1999-02-15
CN1165342C (zh) 2004-09-08
KR19990087432A (ko) 1999-12-27
ZA971663B (en) 1997-08-26
EE9800267A (et) 1999-02-15
BR9708443B1 (pt) 2012-06-12
MX9807083A (es) 1998-12-31
CZ273798A3 (cs) 1999-02-17
SK119498A3 (en) 1999-07-12
BR9708443A (pt) 1999-08-03
WO1997031651A1 (en) 1997-09-04
CA2248182C (en) 2004-04-20
BG102809A (bg) 1999-05-31
CO4600644A1 (es) 1998-05-08
EP0894007A1 (en) 1999-02-03
HUP9901958A3 (en) 2000-04-28
RU2187333C2 (ru) 2002-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5866401A (en) Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
Wensvoort et al. Bovine viral diarrhoea virus infections in piglets born to sows vaccinated against swine fever with contaminated vaccine
EP0601062B1 (en) Sirs vaccine and diagnosis method
US6498008B2 (en) Method for detecting swine infertility and respiratory virus
EP0676467B1 (en) European vaccine strains of the porcine reproductive respiratory syndrome virus (PRRSV)
US7223854B2 (en) Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), proteins encoded by the polynucleic acids, vaccines based on the proteins and/or polynucleic acids, a method of protecting a pig from a PRRSV and a method of detecting a PRRSV
US7517976B2 (en) Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
KR950000887B1 (ko) 프로제니터 비루스 왁찐 조성물, 이의 제조방법, 및 이를 사용하여 비루스에 감염된 동물과 왁찐 주사를 맞은 동물을 구별하기 위한 방법
US7264804B2 (en) Kits for detecting anti-SIRS antibodies
BG64693B1 (bg) Ваксина против репродуктивния и респираторвия синдром при свинете
Mendoza et al. Antigenic differentiation of classical swine fever vaccinal strain PAV-250 from other strains, including field strains from Mexico
MXPA98007083A (en) Vaccine against the reproductive and respiratory syndrome porc
CA2240843A1 (en) Rotavirus antigens, vaccines and diagnostic drugs for infection with rotavirus, and processes for producing the same