CZ309704B6 - Transportní médium pro transport a skladování virů - Google Patents
Transportní médium pro transport a skladování virů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309704B6 CZ309704B6 CZ2020-665A CZ2020665A CZ309704B6 CZ 309704 B6 CZ309704 B6 CZ 309704B6 CZ 2020665 A CZ2020665 A CZ 2020665A CZ 309704 B6 CZ309704 B6 CZ 309704B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- transport
- virus
- transport medium
- medium
- polymer
- Prior art date
Links
- 239000006163 transport media Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 30
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 15
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 claims description 16
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 14
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims 4
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 claims 1
- 239000012909 foetal bovine serum Substances 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 5
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 4
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 3
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 3
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100248253 Arabidopsis thaliana RH40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje transportní médium pro vzorky obsahující nukleové kyseliny a/nebo proteiny, obsahující pufrovací roztok, alespoň jedno antibiotikum, alespoň jedno antimykotikum, a dále obsahující polymer, kterým je dextran.
Description
Transportní médium pro transport a skladování virů
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká transportního média pro transport a skladování vzorků obsahujících viry, a zejména například virus SARS CoV-2.
Dosavadní stav techniky
V současné době se k vyšetření přítomnosti SARS-CoV-2 viru (SARS, Wuhan 2019 CoV pneumonia viru) a dalších virů napadajících respirační trakt používají nasopharyngeální nebo oropharyngeální výtěry. Stěr se provádí syntetickým tamponem, který se následně vloží do zkumavky s transportním médiem. Obdobně se transportní médium používá i pro transport vzorků odebraných z jiných tkání určených pro diagnostiku virů. Transportní médium se používá i pro transport vzorků určených pro diagnostiku jiných patogenů, nebo i vzorků určených pro detekci DNA, RNA či proteinů pacienta. Takto transportované a skladované vzorky se používají k izolaci nukleových kyselin a následné detekci (např. detekci virů či jiných patogenů) pomocí amplifikace nukleových kyselin (například PCR či LAMP metodami).
Používaným transportním médiem je tzv. transportní virologické médium (VTM, viral transport medium), které obsahuje fetální bovinní sérum a popřípadě i sérový albumin, a dále antibiotika a antimykotika. Typické složení VTM je například: 2% fetální bovinní sérum (FBS), 100 pg/ml gentamycin nebo jiné antibiotikum; 0,5 pg/ml amphotericin B nebo jiné antibiotikum, Hank’s balanced salt solution (HBSS). Složení transportního virologického média není chemicky definovatelné a reprodukovatelné. Fetální bovinní sérum je směs obsahující tisíce proteinů, která se získává z nenarozených telat. Jedná se tedy o produkt s proměnlivým složením, který navíc může obsahovat inhibitory polymerace anebo reverzní transkripce, což dále snižuje reprodukovatelnost jakýchkoliv amplifikačních testů prováděných s nukleovými kyselinami ve vzorcích skladovaných či transportovaných ve VTM. Použití FBS navíc značně komplikuje či přímo znemožňuje stanovení proteinů v transportovaných či skladovaných vzorcích, neboť je obtížné je odlišit od proměnlivých zastoupení proteinů vyskytujících se v FBS. Dále již samotný způsob získávání fetálního bovinního séra je považovaný za problematický z etického hlediska a vyžaduje použití zvířat, je tedy žádoucí jej nahrazovat jinými produkty, kdekoliv je to možné.
Biologické vzorky odebrané do VTM jsou podle údajů výrobců i podle zkušeností původců předkládaného vynálezu stabilní při teplotě 4 °C po dobu až 5 dní, v některých případech až 7 dní, jejich zpracování se však doporučuje nanejvýš do 3 dnů od odběru. Transport vzorků ve VTM také může probíhat v zamraženém stavu, ve kterém jsou patogeny stabilní až 6 měsíců.
Předkládaný vynález si klade za cíl vyvinout dobře chemicky definované a dobře reprodukovatelné transportní médium pro transport a skladování vzorků nukleových kyselin a proteinů, což může být virů a/nebo dalších patogenů a nukleových kyselin a proteinů hostitele. Dále má toto médium být zejména vhodné pro transport a skladování vzorků získaných samoodběrem kloktáním.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je transportní médium, které obsahuje pufrovací roztok, alespoň jedno antibiotikum, alespoň jedno antimykotikum, a polymer, kterým je dextran.
V rámci vývoje nového transportního média bylo zjištěno, že proteiny fetálního bovinního séra lze nahradit polymerem, kterým je dextran. Polymer musí zajistit vhodný onkotický tlak, a musí být rovněž zajištěna správná rovnováha onkotického a osmotického tlaku pro stabilizaci virů a dalších
- 1 CZ 309704 B6 patogenů, ale i somatických buněk v médiu. Kombinace těchto parametrů vytvoří prostředí obdobné prostředí organismu, v němž je vzorek stabilní.
Nahrazením proteinů vhodnými neproteinovými polymery se odstraní problémy s přítomností proteinů, zejména s přítomností špatně definovaných směsí proteinů. V médiu tak nejsou přítomny degradační enzymy, které by mohly virus či jiný vzorek rozložit, zničit, nebo které by mohly inhibovat polymeraci, amplifikaci nebo například reverzní transkripci v dalších krocích diagnostického či identifikačního postupu. Médium má jednoznačně chemicky definované složení, je opakovaně připravitelné se stabilním a opakovatelným přesným složením, a to vede k lepší reprodukovatelnosti a menší chybovosti veškerých navazujících metod.
Oproti standardnímu VTM není v transportním médiu podle předkládaného vynálezu zapotřebí používat fetální bovinní sérum (FBS) nebo sérový albumin, jejich funkce je plně nahrazena polymerem. To odstraňuje i etické problémy spojené s používáním FBS, a zároveň odstraňuje potřebu využívání živých zvířat, což je v souladu s principy tzv. 3Rs - nahrazování (replacement) živých zvířat, snížení (redukce) množství využívaných zvířat, zlepšení (refinement) metod tak, aby způsobovala zvířatům co nejnižší míru bolesti či stresu. Zde se tedy jedná o úplné nahrazení produktu, jehož výroba zahrnuje využití zvířat.
Dextran je polymer schválený pro farmaceutické použití jako pomocná látka. Případný kontakt média s organismem pacienta tak není rizikový a polymer je organismy dobře snášen.
Navíc bylo v rámci předkládaného vynálezu zjištěno, že dextran stabilizuje odebraný virový materiál i za laboratorní teploty, a zároveň neinhibuje amplifikaci nukleových kyselin metodou PCR, ani metodou LAMP. Stabilizace za laboratorní teploty je podstatnou výhodou proti standardnímu VTM.
Množství polymeru v transportním médiu může být s výhodou v rozmezí 0,05 až 5 % hmotn., výhodněji 0,1 až 2 % hmotn., ještě výhodněji 0,1 až 1 % hmotn.
Relativní molekulová hmotnost polymeru by měla být alespoň 10 000, například v rozmezí 10 000 až 100 000, výhodněji 10 000 až 70 000. Při relativní molekulové hmotnosti polymeru pod 10 000 už nemusí docházet k vytvoření potřebného onkotického tlaku. Horní hranice relativní molekulové hmotnosti polymeru nemá technické omezení.
Pufrovacím roztokem v transportním médiu podle vynálezu může být v některých provedeních pufrovaný fyziologický roztok (PBS, phosphate buffered saline) nebo Hanksův vyvážený solný roztok (HBSS, Hank's balanced salt solution). Obecněji je pufrovacím roztokem pufrovaný fyziologický roztok.
V transportním médiu podle vynálezu lze používat antibiotika a antimykotika, která se používají ve standardním VTM. Nejčastěji používanými antibiotiky ve VTM jsou gentamycin, penicilin či streptomycin, ale lze použít i jiná antibiotika. Nejčastěji používaným antimykotikem ve VTM je amphotericin B, ale lze použít i jiná antimykotika. Antibiotikum může být s výhodou přítomno v množství 50 až 200 pg/ml. Antimykotikum může být s výhodou přítomno v množství 0,1 až 2 pg/ml.
Médium podle předkládaného vynálezu může být v kapalné formě nebo v lyofilizované pevné formě. Lyofilizovaná pevná forma se získá lyofilizací (mrazovým sušením) kapalné formy média.
Médium podle překládaného vynálezu je dobře chemicky definované, neobsahuje směs bílkovin. Toto médium má stabilizační funkci i při skladování vzorků za laboratorní teploty. Zároveň dovoluje bezproblémovou následnou detekci nukleových kyselin pomocí technik založených na amplifikaci nukleových kyselin, kvalitativních i kvantitativních, včetně jejich modifikací v reálném čase.
- 2 CZ 309704 B6
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití výše popsaného média pro transport a skladování vzorků obsahujících viry, např. vzorků patogenů či vzorků tkání či tělních tekutin. S výhodou se jedná o vzorky odebrané pacientovi kloktáním vody, tzv. vzorky kloktacích 5 samoodběrů.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále způsob detekce viru ve vzorku odebraném z těla pacienta, v němž se odebraný vzorek umístí do média podle předkládaného vynálezu, v tomto médiu se transportuje a/nebo skladuje, a následně se metodou PCR nebo LAMP stanoví přítomnost 10 a/nebo množství viru ve vzorku.
Médium je, obdobně jako standardní VTM, vhodné pro transport a skladování virů, a to jak DNA virů, tak RNA virů. Zejména může být virem virus SARS-CoV-2, HPV a další viry způsobující onemocnění u člověka nebo zvířat, jako jsou viry hepatitidy, chřipky, koronaviry, viry klíšťové 15 encefalitidy, neštovic, mononukleózy, HIV apod.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Výběr polymeru
S ohledem na možnost kontaktu pacienta se složkami média byly testovány zejména polymery, které jsou využívány ve farmaceutických formulacích, a jsou tedy spolehlivě zdravotně nezávadné.
Jednotlivé polymery byly testovány na inhibici amplifikace metodou LAMP a PCR. Pro testování byly použity komerční kity AUMED test RT-LAMP Assay SARS-CoV-2 od společnosti AUMED, a.s., Praha, Česká republika, Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-OCR Kit (Detection 3 genes) od společnosti Liferiver, Shanghai ZJ Bio-Tech Co.), dále bylo postupováno podle instrukcí výrobce. Amplifikovaným vzorkem byla nukleová kyselina viru SARS-CoV-2.
Výsledky tohoto testování uvádí tabulka 1, z níž je zřejmé, že pouze polymery dextran a polyvinylpyrrolidon neinhibovaly amplifikaci metodou LAMP.
Tabulka 1. Test inhibice LAMP kandidátními polymery*
| Polymer | SARS ředění 10-5/ 10-2 / 0 | Koncentrace |
| SoluPlus | + / 0 / 0 | 1,00 % |
| Lutrol F 68 | ++ / 0 / 0 | 1,00 % |
| Kollidon 17 PF | ++ /++ / 0 | 1,00 % |
| Kolliphor RH40 | ++ / 0 / 0 | 1,00 % |
| Dextran (MW 40000) Polyvinylpyrrolidone | ++ / + / 0 | 1,00 % |
| (MW 40000) Polyethylenglykol | ++ / + / 0 | 1,00 % |
| (MW 6000) PCR voda Fosfátový pufr (PBS) | + / 0 / 0 + / 0 / 0 + / 0 / 0 | 1pM |
++- vysoce pozitivní, +- slabě pozitivní, 0- negativní;
*- PCR reakce testovanými polymery inhibovaná nebyla.
- 3 CZ 309704 B6
Příklad 2: Příprava médií pro testování
K pufrovanému fyziologickému roztoku (PBS) byl přidán zásobní roztok gentamycinu na finální koncentraci 100 μg/ml gentamycinu, zásobní roztok amphotericinu B na finální koncentraci 0,5 μg/ml amphotericinu B, a dále polymer (dextran, relativní molekulová hmotnost 40 000) v množství uvedeném v jednotlivých testech (typicky na finální koncentraci 0,1 % hmotn., 0,5 % hmotn., nebo 1 % hmotn.). Média byla přímo použita nebo skladována za laboratorní teploty.
Příklad 3: Testování stability SARS-CoV-2 v médiích
V tomto experimentu byla testována stabilita SARS-CoV-2 v médiích podle vynálezu, ve srovnání se standardním transportním virologickým médiem. Média podle vynálezu obsahovala 0,1 % hmotn. 0,5 % hmotn. nebo 1 % hmotn. polymeru, kterým byl dextran.
Stabilita byla testována při laboratorní teplotě (24 až 27 °C) a při 4 °C po dobu 15 dní. V den 0 bylo do každého testovaného média inokulováno 6223 PFU/ml a 62,23 PFU/ml viru SARS-CoV2. (PFU = plaque forming units, plaky tvořící jednotky). Z každé alternativy média byl za daných podmínek testován pouze jeden replikát.
Izolace nukleových kyselin byla provedena pomocí kitu RNA-VIRAL-PREP-96 (Palacky University Olomouc, IMTM) nebo VIRAL-RNA-Prep (ITA-Intertact). K detekci koronavirů jsme použili Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Liferiver, Shanghai ZJ Bio-Tech Co.). Test detekuje 3 geny, a to ORF1, gen N, gen E. Dále byla detekována interní kontrola (IC). Při izolaci i detekci bylo postupováno podle instrukcí výrobce. Testy byly provedeny i s negativní a pozitivní kontrolou, byly použity kontroly z uvedeného komerčního kitu.
Výsledky jsou uvedeny níže v tabulce 2, uvedené hodnoty jsou v jednotkách Ct. Je zřejmé, že virové transportní médium podle vynálezu stabilizovalo virus po dobu 2 týdnů, a to i při laboratorní teplotě nebo teplotě 37 °C.
Příklad 4: Testování stability SARS-CoV-2 v médiích
V tomto experimentu byla testována stabilita SARS-CoV-2 v médiích podle vynálezu, ve srovnání se standardním transportním virologickým médiem. Pro toto testování byla vybrána média s 0,5% dextranem a 0,5% dextranem s 0,25% BSA (bovinní sérový albumin). Druhý uvedený typ média nespadá do rozsahu vynálezu. Stabilita byla testována při 4 °C, pokojové teplotě (24 °C) a 37 °C po dobu 15 dní. V den 0 bylo do každého testovaného média inukolováno 62,23 PFU/ml SARSCoV-2. Z každé alternativy média byly za daných podmínek testovány tři replikáty.
Izolace nukleových kyselin byla provedena pomocí kitu RNA-VIRAL-PREP-96 (Palacky University Olomouc, IMTM) nebo VIRAL-RNA-Prep (ITA-Intertact). K detekci koronavirů jsme použili Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Liferiver, Shanghai ZJ Bio-Tech Co.). Test detekuje 3 geny, a to ORF1, gen N, gen E. Dále byla detekována interní kontrola (IC). Při izolaci i detekci bylo postupováno podle instrukcí výrobce.
Výsledky jsou uvedeny níže v tabulce 3, uvedené hodnoty jsou v jednotkách Ct. Je zřejmé, že virové transportní médium podle vynálezu stabilizovalo virus po dobu 2 týdnů, a to i při laboratorní teplotě.
Příklad 5: Testování stability vzorků z kloktacích testů s SARS-CoV-2 v médiích
Pro konečné ověření stability vzorku odebraného do média obsahujícího 0,5% dextran byl testován simulovaný vzorek. Po kloktání 10 až 20 ml pitné vody po dobu 10 až 30 s byl obsah vyplivnut do odběrové nádobky s lyofilizovaným médiem a po uzavření důkladně protřepán. Po přidání 10 až
- 4 CZ 309704 B6 ml kloktání by měl vzorek v odběrové nádobky obsahovat přibližně stejné množství složek média jako při předchozích stabilitních testech. Simulovaný vzorek vznikl smícháním vzorku kloktání od tří jedinců. Stabilita byla testována při 4 °C, pokojové teplotě (24 °C) a 37 °C po dobu 15 dní. V den 0 bylo do každého testovaného média inukolováno 62,23 PFU/ml SARS-CoV2. Z 5 každé alternativy média byly za daných podmínek testovány tři replikáty.
Izolace nukleových kyselin byla provedena pomocí RNA-VIRAL-PREP-96 (Palacky University Olomouc, IMTM) nebo VIRAL-RNA-Prep (ITA-Intertact). K detekci koronavirů jsme použili Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Liferiver, Shanghai ZJ Bio10 Tech Co.). Test detekuje 3 geny, a to ORF1, gen N, gen E. Dále byla detekována interní kontrola (IC). Při izolaci i detekci bylo postupováno podle instrukcí výrobce.
Byla prokázána stabilita SARS-CoV-2 pro jeho následnou detekci pomocí real-time PCR v čistém médiu obsahujícím 0,5% dextran i v simulovaném reálném vzorku. Výsledky jsou shrnuty 15 v tabulce 4, uvedené hodnoty jsou v jednotkách Ct.
- 5 CZ 309704 B6
GO co
GO
CO
GO
GO
CO
GO
GO
CO
GO go ri
GO go
GO
0O
GO go go
GO ri ¢1 vo
GO
GO co
GO
CO
VO co
GO
CO
GO
GO
V*j
GO
GO ¢4
GO
GO
GO
GO
GO co
GO
-6CZ 309704 B6
Tabulka 3 Test stability detekce SARS-CoV2 ve virových transportních médiích, obsahujících 0,3% dextran nebo 0,25% dextran s 0,5% bovimiim sérovým
JO sq o^i <? n rq rq
O od rq rq rq ’Τ Ό πτ tt *q <7 ‘•O 'O 'Ó 'Ó rq rq rq rq rq oo rq rqoo η oo *q τηin 'O 'O '•O '•O'•O ι<·ιΠ-|ΌΓ^· i> r-- vr oo i< od i> i> i>
rq rq rq rq rq
T-ι rq ioo i> eq <?
W3I<I<I<I< rq rq rq rq rq rq rq eii en
V) Φ
X
A £ Κΐ e X ti fi
tli ϋ
N
O
BSA-bovinní sérový albumin, DEX- dextran (MW 40000), IC- interní kontrola, ND- nedetekováno, NTC_PCR- negativní kontrola polymerázové řetězové reakce, POZ PCR-pozitivní kontrola polymerázové řetězové reakce
-7 CZ 309704 B6 rt
Ů t—I rS
f'J cN rN i*-q f'lcN ™ ™ ™ fqcN
Ό kD Ό kD kD kDO qi rS fN rS ex υ t tó u tx
N O ex
-8CZ 309704 B6
Příklad 6: Klinická validační studie
Validační studie byla prováděna s kloktacím testem, který obsahuje virové transportní médium podle předkládaného vynálezu. Virové transportní médium v kloktacím testu bylo připraveno namícháním kapalného média obsahujícího 0,5 % hmotn. dextranu a lyofilizací tohoto média.
Testované osoby provedly samoodběr vzorku vykloktáním 10 až 20 ml pitné vody po dobu 10 až 30 s, následně byl obsah vyplivnut do odběrové nádobky s lyofilizovaným médiem a po uzavření důkladně protřepán.
Izolace RNA proběhla po transportu a popřípadě několika dnech skladování odběrové nádobky, pomocí izolačního kitu s paramagnetickými kuličkami VIRAL-RNA-Prep (ITA Intertact), a RTPCR detekce byla provedena s pomocí kitu Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-OCR Kit (Detection 3 genes) od společnosti Liferiver, Shanghai ZJ Bio-Tech Co. Při izolaci i detekci se postupovalo podle instrukcí výrobce.
Souhrnné výsledky PCR detekce jsou uvedeny v následující tabulce:
| PCR | Vzorek | Celkem | ||
| Pozitivní | Negativní | |||
| Kloktání | Pozitivní | 206 | 0 | 206 |
| Negativní | 24 | 229 | 253 | |
| Celkem | 230 | 229 | 459 |
Na základě testování byly vypočteny následující statistické parametry kloktacího testu využívajícího virové transportní médium podle vynálezu (CI = interval spolehlivosti):
- senzitivita: SE = 89,6%, 95% CI = (84,9%, 93,2%)
- specificita: SP = 100,0%, 95% CI = (98,4%, 100,0%)
- negativní prediktivní hodnota: NPV = 90,5%, 95% CI = (86,2%, 93,8%)
- pozitivní prediktivní hodnota: PPV = 100,0%, 95% CI = (98,2%, 100,0%)
- přesnost (accuracy) = 94,8%, 95% CI = (92,3%, 96,6%).
Claims (9)
1. Transportní médium pro transport a skladování vzorků obsahujících viry, obsahující pufrovací roztok, alespoň jedno antibiotikum, alespoň jedno antimykotikum, vyznačující se tím, že dále obsahuje polymer, kterým je dextran, a zároveň neobsahuje fetální bovinní sérum ani sérový albumin.
2. Transportní médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství polymeru v kapalném virovém transportním médiu je v rozmezí 0,05 až 5 % hmotn.
3. Transportní médium podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že relativní molekulová hmotnost polymeru je alespoň 10 000.
4. Transportní médium podle nároku 1 nebo 3, vyznačující se tím, že je v lyofilizované pevné formě.
5. Transportní médium podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že je v kapalné formě.
6. Použití transportního média podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro transport a skladování vzorků patogenů a/nebo vzorků tkání či tělních tekutin.
7. Použití podle nároku 6, kde patogenem je koronavirus, zejména virus SARS-CoV-2.
8. Způsob detekce nukleové kyseliny patogenu, zejména viru, ve vzorku odebraném z ústní dutiny a/nebo respiračního traktu pacienta, vyznačující se tím, že se odebraný vzorek uvede do kontaktu s transportním médiem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, v tomto médiu se transportuje a/nebo skladuje, a následně se metodou založenou na amplifikaci nukleových kyselin stanoví přítomnost a/nebo množství nukleové kyseliny patogenu ve vzorku.
9. Způsob podle nároku 8, kde virem je koronavirus, zejména virus SARS-CoV-2.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2020-665A CZ309704B6 (cs) | 2020-12-10 | 2020-12-10 | Transportní médium pro transport a skladování virů |
| EP21213792.1A EP4012025A1 (en) | 2020-12-10 | 2021-12-10 | Transport medium for samples containing nucleic acids and/or proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2020-665A CZ309704B6 (cs) | 2020-12-10 | 2020-12-10 | Transportní médium pro transport a skladování virů |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2020665A3 CZ2020665A3 (cs) | 2022-06-22 |
| CZ309704B6 true CZ309704B6 (cs) | 2023-08-09 |
Family
ID=82060160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2020-665A CZ309704B6 (cs) | 2020-12-10 | 2020-12-10 | Transportní médium pro transport a skladování virů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309704B6 (cs) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997031651A1 (en) * | 1996-03-01 | 1997-09-04 | Schering Corporation | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
| CN103169964A (zh) * | 2013-03-27 | 2013-06-26 | 武汉蜀泰科技有限公司 | 猫泛白细胞减少症弱毒冻干疫苗的冻干保护剂 |
| US20140186821A1 (en) * | 2012-12-28 | 2014-07-03 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Noninterfering Multipurpose Compositions for Collecting, Transporting and Storing Biological Samples |
| CN109258622A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-25 | 扬州大学 | 一种兽用自体血清角膜中期保存液及其制备方法 |
| WO2020124077A1 (en) * | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Gentegra, Llc | Matrices and methods for storage and stabilization of biological samples comprising viral rna |
| CN111518775A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-08-11 | 合肥铼科生物科技有限公司 | 一种长时间常温保存病毒样本的保存液及其应用 |
-
2020
- 2020-12-10 CZ CZ2020-665A patent/CZ309704B6/cs unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997031651A1 (en) * | 1996-03-01 | 1997-09-04 | Schering Corporation | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
| US20140186821A1 (en) * | 2012-12-28 | 2014-07-03 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Noninterfering Multipurpose Compositions for Collecting, Transporting and Storing Biological Samples |
| CN103169964A (zh) * | 2013-03-27 | 2013-06-26 | 武汉蜀泰科技有限公司 | 猫泛白细胞减少症弱毒冻干疫苗的冻干保护剂 |
| CN109258622A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-25 | 扬州大学 | 一种兽用自体血清角膜中期保存液及其制备方法 |
| WO2020124077A1 (en) * | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Gentegra, Llc | Matrices and methods for storage and stabilization of biological samples comprising viral rna |
| CN111518775A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-08-11 | 合肥铼科生物科技有限公司 | 一种长时间常温保存病毒样本的保存液及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JEEVANANDAM, Jaison; BANERJEE, Subhamoy; PAUL, Rajkumar. Challenges and Opportunities to Develop Diagnostics and Therapeutic Interventions for Severe Acute Respiratory Syndrome-Corona Virus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biomedical Research & Environmental Sciences, 2020-10-19, 6.10: 219-232, ISSN: 2766-2276, Doi: 10.37871/Jbres1147, https://www.jelsciences.com/articles/jbres1147.php * |
| JIN, Tom H., et al. Stabilizing formulations for inhalable powders of an adenovirus 35-vectored tuberculosis (TB) vaccine (AERAS-402). Vaccine, 2010, 28.27: 4369-4375, E-ISSN: 1873-2518. L-ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2010.04.059, Document ID: 20444437 (PubMed ID) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2020665A3 (cs) | 2022-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bano et al. | Evaluation of pathogenic potential of avian influenza virus serotype H9N2 in chickens | |
| CN111088319B (zh) | 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法 | |
| CN104774974A (zh) | 大肠杆菌噬菌体ms2标准样品及其制备方法 | |
| CN109337994A (zh) | 一种检测布鲁氏菌的rpa-lfd检测试剂盒及其使用方法 | |
| Nolting et al. | Nasal wipes for influenza A virus detection and isolation from swine | |
| US20220145405A1 (en) | Use of pooled samples to optimise the efficiency and utility of a rapid, lab-free point-of-care test | |
| CZ309704B6 (cs) | Transportní médium pro transport a skladování virů | |
| Hardt et al. | Pre-analytical sample stabilization by different sampling devices for PCR-based COVID-19 diagnostics | |
| RU2703394C1 (ru) | Способ выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней | |
| CN108374058A (zh) | 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸标准物质及其制备方法 | |
| Emadi et al. | Stability Study of Iriba brucellosis full-dose and reduced-dose vaccine produced by Razi Institute in Iran | |
| CN105238765A (zh) | 大肠杆菌噬菌体ms2内标质控品的制备、应用和试剂盒 | |
| EP4012025A1 (en) | Transport medium for samples containing nucleic acids and/or proteins | |
| Willoughby et al. | Development of a real time reverse transcriptase polymerase chain reaction for the detection of bovine respiratory syncytial virus in clinical samples and its comparison with immunohistochemistry and immunofluorescence antibody testing | |
| JP2005531751A (ja) | 固体担体に投与された核酸の保存および検出 | |
| CZ35138U1 (cs) | ransportní médium pro transport a skladování virů | |
| RU2756474C1 (ru) | Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| US20230284611A1 (en) | Aqueous solution to preserve nucleic acids | |
| RU2683029C1 (ru) | Способ выявления и количественной оценки содержания ДНК U. diversum методом ПЦР в реальном времени в материале от взрослого крупного рогатого скота | |
| FAROOQ et al. | Molecular based diagnosis of rinderpest and peste des petits ruminants virus in Pakistan | |
| Poh et al. | Bioaerosol sampling for airborne respiratory viruses in an experimental medicine pig handling facility, Singapore | |
| KR102532739B1 (ko) | 코로나 바이러스 검출 및/또는 코로나 바이러스 감염증 진단을 위한 전처리용 조성물 및 이를 이용한 전처리방법 | |
| US20230349009A1 (en) | Kit for Collecting Saliva Samples | |
| CN111286491A (zh) | 猪塞内卡病毒核酸标准物及其应用 | |
| Alıravcı et al. | Assessment of genotoxic and cytotoxic effects in COVID-19 patients |