CN111518775A - 一种长时间常温保存病毒样本的保存液及其应用 - Google Patents
一种长时间常温保存病毒样本的保存液及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种长时间常温保存病毒样本的保存液,配置有病毒生存所需的盐类、氨基酸、葡萄糖等营养物质,同时为保护病毒,添加了聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、海藻糖等病毒保护剂,为抑制菌类生长,添加了两性霉素B、万古霉素等抑菌剂。该保存液安全无毒,使用简单,无须冷链保存,可常温运输保存病毒样本长达3天,有效解决病毒样本采样、运输以及保存过程中依赖冷链且保存时间较短等问题。该保存液能保持病毒样本的原始性,利于对病毒样本的全面分析研究,适用于流行病毒样本采集与运输。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及一种长时间常温保存病毒样本的保存液及其应用。
背景技术
病毒是一种没有细胞结构的特殊生物,由蛋白质外壳和内部的遗传物质组成。病毒个体微小,结构简单,只含一种遗传物质(DNA或RNA)。病毒没有代谢机构,没有酶系统,不能独立生存,只能寄生在宿主细胞内,依赖宿主细胞中的物质和能量完成生命活动,根据其包含的遗传信息进行复制、转录、和转译,产生新一代病毒,实现复制式增殖。复制增殖后的新一代病毒可裂解原宿主细胞,感染新的宿主细胞进行下一轮复制式增殖。病毒性感染的潜在危害极大,例如新型冠状病毒(SARS-CoV-2),该病毒是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒,可导致急性感染性肺炎(COVID-19),感染者初始症状多为发热、乏力和干咳,后续逐渐出现呼吸困难,严重者可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克,甚至死亡。
为了全面分析病毒性感染发生的原因,往往需要将病毒从病患中分离出来并通过分析鉴定,以确定病毒感染类型。活体病毒可以最大程度保持样本的原始性,既可用于病毒的培养和分离,也可用于对病毒的各种分子生物检测。目前用来作为病毒运送保存液主要为Hanks液。但受运输、冷链、保存等因素影响,Hanks液的保存时间较短,病毒形态的完整性易受影响,不利于病毒的分离鉴定,也不利于病毒提取率,且易滋生细菌、真菌,导致Hanks液pH值下降,当Hanks液pH值小于7.4时,病毒稳定性下降,病毒的分解速度加快,难以长时间保存病毒活性。现有的病毒样本采集和保存处理方法依赖冷链运输,同时基于病毒活性的考虑,保存时间多为48小时内,不仅增加了样本运输和保存的成本,更限制了样本采集点和诊断实验之间的可能和距离,直接影响实验检测结果的准确性。
因此有必要开发一种无须冷链、在常温下长时间稳定保存病毒活性的病毒样本保存液。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种长时间常温保存病毒样本的保存液及其应用,该保存液无须冷链,可常温稳定保存病毒样本长达3天,能保持病毒样本的原始性,利于对病毒样本的全面分析研究,适用于流行病毒样本采集。
为实现上述目的,本发明第一方面提供一种长时间常温保存病毒样本的保存液,包括葡萄糖、谷氨酸钠、柠檬酸氢铵、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸、病毒保护剂、抑菌剂。
在本发明一实施例中,所述长时间常温保存病毒样本的保存液包括葡萄糖0.5-1.5mg/mL、谷氨酸钠0.01-0.05mg/mL、柠檬酸氢铵2-5mg/mL、氯化钠5-10mg/mL、氯化钾0.1-0.5mg/mL、磷酸二氢钾0.02-0.1mg/mL、磷酸氢二钠0.01-0.1mg/mL、乙二胺四乙酸1-5mg/mL、病毒保护剂2-6%、抑菌剂1-3%。
在本发明一优选实施例中,所述病毒保护剂包括聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、海藻糖中的一种或多种。
进一步地,所述病毒保护剂包括聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、海藻糖,所述聚乙烯吡咯烷酮浓度为0.5-1.5%,所述甘露醇浓度为0.5-1.5%,所述海藻糖浓度为1-3%。
在本发明一优选实施例中,所述抑菌剂包括真菌抑菌剂与细菌抑菌剂,所述真菌抑菌剂包括两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素中的一种或多种,所述细菌抑菌剂包括万古霉素、庆大霉素、粘菌素中的一种或多种。
进一步地,所述抑菌剂包括两性霉素B、万古霉素,所述两性霉素B浓度为0.25-0.75%,所述万古霉素为0.75-2.25%。
在本发明一实施例中,所述长时间常温保存病毒样本的保存液通过碳酸氢钠调节pH值。
在本发明一实施例中,所述长时间常温保存病毒样本的保存液pH值为6.5-7.5。
本发明第二方面提供一种长时间常温保存病毒样本的保存方法,包括以下步骤:采集病毒样本置于本发明第一方面所述的长时间常温保存病毒样本的保存液中,室温保存。
在本发明一实施例中,所述病毒样本保存液室温保存病毒样本稳定的时限为3天。
本发明第三方面提供如本发明第一方面所述的长时间常温保存病毒样本的保存液或如本发明第二方面所述的长时间常温保存病毒样本的保存方法在制备病毒保存试剂中的应用。
本发明提供的长时间常温保存病毒样本的保存液配置有病毒生存所需的盐类、氨基酸、葡萄糖等营养物质,同时为保护病毒,添加了聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、海藻糖等病毒保护剂,为抑制菌类的生长,添加了两性霉素B、万古霉素等抑菌剂。该保存液安全无毒,使用简单,无须冷链保存,可常温运输保存病毒样本长达3天,有效解决病毒样本采样、运输以及保存过程中依赖冷链且保存时间较短等问题。该保存液能保持病毒样本的原始性,利于对病毒样本的全面分析研究,适用于流行病毒样本采集。
附图说明
图1为本发明实施例提供的病毒样品核酸检测验证保存液保存效果的qPCR结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解,现详细说明本发明的具体实施方式。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中若无特别说明,所用试剂及耗材均为市售商品。
本发明提供的长时间常温保存病毒样本的保存液,包括葡萄糖、谷氨酸钠、柠檬酸氢铵、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸、病毒保护剂、抑菌剂。
本发明提供的长时间常温保存病毒样本的保存液,配置有病毒生存所需的盐类、氨基酸、葡萄糖等营养物质,同时为保护病毒,添加了聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、海藻糖等病毒保护剂,聚乙烯吡咯烷酮能防止病毒由外向内渗透溶质,可保护细胞内病毒在外界温度升高时可能产生的损害,无定型的甘露醇具有稳定蛋白质的作用,可阻止蛋白质分子聚集,海藻糖作为一种稳定的非还原性双糖,海藻糖的羟基可代替水分子同蛋白质分子表面部分结合,对蛋白质形成保护,同时为抑制菌类的生长,添加了两性霉素B、万古霉素等抑菌剂,上述各组分协同配合,实现无须冷链运输、常温稳定保存病毒样本长达3天的保存效果。
实施例1长时间常温保存病毒样本的保存液的配制
1)根据以下配方配制长时间常温保存病毒样本的保存液:
2)用碳酸氢钠调节保存液pH值为6.5-7.5,即得长时间常温保存病毒样本的保存液。
实施例2保存液对病毒样本的保存效果验证
根据实施例1中配方3配制所得的保存液与目前市面使用较为广泛的Hanks液对病毒样本核酸的保存效果比较
1、病毒样本活性检测验证保存液保存效果
将流感病毒H3N2(H3N2亚型流感病毒Vero细胞冷适应株由医学生物学研究所赠送)用本发明提供的保存液适当稀释,置于4℃和室温条件下保存,分别于保存的0h、24h、48h和72h,将上述样品加入已经备好的单层Vero细胞(非洲绿猴肾细胞P132购自欧洲细胞收藏中心,传代至P140)孔中,每个样本设置8个平行孔,每孔100μL,后置于37℃,5%CO2培养箱中培养72h。分别于第0h、24h、48h、和72h于倒置纤维镜下观察细胞病变,计算细胞培养半数感染量(TCID50)。以Hanks液为对照,用相同方法测定相应对照组的TCID50,结果如下:
结果表明,与Hanks液相比,本发明提供的病毒样本保存液在室温下3天内较好地保持了病毒样本活性,相关病毒样本的原始性保持较好。
2、病毒样本核酸检测验证保存液保存效果
根据实施例1中配方3配制所得的保存液与目前市面使用较为广泛的Hanks液对病毒样本核酸的保存效果比较:
待验证病毒样本:猪PEDV冠状病毒(流行性腹泻活疫苗AJ1102-R,购自武汉科前生物),病毒含量≥107.3TCID50/mL。
验证方案:
方案一
1)将200μL活病毒疫苗置于1mL本发明提供的保存液,设置3个独立样本,同时取3个健康志愿者左右两侧腮部的口腔拭子样品,置于保存液样本中,充分混匀;
2)置于30℃恒温箱中保存,分别于第0天(样本处理后2小时内)、第1天、第2天和和第3天时,取出140μL保存液样本,选用天根TIANamp Virus RNAKit(DP315-R)提取病毒RNA,洗脱体积为20μL;
3)Qubit检测RNA浓度,选用QubitTMRNAHS Assay Kit(InvitrogenTM Q32852),于Qubit 4.0上检测每个时间点的病毒RNA样本浓度;
方案二
1)将200μL活病毒疫苗置于1mL Hanks液,设置3个独立样本,同时取3个健康志愿者左右两侧腮部的口腔拭子样品,置于保存液样本中,充分混匀;
2)置于4℃冰箱中保存,分别于第0天(样本处理后2小时内)、第1天、第2天和和第3天时,取出140μL保存液样本,选用天根TIANamp Virus RNAKit(DP315-R)提取病毒RNA,洗脱体积为20μL;
3)Qubit检测RNA浓度,选用QubitTM RNAHSAssay Kit(InvitrogenTM Q32852),于Qubit 4.0上检测每个时间点的病毒RNA样本浓度;
4)qPCR检测病毒PEDV基因。
方案三
1)将200μL活病毒疫苗置于1mL Hanks液,设置3个独立样本,同时取3个健康志愿者左右两侧腮部的口腔拭子样品,置于保存液样本中,充分混匀;
2)置于30℃恒温箱中保存,分别于第0天(样本处理后2小时内)、第1天、第2天和和第3天时,取出140μL保存液样本,选用天根TIANamp Virus RNAKit(DP315-R)提取病毒RNA,洗脱体积为20μL;
3)Qubit检测RNA浓度,选用QubitTM RNAHSAssay Kit(InvitrogenTM Q32852),于Qubit 4.0上检测每个时间点的病毒RNA样本浓度;
RNA浓度检测结果如下:
qPCR检测结果如下:
结果,方案一即本发明提供的保存液温室保存的病毒样品,其RNA浓度在三天内保持相对稳定,没有发生降解,qPCR检测结果Ct值也保持相对稳定,表明本发明提供的保存液可在温室情况下稳定保存病毒样本至少3天;方案二即Hanks液4℃保存的病毒样品,在三天内随着保存时间增长,其RNA浓度迅速降低,同时qPCR检测结果Ct值也越来越大,表明Hanks液4℃保存的病毒样品不稳定,易随时间增长而降解;而方案三Hanks液温室保存的病毒样品,由于温室保存,相比方案二更加不稳定,降解速度更快,三个方案保存的病毒样品在保存第3天提取核酸做qPCR检测验证结果如图1所示。
综上,本发明提供一种长时间常温保存病毒样本的保存液,安全无毒,使用简单,无须冷链保存,可常温运输保存病毒样本长达3天,有效解决病毒样本采样、运输以及保存过程中依赖冷链且保存时间较短等问题。该保存液能保持病毒样本的原始性,利于对病毒样本的全面分析研究,适用于流行病毒样本采集。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种长时间常温保存病毒样本的保存液,其特征在于,包括葡萄糖、谷氨酸钠、柠檬酸氢铵、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸、病毒保护剂、抑菌剂。
2.如权利要求1所述的长时间常温保存病毒样本的保存液,其特征在于,包括葡萄糖0.5-1.5mg/mL、谷氨酸钠0.01-0.05mg/mL、柠檬酸氢铵2-5mg/mL、氯化钠5-10mg/mL、氯化钾0.1-0.5mg/mL、磷酸二氢钾0.02-0.1mg/mL、磷酸氢二钠0.01-0.1mg/mL、乙二胺四乙酸1-5mg/mL、病毒保护剂2-6%、抑菌剂1-3%。
3.如权利要求1所述的长时间常温保存病毒样本的保存液,其特征在于,所述病毒保护剂包括聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、海藻糖中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的长时间常温保存病毒样本的保存液,其特征在于,所述抑菌剂包括真菌抑菌剂与细菌抑菌剂,所述真菌抑菌剂包括两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素中的一种或多种,所述细菌抑菌剂包括万古霉素、庆大霉素、粘菌素中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的长时间常温保存病毒样本的保存液,其特征在于,所述长时间常温保存病毒样本的保存液通过碳酸氢钠调节pH值。
6.如权利要求1所述的长时间常温保存病毒样本的保存液,其特征在于,所述长时间常温保存病毒样本的保存液pH值为6.5-7.5。
7.一种长时间常温保存病毒样本的保存方法,其特征在于,包括以下步骤:采集病毒样本置于权利要求1所述的长时间常温保存病毒样本的保存液中,室温保存。
8.如权利要求7所述的长时间常温保存病毒样本的保存方法,其特征在于,所述病毒样本保存液室温保存病毒样本稳定的时限为3天。
9.如权利要求1所述的长时间常温保存病毒样本的保存液或如权利要求7所述的长时间常温保存病毒样本的保存方法在制备病毒保存试剂中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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