CN101979516A - 一种病毒采样液组合物 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种病毒采样液，含有海藻糖(或牛血清白蛋白、右旋糖酐)、谷氨酸钠、明胶、甘氨酸、蔗糖、抗生素等，可以克服现有技术中病毒样本在储运过程中易失活及病毒核酸被降解等问题。

Description

一种病毒采样液组合物

技术领域

本发明涉及病毒检验检疫领域，尤其涉及保存病毒样品的方法和试剂。

背景技术

病毒是由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质构成的非细胞形态的营寄生生活的生命体。病毒有高度的寄生性，完全依赖宿主细胞的能量和代谢系统，获取生命活动所需的物质和能量。早在公元前1400年人类就有了病毒感染的记载，但直到19世纪末病毒才开始逐渐被发现和鉴定。病毒能引起动物、植物及人类的各种疾病，对人类的生存和健康造成极大的威胁，如人类免疫缺陷病毒、埃博拉病毒、SARS、H1N1等，均对人类及动物造成极大威胁。

病毒感染检测有赖于病毒分离鉴定、病毒基因检测、病毒特异性抗原检测等方法，这些都必须建立在采集到高质量的标本的基础之上。现在常规的病毒采样方法是用拭子插拭咽部等带病毒部位，然后将拭子浸泡在MEM或Hank’s等缓冲液中，再送入实验室进行病毒分离及病毒基因、抗原的检测。由于从样品采集到实验室检测有一定的时间间隔，样品需经过运输及低温保存等过程，使得病毒活力下降，病毒核酸、抗原等遭到降解，阳性检出率远低于临床诊断。据统计，流感咽拭子标本仅有10-20％能分离到流感病毒，这极大影响疾病诊断、流行病学研究以及疫苗和抗病毒药物的研究，这一直是病毒学临床及研究工作的一大瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种病毒采样液，用于保存从人体获得的病毒样本，克服现有技术中病毒样本在保存中失活或降解的问题。

本发明提供了一种病毒采样液，包含以下组分：

海藻糖            2％-4％

或牛血清白蛋白    2％-4％

或右旋糖酐        1％-3％

谷氨酸钠          1％

明胶              1％-2％

甘氨酸    1-3％

蔗糖      2％

以上组分用Hank’s液溶配制，组分浓度为每100mL采样液中该组分的质量(克)，采样液的PH值为7.3±0.2。

在一个优选的方案中，采样液中加入50-150ug/ml的万古霉素、2-6ug/mL的两性霉素B、5-10ug/ml的粘霉素；再加入5-15ug/ml的酚红；用Hank’s液定容到500mL。

配置好的病毒采样液装入病毒采集管中，每管3mL，每管放入3mm直径的玻璃珠3颗，加盖密封后，γ-射线消毒。

本发明的病毒采样液采用海藻糖、明胶、L-谷氨酸等病毒保护剂，抑制了病毒核酸、蛋白的降解，可以使病毒保持活力更长时间，方便病毒样品的采集，提高病毒基因、特异性蛋白检测率及病毒分离率。

具体实施方式

本发明所用的流感病毒H1N1病毒样本、肠道病毒EV71样本由南京医科大学提供。本发明采用的MDCK细胞为狗肾细胞，ATCC号为CCL-34，作为宿主细胞用于培养流感病毒。本发明采用的“肠道病毒EV71定量PCR试剂盒”为中山大学达安基因股份有限公司产品，货号为2010002。本发明采用的万古霉素、两性霉素B、粘霉素为生工生物工程(上海)有限公司产品。Hank’s按照参考文献(郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术.北京：中国三峡出版社，1997)的方法配制。本发明采用的其他试剂均为国产分析纯试剂。

实施例1、病毒采样液组合物的配制

(1)配方1

海藻糖    3％

谷氨酸钠  1％

明胶      1％

甘氨酸    2％

蔗糖      2％

按比例称取以上组分，各组分浓度为每100毫升采样液中该组分的质量(克)。上述组分用450毫升的Hank’s液溶解，用NaHCO₃调PH至7.3±0.2(25℃)；加入万古霉素(100ug/ml)、两性霉素B(4ug/mL)、粘霉素(7.5ug/ml)；再加入10ug/ml的酚红；用Hank’s定容到500毫升。

(2)配方2

用牛血清白蛋白(2％)替代配方1中的海藻糖，其他同配方1。

(3)配方3

用右旋糖酐(2％)替代配方1中的海藻糖，其他同配方1。

上述各种配方的病毒采样液装入病毒采集管中，每管3ml，每管放入3mm直径的玻璃珠3颗，加盖密封后，γ-射线消毒。

实施例2、病毒采样液保存流感病毒H1N1的效果观察

将流感病毒H1N1用上述配方1的病毒采样液适当稀释，分别放置于4℃和室温条件下，分别放置0、24h和48h。将上述样品加入已准备好的单层MDCK细胞孔中，每孔100ul，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养72h，倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)，计算细胞培养半数感染量(TCID₅₀)。以Hank’s液为对照，用同样方法测定相应对照组的TCID₅₀。结果见表1

表1不同保存条件下H1N1半数感染量的比较

实施例3、病毒采样液保存肠道病毒EV71的效果观察

将肠道病毒EV71用上述配方3的病毒采样液适当稀释，分别放置于4℃和室温条件下，分别放置0、24h和48h。以Hank’s液为对照，用市售的肠道病毒EV71定量PCR试剂盒测定样品中的肠道病毒EV71RNA浓度。EV71RNA浓度按每毫升稀释液中病毒RNA的拷贝数的对数计，具体操作按产品说明书。结果见表2。

表2不同保存条件下EV71病毒RNA浓度的比较

a：EV71RNA数值为每毫升拷贝数的对数值(log^copies/ml)。

Claims (4)

1.一种病毒采样液，其特征在于，包含以下组分：

海藻糖        2％-4％

或牛血清白蛋白2％-4％

或右旋糖酐    1％-3％

谷氨酸钠      1％

明胶          1％-2％

甘氨酸        1-3％

蔗糖          2％

以上组分用Hank’s液溶配制，组分浓度为每100mL采样液中该组分的按克计的质量，采样液的PH值为7.3±0.2。

2.如权利要求1的病毒采样液，其特征在于，在采样液中加入50-150ug/ml的万古霉素、2-6ug/mL的两性霉素B、5-10ug/ml的粘霉素。

3.如权利要求2的病毒采样液，其特征在于，在采样液中加入5-15ug/ml的酚红。

4.如权利要求1-3的任一项所述的病毒采样液，其特征在于，病毒采样液装入病毒采集管中，每管3ml，每管放入3mm直径的玻璃珠3颗，加盖密封后，γ-射线消毒。